WO2006133691A1 - Verfahren zur bestimmung und beeinflussung der fertilität männlicher säugetiere und des menschen - Google Patents

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WO2006133691A1
WO2006133691A1 PCT/DE2006/001033 DE2006001033W WO2006133691A1 WO 2006133691 A1 WO2006133691 A1 WO 2006133691A1 DE 2006001033 W DE2006001033 W DE 2006001033W WO 2006133691 A1 WO2006133691 A1 WO 2006133691A1
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sperm
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inhibitor
fertility
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PCT/DE2006/001033
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Ingrid Boekhoff
Thomas Gudermann
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Philipps Universität Marburg
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    • G01N2800/367—Infertility, e.g. sperm disorder, ovulatory dysfunction

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the fertility of male mammals and humans, a method of contraception, and a method for increasing the fertility of male mammals and humans.
  • the taste receptor subtype T1 R3 in the acrosome region of various mammalian sperm i. in the vesicular cap in the head area of the sperm, which plays an important role in preparing for the actual fusion of the sperm with the egg.
  • this receptor plays an important role in the pathfinding of sperm to fertilizable oocytes and the initiation of the fusion process between sperm and egg cells.
  • the T1R3 receptor is an indicator of male mammalian and human fertility. This was unexpected because the T1 R3 receptor was previously only characterized as a taste receptor.
  • the amino acid sequences of the T1 R3 receptor expressed in various mammalian species are known and disclosed, for example, in WO 03/001 876 A2 and US 2004/0 219 632 A1. From the amino acid sequences, it can be deduced that the T1 R3 receptor is an approximately 850 amino acid protein with seven transmembrane helices and a long N-terminal domain.
  • T1R3 receptor gene transcription of the T1R3 receptor gene was observed in the testis, thymus, and brain, but the transcripts were shorter than those of taste-containing tongue tissue.
  • the nucleotide sequence of the human T1 R3 receptor is described in US 2004/01 320 775 A1 and US 2004/0 219 632 A1.
  • a heterologous expression method for the human T1 R3 receptor is known, for example, from US 2004/0 191 862 A1.
  • the invention there is now provided a method for determining the fertility of male mammals and humans, in which the content of T1 R3 receptors in spermatozoa of the subject to be examined is determined in vitro. Since the method according to the invention can be easily standardized, it can be used both in human medicine, in particular in the monitoring of in vitro fertilizations or in fertilization diagnoses and fertilization assessments, as well as in modern animal breeding.
  • the quantification of the T1 R3 receptor content in sperm is preferably carried out by comparing determined measurement data with a reference value.
  • the reference value is usually a normal T1R3 receptor value in sperm. This is determined, for example, from comparison curves or comparison tables, or used in the form of comparison values.
  • it is determined in parallel to the analysis of the sample of the individual to be examined by analysis of a reference sample having a defined content of recombinantly expressed or derived from HEK cells T1 R3 receptor. In the latter case, systematic errors in the performance of the determination can be excluded. If the content of T1 R3 receptor of the sample is below the value of the reference sample, this is an indication of lack of sperm fertility.
  • the determination of T1 R3 receptor content by detection of the T1 R3 receptor transcript in the sperm by polymerase chain reaction can be carried out with testis-isolated chromosomal DNA as template DNA and suitable primers. The latter are adapted for amplification of a nucleic acid sequence comprising at least part of the gene region coding for the T1 R3 receptor in the DNA.
  • the PCR product is analyzed, for example by sequencing, for agreement with a sequence that codes the functional T1 R3 receptor.
  • RT-PCR is performed using first total RNA or mRNA Testis of the individual to be examined is isolated. This is then rewritten with reverse transcriptase in cDNA and the latter subjected to a PCR with suitable primers.
  • two or more primers are used in the RT-PCR which are adapted to amplify a nucleic acid sequence comprising at least part of the gene region coding for the T1R3 receptor in the DNA
  • Reliable results are obtained, in particular, when a quantitative PCR or quantitative RT-PCR is carried out, with a real-time PCR using fluorescence-labeled probes or using fluorescent substances intercalating into the PCR products formed being particularly suitable Has.
  • Suitable systems for this include the LightCycler ® real-time PCR system and the Taqman ® - System from Roche.
  • the quantitative PCR can also be carried out with any other method known to the skilled person for this purpose.
  • the determination of T1 R3 receptor content in sperm is by immunological methods directed against proteins.
  • immunocytochemical methods determination by radioimmunoassay (RIA) or determination by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) have proven to be particularly suitable.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Receptor is abandoned.
  • the antibody binds to the sample immobilized on the surface.
  • the surface is finally detected with a second secondary antibody (commercially available) which detects the T1 R3 receptor antibody and which is coupled with an enzyme, for example an alkaline phosphatase or peroxidase.
  • an enzyme for example an alkaline phosphatase or peroxidase.
  • the sample is finally added to a colorless or non-fluorescent substrate for the enzyme bound to the second antibody.
  • This enzyme converts the substrate to a colored or fluorescent product whose concentration can be determined by a suitable detector, for example a photometer.
  • the same steps as in the ELISA method take place in the RIA method, except that instead of a second antibody conjugated with a suitable enzyme, a radioactively labeled second antibody is used.
  • the quantitative detection takes place in this case, for example by means of a scintillation counter.
  • the sperm of the individual to be examined are preferably fixed on a suitable surface and incubated after subsequent blocking of the remaining surface sites with a T1 R3 receptor-specific antibody. Thereafter, the bound first antibody is treated, for example, with a commercially available FITC-conjugated anti-rabbit IgG and visualized for fluorescence microscopy before being detected by fluorescence microscopy, as shown in FIG.
  • This method not only determines the amount of T1 R3 receptor, but also its exact location in the sperm of the individual to be examined.
  • the determination of the T1R3 receptor content in sperm can also be quantified with other immunological methods known to those skilled in the art, merely mentioning, for example, the "Western Blof method” or the "Dot blot method”.
  • the determination of the T1 R3 receptor content in the sperm or their reactivity takes place by isolating sperm isolated from the individual to be examined with one or more flavorings, ie the natural binding partners of the T1R3 receptor, be contacted and stimulated.
  • flavorings ie the natural binding partners of the T1R3 receptor
  • sweeteners such as the naturally occurring sugars sucrose, glucose, maltose, galactose, lactose and fructose and the synthetically produced compounds acesulfame K, saccharin. Aspartame, dulcine, cyclamate and SC-45647.
  • Sweeteners also include guanidine-1-acetic acid (GA-D, guanidine-2-acetic acid (GA-2), glycyrrhizic acid (GA), neohesperidin dihydrochalcone and also proteinaceous sweeteners such as preferably monellin, thaumatin, mabinlin, pentadine, brazzein, Curculin and miraculin
  • at least one amino acid, or preferably an amino acid selected from the group consisting of glutamate, L-alanine, L-proline, L-serine, L-aspartate, L-asparagine, L-arginine and combinations thereof, or their derivatives use appropriate salt, especially alkali or alkaline earth salt as a flavor and stimulant for the T1 R3 receptor in sperm After contacting, so after binding of the flavor to a designated binding site on the T1 R3 receptor, the cytosolic calcium concentration in the sperm with the help of membrane-permeable calcium-sensitive
  • the determination of the content of intact T1 R3 receptor in the sperm is carried out by determining the taste profile of male mammals or preferred by men, for example, by means of the "two-bottle preference test" or other taste tests.
  • These methods for determining the threshold values for certain flavorings (production of a taste profile) are known to the person skilled in the art (Feigin et al., Neurosci Biobehav Rev.11, pp 231- 240, 1987, Ruiz et al., Chemical Senses, 28, pp, 573-579, 2003) and are routinely used for mammals and humans.
  • the threshold value of one or more flavorings of the individual to be examined is determined.
  • the method according to the invention can be carried out both for medical and for non-medical purposes.
  • Another object of the present invention is a method for contraception in mammals and humans, in which a male mammal or a human at least one inhibitor for the T1 R3 receptor is administered.
  • Inhibitors according to the invention are substances that interact with the T1R3 receptor and make it difficult or completely prevent the attachment of flavorings to it (competitive and non-competitive antagonists). Especially good results are obtained with a compound selected from the group consisting of lactisole, gurmarine, cyclohexylacetic acid, indoleacetic acid and combinations thereof. Also derivatives of these compounds are among the inhibitors. Likewise, one or more members of a group of compounds capable of binding tightly to sweet-taste receptors are administered.
  • Each inhibitor may be administered separately, in combination with one or more further inhibitors and / or together with pharmaceutically acceptable excipients, ie as a pharmaceutically acceptable composition, wherein the ratio of inhibitor to carrier is determined by the solubility or chemical nature of the inhibitor the chosen route of administration and / or by procedures common in the pharmaceutical practice.
  • Pharmaceutically acceptable compositions may also include the inhibitor (s) in the form of a salt, ester, amide, or prodrug, that is, inactive inhibitor precursor
  • they include ointments, powders, sprays, or inhalants by mixing the inhibitor under sterile conditions with a physiologically acceptable carrier and possible coloring and flavoring agents, buffers or propellants, as needed.
  • the administration of the inhibitor or its pharmaceutically acceptable composition is preferably carried out orally, sublingually, rectally, parenterally, intracisternally, intrathecally or intravesically (by instillation into the bladder).
  • parenteral administration is intravascular, for example intravenous administration (with a syringe into a vein), an intramuscular injection (into a skeletal muscle), a subcutaneous injection (under the skin), a transdermal administration (eg with a "plaster") , an intragenital administration into the genital organ, an intrapulmonary administration (as aerosol or injection), an intraperitoneal injection (into the abdominal cavity), an intracardiac injection (into the heart) or an application to the mucous membranes (eg the genital mucosa, the nasal mucosa or locally on the conjunctiva), or locally as powder, ointment, drops or in spray form (aerosol) preferably in the genital area.
  • Parenterals include injections, infusions, powder for solution preparation, concentrates and implants.
  • pregnancies can be prevented simply and reliably without fear of side effects in the treated individuals.
  • conventional contraceptive methods such as hormonal contraceptive methods for women using, for example, estrogens or gestagens, or hormonal ones Contraceptive methods for men based on testosterone, progestin and etonogestrel, which are each associated with significant side effects, offers the inventive contraceptive method considerable advantages. It is cheaper compared to the known methods of contraception, shows almost no side effects and is very reliable.
  • the method according to the invention can be carried out both for medical and for non-medical purposes
  • the present invention relates to the use of an inhibitor of the T1 R3 receptor for contraception in mammals and humans. As those skilled in the art will appreciate, use may be for both medical and non-medical purposes.
  • a further subject of the present invention is a method for increasing the fertility of male mammals or of humans, in which a male mammal or human is administered at least one ligand potentiating recognition of the T1R3 receptor, in particular a positive allosteric modulator.
  • Potentating ligands according to the invention are molecules which bind to a binding site of the T1 R3 receptor, which is arranged at a distance from the binding site for flavorings or inhibitors. With the receptor interacting potentiating üganden cause this has an even greater affinity for flavorings or inhibitors and / or binds even more tightly.
  • a selected from the group consisting of monophosphates, in particular of inosine monophosphate (IMP) and guanosine monophosphate (GMP) and combinations thereof selected ligand provides particularly good results. Also derivatives of these monophosphates are among the potentiating ligands.
  • Each potentiating ligand may be administered separately, in combination with one or more other ligands and / or together with pharmaceutically acceptable carriers, that is, as a pharmaceutically acceptable composition, wherein the ratio of ligand to carrier is determined by the solubility or chemical nature of the ligand, by the selected dosing and / or determined by methods generally used in pharmaceutical practice.
  • compositions may also contain the ligand or ligands in the form of a salt, ester, amide or as a "prodrug", ie as an inactive ligand precursor
  • a prodrug ie as an inactive ligand precursor
  • composition is obtained by mixing the ligand (s) under sterile conditions with a physiologically acceptable carrier and possible coloring and flavoring agents, buffers or propellants, as needed.
  • the administration of the ligand or the pharmaceutically acceptable composition is preferably carried out orally, sublingually, rectally, parenterally, intracistemally, intrathecally or intravesically (by instillation into the bladder).
  • parenteral administration is preferably preferably supplied parenterally.
  • parenteral administration are: an intravascular, for example intravenous administration (with a syringe into a vein), an intramuscular injection (into a skeletal muscle), a subcutaneous injection (under the skin), a transdermal administration (eg with a "plaster") ), intragenital administration to the genital organ, intrapulmonary administration (by aerosol or injection), intraperitoneal injection (into the abdominal cavity), intracardiac injection (to the heart), or mucosal application (eg, to the genital mucosa, Nasal mucosa or locally on the conjunctiva), or locally as a powder, ointment or drop or in spray form (aerosol) preferably in the genital area.
  • Parenterals include injections, infusions, powder for solution, concentrates and implants.
  • the present invention relates to the use of a T1 R3 receptor potentiating ligand, in particular a positive allosteric modulator for increasing the fertility of male mammals and humans. As those skilled in the art will recognize, use may be for both medical and non-medical purposes.
  • Fig. 1 is an agarose gel with the PCR products obtained in Example 1 and
  • Example 2 shows an immunocytochemical detection of the T1 R3 receptor in isolated sperm of the mouse according to Example 2.
  • RT-PCR was performed with mouse testicular tissue and tissue of circumvallate taste papillae as positive control (CV).
  • RNA from mouse testicular cells and total RNA from circumvallated taste papillae of a mouse were first isolated using a standard molecular biological method. Subsequently, the RNA of both samples was separated into cDNA by hybridizing the samples with an oligo dT primer or "random" hexamer primer and incubated with reverse transcriptase after addition of a deoxynucleotide mixture, after which a subset of the thus obtained Samples were amplified by PCR with a primer pair specific for the T1 R3 receptor before each of a subset of the resulting amplification products was spiked with DNA sample buffer and electrophoresed in an agarose gel.
  • T1 R3 receptor specific primer pair a mouse was specific T1 R3 primer pair used with the sequence 5 'GCT TGA GGG CAA ACT GGC TA 3 x as kodierendem or sense primers, and the sequence 5 * TCT TGG CAT TCC TTC CCA GG 3 v as a non-coding or antisense primer.
  • the PCR reaction was carried out for one minute at an annealing temperature of 60 ° C in a total volume of 50 ⁇ l. This contained 20-100 ng mouse cDNA, 0.4 ⁇ M of each primer, 0.4 mM dNTP, 1.5 mM MgCl 2 and 2.5 U Taq DNA polymerase (Master Taq Kit, Eppendorf, Hamburg).
  • a standard molecular weight marker was placed on the far left of the agarose gel.
  • the sperm were fixed with ice-cold methanol on a microscope slide and after subsequent blocking with PBS / 10% FCS incubated with a T1 R3 receptor-specific antibody at 4 ° C overnight.
  • the T1 R3 specific antibody is directed against the amino acid sequence 239-254 of the T1 R3 mouse receptor (Damek et al., Science, 301, pp. 850-853, 2003).
  • the T1 R3-specific antibody against the human receptor used recognizes the amino acid sequence 829-843 (Damek et al., Science, 301, pp. 850-853, 2003).
  • FIGS. 2A and B show at the top left a core coloration with propidium iodide, the image shown next to it shows the corresponding transmitted light image; below, on the left, the labeling of the T1 R3 receptor can be seen by detection with the FITC-labeled antibody.
  • the illustration at the bottom right shows the superimposition of all three single shots. It can be seen that the T1 R3 receptor is located exclusively in the acrosome area of the sperm.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und Menschen, ein Verfahren zur Empfängnisverhütung sowie ein Verfahren zur Erhöhung der Fertilität männlicher Säugetiere und Menschen. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Inhibitors für den T1 R3- Rezeptor zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren und Menschen sowie die Verwendung eines potenzierenden Liganden für den T1 R3-Rezeptor zur Erhöhung der Fertilität von männlichen Säugetieren und Menschen.

Description

Verfahren zur Bestimmung und Beeinflussung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen, ein Verfahren zur Empfängnisverhütung sowie ein Verfahren zur Erhöhung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen.
Fruchtbarkeit bzw. Fertilität ist eine der wichtigsten Voraussetzungen dafür, dass sich Organismen entwickeln und immer neu reproduzieren können. Aus diesem Grund sind Fertilitätsbestimmungen männlicher Säuger und die Erhöhung deren Fertilität von zentraler Bedeutung für den Prozess der Reproduktion.
Zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen sind eine Reihe an Standardverfahren bekannt, die häufig auf einer Erfassung der Morphologie der Spermienzellen des zu untersuchenden Individuums, der Erfassung der Spermienkonzentration und/oder der Erfassung der Spermienmotilität basieren. Allerdings sind die Bewertungskriterien einiger dieser Tests relativ ungenau. Zudem kann ein Teil von ihnen nur in der präovulatorischen Phase durchgeführt werden. Beim Sims-Huhner1 Test beispielsweise wird 2 bis 6 Stunden nach der Kohabitation Schleim aus dem Gebärmutterhalskanal entnommen, und auf das Vorhandensein und die Anzahl beweglicher Spermien untersucht. Finden sich im Zervixschleim reichlich bewegliche normale Spermien, wird der Test als positiv bewertet, d.h. das Sperma des Mannes ist wahrscheinlich als fertil anzusehen, und es liegt keine funktionelle zervikale Störung vor.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen zur Verfügung zu stellen, welches einfach durchzuführen ist und Rückschlüsse auf die Fertilität des untersuch- ten Individuums zulässt. Ferner wird angestrebt, ein Verfahren zur Erhöhung der Fertilität männlicher Säugetiere bereitzustellen, sowie ein Verfahren zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren. Alle Verfahren sollen zudem den biologischen und hormonellen Haushalt eines Individuums möglichst wenig beeinflussen. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch den kennzeichnenden Teil der Ansprüche 1 , 14 und 20 sowie durch die Ansprüche 19 und 25 gelöst.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde herausgefunden und nachgewie- sen, dass der Geschmacksrezeptor-Subtyp T1 R3 im Akrosomenbereich verschiedener Säugerspermien, d.h. in der vesikulären Kappe im Kopfbereich der Spermien, dem eine wichtige Funktion bezüglich der Vorbereitung für die eigentliche Fusion des Spermiums mit der Eizelle zukommt, vorkommt.
Dieser Rezeptor spielt nach ersten Erkenntnissen eine wichtige Rolle bei der Wegfindung der Spermien zu befruchtungsfähigen Eizellen und der Einleitung des Fusionsprozesses zwischen Spermien und Eizellen. Nach den bis jetzt erhaltenen Ergebnissen der vorliegenden Erfindung ist der T1 R3-Rezeptor demnach ein Indikator für die Fertilität männlicher Säugetiere und des Menschen. Dies war insbe- sondere deshalb unerwartet, weil der T1 R3-Rezeptor bisher nur als Geschmacksrezeptor charakterisiert wurde.
Die Aminosäuresequenzen des in verschiedenen Säugerspezies exprimierten T1 R3-Rezeptors sind bekannt und beispielsweise in der WO 03 / 001 876 A2 und US 2004 / 0 219 632 A1 offenbart. Aus den Aminosäuresequenzen lässt sich ableiten, dass es sich bei dem T1 R3-Rezeptor um ein etwa 850 Aminosäuren umfassendes Protein mit sieben Transmembranhelices und einer langen N- terminalen Domäne handelt. Aus der US 2004 / 0 185 469 A1 , der US 2004 / 0 175 793 A1 , der US 2004 / 0 191 862 A1 und der WO 03 / 001 876 A2 ist bekannt, dass der T1 R3-Rezeptor in Verbindung mit dem T1 R2-Rezeptor einen Geschmacksrezeptor für süße Kohlenhydrate, künstliche Süßstoffe sowie süße Proteine bildet, wohingegen der T1 R3-Rezeptor in Verbindung mit dem T1 R1 -Rezeptor einen Rezeptor für Umami-Geschmack (Glutamat) ergibt. Zudem wurde in der US 2004 / 0 219 632 A1 die Expression des T1 R3-Rezeptors in Geschmackspapillen umfassendem Zungengewebe nachgewiesen, wohingegen Zungengewebe ohne Geschmackspapillen diesen Rezeptor nicht exprimiert. Daneben wurde die Transkription des T1 R3-Rezeptor-Gens in Hoden, Thymus und im Gehirn beobachtet, wobei die entsprechenden Transkripte jedoch kürzer waren als jene aus Geschmackspapillen enthaltendem Zungengewebe. Ferner wird die Nukleotidsequenz des humanen T1 R3-Rezeptors in der US 2004 / 01 320 775 A1 und der US 2004 / 0 219 632 A1 beschrieben. Ein heterolo- ges Expressionsverfahren für den humanen T1 R3-Rezeptor ist beispielsweise aus der US 2004 / 0 191 862 A1 bekannt. Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und Menschen bereitgestellt, bei dem der Gehalt an T1 R3-Rezeptoren in Spermien des zu untersuchenden Individuums in vitro bestimmt wird. Da sich das erfindungsgemäße Verfahren einfach standardisieren lässt, kann es sowohl in der Humanmedizin, insbesondere bei der Überwachung von in wϊra-Fertilisationen oder bei Fertilisationsdiagnosen und Fertilisationsgutachten, als auch im Rahmen der modernen Tierzucht eingesetzt werden.
Vorzugsweise erfolgt die Quantifizierung des T1 R3-Rezeptor-Gehaltes in Spermien, indem ermittelte Messdaten mit einem Referenzwert verglichen werden. Auf diese Weise können zuverlässige Rückschlüsse auf die Fertilität der untersuchten Individuen gezogen werden. Als Referenzwert wird üblicherweise ein T1R3- Rezeptor-Normalwert in Spermien herangezogen. Dieser wird beispielsweise aus Vergleichskurven oder Vergleichstabellen ermittelt oder in Form von Vergleichswerten zugrunde gelegt. Vorzugsweise bestimmt man ihn parallel zur Analyse der Probe des zu untersuchenden Individuums und zwar durch Analyse einer Referenzprobe, die einen definierten Gehalt an rekombinant exprimiertem oder aus HEK Zellen gewonnenem T1 R3-Rezeptor aufweist. In dem letztgenannten Fall können systematische Fehler bei der Durchführung der Bestimmung ausgeschlossen werden. Liegt der Gehalt an T1 R3-Rezeptor der Probe unterhalb des Wertes der Referenzprobe, ist dies ein Hinweis auf mangelnde Fertilität der Spermien.
Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts durch Nachweis des T1 R3- Rezeptor-Transkripts in den Spermien mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Prinzipiell kann die PCR mit aus Hoden isolierter chromosomaler DNA als Matrizen-DNA und geeigneten Primern durchgeführt werden. Letztere sind an eine Amplifikation einer zumindest einen Teil des den T1 R3-Rezeptor kodierenden Genbereichs in der DNA umfassenden Nukleinsäuresequenz angepasst. Im An- Schluss an die PCR wird das PCR-Produkt, beispielsweise durch Sequenzierung, auf Übereinstimmung mit einer den funktionsfähigen T1 R3-Rezeptor kodierenden Sequenz analysiert.
Um jedoch zuverlässigere Informationen über eine tatsächlich stattfindende Transkription des T1 R3-Rezeptor-Gens und somit über die Bildung und den Gehalt an T1 R3-Rezeptor in den Spermien zu erhalten, wird eine RT-PCR durchgeführt, wobei zunächst Gesamt-RNA oder mRNA aus Hoden des zu untersuchenden Individuums isoliert wird. Diese wird anschließend mit Reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben und letztere einer PCR mit geeigneten Primern unterzogen.
Vorzugsweise werden in der RT-PCR zwei oder mehr Primer eingesetzt, welche daran angepasst sind, eine zumindest einen Teil des den T1 R3-Rezeptor kodie- renden Genbereichs in der DNA umfassende Nukleinsäuresequenz zu amplifizie- ren
Zuverlässige Ergebnisse werden insbesondere erhalten, wenn eine quantitative PCR oder quantitative RT-PCR durchgeführt wird, wobei sich insbesondere eine Real Time PCR unter Einsatz von fluoreszenz-markierten Sonden oder unter Einsatz von fluoreszierenden, in die gebildeten PCR-Produkte interkalierenden Substanzen als besonders geeignet erwiesen hat. Geeignete Systeme hierfür sind beispielsweise das LightCycler® Real Time PCR System und das Taqman®- System der Firma Roche. Selbstverständlich kann die quantitative PCR auch mit jedem anderen dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren erfolgen.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehaltes in Spermien mittels immunologischer Methoden, die gegen Proteine gerichtet sind. Insbesondere immuncytochemische Verfahren, eine Bestimmung durch Radioimmunoassay (RIA) oder eine Bestimmung durch einen „Enzyme linked Immunosorbent Assay" (ELISA) haben sich als besonders geeignet erwiesen. Bei dem letztgenannten Verfahren wird üblicherweise zuerst die zu untersuchende Probe an einer Oberfläche beispielsweise einer Mikrotiterplatte, einer Polyvinylchloridplatte oder einer geeigneten Gewebeplatte immobilisiert, bevor ein für das zu identifizierende Protein spezifischer Antikörper, hier ein spezifischer Antikörper für den im Akrosomenbereich der Spermien vorliegenden T1 R3-Rezeptor, aufgegeben wird. Sofern die Probe den T1 R3-Rezeptor enthält, bindet der Antikörper an die auf der Oberfläche immobilisierte Probe. Nach einem Waschschritt wird die Oberfläche schließlich mit einem zweiten den T1 R3-Rezeptor-Antikörper detektie- renden Sekundärantikörper (kommerziell erhältlich), der mit einem Enzym bei- spielsweise einer alkalischen Phosphatase oder Peroxidase gekoppelt ist, nachgewiesen. Nach einem erneuten Waschschritt wird der Probe schließlich ein farbloses bzw. nicht-fluoreszierendes Substrat für das am zweiten Antikörper gebundene Enzym zugefügt. Dieses Enzym wandelt das Substrat zu einem farbigen o- der fluoreszierenden Produkt um, dessen Konzentration durch einen geeigneten Detektor, beispielsweise ein Photometer bestimmt werden kann. Mit dem ELISA- Verfahren lassen sich selbst geringe Mengen des T1 R3-Rezeptors schnell und zuverlässig nachweisen. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es mit gebräuchlichen ELISA-Geräten und kommerziell erhältlichen Mikroti- terplatten im 96-, 256- oder gar 1024-Format betreibbar ist, weshalb sich eine große Anzahl von Analysen gleichzeitig durchführen lassen.
Bei dem RIA-Verfahren finden im Prinzip die gleichen Schritte wie beim ELISA- Verfahren statt, ausgenommen, dass anstelle eines mit einem geeigneten Enzym konjugierten zweiten Antikörpers ein radioaktiv markierter zweiter Antikörper ein- gesetzt wird. Die quantitative Detektion erfolgt in diesem Fall beispielsweise mittels eines Scintillationszählers.
Bei dem immuncytochemischen Verfahren werden die Spermien des zu untersuchenden Individuums vorzugsweise auf einer geeigneten Oberfläche fixiert und nach anschließender Blockierung der verbliebenen Oberflächenstellen mit einem T1 R3-rezeptor-spezifischen Antikörper inkubiert. Danach wird der gebundene erste Antikörper beispielsweise mit einem kommerziell erhältlichen FITC-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG behandelt und so für die Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, bevor man ihn, wie in Fig. 2 zu sehen, fluoreszenzmikroskopisch erfasst. Mit diesem Verfahren lässt sich nicht nur die Menge des T1 R3-Rezeptors, sondern auch dessen genaue Lage in den Spermien des zu untersuchenden Individuums bestimmen.
Abgesehen von den vorgenannten Verfahren kann die Bestimmung des T1R3- Rezeptor-Gehalts in Spermien auch mit anderen dem Fachmann bekannten immunologischen Methoden quantifiziert werden, wobei lediglich beispielsweise das „Western-Blof-Verfahren bzw. das Dot-Blot-Verfahren genannt sei.
Gemäß einer dritten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts in den Spermien bzw. deren Reaktivität, indem aus dem zu untersuchenden Individuum isolierte Spermien mit einem oder mehreren Geschmackstoffen, sprich den natürlichen Bindungspartnern des T1 R3-Rezeptors, kontaktiert und stimuliert werden. Diese umfassen Süßmittel wie die natürlich vorkommenden Zucker Sucrose, Glucose, Maltose, Galactose, Lactose und Fructose und die synthetisch hergestellten Verbindungen Acesulfam K, Saccharin. Aspartam, Dulcin, Cyclamat und SC-45647. Zu den Süßmitteln gehören auch Guanidin-1-Esssigsäure (GA-D, Guanidin-2-Essigsäure (GA-2), Glycyrrhizinsäure (GA), Neohesperidin Dihydrochalkon und weiterhin Süßstoffe mit Proteincharakter wie vorzugsweise Monellin, Thaumatin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein, Curculin und Miraculin. Schließlich läßt sich wenigstens eine Aminosäure, vorzugsweise eine aus der aus Glutamat, L-Alanin, L-Prolin, L-Serin, L-Aspartat, L-Asparagin, L-Arginin und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure oder deren entsprechendes Salz, insbesondere Alkali oder Erdalkalisalz als Geschmackstoff und Stimulans für den T1 R3-Rezep- tor in Spermien einsetzen. Nach der Kontaktierung, also nach der Bindung des Geschmackstoffs an eine dafür vorgesehene Bindungsstelle auf dem T1 R3- Rezeptor, wird die cytosolische Calciumkonzentration in den Spermien mit Hilfe membranpermeabler Calcium-sensitiver Farbstoffe, beispielsweise Fura2 oder Fluo bestimmt.
Gemäß einer vierten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung des Gehalts an intaktem T1 R3-Rezeptor-in den Spermien durch Bestimmung des Geschmacksprofils von männlichen Säugetieren oder be- vorzugt von Männern beispielsweise mit Hilfe des „two bottle preference test" oder anderer Geschmackstests. Diese Verfahren zur Bestimmung der Schwellenwerte für bestimmte Geschmacksstoffe (Erstellung eines Geschmackssprofils) sind dem Fachmann bekannt (Feigin et al„, Neurosci Biobehav Rev.11 , pp 231-240, 1987; Ruiz et al., Chemical Senses, 28, pp, 573-579, 2003) und werden routinemäßig für Säuger und Menschen eingesetzt.
Vorzugsweise wird bei den Ausführungsformen drei und vier der Schwellenwert eines oder mehrerer Geschmackstoffe des zu untersuchenden Individuums be- stimmt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren und Menschen, bei dem einem männlichen Säugetier oder einem Menschen wenigstens ein Inhibitor für den T1 R3-Rezeptor verabreicht wird.
Inhibitoren gemäß der Erfindung sind Stoffe, die mit dem T1 R3-Rezeptor in Wechselwirkung treten und eine Anlagerung von Geschmackstoffen an ihn erschweren oder vollständig unterbinden (kompetitive und nicht-kompetitive Antago- nisten). Insbesondere mit einer aus der aus Lactisol, Gurmarin, Cyclohexylessig- säure, Indolessigsäure und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählten Verbindung werden besonders gute Ergebnisse erhalten. Auch Derivate dieser Verbindungen zählen zu den Inhibitoren. Genauso werden ein oder mehrere Vertreter aus einer Gruppe von Verbindungen verabreicht, die in der Lage sind, sich fest an Rezeptoren für den Süßgeschmack zu binden.
Jeder Inhibitor kann separat, in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Inhibitoren und/oder zusammen mit pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoffen, sprich als pharmazeutisch akzeptable Komposition verabreicht werden, wobei das Verhältnis von Inhibitor zu Trägerstoff durch die Löslichkeit bzw. chemische Be- schaffenheit des Inhibitors, durch den ausgewählten Verabreichungsweg und/oder durch in der pharmazeutischen Praxis allgemein übliche Vorgehensweisen bestimmt wird. Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können den oder die Inhibitoren auch in Form eines Salzes, Esters, Amids oder als „Prodrug", sprich als inaktive Inhibitorvorstufe beinhalten. Für die örtliche Administration des Inhibitors umfassen sie Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel. Besagte Kompositionen stellt man her, indem der Inhibitor unter sterilen Bedingungen, mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Färb- und Geschmacksstoffen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt wird.
Die Verabreichung des Inhibitors bzw. seiner pharmazeutisch akzeptablen Kom- position erfolgt vorzugsweise oral, sublingual, rektal, parenteral, intrazisternal, intrathekal oder intravesikal (durch Instillation in die Blase).
Um eine Verdauung des Inhibitors im Magen-Darm-Trakt zu verhindern, wird er bzw. seine pharmazeutisch akzeptable Komposition besonders bevorzugt paren- teral zugeführt. Mögliche Formen der parenteralen Gabe sind eine intravaskuläre, beispielsweise intravenöse Gabe (mit einer Spritze in eine Vene), eine intramuskuläre Injektion (in einen Skelettmuskel), eine subkutane Injektion (unter die Haut), eine transdermale Gabe (z.B. mit einem "Pflaster"), eine intragenitale Verabreichung in das Geschlechtsorgan, eine intrapulmonale Gabe (als Aerosol oder Injektion), eine intraperitoneale Injektion (in die Bauchhöhle), eine intrakardiale Injektion (in das Herz) oder ein Auftrag auf die Schleimhäute (z.B. auf die Genitalschleimhaut, die Nasenschleimhaut oder lokal auf die Bindehaut), bzw. lokal als Puder, Salbe, Tropfen oder in Sprayform (Aerosol) bevorzugt im Genitalbereich. Parenteralia umfassen Injektionen, Infusionen, Pulver zur Herstellung einer Lösung, Konzentrate und Implantate.
Um die gleiche Wirkung wie mit parenteral verabreichten Mengen zu erzielen, müssen bei oraler Verabreichung größere Mengen an Inhibitor eingesetzt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Schwangerschaften einfach und zuverlässig verhindert werden, ohne dass Nebenwirkungen bei den behandelten Individuen zu befürchten sind. Gegenüber den herkömmlichen Empfängnisverhütungsverfahren, wie hormonelle Verhütungsverfahren für Frauen, bei denen beispielsweise Östrogene bzw. Gestagene eingesetzt werden, oder hormonellen Verhütungsverfahren für Männer auf der Basis von Testosteron, Gestagen und Etonogestrel, welche jeweils mit signifikanten Nebenwirkungen verbunden sind, bietet das erfindungsgemäße Empfängnisverhütungsverfahren erhebliche Vorteile. Es ist im Vergleich zu den bekannten Verhütungsmethoden kostengünstiger, zeigt nahezu keine Nebenwirkungen und ist sehr zuverlässig. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Inhibitors für den T1 R3-Rezeptor zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren und Menschen. Wie der Fachmann erkennt, kann die Verwendung sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Erhö- hung der Fertilität männlicher Säugetiere bzw. des Menschen, bei dem einem männlichen Säugetier oder Menschen wenigstens ein die Erkennung des T1 R3 Rezeptors potenzierender Ligand, insbesondere ein positiver allosterischer Modulator verabreicht wird.
Potenzierende Liganden im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die an eine Bindungsstelle des T1 R3-Rezeptor binden, die beabstandet von der Bindungsstelle für Geschmackstoffe bzw. Inhibitoren angeordnet ist. Mit dem Rezeptor wechselwirkende potenzierende üganden bewirken, daß dieser eine noch größere Affinität für Geschmackstoffe bzw. Inhibitoren besitzt und/oder diese noch fester bindet. Ein aus der aus Monophosphaten insbesondere aus Inosinmonophosphat (IMP) und Guanosinmonophosphat (GMP) und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählter Ligand liefert besonders gute Ergebnisse. Auch Derivate dieser Monophosphate zählen zu den potenzierenden Liganden.
Jeder potenzierende Ligand läßt sich separat, in Kombination mit einem oder mehreren weiteren Liganden und/oder zusammen mit pharmazeutisch verwendbaren Trägerstoffen, sprich als pharmazeutisch akzeptable Komposition verabreichen, wobei das Verhältnis von Ligand zu Trägerstoff durch die Löslichkeit bzw. chemische Beschaffenheit des Liganden, durch den ausgewählten Verabrei- chungsweg und/oder durch in der pharmazeutischen Praxis allgemein übliche Vorgehensweisen bestimmt wird.
Pharmazeutisch akzeptable Kompositionen können den oder die Liganden auch in Form eines Salzes, Esters, Amids oder als „Prodrug", sprich als inaktive Ligan- denvorstufe beinhalten. Für die örtliche Administration des Liganden umfassen sie
Salben, Puder, Sprays oder Inhalationsmittel. Benannte Komposition erhält man, indem der oder die Liganden unter sterilen Bedingungen mit einem physiologisch akzeptablen Trägerstoff und möglichen Färb- und Geschmacksstoffen, Puffern oder Treibmitteln, je nach Bedarf, vermischt wird.
Die Verabreichung des Liganden bzw. der pharmazeutisch akzeptablen Komposition erfolgt vorzugsweise oral, sublingual, rektal, parenteral, intrazistemal, intrathekal oder intravesikal (durch Instillation in die Blase).
Um eine Verdauung des Liganden im Magen-Darm-Trakt zu verhindern, wird er bzw. seine pharmazeutisch akzeptable Komposition besondes bevorzugt parenteral zugeführt. Mögliche Formen der parenteralen Gabe sind: eine intravaskuläre, beispielsweise intravenöse Gabe (mit einer Spritze in eine Vene), eine intramuskuläre Injektion (in einen Skelettmuskel), eine subkutane Injektion (unter die Haut), eine transdermale Gabe (z.B. mit einem "Pflaster"), eine intragenitale Verabreichung in das Geschlechtsorgan, eine intrapulmonale Gabe (als Aerosol oder Injektion), eine intraperitoneale Injektion (in die Bauchhöhle), eine intrakardiale Injektion (in das Herz), oder ein Auftrag auf die Schleimhäute (z.B. auf die Genitalschleimhaut, die Nasenschleimhaut oder lokal auf die Bindehaut), bzw. lokal als Puder, Salbe oder Tropfen oder in Sprayform (Aerosol) bevorzugt im Genitalbereich. Parenteralia: umfassen Injektionen, Infusionen, Pulver zur Herstellung einer Lösung, Konzentrate und Implantate.
Um die gleiche Wirkung wie mit parenteral verabreichten Mengen zu erzielen, müssen bei oraler Verabreichung größere Mengen an Ligand eingesetzt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl zu medizinischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines die Erkennung des T1 R3 Rezeptors potenzierenden Liganden, insbesondere eines positiven allosteri- schen Modulators zur Erhöhung der Fertilität von männlichen Säugetieren und Menschen. Wie der Fachmann erkennt, kann die Verwendung sowohl zu medizi- nischen als auch zu nicht medizinischen Zwecken erfolgen.
Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche und der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnungen. Es zeigen:
Fig. 1 ein Agarosegel mit den in Beispiel 1 erhaltenen PCR-Produkten und
Fig. 2 einen immuncytochemischen Nachweis des T1 R3-Rezeptors in isolierten Spermien der Maus gemäß Beispiel 2.
Beispiel 1
Zum Nachweis einer Expression des T1 R3-Rezeptors in Testis wurde eine RT- PCR mit Maus-Hodengewebe und Gewebe circumvallater Geschmackspapillen als Positivkontrolle (CV) durchgeführt.
Hierzu wurden zunächst mit einem molekularbiologischen Standardverfahren Ge- samt-RNA aus Maushodenzellen und Gesamt-RNA aus circumvallaten Geschmackspapillen einer Maus isoliert. Anschließend wurde die RNA beider Proben getrennt voneinander in cDNA umgeschrieben, indem die Proben mit einem Oligo- dT-Primer bzw. „random" Hexamer-Primer hybridisiert und nach Zugabe eines Desoxynukleotidgemischs mit reverser Transkriptase inkubiert wurden. Danach wurde jeweils eine Teilmenge der so erhaltenen Proben mit einem für den T1 R3- Rezeptor spezifischen Primerpaar durch PCR amplifiziert, bevor jeweils eine Teilmenge der resultierenden Amplifikationsprodukte mit DNA-Proben-Puffer versetzt und in einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt wurden. Das so erhaltene Gel ist in der Fig. 1 wiedergegeben.
Als T1 R3-Rezeptor spezifisches Primerpaar wurde ein Maus-spezifisches T1 R3 Primerpaar verwendet mit der Sequenz 5' TGA GCT GGG CAA ACT GGC TA 3xals kodierendem oder Sense-Primer und der Sequenz 5* TCT TGG CAT TCC TTC CCA GG 3vals nicht kodierendem oder Antisense-Primer. Die PCR Reaktion wurde eine Minute lang bei einer Anlagerungstemperatur von 60 °C in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt. Dieses enthielt 20 -100 ng Maus cDNA, 0,4 μM jedes Primers, 0,4 mM dNTP, 1.5 mM MgCI2 und 2.5 U Taq DNA Polymerase (MasterTaq Kit, Eppendorf, Hamburg). Um die Größe der Amplifikationsprodukte anhand ihres molekularen Gewichts zu bestimmen, wurde ganz links auf dem Agarosegel ein Molekulargewichts-Standardmarker aufgebracht.
Wie aus der Fig. 1 ersichtlich, ließen sich sowohl mit dem Gewebe aus den Maus- Hoden als auch dem Gewebe aus den Geschmackspapillen PCR-Produkte des T1 R3-Rezeptors mit einer erwarteten Größe von jeweils 510 Basenpaaren (bp) erhalten. Dies zeigt, dass der T1 R3-Rezeptor, der bisher nur als Geschmacksrezeptor charakterisiert wurde, nicht nur in Geschmackspapillen, sondern auch in Säuger-Hoden exprimiert wird.
Beispiel 2
Um den in den Maus-Hoden exprimierten T1 R3-Rezeptor zu lokalisieren, wurden Spermien aus dem Nebenhoden (Epidydimis) der Maus isoliert und immuncyto- chemisch untersucht.
Hierzu wurden die Spermien mit eiskaltem Methanol auf einem Objektträger fixiert und nach anschließender Blockierung mit PBS/10% FCS mit einem T1 R3- rezeptorspezifischen Antikörper bei 4°C über Nacht inkubiert. Der T1 R3- spezifische Antikörper ist gegen die Aminosäuresequenz 239-254 des T1 R3- Mausrezeptors gerichtet (Damek et al., Science, 301 , pp. 850-853, 2003). Der verwendete T1 R3-spezifische Antikörper gegen den humanen Rezeptor erkennt die Aminosäuresequenz 829-843 (Damek et al., Science, 301 , pp. 850-853, 2003).
Danach wurde der gebundene Antikörper mit einem kommerziell erhältlichen FITC-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG behandelt, wodurch ersterer für die Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht wurde, bevor der so präparierte Objektträger unter dem Mikroskop betrachtet wurde. Die jeweiligen Einzelbilder der Figur 2A und B zeigen links oben eine Kernfärbung mit Propidium Jodid, die daneben dargestellte Abbildung das entsprechende Durchlichtbild; darunter links ist die Markierung des T1 R3-Rezeptors durch den Nachweis mit dem FITC-markierten Antikörper zu sehen. Die Abbildung rechts unten zeigt die Überlagerung aller drei Einzelaufnahmen. Dabei wird ersichtlich, dass der T1 R3-Rezeptor ausschließlich im Akrosomenbereich der Spermien lokalisiert ist.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der Fertilität männlicher Säugetiere und Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt an T1 R3-Rezeptoren in
5 Spermien des zu untersuchenden Individuums in vitro bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der ermittelte T1 R3-Rezeptor-Gehalt mit einem Referenzwert verglichen wird.
O 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts in den Spermien durch Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und bevorzugt durch quantitative PCR erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der PCR als 5 DNA-Matrize cDNA aus Hoden des zu untersuchenden Individuums eingesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass in der PCR zwei oder mehrere Primerpaare eingesetzt werden, welche daran an- 0 gepasst sind, eine zumindest einen Teil des den T1 R3-Rezeptor kodierenden Genbereichs in der DNA umfassende Nukleinsäuresequenz zu amplifi- zieren.
6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Be- 5 Stimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts in den Spermien mittels einer immunologischen Methode erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts in den Spermien immuncytochemisch, 0 durch einen Radioimmunoassay (RIA) oder durch einen Enzyme-Iinked-
Immunosorbent Assay (ELISA) erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass in dem immunologischen Verfahren ein für den T1 R3-Rezeptor spezifischer Antikörper eingesetzt wird.
5 9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des T1 R3-Rezeptor-Gehalts in den Spermien durch Kontaktieren der Spermien des zu untersuchenden Individuums mit an den T1R3- Rezeptor bindenden Substanzen, vorzugsweise mit an den T1 R3-Rezeptor bindenden Geschmackstoffen, und anschließender Messung der cytosoli- o sehen Calciumkonzentration in den Spermien mittels membranpermeabler calciumsensitiver Farbstoffe bestimmt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass als Geschmackstoff wenigstens ein Süßmittel eingesetzt wird. 5
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus der aus Sucrose, Glucose, Maltose, Galactose, Lactose, Fructose, Acesulfam K, Saccharin. Aspartam, Dulcin, Cyclamat, SC-45647, Guanidin- 1-Esssigsäure (GA-1), Guanidin-2-Essigsäure (GA-2), Glycyrrhizinsäure 0 (GA), Neohesperidin Dihydrochalkon und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählter Geschmackstoff eingesetzt wird.
12. Verfahren nach einem Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Süßmittel wenigstens ein Süßstoff mit Proteincharakter, vorzugs- 5 weise ein aus der aus Monellin, Thaumatin, Mabinlin, Pentadin, Brazzein,
Curculin und Miraculin und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewähltes Süßprotein als Geschmackstoff eingesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine Aminosäure, vorzugsweise eine aus der aus Glutamat, L-Alanin, L- Prolin, L-Serin, L-Aspartat, L-Asparagin, L-Arginin und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte Aminosäure oder deren entspre- chendes Salz, insbesondere Alkali- oder Erdalkalisalz als Geschmackstoff eingesetzt wird.
14. Verfahren zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren und Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass einem männlichen Säugetier oder einem Menschen-wenigstens ein Inhibitor für den T1 R3-Rezeptor verabreicht wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus der aus Lactisol, Gurmarin, Cyclohexylessigsäure, Indolessigsäure und Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählter Inhibitor einge- setzt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor als pharmazeutisch akzeptable Komposition verabreicht wird, die den Inhibitor beispielsweise in Form eines Salzes, Esters, Amids oder als "Prodrug" beinhaltet.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor oral, sublingual oder rektal eingesetzt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor parenteral, intravaskulär, beispielsweise intravenös, subkutan oder transdermal, intragenital, lokal als Puder, Salbe oder Tropfen oder in Form eines Aerosols bzw. durch Auftrag auf die Schleimhäute zugeführt wird.
19. Verwendung eines Inhibitors für den T1 R3-Rezeptor zur Empfängnisverhütung bei Säugetieren und Menschen.
20. Verfahren zur Erhöhung der Fertilität männlicher Säugetiere bzw. des Men- sehen, dadurch gekennzeichnet, dass einem männlichen Säugetier oder dem Menschen wenigstens ein die Erkennung des T1 R3 Rezeptors potenzierender Ligand, insbesondere ein positiver allosterischer Modulator verab-
5 reicht wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus der aus Monophosphaten insbesondere aus Inosinmonophosphat (IMP) und Guanosinmonophosphat (GMP) und Kombinationen hiervon bestehenden o Gruppe ausgewählter Ligand eingesetzt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand als pharmazeutisch akzeptable Kompositionen verabreicht wird, die den Liganden beispielsweise in Form eines Salzes, Esters, Amids oder 5 als „Prodrug" beinhaltet.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand oral, sublingual oder rektal eingesetzt wird.
0 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Ligand parenteral, intravaskulär, beispielsweise intravenös, subkutan oder transdermal, intragenital, lokal als Puder, Salbe oder Tropfen oder in Form eines Aerosols bzw. durch Auftrag auf die Schleimhäute zugeführt wird. 5
25. Verwendung eines die Erkennung des T1 R3 Rezeptors potenzierenden Liganden, insbesondere eines positiven allosterischen Modulators zur Erhöhung der Fertilität von männlichen Säugetieren und Menschen
0
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