JP2007061017A

JP2007061017A - 麦芽飲料老化臭原因遺伝子及びその利用

Info

Publication number: JP2007061017A
Application number: JP2005252329A
Authority: JP
Inventors: Kazuyoshi Takeda; 和義武田; Kazuhiro Sato; 和広佐藤; Hisao Kuroda; 久夫黒田
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd; Okayama University NUC
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd; Okayama University NUC
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2005-08-31
Publication date: 2007-03-15
Also published as: WO2007026698A1

Abstract

【課題】本発明は、老化臭が低減された麦芽飲料を製造するための麦芽を生産するのに有用な麦芽飲料老化臭原因遺伝子、及びその利用を提供する。
【解決手段】本発明にかかる麦芽飲料老化臭原因遺伝子は、９−／１３−ＰＨＬタンパク質をコードする遺伝子である。それゆえ、当該遺伝子の発現抑制や、当該遺伝子への変異導入がなされた植物においては、９−／１３−ＰＨＬタンパク質の発現量を低下させたり、９−／１３−ＰＨＬタンパク質の活性を低下させたりすることができる。それゆえ、そのような上記植物として、オオムギを用いれば、９−／１３−ＰＨＬ活性の低い麦芽を提供することができる。このような麦芽は、老化臭が低減された麦芽飲料の製造に用いることができる。
【選択図】なし

Description

本発明は、麦芽飲料老化臭原因遺伝子及びその利用に関するものであって、特に、オオムギ麦芽中のリノール酸から２（Ｅ）−ノネナールへの変換に関与する遺伝子及びその利用に関するものである。

ビール、発泡酒などの麦芽飲料の原料として利用される麦芽には、多量の脂質及び脂肪酸が含まれている。これら脂質及び脂肪酸は、麦芽発泡飲料を製造する工程のうちの仕込工程において、酵素リポキシゲナーゼ又は自動酸化により酸化される。その結果、脂質ヒドロペルオキシド及び脂肪酸ヒドロペルオキシドが生成される（非特許文献１を参照）。また、上記脂質ヒドロペルオキシドは、麦芽に含まれるリパーゼにより加水分解を受け、脂肪酸ヒドロペルオキシドとなる。

上記のように生成された脂肪酸ヒドロペルオキシドは、熱分解又は化学的分解により、老化臭、青臭み、脂肪酸臭などを有するアルデヒド類といった分解生成物を生じる。これら分解生成物は、麦芽飲料（製品）の香味を著しく損なう要因となることが知られている（非特許文献２を参照）。例えば、閾値の低いアルデヒドとして知られる２（Ｅ）−ノネナール（「トランス−２−ノネナール」ともいう）は、ビールの保存中に生成するカードボード臭の原因物質であると考えられている。

そこで、このような分解生成物の生成を抑える技術の開発が求められ、これまでにいくつかの方法が提案されている。具体的な方法としては、麦芽飲料の製造工程において仕込温度を上げてリポキシゲナーゼ活性を抑制する方法や、リポキシゲナーゼ活性の低い麦芽を用いる方法、例えば、高温で処理しリポキシゲナーゼを失活させた麦芽を用いる方法や酵素活性が低下した変異型リポキシゲナーゼ−１を有するオオムギ植物由来の麦芽を用いる方法などが挙げられる（特許文献１、非特許文献３を参照）。

ところで、本発明者らは、これまでに、麦芽中において、９−リノール酸ヒドロペルオキシドを２（Ｅ）−ノネナールに変換する活性を発見し、本活性がビール老化に影響しうることを見出している（非特許文献４を参照）。

さらに、この活性は酵素であり、双子葉植物で明らかにされた脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ（以下、「ＨＰＬ」ともいう）と非常に良く似た性質を有することを明らかにしている（特許文献２を参照）。すなわち、上述した脂肪酸ヒドロペルオキシドの分解を触媒するＨＰＬが麦芽中に存在することを見出している。
特開２００４−５２２４３４号公報（平成１６（２００４）年７月２９日公開）特開２００４−１６２０２号公報（平成１６（２００４）年１月２２日公開） Kobayashi, N., Kaneda, H., Kano, Y., and Koshino, S., J. Ferment. Bioeng., 76, 371-375 , 1993 Drost, B. W., van Eerde, P., Hoekstra, S. F., and Strating, J., Proc. of the 13th Congress, Estoril, Portugal ,1971 Drost, B. W., van den Berg, R., Freijee, F. J.M., van der Velde, E. G., and Hollemans, M., J. Am. Soc. Brew. Chem., 48, 124-131, 1990 Kuroda, H., Furusho, S., Maeba, H., and Takashio, M., Characterization of factors involved in the production of 2(E)-nonenal during mashing. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:691-697 (2003) Kobayashi, N., Kaneda, H., Kano, Y., and Koshino, S., J. Am. Soc. Brew. Chem., 52(4): 141-5, 1994 黒田久夫ほか、イネ9-脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ遺伝子の同定と機能解析：日本分子生物学会２００４年会要旨集（ポスター 1a 遺伝子・核酸3PA-056）、２００４年

非特許文献３に示すような仕込温度を上げる方法では、タンパク質分解酵素や糖化酵素の作用も抑制される。そのため、発酵に必要な栄養源が不足し、香味品質が損なわれるという問題がある。つまり、このような方法では、香味品質を損なうことなく、老化臭を抑制するには限界がある。

また、麦芽を高温で処理し、リポキシゲナーゼを失活させた麦芽を用いる方法では、香味バランスが崩れたり、香味品質に悪影響を与えたりするという問題がある。すなわち、このような方法も、上記方法と同様に、香味品質を損なうことなく、老化臭を抑制する方法として十分なものではない。

また、特許文献１に開示される酵素活性が低下した変異型リポキシゲナーゼ−１を有するオオムギ植物由来の麦芽を用いる方法では、保存中のビールにおける２（Ｅ）−ノネナールの生成を抑制する効果は見られるものの、老化臭抑制の観点からは改善できる余地を残している。

そもそも、上述したように、麦芽に含まれる脂質ヒドロペルオキシドは、もろみ中のリパーゼにより脂肪酸ヒドロペルオキシドに加水分解される。つまり、リポキシゲナーゼが関与することなく、脂質ヒドロペルオキシドからアルデヒド類などの分解生成物が生成されてしまう。したがって、上記の方法のようなリポキシゲナーゼ単独の抑制による老化臭の抑制及び香味品質の改善には限界がある（非特許文献５を参照）。

一方、麦芽中に含まれるＨＰＬは、麦芽飲料の製造工程において、もろみを製造する時に脂肪酸ヒドロペルオキシドを分解・開裂し、分解生成物を生成する。そのため、ＨＰＬ活性の低い麦芽を原料として利用することにより、分解生成物（老化物質）の生成が効果的に抑制され、より香味品質のよい麦芽飲料を製造できる可能性がある（特許文献２を参照）。

このようなＨＰＬ活性の低い麦芽を生産する方法としては、上記のような問題は抱えるが、麦芽を高温で処理しＨＰＬ活性を失活させる方法が考えられる。しかし、ＨＰＬは高い熱安定性を示すため、そのような方法を用いることをできない（特許文献１を参照）。

そこで、ＨＰＬ活性の低い麦芽を生産する方法として、ＨＰＬ活性の低いオオムギを原料として麦芽を生産する方法が有効な方法の１つとして考えられる。そのようなＨＰＬ活性の低いオオムギを生産する方法としては、従来の交配による品種改良法や、分子生物学的手法、例えば、遺伝子組み換え技術を用いた品種改良法が考えられる。交配による方法は、長い年月がかかるうえ、所望の表現型を示す品種が得られない可能性もある。それに対して、分子生物学的手法を用いる場合、標的となる遺伝子、この場合、ＨＰＬ遺伝子が同定されていれば、比較的容易に所望の表現型を示す品種を作製することができる。

しかしながら、オオムギでは、これまでに、９−リノール酸ヒドロペルオキシドの分解を触媒する、すなわちビールの老化臭の原因物質の生成に関与するＨＰＬの遺伝子は単離されていない。そのため、分子生物学的手法を用いて、上述したようなＨＰＬ活性の低いオオムギを生産することができない。

そこで、オオムギにおいて、９−リノール酸ヒドロペルオキシドの分解を触媒するＨＰＬ遺伝子のように、麦芽飲料の老化臭の原因物質の生成に関与する遺伝子を同定することが求められていた。

本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、老化臭が低減された麦芽飲料を製造するための麦芽を生産するのに有用な麦芽飲料老化臭原因遺伝子、及びその利用を提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、老化臭が低減された麦芽飲料を製造するための麦芽を生産するのに有用な麦芽飲料老化臭原因遺伝子として、９−リノール酸ヒドロペルオキシドの分解を触媒するＨＰＬ遺伝子、すなわち９−／１３−ＨＰＬ遺伝子を、オオムギから初めて単離することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明にかかる遺伝子は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質をコードすることを特徴としている。

（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。

（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性を有するタンパク質。

また、上記遺伝子は、配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有することが好ましい。

さらに、上記遺伝子は、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴としている。

本発明にかかるタンパク質は、上記の本発明にかかる遺伝子にコードされることを特徴としている。

また、上記タンパク質は、以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質であることを特徴としている。

本発明にかかる改変型タンパク質は、上記タンパク質のアミノ酸配列に変異が導入されることによって、９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性が欠損している、又は比活性が減少していることを特徴としている。

さらに、本発明にかかる遺伝子には、上記改変型タンパク質をコードする遺伝子も含まれる。

本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記の本発明にかかる遺伝子を含むことを特徴としている。

また、本発明にかかる形質転換体は、上記の本発明にかかる遺伝子、又は上記組換え発現ベクターを導入してなることを特徴としている。

本発明にかかる植物は、上記改変型タンパク質を含むことを特徴としている。

本発明にかかる飲料の製造方法は、上記形質転換体、又は上記植物を用いることを特徴としている。

上記飲料は、麦芽飲料であることが好ましい。

また、本発明の飲料は、上記の飲料の製造方法を含む方法で製造されることを特徴としている。

以上のように、本発明にかかる遺伝子は、９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性を有するタンパク質をコードしている。それゆえ、当該遺伝子の発現が抑制された形質転換体や、当該遺伝子に変異をもつ変異株を生産することにより、９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性が低い品種を作出することができるという効果を奏する。また、上記のように品種改良されたオオムギを麦芽原料として用いることによって、老化臭が少なく、また、保存中にも老化臭が発生しにくい、すなわち老化が起こりにくい麦芽飲料を製造できるという効果を奏する。

＜１．本発明の背景＞
まず、本発明を完成させるに至るまでの背景について説明する。

ＨＰＬは、シトクロームＰ４５０の１種で植物界に広く存在する。また、双子葉植物においては、ＨＰＬには２つのタイプがあることが知られている。具体的には、１３位にヒドロペルオキシドを有する脂肪酸を分解するＣＹＰ７４Ｂ（以下、「１３−ＨＰＬ」ともいう）と、９位又は１３位にヒドロペルオキシドを有する脂肪酸を分解するＣＹＰ７４Ｃ（以下、「９−／１３−ＨＰＬ」ともいう）とが存在する（図１を参照）。これらのうち、９−／１３−ＨＰＬは、リノール酸９−ヒドロペルオキシド（以下、「９−ＨＰＯＤ」ともいう）を分解し、２（Ｅ）−ノネナールを生成する反応を触媒する。

すなわち、上述のビールの老化臭の原因物質となる２（Ｅ）−ノネナールの生成に関与するＨＰＬは、「９−／１３−ＨＰＬ」である（図２を参照）。

しかし、上記２つのタイプのＨＰＬのうち、１３−ＨＰＯＤは、オオムギにおいて、そのｃＤＮＡ（「ＨｖＨＰＬ」と呼ばれる）が同定されているものの、９−／１３−ＨＰＬは同定されていなかった。

一方、本発明者らは、最近、ｉｎｓｉｌｉｃｏスクリーニングにより、単子葉植物では初めて、イネからＣＹＰ７４Ｃ（「ＯｓＨＰＬ１」、「ＯｓＨＰＬ２」と命名）を単離した（非特許文献６を参照）。ＯｓＨＰＬ１及びＯｓＨＰＬ２は、これらと同じＣＹＰ７４ファミリーに属するアレンオキシド合成酵素（以下、「ＡＯＳ」ともいう。なお、ＡＯＳは、ＣＹＰ７４Ａである）と構造上、非常に似ていた。そのため、ＯｓＨＰＬ１及びＯｓＨＰＬ２は、ＡＯＳと誤ってアノテーションされていた。つまり、本発明者らは、イネでは１７万クローン以上もの完全長ｃＤＮＡが解析されていたにも関わらず、同定されることがなかったＣＹＰ７４Ｃの候補を抽出し、初めて同定することに成功した。

上述のように、ＨＰＬは、ＣＹＰ７４ファミリーのメンバーであるが、ＣＹＰ７４ファミリーには、ＨＰＬ以外に、アレンオキシド合成酵素（以下、「ＡＯＳ」ともいう；なお、ＡＯＳはＣＹＰ７４Ａである）、ジビニルエーテル合成酵素（以下、「ＤＥＳ」ともいう。なお；ＤＥＳはＣＹＰ７４Ｄである）などが含まれる（図１を参照）。つまり、ＣＹＰ７４ファミリーには、異なる酵素活性を有するタンパク質が複数含まれている。したがって、ＯｓＨＰＬ１及びＯｓＨＰＬ２を同定した経緯からも明らかなように、ＣＹＰ７４ファミリーに属する可能性があるタンパク質が新規に見出されたとしても、そのタンパク質の一次構造、すなわち、アミノ酸配列から、そのタンパク質が有する活性を推定することは困難である(非特許文献６を参照)。つまり、ＣＹＰ７４ファミリーに属することまでは比較的容易に導き出せたとしても、ＣＹＰ７４ファミリーの中の具体的にどの酵素であるかを証明することは非常に困難である。また、現在の技術では、ＣＹＰ７４ＡとＣＹＰ７４Ｃの活性の差異を構造やモチーフから推定することはできない。

このような状況下において、本発明者らは、後述の実施例に示すように、オオムギ由来のＣＹＰ７４Ｃ遺伝子を単離・同定することに成功し、本発明を完成させるに至った。

本発明の実施形態について、以下、詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。

＜２．本発明にかかる遺伝子＞
本発明にかかる遺伝子は、麦芽飲料老化臭原因遺伝子であって、具体的には、９−／１３−ＨＰＬ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である。

本発明にかかる遺伝子の具体的な例としては、「（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質」をコードする遺伝子が挙げられる。

上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、オオムギから９−／１３−ＨＰＬ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、すなわちＣＹＰ７４Ｃとして、単離・同定されたものである。当該遺伝子を以後「ＨｖＨＰＬ２遺伝子」と称する。

このＨｖＨＰＬ２遺伝子のｃＤＮＡは、配列番号３に示すように、１６６５塩基対（約１．６ｋｂｐ）のサイズを有しており、１４０番目から１４２番目の塩基配列が開始コドン（ＡＴＧ）であり、１６１３番目から１６１５番目の塩基配列が終止コドン（ＴＧＡ）である。したがって、上記ＨｖＨＰＬ遺伝子は、配列番号３に示す塩基配列のうち、１４０番目から１６１５番目までの塩基配列をオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）として有しており、このＯＲＦは、１４７６塩基対（約１．５ｋｂｐ）のサイズを有している。ＨｖＨＰＬ２遺伝子のｃＤＮＡのうち、ＯＲＦ領域を表す塩基配列を配列番号２に示す。

また、本発明にかかる遺伝子として、「（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ９−／１３−ＨＰＬ活性を有するタンパク質」をコードする遺伝子が挙げられる。

本明細書において、「１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により置換、欠失、挿入、及び／又は付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、さらに好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されることを意味する。このように、上記（ｂ）のタンパク質は、上記（ａ）のタンパク質の変異タンパク質であるといえる。なお、ここでいう「変異」は、主として公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異タンパク質を単離精製したものであってもよい。

さらに、本発明にかかる遺伝子として、配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ９−／１３−ＨＰＬ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。

上記「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ」するとは、少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が配列間に存在するときにのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」の具体的な例として、例えば、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄する条件を挙げることができる。また、上記ハイブリダイゼーションは、J.Sambrook et al. Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory（1989）に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができ、特に限定されるものではない。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなる（すなわち、ハイブリダイズし難くなる）。

また、本発明にかかる遺伝子には、それ自体によって、成熟タンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；成熟したタンパク質のコード配列及びさらなる配列（例えば、リーダー配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列又はプロタンパク質配列又はプレプロタンパク質配列）；イントロン、非コード５’配列及び非コード３’配列（例えば、転写、ｍＲＮＡプロセシング（スプライシング及びポリアデニル化シグナルを含む）において役割を担う転写非翻訳配列）；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。

さらに、本発明には、本発明にかかる遺伝子の変異体も含まれる。このような変異体は、上述したように、１又は数個のヌクレオチド置換、欠失、又は付加によって生成される変異体を含む。置換、欠失、又は付加は、１つ以上のヌクレオチドを含み得る。変異体は、コード若しくは非コード領域、又はその両方において変化され得る。コード領域における変異は、保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、又は付加を生成し得る。

また、上記変異体には、上記（ａ）および（ｂ）タンパク質の改変型タンパク質をコードする遺伝子も含まれる。改変型タンパク質については、後述するので、ここでは、詳細については述べないが、上記（ａ）および（ｂ）タンパク質の比活性よりも低い比活性しか有さない（例えば、ｋ_ｃａｔが低い、Ｋ_ｍ値が高いなど）、又は当該活性を全く有さないタンパク質であることが好ましい。

なお、本明細書において、特に断らない限り、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴは、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンの各塩基を示す。また、アミノ酸及びアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＢの定める１文字表記又は３文字表記を使用する。

また、本明細書において、「遺伝子」との用語は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」又は「核酸分子」と交換可能に使用される。「ポリヌクレオチド」はヌクレオチドの重合体を意味する。したがって、本明細書での用語「遺伝子」には、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡ（ｍＲＮＡ等）を包含する。アンチセンス鎖は、プローブとして又はアンチセンス薬剤として利用できる。

「ＤＮＡ」には、例えばクローニングや化学合成技術、又はそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡ等が含まれる。すなわち、ＤＮＡとは、動物のゲノム中に含まれる形態であるイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、また逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。

また、「核酸」なる語には、任意の単純ヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、全ＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、等が含まれる。「修飾ヌクレオチド」には、イノシン、アセチルシチジン、メチルシチジン、メチルアデノシン、メチルグアノシンを含むリン酸エステルの他、紫外線や化学物質の作用で後天的に発生し得るヌクレオチドも含まれる。

「塩基配列」との用語は、「核酸配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（それぞれＡ、Ｇ、Ｃ及びＴと省略される）の配列として示される。また、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの「塩基配列」は、ＤＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのデオキシリボヌクレオチドの配列を意図し、そしてＲＮＡ分子又はポリヌクレオチドに対してのリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）の対応する配列（ここで特定されるデオキシヌクレオチド配列における各チミジンデオキシヌクレオチド（Ｔ）は、リボヌクレオチドのウリジン（Ｕ）によって置き換えられる）を意図する。

例えば、デオキシリボヌクレオチドの略語を用いて示される「配列番号２又は４の配列を有するＲＮＡ分子」とは、配列番号２又は４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣが、対応するリボヌクレオチドＡ、Ｇ又はＣによって置換され、そしてデオキシヌクレオチドＴが、リボヌクレオチドＵによって置き換えられる配列を有するＲＮＡ分子を示すことを意図する。また、「配列番号２又は４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチド又はそのフラグメント」とは、配列番号２又は４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及び/又はＴによって示される配列を含むポリヌクレオチド又はその断片部分を意図する。

＜３．本発明にかかる遺伝子の取得方法＞
本発明にかかる遺伝子を取得する方法（又は遺伝子の生産方法）は、特に限定されるものではないが、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（サブトラクションクローニング）を利用する方法を挙げることができる。この方法では、公知の技術に従って、試験管内での直接的ハイブリダイゼーションを繰り返し、目的のｃＤＮＡ（本発明にかかる遺伝子）を濃縮すればよい。

上記ディファレンシャルスクリーニングにおける各ステップについては、通常用いられる条件の下で行えばよい。これによって得られたクローンは、制限酵素地図の作成及びその塩基配列決定（シークエンシング）によって、さらに詳しく解析することができる。これらの解析によって、本発明にかかる遺伝子配列を含むＤＮＡ断片を取得したか容易に確認することができる。

また、本発明にかかる遺伝子を取得する方法として、公知の技術により、本発明にかかる遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、上記ｃＤＮＡ配列の一部配列と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、上記各ｃＤＮＡ配列又はその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いかなる配列・長さのものを用いてもよい。

また、本発明にかかる遺伝子を取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明にかかる遺伝子のｃＤＮＡ配列のうち、５’側及び３’側の配列（又はその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明にかかる遺伝子を含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。

なお、本発明にかかる遺伝子の取得において、ｃＤＮＡを用いる場合、当該ｃＤＮＡは、発芽種子の胚芽からｍＲＮＡを抽出し、そのｍＲＮＡを逆転写して得ることが好ましい。オオムギでは、ＨＰＬ活性は、発芽種子(発芽後３日から７日)の胚芽に多く検出されることから、上記のように、発芽種子の胚芽を材料に用いることにより、効率よく、本発明にかかる遺伝子を取得することができる。

また遺伝子配列情報をもとにして、該配列をもつポリヌクレオチドを、公知の化学合成を用いて合成してもよい。

また、上記プローブの配列を、上記本発明にかかるタンパク質の機能上重要と考えられる領域（例えば、上記ＨｖＨＰＬ２タンパク質におけるヘム結合部位のコンセンサス配列等）をコードする配列の中から選択し、各種植物やその他の生物のゲノムＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーをスクリーニングすれば、本発明にかかるタンパク質と同等の機能を有する相同分子や類縁分子をコードする遺伝子を単離できる可能性が高い。

また、本発明にかかる遺伝子の変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じることが可能である。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。また、天然に存在しない変異体は、例えば、当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。

＜４．本発明にかかるタンパク質＞
本発明にかかるタンパク質は、麦芽飲料における老化臭の原因物質の生成に関与するタンパク質であって、具体的には、９−／１３−ＨＰＬ活性を有するタンパク質である。

本発明にかかるタンパク質の具体的な例としては、（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ９−／１３−ＨＰＬ活性を有するタンパク質が挙げられる。

上記配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、上述のＨｖＨＰＬ２遺伝子の翻訳産物である。これ以後、上記タンパク質を、ＨｖＨＰＬ２タンパク質と称する。

このＨｖＨＰＬ２タンパク質は、配列番号１に示すように、４９１アミノ酸残基からなり、その分子質量は、約５３．７ｋＤａである。

さらに、本発明にかかるタンパク質は、配列番号２に示される塩基配列によってコードされるタンパク質の１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したポリペプチドであってもよい。保存的若しくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、又は付加が好ましく、特に好ましいものは、サイレント置換、付加、及び欠失である。上記のものであれば、本発明にかかるタンパク質又はその一部の特性及び活性を変化させない。これらの点において、保存的置換であることが特に好ましい。

また、本発明には、本発明にかかるタンパク質の改変型タンパク質、言い換えれば、変異タンパク質（変異体）も含まれる。このような改変型タンパク質は、１又は数個のアミノ酸置換、欠失、又は付加によって生成される変異体を含む。置換、欠失、又は付加は、１つ以上のアミノ酸を含み得る。本発明では、上記改変型タンパク質は、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質の比活性よりも低い比活性しか有さない（例えば、ｋ_ｃａｔが低い、Ｋ_ｍ値が高いなど）、又は当該活性を全く有さないタンパク質であることが好ましい。

また、本発明にかかるタンパク質は、天然から分離されたものだけでなく、化学合成されても組換え生成されてもよい。つまり、本発明にかかるタンパク質は、細胞、組織などから単離精製された状態であってもよいし、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入して、そのタンパク質を細胞内発現させた状態であってもよい。また、本発明にかかるタンパク質は、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。

上記付加的なポリペプチドとしては、例えば、マーカー配列（例えば、融合されたタンパク質の精製を容易にするペプチドをコードする配列）を例示することができる。本発明の好ましい実施態様において、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Qiagen, INC.）において提供されるタグ）であってもよい。Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989) において記載されているように、ヘキサ−ヒスチジンペプチドは、融合タンパク質の簡便な精製に有用である。また、これ以外にも、多くの公的及び／又は商業的に入手可能なマーカーアミノ酸配列を利用可能である。例えば、Wilsonら、Cell 37: 767 (1984) によって記載されているように、「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用なペプチドである。他にも、本発明にかかるタンパク質のＮ末端又はＣ末端にＦｃを融合させた融合タンパク質も精製のために有用である。

なお、本明細書において、「タンパク質」との用語は、「ポリペプチド」又は「ペプチド」と交換可能に使用している。

本発明にかかるタンパク質の機能について、上述のＨｖＨＰＬ２タンパク質を例に挙げて説明すると以下の通りである。

ＨｖＨＰＬ２タンパク質は、図１に示すように、ＣＹＰ７４ファミリーに属するメンバーであり、ＣＹＰ７４Ｃに分類される。ＨｖＨＰＬ２タンパク質は、例えば、９−リポキシゲナーゼによって、リノール酸が変換された９−ＨＰＯＤを３（Ｚ）−ノネナールに開裂分解する反応を触媒する（図２を参照）。その後、３（Ｚ）−ノネナールは酵素的（イソメラーゼによる）または非酵素的に２（Ｅ）−ノネナールに異性化されると考えられている。このリノール酸から２（Ｅ）−ノネナールへの一連の変換反応は、ビールなどの麦芽飲料の製造の際、仕込工程中に起こるものである。すなわち、ＨｖＨＰＬタンパク質は、麦芽飲料の製造工程において、麦芽飲料の老化臭の原因物質である２（Ｅ）−ノネナールの生成に寄与するタンパク質である。これまでに、麦芽中の９−リポキシゲナーゼタンパク質は同定されていたが、本発明において、新たにＨｖＨＰＬ２タンパク質を同定することに成功した。

したがって、本発明によれば、ＨｖＨＰＬ２タンパク質の活性に変異のある変異体を利用すれば、ビールなどの麦芽飲料の原料としたときに、老化抑制効果のあるオオムギを育種することが可能である。

＜５．本発明にかかるタンパク質の取得方法＞
本発明にかかるタンパク質を取得する方法（又はタンパク質の生産方法）は、特に限定されるものではないが、まず、本発明にかかるタンパク質を含有する生物学的試料（例えば、細胞、組織、生物個体等）などから単純精製する方法を挙げることができる。

植物材料から、本発明にかかるタンパク質を精製する場合、発芽種子の胚芽から抽出することが好ましい。オオムギでは、ＨＰＬ活性は、発芽種子(発芽後３日から７日)の胚芽に多く検出されることから、上記のように、発芽種子の胚芽を材料に用いることによって、効率よく、本発明にかかるタンパク質を精製することができる。

また、精製方法についても特に限定されるものではなく、公知の方法で細胞や組織から細胞抽出液を調製し、この細胞抽出液を公知の方法、例えばカラム等を用いて精製すればよい。例えば、細胞又は組織より抽出した粗タンパク質画分を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、本発明にかかるタンパク質の精製・分離を行うことができる。

精製に用いる緩衝液には、可溶化剤としてＴｒｉｔｏｎＸ−１００やＴｗｅｅｎ２０などの非イオン性界面活性剤を０．０１−０．５％程度含有した緩衝液を用いることが好ましい。一般に、ＣＹＰ７４ファミリータンパク質は、膜蛋白質であるので、上記構成の緩衝液を用いることにより、タンパク質の可溶化が容易となり、効率よく、本発明にかかるタンパク質を精製することができる。

また、上記緩衝液は、β−メルカプトエタノールやジチオスレイトールなどの還元剤を含むことが好ましい。上記還元剤を含むことにより、タンパク質が有するＳＨ基（チオール基）が酸化され、ジスルフィドを形成するのを防ぐことができる。

さらに、上記緩衝液は、プロテアーゼインヒビター(例えば、ロシュ製のコンプリートプロテアーゼインヒビターなど)を含むことが好ましい。上記プロテアーゼインヒビターを含むことにより、タンパク質の精製過程において、目的タンパク質（ここでは、本発明にかかるタンパク質）がプロテアーゼによって分解されるのを防ぐことができる。

また、その他の本発明にかかるタンパク質を取得する方法として、遺伝子組み換え技術等を用いる方法も挙げられる。この場合、例えば、本発明にかかる遺伝子をベクターなどに組み込んだ後、公知の方法により、発現可能に宿主細胞に導入し、細胞内で翻訳されて得られる上記タンパク質を精製するという方法などを採用することができる。遺伝子の導入（形質転換）や遺伝子の発現等の具体的な方法については後述する。

なお、このように宿主に外来遺伝子を導入する場合、外来遺伝子の発現のため宿主内で機能するプロモーターを組み入れた発現ベクター、及び宿主には様々なものが存在するので、目的に応じたものを選択すればよい。産生されたタンパク質を精製する方法は、用いた宿主、タンパク質の性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のタンパク質を精製することが可能である。

変異タンパク質を作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的突然変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, Gene 152,271-275(1995)他）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し、変異タンパク質を作製する方法、あるいはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異タンパク質作製法を用いることができる。これら方法を用いることによって、上記（ａ）のタンパク質をコードするｃＤＮＡの塩基配列において、１又は数個の塩基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されるように改変を加えることによって作製することができる。また、変異タンパク質の作製には、市販のキットを利用してもよい。

また、本発明にかかる改変型タンパク質として、上記例示した上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質の比活性よりも低い比活性しか有さない（例えば、ｋ_ｃａｔが低い、Ｋ_ｍ値が高いなど）、又は当該活性を全く有さないタンパク質を製造する場合、上記変異は、例えば、活性中心及び／又は基質結合部位のような酵素反応において重要な部位（アミノ酸残基）に導入することが好ましい。そうすれば、効率よく、所望の改変型タンパク質を得ることができる。

本発明にかかるタンパク質の取得方法は、上述に限定されることなく、例えば、市販されているペプチド合成器等を用いて化学合成されたものであってもよい。またその他の例としては、無細胞系のタンパク質合成液を利用して、本発明にかかる遺伝子から本発明にかかるペプチドを合成してもよい。

＜６．本発明にかかる組換え発現ベクター＞
本発明にかかる組換え発現ベクターは、上記（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質をコードする本発明の遺伝子を含むものである。例えば、ｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターが挙げられる。組換え発現ベクターの作製には、プラスミド、ファージ、又はコスミドなどを用いることができるが特に限定されるものではない。また、作製方法も公知の方法を用いて行えばよい。

ベクターの具体的な種類は特に限定されるものではなく、宿主（ホスト）細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、ホスト細胞の種類に応じて、確実に遺伝子を発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明にかかる遺伝子を各種プラスミド等に組み込んだものを発現ベクターとして用いればよい。かかる発現ベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、染色体ベクター、エピソームベクター、及びウイルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、トリポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルス）、並びにそれらの組合せに由来するベクター（例えば、コスミド及びファージミド）を利用可能である。

一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中か、又は荷電された脂質との複合体中で導入される。ベクターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用いてin vitroでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。また、レトロウイルスベクターは、複製可能か又は複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。

また、目的の遺伝子に対するシス作用性制御領域を含むベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供給され得るか、又は宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。この点に関する好ましい実施態様としては、ベクターは、誘導性及び／又は細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供するものであることが好適である。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度及び栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。

細菌における使用に好ましいベクターの中には、例えば、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、及びｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎから入手可能）；ｐＢＳベクター、Phagescriptベクター、Bluescriptベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratageneから入手可能）；並びにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Phrmaciaから入手可能）が含まれる。

また、好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、及びｐＳＧ（Stratageneから入手可能）；並びにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ（Phrmaciaから入手可能）が含まれる。

植物における使用に好ましいベクターの中には、例えば、プラスミド「ｐＢＩ１２１」、「ｐＢＩ２２１」、「ｐＢＩ１０１」（いずれもClontech社製）、「ｐＴＡ７００１」、「ｐＴＡ７００２」(Aoyama ら(1997) Plant J. 11:605) 、「ｐＰＺＰ２１１」(Hajdukiewicz et al., Plant Mol. Biol. 25:989(1994)などが含まれる。

本発明にかかる遺伝子が宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認するために、各種マーカーを用いてもよい。すなわち、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このような選択マーカーとしては、例えば、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。また、植物細胞においては、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を用いることができる。さらに、その他にも宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと本発明にかかる遺伝子とを含むプラスミド等を発現ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明にかかる遺伝子の導入を確認することができる。あるいは、本発明にかかるタンパク質を融合タンパク質として発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質ＧＦＰ（GreenFluorescent Protein）をマーカーとして用い、本発明にかかるタンパク質をＧＦＰ融合タンパク質として発現させてもよい。また、本発明にかかる遺伝子は、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合されてもよい。

また、ＤＮＡインサートは、適切なプロモーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーター）に作動可能に連結されることが好ましい。他の適切なプロモーターとしては、従来公知のプロモーターを利用可能である。

本発明において、使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、λＰＲプロモーター及びλＰＬプロモーター、並びにｔｒｐプロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期ＳＶ４０プロモーター及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）、並びにメタロチオネインプロモーター（例えば、マウスメタロチオネインＩプロモーター）が挙げられる。

また、植物細胞での使用に適したプロモーターの中には、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター（Odell et al., Nature, 313:810(1985))、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al., Plant Cell, 3:1155(1991)) 、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al.,Plant Mol. Biol., 23:567(1993))などが含まれる。

また、誘導的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、紫外線の照射、特定の化合物の散布などの外因によって発現することが知られているプロモーターなどが挙げられる。このようなプロモーターとしては、例えば、糸状菌・細菌・ウイルスの感染や侵入によって発現するイネキチナーゼ遺伝子のプロモーター（Xu et al., Plant Mol. Biol., 30:387(1996))やタバコのPRタンパク質遺伝子のプロモーター(Ohshima et al., Plant Cell 2:95(1990))、低温によって誘導されるイネの「ｌｉｐ１９」遺伝子のプロモーター（Aguan et al., Mol. Gen Genet., 240:1(1993))、高温によって誘導されるイネの「ｈｓｐ８０」遺伝子と「ｈｓｐ７２」遺伝子のプロモーター（Van Breusegem et al., Planta, 193:57(1994))、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナの「ｒａｂ１６」遺伝子のプロモーター（Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1406(1990))、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al., EMBO J., 8:651(1989))、嫌気的条件で誘導されるトウモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモーター（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6624(1987))などが挙げられる。

また、イネキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタバコのＰＲタンパク質遺伝子のプロモーターはサリチル酸などの特定の化合物によって、「ｒａｂ１６」は植物ホルモンのアブシジン酸の散布によっても誘導される。またグルココルチコイドやエストロジェンの処理によって植物内で誘導的遺伝子発現が可能であるシステムを有するベクター系の使用も含有し得る。グルココルチコイド処理によって発現誘導可能なベクターとしてはｐＴＡ７００１、ｐＴＡ７００２(Aoyama et al., Plant J., 11:605(1997))や、エストロジェン処理によって発現誘導が可能なベクターとしてはｐＥＲ１０(Zuo et al., Plant J., 24:265(2000))が挙げられる。

また、増殖細胞特異的に発現させるためのプロモーターとしては、例えばＳ〜Ｍ期に発現するタバコＮＰＫ１遺伝子のプロモーター(Nishihama et al., Genes Dev., 15:352(2000))、Ｍ期に発現するプロモーターとしてタバコＮＡＣＫ１遺伝子のプロモーター(Nishihama et al., Cell, 109:87(2002))、ニチニチソウＣＹＭ遺伝子プロモーター(Ito et al., Plant J.,11:983(1997))、Ｓ期に発現するニチニチソウＣＹＳ遺伝子プロモーター(Ito et al., Plant J.,11:983(1997))、増殖細胞において細胞周期を通じて発現が認められるシロイヌナズナｃｄｃ２ａ遺伝子のプロモーター(Chung et al., FEBS Lett.,362:215(1995))などが挙げられる。

また、組織特異的プロモーターの例としては、ＵＳ５４５９２５２およびＵＳ５６３３３６３（根特異的）、ＵＳ５０９７０２５（（ｉ）種子、（ｉｉ）成熟植物）、ＵＳ５３９１７２５（（ｉ）葉緑体、（ｉｉ）細胞質ゾル）、ＵＳ４８８６７５３（根粒）、ＵＳ５６４６３３３（表皮）、ＵＳ５１１０７３２（（ｉ）根、（ｉｉ）貯蔵根）、ＵＳ５６１８９８８（貯蔵器官）、ＵＳ５４０１８３６およびＵＳ５７９２９２５（根）、ＵＳ４９４３６７４（果実）、ＵＳ５４９５００７（師部）、およびＵＳ５８２４８５７（脈管構造）の特許文献に見出すことが可能である。これら特許文献は各々、本明細書に援用される。

これらのプロモーターに加え、維管束の前形成層特異的なプロモーターであるシロイヌナズナＡｔＨＢ８プロモーター(Baima et al. Development 121:4171(1995)) 、茎や根に特異的なシロイヌナズナＡＣＬ５プロモーター(Hanzawa et al. The EMBO Journal, 19:4248(2000))、地上部に特異的なトマトＲＢＣＳ３Ａプロモーター(Meier et al. Plant Physiol. 107:1105(1995))なども使用することができる。

組換え発現ベクターは、さらに、転写開始、転写終結のための部位、及び、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含むことが好ましい。ベクター構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始ＡＵＧを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含むことになる。

また、高等真核生物によるＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増大させ得る。エンハンサーは、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働く、通常約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、複製起点の後期側上の１００〜２７０ｂｐに位置される）、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。

また、上記宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。適切な宿主の代表的な例としては、菌体（例えば、E. coli細胞、Streptomyces細胞、及びSalmonella typhimurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Drosophila Ｓ２細胞及びSpodoptera Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＢｏｗｅｓ黒色腫細胞）；並びに植物細胞（例えばシロイヌナズナ、タバコなどの双子葉植物、イネ、オオムギなどの単子葉植物）が挙げられる。より具体的には、ヒトやマウス等の哺乳類の細胞だけでなく、例えば、カイコガ由来の細胞をはじめとして、キイロショウジョウバエ等の昆虫、大腸菌（Escherichia coli）等の細菌、酵母（出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeや分裂酵母Schizosaccharomyces pombe）、線虫Caenorhabditis elegans、アフリカツメガエル（Xenopuslaevis）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は当分野で公知ものを利用可能である。

上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換方法も特に限定されるものではなく、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、感染等の従来公知の方法を好適に用いることができる。このような方法は、Davisら、Basic Methods In Molecular Biology (1986) のような多くの標準的実験マニュアルに記載されている。

なお、本発明は、本発明にかかるタンパク質の部分断片（フラグメント）を組換え的に生成するための、本発明にかかるタンパク質の部分断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター、組換え発現ベクターで遺伝子操作された形質転換体（宿主細胞）を提供することもできる。

さらに、本発明には、上述の組換え技術によって本発明にかかるタンパク質、又はそのフラグメントの産生に関する発明も含まれ得る。すなわち、本発明には、組換え技術を利用して本発明にかかるタンパク質やそのフラグメントを生産する方法も含まれ得る。かかる技術によって生産された組換えタンパク質は、硫安沈殿又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。

＜７．本発明にかかる形質転換体＞
本発明にかかる形質転換体は、本発明にかかる遺伝子が導入された形質転換体、すなわち、上記＜６＞の項に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体である。ここで、「遺伝子が導入された」とは、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、対象細胞（宿主細胞）内に発現可能に導入されることを意味する。また、上記「形質転換体」とは、細胞・組織・器官のみならず、生物個体を含む意味である。

本発明に係る形質転換体の作製方法（生産方法）は、上述した組換え発現ベクターを形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記＜６＞の項で例示した各種微生物や動物、植物を挙げることができる。

本発明にかかる好ましい形質転換体としては、本発明にかかる遺伝子、又は、他種植物に由来し、本発明にかかる遺伝子に相同性を有する相同遺伝子を、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、宿主細胞に発現可能に導入することにより、当該遺伝子の発現量を人為的にコントロール（過剰発現又は抑制）した形質転換体が挙げられる。

つまり、本発明には、本発明にかかるタンパク質の活性が改変された植物も含まれる。上記「本発明にかかるタンパク質の活性が改変された植物」とは、本発明にかかるタンパク質の発現またはタンパク質の機能が変化した植物であり、該タンパク質の発現量または発現したタンパク質の機能が野生型と比較して検出可能なレベルで変化している植物が好ましい。なお、「発現量の変化」とは、恒常的発現、誘導的発現、過剰発現、異所的発現、発現の抑制を含む意味である。

宿主生物が植物である場合、形質転換に用いる植物材料は特に限定されるものではなく、プロトプラスト、細胞、カルス、器官葉、種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子等の増殖可能な植物材料、花、実、葉、根、又は挿木等の植物体の一部等を用いることができる。さらに、形質転換する方法についても特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、プロトプラスト共存培養法やリーフディスク法等アグロバクテリウム属細菌の感染を利用する方法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポソーム法、適切なベクター系を用いた導入法等を例に挙げることができる。

上記例示した形質転換に用いる植物材料及び方法は、宿主の種類に応じて、最適な方法を選択すればよい。

＜８．本発明にかかる遺伝子及びタンパク質の利用＞
（８−１．９−／１３−ＨＰＬ活性の低い植物）
本発明にかかる遺伝子の利用の一形態として、９−／１３−ＨＰＬ活性の低い植物、当該植物の利用について、以下説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明にかかる遺伝子、及び／又は改変型タンパク質をコードする遺伝子を用いれば、９−／１３−ＨＰＬ活性が低下した植物を生産することができる。ここでいう「９−／１３−ＨＰＬ活性が低下した植物」とは、野生型植物に比べて、９−／１３−ＨＰＬタンパク質の含有量が減少したため、当該酵素活性が低下した植物と、９−／１３−ＨＰＬタンパク質の質的な変化、具体的には比活性が低下（例えば、ｋ_ｃａｔの低下やＫ_ｍ値の上昇など）したために、当該酵素活性が低下した植物との両方を含む意味である。また、９−／１３−ＨＰＬタンパク質の量的減少と、質的減少とが共に起こった植物であってもよい。

上記の植物は特に限定されるものではないが、本実施形態では、ムギ類、特にオオムギであることが好ましい。上記植物がオオムギである場合、９−／１３−ＨＰＬ活性が低い麦芽を製造することが可能となる。このような麦芽をビールなどの麦芽飲料の製造に用いれば、保存時における２（Ｅ）−ノネナールの生成が低減され、カードボード臭の少ない麦芽飲料を製造することができる。また、製造工程においても、老化臭の原因物質の生成を抑制することができる。すなわち、本発明によれば、麦芽飲料において、香味品質の向上（維持）と、老化臭の抑制とを両立させることができる。

なお、本明細書において、「麦芽飲料」とは、麦芽のみのビール、エール、ドライビール、ニアービアー、ライトビール、低アルコールビール、低カロリービール、ポーター、ボックビール、スタウト、麦芽酒、発泡酒、ノンアルコール麦芽酒などが含まれる。さらに、代替麦芽飲料も含まれる。代替麦芽飲料としては、例えば、レモン、オレンジ、ライム若しくはイチゴのような果実風味又は柑橘類風味の麦芽飲料、ウォッカ、ラム、又はテキーラのような酒風味の麦芽飲料や、コーヒー風味の麦芽飲料などが挙げられる。

上記のような９−／１３−ＨＰＬ活性の低い植物を製造する方法は、特に限定されるものではない。例えば、天然に存在する変異体からこのような表現型を示す植物を選抜することによって得ることができる。また、人為的に当該植物を製造することができる。その場合、例えば、以下の（Ｉ）〜（ＶＩＩＩ）のような方法を用いることができる。

（Ｉ）形質転換
植物を、本発明にかかる遺伝子発現を操作するように、又は本発明にかかる遺伝子の構造を改変するように設計された種々の核酸分子を用いて形質転換することができる。本実施形態には、上述した本発明にかかる改変型タンパク質をコードする遺伝子を用いた形質転換も含まれる。なお、形質転換方法や、形質転換に用いる植物材料については、上記＜７＞項で例示したものを適宜用いればよい。

（ＩＩ）突然変異誘発
本発明にかかる遺伝子を、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発の標的とすることができる。これらのキメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、植物細胞（Zhuら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8768-8773; 及びBeethamら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 8774-8778）及び哺乳動物細胞（Yoonら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 2071-2076）において所望の位置に突然変異を導入できることが知られている。なお、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、上記＜７＞項で例示した形質転換方法や、植物材料を用いて形質転換することができる。

また、所望の位置に突然変異が導入されているか否かは、従来公知の方法、例えば、ＰＣＲに基づく方法などを用いることにより、確認及び追跡することができる。

したがって、本発明にかかる遺伝子を、キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発の標的とすれば、本発明にかかる遺伝子中の特定の部位に変異を導入することができる。

上記方法によれば、本発明にかかる遺伝子のプロモーター領域において、１ヌクレオチド以上の変異を導入し、本発明にかかる遺伝子の転写をダウンレギュレート又はノックアウトすることができる。また別の様式として、本発明にかかる遺伝子のコード領域に変異を導入することによって、９−／１３−ＨＰＬ活性が低下した変異型９−／１３−ＨＰＬタンパク質、すなわち本発明にかかる改変型タンパク質を発現させることができる。

なお、本発明にかかる遺伝子のコード領域における変異は、特に限定されるものではなく、フレームシフトを生じさせたり、翻訳産物であるタンパク質の末端切断及び／又は基質特異性の低下を生じさせたりする挿入、欠失及び置換を含むものである。

（ＩＩＩ）アンチセンス発現
９−／１３−ＨＰＬ活性が低下した植物は、当該植物において、本発明にかかる遺伝子のアンチセンス鎖を発現させることによっても実現することができる。アンチセンス核酸配列を含有する発現ベクターを用いた形質転換は、上記＜７＞項で例示した形質転換方法を用いて行うことができる。

（ＩＶ）標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子発現
植物に内在する本発明にかかる遺伝子の発現の抑制は、本発明にかかる遺伝子（標的遺伝子）のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。本発明において「ドミナントネガティブの形質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ」とは、該ＤＮＡを発現させることによって、植物体が本来もつ内在性の本発明にかかる遺伝子がコードするタンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡのことを指す。

なお、形質転換方法や、形質転換に用いる植物材料については、上記＜７＞項で例示した方法を用いればよい。

（Ｖ）共抑制
内在性の本発明にかかる遺伝子の発現の抑制は、本発明にかかる遺伝子（標的遺伝子）配列と同一もしくは類似した配列を有するＤＮＡの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成され得る。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr. Biol., 7:R793, 1997; Curr. Biol., 6:810, 1996)。例えば、本発明にかかる遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、本発明にかかる遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換し、得られた植物より生育が抑制された植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は、従来公知の方法で決定することができる。

（ＶＩ）化学的突然変異誘発
化学的突然変異原である公知な化合物で種子などを処理することによっても、９−／１３−ＨＰＬ活性が低下した植物を生産することができる。上記化学的突然変異原としては、アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、アジドグリセロール（ＡＧ、３−アジド−１，２−プロパンジオール）、メチルニトロソ尿素（ＭＮＵ）、及びマレイン酸ヒドラジド（ＭＨ）などが例示できる。また、ＵＶ照射を用いてもよい。

また、上記植物がオオムギである場合、アジ化ナトリウムを用いることが好ましい。そうすれば、オオムギゲノムのＤＮＡ（デオキシリボ核酸）配列において安定な変異を誘導することができる。

（ＶＩＩ）ＲＮＡ干渉
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を逆位反復に配置したＤＮＡの形質転換によってもたらされるＲＮＡ干渉によっても達成されうる。「ＲＮＡ干渉」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を逆位反復に配置したＤＮＡを形質転換により導入すると、外来ＤＮＡに由来する２本鎖ＲＮＡが発現し、標的遺伝子の発現が抑制される現象のことをいう。ＲＮＡ干渉の機構としては、第１段階として、標的遺伝子のｍＲＮＡと導入配列由来の２本鎖ＲＮＡが複合体を形成し会合した配列をプライマーとして相補的なＲＮＡが合成される。第２段階として、内在性ＲＮａｓｅによってこの複合体が断片化される。第３段階として、２０〜３０塩基対に断片化した２本鎖ＲＮＡが二次的なＲＮＡ干渉のシグナルとして機能することによって再び、内在性の標的遺伝子のｍＲＮＡを分解すると考えられている(Curr. Biol., 7:R793, 1997; Curr. Biol., 6:810, 1996)。なお、形質転換法は、上述したように、宿主の種類に応じて、最適な方法を選択すればよい。

例えば、本発明にかかる遺伝子がＲＮＡ干渉によって抑制された植物体を得るためには、まず、本発明にかかる遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するＤＮＡを逆位反復に配置したＤＮＡを発現できるように作製したベクターＤＮＡを目的の植物へ形質転換する。次に、得られた植物体から９−／１３−ＨＰＬ活性が低下した植物を選抜すればよい。

ＲＮＡ干渉に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも１０塩基以上が連続して同一であり、好ましくは２０塩基から１００塩基が連続して同一であり、さらに好ましくは５０塩基が連続して同一である。またＲＮＡ干渉に用いる遺伝子は、標的遺伝子と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有する遺伝子であってもよい。さらにより好ましくは、標的遺伝子と少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性を有する遺伝子が逆位反復に配置したものが挙げられる。とりわけ、これらの標的遺伝子と配列の同一性を有する遺伝子がスペーサー配列を挟んで逆位反復に配置されたものが好ましい。配列の同一性は、従来公知の方法を用いて決定することができる。

ＲＮＡ干渉に用いる遺伝子の長さとしては、標的遺伝子の全長を使用してもよいが、少なくとも２５塩基あればよく、好ましくは５０塩基、より好ましくは１００塩基、さらに好ましくは５００塩基あればよい。

また、ＲＮＡ干渉は植物ウイルスの感染によっても実現可能である。ゲノムとして１本鎖ＲＮＡをもつ植物ウイルスは、その複製過程において２本鎖ＲＮＡ形態をとる。そこで、植物ウイルスゲノム中に目的遺伝子配列を適当なプロモーターと共に挿入し、この組換えウイルスを植物に感染させた場合、該ウイルスの複製に伴い目的遺伝子配列の２本鎖ＲＮＡが生成されることになる。その結果、ＲＮＡ干渉の効果を得ることができる（Angell et al., Plant J. 20, 357-362,(1999)）。

（ＶＩＩＩ）トランスポゾン
トランスポゾン遺伝子を変異原として利用し、所望の植物等において、トランスポゾンタグ系統を作出することができる。このようにして、作出したトランスポゾンタグ系統から、本発明にかかるタンパク質の発現量が低下した植物や、活性が低下した植物を選抜することにより、９−／１３−ＨＰＬ活性の低い植物を作出することができる。

トランスポゾン遺伝子の植物への導入方法は、上述した形質転換法により行うことができる。

上記のような方法で製造した植物から、９−／１３−ＨＰＬ活性が低下した植物を選抜する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。例えば、遺伝子の発現量を評価する方法としては、ノーザンブロット法などが例示できる。また、タンパク質の発現量は、本発明にかかるタンパク質を特異的に認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ法やウェスタンブロット法などの免疫学的方法を用いることができる。さらに、９−／１３−ＨＰＬ活性を直接評価する方法として、上記特許文献２に開示されるような方法を用いることができる。

９−／１３−ＨＰＬ活性の具体的な測定方法としては、（ｉ）植物抽出液にＨＰＯＤを加える等して植物抽出液中のＨＰＯＤの量を所定値とした後に、所定条件下（例えば、２５℃で１５分間）インキュベートし、ＨＰＯＤがＨＰＬにより分解されて生成した分解生成物の生成量を測定し評価する方法、（ｉｉ）植物抽出液にＨＰＯＤを加える等して植物抽出液中のＨＰＯＤの量を所定値とした後に、所定条件下インキュベートし、ＨＰＯＤがＨＰＬにより分解されることによるＨＰＯＤの減少量を測定し評価する方法が挙げられる。このような植物抽出液は、所定量の粉砕植物を所定量の緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）に加え、所定時間攪拌することにより得ることができる。また、このような分解生成物としては、ＨＰＯＤが分解されて生成したアルデヒド類が挙げられ、具体的には、ノネナール（トランス−２−ノネナール）、ヘキサナール、ヘキセナール、ノナジエナールなどが挙げられる。

上記分解生成物の生成量を測定する方法としては、特に制限されず、公知の方法により測定される。例えば、各種誘導体化試薬で分解生成物を誘導体化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定する方法、分解生成物をガスクロマトグラフィーで測定する方法が使用できる。また、このようなＨＰＯＤの減少量を測定する方法としては、特に制限されず、公知の方法により測定されるが、例えば、基質であるＨＰＯＤの減少量を紫外吸光で測定する方法が使用できる。

ＨＰＬ活性は、このような分解生成物の生成量が少ない又は生成速度が遅いほど、或いはＨＰＯＤの減少量が少ない又は減少速度が遅いほど、活性が低いと評価できる。また、ＨＰＬ活性は、上記方法により測定された測定値から、以下の式により算出することにより評価することもできる。

（ｉ）分解生成物（アルデヒド類）の生成量を測定する方法では、以下の計算式によって脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性（酵素活性）を算出する。

酵素活性（ｍＵ／ｇ）＝１分間における分解生成物の生成量（μＭ）×反応液全量（ｍＬ）÷酵素液量（ｍＬ）÷酵素液濃度（ｇ／ｍＬ）
（ｉｉ）脂肪酸ヒドロペルオキシドの減少量を紫外吸光で測定する方法では、以下の計算式によって酵素活性を算出する。

酵素活性（ｎｋａｔ／ｇ）＝１分間における２３４ｎｍの紫外吸光度減少×０．６６７×反応液全量（ｍＬ）÷酵素液量（ｍＬ）÷酵素液濃度（ｇ／ｍＬ）
なお、上記方法による検出限界は、分解生成物（アルデヒド類）の生成量を測定する方法では０．１ｍＵ／ｇであり、脂肪酸ヒドロペルオキシドの減少量を紫外吸光で測定する方法では１ｎｋａｔ／ｇである。

上記の方法によれば、９−／１３―ＨＰＬ活性の低い植物を選抜することができる。

上記植物がオオムギであれば、当該オオムギを用いて、ＨＰＬ活性の低い麦芽を製造することができる。本実施形態にかかる９−／１３―ＨＰＬ活性の低いオオムギを用いて、麦芽を製造する場合、ＨＰＬ活性は低いことが好ましいが、具体的には、２ｍＵ／ｇ以下、より好ましくは０．１ｍＵ／ｇ以下、または５ｎｋａｔ／ｇ以下、より好ましくは１ｎｋａｔ／ｇ以下であることが好ましい。

（８−２．飲料の製造方法）
本発明の飲料の製造方法は、上述した本発明にかかる形質転換体、または上記（８−１）に例示した植物を用いていればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。すなわち、製造する飲料に応じて、当該飲料の製造方法として、従来公知の方法を用いればよい。また、上記飲料も特に限定されるものではないが、麦芽飲料であることが好ましい。上記麦芽飲料には、先に例示した麦芽飲料が含まれる。

なお、本発明にかかる飲料の製造方法の実施形態として、９−／１３−ＨＰＬ活性の低いオオムギから製造された麦芽を用いて、麦芽飲料を製造する方法について、以下説明する。麦芽飲料の一般的な製造方法として、糖化工程、麦汁煮沸工程、冷却工程、発酵工程、及び熟成工程を含む方法が挙げられる。本発明においても上記方法を用いることができる。以下、各工程について説明する。

〔糖化工程〕
糖化工程は、麦芽を含む原料を糖化させることにより糖化液を得る工程である。本発明で用いられる麦芽は、９−／１３−ＨＰＬ活性の低いオオムギから製造された麦芽、すなわちＨＰＬ活性の低い麦芽である。具体的には、酵素活性が２ｍＵ／ｇ以下、より好ましくは０．１ｍＵ／ｇ以下、又は５ｎｋａｔ／ｇ以下、より好ましくは１ｎｋａｔ／ｇ以下である麦芽が好ましい。また、このような麦芽はオオムギに水分と空気とを十分に与えて発芽させ、乾燥して幼芽を取り除いたものであることが好ましい。麦芽は麦汁製造に必要な酵素源であると同時に糖化の原料として主要な澱粉源となる。また、麦芽を焙燥することにより、麦芽飲料特有の香味と色素とを付与することができる。例えば、オオムギを浸麦度４０〜４５％まで浸麦した後、１０〜２０℃で３〜６日間発芽させ、これを焙煎することによって目的の麦芽を得ることができる。

麦芽を含む原料を糖化する方法は、特に制限されないが、例えば、麦芽を含む原料と仕込み用水とを仕込み釜に入れて混合し、その混合物を所定の温度（好ましくは６５〜７５℃）に加温した後、必要に応じて濾過により滓を除去して糖化液を得ることができる。原料中の麦芽の使用比率は、ビール、発泡酒等の麦芽飲料の種類に応じて適宜選定される。また、このとき、市販又は別途調製されたモルトエキスを仕込み用水と混合してもよく、必要に応じてコーンスターチ、コーングリッツ、米、糖類などの副原料を添加してもよい。

〔麦汁煮沸工程〕
麦汁煮沸工程は、糖化液を濾過して得られる麦汁にホップを添加し、その混合物を煮沸する工程である。上記糖化液におけるホップの含有量は好ましくは０．５〜３．０ｇ／Ｌの範囲内であり、また、当該混合物の煮沸時間は好ましくは９０〜１２０分間である。これにより、麦芽飲料特有の香りと苦味とが付与され、また、麦芽の酵素の働きが止められる。

〔冷却工程〕
冷却工程では、麦汁煮沸工程後の麦汁（熱麦汁）を、所定の温度まで冷却する。冷却された麦汁は、その後、発酵工程に供される。この冷却工程においては、熱麦汁を通常１５℃以下まで冷却することが好ましい。

〔発酵工程〕
発酵工程では、冷却工程後の麦汁に酵母を添加して、麦汁を発酵させることにより発酵液が得られる。発酵工程で用いられる酵母は、麦汁内の糖分を代謝してアルコールや炭酸ガス等を産生するもの（いわゆるアルコール発酵を行う酒類酵母）であれば特に制限されず、具体的には、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ウバルム等が挙げられる。

また、発酵条件については特に制限されないが、発酵温度は好ましくは１５℃以下、より好ましくは８〜１０℃であり、発酵時間は好ましくは８〜１０日である。このようにして得られる発酵液を熟成した後、これを濾過することによって、麦芽飲料が得られる。

〔熟成工程〕
熟成工程における条件は特に制限されないが、例えば密閉タンク等に貯蔵して貯蔵温度−５〜３℃で３０〜９０日間貯蔵することにより残存エキスの再発酵と熟成とを好適に行うことができる。
また、濾過条件についても特に制限されないが、濾過助剤として珪藻土、ＰＶＰＰ（ポリビニルポリピロリドン）、シリカゲル、セルロースパウダー等を用いて濾過を行う。濾過された麦芽発泡飲料はタンク詰め、たる詰め、瓶詰め、缶詰め等されて市場に出荷される。

本発明の方法で製造可能な麦芽飲料としては、例えば、ビール、発泡酒が挙げられる。本発明の製造方法により製造された麦芽飲料は、麦芽由来の脂肪酸ヒドロペルオキシドが分解されることにより生成するアルデヒド類等の老化物質の含有量が少ない。また、麦芽飲料に含まれる９−／１３−ＨＰＬ活性は、量的及び／質的に減少している。したがって、当該麦芽飲料は、長期間保存した場合にも、老化臭が少ない、すなわち老化耐久性に優れているという効果を奏するものである。

（８−３．遺伝マーカーとしての利用）
本発明にかかる遺伝子の一つであるＨｖＨＰＬ２は、遺伝マーカーとしても利用可能である。具体的には、塩基配列中に、オオムギ染色体の塩基配列中に存在する塩基置換を含んでいるオリゴヌクレオチドは、遺伝マーカーとして利用することができる。したがって、オオムギ染色体上のＨｖＨＰＬ２遺伝子領域において、上記のようなオリゴヌクレオチドを設計すれば、当該オリゴヌクレオチドを遺伝マーカーとして利用することができる。このような遺伝マーカーは、マッピング用の遺伝マーカー群や特定の遺伝子の単離、および品種改良等の用途に用いることができる。

なお、本発明は、以上例示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術範囲に含まれる。

本発明について、実施例及び図３〜５に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、及び改変を行うことができる。

〔実施例１：ＨｖＨＰＬ２遺伝子の単離・同定〕
まず、本発明者らが既に単離に成功していたイネ由来のＯｓＨＰＬ１遺伝子およびＯｓＨＰＬ２遺伝子と、イネ由来のＡＯＳ遺伝子（ＯｓＡＯＳ１遺伝子およびＯｓＡＯＳ２遺伝子）とにおいて、一次構造を詳細に解析した。その結果、ヘム結合部位の配列は両者の間では保存されているが、その他の領域は両者の間では明確に異なることが分かった。

そこで、イネ由来のＯｓＨＰＬ１遺伝子およびＯｓＨＰＬ２遺伝子におけるヘム結合部位コンセンサス配列（PSEGNKQCPGKDMVVAVGRLMVAVGRLMVA；配列番号４を参照）と相同領域をもつオオムギＥＳＴを公開データベースよりスクリーニングし、オオムギのＣＹＰ７４Ｃ候補の抽出を試みた。

その結果、４種のＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＣＡ０３２９７６、ＢＱ７５７６６５、ＡＪ４６５３０９、及びＢＦ２５９８４３）が抽出された。しかし、これらは、それぞれ部分的に配列が一致したことから、同一の遺伝子であると考えられた。

次に、上記のＥＳＴ配列を利用して、５’−ＲＡＣＥ法によりオオムギ発芽種子の胚芽（ｃｖ．ＨａｒｕｎａＮｉｊｏ）より完全長ｃＤＮＡ（ＨｖＨＰＬ２と命名）を取得し、その塩基配列を決定した（配列番号３、および図３を参照）。さらに、ＨｖＨＰＬ２遺伝子に存在する最長のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）からＨｖＨＰＬ２タンパク質の一次構造を予測したところ、ＨｖＨＰＬ２タンパク質は４９１アミノ酸残基からなり、その分子質量は、約５３．７ｋＤａであると推定された。

ここで、ＯｓＨＰＬ１タンパク質、ＯｓＨＰＬ２タンパク質、及びＨｖＨＰＬ２タンパク質のアミノ酸配列の相同性解析を行ったところ、図４に示すように、これらのタンパク質の相同性は非常に高かった。さらに、ＯｓＨＰＬ１遺伝子、ＯｓＨＰＬ２遺伝子、及びＨｖＨＰＬ２遺伝子を含め、オオムギおよびイネのＣＹＰ７４ファミリー遺伝子の系統樹を作成した。その結果、図５に示すように、ＯｓＨＰＬ１遺伝子、ＯｓＨＰＬ２遺伝子、及びＨｖＨＰＬ２遺伝子は、互いに近縁関係にあることが示された。つまり、ＨｖＨＰＬ２タンパク質は、イネのＣＹＰ７４Ｃタンパク質（すなわち、ＯｓＨＰＬ１タンパク質及びＯｓＨＰＬ２タンパク質）と構造的に類似していた。

しかし、上述したように、ＣＹＰ７４ファミリーに属するタンパク質は、一次構造が類似しているため、一次構造からだけでは、そのタンパク質が有する活性を予測することが困難である。また、現在の技術では、ＣＹＰ７４ＡとＣＹＰ７４Ｃの活性の差異を構造やモチーフから推定することはできない。したがって、タンパク質を実際に発現させ、酵素機能を確定しなければならない。そこで、ＨｖＨＰＬ２タンパク質について、９−ＨＰＬ活性、１３−ＨＰＬ活性、ＡＯＳ活性及びＤＥＳ活性を測定することにした。

まず、それらの活性を測定するにあたり、ＨｖＨＰＬ２遺伝子の予測ＯＲＦ領域（配列番号２を参照）を発現ベクターに組込み、組換えタンパク質を大腸菌内で発現させた。

大腸菌における組換えタンパク質の発現は、以下のようにして行った。

まず、下記のプライマー１およびプライマー２を用いて、ＰＣＲ法により、ＨｖＨＰＬ２遺伝子のＯＲＦ領域を増幅し、その断片を平滑末端処理した。

プライマー１：5’-GAGGATCCATGACGTCCAAGGTACCCAACAGC-3’（配列番号１１）
プライマー２：5’-GGAAGCTTGCTACTACTATAGTCACTCGGCCC-3’（配列番号１２）
次に、上記平滑末端処理した断片をｐＵＣ１１８のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニング後、大腸菌発現ベクターｐＲＳＥＴＡ(インビトロジェン)のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩにサブクローニングした。これをｐＲＳＥＴＡ−ＨｖＨＰＬ２と命名した。なお、これらのプラスミドは、大腸菌内で、Ｎ末端に以下のアミノ酸配列からなる36残基のタグペプチドを付加したタンパク質を合成する。

タグペプチド：MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS（配列番号１３）
次に、ｐＲＳＥＴＡ−ＨｖＨＰＬ２をＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した。大腸菌内生産および組換えタンパク質のアフィニティー精製は以下の方法に従った。形質転換株を１００ｍｌのＬＢ培地で１６℃の条件で前培養し、ＯＤ_６００が０．７に到達した時点で、終濃度２ｍＭとなるようにイソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを添加した。同じ条件でさらに１６時間培養し、その後細胞を遠心分離によって回収した。細胞に１０ｍｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ β−メルカプトエタノールに懸濁し、−８０℃で凍結し、融解した後、１００ＵのＤＮａｓｅ I(ニッポンジーン) を添加した。２５℃、１０分間インキュベートした後に、サンプルを４℃、１０分間、１００００×ｇの条件で遠心分離を行い、上清を大腸菌ライセートとして用いた。タンパク質濃度は、Bio-Rad protein assay (Bio-Rad)を用いて測定した。このようにして得られた大腸菌ライセートの一部を利用して、酵素機能の解析を行った。

その結果、組換えタンパク質は９位又は１３位にヒドロペルオキシドを有するリノール酸及びリノレン酸を分解し、３（Ｚ）−ノネナール等のアルデヒドを生成する活性を有した（図６を参照）。また、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行い、生成物を解析した結果、ＡＯＳとＤＥＳ活性は認められなかった。このことから、ＨｖＨＰＬ２はＣＹＰ７４Ｃに属することが明らかとなった。

なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

以上のように、本発明は、麦芽飲料における老化臭の原因物質の生成に関与する遺伝子を提供する。それゆえ、本発明にかかる遺伝子を用いれば、麦芽飲料における老化臭の原因物質の生成に関与するタンパク質の発現が抑制されたオオムギの品種改良に用いることができる。また、当該遺伝子の変異体を用いることによっても、上記効果を奏するオオムギの品種改良を行うことができる。さらに、本発明は上記オオムギの品種改良にとどまらず、ムギ類全般、より広くは単子葉植物全般の品種改良に用いることができる。

また、本発明にかかる遺伝子およびタンパク質は、麦芽飲料の老化を判定するために用いることもできる。

さらに、本発明は、上述した品種改良により得られた植物を原材料として、老化が起こりにくい麦芽飲料を提供することができる。

ＣＹＰ７４ファミリータンパク質の反応機構を説明する図である。２（Ｅ）−ノネナールの生成機構を説明する図である。ＨｖＨＰＬ２クローンの塩基配列及び推定アミノ酸配列を示す図である。オオムギ及びイネのＣＹＰ７４ＣとＣＹＰ７４Ａとにおいて、タンパク質の一次構造を比較した結果を示す図である。オオムギ及びイネのＣＹＰ７４ファミリーの系統樹を示す図である。ＨｖＨＰＬ２組換えタンパク質の機能解析結果を示すクロマトグラムである。

Claims

以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性を有するタンパク質。
配列番号２に示される塩基配列をオープンリーディングフレーム領域として有することを特徴とする遺伝子。
配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、かつ９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性を有するタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子にコードされることを特徴とするタンパク質。
以下の（ａ）又は（ｂ）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性を有するタンパク質。
請求項４又は５に記載のタンパク質のアミノ酸配列に変異が導入されることによって、９−／１３−脂肪酸ヒドロペルオキシドリアーゼ活性が欠損している、又は比活性が減少していることを特徴とする改変型タンパク質。
請求項６に記載の改変型タンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
請求項１〜３、又は７のいずれか１項に記載の遺伝子を含むことを特徴とする組換え発現ベクター。
請求項１〜３、又は７のいずれか１項に記載の遺伝子又は請求項８に記載の組換え発現ベクターを導入してなることを特徴とする形質転換体。
請求項６に記載の改変型タンパク質を含むことを特徴とする植物。
飲料の製造方法において、請求項９に記載の形質転換体、又は請求項１０に記載の植物を原材料として用いることを特徴とする飲料の製造方法。
上記飲料が麦芽飲料であることを特徴とする請求項１１に記載の飲料の製造方法。
請求項１１又は１２に記載の飲料の製造方法を含む方法によって製造されることを特徴とする飲料。