WO2007007563A1

WO2007007563A1 - Ｃｅ／ｍｓによる陰イオン性化合物の定量分析法

Info

Publication number: WO2007007563A1
Application number: PCT/JP2006/313045
Authority: WO
Inventors: Eiichiro Fukusaki; Akio Kobayashi; Kazuo Harada
Original assignee: Osaka University
Priority date: 2005-07-11
Filing date: 2006-06-23
Publication date: 2007-01-18
Also published as: JP2008241244A

Abstract

本発明は、キャピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせて陰イオン性化合物を分離分析する方法を提供し、該方法は、泳動液で満たされたキャピラリーの泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定し、該キャピラリーに電圧を印加して陰イオン性化合物を含む試料を電気泳動する工程であって、該電圧の印加により発生する電気浸透流の移動度の絶対値が、該試料中の少なくとも１種の陰イオン性化合物の電気泳動移動度の絶対値を上回るような条件で該電気泳動を行う、工程；および、該キャピラリーの出口まで泳動された該試料中の陰イオン性化合物を質量分析する工程；を含む。

Description

C E ZM Sによる陰ィオン性化合物の定量分析法技術分野

本発明は、キヤビラリ一電気泳動と質量分析とを組み合わせたキヤビラリ一電気泳動 Z質量分析装置（CE明/MS) およびこの装置を用いる陰イオン性化合物の分離分析方法に関する。

書

背景技術

近年、キヤピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせた、高感度かつ高選択性を有するキヤピラリー電気泳動質量分析装置 (CE/MS) を用いたイオン性化合物の分析法が開発されている。この手法の優位性は、キヤピラリー電気泳動（CE) については迅速な分析を可能にし、非常に高い分離能を有する点、および質量分析 (MS) については非常に高い選択性と感度を有する点が挙げられる。この優れた分析手法により、カルボン酸、フエノール性化合物、アミノ酸などの分析例が報告されてい.る。そして近年、 CE /MSを用いたァニオン分析系が確立され、解糖系、ペントースリン酸回路、 TCA回路、およぴカルビン ·ベンソン回路中間体の分離 ·検出が可能となつた（Soga T.ら、「Anal. Chem. J ， 2002年， 74巻， pp.2233-2239) 。

図 1 Aに示すように、通常のフューズドシリカキヤビラリ一を用いた電気泳動では、キヤピラリー内表面がシラノール基の解離によって負電荷を帯びている。したがつで、キヤビラリ一中の泳動液に含まれている電解質はキヤピラリーとの界面が正電荷を帯び、電気浸透流（EOF) は陽極（ァノード）から陰極（力ソード）に向かう。さらに、 CE/MSにおいては、質量分析装置（MS) に接続した側のキヤビラリ一の先端を、電解質を含む泳動液に浸すことができない。これらの理由により、泳動液を入れたパイアル側を陰極および MS側を陽極とした場合には、 EOFがパイアル側に向かうため、 MS側のキヤビラリ一先端に空洞が生じる。そのため、 CEの電流が流れなくなり、泳動が中断される（図 1A参照）。

CEの電流が流れなくなる現象を防ぐために、 SMI LEキヤピラリーを使用して、 EOFを反転させる方法が開発されている（特開 2003— 35 698号公報）。 SMI LEキヤビラリ一は、キヤピラリー内表面が陽ィォン性化合物によってコーティングされているので、キヤビラリ一内壁が正に荷電し、 EOFを陰極から陽極へと反転させることが可能である（図 1 B参照）。これにより、解糖系、 TCA回路、およびペントースリン酸回路の中間体などの種々の陰ィオン性ィヒ合物を連続的かつ安定に一斉分析することが可能となった。

しかし、この SMI LEキヤビラリ一は高価である上、非常に耐久性が低く、ルーチンワークに適さない。また、リブロース 5—リン酸とリボース 5 —リン酸、あるいはグルコース 1一リン酸、グルコース 6—リン酸、フルクトース 6—リン酸などの異性体の分離が不完全であり、定量分析が困難である。さらに、 SMI LEキヤピラリーを用いた分析系では、一部のヌクレオチドゃ Co A類などの多価陰イオンは、 SMI LEキヤピラリー内表面に吸着するため、検出することができ.ない。

そこで、中性ポリマー（ポリ（ジメチルシロキサン））で内表面をコーテイングしたキヤビラリ一（DB— 1) を用い、さらにキヤビラリ一の入口をエアーポンプで加圧することにより、一定流量の液体を質量分析計側に送り込む方法も開発されている（Soga T.ら、「Anal. Chem,」， 2002年， 74卷， p p.6224-6229) 。この方法によれば、ヌクレオチド類、ニコチンアミド捕酵素類、 Co A類などの一斉分析が可能である。し力し、この方法では、糖リン酸の異性体を分離することができず、ヌクレオチド類の分離も充分とはいえない。したがって、同一移動時間に多数の化合物が同時溶出し、イオン化サブレッシヨンによる M Sの定量性の低下が懸念される。発明の開示

' 本発明は、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、 C o A化合物などの幅広い陰イオン性化合物の一斉分析を、より安価かつ安定して行うことが可能な分析系を提供することを目的とする。

C EZM Sにおいて、分析対象イオンのみかけの移動度は、 E O F移動度と電気泳動移動度とのベクトル和で表すことができる。一般的に、これらの値は、陽極から陰極に向かう方向を正とする。陽イオン性化合物を対象とした C E/M S分析系、すなわち、泳動液を入れたパイアル側を陽極および M S側を陰極とした系では、 E O F移動度と電気泳動移動度とはいずれも正であるため、分析の途中で電流が流れなくなるという現象はほとんど見られず、安定して分析を行うことができる。そこで、本発明者らは、このような極性で陰イオン'!¹生ィ匕合物を分析できるか否かの検討を行ったところ、 E O F移動度の絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくして、分析対象イオンのみかけの移動度を正にすることにより、安定な陰イオン性化合物の分析系を確立した。

すなわち、本発明は、キヤピラリー電気泳動と質量分析とを組み合わせて陰イオン性化合物を分離分析する方法を提供し、該方法は、

泳動液で満たされたキヤビラリ一の泳動液の入口側を陽極おょぴ出口側を陰極となるように設定し、該キヤビラリ一に電圧を印加して陰イオン性ィ匕合物を含む試料を電気泳動する工程であって、該電圧の印加により発生する電気浸透流の移動度の絶対値が、該試料中の少なくとも 1種の陰イオン性化合物の電気泳動移動度の絶対値を上回るような条件で該電気泳動を行う、ェ程；および該キヤビラリ一の出口まで泳動された該試料中の陰ィォン性化合物を質量分析する工程；

を含む。

1つの実施態様では、上記キヤビラリ一は、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキヤビラリ一である。

1つの実施態様では、上記泳動液の p Hは 8から 1 1である。

1つの実施態様では、上記泳動液は、酢酸アンモニゥム、トリメチルァミン、トリェチルァミン、エタノールァミン、および炭酸アンモユウムからなる群より選択される少なくとも 1種を含む。

1つの実施態様では、上記方法は、上記電気泳動して質量分析する工程中または該工程後に、該電圧の印加を中止して、該キヤピラリー内の該泳動液を該出口側へ加圧送液し、該キヤビラリ一の出口まで移動した試料を質量分析する工程、をさらに含む。

本発明はまた、キヤビラリ一の出口側が陰極になるように設定されたキヤピラリー電気泳動装置；

該キヤビラリ一電気泳動装置で分離された試料をィォン化するためのィォン化装置；および

該イオン化された試料を分析するための質量分析装置；

を備えた、陰イオン性化合物の分離分析装置を提供する。

1つの実施態様では、上記分離分析装置は、さらに、上記キヤピラリー内の泳動液を該出口側に加圧送液するための手段を備える。

本努明はさらに、泳動液で満たされたキヤビラリ一において、該泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定された、陰イオン性化合物の分離装置を提供する。本発明によれば、陰ィオン' I"生化合物の分析に用いられる通常の C Eの系とは電極の極性を逆転させているため、分析途中で CEの電流が流れなくなる現象がなく、安定して分析を行うことができる。さらに、特殊なキヤビラリ一ではなく、一般的なフューズドシリカキヤピラリーを用いることができるため、安価に分析することができる。さらに、本発明によれば、 CEと CE 後の加圧送液とを組み合わせることにより、今まで同時に分析を行うことが困難だった糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、 Co A化合物などの陰イオン性化合物を、一斉分析することが可能となる。図面の簡単な説明

図 1は、従来技術の CE/MSにおける EO Fの方向を示す模式図である。 A：未修飾フューズドシリカキヤピラリーを用いた場合；および B ： SMI L Eキヤビラリ一を用いた場合。

図 2は、本発明の陰イオン性化合物を分離分析する方法を示す模式図である。

図 3は、 30分間の電気泳動後に電圧を落として送液した場合の、種々の陰イオン性化合物の測定結果を示すエレクトロフエログラムである（実施例 1 -5) 。

図 4は、種々の陰イオン性ィヒ合物の標準溶液について、三連四重極リニアトラップ型質量分析計を用いて CE/ES I— MS分析した結果を示すエレタトロフエログラムである（実施例 2— 1) 。

図 5は、シロイヌナズナ培養細胞 T 87の抽出物について、三連四重極リ二アトラップ型質量分析計を用いて CEZES I一 MS分析した結果を示すエレクト口フエログラムである（実施例 2— 2) 。発明を実施するための最良の形態本発明は、以下の原理に基づく。

上述のように、 C EZM Sにおいて、分析対象イオンのみかけの移動度は、

E O F移動度と電気泳動移動度とのベタトル和で表すことができる。一般的に、これらの値は、陽極から陰極に向かう方向を正とする。特開 2 0 0 3— 3 5 6 9 8号公報に記載の陰イオン性化合物の分析系の場合（図 1 B参照）、パイアル側を陰極および MS側を陽極としており、分析対象が陰イオン性ィ匕合物であるため、電気泳動移動度は負となる。また、 S M I L Eキヤビラリ '一を用いて E O Fを負に反転させている。その結果、分析対象イオンのみかけの移動速度は負となり、分析対象は M S側に泳動されて M Sで検出される。分析対象の電気泳動移動度の正負を変えることはできない。しかし、泳動液を入れたパイアル側を陽極および M S側を陰極とすれば、分析対象である陰イオン性化合物の電気泳動移動度は負であるが、通常のフューズドシリカキヤビラリ一における E O Fは正になる。ここで、 E O Fの絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくすれば、分析対象のみかけの移動度を正にすることができ、陰イオン性ィ匕合物を MS側に泳動させることができると考えられる。そこで、本発明は、この原理に基づいて、通常のフューズドシリカキヤピラリーを用いて、 E O F移動度の絶対値を電気泳動移動度の絶対値よりも大きくすることによって、安定な陰ィオン性化合物分析系を確立した。上記の原理に基づいて構築した、本発明の陰イオン性化合物を分離分析する方法を、図 2に示すシステムを例に挙げて、詳細に説明する。

本発明の方法に用いられる陰イオン性化合物の分離分析装置は、キヤビラリ一の出口側が陰極になるように設定されたキヤビラリ一電気泳動装置（C E) ；該 C Eで分離された試料をイオン化するためのイオン化装置；および該イオン化された試料を分析するための質量分析装置（MS ) から構成される。

C Eは、フューズドシリカキヤビラリ一；このキヤビラリ一に導入され、試料を分離するための泳動液を貯留するパイアル；該泳動液に先端が浸漬された電極；および、該電極に電圧を印加するための電源を含む。フューズドシリカキヤビラリ一の一端は、パイアル中の泳動液に浸漬され、そして他端はイオン化装置に接続されている。

本発明で用いられるフューズドシリカキヤビラリ一は、当該技術分野で通常用いられるキヤビラリ一であれば特に限定されず、市販のものを使用することができる。 E O F移動度を適切にする目的で、およびキヤピラリーの耐久性を考慮して、フューズドシリカキヤピラリーの内表面の遊離シラノール基をジメチルシロキサン処理した（すなわち、不活性処理した）キヤビラリ一が好適に用いられる。このようなキヤビラリ一は、タンパク質やペプチドをキヤピラリー H P L C、 n a n o— H P L C どで分離する際によく用いられ、不活性処理キヤビラリ一として市販されている。一般に用いられている不活性処理キヤビラリ一は、遊離シラノール基がすべて完全にジメチルシ口キシル化されているわけではなく、部分的に遊離シラノール基が残存していると思われる。そのため、本発明においては、キヤピラリーの内表面に帯電したわずかな負電荷によって、適切な E O F移動度を得ることができる。本発明で用いられる泳動液は、通常の陰イオン性ィ匕合物の分離に用いられる泳動液が用いられ得、これは電解質を含む緩衝液であり得る。 M Sに導入する際のイオン化を考慮して、揮発性の高い泳動緩衝液を用いることが好ましい。また、泳動緩衝液は、分析対象である陰イオン性化合物の p K aおよび p iを考慮して、中性〜アルカリ性であることが'好ましい。このような揮発性かつ中性〜アルカリ性の泳動緩衝液には、代表的には、酢酸アンモユウム、トリメチルァミン、トリェチルァミン、エタノールァミン、炭酸アンモニゥムなどが含まれ得る。泳動液に含まれるこのような電解質および濃度は、分析対象の陰イオン性化合物の種類に応じて、およぴ泳動液の p Hを考慮して、適宜決定され得る。通常、陰イオン性化合物の分離の場合、泳動液の p Hは、 p Hが高い方がほとんどの陰ィォン性化合物の一斉分析が可能であると考えられている（特開 2003-35698号公報）。し力し、本発明においては、泳動液の pHは、好適には 7〜11であり、より好適には 9〜1 0である。

前述のように、 CEZMSにおいては、 MSに接続した側のキヤビラリ一の先端を、電解質を含む泳動液に浸すことができない。したがって、陰ィォン性物質を C EZM Sにより分析することを目的として、泳動液を入れたバィアル側を陰極およぴ M S側を陽極とした場合には、 EOFがパイアル側に向かうため、 MS側のキヤビラリ一先端に空洞が生じる。そのため、 CEの電流が流れなくなり、泳動が中断される（図 1A参照）。本発明においては、キヤビラリ一の出口側（MS側）が陰極おょぴ入口側（バイアル側）が陽極になるように設定される。そのため、電圧をかけた場合に、キヤビラリ一における EOFは正方向（キヤピラリーの入口側から出口側へ）となる（図 2 参照）。

C Eを行う際、上記電極には通常当該技術分野で行われる程度の高電圧 (例えば、約 30kV) が印加される。電圧の印加によって電気泳動が開始され、キヤビラリ一中の陰イオン性化合物は、負方向の泳動移動度で（陽極 (入口側））に泳動する。しかし、本発明においては、 EOF移動度の絶対値が陰イオン性化合物の泳動移動度の絶対値を上回る条件で CEが行われるので、陰イオン性化合物のみかけの移動度は正になる。そのため、陰イオン性化合物はキヤビラリ一の出口へと泳動される。

EOF移動度（EOFの流速）は、泳動液の pHと電圧とに依存して変動する。 EOF移動度は、中性マーカー（例えば、グルコース）を分析対象として CEZMS分析を行うことにより測定可能である。具体的には、所定の長さのキヤビラリ一および所定の電圧下において、中性マーカーの検出時間を測定することによって、 EOF移動度（cm²V一 s-¹) を算出することができる。一方、陰イオン性化合物の泳動移動度は、各化合物の p K aおょぴ p Iと、泳動液の p Hと、電圧とに依存して変動し、これは、既知の E O F移動度となる条件下で C Eを行うことによって求めることができる。上記のようにして算出される E O F移動度およぴ電気泳動移動度をもとに、泳動液の p Hを適宜変えることによって、分析対象試料中の少なくとも 1種の陰イオン性化合物のみかけの移動度が正になるように、 E O F移動度の絶対値が陰イオン性化合物の泳動移動度の絶対値を上回る条件が決定される。なお、通常のフューズドシリカキヤピラリーを用いる場合、 E O Fは常に正であり、その流速は p Hが高くなるに従って大きくなることが知られている ( 「キヤピラリー電気泳動の基礎と実際」，本田進および寺部茂編， 1988 年，講談社サイェンティフイク）。また、上述のように、本発明においては、泳動液の p Hは、好適には 7〜 1 1である。したがって、当該技術分野で通常用いられる泳動液中の電解質濃度および印加電圧において、泳動液の p H を 7〜1 1の範囲で最適化することによって、本発明の C E/M Sに適切な条件を決定することができる。本発明においては、好適には、例えば、 3 0 k Vの電圧をかける場合、約 5 O mMの電解質を含む p H 9〜l 0の泳動液を用いることにより、上記条件を達成し得る。

分析すべき試料中に、電気泳動移動度の絶対値が E O F移動度の絶対値と同等である陰イオン性化合物が含まれている場合は、この化合物は、電気泳動によってキヤビラリ一の出口まで移動することができず、キヤピラリー内に滞留する。そこで、電気泳動の途中の適切な時点で電圧の印加を中止して、キヤピラリー内の泳動液を入口側から加圧して出口側へ送液することによつて、滞留している化合物を出口へ移動させることができる。あるいは、電圧を変化させることによって、あるいは電圧を下げかつ加圧を上げることによつて、化合物を出口へ移動させてもよい。

したがって、本発明に用いられる陰イオン性化合物の分離分析装置は、このような泳動液を加圧送液するための手段を備えていることが好ましい。加圧送液手段としては、例えば、エアーポンプが挙げられる。

CEで分離されてキヤビラリ一の出口に移動した試料は、キヤピラリー出口に接続されたィォン化装置でィオン化される。

イオン化の方法は、通常 MSにおいて行われる方法であれば特に限定されない。例えば、エレクトロスプレー法（E S I ) 、大気圧化学イオン化法 (APC I) 、高速原子衝突法（FAB) が採用され得る。

例えば、 ES Iの場合、イオン化装置には、シース液がエレクトロスプレ一に適した流量で供給され、同時に、細かい液滴を生成してイオン化を促進するためのネブライザガス（例えば、窒素ガス）が供給される。

イオン化された試料は、質量分析装置（MS)' で分析される。 MSは、通常用いられる質量分析装置が用いられ、例えば、シングルステージの四重極型、磁場型、飛行時間、イオントラップなどの種々の形式の質量分析装置、あるいはタンデム型の質量分析装置であってもよい。

本発明の方法によって分析され得る陰イオン性化合物としては、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、 Co Aィ匕合物などが挙げられる。これらの化合物は、異性体の分離分析も可能である。実施例

[実施例 1 ]

実施例 1におけるすべての CE/E S I— MS実験は、 P/ACE MDQ (Beckm an Coulter, Fullerton, CA)、 Esquire 3000 plus ion trap mass spectrom eter (Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) _N syringe pump IC3100 (Co le parmer, Illinois, USA) およぴ CE ESI sprayer (Aglient Technologie s， California, USA)を用いて行った。 CEの制御は、 32 Karat software (Beckman Coulter)を用い、 MSの制御およびデータ取得は、 Esquire Contr ol 5.1 (Bruker Daltonics)を用い、そしてデータ解析は、 Data Analysis 3. 1 (Bruker Daltonics)を用いて行った。

実施例 1を行うにあたって、分析に初めて使用するキヤビラリ一は、泳動液を 30 p s i (2. l b a r) 、 60分の条件で送液することにより洗浄 'した。各分析において、キヤビラリ一に試料を注入する前には、キヤビラリ一に泳動液を 30 p s i. (2. l b a r) 、 10分の条件で送液し、平衡ィ匕を行った。試料の注入は、 2. O p s i (0. 14 b a r ) の圧力で 5秒間行った（約 6 nL) 。

電気泳動は、パイアル側を陽極およぴ M S側を陰極に設定し、キヤビラリ一の両端に 3 O kVの電圧を掛けた。電圧印加開始から設定した電圧値に達するまでに要する時間（ランプ時間）は 0. 30分とした。電気泳動時に、キヤピラリーには 22. 5〜23, 0 μ Aの電流が流れ、電力は 0. 68W であった。キヤビラリ一の温度は 20°Cに保った。シース液として、 5mM 酢酸アンモニゥムを含む 50%(v/v)メタノール水溶液を用い、シリンジポンプにより 5 /Z L/分の流速でイオン化室に送液した。

ES I— MSはネガティブイオンモードで検出を行った。 MSのパラメ一ターは以下の通りである：ターゲットマス、 mZz 1 50 ;スキャン範囲、 mZz = 50〜： L 000 ；スキャン速度、 13, 000 niZ z Z sの標準スキャン分解能；ネブライザガス、 6. O p s i , ドライガス流速、 4. 0 L ノ分；ドライガス温度、 300。C；キヤビラリ一電圧、 4. 0 kV₀

実施例 1において分析に供した試料としての陰イオン性化合物を、以下の表 1に示す。各化合物のストック溶液は純水を用いて、 10 OmMの濃度に調製した。分析用試料は、これらのストック溶液を適宜混合し、純水で希釈して用いた。表 1

(実施例 1一 1 )

50μηι i. d. X 100cmの通常のフューズドシリカキヤビラリ一（GL sciences Inc.) を用いた。パイアル側を陽極おょぴ MS側を陰極に設定した。泳動液は、特開 2003— 35698号公報に記載の方法に従って 50 mM酢酸アンモニゥム（pH9. 0) を用いた。

種々の陰イオン性化合物について、上記の条件下で CE/ES I— MSを行った結果、 EOFは MS側に流れることにより、電気泳動が成立し、ほとんどの陰ィォン' I"生化合物が検出できた。キヤビラリ一の内表面に特殊なコ一ティングを施す必要がないため、キヤビラリ一の品質にばらつきが少なく、安定した結果を得ることができた。

し力し、共溶出する化合物が存在し、一部イオン化サブレッシヨンにより検出が困難になる場合もあった。また、グルコース 1一リン酸、グルコース 6—リン酸、フルクトース 6—リン酸などの異性体の分離は不十分であり、これらを区別することが困難であった。さらに、クェン酸、イソクェン酸などの多価有機酸を検出することができなかった。このように、検出が良好でない原因としては、 E O Fが早すぎるため、.十分に分離しないうちに M Sに分析対象化合物が到達すること、異性体間の電気泳動移動度の差が小さすぎることなどが考えられる。

(実施例 1一 2 )

通常のフューズドシリカキヤビラリ一の代わりに、フューズドシリカキヤピラリーの内表面をジメチルシロキサン処理しナこキヤビラリ一（50 /z m i. d. X 100cm, GL sciences Inc. ) を用いたこと以外は、上記実施例 1一 1と同様に C E/ E S I—M Sを行った。ジメチルシロキサン処理したキヤビラリ一では、その内表面の極性が低くなり、ゼータ電位（電気二重層における滑り面と液体内部の電位との差）が小さくなり、 E O Fをある程度遅くすることができると予想される。

分析時間は長くなったが、各陰イオン性化合物の分離が大きく向上した。実施例 1—1では共溶出したグルコース 1—リン酸、グルコース 6—リン酸、フルクトース 6—リン酸などが分離し、異性体の分離も可能になった。また、電流値が落ちるということはなく、上記実施例 1一 1で用いた通常のフューズドシリカキヤビラリーと同様に、安定して結果が得られた。

(実施例 1— 3 )

通常のフューズドシリカキヤビラリ一の代わりに、フューズドシリカキヤピラリーの内表面をジメチルシロキサン処理したキヤビラリ一（50 / m i. d.

X 100cm, GL sciences Inc. ) を用い、そして泳動液と,して酢酸アンモニゥム（pH9. 0) の代わりに 5 OmM酢酸 +92 mMトリメチルァミン（p H9. 4) を用いたこと以外は、上記実施例' 1一 1ど同様に CE/ES I— MSを行った。

その結果、陰イオン性化合物の分離が全体的に向上し、特に、リブロース 5—リン酸とリボース 5—リン酸、あるいはグルコース 1—リン酸、ダルコース 6—リン酸、フルクトース 6—リン酸などの異性体の分離が向上した。これは、アンモニゥムイオンよりもかさ高いトリメチルァミンがこれらの陰イオン性ィヒ合物を取り囲むため、異性体の構造の相違が強調され、異性体間の電気泳動移動度の差が大きくなつたためと考えられる。

一方、フルクトース 1, 6—ビスリン酸、フルクトース 2， 6 -ビスリン酸、クェン酸、イソクェン酸などの分子量が小さくかつ極性の非常に高い化合物は検出ができなかった。これは、 EOF移動度よりも電気泳動移動度の絶対値のほうが大きいため、 M S側ではなく、パイアル側に移動じてしまつたためと考えられる。

(実施例 1一 4)

次に、電気泳動を行うと同時に、エアーポンプでキヤビラリ一の入口側に 0. 5 p s i (34mb a r) の圧力を掛けて補助的に送液を行う条件で、上記実施例 1— 3と同様に C E/E S I一 MSを行った。

その結果、リブロース 5—リン酸とリボース 5—リン酸、あるいはダルコース 1一リン酸、グルコース 6—リン酸、フルクトース 6—リン酸などの異性体は分離可能であり、そしてフルクトース 1 , 6—ビスリン酸、フルクトース 2, 6—ビスリン酸、クェン酸、イソクェン酸などの検出も可能であつた。しかし、後者の化合物の検出時間は遅く、それまでに拡散が起こってピ一クが非常にブロードになつた。 (実施例 1— 5 )

次に、電気泳動の途中で電圧を落とし、それ以降は、単にエアーポンプで送液する手法で、 C E/E S I一 MSを行った。上記実施例 1一 4と同様に、ジメチルシロキサン処理したフューズドシリカキヤビラリ一（50μπι i. d. X 100cm) およぴ泳動液として 50 mM酢酸、 92 mMトリメチルァミン H9. 4) を用い 0. 5 p s iで補助的に送液しながら 30分間電気泳動を行い、その後電圧を落としてエアーポンプのみで 1. 5 p s i (0. 10 b a r ) にて 20分間送液した。結果を図 3に示す。なお、 CE/MSに供した各化合物の濃度は 100 Mである。

図 3からわかるように、種々の陰イオン性ィ匕合物が非常に良好に分離され、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、 C o Aなどの 51種の陰ィオン性化合物の一斉分析が可能となった。このようなエアーポンプを補助的に用いる方法は、エアーポンプの圧力の調整を自由に行うことができるので、分離.検出時間の微妙な調整を容易に行うことが可能である。

[実施例 2]

本実施例 2における CE/E S I— MS実験は、選択性おょぴ感度を向上させるために、三連四重極リニアトラップ型質量分析計である 4000 QTRAP (Applied Biosystems, Inc. Foster City, CA， USA) を用いて行った。この質量分析計は、 multiple reactions monitoring (MRM) が可能である。これは、 3つ直列に並んでいる 1番目の四重極で、ある特定の mZzを有するイオン（Precursor ion) のみを通過させ、 2番目の四重極で衝突誘起解離 (Collision-induced dissociation) を行い、発生したフラグメントィォンを 3番目の四重極に導き、その中で、特徴的なイオン（Product ion) のみを通過させるという検出方法である。これによりノイズを取り除き。目的の化合物をより選択的に検出することができる。 CEとのインターフェイス部分は、 Turbo V™ ion sourceおよび CE/MS kit (ともに Applied Biosystems)を用いて接続した。また、質量分析計の制御、テータ取ネ导、およびテータ角军析は、 Analyst software (Applied Biosystem s) を用いて行った。

本実施例 2では、 CEに 50//m i. d. X80cmの通常のフューズドシリカキヤピラリー（GL sciences Inc.) を用いた。キヤビラリ一は、泳動液を 30 p s i (2. l b a r) 、 60分の条件で送液することにより予め洗浄した。泳動液は、 50mM酢酸、 85 mMトリェチルァミン（pH9. 4) を用いた。各分析において、キヤビラリ一に試料を注入する前には、キヤビラリ一に泳動液を 30 p s i (2. l b a r) 、 5分の条件で送液し、平衡化を行つた。試料の注入は、 2. O p s i (0. 14 b a r) の圧力で 5秒間行つた（約 6 n L) 。

電気泳動は、ノアル側を陽極および MS側を陰極に設定し、キヤビラリ一の両端に 30 kVの電圧を掛けた。電圧印加開始から設定した電圧値に達するまでに要する時間（ランプ時間）は 0. 30分とした。電気泳動時に、キヤピラリーには 22. 5〜23. 0 μ Aの電流が流れ、電力は 0. 68W であった。キヤビラリ一の温度は 20°Cに保った。 0、 7 p s i (20. 4 b a r) で捕助的に送液しながら 1 7分間電気泳動を行い、その後電圧を落としてエアーポンプのみで 3. 0 p s i (0. 21 b a r ) にて 8分間送液した。シース液として、 5mMギ酸アンモニゥムを含む 50%(v/v)ァセト二トリル水溶液を用い、シリンジポンプにより 10 μ LZ分の流速でイオン化室に送液した。

ES I— MSはネガティブイオンモードで検出を行った。 MSのパラメ一ターは以下の通りである：ネプライザガス、 15. 0 p s i、ドライガス流速、 5. 0 L /分；ドライガス温度、 0°C；イオンスプレー電圧、 0. O k V (0〜1. 0分）および一 4. 5 k V (1. 0分〜）；スキャン、 multip le reactions monitoring (MRM) 。

(実施例 2— 1)

以下の表 2に示す種々の化合物を、純水に溶解し、各化合物の濃度が 10 Ο μΜとなるように調製した標準物質混合溶液を、上記の条件で分析した。表 2には、ピーク同定および MRMにおける precursor ionおよび product i on ionの mz zもす。

表 2

結果を図 4に示す。図 4からわかるように、各化合物が非常に良好に分離され、糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、 C o Aなどの 44種の陰イオン性化合物の一斉分析が可能であった。 (実施例 2 - 2 )

モデル植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana) の培養細胞 T 87 (理化学研究所パイオリソースセンター（筑波））を、改変 Mu r a s h i g e a n d S k o o g (MS) 培地（通常の MS培地（Murashig e， T.および Skoog, F.、 rphysiol. Plant. J , 1962年， 15卷， pp.473-49 7) に 20 Omg/Lの二水素リン酸カリウム、 l O OmgZLの my o— イノシトール、 lmgZLのニコチン酸、 lmg/Lのピリドキシン塩酸塩、 1 OmgZLのチアミン塩酸塩、 0. 2mgZLの 2， 4ージクロロフエノキシ酢酸、および 3% (w/v)のスクロースを添加した培地）中で、 23 にて連続光照射下（50 μ mo 1 · m— ² · s 、 130 r p mの条件で培養した。培養細胞を、吸引ろ過により培地から分離した。水洗後、 2mLェッペンドルフチューブに湿重量 10 Omgの細胞を取り分け、ジルコ二アポ一ルを加え、ボールミル (Retsch model 醒 301： Hann, Germany) を用いて 20 s ¹で 1分間凍結破碎を行った。破砕後、メタノール 500 Lと内部標準溶液（リビトールおよび P I P E S、各濃度 100 の水溶液） 20 /z Lとを加え、 37 °Cにて 30分間抽出を行い、水で希釈後，固相抽出により、脂質、タンパク質、ァミン、およびアミノ酸を取り除いたサンプルを得た。このサンプルを、上記の条件で CEZE S I— MS分析した。

結果を図 5に示す。図中の各ピークの番号は、上記表 2に示す化合物と同様である。

図 5からわかるように、上記の分析方法によれば、標準物質の混合物だけでなく細胞から抽出物についても、種々の陰イオン性の代謝産物を一斉分析することができた。産業上の利用可能性

本発明によれば、陰ィォン性化合物の分析に用いられる通常の C Eの系とほ電極の極性を逆転させているため、分析途中で C Eの電流が流れなくなる減少がなく、安定して分析を行うことができる。さらに、特殊なキヤビラリ一ではなく、一般的なフューズドシリカキヤビラリ一を用いることができるため、安価に分析することができる。さらに、本発明によれば、 C Eと C E 後の加圧送液とを組み合わせることにより、今まで同時に分析を行うことが困難だった糖リン酸、有機酸、ヌクレオチド、 C o A化合物などの陰イオン性化合物を、一斉分析することが可能となる。したがって、本発明の方法は、メタポローム解析の新たな必須技術となり得る。

Claims

請求の範囲

1 . キヤビラリ一電気泳動と質量分析とを組み合わせて陰イオン性化合物を分離分析する方法であって、

泳動液で満たされたキヤビラリ一の泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定し、該キヤビラリ一に電圧を印加して陰イオン性化合物を含む試料を電気泳動する工程であって、該電圧の印加により発生する電気浸透流の移動度の絶対値が、該試料中の少なくとも 1種の陰イオン性化合物の電気泳動移動度の絶対値を上回るような条件で該電気泳動を行う、ェ程；および

- 該キヤビラリ一の出口まで泳動された該試料中の陰イオン性化合物を質量分析する工程；

を含む、方法。

2 . 前記キヤビラリ一が、内表面が予め不活 1"生処理されているフューズドシリカキヤビラリ一である、請求項 1に記載の方法。

3 . 前記泳動液の p Hが 8から 1 1である、請求項 1または 2に記載の方法。

4 . 前記泳動液が、酢酸アンモニゥム、トリメチルァミン、トリェチルアミン、エタノールァミン、および炭酸アンモニゥムからなる群より選択される少なくとも 1種を含む、請求項 3に記載の方法。

5 . 前記電気泳動して質量分析する工程中または該工程後に、該電圧の印加を中止して、該キヤビラリ一内の該泳動液を該出口側へ加圧送液し、該キヤピラリーの出口まで移動した試料を質量分析する工程、をさらに含む、請求項 1から 4のいずれかに記載の方法。

6 . キヤビラリ一の出口側が陰極になるように設定されたキヤビラリ一電気泳動装置；

該キヤピラリー電気泳動装置で分離された試料をイオン化するためのィォン化装置；および

該イオン化された試料を分析するための質量分析装置；

を備えた、陰イオン性化合物の分離分析装置。

7 . 前記キヤビラリ一が、内表面が予め不活性処理されているフューズドシリカキヤビラリ一である、請求項 6に記載の分離分析装置。

8 . さらに、前記キヤピラリー内の泳動液を該出口側に加圧送液するための手段を備える、請求項 6または 7に記載の分離分析装置。

9 . 泳動液で満たされたキヤビラリ一において、該泳動液の入口側を陽極および出口側を陰極となるように設定された、陰イオン性化合物の分離装置。