CN111801007B - 具有增加的水解酶活性的大麦 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有高α‑淀粉酶活性的大麦植物。本发明的大麦植物可以例如在一个或多个α‑淀粉酶启动子中、在HRT基因中、在HBL12基因中和/或在WRKY38基因中携带突变。本发明还提供了由所述大麦植物制备的植物产品。

Description

具有增加的水解酶活性的大麦
技术领域
本发明涉及具有增加的水解酶活性的大麦植物。具体地，本发明的大麦植物在发芽早期可以具有增加的水解酶活性。
背景技术
在商业化的麦芽制造方法中，大麦谷粒在受控条件下发芽或麦芽制造，这些条件允许淀粉质胚乳的淀粉和蛋白质储备在4-6天的时间内部分动员。通常通过将干燥的大麦谷粒浸入水中来开始麦芽制造过程。这个过程被称为浸泡，其目的不仅是清洁谷粒，而且还将其水分含量提高到约40％(w/w)，以便随后的胚乳动员步骤更快地发生。在浸泡期间，排水一次以使谷粒再通气。该步骤被称为"通风"并且被认为是必要的，主要是因为浸没的谷粒在约16小时后变得缺氧。在约8小时的"通风"后，将谷粒重新浸入水中以在另8小时的时间段内或在一系列再浸泡步骤中完成浸泡处理。两步浸泡过程将干谷粒的水分含量增加至40％或更高，总共花费约32小时。
将浸泡的谷粒铺开以进行发芽处理，在此期间，从糊粉粒和盾片上皮细胞分泌的酶与预先存在于淀粉质胚乳细胞中的一些酶一起降解细胞壁、淀粉和蛋白质。在正常的发芽条件下，植物激素赤霉酸(GA)被认为是在节点区或胚中的其它地方合成的，它由此处沿着水梯度扩散。
麦芽制造者通常旨在尽可能快速地诱导谷粒中尽可能多的淀粉降解酶的合成。在许多商业化的麦芽制造程序中，可以加入GA以加速酶从糊粉层中分泌的过程。淀粉降解酶包括α-淀粉酶和β-淀粉酶、淀粉脱支酶(例如极限糊精酶)和α-葡糖苷酶，其将谷粒的淀粉储备部分解聚为单糖、寡糖和葡萄糖。淀粉的解聚产物随后被酵母细胞用作碳源并发酵成啤酒乙醇。
α-淀粉酶在胚乳中淀粉的降解中具有主要作用。α-淀粉酶的表达在谷物植物中受到严格调节。在野生型大麦中，在胚乳生长和成熟过程中α-淀粉酶基因的表达非常少，这与淀粉在此期间的大量积累相一致。在发芽期间，α-淀粉酶活性增加。α-淀粉酶活性的严格调节是重要的，因为异常的α-淀粉酶活性可能对植物健康产生严重后果。例如，在某些大麦品种中，可能发生过早出芽。这可能与茎干和根生长、高α-淀粉酶产生和成熟时谷粒皱缩有关(Green等人，1997)。而且，已经发现，与正常的谷粒相比，在皱缩的谷粒中α-淀粉酶活性经常增加(Green等人，1997)。携带sln1突变的Cv.Himalaya大麦也被一致地证明既有早发性萌芽又有高α-淀粉酶产生(Green等，1997)。在水稻的发育胚乳中α-淀粉酶基因的过表达产生了不同程度的"白垩样"谷粒，即包含不成熟的松散堆积的淀粉颗粒的谷粒(Nakata等人2017)。麦芽制造者还试图诱导高水平的降解大麦谷粒中细胞壁多糖的酶，特别是(1,3；1,4)-β-葡聚糖和阿拉伯糖基木聚糖。不完全降解的(1,3；1,4)-β-葡聚糖对于啤酒制造商来说可能是特别麻烦的，因为它们可以以可溶形式从麦芽中提取，形成高粘度的水溶液，这减慢了啤酒厂中的过滤过程，并导致最终啤酒中不希望的云雾状混浊。因此，低水平的可溶性(1,3；1,4)-β-葡聚糖代表重要的麦芽制造质量参数，而高水平的(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶仍然是麦芽质量的重要量度。
如上所述，发芽过程通常需要大约4-5天。在受控的发芽步骤之后，将湿麦芽的含水量从约40％干燥至4-5％。这种称为窑烧(kilning)的干燥过程非常耗能，并且是该行业的主要成本。包括窑烧干燥的整个过程通常为6-7天。
在啤酒厂，将窑烧干燥的麦芽研磨以使谷物破碎开，并在称为糖化的过程中用热水提取所得内容物。如上所述，提取的材料包括部分降解的淀粉、蛋白质和细胞壁分子，并且这些被从麦芽提取的内源谷粒酶进一步降解。在这个阶段，一些啤酒制造商添加额外的且通常更便宜的碳源(附加助剂)以支持随后的酵母发酵过程和抵消较高的麦芽成本。所述附加助剂可以是大麦、大米、小麦或其它来自未发芽谷粒的谷粉，但它们的加入可能需要同时加入水解酶，因为麦芽中的内源酶不足以降解附加助剂的组分。加入的酶通常来自未纯化且相对便宜的真菌和/或细菌培养物的提取物。在一些国家，特别是在必须在严格规定的环境下生产啤酒的国家，外源酶的添加是不合法的。
淀粉和在热水中提取的其他胚乳组分的进一步降解在称为糖变(saccharification)的过程中进行。在糖化(mashing)之后，通常在过滤槽中过滤提取物并冷却。提取物可以在啤酒花或啤酒花提取物存在下煮沸，冷却后，加入酵母培养物，将释放的糖发酵成乙醇。如此生产的啤酒通常在装瓶前熟化并过滤。啤酒也可在装瓶前进行碳酸化。
发明内容
如上所述，啤酒生产的一个耗时耗能的步骤是麦芽制造。麦芽制造过程中的限速步骤是在谷粒中合成足够的淀粉降解酶。因此，需要提供能够减少麦芽制造所需时间的材料和方法。特别地，需要允许包含足够的淀粉降解酶的谷粒在发芽开始后不久发芽的方法。
然而，如上所述，高α-淀粉酶活性与对植物适合度的不期望的影响有关。特别地，高α-淀粉酶活性可与谷粒淀粉含量降低和/或收获前出芽有关。收获前出芽是植物上生理成熟的籽粒开始表现为发芽种子而不是淀粉储存谷粒的现象。收获前出芽的特征在于收获前谷粒的早熟发芽，结果降低了种子活力和最终使用价值。因此，收获前出芽使大麦倾向于相对迅速地丧失种子活力，并且由于麦芽制造工艺需要发芽，所以非常不期望其发生在用于麦芽制造的大麦作物中。收获前出芽最经常与降雨和在谷物完全成熟后延长的潮湿天气有关。α-淀粉酶活性与早发芽和早熟出芽相关，并可用作出芽损伤的指示(Schwarz等，2004)。
因此，需要这样的大麦植物，其在发芽开始后不久具有高水平的淀粉降解酶活性，但其仍然具有高淀粉含量的谷粒，这导致高产量和/或低收获前出芽发生率。
本发明提供了在发芽开始后不久具有高水平的淀粉降解酶活性的大麦植物，特别地，所述大麦植物具有高水平的α-淀粉酶活性和极限糊精酶活性。此类大麦植物特别可用于发芽时间缩短的生产基于谷物的饮料的方法。
本发明解决的一个技术问题是提供在发芽开始后不久，例如在麦芽开始后已经72小时或甚至早在发芽开始后48小时就具有高α-淀粉酶活性和极限糊精酶活性的大麦植物，其中所述大麦植物同时具有可接受的农艺学性状。本发明的一个方面提供了在HRT基因中携带突变的大麦植物。本发明令人惊讶地证明了具有HRT功能丧失的大麦植物是有活力的，是农艺学合理的，并且具有与其它大麦栽培种相当的产量。同时，此类大麦植物在发芽开始后48小时已经具有高的α-淀粉酶和极限糊精酶活性。本发明解决的另一个技术问题是提供即使在降低的氧条件下也具有足够发芽的大麦植物。有趣的是，具有HRT功能丧失的大麦植物也解决了这个技术问题。
Raventos等1998描述了当在瞬时表达后的植物细胞中测试时，大麦基因Hv转录抑制因子(HvHRT)的全长蛋白产物在多种不同启动子上充当转录阻抑物。瞬时表达通常导致表达水平比天然表达水平高得多，并且因此不可能使用瞬时表达测定最终推断蛋白的功能。在这些人工设置中，HRT的瞬时表达导致在不同α-淀粉酶启动子(Amy2和Amy1)控制下的报道基因的表达降低，但也导致自组成型CaMV 35S启动子的表达降低(Raventos等1998)。因此，基于Raventos等人，HRT这种具有三个DNA结合结构域的蛋白可以结合并影响自不同启动子序列的表达。具有HRT功能缺失的突变体可具有许多基因的异常转录。此外，Raventos等描述了HRT mRNA在未成熟组织中积累，例如在未成熟种子、未成熟胚和未成熟胚乳/糊粉粒中积累。相比之下，HRT mRNA在发芽种子的各层中几乎检测不到。在此基础上，HRT可能潜在地参与确保α-淀粉酶在不期望高α-淀粉酶活性的大麦发育的时间点不表达。在植物发育期间高的α-淀粉酶活性是不希望的，因为它可能损害适当的谷粒灌浆，可能导致谷粒淀粉减少并导致收获前出芽。本发明证明了这些大麦突变体仍然健康且有活力。此外，即便Raventos等人公开了在发芽种子的各层上几乎检测不到HRT mRNA，本发明仍令人惊奇地证明HRT功能的丧失导致了发芽种子中α-淀粉酶活性的增加。
推定的阻抑物的功能丧失性突变的作用通常难以预测。首先，基于瞬时表达研究不能最终预测在体内环境中阻遏物是否实际上是阻遏物。此外，阻抑物的突变可能影响大量基因，并且因此不能预测影响。此外，也不能预测突变是否实际上会导致靶基因表达的增加。例如，KGM已被描述在瞬时转染后在GAMYB功能水平上特异性抑制α-淀粉酶启动子活性(Woodger等，2003)。然而编码KGM的基因中的两种不同的突变，其中一个突变是引入提前的终止密码子的突变，都不会导致α-淀粉酶活性增加。
本发明进一步描述了大麦基因HBL12(同源异形盒样12(HomeoBoxLike12))的鉴定。该大麦基因在本文中也称为HvHBL12。Mascher等人，2017描述了大麦基因组的测序。此外，Mascher等人，2017提供了包含总共123,875个校正序列的大麦模型cv.Morex的转录组。基于该信息，本发明人发现HvHBL12在几种组织中表达，包括发芽谷粒的胚组织。
拟南芥(Arabidopsis thaliana)包含与HvHBL12具有有限序列同一性的基因。因此，拟南芥的ATHB12(拟南芥同源异形盒12)基因与HvHBL12具有约70％的DNA序列同一性。ATHB12是在模式植物拟南芥中发现和研究的同源异形结构域-亮氨酸拉链(HD-Zip)I类转录因子。Valdés等(2012)报道了ATHB12表达由激素ABA诱导。Son等(2010)报道了基因产物ATHB12阻抑了拟南芥茎中GA生物合成途径的基因GA20氧化酶1(GA20ox1)。具有ATHB12的功能丧失性突变的拟南芥植物具有更长的茎。Valdés等2012和Son等2010都没有讨论ATHB12在早期发芽期间的作用。
如上所述，本发明解决的一个技术问题是提供在发芽开始后不久，例如已经在发芽开始后已经72小时或甚至早在发芽开始后48小时就具有高α-淀粉酶和极限糊精酶活性的大麦植物，其中所述大麦植物同时具有可接受的农艺学性状。在一个方面，本发明提供了在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物。本发明令人惊讶地证明了具有HvHBL12功能丧失的大麦植物是有活力的，农艺学上是合理的，具有与野生型大麦长度相当的茎，并且具有与其它大麦栽培种相当的产量。同时，此类大麦植物在发芽开始后已经48小时具有高的α-淀粉酶和极限糊精酶活性。本发明解决的另一个技术问题是提供在谷粒发芽期间对氧和低氧条件具有较低敏感性的大麦植物。有趣的是，具有HvHBL12功能丧失的大麦植物也解决了这个技术问题。
Zou等人2008提出，Amy32b的表达受蛋白复合物调节，并且阻抑物或激活物复合物的相对量调节表达。Zou等人2008进一步提出，HvWRKY38和BPBF可作为转录阻抑物。然而，这些建议基于使用Amy32b启动子控制下的GUS报告基因的非常人工的设置的数据。此外，根据Zou等2008年，不可能预测阻抑物或激活物的哪些相对量将导致Amy32b表达的调节。如上所述，推定的阻抑物的功能丧失性突变的作用通常难以预测。
如上所述，本发明解决的一个技术问题是提供在发芽开始后不久具有高α-淀粉酶和极限糊精酶活性的大麦植物，其中所述大麦植物同时具有可接受的农艺学性状。在一个方面，本发明提供了携带WRKY38基因中的突变的大麦植物。
因此，本发明的一个方面是提供具有高α-淀粉酶活性的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物
·在HvHRT基因中携带突变，导致HvHRT功能丧失；和/或
·携带至少一种α-淀粉酶基因，其包含在GARE盒中含有突变的突变体α-淀粉酶启动子；和/或
·携带至少四个α-淀粉酶基因，其包括具有序列TAACAAA的GARE盒；和/或
·携带amy2簇中的至少一个α-淀粉酶基因，其包含在GARE盒中含有突变的突变体α-淀粉酶启动子，GARE盒具有序列TAACAAA；和/或
·在HvHBL12基因中携带突变，导致HvHBL12功能丧失；和/或
·携带至少四个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子，其中所述非标准串联重复W-盒包含序列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)，其中一个或多个特定核苷酸已被取代或缺失，且其中X可以是任何核苷酸，n是0或1，并且m是0-20范围内的整数；和/或
·携带amy2簇中的至少一个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子；
·在WRKY38基因中携带突变，导致WRKY38功能丧失。
附图说明
图1显示在4ml(左列)或8ml(右列)水存在下的标准发芽试验后，CV.Paustian(wt)和大麦突变体HENZ-2的发芽谷粒％。
图2显示了以90L/h/kg大麦谷粒干重的气流在水中温育24小时和48小时后，CV.Paustian(wt)和大麦突变体HENZ-2谷粒的谷粒含水量。
图3显示了以90L/h/kg大麦谷粒干重的气流在水中温育48h后，通过ddPCR测定的，在cv.Paustian(wt)和大麦突变体HENZ-2中，由amy1_1簇(左列2个)、amy1_2簇(中列2个)的α-淀粉酶基因编码的α-淀粉酶mRNA和BGL2A+BGL2B mRNA(右列2个-表示为"BGL2A")的基因表达。
图4显示了以90L/h/kg大麦谷粒干重的气流在水中温育24小时和48小时后，cv.Paustian(wt)和大麦突变体HENZ-2中，α-淀粉酶活性(图4A)、β-淀粉酶活性(图4B)和极限糊精酶活性(图4C)。
图5显示了已被剥皮并在水中温育24小时(24h)或者在水中温育24小时并且在空气中温育24小时(48h)且在温育期间气流为90L/h/kg大麦谷粒干重时，cv.Paustian(wt)和大麦突变体HENZ-2谷粒的α-淀粉酶活性(图5A)、β-淀粉酶活性(图5B)和极限糊精酶活性(图5C)。
图6显示在4ml(左列)或8ml(右列)水存在下的标准发芽试验后，cv.Hull-less 1(wt)和大麦突变体HENZ-10的发芽谷粒％。
图7显示了在水中温育48小时后，通过ddPCR测定的cv.Hull-less 1(wt)和大麦突变体HENZ-10中，amy1_1簇、amy1_2簇、极限糊精酶mRNA(LD)、AGL97 mRNA、BGL2A mRNA和BGL2B mRNA的α-淀粉酶基因编码的α-淀粉酶mRNA的表达。
图8显示了以每kg大麦谷粒干重90L/h的气流在水中温育后，通过ddPCR测定的cv.Hull-less 1(wt)和大麦突变体HENZ-10中，amy1_1簇、amy1_2簇、极限糊精酶mRNA(LD)和BGL2A mRNA的α-淀粉酶基因编码的α-淀粉酶mRNA的基因表达。
图9显示了以90L/h/kg大麦谷粒干重的气流在水中温育24h和48h后，Hull-less 1(wt)和大麦突变体HENZ-10中的α-淀粉酶活性(图9A)、β-淀粉酶活性(图9B)和极限糊精酶活性(图9C)。
图10显示了在相似条件下在田间培养后Hull-less 1(wt)和大麦突变体HENZ-10的植物高度。
图11显示了含有调节盒的α-淀粉酶启动子的部分的比对，所述调节盒来自amy1_1和amy1_2簇的不同α-淀粉酶基因以及HENZ-43突变体的amy1_1(图11A)和amy2簇的α-淀粉酶基因(图11B)。HENZ-43突变体的突变用#标记。
图12显示了用于制备绿麦芽的设备的实例。该设备包括一个槽(2)，谷粒可在其中浸入水溶液并连续通气。该设备包括大麦谷粒的入口(1)，槽，例如浸泡槽(2)；气体入口(3)，例如烧结石；泵(4)，例如空气泵；用于大麦谷粒的出口(5)；谷粒泵(6)；用于精细分割大麦谷粒的设备(7)，例如，研磨机；入口(8)；容器(9)，例如糖化容器，以及出口(10)。
图13显示了在发芽开始后48小时和72小时，在水中浸没并以9L/h的气流发芽的大麦谷粒中的α-淀粉酶活性。图13A显示了大麦突变体HENZ-2和对照纯合大麦植物(WT)的α-淀粉酶活性，而图13B显示了大麦突变体HENZ-10和大麦野生型Hull-less 1(wt)的α-淀粉酶活性。
图14示出了在发芽开始后24h、48h和72h时，在大麦突变体HENZ-10和大麦野生型Hull-less 1(wt)中，在水中浸没但没有气流发芽麦芽的大麦谷粒中的α-淀粉酶活性。
图15显示了在发芽开始后72小时，在水中浸没但没有气流发芽的大麦谷粒中的α-淀粉酶活性。图15上图显示了大麦突变体HENZ-2a和cv.Planet的野生型大麦的α-淀粉酶活性。图15中间的图显示了大麦突变体HENZ-54和cv.Planet的野生型大麦的α-淀粉酶活性。图15下图显示大麦突变体HENZ-43和cv.Planet的野生型大麦的α-淀粉酶活性。
图16显示了在发芽开始后0、12h、24h和48h，通过RT ddPCR测定的，在大麦突变体HENZ-2和对照纯合大麦植物(WT)的发芽谷粒中由amy1_1簇(图16A)、amy1_2基因(图16B)和amy2簇(图16C)的α-淀粉酶基因编码的α-淀粉酶mRNA的基因表达。
图17显示了在72小时后，通过RT ddPCR测定的，在大麦突变体HENZ-2a和cvPlanet的野生型大麦的发芽谷粒中(图17A)、在大麦突变体HENZ-54和cv Planet的野生型大麦的发芽谷粒中(图17B)以及在大麦突变体HENZ-43和cv Planet的野生型大麦的发芽谷粒中(图17C)，amy1_1簇的α-淀粉酶基因编码的α-淀粉酶mRNA的基因表达。
图18显示了发芽72小时后，通过RT ddPCR测定的，在大麦突变体HENZ-2a和cvPlanet的野生型大麦的发芽谷粒中(图18A)、在大麦突变体HENZ-54和cv Planet的野生型大麦的发芽谷粒中(图18B)以及在大麦突变体HENZ-43和cv Planet的野生型大麦的发芽谷粒中(图18C和18D)，amy1_2基因(图18A、18B和18C)和amy2簇(图18D)的α-淀粉酶基因编码的α-淀粉酶mRNA的基因表达。
图19显示了72小时后，通过RT ddPCR测定的，大麦突变体HENZ-2a和cv.Planet的野生型大麦(上图)、大麦突变体HENZ-54和cv Planet的野生型大麦(中图)以及大麦突变体HENZ-43和cv Planet野生型大麦(下图)的发芽谷粒中极限糊精酶mRNA的表达。
图20显示了72小时后，通过RT ddPCR测定的，在大麦突变体HENZ-2a和cv.Planet的野生型大麦(图20A)、大麦突变体HENZ-54和cv.Planet的野生型大麦(图20B)和大麦突变体HENZ-43和cv.Planet的野生型大麦(图20C)的发芽谷粒中，Bgl2基因的基因表达。
具体实施方式
定义
如本文所用，"一"可表示一个或多个，这取决于其所使用的上下文。
如本文所用，术语"α-淀粉酶"是指具有α-淀粉酶活性的酶。特别地，本发明的α-淀粉酶是一种能够催化含有三个或更多个(1→4)-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中(1→4)-α-D-糖苷键的内切水解的酶。α-淀粉酶活性可以通过K-CERA01/12(可从Megazyme，爱尔兰获得方案和试剂盒)测定。
本文所用的术语"附加助剂"是指在啤酒制备过程中加入的富碳原料来源。附加助剂可以是未发芽的谷物谷粒，其可以与根据本发明制备的发芽的谷粒一起碾磨。附加助剂也可以是糖浆、糖等。
当在本文中与数值相关使用时，术语"大约"优选地意指±10％，更优选地±5％，还更优选地±1％。
如本文所用的术语"氨基酸"是指蛋白原氨基酸。优选地，蛋白原氨基酸是由标准遗传密码编码的20种氨基酸之一。IUPAC单字母代码和三字母代码用于命名氨基酸。
术语"对应于X的氨基酸"在本文中用于描述相对于参照多肽(例如，SEQ ID NO：2、6、11或12的任何多肽)的氨基酸，给定多肽(例如，突变体HRT、HBL12或WRKY38多肽)的氨基酸。在所述多肽和参照多肽之间进行比对后，如果氨基酸与X在所述比对中处于相同位置，则该氨基酸对应于X。
术语"直链淀粉"是指α-D-葡萄糖的均聚物。直链淀粉具有线性分子结构，因为其葡萄糖单元几乎仅通过α-1-4糖苷键连接。
术语"支链淀粉"是指α-D-葡萄糖的均聚物。支链淀粉分子含有频繁的α-1-6糖苷键。这些将分支点引入到α-1-4-连接的葡萄糖链中，导致沿着分子的轴以规则的间隔出现的平行链簇。
本文所用的术语"大麦粉"是指磨碎的大麦麦粒。
术语β-淀粉酶是指催化多糖中(1-＞4)-α-D-糖苷键水解以便从链的非还原末端除去连续麦芽糖单元的酶。β-淀粉酶活性可通过K-BETA3(可从Megazyme，爱尔兰获得的方案和试剂盒)测定。
本文所用的术语“嫩芽(chit)”是指在谷物谷粒的发芽期期间可见的胚生长芽。
本文所用术语"高产量"是指与高产大麦栽培种的产量相当的产量。特别地，"高产量"可以是在相同条件下生长的cv.Planet的大麦植物产量的至少95％，例如至少98％，例如至少100％的产量。
对于制备基于大麦的饮料如啤酒的过程，特别是当用于描述麦芽制造过程时，术语"大麦"是指大麦麦粒。在所有其它情况下，除非另有说明，否则"大麦"是指大麦植物(栽培大麦(Hordeum vulgare，L))，包括任何育种品系或栽培品种或变种，而大麦植物的部分可以是大麦植物的任何部分，例如任何组织或细胞。
如本文所定义的，"谷物"植物是禾本科(Poaceae)植物科的成员，栽培它们主要为了它们的含淀粉种子或米粒。谷物植物包括但不限于大麦(大麦属(Hordeum))、小麦(小麦属(Triticum))、水稻(稻属(Oryza))、玉米(玉蜀黍属(Zea))、黑麦(黑麦属(Secale))、燕麦(燕麦属(Avena))、高粱(高粱属(Sorghum))和黑小麦(黑麦-小麦杂种)。
在特定核酸的上下文中，"编码"或"编码的"是指包含用于翻译成特定蛋白的信息。编码蛋白的核酸或多核苷酸可以在核酸的翻译区内包含非翻译序列，例如内含子，或者可以缺少此类插入的非翻译序列，例如在cDNA中。编码蛋白的信息通过使用密码子来指定。
如本文所用，在核酸的上下文中，"表达"应理解为mRNA的转录和积累。在蛋白的上下文中使用时，"表达"是指mRNA翻译成多肽。
术语"基因"是指参与产生多肽链的DNA片段；它包括编码区之前和之后的区域(启动子和终止子)。此外，植物基因通常由被内含子中断的外显子组成。
本文所用的术语"开始发芽"是指含水量小于15％的大麦谷粒与足够的水接触以开始发芽的时间点。
本文所用的术语"麦芽制造"是指在受控环境条件下发生的谷物米粒(特别是大麦麦粒)的受控发芽。在一些实施方案中，"麦芽制造"可以进一步包括干燥所述发芽的谷物米粒的步骤，例如通过窑烧干燥。
本文所用的术语"发芽的谷粒"是指已经发育有可见的嫩芽和可见的茎的谷粒。
本文所用的术语"绿麦芽"是指没有经过窑烧干燥步骤的发芽的谷物米粒。通常，所述谷物米粒已经在受控的环境条件下发芽。在一些实施方案中，所述绿麦芽是磨碎的绿麦芽。
本文所用术语"窑烧干燥的麦芽"是指已通过窑烧干燥进行干燥的发芽的谷物米粒。通常，所述谷物米粒已经在受控的环境条件下发芽。在一些实施方案中，窑烧干燥麦芽是磨碎的窑烧干燥麦芽。
本文所用的术语"极限糊精酶"是指能够催化支链淀粉和糖原和普鲁兰多糖中的α-和β-极限糊精中的(1-＞6)-α-D-糖苷键水解的酶。特别地，极限糊精酶可以是分类在EC3.2.1.142下的酶。极限-糊精酶活性通过T-LDZ1000(可从Megazyme，爱尔兰获得的方案和试剂盒)测定。
"糖化"是将磨碎的麦芽(例如，绿麦芽或窑烧干燥麦芽)和/或未发芽的谷物米粒在水中温育。糖化优选在特定温度和特定体积的水中进行。
术语"磨碎"是指例如通过切割、磨碎、研磨或压碎而被精细分割的材料(例如，大麦麦粒或麦芽)。可以在湿润时使用例如研磨机或湿磨机研磨大麦麦粒。磨碎的大麦麦粒或磨碎的麦芽充分地精细分割以使该材料可用于水性提取物。磨碎的大麦麦粒或磨碎的麦芽不能通过基本上生物的方法再生成完整的植物。
"突变"包括基因的编码区和非编码区中的缺失、插入、置换、颠换和点突变。缺失可以是整个基因的缺失，或者仅是基因的一部分的缺失。点突变可涉及一个碱基对的变化，并可产生提前的终止密码子、移码突变、剪接位点突变或氨基酸取代。包含突变的基因可以称为"突变体基因"。如果所述突变体基因编码具有不同于野生型的序列的多肽，则所述多肽可被称为"突变体多肽"。当突变体多肽包含不同于野生型序列的氨基酸序列时，可将其描述为携带突变。术语"XnnnY"表示位置nnn的氨基酸或核苷酸X已被Y取代，因此，例如Xnnn终止表示在位置nnn编码氨基酸X的密码子已被终止密码子取代。
术语"植物产品"是指由植物或植物材料的加工产生的产品。因此，所述植物产品可以是例如绿麦芽、窑烧干燥麦芽、麦芽汁、发酵或非发酵饮料、食品或饲料产品。
本文所用的术语"后代"是指直接或间接地是给定植物的后代的植物。因此，后代不限于直接的后代，还包括多代后的后代。通常，携带特定突变的大麦植物的后代也携带该特定突变。
如本文所用的术语"序列同一性"是指比对后候选序列与参考序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比。因此，与参考序列具有80％氨基酸同一性的候选序列需要在比对后，候选序列中80％的氨基酸与参考序列中相应的氨基酸相同。本发明的同一性通过计算机分析来确定，例如但不限于用于多肽序列比对的Clustal Omega计算机比对程序(Sievers等人(2011年10月11日)Molecular Systems Biology 7:539，PMID：21988835；Li等人(2015年4月6日)Nucleic Acids Research 43(W1)：W580-4 PMID：25845596；McWilliam等人，(2013年5月13日)Nucleic Acids Research 41(Web Server Issue)：W597-600 PMID：23671338以及其中建议的默认参数。Clustal Omega软件可从EMBL-EBI以https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/获得。使用该程序和其默认设置，将查询的成熟(生物活性)部分与参考多肽进行比对。对完全保守残基的数目进行计数，并除以参照多肽的长度。MUSCLE或MAFFT算法可用于核苷酸序列的比对。序列同一性可以以与针对氨基酸序列所示的类似方式计算。因此，本文提供的序列同一性是在参考序列的全长上计算的。
如本文所用，术语"浸泡"是指增加谷物米粒的含水量的过程。
如本文所用，术语"淀粉"是指离散大分子直链淀粉和支链淀粉的一者或两者的组合物。
如本文所用的术语"剪接位点"指作为剪接过程的剪接信号的共有序列。剪接位点突变是一种基因突变，其在剪接过程中，即前体信使RNA加工成成熟信使RNA(mRNA)的过程中，在发生剪接的特定位点插入、缺失或改变许多核苷酸。驱动外显子识别的剪接位点共有序列通常位于内含子的最末端。
本文所用的术语"终止密码子"是指遗传密码中的核苷酸三联体，其在mRNA中导致翻译终止。本文所用的术语"终止密码子"也指基因内的编码mRNA中终止密码子的核苷酸三联体。DNA中的终止密码子通常具有以下序列之一：TAG、TAA或TGA。
本文所用的术语谷物的"含水量"是指所述谷粒中H2O的w/w％。
如本文所用，谷物谷粒的酶活性是指在由指定谷粒类型制备的面粉中测量的活性。例如，每克谷物谷粒中10U/g的α-淀粉酶活性是指在来自1g所述谷物的面粉(干物质)的水性提取物中测量的所述α-淀粉酶活性(10U)。
如本文所指出的气体的体积是指在1atm和20℃下所述气体的体积。
如本文所示的O2的体积是指在1atm和20℃下O2的体积。在O2包含在气体混合物中的本发明实施方案中，可确定气体混合物的总体积，且O2的体积可被计算为由O2构成的总体积的百分比。例如，大气空气包含21％O2。因此，本文所用的大气中O2的体积为大气总体积的21％。
术语"麦芽汁"是指麦芽和/或谷物米粒(例如磨碎的麦芽和/或磨碎的谷物米粒和任选的附加附加助剂)的液体提取物。麦芽汁通常通过糖化，任选地随后是在用热水糖化后从废谷粒中提取残余的糖和其它化合物的过程中进行"洗槽"(sparging)，来获得。洗槽通常在过滤槽、醪液过滤器或其它设备中进行，以允许从废谷粒中分离出提取的水。糖化后得到的麦芽汁通常称为"初次麦芽汁"，而洗槽后得到的麦芽汁通常称为"二次麦芽汁"。如果没有指定，术语麦芽汁可以是初次麦芽汁、二次麦芽汁或两者的组合。在传统的啤酒生产过程中，麦芽汁与啤酒花一起煮沸。不含啤酒花的麦芽汁也可以称为"甜麦芽汁"，而与啤酒花一起煮沸的麦芽汁可以称为"煮沸的麦芽汁"或简单地称为麦芽汁。
α-淀粉酶和在α-淀粉酶启动子中携带突变的大麦植物
本文所用的术语α-淀粉酶是指能够催化α-连接的多糖如淀粉内的α键水解的酶。α-淀粉酶通常是分类为EC3.2.1.1的酶。α-淀粉酶也称为αlpha-淀粉酶。
谷物植物可包含多于一种编码α-淀粉酶的基因。因此，本发明的大麦植物可以包含多于一种编码α-淀粉酶的基因。通常，编码α-淀粉酶的基因可以组织在基因簇中。
本发明的α-淀粉酶可以特别地是具有登录号HORVU6Hr1G078330.1、HORVU6Hr1G078360.1、HORVU6Hr1G078420.1、HORVU6Hr1G080790.1、HORVU7Hr1G091150.1、HORVU7Hr1G091240.1或HORVU7Hr1G091250.3的序列的多肽或与其具有至少90％，例如至少95％序列同一性的功能同源物，其中所述登录号是来自Mascher等人，2017公布的大麦基因组测序项目的登录号。这些序列也可以在BARLEX数据库中获得：https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f？p＝284:10。
因此，本发明的大麦植物可以包含至少1个，优选至少2个，例如至少3个，例如3个α-淀粉酶基因簇。特别地，大麦植物可以包含Amy1_1簇、Amy1_2簇和Amy2簇。amy1_2簇通常仅包含一个基因，然而为了简单起见，本文中仍然称为amy1_2簇。除了上述簇之外，大麦植物可以含有额外的α-淀粉酶基因/簇(例如amy3、amy4_1和amy4_2基因)。这些簇中的每一个都可包含一个或多个α-淀粉酶基因。
α-淀粉酶基因序列的实例可从Mascher等人，2017出版的大麦基因组项目获得。
每种α-淀粉酶基因通常包含启动子区(本文中称为α-淀粉酶启动子)、编码区和一个或多个内含子。如本文所用，α-淀粉酶启动子包含1000个核苷酸的序列或由其组成，例如在α-淀粉酶基因的编码序列的起始密码子(ATG)的上游紧邻的800个核苷酸。每个簇内和不同大麦栽培种之间的单基因拷贝的精确序列可显示α-淀粉酶启动子的显著差异，然而某些调节盒在多个α-淀粉酶基因之间是保守的。特别地，所述调节盒在Amy1_1簇、Amy1_2簇和Amy2簇的α-淀粉酶基因间可以是保守的。图11显示了含有所述调节盒的α-淀粉酶启动子的部分的比对，所述调节盒来自amy1_1和amy1_2簇的不同α-淀粉酶基因(图11A)，以及来自amy2簇的α-淀粉酶基因(图11B)。
特别地，本发明大麦植物的一个或多个α-淀粉酶基因可以包含具有序列TAACARA的GARE盒，其中R是G或A。这特别是amy1_1簇、amy1_2簇或amy2簇的α-淀粉酶基因的情况。通常，每个α-淀粉酶启动子包含至多一个GARE盒。amy3和amy4簇的α-淀粉酶基因通常不含GARE盒。
在本发明的一个实施方案中，优选大麦植物包含一个或多个α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因包含含有突变的GARE盒的α-淀粉酶启动子。换句话说，一个或多个α-淀粉酶启动子可以不包含野生型GARE盒，而是包含突变的GARE盒，其中核苷酸TAACARA的一个或多个被取代或缺失。优选地，所述突变的GARE盒是其中仅核苷酸TAACARA的一个核苷酸被取代或缺失的GARE盒。特别地，大麦植物可以包含amy1_1簇、amy1_2簇或amy2簇的一个或多个α-淀粉酶基因，其包含含有突变的GARE盒的α-淀粉酶启动子。
在另一个实施方案中，优选本发明的大麦植物包含一个或多个α-淀粉酶基因，优选至少4个，例如至少5个，例如至少6个α-淀粉酶基因，例如至少7个α-淀粉酶基因，其包含含有一个具有TAACAAA序列的GARE盒的α-淀粉酶启动子。特别地，所述α-淀粉酶基因可以是Amy1_1簇、Amy1_2簇或Amy2簇的α-淀粉酶基因。所述α-淀粉酶基因也可含有PYR盒。本文所用的术语"PYR盒"是指序列CMTTTT，其中M是C或A。
此外，本发明大麦植物的一个或多个α-淀粉酶基因可以包含串联重复W-盒。标准串联重复W-盒具有序列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)，其中每个X单独地可以是任何核苷酸，n是0或1，m是0至20范围内的整数。应理解在任何给定的串联重复W-盒内，单独的X可以是相同或不同的核苷酸。通常，每个α-淀粉酶启动子仅包含一个串联重复W-盒。
在本发明的一个实施方案中，优选大麦植物包含一个或多个α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子。换句话说，一个或多个α-淀粉酶启动子可以不包含标准串联重复W-盒，而是包含非标准串联重复W-盒，其中标准串联重复W-盒(TGAC(C)n(X)mTTGACC)的一个或多个核苷酸已被取代或缺失。应理解，所述一个或多个已被取代或缺失的核苷酸是标准串联重复W盒的一个或多个特定核苷酸(即不是任何X)。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含一个或多个α-淀粉酶基因，例如至少4个，例如至少5个，例如至少6个，例如至少7个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子，所述非标准串联重复W-盒分别选自由下列序列组成的组：
(TGACR(X)mYTGRCC)，其中R是G或A，Y是C或T，m是0-20的整数；或
(TGACR(X)mTTGACC)，其中R是G或A，m是0-20的整数；或
(TGACR(X)mTTGAC)，其中R是G或A，m是0-20的整数；或
(TGAC(C)n(X)mYTGRCC)，其中R是G或A，Y是C或T，n是0或1，m是0-20的整数；或
(TGAC(C)n(X)mCTGRCC)，其中R为G或A，n为0或1，m为0-20的整数；
(TGAC(C)n(X)mYTGGCC)，其中Y是C或T，n是0或1，m是0-20的整数；或
(TGAC(C)n(X)mCTGACC)，其中n为0或1，m为0-20的整数；
(TGAC(C)n(X)mTTGGCC)，其中n是0或1，m是0-20的整数
(TGAC(C)n(X)mTTGATC)，其中n是0或1，m是0-20的整数；或者，
如上所述，m可以是0-20的整数，优选m是0-10的整数，更优选m是0-6的整数。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含一个或多个α-淀粉酶基因，例如至少5个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子，所述非标准串联重复W-盒是分别选自以下序列的非标准串联重复W-盒：
TGACGGTCGTATTGACC(SEQ ID NO:31)；
TGACAGTGGTATTGGCC(SEQ ID NO:32)；
TGACAGTGGTACTGGCC(SEQ ID NO:33)；
GTGACAGTGGTATTGGCC(SEQ ID NO:34)；
TGACGGTCGTATTGATC(SEQ ID NO:35)；
TGACCGTCGTATTGATC(SEQ ID NO:36)；和
TTGACTTGATC(SEQ ID NO:37)。
本文提供的数据库搜索和启动子再测序证明，amy1_1、amy1_2和amy2簇的α-淀粉酶基因的α-淀粉酶启动子包含GARE盒序列。特别地，野生型大麦中amy2簇的α-淀粉酶基因包含具有序列TAACAGA的GARE盒。
amy1_1簇可包含1至5个α-淀粉酶基因，然而并非所有α-淀粉酶基因都必须表达。因此，在一些大麦植物(例如在cv.Barke或其后代中)中，amy1_1簇包含至少三个主要拷贝，而其它大麦植物(例如cv.Planet或其后代)可以在amy1_1簇中包含三个α-淀粉酶基因，其中只有两个可能被表达。例如，一些α-淀粉酶启动子缺少PYR盒，因此被认为不能表达。本发明的α-淀粉酶可以是由amy1_1簇的基因编码的α-淀粉酶。例如，α-淀粉酶可以是具有登录号AAA98790.1或BAK03603.1的序列的多肽或其与其具有至少90％，例如至少95％序列同一性的功能同源物，其中所述登录号是NCBI数据库的登录号。α-淀粉酶还可以是具有登录号HORVU6Hr1G078330.1、HORVU6Hr1G078360.1、HORVU6Hr1G078420.1、HORVU0Hr1G032700.1或HORVU0Hr1G032850.5的序列的多肽或其与其具有至少90％，例如至少95％序列同一性的功能同源物，其中所述登录号为BARLEX数据库(https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f？p＝284:10)的登录号并且由Mascher等人,2017出版。
本发明的大麦植物包含amy1_1簇，其中至少一个α-淀粉酶启动子，优选所有α-淀粉酶启动子包含：
·仅突变的GARE盒，其中GARE盒(TAACARA)的一个核苷酸被取代或缺失；和/或
·序列为TAACAAA的GARE盒；和/或
·仅非标准串联重复W-盒，其中标准串联重复W-盒(TGAC(C)n(X)mTTGACC)的一个或多个特定核苷酸已被取代或缺失，例如所述非标准串联重复W-盒可具有上文所述的任何非标准串联重复W-盒序列。
另外，所述α-淀粉酶启动子可包含PYR盒。
本文所用的术语"仅突变的GARE盒"指所述启动子仅包含一个GARE盒，其中所述GARE盒是突变的，即所述启动子除了所述突变的GARE盒之外，不含野生型GARE盒。类似地，本文所用的术语"仅非标准串联重复W盒"是指所述启动子仅包含一个串联重复W盒，其中所述串联重复W盒是非标准串联重复W盒，即所述启动子除了所述非标准串联重复W盒之外不含标准串联重复W盒。
如本发明所示，与具有序列TAACAGA的GARE盒相比，具有序列TAACAAA的GARE盒具有较低的HRT结合。类似地，认为WRKY38与非标准串联重复W盒的结合低于与标准串联重复W盒的结合。在96种麦芽制造大麦的世界小组(2行春大麦、2行冬大麦、6行冬大麦)中，可以发现六个独特的amy1_1簇。在该组中，具有最高α-淀粉酶活性的大麦总是包含至少三个α-淀粉酶基因的amy1_1簇，所述α-淀粉酶基因包含含有具有序列TAACAAA的GARE盒的α-淀粉酶启动子。不幸的是，在该组中测试的具有最高α-淀粉酶活性的大麦植物不具有最高产量。在一个实施方案中，本发明提供了具有高产量和高α-淀粉酶活性的大麦植物。
在一个实施方案中，所述大麦植物包含amy1_1簇，其中至少一个α-淀粉酶启动子包含含有序列TTGATC的非标准串联重复W-盒。例如，大麦植物可以包含amy1_1簇，其中至少一个α-淀粉酶启动子包含含有序列CTGACGGTCGTATTGATC(SEQ ID NO：72)的非标准串联重复W-盒。特别地，大麦植物可以包含α-淀粉酶启动子，其包含图11A中显示为"HENZ-43amy1_1"的序列。所述大麦植物可以是例如HENZ-43或其后代。例如，所述大麦植物可以是如实施例13A中所述鉴定的大麦植物或其后代。
amy1_2簇通常仅包含单个α-淀粉酶基因。amy1_2簇通常与大麦基因组中的amy1_1簇紧密连锁。本发明的α-淀粉酶可以是由amy1_2簇的基因编码的α-淀粉酶。例如，α-淀粉酶可以是具有登录号AAA98615.1序列的多肽或其与其具有至少90％，例如至少95％序列同一性的功能同源物，其中所述登录号是NCBI数据库的登录号。α-淀粉酶还可以是具有登录号HORVU6Hr1G080790.1的序列的多肽或其与之具有至少90％，例如至少95％序列同一性的功能同源物，其中所述登录号是BARLEX数据库的登录号((https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f？p＝284:10)并描述于Mascher等人,2017。
通常，amy1_2簇的α-淀粉酶基因包含α-淀粉酶启动子，其包含具有序列TAACAAA的GARE盒。本发明的大麦植物可以包含amy1_2簇，其包含具有α-淀粉酶启动子的α-淀粉酶，所述α-淀粉酶启动子包含：
·仅突变的GARE盒，其中GARE盒(TAACARA)的一个核苷酸被取代或缺失；和/或
·序列为TAACAAA的GARE盒；和/或
·仅非标准串联重复W-盒，其中标准串联重复W-盒(TGAC(C)n(X)mTTGACC)的一个或多个特定核苷酸已被取代或缺失，例如所述非标准串联重复W-盒可具有上文所述的任何非标准串联重复W-盒序列。
amy2簇可以由α-淀粉酶基因的三个表达拷贝组成。例如cv.Morex中的情况就是这样。在野生型大麦中，amy2簇的每个α-淀粉酶基因可包含具有序列TAACAGA的GARE盒。
本发明的α-淀粉酶可以是由amy2簇的基因编码的α-淀粉酶。例如，α-淀粉酶可以是具有登录号HORVU7Hr1G091150.1、HORVU7Hr1G091240.1、HORVU7Hr1G091250.3的序列的多肽或其与其具有至少85％，例如至少90％序列同一性的功能同源物，其中所述登录号是BARLEX数据库的登录号(https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f？p＝284:10)且描述于Mascher等，2017)。
相比之下，本发明的大麦植物可以包含amy2簇，其包含一个或多个具有α-淀粉酶启动子的α-淀粉酶基因，其中α-淀粉酶启动子包含：
·仅突变的GARE盒，其中核苷酸TAACARA的一个或多个被取代或缺失，
·序列为TAACAAA的GARE盒，
·仅非标准串联重复W-盒，其中标准串联重复W-盒(TGAC(C)n(X)mTTGACC)的一个或多个特定核苷酸已被取代或缺失，例如所述非标准串联重复W-盒可具有上文所述的任何非标准串联重复W-盒序列。
特别地，所述大麦植物可以包含amy2簇，其包含一个或多个具有α-淀粉酶启动子的α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶启动子包含突变的串联重复W-盒，该突变的串联重复W-盒包含序列TTGACTTGACC，其中至少一个核苷酸已被取代或缺失。
HRT
当在瞬时表达后在植物细胞中测试时，大麦转录Hv阻抑基因(HvHRT)的全长蛋白产物在多种不同启动子上充当转录阻抑物。在这些非常人工的环境中，HRT的瞬时表达导致在不同α-淀粉酶启动子(Amy2和Amy1)控制下的报道基因的表达降低，但也导致自组成型CaMV 35S启动子的表达降低。发现amy2启动子的阻抑在该系统中更强(Raventos等1998)。HRT结合并阻断所谓的"GARE(GA响应元件)盒"，其也是α-淀粉酶基因表达的推定激活物HvGAMyb的结合位点(Gubler等，1995)。
本文提供了大麦HRT的野生型编码序列SEQ ID NO：1。HvHRT CDS序列AK362734.1(cv.Haruna Nijo)、AK252040.1(Haruna Nijo)、HORVU2Hr1G035630.1(cv.Morex)、AJ001317.1(Himalaya)以及针对cv.Bowman和cv.Barke的衍生自IBSC2012中的基因组DNA重叠群的人工装配的序列(可在BARLEX数据库中获得，https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f？p＝284:10)的多重序列比对，证明了CDS序列之间100％的序列同一性。本文提供了野生型大麦HRT的蛋白序列SEQ ID NO：2。HvHRT蛋白序列AK362734.1(cv.Haruna Nijo)、AK252040.1(Haruna Nijo)、HORVU2Hr1G035630.1(cv.Morex)、AJ001317.1/CAA04677.1(Himalaya)以及针对cv.Bowman和cv.Barke的衍生自IBSC2012中基因组DNA重叠群的人工组装和翻译序列的多序列比对，证实了蛋白序列之间100％的序列同一性。HvHRT蛋白含有两个推定的核定位位点(NLS)。因此，SEQ ID NO：2的氨基酸276-292(Arg276-Arg292)和SEQ ID NO：2的氨基酸527-530(Arg527-Arg530)构成了推定的NLS(Raventos等，1998)。此外，HvHRT含有三个推定的表明锌指的DNA结合结构域(本文也称为HRTdb)，含有下列共有序列：VCGX4DGX2CX2CX3PVX2RKRCX2HKGXR，其中X可以是任意氨基酸。因此，SEQ ID NO：2的氨基酸302至331、SEQ ID NO：2的氨基酸463至491以及SEQ ID NO：2的氨基酸509至539构成了推定的DNA结合结构域。
在HRT基因中携带突变的大麦植物
在一个实施方案中，本发明提供了在HRT基因中携带导致HRT功能丧失，特别是HRT功能完全丧失的突变的大麦植物。HRT功能的丧失可通过测定HRT在mRNA水平或蛋白水平的表达水平来确定。在一个实施方案中，当与包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物中HvHRT mRNA的水平相比，大麦植物包含少于50％，优选少于25％，甚至更优选少于10％的突变体或野生型HvHRT mRNA时，认为该大麦植物具有HRT功能的丧失。当与包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物相比，所述大麦植物包含小于5％，优选小于1％的突变或野生型HvHRT mRNA时，可认为所述大麦植物具有HRT功能的完全丧失。所述突变体HvHRT是由在mRNA编码区中携带突变的突变的HvHRT基因编码的mRNA。HvHRT mRNA是编码SEQ ID NO：2的多肽或其功能同源物的RNA，并且野生型HvHRT基因是编码SEQ ID NO：2的多肽或其功能同源物的基因。所述功能同源物优选与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同一性。在一个实施方案中，当通过常规定量RT-PCR测定时，HRT功能完全丧失的大麦植物可以不含有可检测的突变或野生型HvHRT mRNA。
在一个实施方案中，当与包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物中HvHRT蛋白的水平相比，大麦植物包含小于50％，优选小于25％，甚至更优选小于10％的突变或野生型HvHRT蛋白时，大麦植物被认为具有HRT功能的丧失。当与包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物相比，所述大麦植物包含小于5％，优选小于1％的突变或野生型HvHRT蛋白时，可认为所述大麦植物具有HRT功能的完全丧失。所述突变体HvHRT蛋白是由在编码区中携带突变的突变HvHRT基因编码的多肽。HvHRT蛋白是SEQID NO：2的多肽或其功能同源物，并且野生型HvHRT基因是编码SEQ ID NO：2的多肽或其功能同源物的基因。所述功能同源物优选与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同一性。在一个实施方案中，HRT功能完全丧失的大麦植物可以不含有通过常规Western印迹检测的可检测的突变或野生型HvHRT蛋白。
在一个实施方案中，当可以观察到来自包含GARE盒的启动子的表达增加时，大麦植物被认为具有HRT功能的丧失。因此，HRT功能的丧失可通过瞬时转染包含在amy2簇的α-淀粉酶启动子控制下的报道基因(例如荧光素酶)的报道构建体来确定，例如Raventos等，1998年在23314页中"洋葱表皮和大麦糊粉细胞中瞬时基因表达的检测"部分中描述的构建体。与用报道构建体转染至具有野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物相比，在将所述报道构建体转染至给定大麦植物后荧光素酶活性增加至少10％，例如至少25％，表明所述大麦植物具有HRT功能的丧失。
在一个实施方案中，如果大麦植物携带的突变导致HRT基因编码缺少以下一个或多个结构域的突变体HvHRT蛋白，则认为所述大麦植物具有HRT功能的丧失：
·NLS1：SEQ ID NO：2的R276-R292
·NLS2：SEQ ID NO：2的R527-R530
·HRT db1：SEQ ID NO：2的V302-R331
·HRT db2：SEQ ID NO：2的L463-E491
·HRT db3：SEQ ID NO：2的V509-A539
在HRT基因中携带导致HRT功能丧失的突变的大麦植物可以携带不同类型的突变，例如本节中描述的任何突变。
在一个实施方案中，所述大麦植物在HvHRT基因的启动子区或HvHRT基因的内含子中携带突变，导致HvHRT mRNA的异常转录和/或HvHRT蛋白的异常翻译。此类大麦植物尤其可具有上文本节所述的降低的HvHRT mRNA水平和/或上文本节所述的降低的HvHRT蛋白水平。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带导致HvHRT基因缺失的突变。HvHRT基因的基因组序列在不同的大麦品种之间不同；然而，编码区是高度保守的。HvHRT大麦基因的基因组序列的例子包括NCBI中登录号为ID#AJ001317.1的序列。此外，HvHRT基因的大部分基因组序列可在morex_contig_368180和morex_contig_1570244(cv.Morex)(IBSC，2012)中找到，然而这些重叠群不重叠，并且内含子序列的部分丢失。本文提供了几种野生型大麦植物的HRT编码序列SEQ ID NO：1。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带的突变导致编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因。在一个实施方案中，突变可以是导致形成提前的终止密码子的突变。在另一个实施方案中，所述突变是HvHRT基因的剪接位点中的突变。所述突变可能导致HvHRTmRNA的异常剪接。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带的突变导致突变体HvHRT基因编码的突变体HvHRT蛋白至少缺少对应于SEQ ID NO：2的氨基酸527-530的氨基酸。应理解至少缺少氨基酸XX-YY的突变体HvHRT可缺少除了氨基酸XX-YY之外的其它氨基酸。
在一个实施方案中，所述大麦植物可包含编码至少缺少SEQ ID NO：2的氨基酸463至491的突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，例如所述突变体HvHRT蛋白至少缺少SEQ IDNO：2的氨基酸463至491和氨基酸527至530。
在一个实施方案中，所述大麦植物可包含编码至少缺少SEQ ID NO：2的氨基酸509至539的突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可包含编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT蛋白缺少SEQ ID NO：2的至少21个最C-末端氨基酸，例如至少39个最C-末端氨基酸，例如至少85个最C-末端氨基酸，例如至少100个最C-末端氨基酸。例如，大麦植物可以包含编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT蛋白缺少SEQ ID NO：2的至少118个最C-末端氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可以包含编码截短的HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，所述截短的HvHRT蛋白包含HvHRT的N-末端片段，该片段包含SEQ ID NO：2的至多526个N-末端氨基酸，例如SEQ ID NO：2的至多508个N-末端氨基酸，例如SEQ ID NO：2的至多462个N-末端氨基酸，优选SEQ ID NO：2的至多431个N-末端氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可以包含在密码子1至527中的任一个中，例如在密码子1至509中的任一个中，如在密码子1至463中的任一个中，例如在密码子1至431中的任一个中携带提前的终止密码子的突变体HvHRT基因。例如，大麦植物可以包含在密码子431中携带提前的终止密码子的突变体HvHRT基因。密码子根据SEQ ID NO：1编号，从5'端开始，其中3个核苷酸构成一个密码子。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含编码具有SEQ ID NO：2的W431终止突变的突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因。在一个优选的实施方案中，本发明的大麦植物包含编码SEQ ID NO：4的多肽的突变体HvHRT基因。特别地，所述大麦植物可包含SEQ IDNO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1293的G→A突变。例如，大麦植物可包含含有SEQ ID NO：3的编码序列的突变体HvHRT基因。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含编码具有SEQ ID NO：2的W170终止突变的突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因。例如，大麦植物可包含在密码子170中携带提前的终止密码子(如上所述，相对于SEQ ID NO：1的密码子编号)的突变体HvHRT基因。特别地，所述大麦植物可包含SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸510的G→A突变。例如，所述大麦植物可以是HENZ-53或其后代。例如，所述大麦植物可以是如实施例14中所述鉴定的大麦植物或其后代。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含编码具有SEQ ID NO：2的W371终止突变的突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因。例如，大麦植物可包含在密码子371中携带提前的终止密码子(如上所述，相对于SEQ ID NO：1的密码子编号)的突变体HvHRT基因。特别地，所述大麦植物可包含SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1113的G→A突变。例如，所述大麦植物可以是HENZ-54或其后代。例如，所述大麦植物可以是如实施例14中所述鉴定的大麦植物或其后代。
为了本专利申请的目的，大麦植物(Hordeum vulgare)的种子命名为"HENZ-2"，按照布达佩斯条约的规定已经保藏于NCIMB Ltd.Ferguson Building,Craibstone Estate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA苏格兰。HENZ-2大麦植物保藏于2018年11月12日，并且已获得登录号NCIMB 43270。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物是2018年11月12日保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 43270，并且称为"HENZ-2"的大麦植物(Hordeum vulgare)；或其后代。因此，本发明的大麦植物可以是2018年11月12日保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 43270的大麦植物HENZ-2或其后代，其中所述后代大麦植物携带SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1293的G→A突变和/或其中所述大麦植物的HvHRT基因编码包含SEQ ID NO：2的W431终止突变的突变体HvHRT蛋白。
HvHBL12
大麦基因HvHBL12以前没有描述过。本文提供了来自大麦栽培种Haruna Nijo的HvHBL12基因的编码序列SEQ ID NO：5。本文提供了由该序列编码的HvHBL12蛋白的序列SEQID NO：6。可从Haruna Nijo获得另外的编码序列，然而该序列在密码子216处携带终止密码子。本发明人认为这是非功能性拷贝。HvHBL12的两个序列已经以登录号AK376953.1和AK361212.1保藏在NCBI数据库中。所述序列编码与SEQ ID NO：6相比具有多种多态性的蛋白，包括以下：N141D、M142V和E184D。SEQ IDNO：6的多肽，以及具有多态性N141D、M142V和E184D中任一个的SEQ ID NO：6的多肽，在本文中都被认为是野生型HvHBL12蛋白。
HvHBL12基因的基因组序列在不同的大麦品种中可能不同。HvHBL12大麦基因的基因组序列的例子见于Morex_contig_56855(cv.Morex)(IBSC，2012)，以及NCBI数据库中登录号AK376953.1和AK361212.1的序列(部分序列)。然而，NCBI数据库中指出的编码序列的起始可能是不正确的。HvHBL12基因的编码序列在不同的大麦品种之间也略有不同。优选地，功能性HvHBL12基因的编码序列具有如本文提供的SEQ ID NO：5的序列或与其具有至少90％、优选至少95％序列同一性的序列，其中所述序列编码SEQ ID NO：6的多肽或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物。大麦中HvHBL12基因的编码序列的实例包括本文提供的如SEQ ID NO：5所示的序列，或登录号为HORVU5Hr1G081090.1的序列(Mascher等人，2017)。
使用HvHBL12蛋白序列的蛋白序列BLAST显示HvHBL12与同源异形盒-亮氨酸拉链蛋白具有一些同源性。
SEQ ID NO：6的氨基酸26至79构成推定的同源异形盒结构域，而SEQ ID NO：6的氨基酸81至122构成推定的同源异形盒相关亮氨酸拉链。
在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物
在一个实施方案中，本发明提供了在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物，所述突变导致HvHBL12功能丧失，特别是HvHBL12功能完全丧失。HvHBL12功能的丧失可通过在mRNA水平或蛋白水平测定HvHBL12的表达水平来确定。在一个实施方案中，当与包含野生型HvHBL12基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物中的HvHBL12 mRNA的水平相比，所述大麦植物包含少于50％，优选少于25％，甚至更优选少于10％的突变体或野生型HvHBL12mRNA时，认为所述大麦植物具有HvHBL12功能丧失。当与包含野生型HvHBL12基因但在其他方面具有相同基因型的大麦植物相比，所述大麦植物包含少于5％，优选少于1％的突变体或野生型HvHBL12 mRNA时，可认为所述大麦植物具有HvHBL12功能的完全丧失。所述突变体HvHBL12是由在mRNA编码区中携带突变的突变的HvHBL12基因编码的mRNA。HvHBL12 mRNA是编码SEQ ID NO：6的多肽或其功能同源物的RNA，并且野生型HvHBL12基因是编码SEQ IDNO：6的多肽或其功能同源物的基因。所述功能同源物优选与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，当通过常规定量RT-PCR测定时，HvHBL12功能完全丧失的大麦植物可不含可检测到的突变体或野生型HvHBL12 mRNA。
在一个实施方案中，当与包含野生型HvHBL12基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物中的HvHBL12蛋白水平相比，所述大麦植物包含少于50％，优选少于25％，甚至更优选少于10％的突变体或野生型HvHBL12蛋白时，认为所述大麦植物具有HvHBL12功能丧失。当与包含野生型HvHBL12基因但在其他方面具有相同基因型的大麦植物相比，所述大麦植物包含少于5％，优选少于1％的突变体或野生型HvHBL12蛋白时，可认为所述大麦植物具有HvHBL12功能的完全丧失。所述突变体HvHBL12蛋白是由在编码区中携带突变的突变的HvHBL12基因编码的多肽。HvHBL12蛋白为SEQ ID NO：6的多肽或其功能同源物，并且野生型HvHBL12基因为编码SEQ ID NO：6的多肽或其功能同源物的基因。所述功能同源物优选与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，通过常规Western印迹检测，HvHBL12功能完全丧失的大麦植物可不含有可检测的突变体或野生型HvHBL12蛋白。
在一个实施方案中，如果所述大麦植物携带的突变导致HvHBL12基因编码缺少一个或多个以下结构域的突变体HvHBL12蛋白，则认为所述大麦植物具有HvHBL12功能丧失：
·同源异形盒结构域：SEQ ID NO：6的氨基酸26至79
·同源异形盒相关的亮氨酸拉链：SEQ ID NO：6的氨基酸81-122
·C-末端部分：SEQ ID NO：6的氨基酸228至250
在HvHBL12基因中携带导致HvHBL12功能丧失的突变的大麦植物可携带不同类型的突变，例如本节中本文所述的任何突变。
在一个实施方案中，所述大麦植物在HvHBL12基因的启动子区或HvHBL12基因的内含子中携带突变，导致HvHBL12 mRNA的异常转录和/或HvHBL12蛋白的异常翻译。此类大麦植物可特别具有上文本部分所述的降低的HvHBL12 mRNA水平和/或上文本部分所述的降低的HvHBL12蛋白水平。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带导致HvHBL12基因缺失的突变。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带的突变导致突变体HvHBL12基因编码突变体HvHBL12蛋白。在一个实施方案中，突变可以是导致形成提前的终止密码子的突变。在另一个实施方案中，突变是HvHBL12基因剪接位点中的突变。所述突变可导致HvHBL12mRNA的异常剪接。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带导致突变体HvHBL12基因的突变，所述突变体HvHBL12基因编码缺少SEQ ID NO：6的一个或多个氨基酸的突变体HvHBL12蛋白或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物。
在一个实施方案中，所述大麦植物可以包含编码突变体HvHBL12蛋白的突变体HvHBL12基因，所述突变体HvHBL12蛋白至少缺少
·SEQ ID NO：6的或携带多态性N141D、M142V或E184D中的一种或多种的SEQ IDNO：6的氨基酸26-79；或
·SEQ ID NO：6的或携带多态性N141D、M142V或E184D中的一种或多种的SEQ IDNO：6的氨基酸81-122；或
·SEQ ID NO：6的或携带多态性N141D、M142V或E184D中的一个或多个SEQ ID NO：6的氨基酸228-250。
应理解，至少缺少氨基酸XX至YY的突变体HvHBL12可缺少除了氨基酸XX至YY之外的其它氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可包含突变体HvHBL12基因，其编码缺少SEQ ID NO：6的至少5个最C端氨基酸，例如至少10个最C端氨基酸，例如至少15个最C端氨基酸，例如至少20个最C端氨基酸的突变体HvHBL12蛋白或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物。例如，所述大麦植物可包含编码突变体HvHBL12蛋白或与其具有至少95％序列同一性的功能同源物的突变体HvHBL12基因，所述突变体HvHBL蛋白至少缺少SEQ ID NO：6中至少22个最C-末端氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可包含编码截短的HvHBL12蛋白的突变体HvHBL12基因，所述截短的HvHBL12蛋白包含含有SEQ ID NO：6的至多245个N-末端氨基酸的N-末端片段或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物，例如SEQ ID NO：6的至多240个N-末端氨基酸或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物，例如SEQ ID NO：6的至多235个N-末端氨基酸或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物，优选SEQ ID NO：6的至多227个N-末端氨基酸或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可包含在密码子1至245的任一个中，例如在密码子1至240的任一个中，如在密码子1至235的任一个中，例如在密码子1至228的任一个中携带提前的终止密码子的突变体HvHBL12基因。例如，大麦植物可以包含在密码子228中携带提前的终止密码子的突变体HvHBL12基因。密码子根据SEQ ID NO：5编号，从5'端开始，其中3个核苷酸构成一个密码子。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含的突变体HvHBL12基因编码具有SEQID NO：6的W228终止突变的突变体HvHRT蛋白。在一个优选实施方案中，本发明的大麦植物包含编码SEQ ID NO：9的或携带多态性N141D、M142V或E184D中的一种或多种的SEQ ID NO：9的多肽的突变体HvHBL12基因。特别地，所述大麦植物可以包含SEQ ID NO：5的HvHBL12编码序列的核苷酸684的G→A突变，例如，所述大麦植物可以包含含有SEQ ID NO：8的编码序列的突变体HvHBL12基因。
在本节中提及的功能性同源物可以是SEQ ID NO：6的功能性同源物，其可以特别地是携带一个或多个以下多态性的SEQ ID NO：6的功能性同源物：N141D、M142V和E184。
为了本专利申请的目的，大麦植物(Hordeum vulgare)的种子，命名为"HENZ-10"，已经按照布达佩斯条约的规定保藏于NCIMB Ltd.Ferguson Building,CraibstoneEstate,Bucksburn,Aberdeen,AB21 9YA苏格兰。HENZ-10大麦植物于2018年11月12日保藏，并已获得登录号NCIMB 43271。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物是2018年11月12保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB 43271，称为"HENZ-10"的大麦植物(Hordeum vulgare)；或其后代。因此，本发明的大麦植物可以是2018年11月12保藏于NCIMB且登录号为NCIMB 43271的大麦植物HENZ-10，或其任何后代大麦植物，其中所述大麦植物携带SEQ ID NO：5的HvHBL12编码序列的核苷酸684的G→A突变，和/或其中所述大麦植物的HvHBL12基因编码包含SEQ ID NO：6的W228终止突变的突变体HvHBL12蛋白。
HvWRKY38
大麦基因HvWRKY38的全长蛋白产物被认为通过结合串联重复W盒而用作转录阻抑物。HvWRKY38是II组WRKY转录因子的成员，其仅含有一个WRKY结构域。Zou等人2008已提出HvWRKY38和BPBF可作为Amy32b的转录阻抑物。
本文提供了大麦WRKY38的一种野生型编码序列SEQ ID NO：10。衍生自登录号AJ536667.1(cv.Ingrid)、AK360269.1(cv.Haruna Nijo)、AY541586.1(cv.Nure)、MLOC_60890.1(cv.Morex)的序列和来自cv.Bowman(IBSC，2012)的contig_242376的序列的HvWRKY38 CDS序列的多重序列比对表明，在SEQ ID NO：10的核苷酸159和292处具有2个多态性的CDS序列之间具有非常高的序列同一性。本文提供了野生型大麦HvWRKY38的蛋白序列SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。从上述基因组序列翻译的HvWRKY38蛋白序列的多重序列比对表明，所有HvWRKY38蛋白都具有本文SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示的序列，其中氨基酸98可以是Val或Met。这两种序列在此都被认为是野生型HvWRKY38序列。HvWRKY38蛋白在SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸200-206处含有WRKY结构域，在SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的亮氨酸拉链基序中含有保守的疏水残基Leu63、Val70、Leu77、Val84和Leu91，和包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的Cys220、Cys226、His250和His252的推定的锌指样基序(CX4-5CX22-23HX1H)。
WRKY38基因的基因组序列在不同的大麦品种之间可以不同。WRKY38大麦基因的基因组序列的实例是NCBI数据库的登录号AY541586.1以及BARLEX数据库中可得的morex_contig_44877(cv.Morex CV)(IBSC，2012)和bowman_contig_242376(https://apex.ipk-gatersleben.de/apex/f？p＝284:10)。
在WRKY38基因中携带突变的大麦植物
在一个实施方案中，本发明提供了携带HvWRKY38基因中的突变的大麦植物，所述突变导致HvWRKY38功能丧失，特别是HvWRKY38功能完全丧失。HvWRKY38功能的丧失可通过在mRNA水平或蛋白水平上测定HvWRKY38的表达水平来测定。在一个实施方案中，当与包含野生型HvWRKY38基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物中HvWRKY38mRNA的水平相比，大麦植物包含少于50％，优选少于25％，甚至更优选少于10％的突变体或野生型HvWRKY38mRNA时，认为该大麦植物具有HvWRKY38功能丧失。当与包含野生型HvWRKY38基因但其他基因型相同的大麦植物相比，大麦植物包含少于5％，优选少于1％的突变体或野生型HvWRKY38 mRNA时，可以认为所述大麦植物具有HvWRKY38功能的完全丧失。所述突变体HvWRKY38是由在mRNA编码区中携带突变的突变的HvWRKY38基因编码的mRNA。HvWRKY38mRNA是编码SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12多肽或其功能同源物的RNA，野生型HvWRKY38基因是编码SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12多肽或其功能同源物的基因。所述功能同源物优选与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，当通过常规定量RT-PCR测定时，完全丧失HvWRKY38功能的大麦植物可以不含可检测到的突变体或野生型HvWRKY38 mRNA。
在一个实施方案中，当与包含野生型HvWRKY38基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物中HvWRKY38蛋白水平相比，大麦植物包含少于50％，优选少于25％，甚至更优选少于10％的突变体或野生型HvWRKY38蛋白时，大麦植物被认为具有HvWRKY38功能丧失。当与包含野生型HvWRKY38基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物相比，大麦植物包含少于5％，优选少于1％的突变体或野生型HvWRKY38蛋白时，可以认为所述大麦植物具有HvWRKY38功能的完全丧失。所述突变体HvWRKY38蛋白是由在编码区中携带突变的突变的HvWRKY38基因编码的多肽。HvWRKY38蛋白是SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的多肽或其功能同源物，并且野生型HvWRKY38基因是编码SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12多肽或其功能同源物的基因。所述功能同源物优选与SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12具有至少95％序列同一性。在一个实施方案中，如通过常规Western印迹所检测的，完全丧失HvWRKY38功能的大麦植物可以不含可检测到的突变体或野生型HvWRKY38蛋白。
在一个实施方案中，当可以观察到来自包含串联重复W-盒的启动子的表达增加时，大麦植物被认为具有HvWRKY38功能丧失。因此，HvWRKY38功能的丧失可通过瞬时转染报道构建体来测定，所述报道构建体包含在来自例如amy2-1基因的α-淀粉酶启动子控制下的报道基因(例如萤光素酶)。这种构建体可以以与Raventos等1998年在23314页在"洋葱表皮和大麦糊粉细胞中的瞬时基因表达分析"部分描述的构建体相同的方式制备。与用报道构建体载体转染至具有野生型HvWRKY38基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物后相比，所述报道构建体转染至给定大麦植物后荧光素酶活性增加至少10％，例如至少25％表明，所述大麦植物具有HvWRKY38功能丧失。
在一个实施方案中，如果大麦植物携带的突变导致HvWRKY38基因编码缺少一个或多个以下氨基酸的突变体HvWRKY38蛋白，则认为所述大麦植物具有HvWRKY38功能丧失：
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸200-206
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸63(Leu)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸70(Val)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸77(Leu)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸84(Val)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸91(Leu)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸220(Cys)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸226(Cys)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸250(His)
SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸252(His)
携带导致HvWRKY38功能丧失的HvWRKY38基因中突变的大麦植物可以携带不同类型的突变，例如本节中本文所述的任何突变。
在一个实施方案中，所述大麦植物在HvWRKY38基因启动子区或HvWRKY38基因内含子中携带突变，导致HvWRKY38 mRNA的异常转录和/或HvWRKY38蛋白的异常翻译。这种大麦植物可特别具有上文本部分所述的降低的HvWRKY38 mRNA水平和/或上文本部分所述的降低的HvWRKY38蛋白水平。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带导致HvWRKY38基因缺失的突变。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带的突变导致突变体HvWRKY38基因编码突变体HvWRKY38蛋白。在一个实施方案中，突变可以是导致形成提前的终止密码子的突变。在另一个实施方案中，突变是HvWRKY38基因剪接位点中的突变。所述突变可导致HvWRKY38mRNA异常剪接。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物携带的突变导致突变体HvWRKY38基因编码突变体HvWRKY38蛋白，所述蛋白缺少对应于SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸200至206、220、226、250和/或252中至少一个氨基酸。应当理解，缺少至少氨基酸XX至YY的突变体HvWRKY38可以缺少除了氨基酸XX至YY之外的其它氨基酸。
在一个实施方案中，大麦植物可以包含编码至少缺少SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸200-206的突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因。在一个实施方案中，大麦植物可以包含编码至少缺少SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸220、226、250和/或252之一的突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因。
在一个实施方案中，大麦植物可以包含编码突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因，所述蛋白缺少SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸63、70、77、84和/或91中的至少一个。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可以包含编码突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因，所述蛋白缺少SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至少102个最C端氨基酸，例如至少104个最C端氨基酸，例如至少128个最C端氨基酸，例如至少134个最C端氨基酸。例如，大麦植物可以包含编码突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因，所述蛋白缺少SEQID NO：11或SEQ ID NO：12的至少154个最C端氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可以包含编码截短的HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因，所述截短的HvWRKY38蛋白包含HvWRKY38的N-末端片段，其包含SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：12的至多251个N-末端氨基酸，例如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多249个N-末端氨基酸，例如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多225个N-末端氨基酸，例如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多219个N-末端氨基酸，优选SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：12的至多199个N-末端氨基酸。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可以包含在密码子1至252的任一个中，例如在密码子1至250的任一个中，如在密码子1至226的任一个中，例如在密码子1至220的任一个中，优选在密码子1至200的任一个中携带提前的终止密码子的突变体HvWRKY38基因。例如，大麦植物可以包含在密码子200中携带提前的终止密码子的突变体HvWRKY38基因。密码子根据SEQ ID NO：10编号，从5'端开始，其中3个核苷酸构成一个密码子。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物包含的突变体HvWRKY38基因编码具有SEQID NO：11或12的W200终止突变的突变体HvWRKY38蛋白。在一个优选实施方案中，本发明的大麦植物包含编码SEQ ID NO：14的多肽或SEQ ID NO：14中氨基酸98是Met的多肽的突变体HvWRKY38基因。特别地，所述大麦植物可以包含SEQ ID NO：10的HvWRKY38编码序列的核苷酸600的G→A突变，例如，大麦植物可以包含含有SEQ ID NO：13的编码序列的突变体HvWRKY38基因。
大麦植物
根据本发明，在一个或多个α-淀粉酶启动子、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物可以是大麦(Hordeum vulgare)种的任何植物，包括任何育种系(breeding line)或栽培品种(cultivar)或品种(variety)。
"野生大麦"，野生二棱大麦(Hordeum vulgare ssp.Spontaneum)，被认为是当今栽培的大麦形式的先祖。大麦的驯化的但异质的混合被称为大麦地方品种(landraces)。今天，大部分地方品种已经在先进的农业中被纯种系栽培品种取代。与地方品种相比，现代大麦栽培种具有许多改进的特性(Nevo，1992；Pelger等，1992)。
在本发明中，术语"大麦植物"包括任何大麦植物，例如大麦地方品种或现代大麦栽培种。因此，本发明涉及在一个或多个α-淀粉酶启动子中、在HRT基因中、在HBL12基因中和/或在WRKY38基因中包含突变的任何大麦植物，例如本文所述的任何突变。
然而，用于本发明的优选大麦植物是现代大麦栽培品种或纯种系。本发明所用的大麦栽培品种可以是，例如，选自由以下组成的组：Paustian、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A、Swan Hals、Kanto Nakate Gold、Hakata 2号、Kirin–choku 1号、Kanto late Variety Gold、FujiNijo、New Golden、Satukio Nijo、Seijo 17号、Akagi Nijo、Azuma Golden、Amagi Nijpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett、Rosalina和Jersey，优选自由以下组成的组：Haruna Nijo、Sebastian、Quench、Celeste、Lux、Prestige、Saloon、Neruda和Power，优选自由以下组成的组：Paustian、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、Blenheim、Ariel、Lenka、Maresi、Steffi、Gimpel、Cheri、Krona、Camargue、Chariot、Derkado、Prisma、Union、Beka、Kym、Asahi 5、KOU A、SwanHals、Kanto Nakate Gold、Hakata 2号、Kirin–choku 1号、Kanto late Variety Gold、Fuji Nijo、New Golden、Satukio Nijo、Seijo 17号、Akagi Nijo、Azuma Golden、AmagiNijpo、Nishino Gold、Misato golden、Haruna Nijo、Scarlett和Jersey，优选自由以下组成的组：Paustian、Haruna Nijo、Sebastian、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Power、Quench、NFC Tipple、Barke、Class、Vintage、Applaus、Bowie、Broadway、Champ、Chanson、Charles、Chimbon、Cosmopolitan、Crossway、Dragoon、Ellinor、Embrace、Etoile、Evergreen、Flair、Highway、KWS Beckie、KWS Cantton、KWS Coralie、KWS Fantex、KWSIrina、KWS Josie、KWS Kellie、LG Diablo、LG Figaro、LG Nabuco、LG Tomahawk、Laureate、Laurikka、Lauxana、Luther、Odyssey、Ovation、Prospect、RGT Elysium、RGTObserver、RGT Planet、Rotator、Sarbi、Scholar、Subway和Golden Promise。
大麦植物可以是任何合适的形式。例如，本发明的大麦植物可以是有活力的大麦植物、干燥的植物、均质化的植物或磨碎的大麦麦粒。植物可以是成熟植物、胚、麦粒、发芽的麦粒(例如，以绿麦芽或窑烧干燥麦芽的形式)、磨碎的发芽的麦粒、磨碎的麦粒等。
大麦植物的部分可以是植物的任何合适的部分，例如麦粒、胚、叶、茎、根、花或其部分。部分可以是例如麦粒、胚、叶、茎、根或花的部分。大麦植物的部分也可以是匀浆的部分或磨碎的大麦植物或买粒的部分。
在本发明的一个实施方案中，大麦植物的部分可以是所述大麦植物的细胞，例如可以在组织培养物中体外繁殖的活细胞。然而，在其他实施方案中，大麦植物的部分可以是不能成熟为完整大麦植物的活细胞，即不是繁殖材料的细胞。
本发明大麦植物的特征
本发明提供了在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物。这种大麦植物的一个主要优点是α-淀粉酶活性增加。特别地，所述大麦植物在发芽早期麦粒中可具有α-淀粉酶活性的增加。
大麦植物的α-淀粉酶活性受到严格调节。在发芽期间，α-淀粉酶活性有助于淀粉向糖的转化。然而，在植物发育期间的其它时间点，例如在谷粒灌浆(grain filling)期间，α-淀粉酶活性是不期望的，因为它可以导致谷粒灌浆减少、淀粉含量减少、谷粒干瘪和/或收获前出芽。
然而，本发明的大麦植物优选进一步的特征在于具有良好的农艺学品质，例如与野生型大麦相当的农艺学品质。因此，例如，可以优选大麦植物具有高产量，例如与高产现代栽培品种如cv.Planet的产量相当的产量。
因此，本发明的一个方面是提供大麦植物，其在发芽过程中具有增加的α-淀粉酶活性，但其仍然具有良好的植物适应性。
特别地，携带本文所述的任何突变的本发明大麦植物的产量可以是不包含所述突变但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的产量的至少90％。本发明的在HvHRT基因中携带突变的大麦植物的产量可例如这样，其是包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的产量的至少90％，优选至少95％。本发明的在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物的产量可以例如为包含野生型HvHBL12基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物的产量的至少90％。
因此，本发明的大麦植物可以具有至少38g，例如至少40g的1000个麦粒重量(TKW)。特别地，携带本文所述的任何突变的本发明大麦植物可以具有TKW，其是不包含所述突变但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的TKW的至少90％。在HvHRT基因中携带突变的本发明大麦植物可例如具有TKW，其为包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的TKW的至少90％，例如至少95％。在HvHBL12基因中携带突变的本发明大麦植物可例如具有TKW，其为包含野生型HvHBL12基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的TKW的至少90％，例如至少95％。
本发明的大麦植物可以具有至少55％w/w，例如至少60％w/w的淀粉含量。该百分比以占总谷粒干重的淀粉干重％表示。特别地，携带本文所述的任何突变的本发明大麦植物的淀粉含量可以是不包含所述突变但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的淀粉含量的至少90％。本发明的在HvHRT基因中携带突变的大麦植物的淀粉含量可以是例如包含野生型HvHRT基因但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的淀粉含量的至少90％，例如至少95％。在HvHBL12基因中携带突变的本发明大麦植物的淀粉含量可以是例如包含野生型HvHBL12基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的淀粉含量的至少90％，例如至少95％。
本发明的大麦植物可以具有至少9.5％w/w的蛋白质含量。该百分比以占总谷粒干重的蛋白质干重的百分数表示。特别地，携带本文所述的任何突变的本发明大麦植物的蛋白质含量可以是不包含所述突变但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的蛋白质含量的至少90％。本发明的在HvHRT基因中携带突变的大麦植物的蛋白质含量可例如为包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的蛋白质含量的至少90％，例如至少95％。在HvHBL12基因中携带突变的本发明大麦植物的蛋白质含量可例如为包含野生型HvHBL12基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的蛋白质含量的至少90％，例如至少95％。
携带本文所述的任何突变的本发明大麦植物的高度可以是不包含所述突变但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的高度的至少90％。本发明的在HvHRT基因中携带突变的大麦植物的高度可例如为包含野生型HvHRT基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的高度的至少90％，例如至少95％。在HvHBL12基因中携带突变的本发明大麦植物的高度可以是例如包含野生型HvHBL12基因但其它方面基因型相同的大麦植物高度的至少90％，例如至少95％。
已经描述了大麦植物中赤霉酸水平的降低与更高的穗数目有关。因此，大麦突变体sdw1/denso具有降低的GA生物合成基因表达和增加的每面积穗数(Jia等，2011)。因此，存在GA水平增加的大麦植株具有减少的穗数目的风险。然而，本发明的大麦植物优选具有大约与野生型大麦植物相同数量的穗。因此，携带本文描述的任何突变的本发明的大麦植物具有的穗数/M2是不包含所述突变但在其他方面具有相同基因型的大麦植物的穗数/M2的至少90％。本发明的在HvHRT基因中携带突变的大麦植物具有的穗数/M2可例如为包含野生型HvHRT基因但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的穗数/M2的至少90％，例如至少95％。在HvHBL12基因中携带突变的本发明大麦植物的穗数/M2可例如为包含野生型HvHBL12基因但其它方面具有相同基因型的大麦植物的穗数/M2的至少90％，例如至少95％。
本发明的携带本文所述的任何突变的大麦植物优选不经历收获前出芽。特别地，本发明的大麦植物具有从已经用水定期喷洒20天的大麦植物收获的麦粒的发芽率，该发芽率与未经历所述喷洒并在成熟时收获的相同种类的大麦植物的发芽率相同或更高。特别地，当如下文实施例3B中所述进行测定时，本发明的大麦植物优选不经历收获前出芽。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物在发芽开始后48小时具有至少16U/g的α-淀粉酶活性。
在一个实施方案中，当所述大麦植物在9L/h的气流下浸泡在水中已经发芽时，本发明的大麦植物在发芽开始后48h具有至少4U/g的α-淀粉酶活性和/或72h后具有至少7U/g的α-淀粉酶活性。这可以是例如在HvHRT基因中携带突变的大麦植物的情况。
在一个实施方案中，当所述大麦植物在9L/h气流下浸泡在水中已经发芽时，本发明的大麦植物在发芽开始后48h具有至少15U/g的α-淀粉酶活性和/或72h后具有至少20U/g的α-淀粉酶活性。这可以是例如在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物的情况。
在一个实施方案中，当所述大麦植物在浸没于水中而没有气流的情况下已经发芽时，本发明的大麦植物在发芽开始后72小时具有至少6U/g的α-淀粉酶活性。例如，这可以是例如在HvHRT基因中携带突变的大麦植物的情况。
在一个实施方案中，当本发明的大麦植物在没有气流的水中浸没的情况下已经发芽时，所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少4U/g的α-淀粉酶活性和/或72小时具有至少14U/g的α-淀粉酶活性。例如，对于在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物或携带至少四个α-淀粉酶基因且其中所述α-淀粉酶基因包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子的大麦植物，可以是这种情况。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物在发芽开始后48小时具有的α-淀粉酶活性为不携带所述突变但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的α-淀粉酶活性的至少105％，例如至少110％，例如至少120％。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物在发芽开始后72小时具有的α-淀粉酶活性为不携带所述突变但在其它方面具有相同基因型的大麦植物的α-淀粉酶活性的至少120％，例如至少150％，例如至少170％。对于在HvHRT中携带突变如本文所述的任何突变的大麦植物，情况可以尤其如此。
在一个实施方案中，当在没有通气的水中浸没的同时发芽时，本发明的大麦植物在发芽开始后72小时具有的α-淀粉酶活性是不携带所述突变但在其他方面具有相同基因型的大麦植物的α-淀粉酶活性的至少120％，例如至少150％，例如至少170％。对于在HvHBL12中携带突变例如本文所述的任何突变的大麦植物，情况可以尤其如此。
在一个实施方案中，当在没有通气的水中浸没的同时发芽时，本发明的大麦植物在发芽开始后72小时具有的α-淀粉酶活性是不携带所述突变但在其他方面具有相同基因型的大麦植物的α-淀粉酶活性的至少150％，例如至少200％，例如至少300％。对于携带至少四个α-淀粉酶基因且所述α-淀粉酶基因包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子的大麦植物，情况可以尤其如此。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物是无壳大麦植物，并且所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少140U/G，例如至少150U/G，例如至少160U/G，例如至少170U/G的α-淀粉酶活性。在一个实施方案中，所述大麦植物是无壳大麦植物，并且所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少100U/g，例如至少110U/g的α-淀粉酶活性。
在一个实施方案中，大麦植物是无壳大麦植物，并且在发芽开始后48小时具有至少30mU/g，例如至少35mU/g，例如至少40mU/g的极限糊精酶。在一个实施方案中，本发明的大麦植物在发芽开始后48小时具有至少20mU/g的极限糊精酶活性。
在一个实施方案中，所述大麦植物是脱壳大麦植物，其在发芽开始后48小时具有至少140U/G，例如至少150U/G，例如至少160U/G，例如至少170U/G的α-淀粉酶活性，条件是在发芽开始之前已经从所述大麦麦粒上除去了至少部分的壳。在一个实施方案中，所述大麦植物是脱壳大麦植物，其在发芽开始后48小时具有至少100U/g，例如至少110U/g的α-淀粉酶活性，条件是在发芽开始之前已经从所述大麦麦粒上除去了至少部分的壳。在一个实施方案中，大麦植物是脱壳大麦植物，其在发芽开始后48小时具有至少30mU/g，例如至少35mU/g，例如至少40mU/g的极限糊精酶活性，条件是在发芽开始之前已经从大麦麦粒上除去了至少部分的壳。在一个实施方案中，所述大麦植物是脱壳大麦植物，其极限糊精酶活性至少为20mU/g，条件是在发芽开始之前已经从大麦麦粒上除去了至少部分的壳。例如，所述壳可以通过机械处理去除。所述壳可以通过例如以导致大麦麦粒总重量减少至少2％，例如至少3％，例如3-6％的机械处理方式除去。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物可以具有在胁迫条件下改善的发芽。因此，在一个实施方案中，所述大麦植物的至少60％，优选至少70％，例如至少75％的麦粒在高水分条件下发芽，例如当如实施例3C中所述测定时。
包含多于一个突变的大麦植物
本发明还提供了包含多于一个突变的大麦植物。因此，本发明的大麦植物可以包含一个或多个以下突变：
·在一个或多个α-淀粉酶启动子中的突变，例如上文在"α-淀粉酶和在α-淀粉酶启动子中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变，
·在HvHRT基因中的突变，例如上文在"在HRT基因中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变
·在HvHBL12基因中的突变，例如上文在"在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变
·在HvWRKY38基因中的突变，例如上文在"在WRKY38基因中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变。
除了本文所述的突变之外，大麦植物还可以包含一个或多个其它突变。因此，所述大麦植物可以包含一个或多个以下突变。
除了上述一个或多个突变之外，大麦植物还可以在编码LOX-1的基因中包含突变，导致功能性LOX-1的完全丧失。所述突变可以是例如国际专利申请WO2005/087934中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码LOX-1的基因，所述基因包含提前的终止密码子，所述密码子对应于WO2005/087934的SEQ ID NO：2的碱基号3572-3574，或剪接位点突变，所述突变对应于WO2005/087934的SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：6的碱基2311。
除了上述一个或多个突变之外，大麦植物还可以在编码LOX-2的基因中包含突变，导致功能性LOX-2的完全丧失。所述突变可以是例如国际专利申请WO2010/075860中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码LOX-2的基因，该基因包含在WO2010/075860的SEQID NO：1的核苷酸位置2689处的突变，导致形成提前的终止密码子。
除了上述一个或多个突变之外，大麦植物还可以在编码MMT的基因中包含突变，导致功能性MMT的完全丧失。所述突变可以是例如国际专利申请WO2010/063288中描述的任何突变。例如，大麦植物可以包含编码MMT的基因，所述MMT包含WO2010/063288的SEQ ID NO：3的碱基号3076的G→A突变，或包含编码MMT的基因，所述基因包含WO2010/063288的SEQ IDNO：16的碱基号1462的G→A突变。
除了上述一个或多个突变之外，所述大麦植物还可以在编码CslF6的基因中包含突变，其中所述突变体基因编码具有降低的CslF6活性的突变体CslF6蛋白。所述突变可以是例如转让给本申请人并具有与本申请相同的申请日的题为"具有改善的细胞壁性质的谷类植物"的共同未决申请中描述的任何突变。例如，所述大麦植物可以包含编码CslF6编码突变体CslF6的基因，所述突变体CslF包含所述共同未决申请的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的G847E突变、或G748D突变或T709I突变。所述共同未决申请的SEQ ID NO：1具有GenBank登录号NCBI：Eu267181.1。
植物产品
本发明还提供了从大麦植物例如本文所述的任何大麦植物制备的植物产品，所述大麦植物在一个或多个α-淀粉酶启动子中、在HRT基因中、在HBL12基因中和/或在WRKY38基因中携带突变。
植物产品可以是从大麦植物制备的任何产品，例如食物、饲料或饮料。因此，植物产品可以是本文以下在"饮料及其生产方法"部分中描述的任何饮料。植物产品还可以是大麦植物和/或从所述大麦植物的麦粒制备的麦芽的水性提取物，例如植物产品可以是麦芽汁。所述水性提取物可以例如如下文"水性提取物及其制备方法"部分中所述制备。
在一个实施方案中，植物产品可以是麦芽，例如绿麦芽或窑烧干燥麦芽，例如本文以下在"绿麦芽、麦芽及其生产方法"部分中描述的任何麦芽，或基于麦芽的产品，例如基于麦芽的饮料。尽管绿麦芽和/或窑烧干燥麦芽的主要用途是用于饮料生产，但它也可用于其它工业过程，例如在焙烤工业中作为酶源，或在食品工业中作为调味剂和着色剂，例如以麦芽或麦芽粉的形式或间接作为麦芽糖浆等。因此，本发明的植物产品可以是任何上述产品。
在另一个方面，本发明的植物产品包含糖浆，或甚至由糖浆组成，例如大麦糖浆或大麦麦芽糖浆。植物产品也可以是大麦或麦芽的提取物。因此，植物产品可以是麦芽汁。
绿麦芽、窑烧干燥麦芽及其生产方法
本发明还提供了从大麦植物制备的麦芽，所述大麦植物在一个或多个α-淀粉酶启动子、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变，例如本文所述的任何大麦植物。所述麦芽可以是从大麦植物的大麦谷粒制备的绿麦芽或窑烧干燥麦芽，所述大麦植物在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变。所述突变可以是上文所述的任何突变。
绿麦芽可以通过麦芽制造来制备，即通过在受控的环境条件下使谷物谷粒发芽来制备。通常，所述发芽可以包括浸泡大麦麦粒的步骤，随后是发芽步骤。浸泡和发芽也可同时或部分同时进行。在一些实施方案中，麦芽的生产可以包括干燥发芽的谷粒的步骤。所述干燥步骤可以优选地是在升高的温度下对发芽的麦粒进行窑烧干燥。因此，窑烧干燥麦芽可以通过将绿麦芽进行窑烧干燥步骤来制备。
因此，在一个实施方案中，麦芽制造的方法可以包括以下步骤：
(a)提供大麦植物的麦粒，特别是在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物；
(b)浸泡所述大麦麦粒；
(b)使所述大麦麦粒发芽；以及
(c)干燥所述发芽的大麦麦粒，优选通过窑烧干燥燥。
发芽的大麦谷粒可通过包括以下步骤的方法制备：
(a)提供大麦植物的麦粒，特别是在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物；
(b)浸泡所述大麦麦粒；
(b)使所述大麦麦粒发芽。
浸泡和发芽的步骤可以顺序地、同时地或部分同时地进行。
在一个优选的实施方案中，浸泡和发芽在发芽过程中同时进行，所述发芽过程包括通常在通气下在水溶液中温育大麦谷粒至多72小时。
浸泡可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法进行。一个非限制性实例包括在10至25℃范围内的温度下以交替的干燥和润湿条件浸泡。例如，在浸泡期间，大麦麦粒可以湿温育30分钟至3小时，然后干温育30分钟至3小时，任选地重复所述温育方案2至5次。浸泡后的最终含水量可以例如在40％至50％的范围内，例如在40％至45％的范围内。
本发明提供的大麦植物的特征在于在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变。这种大麦植物的一个主要优点是增加了发芽过程中水解酶如α-淀粉酶和极限糊精酶的活性。这些大麦植物的谷粒可以有利地在短发芽过程中发芽，因为麦芽制造的一个目的是诱导足够的水解酶活性。有趣的是，本发明的大麦植物在发芽早期具有一定水平的水解酶活性，从而允许使用短的发芽过程。
有用的短发芽过程的实例描述于国际专利申请PCT/EP2017/065498中，其通过引用并入本文。有用的短发芽过程的一个实例是包括通常在通气下在水溶液中温育大麦谷粒的步骤的发芽过程，其中整个发芽过程进行至多72小时。
如上所述，发芽可以包括在通气下在水溶液中温育大麦植物谷粒的步骤，所述大麦植物携带在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中的突变。可以将大麦谷粒在所述水溶液中温育足够的时间，以使大部分所述大麦谷粒发芽。大麦谷粒也可以在所述水溶液中温育足够的时间，以获得至少35％，优选至少37％，例如35-60％的含水量。通常，将大麦谷粒在所述水溶液中温育至少20小时，例如至少24小时。通常，将谷粒在所述水溶液中温育至多72小时，例如至多60小时，例如至多48小时。因此，在一些实施方案中，将大麦谷粒在所述水溶液中温育20至72小时，例如20至60小时，例如20至48小时，例如20至30小时，例如22至26小时。
优选在整个温育过程中，大麦谷粒完全被所述水溶液覆盖。
所述大麦谷粒通常在所述水溶液中温育，而O2通过该水溶液。所述O2可以纯O2的形式加入所述水溶液中。然而，所述O2通常包含在气体混合物中。在一个实施方案中，所述O2包含在大气空气中。
通常，每小时每kg大麦谷粒至少2L，优选至少3L，更优选至少4L，还更优选至少5L，甚至更优选至少6L O2通过所述水溶液。所述大麦谷粒的重量为干重。每小时每kg大麦谷粒(干重)，例如2至100L，例如2至75L，如2至50L，例如4至100L，例如4至75L，如4至50L，例如6至100L，例如6至75L，如6至50L的O2通过所述水溶液/大麦谷粒混合物。
如上所述，通常是大气空气通过水溶液。因此，该方法可以包括每小时每kg大麦谷粒有至少10L、优选至少15L、更优选至少20L、还更优选至少25L、甚至更优选至少30L大气空气通过所述水溶液。所述大麦谷粒的重量是干重。对于每小时每kg大麦谷粒(干重)，例如10至500L，例如10至375L，如10至250L，例如20至500L，例如20至375L，如20至250L，例如30至500L，例如30至375L，如30至250L大气空气通过所述水溶液。
在一些实施方案中，发芽步骤包括：
a.在水溶液中温育所述麦粒的至少一个步骤，其中每小时每kg干重大麦麦粒有至少2L O2通过所述水溶液；以及
b.至少一个在空气中温育所述大麦麦粒的步骤。
在一些实施方案中，在所述水溶液中温育大麦谷粒之后，大麦谷粒具有至少20％、优选至少30％、例如30％至60％、例如30％至50％、例如30％至60％、例如30％至50％的含水量。
在所述空气中温育所述大麦麦粒的步骤中，每小时每kg干重的大麦麦粒至少2LO2可以通过所述大麦麦粒。例如，在空气中温育期间和在如上所述的水溶液中温育期间，相同量的O2可以通过大麦麦粒。
通过这种方法制备的发芽的大麦麦粒在此也称为绿麦芽。
大麦谷粒的含水量可以通过测定大麦谷粒的重量，然后干燥所述大麦谷粒并测定干燥的大麦谷粒的重量来确定。湿和干大麦谷粒的重量差被认为是水，并且含水量被提供为水的重量除以大麦谷粒(湿大麦谷粒)的总重量。因此，以％提供的含水量是w/w％。
大麦谷粒可在任何有用的温度下温育，然而，可优选在足够高以允许含水量快速增加的温度下进行温育。
特别地，在本发明在20-30℃的温度范围内温育大麦谷粒的实施方案中，可以将所述大麦谷粒温育20-48小时。
谷粒的发芽也可以通过本领域技术人员已知的任何常规方法进行。一个非限制性实例包括在10至25℃范围内的温度下发芽，任选地在1至4天范围内变化的温度下发芽。
如上所述，在本发明的一些实施方案中，可以将发芽的大麦谷粒(即，绿麦芽)进行窑烧干燥。在一些实施方案中，优选不将绿麦芽窑烧干燥。特别优选的是，当通过发芽制备绿麦芽时，所述发芽包括在通气条件下在水溶液中温育所述大麦谷粒的步骤，则不将绿麦芽窑烧干燥。
如果将绿麦芽进行窑烧干燥，则可以在常规温度下进行，例如至少75℃，例如80-90℃，例如80-85℃，因此，麦芽可以例如通过Hough等(1982)描述的任何方法生产。然而，任何其它合适的生产麦芽的方法也可用于本发明，例如生产特殊麦芽的方法，包括但不限于烘焙麦芽的方法。
窑烧干燥的麦芽和绿麦芽可以进一步加工，例如通过碾磨。因此，本发明的植物产品可以是任何种类的麦芽，例如未加工的麦芽或磨碎的麦芽，例如面粉。因此，植物产品可以是例如磨碎的、窑烧干燥的麦芽或磨碎的绿麦芽。磨碎的麦芽及其面粉包含麦芽和缺少再发芽能力的死细胞的化学成分。
在一些实施方案中，所述大麦是带壳大麦，并且所述方法包括在水溶液中温育所述麦粒之前除去至少部分所述壳的步骤。去壳的谷物谷粒可以通过对谷物谷粒进行除去壳的物理处理来进行处理以除去壳。所述物理处理可以例如选自由抛光、砂磨、剥皮和平滑化组成的组。优选地，物理处理导致壳丧失。壳的丧失可以被确定为总体重量损失。因此，物理处理优选导致谷物谷粒总重量的1-4％的损失，例如1.5-3.0％的损失。
水性提取物及其生产方法
本发明提供了基于大麦的饮料及其制备方法，其中所述大麦植物在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变，例如本文所述的任何突变。本发明还提供了在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物麦粒的水性提取物。所述水性提取物可以例如由绿麦芽或窑烧干燥麦芽制备。
通常，制备饮料的方法包括制备本发明大麦植物的麦粒的水性提取物和/或由本发明大麦植物制备的麦芽的水性提取物的步骤。
通常，可以通过在水或水溶液中温育大麦粉、绿麦芽的粉和/或窑烧干燥麦芽的粉来制备水性提取物。所述水溶液在本文中也称为"糖化溶液"。特别地，可以通过糖化制备水性提取物。
本发明还提供了一种生产水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供大麦植物的麦粒，其中所述大麦植物在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变，例如本文所述的任何突变；
b.使所述大麦麦粒经历发芽步骤，从而获得发芽的麦粒，其中所述发芽步骤包括在水溶液中温育所述麦粒最多72小时；
c.精细分割所述发芽的麦粒，同时所述发芽的麦粒具有至少20％的含水量，条件是所述大麦麦粒在步骤b)和c)之间的任何时间的含水量不低于20；
d.制备所述磨碎的发芽麦粒的水性提取物，从而产生大麦的水性提取物。
发芽步骤在以上"绿麦芽、窑烧干燥麦芽及其制造方法"的部分有详细说明。
通常，所述糖化溶液可以是水，例如自来水，其中可以加入一种或多种另外的试剂。另外的试剂可以在开始时就存在于水溶液中，或者它们可以在制备水性提取物的过程中加入。另外的试剂可以是酶。因此，糖化溶液可以包含一种或多种酶。所述酶可以在该过程开始时或随后在过程中加入到水溶液中。
所述酶可以是例如一种或多种水解酶。合适的酶包括脂肪酶、淀粉降解酶(例如淀粉酶)、葡聚糖酶[优选(1-4)-和/或(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶]和/或木聚糖酶(如阿拉伯糖基木聚糖酶)和/或蛋白酶，或包含一种或多种上述酶的酶混合物，例如Cereflo、Ultralo或Ondea Pro(Novozymes)。例如，水溶液可以包含一种或多种水解酶，其选自α-淀粉酶、β-淀粉酶、极限糊精酶、支链淀粉酶、β-葡聚糖酶(例如内切-(1,3；1,4)-β-葡聚糖酶或内切-1,4-β-葡聚糖酶)、木聚糖酶(例如内切-或外切-1,4-木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿魏酸酯酶)、葡糖淀粉酶和蛋白酶。
在一个实施方案中，不向所述糖化溶液中加入或仅加入有限量的α-淀粉酶。
在一个实施方案中，不向所述糖化溶液中加入或仅加入有限量的极限糊精酶和支链淀粉酶。
所述另外的试剂，优选具有食品级质量，还可以是盐，例如CaCl2，或酸，例如H3PO4。
通常通过在一个或多个预定温度下在糖化溶液中温育大麦粉、绿麦芽粉和/或窑烧干燥麦芽粉来制备水性提取物。所述预定温度在本文中也可以被称为"糖化温度"。所述糖化温度可以是例如用于糖化的常规温度。糖化温度通常保持恒定(等温糖化)或逐渐升高，例如以顺序方式升高。在任一情况下，大麦谷粒和/或麦芽中的可溶性物质被释放到所述糖化溶液中，从而形成水性提取物。
糖化温度通常为30-90℃的温度，例如40-85℃，例如50-85℃，通常，与糖化溶液一起温育包括加热至更高温度例如75-80℃的温度的最终步骤。
在水溶液中在例如糖化容器中温育之后，可以将水溶液转移到另一个容器例如过滤槽中，并在升高的温度下温育额外的时间。
有用的糖化方案的非限制性实例可在酿造文献中找到，例如Hough等(见上文)。
糖化(即大麦粉、绿麦芽粉和/或窑烧干燥麦芽粉在糖化溶液中的温育)可在附加助剂(adjunct)存在下进行，所述附加助剂被理解为包含除麦芽或发芽大麦谷粒之外的任何碳水化合物来源，例如但不限于以完整麦粒或加工产品如磨光粉、糖浆或淀粉的形式存在的大麦、大麦糖浆或玉米或大米。所有上述附加助剂主要用作提取物的附加来源(糖浆通常在麦芽汁加热期间定量加入)。在酿酒厂中对附加助剂的处理要求取决于所用附加助剂的状态和类型。
在糖化溶液中温育后，通常可以将水性提取物分离，例如通过过滤分离成水性提取物和残留的不溶解固体颗粒，后者也称为"废谷粒"。例如，可以在过滤槽中执行过滤。或者，过滤可以是通过醪液过滤器过滤。由此获得的水性提取物也可以称为"初次麦芽汁"。在也称为洗槽的过程中，可以将额外的液体，例如水，加入到废谷粒中。在洗槽和过滤后，可以获得"二次麦芽汁"。通过重复该过程可以制备更多的麦芽汁。因此，水性提取物可以是麦芽汁，例如初次麦芽汁、二次麦芽汁、另外的麦芽汁或其组合。
在一个实施方案中，制备水性提取物的方法可以使用国际专利申请PCT/EP2017/065498中描述的任何装置，例如在第20-22页描述的任何装置来执行。可用的装置的非限制性例子提供在图12中。
饮料及其生产方法
本发明还提供了基于大麦的饮料和生产此类饮料的方法，其中所述饮料由大麦植物制备，所述大麦植物在一个或多个α-淀粉酶启动子中、在HRT基因中、在HBL12基因中和/或在WRKY38基因中携带突变，例如本文所述的任何突变。
所述饮料可以是含酒精的基于大麦的饮料或不含酒精的基于大麦的饮料。基于大麦的酒精饮料可以是例如啤酒或蒸馏酒精。
所述啤酒可以是任何种类的啤酒，例如贮藏啤酒或淡啤酒。因此，啤酒例如可以选自由德国老式啤酒(altbier)、琥珀艾尔、大麦酒、柏林酸小麦(Berliner Weisse)、北法窖藏(Bière de Garde)、苦啤、金色艾尔(Blonde Ale)、博克(Bock)、棕色艾尔、加州蒸汽啤酒(California Common)、奶油艾尔(Cream Ale)、多特蒙德出口啤酒(Dortmunder Export)、双倍博克(Doppelbock)、深色啤酒(Dunkel)、深色小麦啤酒(Dunkelweizen)、冰博克(Eisbock)、水果兰比克(Fruit lambic)、金色艾尔(Golden Ale)、古斯(Gose)、贵兹(Gueuze)、酵母小麦啤酒(Hefeweizen)、清亮(Helles)、印度淡色艾尔、科隆啤酒兰比克、低度啤酒(Light ale)、五月博克(Maibock)、麦芽酒、英国黄啤酒(Mild)、三月啤酒老艾尔(Old ale)、老棕酸(Oud bruin)、淡色艾尔、皮尔森啤酒(Pilsener)、波特、红色艾尔、黑麦啤酒(Roggenbier)、赛松(Saison)、苏格兰艾尔、蒸汽啤酒、世涛(Stout)、德式黑啤(Schwarzbier)、拉格(lager)、比利时小麦(Witbier)、德式小麦白啤(Weissbier)和小麦博克(Weizenbock)。
所述蒸馏酒精可以是任何种类的蒸馏酒精。特别地，蒸馏的酒精可以基于大麦，例如大麦麦芽。这种蒸馏酒精的非限制性示例包括威士忌和伏特加。
饮料可以是非酒精饮料，例如非酒精的基于大麦的饮料，例如非酒精啤酒或非酒精麦芽饮料，例如maltina。
饮料可以例如通过包括以下步骤的方法制备：
(i)提供本发明的大麦植物的麦粒和/或由本发明的大麦植物的麦粒制备的绿麦芽和/或窑烧干燥麦芽
(ii)制备所述麦粒和/或所述绿麦芽和/或所述窑烧干燥麦芽的水性提取物，例如，如上文在制备水性提取物部分中所述
(iii)将所述水性提取物加工成饮料。
可以在有或没有啤酒花的情况下将水性提取物煮沸，此后可以将其称为煮沸的麦芽汁。可以将初次麦芽汁、二次麦芽汁和进一步的麦芽汁合并，然后进行煮沸。可以将水性提取物煮沸任何合适的时间量，例如60分钟至120分钟。
步骤(iii)可以包括
a.任选在啤酒花或啤酒花提取物的存在下加热所述水性提取物；
b.冷却该水性提取物；
c.用酵母发酵所述水性提取物，从而产生发酵饮料。
步骤(iii)可以特别包括所述水性提取物的发酵，例如通过麦芽汁的发酵。因此，可以通过用酵母发酵水性提取物来制备饮料。
一旦制备了水性提取物，就可以通过包括常规酿造方法的任何方法将其加工成啤酒。合适酿造方法的实例的非限制性描述可参见例如Hough等(1982)的出版物。许多用于分析大麦和啤酒产品的常规更新方法是可获得的，例如但不限于美国谷物化学家协会(American Association of Cereal Chemists)(1995)、美国酿造化学家协会(AmericanSociety of Brewing Chemists)(1992)、欧洲啤酒啤酒酿造协会(European BreweryConvention)(1998)和酿造研究所(Institute of Brewing)(1997)。已经认识到，对于给定的啤酒厂，采用了许多特定的程序，其中最显著的变化与当地消费者的偏好有关。任何这种生产啤酒的方法都可以用于本发明。
由水性提取物生产啤酒的第一步优选包括如上所述煮沸所述水性提取物，随后是冷却和任选的漩涡沉淀静置的后续阶段。可以将一种或多种另外的化合物加入到水性提取物中，例如，一种或多种在下面"另外的化合物"部分中描述的另外的化合物。冷却后，可以将水性提取物转移到含有酵母的发酵罐中，所述酵母例如是酿造酵母，如巴斯德毕赤酵母(S.pastorianus)或酿酒酵母(S.cerevisiae)。可以将水性提取物发酵任何合适的时间段，通常在1至20天的范围内，例如1至10天。发酵在任何有用的温度下进行，例如在10至20℃范围内的温度下。所述方法还可以包括添加一种或多种酶，例如可以在发酵之前或发酵期间将一种或多种酶添加到麦芽汁中。特别地，所述酶可以是脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶的非限制性实例是可从DSM获得的"Brewer's Clarex"。在其它实施方案中，在所述方法期间不添加外源酶。
在几天长的发酵过程中，糖转化为醇和CO2，同时产生一些风味物质。发酵可以在任何所需的时间终止，例如一旦没有观察到％P的进一步下降。
随后，啤酒可以被进一步处理，例如被冷藏。它还可以被过滤和/或贮藏—一个产生令人愉快的香气和较少酵母样风味的过程。也可以加入添加剂。此外，可添加CO2。最后，在包装(例如转移到容器或桶中，装瓶或装罐)之前，可以对啤酒进行巴氏灭菌和/或过滤。啤酒也可以通过标准方法进行巴氏灭菌。
另外的化合物
本发明的方法可以包括添加一种或多种另外的化合物的步骤。所述另外的化合物可以是例如风味化合物、防腐剂、功能性成分、着色剂、甜味剂、pH调节剂或盐。pH调节剂可以是例如缓冲剂或酸，如磷酸。
功能性成分可以是为获得给定功能而添加的任何成分。优选地，功能性成分使饮料更健康。功能性成分的非限制性实例包括维生素或矿物质。
防腐剂可以是任何食品级防腐剂，例如其可以是苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐(例如山梨酸钾)、亚硫酸盐和/或其盐。
另外的化合物也可以是CO2。特别地，可添加CO2以获得碳酸饮料。
本发明所用的风味化合物可以是任何有用的风味化合物。风味化合物可以例如选自由香气、植物提取物、植物浓缩物、植物部分和草药浸液组成的组。特别地，风味化合物可以是啤酒花。
制备在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物的方法
可以以任何有用的方式制备在一个或多个α-淀粉酶启动子、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物，例如本文所述的任何突变。
例如，这样的大麦植物可以通过包括以下步骤的方法制备：
·将大量大麦植物或大麦麦粒进行随机诱变，例如通过辐射或化学处理，例如用叠氮化钠处理；
·鉴定携带所需突变(例如在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中的突变)的大麦植物或大麦麦粒。
这种方法还可以包括一个或多个繁殖所述大麦植物/大麦麦粒的步骤，以便获得多个均携带有随机突变的大麦植物/麦粒。
特别地，可以基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516中所述，使用设计用于鉴定所需突变的引物和探针，来制备和鉴定携带特定突变的大麦植物。实施例13A中提供了用于鉴定在α-淀粉酶启动子中携带突变的大麦植物的引物和探针的非限制性实例。实施例2A中提供了用于鉴定在HRT基因中携带突变的大麦植物的引物和探针的非限制性实例。实施例14中提供了用于鉴定在HRT基因中携带突变的大麦植物的引物和探针的另外两个非限制性实例。实施例7A中提供了用于鉴定在HBL12基因中携带突变的大麦植物的引物和探针的非限制性实例。实施例12A中提供了用于鉴定在WRKY38基因中携带突变的大麦植物的引物和探针的非限制性实例。本领域技术人员将基于公知常识和/或在国际专利申请PCT/EP2017/065516(其通过引用并入本文)中提供的指导，能够设计用于鉴定其他突变体的有用的引物和探针。
在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物也可使用各种定点诱变方法制备，例如可根据本文提供的α-淀粉酶启动子、HRT基因、HBL12基因和/或WRKY38基因的序列设计所述方法。在一个实施方案中，使用如WO2017/138986中所述的CRISPR、TALEN、锌指、大范围核酸酶和DNA切割抗生素中的任一种制备大麦植物。在一个实施方案中，使用CRISPR/cas9技术，例如使用RNA引导的Cas9核酸酶制备大麦植物。这可以如Lawrenson等人，Genome Biology(2015)16:258；DOI10.1186/s13059-015-0826-7的描述进行，除了根据本文提供的基因序列设计单个引导RNA序列外。在一个实施方案中，使用TALEN和CRISPR/cas9技术的组合，例如使用RNA引导的Cas9核酸酶，制备大麦植物。这可以如Holme等人，Plant Mol Biol(2017)95:111-121；DOI：10.1007/s11103-017-0640-6所述进行，除了根据本文提供的基因序列设计TALEN和单个引导RNA序列外。
在一个实施方案中，使用同源性介导的修复(DNA切割核酸酶和供体DNA片段的组合)制备谷物植物。这可以如Sun等人,Molecular Plant(2016)9:628-631；DOI:https://doi.org/10.1016/j.molp.2016.01.001进行，除了DNA切割核酸酶是基于本文提供的基因序列设计的，供体DNA片段是基于本文提供的突变的谷物变体的编码序列设计的。
在本发明的一个实施方案中，目的是提供农艺学上有用的大麦植物，其在一个或多个α-淀粉酶启动子、HRT基因、HBL12基因和/或WRKY38基因中携带突变。除了在一个或多个α-淀粉酶启动子中、在HRT基因中、在HBL12基因中和/或在WRKY38基因中的突变之外，在产生用于麦芽制造和/或酿造和/或作为饮料基础的商业大麦品种的领域中，还存在其它因素，例如麦粒产量和大小，以及与麦芽制造性能或酿造性能相关的其它参数。由于许多(如果不是所有)相关性状已显示处于遗传控制下，本发明还提供现代的纯合高产麦芽制造栽培种，其可由与本公开中公开的大麦植物杂交而制备。熟练的大麦育种者将能够选择和开发大麦植物，其在与其它大麦植物杂交后将产生优良的栽培种。或者，育种者可利用本发明的植物进一步诱变以产生新的栽培品种，所述新的栽培品种除了在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中的突变外，还携带其它突变。
本发明还包括通过植物育种方法制备的在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物，所述植物育种方法包括自交、回交、与群体杂交等方法。回交方法可用于本发明以将一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中的突变导入另一栽培种。
在一个实施方案中，本发明涉及2018年11月12日保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB43270，称为"HENZ-2"的大麦植物的后代，或2018年11月12日保藏于NCIMB，保藏号为NCIMB43271，称为"HENZ-10"的大麦植物的后代。
一种加速植物育种过程的方法包括通过应用组织培养和再生技术来初步增殖所产生的突变体。因此，本发明的另一方面是提供细胞，其在生长和分化时产生在一个或多个α-淀粉酶启动子中、HRT基因中、HBL12基因中和/或WRKY38基因中携带突变的大麦植物。例如，育种可包括传统杂交、制备可育花药衍生的植物或使用小孢子培养。
在一个实施方案中，本发明的大麦植物不是专门通过基本上为生物学的方法获得的。通过技术方法获得的大麦植物的后代在本文中被认为不是专门通过基本上为生物学的方法获得的，因为亲本植物是通过技术方法获得的。
在一个实施方案中，所述大麦植物携带本文所述的任何突变，其中所述突变已被化学和/或物理试剂诱导。
在一个实施方案中，所述大麦植物是通过包括诱导诱变步骤的方法制备的，或者所述植物是通过包括诱导诱变步骤的方法制备的植物的后代。因此，所述大麦植物可以是通过包括以下步骤的方法制备的大麦植物或者是通过包括以下步骤的方法制备的植物的后代：
·使大麦植物或其部分诱变，例如用化学诱变剂如NaN3
·选择携带本文所述的任何突变的大麦植物。
序列
项
本发明例如可以如以下项中所定义的：
1.一种具有高α-淀粉酶活性的大麦植物或其部分，其中所述大麦植物
·在HvHRT基因中携带导致HvHRT功能丧失的突变；和/或
·携带至少一个α-淀粉酶基因，其包含在GARE盒中含有突变的突变体α-淀粉酶启动子；和/或
·携带至少四个α-淀粉酶基因，其包含具有序列TAACAAA的GARE盒；和/或
·携带amy2簇中的至少一个α-淀粉酶基因，其包含在GARE盒中含有突变或具有序列TAACAAA的突变体α-淀粉酶启动子；和/或
·在HvHBL12基因中携带导致HvHBL12功能丧失的突变；和/或
·携带至少四个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子，其中所述非标准串联重复W-盒包含序列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)，其中一个或多个特定核苷酸已被取代或缺失，且其中X可以是任何核苷酸，n是0或1，m是0-20范围内的整数；和/或
·携带amy2簇中的至少一个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子；
·在WRKY38基因中携带导致WRKY38功能丧失的突变。
2.一种大麦植物或其部分，其中所述大麦植物
a.在HvHRT基因中携带突变，导致突变体HvHRT基因编码缺少SEQ ID NO：2的一个或多个氨基酸的突变体HvHRT蛋白，或携带突变，导致HvHRT基因的至少编码区的缺失，其中HvHRT基因的编码区编码SEQ ID NO：2的多肽；和/或
b.携带至少一个α-淀粉酶基因，该基因包含突变体α-淀粉酶启动子，该启动子在GARE盒中包含突变；和/或
c.携带至少四个α-淀粉酶基因，该基因包含具有序列TAACAAA的GARE盒；和/或
d.携带amy2簇中至少一个α-淀粉酶基因，其包含突变体α-淀粉酶启动子，所述突变体α-淀粉酶启动子包含GARE盒中的突变或具有序列TAACAAA；和/或
e.在HvHBL12基因中携带突变，导致突变体HvHBL12基因编码缺少SEQ ID NO：6的一个或多个氨基酸的突变体HvHBL12蛋白，或携带突变，导致HvHBL12基因的至少编码区的缺失，其中HvHBL12基因的编码区编码SEQ ID NO：6的多肽；和/或
f.携带至少四个α-淀粉酶基因，所述基因包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子，其中所述非标准串联重复W-盒包含序列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)，其中一个或多个特定核苷酸已被取代或缺失，并且其中X可以是任何核苷酸，n是0或1，m是0-20范围内的整数；和/或
g.携带amy2簇中的至少一个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子；和/或
h.在WRKY38基因中携带突变，导致突变体WRKY38基因编码缺少SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12中存在的一个或多个氨基酸的突变体WRKY38蛋白，或携带突变，导致WRKY38基因的至少编码区的缺失，其中WRKY38基因的编码区编码SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的多肽。
3.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在HvHRT基因中携带突变。
4.根据项3所述的大麦植物，其中所述突变是：
·导致突变体HvHRT基因编码突变体HvHRT蛋白的突变，该蛋白至少缺少对应于SEQ ID NO：2的氨基酸527-530的氨基酸
·导致HvHRT基因缺失的突变。
5.根据项3至4中任一项所述的大麦植物，其中所述突变在HvHRT基因中引入提前的终止密码子。
6.根据项3至5中任一项所述的大麦植物，其中所述突变是HvHRT基因的剪接位点中的突变。
7.根据项3至6中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT基因编码至少缺少SEQ ID NO：2的氨基酸463至491的突变体HvHRT蛋白。
8.根据项3至7中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT基因编码至少缺少SEQ ID NO：2的氨基酸509至539的突变体HvHRT蛋白。
9.根据项3至8中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT蛋白缺少SEQ ID NO：2的至少21个最C端氨基酸，例如至少39个最C端氨基酸，例如至少85个最C端氨基酸，例如至少100个最C端氨基酸。
10.根据项3至9中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT基因编码缺少SEQ ID NO：2的至少118个最C端氨基酸的突变体HvHRT蛋白。
11.根据项3至10中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码截短的HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，所述截短的HvHRT蛋白包含HvHRT的N-末端片段，所述N-末端片段包含至多526个SEQ ID NO：2的N-末端氨基酸，例如至多508个SEQ ID NO：2的N-末端氨基酸，例如至多462个SEQ ID NO：2的N-末端氨基酸，优选至多431个SEQ ID NO：2的N-末端氨基酸。
12.根据项3至11中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在密码子1-431中的任一个中携带提前的终止密码子的突变体HvHRT基因。
13.根据项3至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在SEQ ID NO：1的431中携带提前的终止密码子的突变体HvHRT基因。
14.根据项3至13中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，其中所述突变体HvHRT蛋白携带SEQ ID NO：2的W431终止突变。
15.根据项3至14中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT基因包含SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1293的G→A突变
16.根据项3至15中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物为以保藏号NCIMB43270保藏于NCIMB的大麦植物或其后代。
17.根据项3至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含携带SEQ IDNO：1的170中的提前的终止密码子的突变体HvHRT基因。
18.根据项3至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，其中所述突变体HvHRT蛋白携带SEQ ID NO：2的W170终止突变。
19.根据项3至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT基因包含SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸510的G→A突变。
20.根据项3至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在SEQ ID NO：1的371中携带提前的终止密码子的突变体HvHRT基因。
21.根据项3至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，其中所述突变体HvHRT蛋白携带SEQ ID NO：2的W371终止突变。
22.根据项3至12中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHRT基因，所述突变体HvHRT基因包含SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1113的G→A突变。
23.根据项3至22中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码SEQ IDNO：4的多肽的突变体HvHRT基因。
24.根据项3至23中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含含有SEQ IDNO：3的编码序列的突变体HvHRT基因。
25.根据项3至24中任一项所述的大麦植物，其中与包含野生型HvHRT基因但在其他方面具有相同基因型的大麦植物相比，所述大麦植物包含少于10％的突变体或野生型HvHRT mRNA，其中HvHRT mRNA为编码SEQ ID NO：2的多肽或其功能同源物的RNA，并且野生型HvHRT基因为编码SEQ ID NO：2的多肽或其功能同源物的基因，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：2具有至少95％的序列同一性。
26.根据项2至25中任一项所述的大麦植物，其中所述HvHRT基因中的突变是引起HvHRT功能完全丧失的突变。
27.根据前述项任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物含有至少一个α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因含有在GARE盒中含有突变的突变体α-淀粉酶启动子，其中核苷酸TAACARA的一个被取代或缺失。
28.根据前述项任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含含有所述突变体α-淀粉酶启动子的至少两个α-淀粉酶基因，例如至少三个α-淀粉酶基因，例如至少4个α-淀粉酶基因。
29.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含至少五个α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因包含具有序列TAACAAA的GARE盒。
30.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含至少六个，例如至少七个α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因包含具有序列TAACAAA的GARE盒。
31.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物为高产量的春大麦品种。
32.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含amy2簇中的至少一个、例如至少两个、例如至少三个α-淀粉酶基因，所述基因包含具有序列TAACAAA的GARE盒。
33.根据项27至32中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物还在HvHRT基因中携带突变，其中所述突变是项3至26中任一项所述的突变。
34.根据项3至33中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少16U/g的α-淀粉酶活性。
35.根据项3至34中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少140U/G，例如至少150U/G，例如至少160U/G，例如至少170U/G的α-淀粉酶活性，条件是所述大麦植物无壳或至少一部分壳在发芽开始前已除去。
36.根据项3至35中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少30mU/g，例如至少35mU/g，例如至少40mU/g，条件是所述大麦植物无壳或至少一部分壳已被除去。
37.根据项1至2中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在HvHBL12基因中携带突变。
38.根据项37所述的大麦植物，其中所述突变是：
a.导致编码缺少SEQ ID NO：6的一个或多个氨基酸的突变体HvHBL12蛋白或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物的突变体HvHBL12基因的突变；或
b.导致HvHBL12基因缺失的突变。
39.根据项37至38中任一项所述的大麦植物，其中所述突变在HvHBL12基因中引入提前的终止密码子。
40.根据项37至39中任一项所述的大麦植物，其中所述突变是HvHBL12基因的剪接位点中的突变。
41.根据项37至40中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHBL12基因，其编码缺少SEQ ID NO：6的至少10个最C端氨基酸，例如至少20个最C端氨基酸的突变体HvHBL12蛋白或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物。
42.根据项37至41中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHBL12基因，其编码缺少SEQ ID NO：6中至少22个最C端氨基酸的突变体HvHBL12蛋白或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物。
43.根据项37至42中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码截短的HvHBL12蛋白的突变体HvHBL12基因，所述截短的HvHBL12蛋白包含HvHBL12的N-末端片段，该片段包含SEQ ID NO：6的至多228个N-末端氨基酸或其与其具有至少95％序列同一性的功能同源物。
44.根据项37至43中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在密码子1至228中的任一个中携带提前的终止密码子的突变体HvHBL12基因。
45.根据项37至44中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在SEQ IDNO：5的228中携带提前的终止密码子的突变体HvHBL12基因。
46.根据项37至45中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码突变体HvHBL12蛋白的突变体HvHBL12基因，其中所述突变体HvHBL12蛋白携带SEQ ID NO：6的W228终止突变。
47.根据项37至46中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvHBL12基因，其含有SEQ ID NO：5的HvHBL12编码序列的核苷酸684的G→A突变。
48.根据项37至47中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物为以保藏号NCIMB43271保藏于NCIMB的大麦植物或其后代。
49.根据项37至48中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码SEQ IDNO：9或携带多态性N141D、M142V或E184D中的一种或多种的SEQ ID NO：9的多肽的突变体HvHBL12基因。
50.根据项37至49中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含含有SEQ IDNO：8的编码序列的突变体HvHBL12基因。
51.根据项37至50中任一项所述的大麦植物，其中与包含野生型HvHBL12基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物相比，所述大麦植物包含少于10％的HvHBL12 mRNA，其中HvHBL12 mRNA为编码SEQ ID NO：6的多肽或其功能同源物的RNA，且野生型HvHRT基因为编码SEQ ID NO：6的多肽或其功能同源物的基因，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：6具有至少95％序列同一性。
52.根据项37至51中任一项所述的大麦植物，其中所述HvHBL12基因中的突变是引起HvHBL12功能完全丧失的突变。
53.根据项37至52中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物还在HvHRT基因中携带突变，其中所述突变是根据项3至26中任一项所述的突变，和/或所述大麦还包含至少一个根据项27至32中任一项所述的α-淀粉酶基因。
54.根据项1至2中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在HvWRKY38基因中携带突变。
55.根据项54所述的大麦植物，其中该突变是：
a.导致编码突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因的突变，所述突变体HvWRKY38蛋白缺少SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸200至206、220、226、250和/或252中的至少一个；
b.导致HvWRKY38基因缺失的突变
56.根据项54至55中任一项所述的大麦植物，其中所述突变在HvWRKY38基因中引入提前的终止密码子。
57.根据项54至56中任一项所述的大麦植物，其中所述突变是HvWRKY38基因剪接位点中的突变。
58.根据项54至57中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码至少缺少SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的氨基酸200-206的突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因。
59.根据项54至58中任一项的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvWRKY38基因，其编码突变体HvWRKY38蛋白，所述突变体HvWRKY38蛋白缺少SEQ ID NO：11或SEQ IDNO：12的至少102个最C端氨基酸，例如至少104个最C端氨基酸，例如至少128个最C端氨基酸，例如至少134个最C端氨基酸。
60.根据项54至59中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvWRKY38基因，其编码缺少SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至少154个最C端氨基酸的突变体HvWRKY38蛋白。
61.根据项54至60中任一项的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码截短的HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因，所述截短的HvWRKY38蛋白包含HvWRKY38的N-端片段，其包含SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多251个N-端氨基酸，例如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多249个N-端氨基酸，例如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多225个N-端氨基酸，例如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多219个N-端氨基酸，优选SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的至多199个N-端氨基酸。
62.根据项54至61中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在密码子1至200的任一个中携带提前的终止密码子的突变体HvWRKY38基因。
63.根据项54至62中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在SEQ IDNO：10的密码子1至200中任一中携带提前的终止密码子的突变体HvWRKY38基因。
64.根据项54至63中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含在SEQ IDNO：10的200中携带提前的终止密码子的突变体HvWRKY38基因。
65.根据项54至64中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码突变体HvWRKY38蛋白的突变体HvWRKY38基因，其中所述突变体HvWRKY38蛋白携带SEQ ID NO：11或12的W200终止突变。
66.根据项54至65中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含突变体HvWRKY38基因，其包含SEQ ID NO：10的HvWRKY38编码序列的核苷酸600的G→A突变。
67.根据项54至66中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含编码SEQ IDNO：14的多肽或其中氨基酸98为Met的SEQ ID NO：14的多肽的突变体HvWRKY38基因。
68.根据项54到67中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含含有SEQ IDNO：13的编码序列的突变体HvWRKY38基因。
69.根据项54至68中任一项所述的大麦植物，其中与包含野生型HvWRKY38基因但其他方面具有相同基因型的大麦植物相比，所述大麦植物包含少于10％的突变体或野生型HvWRKY38 mRNA，其中HvWRKY38mRNA是编码SEQ ID NO：11或12的多肽或其功能同源物的RNA，并且野生型HvWRKY38基因是编码SEQ ID NO：11或12的多肽或其功能同源物的基因，其中所述功能同源物与SEQ ID NO：11或12具有至少95％的序列同一性。
70.根据项54至69中任一项所述的大麦植物，其中所述HvWRKY38基因中的突变是导致HvWRKY38功能完全丧失的突变。
71.根据项54至70中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物还在HvHRT基因中携带突变，其中所述突变是根据项3至26中任一项所述的突变，和/或所述大麦还包含至少一个根据项27至32中任一项所述的α-淀粉酶基因，和/或所述大麦植物还在HvHBL12基因中携带突变，其中所述突变是根据项37至52中任一项所述的突变。
72.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含至少五个α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子。
73.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含至少六个，例如至少七个α-淀粉酶基因，所述α-淀粉酶基因包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子。
74.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物是高产量的春大麦品种。
75.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含amy2簇中的至少一个、例如至少两个、例如至少三个α-淀粉酶基因，所述基因包含非标准串联重复W盒。
76.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述非标准串联重复W-盒各自选自由以下组成的组：
·(TGACR(X)mYTGRCC)；
·(TGACR(X)mTTGACC)；
·(TGACR(X)mTTGAC)；
·(TGAC(C)n(X)mYTGRCC)；
·(TGAC(C)n(X)mCTGRCC)；
·(TGAC(C)n(X)mYTGGCC)；
·(TGAC(C)n(X)mCTGACC)；
·(TGAC(C)n(X)mTTGGCC)；和
·(TGAC(C)n(X)mTTGATC)。
其中R是G或A，Y是C或T，n是0或1，并且m是0-20的整数。
77.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中m为0～10的整数。
78.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中m为0～6的整数。
79.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中一个或多个α-淀粉酶基因包含非标准串联重复W-盒，所述非标准串联重复W-盒分别选自以下序列：
·TGACGGTCGTATTGACC；
·TGACAGTGGTATTGGCC；
·TGACAGTGGTACTGGCC；
·GTGACAGTGGTATTGGCC；
·TGACGGTCGTATTGATC；
·TGACCGTCGTATTGATC；和
·TTGACTTGATC。
80.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含amy1_1簇，其中至少一个α-淀粉酶启动子包含含有序列TTGATC的非标准串联重复W-盒。
81.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含amy1_1簇，其中至少一个α-淀粉酶启动子包含含有序列CTGACGGTCGTATTGATC(SEQ ID NO：72)的非标准串联重复W-盒。
82.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含含有图11A中显示为"HENZ-43amy1_1"的序列的amy1_1簇。
83.根据项37至82中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少100U/g，例如至少110U/g的α-淀粉酶活性，条件是所述大麦植物无壳或在发芽开始前已除去至少部分壳。
84.根据项37至83中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少20mU/g，条件是所述大麦植物无壳或在发芽开始前已除去至少部分壳。
85.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有的α-淀粉酶活性为不携带所述突变但其它方面具有相同基因型的大麦植物的α-淀粉酶活性的至少105％，例如至少110％，例如至少120％，例如至少150％，例如至少170％。
86.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的产量为不含所述突变但其它方面具有相同基因型的大麦植物的产量的至少90％。
87.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物具有至少38g，例如至少40g的TKW。
88.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的淀粉含量为至少55％w/w，例如至少60％w/w。
89.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的蛋白质含量为至少9.5％w/w。
90.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的高度为不含所述突变但其它方面具有相同基因型的大麦植物的高度的至少90％。
91.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物具有的穗数/M2为不含所述突变但其它方面具有相同基因型的大麦植物的穗数/M2的至少90％。
92.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物不经历收获前出芽。
93.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中当从已经进行了20天的常规水喷雾的大麦植物中收获所述大麦植物时，所述大麦植物的麦粒的发芽率与未经所述水喷雾并成熟时收获的所述大麦植物的麦粒的发芽率相同或更高。
94.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物的所述部分为麦粒。
95.根据前述项中任一项所述的大麦植物或其后代，其中所述大麦植物并非仅通过基本上生物学的方法获得。
96.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物是通过包括以下步骤的方法制备的，或是通过包括以下步骤的方法制备的植物的后代：
·使大麦植物或其部分诱变，例如使用化学诱变剂如NaN3
·选择携带本文所述的任何突变的大麦植物。
97.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含以下突变或性质中的至少两个，例如至少三个：
a.HvHRT基因中携带导致HvHRT功能丧失的突变；和/或
b.携带至少一个α-淀粉酶基因，该基因包含突变体α-淀粉酶启动子，该启动子在GARE盒中包含突变；和/或
c.携带至少四个α-淀粉酶基因，其包括具有序列TAACAAA的GARE盒；和/或
d.携带amy2簇中的至少一个α-淀粉酶基因，其包含突变体α-淀粉酶启动子，所述突变体α-淀粉酶启动子包含GARE盒中的突变或具有序列TAACAAA；和/或
e.在HvHBL12基因中携带导致HvHBL12功能丧失的突变；和/或
f.携带至少四个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子，其中所述非标准串联重复W-盒包含序列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)，其中一个或多个特定核苷酸已被取代或缺失，并且其中X可以是任何核苷酸，n是0或1，m是0-20范围内的整数；和/或
g.携带amy2簇中的至少一个α-淀粉酶基因，其包含含有非标准串联重复W-盒的α-淀粉酶启动子；
h.在WRKY38基因中携带导致WRKY38功能丧失的突变。
98.根据前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物包含以下突变中的至少两个，例如至少三个：
a.一个或多个α-淀粉酶启动子中的突变，例如上文"α-淀粉酶和在α-淀粉酶启动子中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变，
b.HvHRT基因中的突变，例如上文"在HRT基因中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变
c.HvHBL12基因中的突变，例如上文在"在HvHBL12基因中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变
d.HvWRKY38基因中的突变，例如上文在"在WRKY38基因中携带突变的大麦植物"部分中所述的任何突变
99.如前述项中任一项所述的大麦植物，其中所述大麦植物在一个或多个其它基因中含有突变，例如一个或多个以下突变：
a.LOX-1编码基因中导致功能性LOX-1的完全丧失的突变
b.LOX-2编码基因中导致功能性LOX-2的完全丧失的突变
c.MMT编码基因中导致功能性MMT的完全丧失的突变
d.CslF6编码基因中的突变，其中所述突变体基因编码具有降低的CslF6活性的突变体CslF6蛋白。
100.一种植物产品，其包含或制备自根据前述项中任一项所述的大麦植物或其部分。
101.根据项100所述的植物产品，其中所述植物产品选自由大麦粉、绿麦芽和窑烧干燥麦芽组成的组。
102.根据项100至101中任一项所述的植物产品，其中所述植物产品是包含所述大麦植物的经加工麦粒的绿麦芽或窑烧干燥麦芽。
103.根据项100至102所述的植物产品，其中植物产品是磨碎的绿麦芽或磨碎的窑烧干燥麦芽。
104.根据项100至101所述的植物产品，其中植物产品是大麦粉。
105.根据项100所述的植物产品，其中所述植物产品是由所述大麦植物的麦粒和/或由包含所述大麦植物的经加工麦粒的绿麦芽或窑烧干燥麦芽制备的麦芽汁。
106.根据项100所述的植物产品，其中所述植物产品是从所述大麦植物或其部分制备的饮料。
107.根据项106所述的饮料，其中所述饮料由所述大麦植物的麦粒和/或由包含所述大麦植物的经加工麦粒的绿麦芽或窑烧干燥麦芽制备。
108.根据项106至107中任一项所述的饮料，其中饮料为啤酒。
109.一种制备绿麦芽的方法，所述方法包括以下步骤
(i)提供根据项1至99中任一项所述的大麦植物的麦粒；
(ii)浸泡所述麦粒；
(iii)在预定条件下使浸泡的麦粒发芽。
110.一种制备窑烧干燥麦芽的方法，所述方法包括以下步骤
(i)提供根据项1至99中任一项所述的大麦植物的麦粒；
(ii)浸泡所述麦粒；
(iii)在预定条件下使浸泡的麦粒发芽；
(iv)干燥所述发芽的麦粒。
111.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供根据项1至99中任一项所述的大麦植物的麦粒和/或根据项102至103所述的绿麦芽或窑烧干燥麦芽
(ii)制备所述麦粒和/或所述麦芽的水性提取物
(iii)将所述水性提取物加工成饮料。
112.一种生产水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供根据项1至99中任一项所述的大麦植物的谷粒；
b.使大麦谷粒进行发芽步骤，从而获得发芽的谷粒，其中所述发芽步骤包括在水溶液中温育所述谷粒，直到谷粒的含水量至少为30％，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少2L O2通过所述水溶液；
c.精细分割所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒具有至少20％的含水量，条件是所述大麦谷粒在步骤b)和c)之间的任何时间不具有低于20的含水量；
d.制备所述精细分割的发芽的谷粒的水性提取物，从而产生大麦的水性提取物。
113.根据项112所述的方法，其中在整个发芽步骤中将大麦的谷粒浸没在水溶液中。
114.根据项112至113中任一项所述的方法，其中发芽步骤包括
i.至少一个在水溶液中温育所述谷粒的步骤，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少2L O2通过所述水溶液；以及
ii.至少一个在空气中温育所述大麦谷粒的步骤。
115.根据项112至114中任一项所述的方法，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少3L，更优选至少4L，还更优选至少5L，甚至更优选至少6L的O2通过所述水溶液。
116.根据项112至115中任一项所述的方法，其中所述O2包含在气体混合物中，其中该气体混合物是大气空气。
117.根据项112至116中任一项所述的方法，其中整个发芽步骤不超过72h，更优选不超过60h，甚至更优选不超过54h。
118.根据项112至117中任一项所述的方法，其中大麦是去壳大麦，并且该方法包括在水溶液中温育所述谷粒之前去除至少部分所述壳的步骤。
119.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)通过根据项112至118中任一项所述的方法制备水性提取物；
(ii)将所述提取物加工成饮料。
120.根据项119所述的方法，其中步骤(iii)包括以下步骤：
a.任选在啤酒花或啤酒花提取物的存在下加热所述水性提取物；
b.冷却该水性提取物；
c.用酵母发酵所述水性提取物，从而产生发酵的饮料。
121.根据项119至120中任一项所述的方法，其中饮料是啤酒。
122.一种制备具有高α-淀粉酶活性的大麦植物的方法，所述方法包括以下步骤
a)提供大麦麦粒；以及
b)随机诱变所述大麦麦粒，从而在至少一个大麦麦粒中引入至少一个下列突变：
·HvHRT基因中的突变；
·一个或多个α-淀粉酶启动子中的突变
·HvHBL12基因中的突变
·WRKY38基因中的突变
c)选择携带至少一个所述突变的大麦麦粒或其后代。
123.根据项122所述的方法，其中所述突变如项3至26、27至32、37至52、54至70和72至82中任一项所定义。
实施例
通过以下实施例进一步说明本发明，然而，这些实施例不应被解释为限制本发明。
实施例1
大麦基因HvHRT在2012版大麦基因组中表示为ID#MLOC_51005(cv.Morex)或ID#AK362734(cv.Haruna Nijo)下的CDS，以及表示为Morex_contig_368180(cv.Morex)(IBSC，2012)上的基因组DNA。在2017版大麦基因组(Mascher等，2017)中，HvHRT由CDS表示，并且蛋白序列由ID#HORVU2Hr1G035630表示。在2017版大麦基因组中，HvHRT位于染色体2H的位置150.902.998bp-150.911.087bp。在2017版大麦基因组中，HvHRT被注释为转录的效应子2(effector of transcription2)。在2012版大麦基因组中，HvHRT被构建在三个外显子中。原始序列以ID#AJ001317.1保存在NCBI中。
如以下实施例2所述鉴定和分离命名为HENZ-2的大麦突变体。HENZ-2在大麦基因HvHRT中携带核苷酸取代，导致编码序列中的提前的终止密码子。HENZ-2突变体的HRT基因的编码序列在此提供为SEQ ID NO：3，而由突变体HRT基因编码的突变体蛋白的序列提供为SEQ ID NO：4。
突变导致色氨酸431氨基酸转换为终止(W431终止)。突变体背景是cv.Paustian。分离的原始突变体对于多态性是杂合的，但随后繁殖以获得纯合突变体。
实施例2A
基于ddPCR筛选大麦(Hordeum vulgare)转录阻抑基因HRT中具有特定突变的大麦突变体。
使用国际专利申请PCT/EP2017/065516中描述的方法鉴定了在HvHRT基因中携带特定突变的大麦植物。
ddPCR测定
设计了独特的ddPCR分析，特异区分野生型编码序列SEQ ID NO：1中核苷酸位置1293处的HvHRT的突变体等位基因和野生型等位基因。如上所述，大麦HvHRT的几个遗传序列是可获得的，并且在本实施例中使用的ddPCR测定是基于cv.Himalaya GenBank号NCBI：AJ001317.1的基因组序列。突变体检测探针与编码序列互补，在核苷酸位置1293含有A碱基。参考检测探针与编码序列互补，在核苷酸位置1293含有G碱基。设计两个侧翼引物以扩增编码序列中核苷酸1293周围的基因组序列。
下列引物和探针是针对HvHRT基因座特别设计的：
-靶特异性正向引物(SEQ ID NO：15)：
5'-CACGAAGATGAGCCTTG-3'；
-靶特异性反向引物(SEQ ID NO：16)：
5'-TTGGCTGATTTCTGTGC-3'；
-突变体特异性检测探针(SEQ ID NO：17)：
5'-AAGTGATTTGAGCGGCT-3'，用6-羧基荧光素(FAM)标记；
-参考特异性检测探针(SEQ ID NO：18)：
5'-AGGAAGTGGTTTGAGCG-3'，用六氯荧光素(HEX)标记。
制备随机诱变的大麦谷粒库，然后如国际专利申请PCT/EP2017/065516在第66-69页的WS1、WS2和WS3中以及实施例1-7中所述制备有序文库。用于制备所述随机诱变文库的大麦栽培种是cv.Paustian的大麦。
确定文库样品是否含有突变的谷粒
下一步是确定文库是否含有所需的突变谷粒。基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516在WS3和实施例3-7中所述进行筛选，具体如下：
-对总共376个亚群(命名为GLP#1至GLP#376)进行筛选，总共代表大约120,000个突变的大麦植物。
-自每个亚群制备一个5μL gDNA样品(命名为GT#1-GT#376)。将gDNA样品GT#1-GT#94加到微量滴定板的各个孔中，每个孔还含有17μlPCR反应混合物，并通过上下吹打充分混合。
将PCR用微量滴定板放置到QX200液滴读取器(Bio-Rad)上，进行液滴分析。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析获得的数据。使用2-D曲线确定阈值，对于通道1和通道2振幅的扩增，分别设定在3700和2500。比较部分丰度的单个值显示，就突变体检测而言，gDNA(GT#64)提供比任何其它样品更高的信号。gDNA(GT#64)的分数丰度为0.062％，相比之下，所有94个测试的gDNA样品的平均分数丰度为0.012％。
发现以目标突变为特征的单个谷粒
基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516在WS4(第69-72页)和实施例8-15中所述鉴定了携带基因突变的单个大麦谷粒，包括以下连续排序的细节：
1.根据HvHRT特异性ddPCR测定对来自GT#1-GT#94的gDNA的分析，认为4500粒GLP#64[对应于阳性样品gDNA(GT#64)]很可能含有一个或多个具有目的基因突变的谷粒。
2.通过从GLP#64中顺序除去96X 12个谷粒样品而建立FGLP#64。将每等份12粒谷粒置于一张称量纸上，并且然后用一对镊子连续固定，同时使用装备有1.6mm钻头的雕刻机(Marathon-3，Saeyang Microtech)钻出2-3mm深的小孔至胚乳中。旋转运动将粉从胚乳移动到谷物顶部和周围的称量纸的上。将12粒经钻孔的样品置于微量滴定板的单独的2mL孔中，产生经钻孔的大麦谷粒PDGLP#64的第二亚群。将96个面粉样品(各自具有源自12个钻孔的大麦谷粒的粉)转移至1.5mL微量滴定板(PFGLP#64)的分开的孔中，所述微量滴定板保持与钻取的谷粒的样品编号系统匹配的样品编号系统。
3.接着，使用NucleoSpin96 Plant II试剂盒(Macherey-Nagel)的说明书中详述的半自动化DNA提取程序，对PFGLP#64进行gDNA的提取。因此，微量滴定板的每个孔含有来自12个谷粒的粉的gDNA。
4.如上所述分析来源于PFGLP#64的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线图来确定阈值，且针对通道1振幅将阈值设定为3700和针对通道2振幅将阈值设定为2500。比较分数丰度的单个值显示PFGLP#64的一个孔含有突变体谷粒。孔C04显示3.92％的分数丰度，表明杂合突变体PDGLP#64的存在。
5.来自PDGLP#64的孔C04的所有12粒谷粒发芽。从所有12个小植株收获叶材料，并使用REDExtract(Sigma Aldrich)进行DNA提取。如上所述分析来自叶样品的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线来确定阈值，且针对通道1振幅将阈值设定为3700，针对通道2振幅将阈值设定为2500。来自PDGLP#64的孔C04的一个小植株显示45％的分数丰度，证实杂合突变体的存在。繁殖来自所述植物的种子，并将后代杂交以获得纯合植物。繁殖纯合植物以增加材料。将针对突变而言纯合的植物命名为HENZ-2。
因此，HENZ-2大麦植物含有SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1293的G→A突变。因此，HENZ-2携带了编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，该蛋白包含SEQ ID NO：2的W431终止突变。
实施例2B
基本上如实施例2A所述获得大麦突变体HENZ-2a，除了用于制备随机诱变文库的大麦栽培种是cv.Planet的大麦。使用相同的引物和探针。
HENZ-2a还含有SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1293的G→A突变。因此，HENZ-2a也携带编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，该突变体HvHRT蛋白包含SEQ IDNO：2的W431终止突变。
因此，HENZ-2可被认为具有cv.Paustian背景，而HENZ-2a可被认为具有cv.Planet背景。
实施例3A
在田间繁殖HENZ-2大麦突变体植物以及对照纯合大麦植物。对照纯合植物由实施例2A所述杂合突变体杂交获得，并且对照纯合植物包含编码SEQ ID NO：2的HvHRT的野生型HvHRT基因。因此，认为对照纯合植物与HENZ-2相同，只是它们不携带HvHRT基因的突变。
HENZ-2大麦突变体植物以及对照纯合大麦植物在新西兰大田(1块样地)和Fuhnen大田(5块单独的样地)中繁殖。根据标准程序每10m2播种3.6倍的TKW。用150kg氮/公顷处理样地，并且根据标准耕作程序进行杀真菌剂处理。在新西兰，每块样地大约2m2，而在Fuhnen每块样地大约7.5m2。重复耕种样地，并且HENZ-2和对照组的耕种彼此靠近。HENZ-2和对照在相同大小的样地中生长以进行比较。通过在成熟时收获大麦植物并测定每块样地的麦粒重量来测定产量。通过对预定数目的麦粒称重并计算1000个麦粒的重量来确定1000个麦粒的重量(TKW)。使用Foss Tecator，Infratec1241谷粒分析仪，根据生产商的说明书(Foss，丹麦)，通过近红外分析测定大麦麦粒的淀粉含量(淀粉)和蛋白质含量(蛋白质)。淀粉含量和蛋白质含量以总麦粒干重的干淀粉或蛋白质重量％提供。通过测量所选植物从底部(第一节间开始，根的正上方)至穗的顶部(大麦穗保持直立)的植物高度来确定平均植物高度。通过计数来自预定面积的植物上的穗的数目并计算每m2的穗的数目来确定每m2的穗数。
结果示于下表1。
表1
如表1的数据所示，令人惊讶的是，HENZ-2突变体和对照植物之间的产量、TKW、淀粉含量、蛋白质含量、植物高度和穗数/m2没有显著差异。
实施例3B
收获前出芽是非常不希望的，因为它导致种子活力立即丧失。进行收获前出芽实验以评价大麦突体变HENZ-2的收获前出芽程度。作为对照，测定cv.Paustian和cv.Flagship野生型大麦的收获前出芽。已知cv.Flagship的大麦具有高水平的收获前出芽。实验如下进行。HENZ-2、Paustian和Flagship在田地中以彼此接近的单独样地生长。在谷粒成熟时，收获每块样地的子部分(收获1)。通过在植物上喷水10分钟/小时，每天12小时，持续10天来灌溉剩余的样地区域，然后收获每个样地区域的子部分(收获2)。剩余的样地区域再经受10天的相同灌溉方案，然后收获(收获3)。收获后的当天，对所有三次收获启动发芽试验。发芽试验通过将100个麦粒置于9.5cm培养皿中的滤纸上并加入3ml或5ml水来进行。在3天温育后，计算发芽的谷粒的比率，并以％发芽的麦粒提供。在收获1与收获2和3之间具有降低的发芽率的大麦品种被认为是要经历收获前出芽，而在收获1与收获2和3之间具有相同或增加的发芽率的大麦品种不经历收获前出芽。结果示于表2。
表2
G.R.显示以％表示的发芽率
Diff*显示百分点形式的第一和第三次收获的平均发芽率之间的差异。
HENZ-2和cv.Paustian两者在第一次和第三次收获之间发芽率增加，因此这些大麦植物中没有一个经历收获前出芽。此外，在HENZ-2和cv.Paustian之间，在第一次和第三次收获之间观察到的发芽率增加没有显著差异。相比之下，cv.Flagship的发芽率显著降低，因此如预期的那样，显示出收获前出芽。
实施例3C
将在田间在相似条件下生长的HENZ-2大麦突变体植物和大麦植物cv.Paustian的谷粒材料在标准发芽试验中发芽：
·使用Pfeuffer谷粒分选机按大小分选谷粒>使用大小为2.5和2.8mm的谷粒
ο将100粒全谷粒置于90mm培养皿中的2片Whatman(1级，85mm，货号1001-085)上，并加入4ml水媒(aqua dest)
ο另100粒全谷粒置于90mm培养皿中的2片Whatman(1级，85mm，货号1001-085)上，加入8ml水媒(高水条件)
·将培养皿封闭并在20℃下储存在用湿布覆盖的暗箱中
·4ml培养皿在24小时、48小时和72小时后检查，从培养皿中取出发芽的谷粒(细根出现)，并记录发芽的谷粒的数目
·72小时后检查8ml培养皿，从培养皿中取出发芽的谷粒(细根出现)，并记录发芽的谷粒的数目
72小时后的结果如图1所示。野生型和HENZ-2的谷粒在4ml水中99.5％发芽。这表明该材料不是休眠的。当测试水敏感性(8ml水)时，HENZ-2具有显著更高的发芽率(80％相对于40％野生型)。这表明HENZ-2在水和氧应力下表现得明显更好，如在实施例4中所述的麦芽床或具有气流的槽中所见。
实施例4
来自在类似条件下在大田中生长的HENZ-2大麦突变体和大麦植物cv.Paustian的谷粒材料，在基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065498的实施例1中所述的水槽中发芽，细节如下：将200g大麦谷粒(干重)在槽中培养48小时，并用含GA1 mM的水覆盖，同时接受的气流为90L/h/kg大麦谷粒干重)。在发芽期间，在24小时和48小时之后测量谷物含水量，结果示于图2中。HENZ-2与野生型相比在两种情况下均具有更高的谷粒含水量，这表明提前发芽。
使用ddPCR(Biorad)，使用对指定基因特异的引物和探针，在48小时后，在相同材料中测量α-淀粉酶(amy1_1和amy1_2)和β-葡聚糖酶2A和2B(BGL2A)的基因表达。使用实施例20中描述的基因表达的一般ddPCR方案。用于测定BGL2A表达的引物和探针也扩增和检测BGL2B，因此测定了BGL2A和BGL2B的联合表达(在图3中表示为"BGL2A")。结果示于图3中。HENZ-2材料显示所有测试的基因的显著更高的表达，表明提前发芽。BGL2A的序列以登录号HORVU7Hr1G120450.1可获得。
使用如下标准Megazyme测定，在24小时后和48小时后，在相同材料中测量α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶的活性。
样品制备
在酶活性分析之前，使用标准Foss Cyclotech研磨机(Foss，丹麦)研磨发芽的谷粒样品，该研磨机装备有碳化钨研磨环(Foss10004463)、镀镍叶轮(Foss 1000 2666)和1mm出口筛网(Foss 10001989)。在样品研磨后48小时内进行发芽的大麦谷粒中酶活性的所有测量。
α-淀粉酶活性
发芽的谷粒的α-淀粉酶活性基于如上文"样品制备"部分中所述制备的面粉。使用标准实验室设备，测定α-淀粉酶活性的测定利用了来自Megazyme的Ceralpha试剂盒。根据制造商的方案(K-CERA01/12)进行测定，包括计算α-淀粉酶活性。
β-淀粉酶活性
当测量发芽的谷粒的β-淀粉酶活性时，如上文"样品制备"部分中所述制备面粉。β-淀粉酶活性测定遵循由Megazyme的Betamyl试剂盒(K BETA3)提供的建议。
极限糊精酶活性
为了测量发芽的谷粒中的极限糊精酶活性，如上文"样品制备"部分中所述制备面粉。极限糊精酶活性使用Megazyme的Limit Dextrizyme试剂盒T-LDZ1000测定。根据制造商的方案(T-LDZ1000 07/9)进行测定，包括活性测量。
结果示于图4中。HENZ-2材料在所有测试的酶中均显示显著更高的活性，表明提前发芽(例外的是α-淀粉酶24小时样品，其无论如何整体较低)。
实施例5
来自在类似条件下在大田中生长的HENZ-2大麦突变体和大麦植物cv.Paustian的谷粒材料，在基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065498的实施例9中所述的水槽中发芽，细节如下：按照国际专利申请PCT/EP2017/065498的实施例8中所述，将200g大麦谷粒进行1分钟的剥皮。随后，将去皮的大麦谷粒转移到槽中，并用500ml含有0.01％ H2O2、消泡剂-204、GA3 1mM的水覆盖，并且在90L/H空气通气下温育24H。这相当于每100ml水每小时18L空气。排出多余的水，并在90L/h空气通气下温育谷粒24小时)。使用如实施例4中所述的标准Megazyme测定，在发芽后24小时和48小时测定α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶的活性。此外，测定在根据EBC 19标准制备的麦芽中这些酶的活性(获自Institute Francais De LaBrasserie Et De La Malterie(IFBM)，法国)。结果示于图5中。HENZ-2材料在所有测试的酶中显示显著更高的活性，表明提前发芽。测定的HENZ-2的活性甚至超过EBC19标准。
实施例6
如下所述鉴定和分离命名为HENZ-10的大麦突变体。HENZ-10在大麦基因HvHBL12中携带核苷酸取代，导致HBL12蛋白翻译中的提前的终止密码子。氨基酸交换是色氨酸228到终止(W228终止)。突变体背景是无壳大麦品种(本文也称为"无壳1")。与脱壳大麦品种相比，无壳大麦植物在发芽过程中通常具有更高的α-淀粉酶活性。突变体HvHBL12基因的编码序列在此提供为SEQ ID NO：8，而由突变体HvHBL12基因编码的突变体蛋白的序列提供为SEQ ID NO：9。
分离的原始突变体大麦植物对于突变是纯合的。
实施例7A
基于ddPCR筛选在HvHBL12基因中具有特定突变的大麦突变体。
使用国际专利申请PCT/EP2017/065516中描述的方法鉴定携带特定突变的大麦植物。
ddPCR测定
设计了独特的ddPCR分析，特异性地区分HvHBL12在野生型编码序列(GenBank编号NCBI：JX878491.1)核苷酸位置684的突变体等位基因和野生型等位基因。可获得HvHBL12的稍微不同的序列，并且ddPCR测定基于GenBank号NCBI：JX878491.1设计。突变体检测探针与编码序列互补，在核苷酸位置684(对应于SEQ ID NO：5的核苷酸684)含有A碱基。参考检测探针与编码序列互补，在核苷酸位置684含有G碱基。设计两个侧翼引物以扩增编码序列中核苷酸684周围的基因组序列。
针对HvHBL12基因座特别设计下列引物和探针：
-靶特异性正向引物(SEQ ID NO：19)：
5'-GTCGTCGTTCCCGTT-3'；
-靶特异性反向引物(SEQ ID NO：20)：
5'-CTGCAGGTCTGCTCC-3'；
-突变体特异性检测探针(SEQ ID NO：21)：
5'-ACTCGAGCTGACCGT-3'，用6-羧基荧光素(FAM)标记；
-参考特异性检测探针(SEQ ID NO：22)：
5'-CTCGAGCTGGCCGT-3'，用六氯荧光素(HEX)标记。
制备随机诱变的大麦谷粒库，然后如国际专利申请PCT/EP2017/065516在第66-67页WS1和WS2中以及实施例1-2中所述制备有序文库。用于制备所述随机诱变文库的大麦栽培种是Hull-less(无壳)1类型的大麦。
确定文库样品是否含有突变的谷粒
下一步是确定文库是否含有所需的突变的谷粒。基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516在WS3(第67-69页)和实施例3-7中所述进行筛选，具体如下：
-用总共376个亚群(命名为GLP#1至GLP#376)进行筛选，代表大约120,000个突变的大麦植物。
-自每个亚群制备一个5μL gDNA样品(命名为GT#1-GT#376)。将gDNA样品GT#283-GT#376加到微量滴定板的各个孔中，每个孔还含有17μl PCR反应混合物，并通过上下吹打充分混合。
将PCR用微量滴定板放置到QX200液滴读取器(Bio-Rad)上，进行液滴分析。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析获得的数据。使用2-D曲线确定阈值，对于通道1和通道2振幅的扩增，分别设定在3500和1500。比较各个部分丰度值显示，就突变体检测而言，gDNA(GT#291)提供比任何其它样品更高的信号。gDNA(GT#291)的分数丰度是0.105％，相比之下，所有94个测试的gDNA样品的平均分数丰度为0.0094％。
发现以目标突变为特征的单个谷粒
基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065516在WS4(第69-72页)和实施例8-15中所述鉴定了携带基因突变的单个大麦谷粒，包括以下连续排序的细节：
6.根据HvHBL12特异性ddPCR测定对来源于GT#283-GT#376的gDNA分析，认为4500粒GLP#291[对应于阳性样品gDNA(GT#291)]很可能包含一个或多个具有目的基因突变的谷粒。
7.通过从GLP#291中顺序除去96X 12个谷粒样品而建立FGLP#291。将每等份12粒谷粒置于一张称量纸上，并且然后用一对镊子连续固定，同时使用装备有1.6mm钻头的雕刻机(Marathon-3，Saeyang Microtech)钻出2-3mm深的小孔至胚乳中。旋转运动将粉从胚乳移动到谷物顶部和周围的称量纸的上。将12粒经钻孔的样品置于微量滴定板的单独的2mL孔中，产生经钻孔的大麦谷粒PDGLP#291的第二亚群。将96个面粉样品(各自具有源自12个钻取的大麦谷粒的粉)转移至1.5mL微量滴定板(PFGLP#291)的分开的孔中，所述微量滴定板保持与钻取的谷粒的样品编号系统匹配的样品编号系统。
8.接着，使用NucleoSpin96 Plant II试剂盒(Macherey-Nagel)的说明书中详述的半自动化DNA提取程序，对PFGLP#291进行gDNA的提取。因此，微量滴定板的每个孔含有来自12粒谷粒的粉的gDNA。
9.如上所述分析来源于PFGLP#291的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线图来确定阈值，且针对通道1振幅将阈值设定为4000和针对通道2振幅将阈值设定为1500。鉴定了微量滴定板中的三个单个孔(E03、E11、G01)，其显示12.5％、4.42％和7.3％的分数丰度，所有这些表明在PDGLP#291的3个独立孔中存在三个单独突变。
10.来自PDGLP#291的孔G01的所有12粒谷粒发芽。从所有12个小植株收获叶材料，并使用REDExtract(Sigma Aldrich)进行DNA提取。如上所述分析来自叶样品的gDNA。使用软件QuantaSoft(版本v1.7，Bio-Rad)分析数据。使用2-D曲线确定阈值，且针对通道1振幅将阈值设定为6000，针对通道2振幅将阈值设定为2000。来自PDGLP#291的孔H01的一个小植株显示96.9％的分数丰度，证实纯合突变的存在。繁殖所述植物以增加材料。将针对突变而言纯合的植物命名为HENZ-10。
因此，HENZ-10大麦植物含有HvHBL12编码序列(SEQ ID NO：5)的核苷酸684的G→A突变。因此，HENZ-10包含含有编码序列SEQ ID NO：8的HvHBL12基因。HENZ-10因此携带编码包含W228终止突变的突变体HvHBL12蛋白的突变体HvHBL12基因。
实施例7B
基本上如实施例7A所述获得大麦突变体HENZ-61，除了用于制备随机诱变文库的大麦栽培种是cv.Planet的大麦。使用相同的引物和探针。
HENZ-61还包含含有编码序列SEQ ID NO：8的HvHBL12基因。因此，HENZ-61也携带编码包含W228终止突变的突变体HvHBL12蛋白的突变体HvHBL12基因。
因此，HENZ-10可被认为具有无壳1背景，而HENZ-61可被认为具有cv.Planet背景。
实施例8A
在类似条件下在田间样地中种植HENZ-10大麦突变体植物和无壳-1大麦植物。测定了各种农艺学特征，包括平均植物高度。HENZ-10大麦突变体植物经目测检查表现健康。通过测量五个单独田间样地中每样地所选择植物的从底部(第一节间的开始，根的正上方)至穗的顶部(大麦穗保持直立)的植物高度，来确定平均植物高度。结果显示于图10中，有趣的是，在HENZ大麦突变体植物和亲本无壳-1大麦植物之间没有观察到植物高度上的差异。
在新西兰大田(1块样地)和Fuhnen大田(5块单独的样地)中繁殖HENZ-10大麦突变体植物以及无壳1大麦植物。繁殖、地块大小等基本上如以上实施例3A中所述。如以上实施例3A所述测定产量、1000粒麦粒的麦粒重量(TKW)、淀粉含量(淀粉)(占总麦粒干重的干淀粉％)、蛋白质含量(蛋白质)(占总麦粒干重的干蛋白质％)、植物高度和穗数/m2。
表3
如表1的数据所示，令人惊讶的是，HENZ-10突变体和对照植物之间在产量、TKW、淀粉含量、蛋白质和植物高度上没有显著差异。
实施例8B
HENZ-61大麦体突变植物以及cv.Planet的野生型大麦植物在田间以单个但接近的样地繁殖。如以上实施例3A中所述测定产量、1000粒麦粒的麦粒重量(TKW)、淀粉含量(淀粉)、蛋白质含量(蛋白质)、植物高度和穗数/m2。
HENZ-61大麦突变体植物预期具有类似于cv.Planet的产量、1000粒麦粒的麦粒重量(TKW)、淀粉含量(淀粉)、蛋白质含量(蛋白质)、植物高度和/或穗数/m2。
实施例9
如下，将在田间在相似条件下生长的HENZ-10大麦突变体植物和无壳-1大麦植物的谷粒材料在标准发芽试验中在培养皿中发芽：
·使用Pfeuffer谷粒分选机按大小分选谷粒>使用大小为2.5和2.8mm的谷粒
·将100粒全谷粒置于90mm培养皿中的2片Whatman(1级，85mm，货号1001-085)上，并加入4ml水媒(aqua dest)
·另100粒全谷粒置于90mm培养皿中的2片Whatman(1级，85mm，货号1001-085)上，加入8ml水媒
·将培养皿封闭并在20℃下储存在用湿布覆盖的暗箱中
·4ml培养皿在24小时、48小时和72小时后检查，从培养皿中取出发芽的谷粒(细根出现)，并记录发芽的谷粒的数目
·72小时后检查8ml培养皿，从培养皿中取出发芽的谷粒(细根出现)，并记录发芽的谷粒的数目。
72小时后的结果如图6所示。野生型无壳1和HENZ-10的谷粒在4ml水中分别发芽98和97.5％。这表明该材料不是休眠的。当测试水敏感性(8ml水)时，HENZ-10具有显著更高的发芽率(100％相对于89％野生型)。这表明HENZ-10在水和氧应力条件下表现更好，如在实施例4中所述的麦芽床或具有气流的槽中所见。
实施例10
来自在类似条件下在大田中生长的HENZ-10大麦突变体和无壳-1大麦植物的谷粒材料在装有水的锥形瓶中于振荡器上在室温下发芽48小时。48小时后，使用ddPCR，使用对指定基因特异的引物和探针，测量α-淀粉酶(amy1_1和amy1_2)、极限糊精酶(LD)、α-葡糖苷酶97(AGL97)和β-葡聚糖酶2A和2B(BGL2A和BGL2B)的基因表达。结果示于图7。BGL2B的序列可在HORVU1Hr1G057680.1下获得。HENZ-10材料显示所有测试的基因的表达增加，表明与其无壳1野生型亲本相比，提前发芽。应当注意，在无壳1大麦中，胚乳修饰与许多有壳的野生型大麦栽培种相比开始得更早，例如由早期的高α-淀粉酶活性所表明的。因此，值得注意的是，与无壳1相比，HENZ-10显示所有测试的基因的表达增加。因此，尽管无壳1已经具有早期的高α-淀粉酶，HENZ-10仍然具有甚至更高的α-淀粉酶活性。
实施例11
来自在类似条件下在大田中生长的HENZ-10大麦突变体和无壳1大麦植物的谷粒材料，在基本上如国际专利申请PCT/EP2017/065498的实施例1中所述的水槽中发芽，细节如下：将200g大麦谷粒(干重)在槽中培养48小时，并用含GA1 mM的水覆盖，同时接受的气流为90L/h。48小时后通过ddPCR使用对指定基因特异的引物和探针测量α-淀粉酶(amy1_1和amy1_2)、极限糊精酶(LD)和β-葡聚糖酶2A(BGL2A)的基因表达。使用实施例20中描述的基因表达的一般ddPCR方案。结果示于图8中。HENZ-10材料显示所有测试的基因的显著更高的表达，表明与野生型无壳-1大麦相比，提前发芽。
使用如实施例4所述的标准Megazyme分析法，在24小时和48小时后，测量同一材料中的α-淀粉酶、β-淀粉酶和极限糊精酶的活性。结果如图9所示。HENZ-10材料在所有测试的酶中显示更高的活性，表明提前发芽。
实施例12A
基本上如以上实施例2A中所述鉴定和分离命名为HENZ-50的大麦植物。HENZ-50在大麦基因WKRY38中携带核苷酸取代，导致基因在编码序列中含有提前的终止。因此，HENZ-50携带HvWRKY38(SEQ ID NO：10)编码序列的核苷酸600的G→A突变。本文中提供来自大麦cv.Ingrid的WRKY38的编码序列SEQ ID NO：10。提供来自大麦的两种不同的野生型WRKY38多肽序列SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。HENZ-50大麦植物携带导致大麦基因HvWRKY38中过早的终止(W200终止)的点突变。突变位于WKRY基序特征序列WRKYGQK(SEQ ID NO：11或12的aa200-206)的开始。HENZ-50的突变体HvWRKY38基因编码具有序列SEQ ID NO：14的突变体HvWRKY38蛋白。
基本上如实施例2A所述通过随机诱变制备的大麦cv.Planet M2突变体群中鉴定HENZ-50大麦突变体植物。基本上如上文实施例2A所述鉴定和分离HENZ-50，除了使用下列引物和探针用于ddPCR测定：
靶特异性正向引物(SEQ ID NO：23)
5'-CTCAGCCTGGTGGTG-3'
靶特异性反向引物(SEQ ID NO：24)
5'-TGTCCTTGGTCACCTTC-3'
突变体特异性检测探针(SEQ ID NO：25)
5'-CCAATGACGCAAGTACG-3'，FAM标记
参考特异性检测探针(SEQ ID NO：26)
5'-TACCAATGGCGCAAGTA-3'，HEX标记。
实施例12B
大麦突变体HENZ-50和cv.Planet的野生型大麦在丹麦的温室中在类似条件下种植。将每一种的100粒谷粒在装有100ml去离子水的250ml锥形瓶中发芽，用石蜡膜密封，并放在250rpm的振荡器上。在发芽过程中，谷物持续地浸没在H2O中。除了烧瓶中的空气之外，没有空气供应。
在发芽开始后72小时(即从谷物浸没在水中的时间)使用如实施例4中所述的标准Megazyme测定测量α-淀粉酶的活性。
与cv.Planet相比，HENZ-50预期具有显著更高的α-淀粉酶活性。
实施例13A
基本上如以上实施例2A中所述鉴定和分离命名为HENZ-43的大麦植物。HENZ-43在amy1_1簇的大麦α-淀粉酶基因的启动子中携带核苷酸取代。突变导致串联重复W-盒的突变，导致具有以下序列的非标准串联重复W-盒：TGACGGTCGTATTGATC(SEQ ID NO：35)。换句话说，在HENZ-43中，amy1_1基因的野生型TTGACC序列被修饰为TTGATC。图11A显示了各种野生型α-淀粉酶启动子的部分序列与HENZ-43突变体的amy1_1簇的大麦α-淀粉酶基因的启动子的部分序列之间的比对。
基本上如实施例2A所述鉴定和分离HENZ-43大麦突变体植物，除了用于制备随机诱变文库的大麦栽培种是cv.Planet大麦，并且除了使用下列引物和探针用于ddPCR测定外：
靶特异性正向引物(SEQ ID NO：27)
5'-AAACAGAGGTTGAGGATAAC-3'
靶特异性反向引物(SEQ ID NO：28)
5'-GCCTTCGCCTTCCAT-3'
突变体特异性检测探针(SEQ ID NO：29)
5'-AGGCACCGATCAATACG-3'，用FAM标记
参考特异性检测探针(SEQ ID NO：30)
5'-AAGGCACCGGTCAATAC-3'，用HEX标记。
实施例13B
HENZ-43大麦突变体植物以及cv.Planet的野生型大麦植物在田间单独但在相近的样地中繁殖。如以上实施例3A中所述测定产量、1000粒麦粒的麦粒重量(TKW)、淀粉含量(淀粉)、蛋白质含量(蛋白质)、植物高度和穗数/m2。
HENZ-43大麦突变体植物预期具有类似于cv.Planet的产量、1000粒麦粒的麦粒重量(TKW)、淀粉含量(淀粉)、蛋白质含量(蛋白质)、植物高度和/或穗数/m2。
实施例14
基本上如以上实施例2A中所述鉴定和分离命名为HENZ-53和HENZ-54的两种大麦植物。
HENZ-53携带HvHRT编码序列(SEQ ID NO：1)的核苷酸510的G→A突变。HENZ-53因此携带了编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，该蛋白包含W170终止突变。
基本上如上文实施例2A中所述鉴定和分离HENZ-53大麦突变体植物，只是用于制备所述随机诱变文库的大麦栽培种是Planet型大麦，并且除了下面的引物和探针用于ddPCR测定：
靶特异性正向引物(SEQ ID NO：73)
5'-GTCAGCTACTGGGAGTATT-3'
靶特异性反向引物(SEQ ID NO：74)
5'-TCTTCGCGACGACAC-3'
突变体特异性检测探针(SEQ ID NO：75)
5'-TGCATGAAATAAACTGCAGA-3'，用FAMTM标记
参考特异性检测探针(SEQ ID NO：76)
5'-TGCATGGAATAAACTGCAG-3'，用HEXTM标记。
HENZ-54携带HvHRT的编码序列(SEQ ID NO：1)的核苷酸1113的G→A突变。因此，HENZ-54携带了一个突变体HvHRT基因，该基因编码包含W371终止突变的突变体HvHRT蛋白。
基本上如上文实施例2A中所述鉴定和分离HENZ-54大麦突变体植物，只是用于制备所述随机诱变文库的大麦栽培种是Planet型大麦，并且除了下面的引物和探针用于ddPCR测定：
靶特异性正向引物(SEQ ID NO:77)
5’-TGCTAATCCAAGCAAACG-3’
靶特异性反向引物(SEQ ID NO:78)
5’-TTTGTGGACAGATTTTTGGA-3’
突变体特异性检测探针(SEQ ID NO:79)
5’-AGCCTGACAAACCAGTG-3’-用FAMTM标记
参考特异性检测探针(SEQ ID NO:80)
5’-AAGCCTGGCAAACCAG-3’–用HEXTM标记
实施例15
大麦突变体HENZ-2、cv.Paustian的野生型大麦、大麦突变体HENZ-10和野生型大麦无壳1大麦在新西兰大田中在相似条件下生长。来自每种大麦的100粒谷粒在250ml锥形瓶中发芽，所述锥形瓶中装有100ml去离子水，用石蜡膜密封，置于250rpm的振荡器上。在发芽过程中，谷物持续地浸没在H2O中。空气以每100ml水9L/h的气流被引导通过该水。在通气条件下将谷粒在水中温育48小时或72小时。
在发芽开始48小时和72小时后(即，从谷物浸没在水中的时间起)，使用如实施例4中所述的标准Megazyme测定来测量α-淀粉酶的活性。
结果示于图13A和13B中。图13A显示HENZ-2和cv.Paustian(wt)的α-淀粉酶活性。图13B显示了HENZ-10和无壳1大麦(wt)的α-淀粉酶活性。HENZ-2和HENZ-10与各自的野生型对照相比都具有增加的α-淀粉酶活性。
实施例16
大麦突变体HENZ-10和野生型大麦无壳1在新西兰大田中在相似条件下生长。将每种大麦的100粒谷粒在装有100ml去离子水的250ml锥形瓶中发芽，用石蜡膜密封，置于250rpm的振荡器上。在发芽过程中，谷物持续地浸没在H2O中。除了烧瓶中的空气外，没有提供空气。
在从发芽开始24小时、48小时和72小时后(即从谷物浸没在水中的时间起)，使用如实施例4中所述的标准Megazyme测定来测量α-淀粉酶的活性。
结果如图14所示。图14显示了HENZ-10和无壳1大麦(wt)的α-淀粉酶活性。HENZ-10具有显著增加的α-淀粉酶活性，特别是72小时后。
实施例17
大麦突变体HENZ-2a、大麦突变体HENZ-54、大麦突变体HENZ-43和cv.Planet的野生型大麦在类似条件下在丹麦的温室中生长。将每种大麦的100粒麦粒在装有100ml去离子水的250ml锥形瓶中发芽，用石蜡膜密封，置于250rpm的振荡器上。在发芽过程中，谷物持续地浸没在H2O中。除了烧瓶中的空气外，没有提供空气。
在发芽开始72小时后(即从谷物浸没在水中的时间其)使用如实施例4中所述的标准Megazyme测定测量α-淀粉酶的活性。
结果显示于图15，上图中显示HENZ-2a、中图中显示HENZ-54和下图中显示HENZ-43的α-淀粉酶活性。HENZ-2a、HENZ-54和HENZ-43都具有显著增加的α-淀粉酶活性。
实施例18
从如实施例3A所述在类似条件下生长的HENZ-2突变体大麦和的对照纯合大麦植物获得谷粒。
每行50粒谷粒置于锥形瓶中于20℃下吸胀24小时(含水量达到～40％)。将吸胀的谷粒转移至培养皿(2ml H2O)中并使其发芽。在吸胀后0、12、24和48小时，即从将谷粒转移至培养皿时起，收集样品。在单个培养皿中制备每个时间点三个生物学重复。从300ng总RNA合成cDNA，随后稀释10倍。制备每个样品三个技术cDNA重复(因此每行每个处理总共9个重复)。
使用下列引物和探针，通过ddPCR测定amy1_1、amy1_2和amy2基因的mRNA表达。使用实施例20中描述的基因表达的一般ddPCR方案。所有测定都是在所述cDNA序列的3'端设计的。
结果示于图16。对照在图中命名为"WT"。与对照相比，HENZ-2在所有分析的amy基因中具有增加的转录水平。Amy1表达似乎比amy2表达更早受到影响。
实施例19
使用来自大麦突变体HENZ-2a、大麦突变体HENZ-54、大麦突变体HENZ-43和cv.Planet的野生型大麦的在类似条件下在丹麦温室中生长的谷粒材料。100粒谷粒在250ml锥形瓶中发芽，所述锥形瓶中装有100ml H2O，用石蜡膜密封，置于250rpm振荡器上。在发芽过程中，谷物持续地浸没在H2O中。除了烧瓶中的空气外，没有提供空气。
72小时后，通过ddPCR，使用下面所示的引物和探针，测量α-淀粉酶(amy1_1、amy1_2和amy2)、极限糊精酶(LD)的基因表达和β-葡聚糖酶2A和2B的表达(一起称为"bgl2")。β-葡聚糖酶2A和2B都可以使用相同的引物和探针进行扩增和检测。
结果示于图17至20中。HENZ-2a、HENZ-54和HENZ-43均具有增加的amy1_1、amy1_2和amy2、极限糊精酶(LD)和bgl2基因的表达。
实施例20
使用标准方法通过ddPCR测定基因表达。更具体地说，通常首先使用Trizol(Qiagen#15596026)规程从冻干的谷粒粉(约50mg)中提取RNA，然后用AurumTM Total RNAMini试剂盒(Bio-Rad#7326820)纯化。使用Bio-Rad的iScriptTM cDNA合成试剂盒(#1708891)合成cDNA。
对于ddPCR分析，将每个样品与引物、探针(用FAM或HEX标记)、ddPCR反应组分、ddPCR Supermix(无dUTP)和水(BioRad)混合。在液滴产生(Bio-Rad QX200TM自动液滴发生器#1864101)之前，混合样品。在热循环仪上温育液滴平板。
在Bio-Rad QX200TM液滴读取器上检测FAM和/或HEX阳性液滴的存在，并使用来自Bio-Rad的Quantasoft软件进行分析。
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<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 1
atgcctgcgg tcgccgctgc cagattgaag cgggaggact gcccccgcac caaacacgat 60
tccctcttct ccccatggaa ggttcttgtc gggccgtcgg actgggagga ccactccgcc 120
ggcaaggagg gggtccagag gtatcacaca cgcaacctcc cggacaactt ccctggcctc 180
tacgagctgg gcgttgcaag gccttcctat gatggtgtca gggctcgcag aaatcgatca 240
gttgtcgtcg tggtggtata cctcgggcag gccgataatg tcagggcgag gctccagcag 300
tacgggcgga cagggtcaca cctggacacc gggaatccgt tggctgctgt ctgtaaagct 360
gagatgaacg cgctcacggc aggacctgga ttgttcaggg aagtcttctc cagaggctac 420
tctatgatgt ttcgatgtgc gctgatgggt tccaaaaagg cagctgagaa gactgaaggt 480
cagctactgg gagtatttga ttatgcatgg aataaactgc agaatggtgc gtgtcgtcgc 540
gaagaaatac tgctcaagtt agaacaggga agcaatagat tatctttgct tagcagagtc 600
cggcacttaa aacagagggt gtttggagag aaagcaggta taaagattaa cagcagtggg 660
tctgttgaga tttcatctag cagtatgaaa aatatgcttc caagagtccg tacgtttgtc 720
ggcttcaggc ctcgtttggt taactctggc gacgatttaa acgaggcaag tgatattcac 780
cgaaaatgca cacctcaggc caatactgct ggtaaacaag cacatagaag gtctgaagga 840
tacaaggtga aaaagatcga tgttattaaa cggcgaactg caccgataag agaagccgaa 900
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gccaacgcac catcgtcgag aggccaagga tgtcagccaa gagaagcaaa caacgacgca 1380
tcagccttat gtggagtagt gacagataat ggatactgca aactggaacc ggtgatagga 1440
agggaaagat gcgaggagca cagaggaatt gaggtcactg gtgcgtcatc ggcaccatgt 1500
tccggaaggt cggtattgcc atctgtctgt ggagctcggg catccgatgg ttcaccttgc 1560
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tgcgcctccg cgccatcagt caaa 1644
<210> 2
<211> 548
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 2
Met Pro Ala Val Ala Ala Ala Arg Leu Lys Arg Glu Asp Cys Pro Arg
1 5 10 15
Thr Lys His Asp Ser Leu Phe Ser Pro Trp Lys Val Leu Val Gly Pro
20 25 30
Ser Asp Trp Glu Asp His Ser Ala Gly Lys Glu Gly Val Gln Arg Tyr
35 40 45
His Thr Arg Asn Leu Pro Asp Asn Phe Pro Gly Leu Tyr Glu Leu Gly
50 55 60
Val Ala Arg Pro Ser Tyr Asp Gly Val Arg Ala Arg Arg Asn Arg Ser
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Val Val Val Val Val Val Tyr Leu Gly Gln Ala Asp Asn Val Arg Ala
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Arg Leu Ser Leu Leu Ser Arg Val Arg His Leu Lys Gln Arg Val Phe
195 200 205
Gly Glu Lys Ala Gly Ile Lys Ile Asn Ser Ser Gly Ser Val Glu Ile
210 215 220
Ser Ser Ser Ser Met Lys Asn Met Leu Pro Arg Val Arg Thr Phe Val
225 230 235 240
Gly Phe Arg Pro Arg Leu Val Asn Ser Gly Asp Asp Leu Asn Glu Ala
245 250 255
Ser Asp Ile His Arg Lys Cys Thr Pro Gln Ala Asn Thr Ala Gly Lys
260 265 270
Gln Ala His Arg Arg Ser Glu Gly Tyr Lys Val Lys Lys Ile Asp Val
275 280 285
Ile Lys Arg Arg Thr Ala Pro Ile Arg Glu Ala Glu Ala Val Cys Gly
290 295 300
Val Met Leu Glu Asp Gly Ser Ser Cys Leu Glu Asp Pro Met Glu Gly
305 310 315 320
Arg Lys Arg Cys Glu Leu His Lys Gly Arg Arg Val Arg Val Ala Tyr
325 330 335
Ser Arg Lys Val Ser Ser Ser Ser Ser Thr Cys Gln Val Ala Ile Pro
340 345 350
Thr Val Glu Ser Ile Pro Gln Gln Thr Ala Asn Pro Ser Lys Arg Asp
355 360 365
Gln Ala Trp Gln Thr Ser Ala Asp Gln Ser Lys Asn Leu Ser Thr Asn
370 375 380
Ala Lys Glu Pro Ser Trp Gln Arg Asn Ser Phe Lys Ala Asn Glu Met
385 390 395 400
Lys Ile Gly Glu Ala Pro Thr Glu Asp Glu Ala Tyr Gly Thr Ser His
405 410 415
Ala Glu Ser Gln Phe His Glu Asp Glu Pro Cys Gly Arg Lys Trp Phe
420 425 430
Glu Arg Leu Lys Ala Gln Lys Ser Ala Asn Ala Pro Ser Ser Arg Gly
435 440 445
Gln Gly Cys Gln Pro Arg Glu Ala Asn Asn Asp Ala Ser Ala Leu Cys
450 455 460
Gly Val Val Thr Asp Asn Gly Tyr Cys Lys Leu Glu Pro Val Ile Gly
465 470 475 480
Arg Glu Arg Cys Glu Glu His Arg Gly Ile Glu Val Thr Gly Ala Ser
485 490 495
Ser Ala Pro Cys Ser Gly Arg Ser Val Leu Pro Ser Val Cys Gly Ala
500 505 510
Arg Ala Ser Asp Gly Ser Pro Cys Lys Asn Gln Pro Ile Ala Arg Arg
515 520 525
Lys Arg Cys Ala Leu His Lys Gly Gln Arg Ala Cys Cys Ala Ser Ala
530 535 540
Pro Ser Val Lys
545
<210> 3
<211> 1647
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 大麦突变体HENZ-2的HvHRT基因的编码序列
<400> 3
atgcctgcgg tcgccgctgc cagattgaag cgggaggact gcccccgcac caaacacgat 60
tccctcttct ccccatggaa ggttcttgtc gggccgtcgg actgggagga ccactccgcc 120
ggcaaggagg gggtccagag gtatcacaca cgcaacctcc cggacaactt ccctggcctc 180
tacgagctgg gcgttgcaag gccttcctat gatggtgtca gggctcgcag aaatcgatca 240
gttgtcgtcg tggtggtata cctcgggcag gccgataatg tcagggcgag gctccagcag 300
tacgggcgga cagggtcaca cctggacacc gggaatccgt tggctgctgt ctgtaaagct 360
gagatgaacg cgctcacggc aggacctgga ttgttcaggg aagtcttctc cagaggctac 420
tctatgatgt ttcgatgtgc gctgatgggt tccaaaaagg cagctgagaa gactgaaggt 480
cagctactgg gagtatttga ttatgcatgg aataaactgc agaatggtgc gtgtcgtcgc 540
gaagaaatac tgctcaagtt agaacaggga agcaatagat tatctttgct tagcagagtc 600
cggcacttaa aacagagggt gtttggagag aaagcaggta taaagattaa cagcagtggg 660
tctgttgaga tttcatctag cagtatgaaa aatatgcttc caagagtccg tacgtttgtc 720
ggcttcaggc ctcgtttggt taactctggc gacgatttaa acgaggcaag tgatattcac 780
cgaaaatgca cacctcaggc caatactgct ggtaaacaag cacatagaag gtctgaagga 840
tacaaggtga aaaagatcga tgttattaaa cggcgaactg caccgataag agaagccgaa 900
gctgtttgtg gagtaatgct agaagatggt tcttcttgtt tggaggatcc aatggaagga 960
aggaagaggt gtgagttgca caaaggtaga agagtcagag tggcatacag tcgcaaagta 1020
tcctcttcta gctccacttg ccaagttgct attccaactg ttgaatccat acctcaacaa 1080
actgctaatc caagcaaacg agatcaagcc tggcaaacca gtgcagacca atccaaaaat 1140
ctgtccacaa atgcaaagga gccatcttgg caaaggaaca gcttcaaagc aaatgagatg 1200
aaaatcggag aagctcctac agaagatgaa gcatatggaa cctcccatgc agaatctcag 1260
ttccacgaag atgagccttg tggaaggaag tgatttgagc ggctcaaagc acagaaatca 1320
gccaacgcac catcgtcgag aggccaagga tgtcagccaa gagaagcaaa caacgacgca 1380
tcagccttat gtggagtagt gacagataat ggatactgca aactggaacc ggtgatagga 1440
agggaaagat gcgaggagca cagaggaatt gaggtcactg gtgcgtcatc ggcaccatgt 1500
tccggaaggt cggtattgcc atctgtctgt ggagctcggg catccgatgg ttcaccttgc 1560
aagaatcagc caatcgcaag gaggaagaga tgtgcgttgc acaaaggtca aagagcgtgc 1620
tgcgcctccg cgccatcagt caaataa 1647
<210> 4
<211> 430
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 大麦突变体HENZ-2的突变体HvHRT的序列
<400> 4
Met Pro Ala Val Ala Ala Ala Arg Leu Lys Arg Glu Asp Cys Pro Arg
1 5 10 15
Thr Lys His Asp Ser Leu Phe Ser Pro Trp Lys Val Leu Val Gly Pro
20 25 30
Ser Asp Trp Glu Asp His Ser Ala Gly Lys Glu Gly Val Gln Arg Tyr
35 40 45
His Thr Arg Asn Leu Pro Asp Asn Phe Pro Gly Leu Tyr Glu Leu Gly
50 55 60
Val Ala Arg Pro Ser Tyr Asp Gly Val Arg Ala Arg Arg Asn Arg Ser
65 70 75 80
Val Val Val Val Val Val Tyr Leu Gly Gln Ala Asp Asn Val Arg Ala
85 90 95
Arg Leu Gln Gln Tyr Gly Arg Thr Gly Ser His Leu Asp Thr Gly Asn
100 105 110
Pro Leu Ala Ala Val Cys Lys Ala Glu Met Asn Ala Leu Thr Ala Gly
115 120 125
Pro Gly Leu Phe Arg Glu Val Phe Ser Arg Gly Tyr Ser Met Met Phe
130 135 140
Arg Cys Ala Leu Met Gly Ser Lys Lys Ala Ala Glu Lys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Gln Leu Leu Gly Val Phe Asp Tyr Ala Trp Asn Lys Leu Gln Asn Gly
165 170 175
Ala Cys Arg Arg Glu Glu Ile Leu Leu Lys Leu Glu Gln Gly Ser Asn
180 185 190
Arg Leu Ser Leu Leu Ser Arg Val Arg His Leu Lys Gln Arg Val Phe
195 200 205
Gly Glu Lys Ala Gly Ile Lys Ile Asn Ser Ser Gly Ser Val Glu Ile
210 215 220
Ser Ser Ser Ser Met Lys Asn Met Leu Pro Arg Val Arg Thr Phe Val
225 230 235 240
Gly Phe Arg Pro Arg Leu Val Asn Ser Gly Asp Asp Leu Asn Glu Ala
245 250 255
Ser Asp Ile His Arg Lys Cys Thr Pro Gln Ala Asn Thr Ala Gly Lys
260 265 270
Gln Ala His Arg Arg Ser Glu Gly Tyr Lys Val Lys Lys Ile Asp Val
275 280 285
Ile Lys Arg Arg Thr Ala Pro Ile Arg Glu Ala Glu Ala Val Cys Gly
290 295 300
Val Met Leu Glu Asp Gly Ser Ser Cys Leu Glu Asp Pro Met Glu Gly
305 310 315 320
Arg Lys Arg Cys Glu Leu His Lys Gly Arg Arg Val Arg Val Ala Tyr
325 330 335
Ser Arg Lys Val Ser Ser Ser Ser Ser Thr Cys Gln Val Ala Ile Pro
340 345 350
Thr Val Glu Ser Ile Pro Gln Gln Thr Ala Asn Pro Ser Lys Arg Asp
355 360 365
Gln Ala Trp Gln Thr Ser Ala Asp Gln Ser Lys Asn Leu Ser Thr Asn
370 375 380
Ala Lys Glu Pro Ser Trp Gln Arg Asn Ser Phe Lys Ala Asn Glu Met
385 390 395 400
Lys Ile Gly Glu Ala Pro Thr Glu Asp Glu Ala Tyr Gly Thr Ser His
405 410 415
Ala Glu Ser Gln Phe His Glu Asp Glu Pro Cys Gly Arg Lys
420 425 430
<210> 5
<211> 753
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 5
atggagcagg gggaggagga cggggactgg atgatggagc cggcgtcggg gaagaagggc 60
ggggtgatga tcgacaggaa gaagcgcttc agcgaggagc agatcaagtc gctcgagtcc 120
atgttcgcca cgcagaccaa gctggagccc cgccagaagc tgcagctggc ccgggagctc 180
ggcctgcagc cgcgccaggt cgccatctgg ttccagaaca agcgcgcgcg ctggaagtcc 240
aagcagctcg agcgccagta cgccgcgctc cgggacgact acgacgccct cctctccagc 300
tacgaccagc tcaagaagga caagcaagcg ctcgtcaacc agctggagaa gctagcagag 360
atgctgcggg agccgggcgg ggccaagtgc ggagataatg ccggcgctgc tgacagggac 420
aacatgcgcc tggccgtggc cggcatgagc atgaaggacg agttcgcgga cgctgccggg 480
gccagcaagc tctactcggc gtctgccgag ggctgcggcg gcagcggcaa gctctccctc 540
ttcggcgagg aggatgacga cgcgggcctc ttcctccggc cctcgctgca gctgccaacc 600
gcgcacgacg gcggcttcac ggcgtcgggg ccggccgagt accagcagca gtcgccgtcg 660
tcgttcccgt tccactcgag ctggccgtcg tccgcgacgg agcagacctg cagcagctcc 720
caatggtggg aattcgagtc cccgagcgag taa 753
<210> 6
<211> 250
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 6
Met Glu Gln Gly Glu Glu Asp Gly Asp Trp Met Met Glu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Gly Lys Lys Gly Gly Val Met Ile Asp Arg Lys Lys Arg Phe Ser Glu
20 25 30
Glu Gln Ile Lys Ser Leu Glu Ser Met Phe Ala Thr Gln Thr Lys Leu
35 40 45
Glu Pro Arg Gln Lys Leu Gln Leu Ala Arg Glu Leu Gly Leu Gln Pro
50 55 60
Arg Gln Val Ala Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Arg Trp Lys Ser
65 70 75 80
Lys Gln Leu Glu Arg Gln Tyr Ala Ala Leu Arg Asp Asp Tyr Asp Ala
85 90 95
Leu Leu Ser Ser Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Asp Lys Gln Ala Leu Val
100 105 110
Asn Gln Leu Glu Lys Leu Ala Glu Met Leu Arg Glu Pro Gly Gly Ala
115 120 125
Lys Cys Gly Asp Asn Ala Gly Ala Ala Asp Arg Asp Asn Met Arg Leu
130 135 140
Ala Val Ala Gly Met Ser Met Lys Asp Glu Phe Ala Asp Ala Ala Gly
145 150 155 160
Ala Ser Lys Leu Tyr Ser Ala Ser Ala Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Lys Leu Ser Leu Phe Gly Glu Glu Asp Asp Asp Ala Gly Leu Phe Leu
180 185 190
Arg Pro Ser Leu Gln Leu Pro Thr Ala His Asp Gly Gly Phe Thr Ala
195 200 205
Ser Gly Pro Ala Glu Tyr Gln Gln Gln Ser Pro Ser Ser Phe Pro Phe
210 215 220
His Ser Ser Trp Pro Ser Ser Ala Thr Glu Gln Thr Cys Ser Ser Ser
225 230 235 240
Gln Trp Trp Glu Phe Glu Ser Pro Ser Glu
245 250
<210> 7
<211> 1546
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 7
gagacgggag acccggctac gcatgcacgc caccgcgctc cattggccgc cccgttgcca 60
tcaccgcgcc catcgctcca tcccccgatt aaactactcc atatcgctag taagcagaag 120
cagaatcgat ccatcacacc aagctagcta gcctcctagc tcgctcgctc gcccgcacac 180
ccgcgatcca ttctgcttct tccccttcct tcccactccg gatcaggtgc atgaccaccg 240
gcgagaccta gctaggtagg tagggaggga gggagggatg gagcaggggg aggaggacgg 300
ggactggatg atggagccgg cgtcggggaa gaagggcggg gtgatgatcg acaggaagaa 360
gcgcttcagc gaggagcaga tcaagtcgct agagtccatg ttcgccacgc agaccaagct 420
ggagccccgc cagaagctgc agctggcccg ggagctcggc ctgcagccgc gccaggtcgc 480
catctggttc cagaacaagc gcgcgcgctg gaagtccaag cagctcgagc gccagtacgc 540
cgcgcttcgg gacgactacg acgccctcct ctccagctac gaccagctca agaaggacaa 600
gcaagcgctc gtcaaccagg tatatactcc tatgtctgtc tgtctgtgct acgtaccgtg 660
tgtttctccg tgctctccgc tcggtggcgt ggagctcgtg gtgcctctgg ctaatgcatg 720
gtcgacgggt ttcttgcctt gcgtgtccgt gcagctggag aagctagcag agatgctgcg 780
ggagccgggc ggggccaagt gcggagataa tgccggcgct gctgacaggg acgacgtgcg 840
cctggccgtg gccggcatga gcatgaagga cgagttcgcg gacgctgccg gggccagcaa 900
gctctactcg gcgtctgccg agggctgcgg cggcagcggc aagctctccc tcttcggcga 960
ggacgatgac gacgcgggcc tcttcctccg gccctcgctg cagctgccaa ccgcgcacga 1020
cggcggcttc acggcgtcgg ggccggccga gtaccagcag cagtcgccgt cgtcgttccc 1080
gttccactcg agctggccgt cgtccgcgac ggagcagacc tgcagcagct cccaatggtg 1140
ggaattcgag tccccgagcg agtaagtaga gccatcggtc aagcaccatg caaggaatcg 1200
ccgacgtgat cgaccatgca acagatcagt gttcctaaca cagagcacta tactgccgat 1260
cgaatccgtg gagaagacga cggcgcgatc gatcatatgc aaccgaagat ggtggtgtca 1320
agtgtgtaca tagctcgaaa cccaggtctg tccagtccag tacgtccagg cagcctcttc 1380
cttctcaatc agcagtcagc acgccatttt tcttcaccct cttcctcttt aagaatcact 1440
tgctcttgtc aattacctgc cacaccgtgt aatccacagg gaaactagtc acaaaaccaa 1500
attatagaga ccgatcttca gatgcaagtg catgcaacta tttagc 1546
<210> 8
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 大麦突变体HENZ-10的突变体HvHBL12基因的编码序列
<400> 8
atggagcagg gggaggagga cggggactgg atgatggagc cggcgtcggg gaagaagggc 60
ggggtgatga tcgacaggaa gaagcgcttc agcgaggagc agatcaagtc gctcgagtcc 120
atgttcgcca cgcagaccaa gctggagccc cgccagaagc tgcagctggc ccgggagctc 180
ggcctgcagc cgcgccaggt cgccatctgg ttccagaaca agcgcgcgcg ctggaagtcc 240
aagcagctcg agcgccagta cgccgcgctc cgggacgact acgacgccct cctctccagc 300
tacgaccagc tcaagaagga caagcaagcg ctcgtcaacc agctggagaa gctagcagag 360
atgctgcggg agccgggcgg ggccaagtgc ggagataatg ccggcgctgc tgacagggac 420
aacatgcgcc tggccgtggc cggcatgagc atgaaggacg agttcgcgga cgctgccggg 480
gccagcaagc tctactcggc gtctgccgag ggctgcggcg gcagcggcaa gctctccctc 540
ttcggcgagg aggatgacga cgcgggcctc ttcctccggc cctcgctgca gctgccaacc 600
gcgcacgacg gcggcttcac ggcgtcgggg ccggccgagt accagcagca gtcgccgtcg 660
tcgttcccgt tccactcgag ctgaccgtcg tccgcgacgg agcagacctg cagcagctcc 720
caatggtggg aattcgagtc cccgagcgag taa 753
<210> 9
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 大麦突变体HENZ-10的突变体HvHBL12基因的编码序列
<400> 9
Met Glu Gln Gly Glu Glu Asp Gly Asp Trp Met Met Glu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Gly Lys Lys Gly Gly Val Met Ile Asp Arg Lys Lys Arg Phe Ser Glu
20 25 30
Glu Gln Ile Lys Ser Leu Glu Ser Met Phe Ala Thr Gln Thr Lys Leu
35 40 45
Glu Pro Arg Gln Lys Leu Gln Leu Ala Arg Glu Leu Gly Leu Gln Pro
50 55 60
Arg Gln Val Ala Ile Trp Phe Gln Asn Lys Arg Ala Arg Trp Lys Ser
65 70 75 80
Lys Gln Leu Glu Arg Gln Tyr Ala Ala Leu Arg Asp Asp Tyr Asp Ala
85 90 95
Leu Leu Ser Ser Tyr Asp Gln Leu Lys Lys Asp Lys Gln Ala Leu Val
100 105 110
Asn Gln Leu Glu Lys Leu Ala Glu Met Leu Arg Glu Pro Gly Gly Ala
115 120 125
Lys Cys Gly Asp Asn Ala Gly Ala Ala Asp Arg Asp Asn Met Arg Leu
130 135 140
Ala Val Ala Gly Met Ser Met Lys Asp Glu Phe Ala Asp Ala Ala Gly
145 150 155 160
Ala Ser Lys Leu Tyr Ser Ala Ser Ala Glu Gly Cys Gly Gly Ser Gly
165 170 175
Lys Leu Ser Leu Phe Gly Glu Glu Asp Asp Asp Ala Gly Leu Phe Leu
180 185 190
Arg Pro Ser Leu Gln Leu Pro Thr Ala His Asp Gly Gly Phe Thr Ala
195 200 205
Ser Gly Pro Ala Glu Tyr Gln Gln Gln Ser Pro Ser Ser Phe Pro Phe
210 215 220
His Ser Ser
225
<210> 10
<211> 1062
<212> DNA
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 10
atggatccat ggatgggcag ccagccatcc ctgagcctcg acctgcacgt cggcctaccg 60
ccgatggggc acccgcacca ccaccagagc caataccagg cgccgccgat gatcgcgctg 120
gccaagccca agatcctcgt ggaggagaac ttcatgccac tcaagaagga ccctgaggtt 180
gcggttcttg agtcggagct acagcgggtg agcgaggaga accggcggct gggcgagatg 240
ctcagggagg tggcctccaa gtacgaggcc ctgcagggcc agttcaccga cgtggtcacg 300
gccggcggca acaacaacca ctaccacaac cagccgtcct ccgcgtcgga gggcgggtcg 360
gtgtcgccgt cgaggaagcg caagagcgag gagagcctcg gcacgccgcc accgtcgcat 420
actcagcagc agcactatgc cgccggcctc gcgtacgcgg tggcgccgga ccaggcggag 480
tgcacgtccg gcgagccgtg caagcgcatc cgggaggagt gcaagcccgt catctccaag 540
cgctacgtcc acgccgaccc ctccgacctc agcctggtgg tgaaggacgg gtaccaatgg 600
cgcaagtacg ggcagaaggt gaccaaggac aacccatgcc ccagagccta cttccggtgc 660
tccttcgccc ccggctgccc cgtcaagaag aaggtgcaga ggagcgccga ggacaagacc 720
atactcgtgg cgacgtacga gggcgagcac aaccacaccc agcccccgcc gtcgcagccg 780
cagcagcaga acgacggctc cggcgccggc aagaacgccg ggaacgggaa gccgccccag 840
gcgccggcca cgcctcacca cccgcagcag cagcacaagc aggaagcggc agcggtcgtc 900
gtcagcggcg aatcggccgc ggcggcgtcc gagctgatcc ggcgcaacct ggcggagcag 960
atggccatga cgctgacgag ggaccccagc ttcaaggcgg cgctggtcac cgcgctctcc 1020
ggccggatcc tcgagctctc gccgaccagg gacatcaatt aa 1062
<210> 11
<211> 353
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 11
Met Asp Pro Trp Met Gly Ser Gln Pro Ser Leu Ser Leu Asp Leu His
1 5 10 15
Val Gly Leu Pro Pro Met Gly His Pro His His His Gln Ser Gln Tyr
20 25 30
Gln Ala Pro Pro Met Ile Ala Leu Ala Lys Pro Lys Ile Leu Val Glu
35 40 45
Glu Asn Phe Met Pro Leu Lys Lys Asp Pro Glu Val Ala Val Leu Glu
50 55 60
Ser Glu Leu Gln Arg Val Ser Glu Glu Asn Arg Arg Leu Gly Glu Met
65 70 75 80
Leu Arg Glu Val Ala Ser Lys Tyr Glu Ala Leu Gln Gly Gln Phe Thr
85 90 95
Asp Val Val Thr Ala Gly Gly Asn Asn Asn His Tyr His Asn Gln Pro
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Glu Gly Gly Ser Val Ser Pro Ser Arg Lys Arg Lys
115 120 125
Ser Glu Glu Ser Leu Gly Thr Pro Pro Pro Ser His Thr Gln Gln Gln
130 135 140
His Tyr Ala Ala Gly Leu Ala Tyr Ala Val Ala Pro Asp Gln Ala Glu
145 150 155 160
Cys Thr Ser Gly Glu Pro Cys Lys Arg Ile Arg Glu Glu Cys Lys Pro
165 170 175
Val Ile Ser Lys Arg Tyr Val His Ala Asp Pro Ser Asp Leu Ser Leu
180 185 190
Val Val Lys Asp Gly Tyr Gln Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Thr
195 200 205
Lys Asp Asn Pro Cys Pro Arg Ala Tyr Phe Arg Cys Ser Phe Ala Pro
210 215 220
Gly Cys Pro Val Lys Lys Lys Val Gln Arg Ser Ala Glu Asp Lys Thr
225 230 235 240
Ile Leu Val Ala Thr Tyr Glu Gly Glu His Asn His Thr Gln Pro Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Asn Asp Gly Ser Gly Ala Gly Lys Asn
260 265 270
Ala Gly Asn Gly Lys Pro Pro Gln Ala Pro Ala Thr Pro His His Pro
275 280 285
Gln Gln Gln His Lys Gln Glu Ala Ala Ala Val Val Val Ser Gly Glu
290 295 300
Ser Ala Ala Ala Ala Ser Glu Leu Ile Arg Arg Asn Leu Ala Glu Gln
305 310 315 320
Met Ala Met Thr Leu Thr Arg Asp Pro Ser Phe Lys Ala Ala Leu Val
325 330 335
Thr Ala Leu Ser Gly Arg Ile Leu Glu Leu Ser Pro Thr Arg Asp Ile
340 345 350
Asn
<210> 12
<211> 353
<212> PRT
<213> 大麦（Hordeum vulgare）
<400> 12
Met Asp Pro Trp Met Gly Ser Gln Pro Ser Leu Ser Leu Asp Leu His
1 5 10 15
Val Gly Leu Pro Pro Met Gly His Pro His His His Gln Ser Gln Tyr
20 25 30
Gln Ala Pro Pro Met Ile Ala Leu Ala Lys Pro Lys Ile Leu Val Glu
35 40 45
Glu Asn Phe Met Pro Leu Lys Lys Asp Pro Glu Val Ala Val Leu Glu
50 55 60
Ser Glu Leu Gln Arg Val Ser Glu Glu Asn Arg Arg Leu Gly Glu Met
65 70 75 80
Leu Arg Glu Val Ala Ser Lys Tyr Glu Ala Leu Gln Gly Gln Phe Thr
85 90 95
Asp Met Val Thr Ala Gly Gly Asn Asn Asn His Tyr His Asn Gln Pro
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Glu Gly Gly Ser Val Ser Pro Ser Arg Lys Arg Lys
115 120 125
Ser Glu Glu Ser Leu Gly Thr Pro Pro Pro Ser His Thr Gln Gln Gln
130 135 140
His Tyr Ala Ala Gly Leu Ala Tyr Ala Val Ala Pro Asp Gln Ala Glu
145 150 155 160
Cys Thr Ser Gly Glu Pro Cys Lys Arg Ile Arg Glu Glu Cys Lys Pro
165 170 175
Val Ile Ser Lys Arg Tyr Val His Ala Asp Pro Ser Asp Leu Ser Leu
180 185 190
Val Val Lys Asp Gly Tyr Gln Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Val Thr
195 200 205
Lys Asp Asn Pro Cys Pro Arg Ala Tyr Phe Arg Cys Ser Phe Ala Pro
210 215 220
Gly Cys Pro Val Lys Lys Lys Val Gln Arg Ser Ala Glu Asp Lys Thr
225 230 235 240
Ile Leu Val Ala Thr Tyr Glu Gly Glu His Asn His Thr Gln Pro Pro
245 250 255
Pro Ser Gln Pro Gln Gln Gln Asn Asp Gly Ser Gly Ala Gly Lys Asn
260 265 270
Ala Gly Asn Gly Lys Pro Pro Gln Ala Pro Ala Thr Pro His His Pro
275 280 285
Gln Gln Gln His Lys Gln Glu Ala Ala Ala Val Val Val Ser Gly Glu
290 295 300
Ser Ala Ala Ala Ala Ser Glu Leu Ile Arg Arg Asn Leu Ala Glu Gln
305 310 315 320
Met Ala Met Thr Leu Thr Arg Asp Pro Ser Phe Lys Ala Ala Leu Val
325 330 335
Thr Ala Leu Ser Gly Arg Ile Leu Glu Leu Ser Pro Thr Arg Asp Ile
340 345 350
Asn
<210> 13
<211> 1062
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-50的突变体WRKY38基因的编码序列
<400> 13
atggatccat ggatgggcag ccagccatcc ctgagcctcg acctgcacgt cggcctaccg 60
ccgatggggc acccgcacca ccaccagagc caataccagg cgccgccgat gatcgcgctg 120
gccaagccca agatcctcgt ggaggagaac ttcatgccac tcaagaagga ccctgaggtt 180
gcggttcttg agtcggagct acagcgggtg agcgaggaga accggcggct gggcgagatg 240
ctcagggagg tggcctccaa gtacgaggcc ctgcagggcc agttcaccga cgtggtcacg 300
gccggcggca acaacaacca ctaccacaac cagccgtcct ccgcgtcgga gggcgggtcg 360
gtgtcgccgt cgaggaagcg caagagcgag gagagcctcg gcacgccgcc accgtcgcat 420
actcagcagc agcactatgc cgccggcctc gcgtacgcgg tggcgccgga ccaggcggag 480
tgcacgtccg gcgagccgtg caagcgcatc cgggaggagt gcaagcccgt catctccaag 540
cgctacgtcc acgccgaccc ctccgacctc agcctggtgg tgaaggacgg gtaccaatga 600
cgcaagtacg ggcagaaggt gaccaaggac aacccatgcc ccagagccta cttccggtgc 660
tccttcgccc ccggctgccc cgtcaagaag aaggtgcaga ggagcgccga ggacaagacc 720
atactcgtgg cgacgtacga gggcgagcac aaccacaccc agcccccgcc gtcgcagccg 780
cagcagcaga acgacggctc cggcgccggc aagaacgccg ggaacgggaa gccgccccag 840
gcgccggcca cgcctcacca cccgcagcag cagcacaagc aggaagcggc agcggtcgtc 900
gtcagcggcg aatcggccgc ggcggcgtcc gagctgatcc ggcgcaacct ggcggagcag 960
atggccatga cgctgacgag ggaccccagc ttcaaggcgg cgctggtcac cgcgctctcc 1020
ggccggatcc tcgagctctc gccgaccagg gacatcaatt aa 1062
<210> 14
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 来自大麦突变体HENZ-50的突变体WRKY38的蛋白序列
<400> 14
Met Asp Pro Trp Met Gly Ser Gln Pro Ser Leu Ser Leu Asp Leu His
1 5 10 15
Val Gly Leu Pro Pro Met Gly His Pro His His His Gln Ser Gln Tyr
20 25 30
Gln Ala Pro Pro Met Ile Ala Leu Ala Lys Pro Lys Ile Leu Val Glu
35 40 45
Glu Asn Phe Met Pro Leu Lys Lys Asp Pro Glu Val Ala Val Leu Glu
50 55 60
Ser Glu Leu Gln Arg Val Ser Glu Glu Asn Arg Arg Leu Gly Glu Met
65 70 75 80
Leu Arg Glu Val Ala Ser Lys Tyr Glu Ala Leu Gln Gly Gln Phe Thr
85 90 95
Asp Val Val Thr Ala Gly Gly Asn Asn Asn His Tyr His Asn Gln Pro
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Glu Gly Gly Ser Val Ser Pro Ser Arg Lys Arg Lys
115 120 125
Ser Glu Glu Ser Leu Gly Thr Pro Pro Pro Ser His Thr Gln Gln Gln
130 135 140
His Tyr Ala Ala Gly Leu Ala Tyr Ala Val Ala Pro Asp Gln Ala Glu
145 150 155 160
Cys Thr Ser Gly Glu Pro Cys Lys Arg Ile Arg Glu Glu Cys Lys Pro
165 170 175
Val Ile Ser Lys Arg Tyr Val His Ala Asp Pro Ser Asp Leu Ser Leu
180 185 190
Val Val Lys Asp Gly Tyr Gln
195
<210> 15
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 15
cacgaagatg agccttg 17
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 16
ttggctgatt tctgtgc 17
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 17
aagtgatttg agcggct 17
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 18
aggaagtggt ttgagcg 17
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 19
gtcgtcgttc ccgtt 15
<210> 20
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 20
ctgcaggtct gctcc 15
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 21
actcgagctg accgt 15
<210> 22
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 22
ctcgagctgg ccgt 14
<210> 23
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 23
ctcagcctgg tggtg 15
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 24
tgtccttggt caccttc 17
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 25
ccaatgacgc aagtacg 17
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 26
taccaatggc gcaagta 17
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 27
aaacagaggt tgaggataac 20
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 引物
<400> 28
gccttcgcct tccat 15
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 29
aggcaccgat caatacg 17
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 探针
<400> 30
aaggcaccgg tcaatac 17
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 非标准串联重复W-盒
<400> 31
tgacggtcgt attgacc 17
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 非标准串联重复W-盒
<400> 32
tgacagtggt attggcc 17
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 非标准串联重复W-盒
<400> 33
tgacagtggt actggcc 17
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 非标准串联重复W-盒
<400> 34
gtgacagtgg tattggcc 18
<210> 35
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 非标准串联重复W-盒
<400> 35
tgacggtcgt attgatc 17
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 非标准串联重复W-盒
<400> 36
tgaccgtcgt attgatc 17
<210> 37
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 非标准串联重复W-盒
<400> 37
ttgacttgat c 11
<210> 38
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> C或无核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<400> 38
tgacnnttga cc 12
<210> 39
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> G或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X(n), 其中X可以是C或T, n是0或1
<400> 39
tgacnnntgr cc 12
<210> 40
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> G或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<400> 40
tgacnnttga cc 12
<210> 41
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> G或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<400> 41
tgacnnttga c 11
<210> 42
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> X= C或无核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> C或T
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> G或A
<400> 42
tgacnnntgn cc 12
<210> 43
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> C或无核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> G或A
<400> 43
tgacnnctgn cc 12
<210> 44
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> C或无核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> C或T
<400> 44
tgacnnntgg cc 12
<210> 45
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> C或无核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<400> 45
tgacnnctga cc 12
<210> 46
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> C或无核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<400> 46
tgacnnttgg cc 12
<210> 47
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> W-盒
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> C或无核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X(n), 其中X可以是任何核苷酸并且n是介于0-20的整数
<400> 47
tgacnnttga tc 12
<210> 48
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> (Amy6-4)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> (Amy6-4)
<400> 48
taactgacgg tcgtattgac cggtgccttc ttatggaagg cgaaggctgc ctc 53
<210> 49
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> amy1_1a
<400> 49
taactgacgg tcgtattgac cggtgccttc ttatggaagg cgaaggctgc ctc 53
<210> 50
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1b
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> amy1_1b
<400> 50
taactgacgg tcgtattgac cggtgccttc ttatggaagg cgaaggctgc ctc 53
<210> 51
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1c
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> amy1_1c
<400> 51
taactgacgg tcgtattgac cagtgccttc ttatggaagg cgaaggctgc ctc 53
<210> 52
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Amy46
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> Amy46
<400> 52
taactgacag tcgtactggc cggtgcctt 29
<210> 53
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> amy1_2
<400> 53
taagtgacag tggtattggc cggtgcctt 29
<210> 54
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Amy6-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> Amy6-4
<400> 54
catctacatc acttgggcat tgaatcgcct tttgagctca ccgtaccggc cga 53
<210> 55
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> amy1_1a
<400> 55
catctacatc acttgggcat tgaatcgcct tttgagctca ccgtaccggc cga 53
<210> 56
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1b
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> amy1_1b
<400> 56
catctacatc acttgggcat tgaatcgcct tttgagctca ccgtaccggc cga 53
<210> 57
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1c
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> amy1_1c
<400> 57
catctccatc acttgggcat tgaatcgcct tttgagctca ccgcaccggc cga 53
<210> 58
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Amy46
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> Amy46
<400> 58
cttgtcgaag gctggatcca tcagtcgcct tttgagctca ccgcaccggc cga 53
<210> 59
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(53)
<223> amy1_2
<400> 59
ctcatcgaag ccggtgctca tcattcgcct tttgagctca ccgcaccggc cga 53
<210> 60
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Amy6-4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> Amy6-4
<400> 60
taacaaactc cggccgacat atccactgg 29
<210> 61
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1a
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> amy1_1a
<400> 61
taacaaactc cggccgacat atccactgg 29
<210> 62
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1b
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> amy1_1b
<400> 62
taacaaactc cggccgacat atccactgg 29
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1c
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> amy1_1c
<400> 63
taacaaactc cggccaacat atccactgg 29
<210> 64
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Amy46
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> Amy46
<400> 64
taacaaactc cggccgacat atccatcga 29
<210> 65
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> amy1_2
<400> 65
taacaaactc cggccgacat atccatcga 29
<210> 66
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2_1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(42)
<223> amy2_1
<400> 66
ggaatttgtg ccggcccgga ttgacttgac catcatctgt tg 42
<210> 67
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<223> amy2_2
<400> 67
ggaggctgtg ccaacccagc ttgacttgac catcaccagt tac 43
<210> 68
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(48)
<223> amy2_3
<400> 68
ggaacttgtg ccaccccgga ttgacttgac cgtcatcggc tccggatg 48
<210> 69
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2_1
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> amy2_1
<400> 69
caccttttct cgtaacagag tctggtatcc atgcag 36
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2_2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> amy2_2
<400> 70
tccatttttc cataacagag gccggtaccc atgcat 36
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2_3
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(36)
<223> amy2_3
<400> 71
caccttttat cgtaacagag tccggtatcc atgcag 36
<210> 72
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1_1簇
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> amy1_1
<400> 72
ctgacggtcg tattgatc 18
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-53靶特异性正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> HENZ-53
<400> 73
gtcagctact gggagtatt 19
<210> 74
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-53靶特异性反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> HENZ-53 Rev 引物
<400> 74
tcttcgcgac gacac 15
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-53突变体特异性探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> HENZ-53突变体特异性探针
<400> 75
tgcatgaaat aaactgcaga 20
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-53参考特异性检测探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> HENZ-53参考特异性检测探针
<400> 76
tgcatggaat aaactgcag 19
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-54靶特异性正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> HENZ-54靶特异性正向引物
<400> 77
tgctaatcca agcaaacg 18
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-54靶特异性反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> HENZ-54靶特异性反向引物
<400> 78
tttgtggaca gatttttgga 20
<210> 79
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-54突变体特异性检测探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> HENZ-54参考特异性检测探针
<400> 79
agcctgacaa accagtg 17
<210> 80
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> HENZ-54参考特异性检测探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> HENZ-54参考特异性检测探针
<400> 80
aagcctggca aaccag 16
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1-1正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 引物
<400> 81
gactggggcc tgaag 15
<210> 82
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1-1反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(15)
<223> 引物
<400> 82
gtgccgggtc ctgac 15
<210> 83
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1-1 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 探针
<400> 83
agatcgatcg cctggtgtc 19
<210> 84
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1-2正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 引物
<400> 84
agatcgatcg tctggtg 17
<210> 85
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy-1-2反向序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 引物
<400> 85
tccatgatct gcagcttg 18
<210> 86
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy1-2 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> 探针
<400> 86
tcaatcagga cccgacagg 19
<210> 87
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 引物
<400> 87
cgagctcaag gagtgg 16
<210> 88
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> 引物
<400> 88
cgtcgatgta caccttg 17
<210> 89
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> amy2 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 探针
<400> 89
aagagcgacc tcggcttc 18
<210> 90
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Bgl2正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 引物
<400> 90
taccagaacc tgttcgac 18
<210> 91
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Bgl2反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> 引物
<400> 91
acaccaccag cttcac 16
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> Bgl2 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 探针
<400> 92
accgtggacg ccttctac 18
<210> 93
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> LD正向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 引物
<400> 93
cttcgatggg gtttgaac 18
<210> 94
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> LD反向引物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 引物
<400> 94
ccgatttcct caccaaag 18
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> LD 探针
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> 探针
<400> 95
cctgtgcagg tgaattcatc a 21

Claims (38)

1.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
i.从一种大麦植物的麦粒和/或麦芽制备水性提取物或从所述大麦植物的部分制备水性提取物，其中所述大麦植物的HvHRT基因是编码突变体HvHRT蛋白的突变体HvHRT基因，其中存在于所述突变体HvHRT蛋白中的突变是SEQ ID NO：2的W431终止突变，并且其中所述大麦植物包含编码SEQ ID NO：4的多肽的突变体HvHRT基因；和
ii.将所述水性提取物加工为饮料。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述突变体HvHRT基因中的突变是SEQ ID NO：1的HvHRT编码序列的核苷酸1293的G→A突变。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物包含突变体HvHRT基因，其编码序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少16U/g的α-淀粉酶活性。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少140U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物的至少一部分壳在发芽开始前已除去。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少140U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物是无壳的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少150U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物的至少一部分壳在发芽开始前已除去。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少150U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物是无壳的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少160U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物的至少一部分壳在发芽开始前已除去。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少160U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物是无壳的。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少170U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物的至少一部分壳在发芽开始前已除去。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时具有至少170U/G的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物是无壳的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少30mU/g，其中所述大麦植物的至少一部分壳已被除去。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少30mU/g，其中所述大麦植物是无壳的。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少35mU/g，其中所述大麦植物的至少一部分壳已被除去。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少35mU/g，其中所述大麦植物是无壳的。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少40mU/g，其中所述大麦植物的至少一部分壳已被除去。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述大麦植物在发芽开始后48小时的极限糊精酶为至少40mU/g，其中所述大麦植物是无壳的。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在发芽开始后48小时，所述大麦植物具有至少100U/g的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物在发芽开始前已除去至少部分壳。
20.根据权利要求1所述的方法，其中在发芽开始后48小时，所述大麦植物具有至少100U/g的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物是无壳的。
21.根据权利要求1所述的方法，其中在发芽开始后48小时，所述大麦植物具有至少110U/g的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物在发芽开始前已除去至少部分壳。
22.根据权利要求1所述的方法，其中在发芽开始后48小时，所述大麦植物具有至少110U/g的α-淀粉酶活性，其中所述大麦植物是无壳的。
23.根据权利要求1所述的方法，其中在发芽开始后48小时，所述大麦植物具有至少20mU/g的极限糊精酶，其中所述大麦植物是无壳的。
24.根据权利要求1所述的方法，其中在发芽开始后48小时，所述大麦植物具有至少20mU/g的极限糊精酶，其中所述大麦植物在所述发芽开始前已除去至少部分壳。
25.一种制备窑烧干燥麦芽的方法，所述方法包括以下步骤
(i)提供根据权利要求1至24中任一项所述的方法中定义的大麦植物的麦粒；
(ii)浸泡所述麦粒；
(iii)在预定条件下使浸泡的麦粒发芽；
(iv)干燥所述发芽的麦粒。
26.一种生产水性提取物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供根据权利要求1至24中任一项所述的方法中定义的大麦植物的谷粒；
b.使大麦谷粒进行发芽步骤，从而获得发芽的谷粒，其中所述发芽步骤包括在水溶液中温育所述谷粒，直到谷粒的含水量至少为30％，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少2LO2通过所述水溶液；
c.精细分割所述发芽的谷粒，同时所述发芽的谷粒具有至少20％的含水量，其中所述大麦谷粒在步骤b)和c)之间的任何时间不具有低于20％的含水量；
d.制备所述精细分割的发芽的谷粒的水性提取物，
从而产生大麦的水性提取物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在整个发芽步骤中将大麦的谷粒浸没在水溶液中。
28.根据权利要求26所述的方法，其中发芽步骤包括
i.至少一个在水溶液中温育所述谷粒的步骤，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少2LO2通过所述水溶液；以及
ii.至少一个在空气中温育所述大麦谷粒的步骤。
29.根据权利要求26所述的方法，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少3L的O2通过所述水溶液。
30.根据权利要求26所述的方法，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少4L的O2通过所述水溶液。
31.根据权利要求26所述的方法，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少5L的O2通过所述水溶液。
32.根据权利要求26所述的方法，其中每小时每kg干重大麦谷粒有至少6L的O2通过所述水溶液。
33.根据权利要求26所述的方法，其中所述O2包含在气体混合物中，其中该气体混合物是大气空气。
34.根据权利要求26所述的方法，其中整个发芽步骤不超过72h。
35.根据权利要求26所述的方法，其中整个发芽步骤不超过60h。
36.根据权利要求26所述的方法，其中整个发芽步骤不超过54h。
37.根据权利要求26至36中任一项所述的方法，其中大麦是去壳大麦，并且该方法包括在水溶液中温育所述谷粒之前去除至少部分所述壳的步骤。
38.一种生产饮料的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)通过根据权利要求26至37中任一项所述的方法制备水性提取物；
(ii)将所述提取物加工成饮料。
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