WO2006126723A1 - 遺伝子組換え微生物およびそれらの微生物を用いるマクロライド系化合物の製造方法 - Google Patents

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Kazuhiro Machida
Yasuhide Aritoku
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
Mercian Corporation
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    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a genetically modified microorganism and a macrolide compound using the microorganism.
  • the present invention relates to a genetically modified microorganism having the ability to produce a 16-position hydroxylated macrolide compound and a method for producing a 16-position hydroxylated macrolide compound using these microorganisms.
  • polyketide compound compounds having a polyketide as a parent nucleus (hereinafter referred to as a polyketide compound) are structurally found.
  • erythromycin known as an antibacterial substance
  • josamycin Thai mouth syn, midecamycin
  • mycinamicin mycinamicin
  • nystatin known as an antifungal substance
  • amphotericin milbemycin known as an insecticidal substance
  • evermectin known as an immunosuppressive substance
  • tacrolimus rapamycin
  • daunomycin adriamycin
  • aclacinomycin which are known as antitumor substances
  • pragenolide is a general term for a group of compounds discovered from the culture of Streptomyces sp. Mer-11107 strain. It is called 11107B (called pragenolide B) represented by the following formula (A). More than 50 analogs are known (see, for example, WO 2 0 0 2/0 6 0 8 90).
  • the 16-position hydroxide represented by the following formula (I) has excellent properties such as strong antitumor activity, but its productivity is higher than that of 11107B. However, efficient production was difficult.
  • R represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • a compound in which R is a hydrogen atom is sometimes referred to as ME-282, and a compound in which R is a hydroxyl group is sometimes referred to as 11107D or pragenolide D.
  • the applicant's research group found an actinomycete other than pradenolide-producing bacteria that performs the hydroxylation reaction at 11-position of 11107B (see WO 2003/099813 and WO 2004/050890), From these actinomycetes, we obtained and identified DNA involved in the hydroxylation of position 16 of 11107B (DNA encoding 16-position hydroxylase and its ferredoxin). 052152). In addition, Streptomyces sp. (Streptomyces sp.) From 3 ⁇ 4 ⁇ :-11107 strain, we also obtained and identified the polypeptides involved in the biosynthesis of 11107B and the DNAs encoding those polypeptides. W0-A 2006/009276).
  • Streptomyces sp. (Streptomyces sp.) Mer-11107 strain or its variant was used to produce 11107B, etc., and the resulting 11107B, etc.
  • the 16-position hydroxide can be produced more efficiently than before.
  • the reaction on the second floor is performed, the labor for the operation is doubled, and the establishment of a more efficient manufacturing method has been desired.
  • a polyketide compound modified by the introduced enzyme is directly produced by introducing a gene encoding an enzyme that modifies the polyketide compound into a strain that produces the polyketide compound. Yes.
  • a polyketide compound modified by an enzyme inherent in the host strain is directly produced by introducing the biosynthesis gene of the polyketide compound into a strain having an enzyme that modifies the polyketide compound.
  • a polyketide compound modified by an enzyme inherent in the host strain is directly produced by introducing the biosynthesis gene of the polyketide compound into a strain having an enzyme that modifies the polyketide compound.
  • Streptomyces fradiae Tu2717 strain which has an enzyme that hydroxylates the 6-position of tetrasenomycin C, biosynthesis of tetrasenomycin C in Streptomyces glaucescens GLA.
  • 6-hydroxy-tetrasenomycin C can be produced directly by introducing the gene (see J. Bacterid, 1995, vol. 177, 6126-6136).
  • the modified polyketide compound may be produced by the heterologous strain.
  • Streptomyces lividans K4-114 strain as a host, Streptomyces gene encoding 6-erythronorai KB synthase from the strain of 'Erythrea (Saccharopolyspora erythraea)' Antibiotes
  • An object of the present invention is to provide a genetically modified microorganism having an ability to produce a 16-position hydroxylated macrolide compound represented by the formula (I). Furthermore, the present invention provides a method for producing a 16-position hydroxylated macrolide compound using these genetically modified microorganisms.
  • the inventors of the present invention have used a genetically engineered microbial organism having both the DNA isolated in 11107B biosynthesis and the DNA involved in the hydroxylation reaction at position 16 of 11107B.
  • a genetically engineered microbial organism having both the DNA isolated in 11107B biosynthesis and the DNA involved in the hydroxylation reaction at position 16 of 11107B.
  • R represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R represents a microorganism capable of producing a 16-position hydroxylated macrolide compound
  • a genetically modified microorganism having the following properties having the following properties:
  • DNA force represented by the above (a) Polypeptide having polyketide synthase activity, Polypeptide having 7-position acetylating enzyme activity, Polypeptide having 18- and 19-position epoxidase activity and transcription regulator [1] The genetically modified microorganism according to [1], which is a DNA encoding a part of or as a whole, an active polypeptide.
  • (b-2) a continuous base sequence from base 420 to base 1604 of SEQ ID NO: 3
  • (b-3) a continuous base sequence from base 172 to base 1383 of SEQ ID NO: 4.
  • the DNA represented by (b) above is a DNA variant comprising a continuous base sequence from base 1322 to base 2548 of SEQ ID NO: 2, comprising the following 1) to 6):
  • the DNA represented by (b) above is a variant of DNA comprising a continuous base sequence from base 1322 to base 2548 of SEQ ID NO: 2, comprising the following 1) to 6): The genetically modified microorganism according to any one of [1] to [6], which has one or more modified sites selected from the group.
  • a modified site obtained by modifying the sequence cgc from base 1904 to base 1906 into a codon encoding leucine, isoleucine, proline, tyrosine or phenylalanin.
  • Modified site obtained by modifying the sequence ate from base 2054 to base 2056 into a codon encoding phenylalanin or valine.
  • the DNA represented by the above (b) is a DNA variant comprising a continuous base sequence from base 1322 to base 2548 of SEQ ID NO: 2, comprising the following 1) to 6):
  • a genetically modified microorganism capable of producing a 16-position hydroxylated macrolide compound represented by formula (I) is a strain belonging to the genus Streptomyces [1] to [1] 2.
  • the genetically modified microorganism according to any one of items up to 2.
  • [14] Inoculate the genetically modified microorganism into a 250mL Erlenmeyer flask containing 30mL of the following medium, incubate at 25 ° C for 4 days with rotary shaking (220rpm), extract with 270mL of acetonitrile.
  • the obtained extract was subjected to HPLC analysis under the following measurement conditions, and when the 16-position hydroxylated macrolide compound represented by the formula (I) was quantified, the 16-position hydroxylated macrolide represented by the formula (I)
  • the genetically modified microorganism according to any one of [1] to [13], which has an ability to produce 50 mg or more of a compound based on 1 L of a culture solution.
  • the recombinant microorganism described in any one of [1] to [14] is cultured in a nutrient medium, and 16-position hydroxylation represented by the formula (I) is obtained from the culture solution.
  • Cyclodextrins are ⁇ -cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, partially methylated 3-cyclodextrin, dimethyl mono- ⁇ -cyclodextrin, trimethyl _ j3-cyclodextrin, glycosyl] 3-cyclodextrin and The method according to [16], which is a cyclodextrin selected from the group consisting of droxypropyl mono; 3-cyclodextrin.
  • a DNA variant comprising a continuous base sequence from base 1322 to base 2548 of SEQ ID NO: 2, wherein 1 is a modified site selected from the group consisting of 1) to 6) below: Or a DNA variant comprising two or more.
  • a DNA variant comprising a continuous base sequence from base 1322 to base 2548 of SEQ ID NO: 2, wherein the modified portion is selected from the group consisting of 1)) to 6) below: A DNA variant comprising one or more.
  • a modified site obtained by modifying the sequence cgc from base 1904 to base 1906 into a codon encoding leucine, isoleucine, proline, tyrosine or phenylalanin.
  • a DNA variant comprising a continuous base sequence from base 1322 to base 2548 of SEQ ID NO: 2, wherein 1 is a modified site selected from the group consisting of 1) to 6) below: Or a DNA variant comprising two or more.
  • [2 1] A polypeptide encoded by a DNA variant described in any one of [1 8] to [2 0]. '
  • Gene-recombinant microorganism means a microorganism (bacteria, actinomycetes, yeast, filamentous fungi, etc.) that has been introduced into a specific microorganism using genetic recombination technology, and the gene transfer used for it This method includes not only gene recombination using a vector such as plasmid but also homologous recombination.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions means, for example, colony hybridization method, plaque hybridization method or Southern hybridization method using the original DNA as a probe. Specifically, hybridization was performed at 65 ° C in the presence of 0.7 to L 0M sodium chloride using a filter on which colony or plaque-derived DNA was immobilized. After that, use a 0.1 to 2-fold concentrated SSC solution (the composition of the 1-fold concentrated SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate), and filter at 65 ° C. DNA that can be identified by washing I can make it.
  • Analog means compounds that have the same main skeleton characterizing the chemical structure but differ in the mode of modification and the shape of the side chain.
  • 16-position hydroxylase activity means the activity of converting the 16-position hydrogen atom of the macrolide compound (II) into a hydroxyl group.
  • 6-position enzymatic hydroxylation activity means, c to mean converting cheat active macrolide compound of the following formula (B) the 6-position hydrogen atom of (is sometimes called E-265) to a hydroxyl group
  • Polyketide synthase activity means an activity of synthesizing a macrolide compound represented by the following formula (E).
  • 7-position acetylating enzyme activity means the activity of converting the 7-position hydroxyl group of a macrolide compound represented by the following formula (C) to a acetyl group.
  • R represents a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • Transcriptional regulator activity means an activity of regulating transcription of DNA encoding a polypeptide involved in the biosynthesis of a macrolide compound ( ⁇ ).
  • the present invention has a DNA encoding a polypeptide involved in the biosynthesis of the macrolide compound (II) and a DNA encoding a polypeptide having the hydroxylase activity at position 16 of the macrophage compound (II).
  • a genetically modified microorganism capable of directly fermentatively producing the 16-position hydroxylated macrolide compound (I) can be obtained. Further, by culturing the genetically modified microorganism and collecting it from the culture solution, it is possible to efficiently produce the 16-position hydroxylated macrophage compound (I).
  • Macrolide compounds (I) can be produced more efficiently and selectively.
  • Figure 1 shows the biosynthesis pathway of pragenolide in the Mer-11107 strain.
  • Figure 2 shows the correspondence between each 0RF of DNA involved in the biosynthesis of pragenolide in the Mer-11107 strain and cosmids.
  • FIG. 3 is a diagram showing the structure of plasmid pKU253. '
  • FIG. 4 shows the structure of the plasmid pUC19aph :: oriT :: intphiC31. Detailed Description of the Invention
  • the DNA encoding the polypeptide involved in the biosynthesis of the macrolide compound (II) can be obtained by a method well known in the art (for example, the colony hybrid described in Molecular Cloning 2nd Edition). According to the session method), it can be obtained from a cultured cell of a microorganism having the ability to produce the macrolide compound. Examples of such microorganisms include those that have the ability to produce the macrolide compounds, and can be used without regard to species and strains. Preferred microorganisms include strains belonging to Streptomyces genus actinomycetes. be able to. As an example, Streptomyces sp. Mer-11107 strain isolated from soil can be mentioned.
  • the genomic DNA of Mer-11107 was partially digested with an appropriate restriction enzyme and ligated with a cosmid vector that can be replicated in E. coli and digested with an appropriate restriction enzyme.
  • the recombinant DNA obtained in this way is integrated into E. coli to obtain a transduced strain.
  • a known hydroxylase (cytochrome P450 enzyme) gene fragment as a probe, a large number of previously introduced transfection strains are screened to select a transduction strain that binds to the probe. Then, obtain DNA that binds to the hydroxylase gene present in the selected cosmid and determine its sequence.
  • the nucleotide sequence (amino acid sequence in the code sequence) including the peripheral region of DNA that codes for the polypeptide involved in the biosynthesis of the macrolide compound (II) thus obtained is the sequence listing The number 1 is shown.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 1 includes pldA I ( ⁇ ⁇ 8340-27935), pldA II
  • pldA III bases 49134-60269
  • pldA IV bases 60269-65692
  • pldB bases 65707-66903
  • pldC bases 68160-66970
  • pldD bases 69568-68270
  • PLDR ⁇ group 72725-7 0020
  • pldA I, pldA II, pldA III and pldA IV each contain one or more repeat units called modules, as well as other polyketide biosynthetic genes that have already been revealed. There are several transcription reading frames. As described later, each module is involved in the condensation reaction of polyketide synthesis, such as acyl carrier monoprotein (ACP), -ketocil ACP synthase (KS), and acyl transferase.
  • ACP acyl carrier monoprotein
  • KS -ketocil ACP synthase
  • acyl transferase acyl transferase
  • AT ketoacil reductase
  • KR ketoacil reductase
  • DH dehydrase
  • ER enol reductase
  • the last module has a polyketide chain in the polyketide
  • TE thioesterase
  • Fig. 1 shows the biosynthetic pathway of macrolide compounds in Mer-11107 strain.
  • the loading module is replaced with glutamine at the active center, indicating that pldA I is involved in the initial reaction.
  • Module 10 also has a thioesterase (TE) domain, indicating that pldA IV is involved in the final reaction of the synthesis of the polyketide backbone.
  • TE thioesterase
  • a compound in which R is a hydrogen atom can be produced by modifying it so as not to exhibit a force function that deletes pldB.
  • the pldR has a high homology with the gene ave R encoding a transcriptional regulatory factor in avermectin biosynthesis, which encodes the transcription regulator of DNA involved in the biosynthesis of Makurorai de compound.
  • the DNA encoding the polypeptide having the hydroxylase activity at position 16 of the macrolide compound (II) in the present invention is also described in a method well known in the art (for example, described in Molecular Cloning 2nd Edition).
  • the macrolide compound can be obtained from a cultured cell of a microorganism having the hydroxylation ability at the 16-position of the macrolide compound.
  • any microorganism can be used regardless of species and strain as long as it has the ability to convert the 16-position hydrogen atom of the macrolide compound to a hydroxyl group. List strains. For example, Streptomyces sp. A-1544 strain, Streptomyces sp.
  • genomic DNA of A-1544 strain then prepare primers based on the sequence information of the known hydroxylase (cytochrome P450 enzyme) gene and perform PCR reaction. Get and determine its sequence.
  • the base sequence of the peripheral region extending upstream and downstream of the cloned DNA fragment is amplified by inverse PCR (cell engineering 14 ⁇ ⁇ , p. 591-593, 1995). It can be obtained by cloning, sequence analysis. Details of these operations are described in Reference Example 2 (A-1544 strain), Reference Example 3 (Mer-11107 strain) and Reference Example 4 (A-1560 strain). June 9th, 5th W0-A
  • the DNA (including the peripheral region) encoding the polypeptide having the 16-position hydroxylase activity of the macrolide compound (II) obtained from the A-1544 strain is as shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 2 contains two open 'removing frames (0RF) of psmA (base 1322 to base 2548) and psmB (base 2564 to base 2761). Coordinates hydroxylase and ferredoxin.
  • the DNA (including the peripheral region) encoding the polypeptide having the 16-position hydroxylase activity of the macrolide compound (II) obtained from Mer-11107 strain is as shown in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing. is there.
  • the DNA shown in SEQ ID NO: 3 contains two open 'removing frames (0RF), bpmA (base 420 to base 1604) and bpmB (base 1643 to base 1834), 16th hydroxylase and ferred It codes for xin.
  • the DNA (including the surrounding region) that codes for the macrolide compound ( ⁇ ) having 16-position hydroxylase activity obtained from the A-1560 strain is shown in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing. It is as follows.
  • the DNA shown in SEQ ID NO: 4 contains two open 'reading' frenyms (0RF), tpmA (base 172 to base 1383) and tpmB (base 1399 to base 1593), each of which is in position 16. Encodes hydroxylase and ferredoxin. ''
  • various DNA variants encoding the above-mentioned polypeptide having 16-position hydroxylase activity can be obtained as follows. First, site-specific modification treatment is performed based on the sequence information of the original DNA, then the obtained site-specific DNA variant is incorporated into the host, and the strength of the 16-position hydroxylase activity of the genetically modified microorganism and It is possible to select and acquire high selectivity as an index.
  • site-specific modification for example, a plasmid in which the original DNA is cloned is used as a cage, and a primer designed based on the sequence information is used to make a commercially available kit such as QuickChange TM Site- Directed Mutagenesis Kit (Stratagene Co.) can be used.
  • the 16-position hydroxylase activity is strong and the selectivity is high.
  • the base of SEQ ID NO: 2 examples thereof include a DNA variant comprising a continuous base sequence from 1322 to base 2548 and comprising one or more modified sites selected from the group consisting of the following 1) to 6).
  • a modified site obtained by modifying the sequence cgc from base 1592 to base 1594 into a codon that codes for an amino acid other than arginine, preferably cysteine.
  • Modified site obtained by modifying the sequence cgc from base 1904 to base 1906 into a codon encoding an amino acid other than arginine, preferably leucine or tyrosine
  • sequence cgc from base 2027 to base 2029 is converted to an amino acid other than arginine, Preferably a modified site modified to a codon encoding leucine
  • Modified site obtained by modifying the sequence ctg from base 2528 to base 2530 into a codon encoding amino acid other than leucine, preferably methionine
  • the recombinant of the present invention comprises the above-mentioned “DNA encoding a polypeptide involved in biosynthesis of the macrolide compound (II)” and “polyamide having the 16-position hydroxylase activity of the macrolide compound ( ⁇ ). It is a genetically modified microorganism that possesses “DNA that encodes peptide” and can be produced by the methods shown in A) to C) below.
  • the host in the recombinant of the present invention can be used without particular limitation as long as it is capable of integrating the target DNA and can produce the target 16-position hydroxylated macrophide compound, but as a preferred microorganism, Streptomyces ( Examples include strains belonging to the genus Streptomyces). For example, in the case of A), Streptomyces sp. Mer-II IO 7 strain, etc., and in the case of B), Streptomyces sp. A-1544 strain, Treptomyces sp
  • A-1560 strain and the like can be mentioned.
  • C a strain belonging to Escherichia coli can be mentioned.
  • the host and plasmid-vector system is not particularly limited as long as the target DNA can be stably maintained and expressed in the host.
  • the plasmid may contain an autonomously replicating sequence, a promoter sequence, a terminator sequence, a drug resistance gene, etc., and the types of plasmids are not limited to autonomously replicating plasmids : It may be an integrative plasmid having a sequence homologous to a certain region of the genome of the host to be used.
  • the site for incorporating the DNA of interest may be either on the plasmid or on the genome of the host microorganism.
  • actinomycetes or related strains are used as the host, the autonomously replicating vector PIJ6021 (Gene, 166, 133-137 (1995)) or the genome integration vector KC515 [The bacteria, vol. 9, Antibiotic- producing Streptomyces (ed: Queener, SE and Day, E.), p. 119-158, Academic Press, Orlando, Fgla.).
  • the autonomously replicating sequences include rep pIJlOl (1988, J. Bacteriol., 170, 4634-4651), rep SCP2 (1981, J. Gen. Microbiol., 126, 427-442), pUC19 (Gene, 33 (1) , 103-119 (1985)) and the like as promoter sequences include ermEp (Mol Microbiol., 1994, Nov; 14 (3): 533-45.), SnpA Q Bacteriol., 1992, May; 174 (9) : 2797-2808) and other terminator sequences include ter (mmr) (Gene, 1987; 58 (2-3): 229-41), fd terminator (Nucleic Acids Res., 5 (12), 4495- 4503 (1978)), etc., as drug resistance genes, hyg (Nucleic Acids Res., 4 (14), 1565-1581 (1986)),
  • tsr Mol. Gen. Genet., 199 (1), 26-36 (1985)
  • the genetically modified microorganism of the present invention can be easily produced by those skilled in the art according to the description in the present specification.
  • a genetically modified microorganism capable of producing 50 mg or more of the macrolide compound per liter of culture solution Can be obtained with a probability of about 30%, and can be obtained with a high probability of about 30%.
  • the 16-position hydroxylated macrolide compound (I) or a pharmacologically acceptable salt thereof or Their hydrates can be collected.
  • the method for culturing these genetically modified microorganisms is basically the same as the method for culturing general microorganisms, but usually it is preferably performed under aerobic conditions such as shaking culture by liquid culture and aeration and agitation culture.
  • the medium used for the culture may be a medium containing a nutrient source that can be used by these microorganisms, and any of various synthetic, semi-synthetic medium, natural medium, and the like can be used.
  • a medium composition glucose, sucrose, fructose, glycerin, dextrin, starch, molasses, soybean oil and the like as a carbon source can be used alone or in combination.
  • Nitrogen sources include fualuma media, peptone, meat extract, soy flour, casein, amino acids, yeast extract, urine
  • Organic nitrogen sources such as silicon
  • inorganic nitrogen sources such as sodium nitrate and ammonium sulfate can be used alone or in combination.
  • salts such as sodium chloride, chloride chloride, calcium carbonate, magnesium sulfate, sodium phosphate, potassium phosphate, cobalt chloride, heavy metal salts, vitamins such as vitamin B and piotin are added as necessary. be able to.
  • various antifoaming agents can be appropriately added to the medium.
  • Cyclodextrins that can be used in the present invention include: 3-cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, partially methylated / 3-cyclodextrin, dimethyl- ⁇ -cyclodextrin, trimethylolene monocyclodextrin, glycosyl-1-cyclodextrin And hydroxypropyl mono; 3-cyclodextrin, which can be used alone or in combination.
  • the amount of cyclodextrin added to the culture medium is preferably 0.5% to 5%.
  • the addition period may be at the beginning of the culture or during the culture.
  • the culture conditions can be appropriately selected within the range in which the strain can grow well and produce the 16-position hydroxylated macrolide compound (I).
  • the pH of the medium should be about 5-9, usually around neutral.
  • the culture temperature is usually kept at 20-40 ° C, preferably 23-35 ° C.
  • the culture period is about 2 to 12 days, usually about 3 to 10 days.
  • the various culture conditions described above can be appropriately changed according to the type and characteristics of microorganisms used, external conditions, etc., and it is needless to say that optimum conditions can be selected.
  • the separation and purification methods generally used for isolating microbial metabolites from the culture solution are available.
  • Reference Example 1 Obtaining DNA that encodes a polypeptide involved in the biosynthesis of macrolide compound (II)
  • Streptomyces sp. Mer-11107 mycelium was inoculated into 25 mL Tryptic Soy Broth and cultured with shaking at 28 ° C for 3 days. From the culture medium obtained as a result, the Streptomyces D. A. Hopwood et al.
  • Genomic DNA was prepared according to the method described in Isolation genomic DNA (P162-170) of Genetics (The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000).
  • the solution was extracted with / x L black mouth form, and the aqueous phase was recovered again.
  • 3M sodium acetate (pH 6.0) and 300 zL of ethanol were added, placed at _80 ° C for 30 minutes, and centrifuged to collect the precipitated DNA.
  • This DNA was washed with 70% ethanol and then dissolved in 20 ⁇ L of TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), ImM EDTA].
  • the DNA terminal was dephosphorylated with phosphatase (Takara Bio Inc.), digested with the restriction enzyme BamHI, purified, and dissolved in 10 ⁇ L of TE buffer.
  • phosphatase Teka Bio Inc.
  • BamHI restriction enzyme
  • To 1 ⁇ L of this cosmid DNA solution add 2.5 / i L of the aforementioned Sau3Al partial degradation product of Mer-11107 DNA, and then add 1.5 ⁇ L of sterile purified water, DNA Ligation Kit (Takara Bio).
  • (5) and Solution I (10 i L) were added sequentially, followed by incubation at 23 ° C for 10 minutes.
  • This reaction solution was applied to lambda phage using Gigapack III XL Kit (Stratagene).
  • the resulting packaging solution total amount 500 ⁇ L was subjected to a transduction test and tested for colony forming ability. As a result, it was 380 cfu (colony forming unit) /; u L
  • KS-3F 5 '-GACCGCGGCTGGGACGTGGAGGG-3'
  • KS-4R 5'-GTGCCCGATGTTGGACTTCAACGA-3 '
  • dNTP mixed solution (dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2.5m each) 16 ⁇
  • LA Taq polymerase (5u / L, Tacarano Kuyo) 1 ⁇ L
  • the 930 bp DNA fragment amplified as a result of this reaction was electrophoresed on a 0.8% agarose gel, the separated 930 bp DNA fragment was excised, and the DNA was recovered and purified using SUPREC-01 (Takara Bio Inc.). Further, a 930 bp DNA fragment containing the keto synthase coding region was re-amplified under the same reaction conditions as described above except that 10 ng of the obtained DNA fragment was used as a saddle and the reaction cycle number was 20 cycles. A 50 / iL TE solution obtained by concentrating and purifying this DNA fragment using SUPREC-02 (Takara Bio Inc.) was used as a probe solution.
  • cytochrome P450 gene probes Two known cytochrome P450 genes were amplified from actinomycetes. That is, Streptomyces thermotolerans ATCC11416 derived 0RF-A ⁇ i; ⁇ na (Biosci.
  • CB-1F 5'-ATGACAGCTTTGAATCTGATGGATCCC-3 '
  • CB-2R 5 '-TCAGAGACGGACCGGCAGACTCTTCAGACG-3'
  • PC-2R 5 '-TCACGCGCTCTCCGCCCGCCCCCTGCC-3' '"
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 L
  • Genomic DNA of ATCC11416 strain or ATCC15439 strain (100ng / L) 1 L
  • LA Taq polymerase (5u / ⁇ L, Tacarano Kuisha) 1 ⁇ L
  • E. coli XLlBlue MR (Stratagene) was used as a host, and transduction was performed according to the Stratagene manual. Dispense the bacterial solution after transduction into 10 LB-50 g / mL ampicillin-1.5% agar dishes (inner diameter 90 mm, height 15 mm) The cells were cultured at 37 ° C for 18 hours. Copy colonies grown in each petri dish with HybondoN + filter (amersham biosciences) $ 5, HybondoN + 'Ino Letter', and then perform a force treatment and neutralization treatment under the conditions described above. By drying at ° C for 2 hours, colony-derived DNA was immobilized on the finerlet.
  • the 930 bp DNA fragment lOOng containing the keto synthase region prepared in (3-1) above is used.
  • Use AlkPhos Direct System (amersham biosciences) 3 ⁇ 4 "and clean the DNA library using the colony hybridization method. Hybridization is performed at 65 ° C with a salt concentration of 0.5M NaCl. AlkPhos for probe DNA labeling, hybridization and detection conditions
  • pKS58 DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI, ligated to the phage vector Zap Express, BamHI-CIAP-treated (Stratagene), and packaged into lambda phage using Gigapack III XL Kit (Stratagene). This phage solution was infected with E. coli XL1-Blue MRF 'to form plaques. Plaque hybridization was performed using the cytochrome P450 gene probe prepared in the previous section (3-2), so that a DNA fragment containing about 2 kb of cytochrome P450 gene was subcloned.
  • cytochrome P450 gene DNA fragment was sequenced, and two primers, PDL58-1F and PDL58-2R, consisting of the sequences shown below from the N-terminal and C-terminal, which are cytochrome P450 coding regions, were identified. Synthesized (see SEQ ID NO: 1 1 and 1 2).
  • PDL58- 1F 5 '-GCCCCGCATATGGATCTGGAAACCCAACTTCTC-3'
  • PDL58-2R 5 '-GCACTAGTCAGCCGCGCTCGACGAGGAGGTG-3'
  • PCR was performed under the following conditions.
  • dNTP mixed solution (dATP, dGTP, dTTP, dCTP 2.5 mM each) 16 ⁇ L
  • LA Taq polymerase (5u / i L, Tacarano Kuyo) 1 ⁇ L
  • M9CG medium (1.28% Na 2 HP0 4 - 7H 2 0, 0.3% KH 2 P0 4, 0.05% NaCl, 0.1% NH 1, 1% casamino acid, 0.4% Darco one scan, lmM MgCl 2, ⁇ CaCl 2 .
  • the cells were cultured at 50 ⁇ g / mL ampicillin) until the 0D 600 (optical density at 600 nm) reached 0.8.
  • 5-Amino Lebri Acid and IPTG were added at 80 ⁇ g / m and 0. ImM, respectively, and the culture was continued at 22 ° C. for 25 hours to induce cytochrome P450 protein. After induction, the cells collecting Umate CV buffer [50mM NaP0 4 (pH7.
  • Retention time ME-265; 20 minutes, Pradienolide B; 13 minutes
  • cosmids containing a biosynthetic gene cluster adjacent to the cytochrome P450 gene obtained in the previous section (5) were selected.
  • PKS23 was selected as a cosmid adjacent to the cosmid pKS58 and cytochrome P450 gene side on the side not containing the polyketide synthase gene.
  • Fig. 2 as a cosmid clone encompassing the platenolide biosynthetic gene cluster,
  • pKS23, pKS58, pKS54, and pKS35 were selected.
  • the obtained subclone was subjected to a cycle sequence reaction (amersham biosciences) using a fluorescently labeled primer, and the base sequence of each fragment was determined (MegaBACE 1000: amersham biosciences). An approximately 75 kb base sequence containing DNA related to the biosynthesis of the ride was determined (see SEQ ID NO: 1).
  • pldB-L- Bgl2F 5 '-GGGAGATCTAGAGGCCGGTTACCTCTACGAGTA-3'
  • pldB- L-Hind3R 5 '-GGGAAGCTTGCGAcho GAGCTGTGCCAGATAG-3'
  • pldB- R- Hind3F 5 '-GGGAAGCTTGAACTGGCGCGACAGTGTCTT-3'
  • pldB-R-Bgl2R 5 '-GGGAGATC Dc GCAGCGGATCGTCTTCGAGACCCT Dc-3'
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 L
  • PldB-L-Bgl2F or pldB-R-Hind3F 50 pmol/ / i L) ⁇ ⁇ ⁇
  • pldB-L-Hind3R or pldB- R-Bgl2R 50 pmol/ ⁇ L
  • DNA fragment L1 containing nucleotides 66756 to 66302 of SEQ ID NO: 1 was amplified
  • pldB-R From the reaction using -Hind3F and pldB-R-Bgl2R, base 66849 of SEQ ID NO: 1
  • DNA fragment R1 containing base 68368 was amplified.
  • DNA fragments L1 and R1 were purified with QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN) and then digested with restriction enzymes Bglll and Hindlll.
  • pHP45omegahyg derived from Gene 190, 315-317, 1997.
  • the following may be abbreviated as hyg
  • the shuttle vector PKU25 (see Fig. 3) digested with the restriction enzyme BamHI.
  • Linked with ver. 2.1 (Takara Bio Inc.).
  • an approximately 5.4 kb DNA fragment with the hygromycin B resistance gene inserted between DNA fragments L1 and R1 was constructed, and an approximately 21.4 kb plasmid pKU253-U-hyg-R1 inserted into pKU253. It was done.
  • the obtained PKU253-L1-hyg-Rl was transformed into conjugated Escherichia coli S17-1 by electroporation to obtain S17-l / pKU253-Ll-hyg-R1 strain.
  • the obtained S17-l / pKU253-Ll-hyg-Rl strain was added to LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract containing 25 g / mL kanamycin and lOO / ig / mL hygromycin B. , 0.5%
  • the Mer-11107 strain was inoculated into 10 mL of TSB medium (Trypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical), shaken at 30 ° C for 5 hours, and collected. After washing twice with sterile water lOniL, the suspension was suspended in 1 mL of sterile water. This was used as a recipient bacterial suspension. 500 ⁇ L of the obtained S17-l / pKU253-LI-hyg-R1 strain suspension was mixed with the Mer-11107 strain suspension and placed in Actino Medium No. 4 agar medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). Applied. After culturing at 30 ° C.
  • the obtained PKU253-L1-hyg-R1 transformed strain was inoculated into 10 mL of TSB medium not containing lipostamycin, and cultured with shaking at 30 ° C for 24 hours.
  • the pKU253-Ll-hyg-Rl transformant culture solution was collected, washed twice with 10 mL of sterile water, and suspended in 10 mL of sterile water. Appropriate dilution
  • the suspension was applied to YMS agar medium (0.4% yeast extract, 1% malt extract, 0.4% soluble starch, 2% agar, 10 mM calcium chloride) containing 200 g / mL hygromycin B.
  • the cells were cultured at 30 ° C for 4 days.
  • a single colony grown on a YMS agar medium containing hygromycin B was transferred to a YMS agar medium containing 200 ⁇ g / mL hygromycin B and a YMS agar medium containing 200 ⁇ g / mL ribostamycin.
  • A-1544 strain was inoculated into a medium consisting of 1% gnolecose, malt extract 0.4% and yeast extract 1%, and cultured at 28 ° C for 3 days. The resulting culture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect bacterial cells. Genomic DNA was prepared from the cells using a Blood & Cell Culture kit (QIAGEN).
  • Streptomyces 'Serikara I A3 (2) cytochrome P450 (CYP105D5) and the following mix' primers (5Dm-3F and 5Dm-3R) were designed and created with reference to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) 7 and 1 8).
  • 5Dm-3F 5 '-TTCGCSCTSCCSGTCCCSTCSATGGTSAT-3'
  • 5Dm-3R 5 '-GTTGATSAYSGASGTSGAGAA-3'
  • DNA fragment-Al a DNA fragment having a size of about 500 bp (hereinafter referred to as DNA fragment-Al) was amplified.
  • This DNA fragment-A1 is likely to be a part of DNA encoding a protein having hydroxylation activity.
  • the DNA fragment -A1 amplified by the PCR reaction was recovered from the reaction solution by SUPREC PCR (Takara Bio Inc.).
  • DNA Ligation kit ver. 2 (Takara Bio Inc.) was used in the plasmid vector pT.7Blue T (Novagen). ) was used to ligate the DNA fragment-Al and transformed E. coli strain JM109.
  • L-Broth agar medium (1.0% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl 1.5% agar) was used to select transformed E. coli.
  • L-Broth liquid medium 1% butatotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl
  • Plasmid DNA was separated and purified from the grown transformed Escherichia coli using a plasmid purification kit (QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN) to obtain a certain amount of DNA fragment-A1.
  • the DNA fragment-A1 nucleotide sequence obtained in (2) above was analyzed using a DNA terminator “cycle” sequence method using a DNA nucleotide sequence analyzer (PE Biosystems 377XL).
  • the DNA fragment-A1 amplified by the PCR reaction was measured to be approximately 500 bp by electrophoresis, but the nucleotide sequence analysis revealed that it was exactly 528 bp (SEQ ID NO: 2). Base 1775 to base 2302). Since DNA sequences corresponding to the two types of primers used in the PCR reaction were found at both ends of the cloned 528 bp DNA sequence, the DNA fragment -A1 was used in the PCR reaction. It was revealed that it was specifically amplified by the same kind of primers (5Dm-3F and 5Dm-3R).
  • the A-1544 strain genomic DNA (see (1) in the previous section) was placed in H buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, lOmM MgCl 2 , lOmM dithiosalt, lOOmM NaCl) with restriction enzymes Pstl and Sail. Each was digested. The obtained DNA fragments cleaved by each enzyme were self-circularized using DNA Ligation Kit ver. 2 (Takara Bio Inc.).
  • 6PIN-2F 5'-GCTGCGCCTGGCCCTGGAGGACATCGAGAT-3 '
  • 6PIN-2R 5'-CTGTTCCTCGAAGAACTCGTGGTCGGCGTA-3 '
  • PCR reaction was carried out using these two primers (6PIN-2F and 6PIN-2R) and the above-mentioned self-circulated A-1544 strain genomic DNA as a template.
  • PCR is carried out using Takara LA Taq (Takara Bio) and PCR amplification device (Biometra T Gradient). Denaturation is performed at 98 ° C for 20 seconds, annealing and extension at 68 ° C for 5 minutes. The above reaction was repeated 35 times.
  • DNA fragment-B1 with a size of about 3.5 kbp and a DNA fragment (DNA fragment-C1) with a size of about 2.8 kbp were amplified.
  • DNA fragment-C1 with a size of about 2.8 kbp were amplified.
  • the DNA has a DNA sequence including the upstream and downstream regions.
  • DNA fragment-B1 and DNA fragment-C1 were recovered by SUPREC PCR (Takara Bio Inc.).
  • SUPREC PCR Takara Bio Inc.
  • the plasmid vector pT7Blue T Novagen
  • DNA Ligation kit ver. 2 Takara
  • Escherichia coli JM109 strain Echerichia coli JM109 strain
  • a plasmid purification kit QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN
  • the DNA fragment-B1 and DNA fragment-C1 base sequences obtained in the previous section (4) were analyzed by the dye terminator 'cycle' sequence method using a DNA base sequence analyzer (PE Biosystems 377XL). Thus, the base sequence was analyzed, and information on the 3793 bp base sequence shown in SEQ ID NO: 2 was obtained from the DNA fci fragment-B1 and DNA fragment-C1 sequences. Searching for the open reading 'frame (0RF) in this 3793 bp revealed that two proteins were encoded.
  • psmA and les 0RF encoding a protein consisting of 409 amino acids having high homology with cytochrome P450 in bases 1322 to 2548 of SEQ ID NO: 2 (hereinafter, psmA and les) were present.
  • psmA has the highest homology to the predicted amino acid sequence of Streptomyces sericolor A3 (2) cytochrome P450 (CYP105D5) and the predicted amino acid sequence of Streptomyces lividans cytochrome P450 (CYP105D4).
  • SoyC Streptomyces-Griseus cytochrome P450soy
  • psmB 0RF (hereinafter referred to as psmB) encoding a protein having high homology to the 2Fe-2S type ferredoxin was present immediately downstream of psmA (base 2564 to base 2761 of SEQ ID NO: 2).
  • the protein encoded by psmB consists of 66 amino acids and has the highest homology to the amino acid sequence predicted to be ferredoxin immediately downstream of the predicted amino acid sequence of Streptomyces sericolor A3 (2) cytochrome P450 CYP105D5) (83.3%) and relatively high homology with Streptomyces griseus ferredoxin soy (soyB) (homology 57.6%). Therefore, psmB is thought to be responsible for electron transfer and to code for phredoxin that hydroxylates together with psmA.
  • psmB is thought to be responsible for electron transfer and to code for phredoxin that hydroxylates together with psmA.
  • pT7NS-camAB (see Reference Example 5 and W003 / 087381) is digested with restriction enzymes Ndel and Spel in H buffer (50 mM Tris-HC1, pH7.5, lOmM gCl 2 , lOmM dithiothreitol, lOOmM NaCl) A digest was obtained.
  • primer DM-NdeF (5 '-GCCCCCATATGACGGAACTGACGGACATCA-3': see SEQ ID NO: 3 3) with Ndel site added at the 5 'end and Spel site at the 5' end
  • the added primer DM-SpeR (5′-GGGCCACTAGTCAGCCGGCCdGTTCGGTCA-3 ′: see SEQ ID NO: 3 4) was designed and prepared.
  • PCR reaction was performed using these two primers (DM-NdeF and DM-SpeR) and the A-1544 strain genomic DNA obtained in (1) above as a template.
  • Takara LA Taq (Takara Shuzo) and PCR amplification device
  • plasmid pTC-DM plasmid pTC-DM
  • Reference Example 3 DNA-2 encoding a macrolide compound (II) polypeptide with 16-position hydroxylase activity
  • a culture medium consisting of 1% glucose, 0.4% malt extract, and 1% yeast extract was inoculated with Mer-11107 strain and cultured at 28 ° C for 3 days. The obtained culture solution was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect bacterial cells. Genomic DNA was prepared from the cells using Blood & Cell Culture kit (QIAGEN).
  • Streptomyces cericala is estimated to be cytochrome P450 (CYP105D5) of A3 (2)
  • the following mix 'primers (5Dm-3F and 5D-1R) were designed and created with reference to the amino acid sequence (see SEQ ID NOs: 17 and 21).
  • 5Dm-3F 5 '-TTCGCSCTSCCSGTCCCSTCSATGGTSAT-3'
  • 5D-1R 5 '-AGGTGCCCAGCGAGATCATGTT-3'
  • DNA fragment-A2 was amplified. This DNA fragment -A2 is likely to be a part of DNA encoding a protein having hydroxylation activity.
  • the DNA fragment-A2 amplified by the PCR reaction was recovered from the reaction solution by SUPREC PCR (Takara Bio Inc.).
  • DNA Ligation kit ver. 2 (Takara Bio) was added to the plasmid vector pT7Blue T (Novagen).
  • the DNA fragment-A2 was ligated to transform Escherichia coli JM109 strain.
  • DNA fragment-A2 base sequence obtained in (2) above is converted into a DNA base sequence analyzer (PE Biosystems 377XL) was analyzed by the dye miner “cycle” sequence method.
  • DNA fragment-A2 amplified by PCR reaction was measured to be approximately 300 bp by electrophoresis, but nucleotide sequence analysis revealed that it was exactly 325 bp (SEQ ID NO: 3 Base 837 to base 1161). Since the DNA sequences corresponding to the two primers used in the PCR reaction were found at both ends of the cloned 325 bp DNA sequence, the DNA fragment-A2 was found in the PCR reaction. It was revealed that it was specifically amplified by various primers (5Dm-3F and 5D-1R).
  • primers (7PIN-2F and 6PIN-2R) were designed and prepared from the base sequence of DNA fragment-A2 (see SEQ ID NOS: 22 and 20).
  • 6PIN-2R 5'-CTGTTCCTCGAAGAACTCGTGGTCGGCGTA-3 '
  • PCR reaction was performed using these two kinds of primers (7PIN-2F and 6PIN-2R) and the above-mentioned self-circularized Mer-11107 genomic DNA as a template.
  • the PCR reaction uses Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) and a PCR intensifier (Biometra T Gradient). Denaturation is performed at 98 ° C for 20 seconds, annealing and extension at 68 ° C for 5 minutes. Was repeated 35 times.
  • DNA fragment-B2 a DNA fragment of about 1.3 kb (DNA fragment-B2) and a size of about 1.4 kbp A DNA fragment (DNA fragment-C2) was amplified, but these are likely to be DNA encoding a protein having hydroxylation activity and DNA having a DNA sequence including upstream and downstream regions.
  • DNA fragment-B2 and DNA fragment-C2 were recovered by SUPREC PCR (Takara Bio).
  • SUPREC PCR Takara Bio
  • the plasmid vector pT7Blue T Novagen
  • DNA Ligation 'kit ver. 2 Takara Bio Inc.
  • Escherichia coli JM109 strain Echerichia coli JM109 strain
  • a plasmid purification kit QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN
  • the DNA fragment-B2 and DNA fragment-C2 nucleotide sequences obtained in the previous section (4) were analyzed by a dye terminator-cycle sequence method using a DNA nucleotide sequence analyzer (PE Biosystems 377XL).
  • PE Biosystems 377XL DNA nucleotide sequence analyzer
  • the base sequence was analyzed, and information on the base sequence of 2329 bp shown in SEQ ID NO: 3 was obtained from the DNA fragment-B2 and DNA fragment-C2 sequences.
  • a search for the open 'reading frame (0RF) in 2329 bp revealed that two proteins were encoded.
  • BpmA has the highest homology to the amino acid sequence of psmA isolated from strain A-1544 (homology 67.4%), and also relatively high to Streptomyces griseus cytochrome P450soy (SoyC). There was homology (homology 64.8%). This suggests that bpmA is likely to code cytochrome P450 type hydroxylase.
  • bpmB 0RF (hereinafter referred to as bpmB) encoding a protein having high homology to 2Fe-2S type ferredoxin was present immediately downstream of bpmA (base 1643 to base 1834 of SEQ ID NO: 3).
  • the protein encoded by bpmB consists of 64 amino acids and has the highest homology to the amino acid sequence of psmB isolated from the A-1544 strain (homology 81.0%), and also had a relatively high homology to the predicted amino acid sequence of ferredoxin immediately downstream of the predicted amino acid sequence of Streptomyces sericolor A3 (2) cytochrome P450 (CYP105D5) (76 2%). For this reason, bpmB was thought to be responsible for electron transmission and hydroxylate with bpmA.
  • A-1560 strain was inoculated into a medium consisting of glucose 1%, malt extract 0.4% and yeast extract 1%, and cultured at 28 ° C for 3 days. The resulting culture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to collect bacterial cells.
  • A-1560 strain genomic DNA was prepared from the cells using a Blood & Cell Culture kit (QIAGEN).
  • Streptomyces sericolor A3 (2) cytochrome P450 (CYP105D5) and the following mixed primers (5Dm-3F and 5Dm-2R) were designed and created with reference to the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 17) And 2 3).
  • 5Dm-3F 5 '-TTCGCSCTSCCSGTCCCSTCSATGGTSAT-3'
  • 5Dm-2R 5 '-CTGGATSGTGTCSCCSGGYTT-3'
  • DNA fragment-A3 a DNA fragment having a size of about 750 bp (hereinafter referred to as DNA fragment-A3) was amplified.
  • This DNA fragment-A3 is likely to be part of the DNA encoding a protein with hydroxylation activity.
  • the DNA fragment -A3 amplified by the PCR reaction was recovered from the reaction solution by SUPREC PCR (Takara Bio Inc.). Next, in order to obtain a sufficient amount of DNA fragment-A3 for analyzing the nucleotide sequence of the obtained DNA fragment-A3, DNA Ligation kit ver. 2 ( DNA fragment-A3 was ligated using TAKARA BIO INC. And Escherichia coli JM109 strain
  • Plasmid DNA was separated and purified from the grown transformed Escherichia coli using a plasmid purification kit (QlAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN) to obtain a certain amount of DNA fragment -A3.
  • DNA fragment-A3 base sequence obtained in (2) above was analyzed by a DNA terminator “cycle” sequence method using a DNA base sequence analyzer (PE Biosystems 377XL).
  • DNA base sequence analyzer PE Biosystems 377XL
  • DNA fragment-A3 amplified by PCR reaction was measured to be approximately 750 bp by electrophoresis, but nucleotide sequence analysis revealed that it was exactly 741 bp (SEQ ID NO: 4). Bases 616 to base 1356). Since DNA sequences corresponding to the two kinds of primers used in the PCR reaction were found at both ends of the cloned 741 bp DNA sequence, the DNA fragment-A3 was used in the PCR reaction. It was revealed that it was specifically amplified by the same kind of primers (5Dm-3F and 5Dm-2R).
  • the partial sequence of DNA encoding the protein having hydroxylation activity derived from the A-1560 strain was determined, so that the inverse PCR method (Cell Engineering Vol. 14, p. 591-593, 1995) was used.
  • the base sequence of the peripheral region extending upstream and downstream of the cloning fragment was amplified, cloned, and sequenced. That is, A-1560 strain genomic DNA (see (1) in the previous section) was added to K buffer (50m Tris-HCl, pH 8.5, lOmM MgCl 2 , Im dithiolate).
  • 5PIN-2F 5 '-CGGAATCCACCAGTGCCTCGGCCAGAACCT-3'
  • 6PIN-2R 5'-CTGTTCCTCGAAGAACTCGTGGTCGGCGTA-3 '
  • PCR reaction was performed using these two types of primers (5PIN-2F and 6PIN-2R) and the above-described self-circulated A-1560 strain genomic DNA as a template.
  • the PCR reaction was carried out using Takara LA Taq (Takara Bio Inc.) and a PCR amplification device (Biometra T Gradient). Denaturation was performed at 98 ° C for 20 seconds, and annealing and extension were performed at 68 ° C for 5 minutes. Repeated 35 times.
  • DNA fragment-B3 a DNA fragment of about 4.5 kbp (DNA fragment-B3), a DNA fragment of about 3. Okbp (DNA fragment-C3) and a DNA fragment of about 1.7 kbp (DNA fragment) -D3) was amplified, but these are likely to be DNAs that code for proteins with hydroxylation activity and DNA sequences that include upstream and downstream regions.
  • DNA fragment-B3 and DNA fragment-C3 and DNA fragment-D3 were recovered by SUPREC PCR (Takara Bio Inc.).
  • SUPREC PCR Takara Bio Inc.
  • the plasmid vector pT7Blue T was used as in (2) above.
  • Novagen DNA Ligation kit ver. 2 (Takara Bio)
  • Escherichia coli JM109 strain and plasmid purification kit QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN
  • DNA fragment-B3 (approximately 4.5 kbp size), DNA fragment-C3 (approximately 3. Okbp size) and DNA fragment-D3 (approximately 1.7 kbp size)
  • Nucleotide sequences of DNA fragment-B3, DNA fragment-C3 and DNA fragment-D3 obtained in (4) above The DNA was analyzed by a dye terminator-cycle sequence method using a DNA base sequence analyzer (PE Biosystems 377XL). Thus, the base sequence was analyzed, and the information of the base sequence of 1860 bp shown in SEQ ID NO: 4 was obtained from the sequences of DNA fragment-B3, DNA fragment-C3 and DNA fragment-D3.
  • tpmA is likely to be a gene encoding cytochrome P450 type hydroxylase.
  • 0RF immediately downstream of tpmA (base 1399 to base 1593 of SEQ ID NO: 4), 0RF (hereinafter referred to as tpmB) encoding a protein having high homology to the 2Fe_2S type ferredoxin was present.
  • the protein encoded by tpmB consists of 65 amino acids and has the highest homology to the amino acid sequence of psmB isolated from the A-1544 strain (homology
  • Streptomyces sericolor A3 (2) was also highly homologous to the amino acid sequence presumed to be fluredoxin just downstream of the amino acid sequence estimated to be cytochrome P450 (CYP105D5) (82 . Five%). Therefore, tpmB is thought to encode a ferredoxin that is responsible for electron transfer and hydroxylates together with tpmA.
  • Pseudomonas put ida ATCC 17453 genomic DNA was used as a cage in the following conditions using primers PRR-1F (see SEQ ID NO: 29) and PRR 2R (see SEQ ID NO: 30) consisting of the following sequences: PCR was performed.
  • PRR-1F 5 '-GCCCCCCATATGAACGCAAACGACAACGTGGTCATC-3'
  • PRR-2R 5'-GCGGATCCTCAGGCACTACTCAGTTCAGCTTTGGC-3 '
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 8 1
  • PRR-1F primer (100 pmol / ⁇ 1) 0.5 l
  • PRR-2R primer (100 pmol / ⁇ u 1) 0.5 ⁇ 1
  • the obtained put idaredoxin reductase gene (camA) and the putidaredoxin gene (camB) immediately downstream of the gene were treated with restriction enzymes Nde I and BamHI after treatment with a 1.5 kb amplified fragment (camAB fragment).
  • the fragment was recovered and purified using SUPREC-01 (Takara Shuzo) from the gel slice containing the camAB fragment cut out from this gel. This fragment was ligated to the Nde I site and BamHI site of E. coli plasmid vector pETlla (Stratagene) with T4 DNA ligase, and then transformed into E.
  • plasmid P T7- ca mAB plasmid P T7- ca mAB.
  • one linker molecule obtained by annealing two types of synthetic oligo DNAs SP-1 (see SEQ ID NO: 3 1) and SP-2 (see SEQ ID NO: 3 2) consisting of the sequences shown below was added to this plasmid.
  • the plasmid pT7NS-camAB was constructed by ligation to the NdeI site of the smid by T4 DNA ligase and transformation into E. coli DH5a.
  • SP-1 5'-TATGCGTCACTAGTCGGGAGTGCGTTA-3 '
  • Example 1 Preparation of plasmid pPapsmAB in which pldA promoter and psmAB are linked
  • the promoter region of pldA of the pragenolide B biosynthetic gene is designated as psmAB.
  • PldApro-SpeNdeF add Spel and Ndel sites at the 5 'end: see SEQ ID NO: 25
  • pldApro-NdeR add Ndel sites at the 5' end
  • pldApro-SpeNdeF 5'-GGGCATATGACTAGTAGCCGTGTCCTGCCCGCC-3 '
  • pldApro-NdeR 5'-GGGCATATGTTCGGACGTGAATTCATTCG-3 '
  • dNTP mixed solution (dATP, dGTP, dCTP, dTTP each 2 mM) ⁇
  • pldApi-o-SpeNdeF 50 pmol//iL
  • pldApro-NdeR 50 pmol/ ⁇ L 1 ⁇
  • the amplified 360 bp DNA fragment was recovered using the QlAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). The resulting 360 bp DNA fragment was deleted with the restriction enzyme Ndel.
  • plasmid pTC-DM (Reference Example 2 (6)) was digested with the restriction enzyme Ndel. The obtained digested product of 360 bp DNA fragment and plasmid digested product were ligated using DNA Ligation Kit ver.2.1 (Takara Bio Inc.).
  • a plasmid pPapsmAB having a size of about 9.9 kbp in which the pldA promoter and psmAB were linked was constructed.
  • a recombinant introduction plasmid pAOC :: PapsmAB was constructed by inserting PapsmAB into the recombination introduction vector pUC19aph :: oriT :: intphiC31.
  • Example 3 Plasmid for introduction of recombinant pAOC :: Introduction of PapsmAB into Mer-11107 strain
  • the obtained pAOC :: PapsmAB was transformed into conjugated Escherichia coli S17-1 (ATCC47055) using an electroporation method, Sl7-l / pA0C:: PapsmAB strain was obtained.
  • the obtained S17-1 / pAOC PapsmAB strain was inoculated into 10 mL of LB medium (1% bactryton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 25 g / mL kanamycin, After shaking culture at 30 ° C for 2 hours, the cells were collected, washed twice with 10 mL of LB medium, and suspended in 5 mL of LB medium. This was used as a donor cell suspension. Simultaneously with the preparation of the donor suspension, the Mer-11107 strain was inoculated into TSB medium (Trypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical) lOtnL, shaken at 30 ° C for 5 hours, and collected.
  • TSB medium Trapto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical
  • S17-1 / pAOC PapsmAB strain donor suspension 500 / L was mixed with 10 L of Mer-11107 recipient suspension and applied to Actino Medium No. 4 agar medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). After culturing at 30 ° C for 18 hours, 2.5 mL of SNA (0.8% nutrient medium: Difco, 0.4% agar) containing 2 mg / mL ribostamycin was overlaid. After culturing at 30 ° C for 7 days, a pAOC :: PapsmAB transformant Mer-11107 :: pAOC :: PapsmAB strain resistant to ribostamycin was obtained.
  • Example 4 Mer- 11107:: pA0C: : PapsmAB strain Praz genotype ride production Test
  • Example 3 obtained in Mer- 1110 7:: pA0C:: as PapsmAB strain and Kontoronore the Mer-11107 strain parent, The productivity of pragenolide B and its 16-position hydroxide, pragenolide D, was tested.
  • main culture medium soluble starch 5%, glucose 1%, Pharmamedia 3 %, Ade force Nord LG-126 0.
  • Pragenolide B Pragenolide D
  • Pragenolide B Pragenolide D
  • Pragenolide D (mg / L) (mg / L) (mg / L) (mg / L)
  • Pragenolide D was produced in PapsmAB strain. This indicates that pragenolide D can be produced directly by introducing psmAB, the 16th-position hydroxylase gene of pragenolide B, into the Mer-11107 strain, which is a pragenolide B producing strain. ,
  • Example 5 Mer-11107:: pA0C:: 3ps in production of pragenolide D of PapsmAB strain
  • Mer-1110 7 :: pA0C: Freezing seed mother 300 / iL of PapsmAB, seed medium (soluble starch 2%, soybean flour (Ajinomoto Co., Inc .: Essan Meat) 2%, yeast extract 0.3%, K 2 HP0 4 0.1%, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0.25%, CaC0 3 0.3% pH unadjusted) 30 mL was inoculated and cultured at 25 ° C for 3 days.
  • the amount of accumulated pragenolide D increased by about 1.4 times with the addition of 2% of / 3 -CD, indicating that the addition of i3 -CD is effective for the direct production of pragenolide D. It was done.
  • Example 6 Mer- 11107:: pA0: PapsmAB strain Purajenorai de production (2) obtained in Example 3
  • Mer-11107:: pA0C PapsmAB strain freeze species mother 300 M L a Tanehaha ⁇ locations ( Soluble starch 2%, soy flour (Ajinomoto Co .: Essan Meat) 2%, yeast extract 0.3%, K 2 HP0 4 0.1%, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0.25%, CaC0 3 0.3% pH unadjusted) Inoculated into 30 mL And cultured at 25 ° C for 3 days.
  • the S17 "l / pA0C :: PapsmAB strain obtained in Example 3 was inoculated into 10 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 25 g / mL kanamycin. After culturing at 30 ° C for 2 hours after shaking, the cells were collected, washed twice with LB medium lOniL, and suspended in 5 mL of LB medium. This was used as a donor cell suspension.
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl
  • the Mer-11107 pldB :: hyg strain prepared in Reference Example 1 (8) was inoculated into 10 mL of TSB medium (Trypto_Soya broth: Nissui Pharmaceutical), and 30 After 5 hours of shaking culture at ° C, the cells were collected, washed twice with 10 mL of sterile water, and suspended in 1 mL of sterile water. This was used as a recipient bacterial suspension.
  • the resulting Sn-1 / pAOC :: PapsmAB strain donor suspension 500 L was mixed with Mer-11107 pldB :: hyg strain recipient suspension 10 L, and Actino Medium No.
  • agar medium Japan (Pharmaceutical company). After culturing at 30 ° C. for 18 hours, 2.5 mL of SNA (0.8% nutrient medium: Difco, 0.4% agar) containing 2 mg / mL lipostamycin was overlaid. After culturing at 30 ° C for 7 days, a pAOC :: PapsmAB transformant Mer-11107 pldB :: hyg :: pAOC :: PapsmAB strain resistant to ribostamycin was obtained.
  • Example 8 Pragenolide production test of Mer-11107 pldB:: hyg:: pA0C:: PapsmAB strain
  • Example Mer-11107 pldB :: hyg :: pAOC :: PapsmAB obtained as a control and Mer-11107 pldB :: hyg as the parent strain as a control are ME-265 and its 16-position hydroxide. The productivity of ME-282 was tested.
  • Mer-11107 pldB :: hyg:: pA0C :: PapsmAB strain and Mer-11107 pldB :: hyg strain 300 L of each seed medium (soluble starch 2%, soy flour (Ajinomoto Co., Inc .: S Sunmeat) 2%, yeast extract 0.3 /., K 2 HP0 4 0.1% gS0 4 ⁇ 7H 2 0 0.25%, CaC0 3 0.3% pH unadjusted) C. cultured for 3 days.
  • soluble starch 2%
  • soy flour Aligninomoto Co., Inc .: S Sunmeat
  • yeast extract 0.3 /.
  • CaC0 3 0.3% pH unadjusted C. cultured for 3 days.
  • pldB:: hyg:: pA0C:: PapsmAB strain produced ME-282.
  • ME-282 can be produced directly by introducing psmAB, the 16-position hydroxylase gene of ME-265, into Mer-11107 pldB :: hyg strain, which is a ME-265 producing strain. It was.
  • the Kiriyama funnel 60 ⁇ The cells were separated by filtration with Kiriyama filter paper No. 4). The cells were washed with 50 mL of water to obtain a cell separation filtrate. The cell separation filtrate was extracted twice with lOOmL of ethyl acetate. After drying over anhydrous sodium sulfate, the solvent was removed to obtain a residue.
  • Example 9 Preparation of plasmid pPepsmAB in which ermE promoter and psmAB were linked
  • the ermE promoter region was linked to psmAB.
  • two primers consisting of the following sequences to amplify psmAB, eDM_SphF (add Sphl site at the 5 'end: see SEQ ID NO: 27) And eDM-SphR (added Sphl site at the 5 ′ end: see SEQ ID NO: 28).
  • eDM-SphF 5 '-TCCCCGCATGCCGGAACTGACGGACATCAC-3'
  • eDM- SphR 5 '-CCCGGGCATGCAGACGACGACGTAGAGGAA-3'
  • dNTP mixed solution (dATP, dGTP, dCTP, dTTP 2m each) 5 ⁇ L
  • Example 10 Preparation of recombinant introduction plasmid containing psmAB linked to ermE promoter
  • the plasmid pPepsmAB prepared in Example 9 was digested with restriction enzymes Kpnl and Bglll, and the ends were blunted using BKL Kit (Takara Bio Inc.). Electrophoresis of the resulting DNA on 0.8% Molecular Biology Agarose (registered trademark, BIO-RAD)
  • PepsmAB The isolated 2060 bp ermE promoter and psmAB-containing DNA fragment (hereinafter referred to as PepsmAB) was excised and collected and purified using the QlAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Further, the vector pUC19aph :: oriT :: intphiC31 for introduction of recombination shown in FIG. 4 was digested with the restriction enzyme BamHI, and then BK was used to smooth the ends using Kit (Takara Bio). The vector thus obtained and PepsmAB were ligated using DNA Ligation Kit ver.2.1 (Takara Bio Inc.).
  • a recombinant introduction plasmid pAOC PepsmAB was constructed by inserting PepsmAB into the recombination introduction vector pl) C19aph:: oriT:: intphiC31.
  • Example 11 1 Preparation of a plasmid for recombinant introduction containing natural psmAB
  • DM-BglF (5'-CGCATAGATCTTCACCCGAGCGGGTGATCA-3 ': see SEQ ID NO: 3) and a primer with a Bglll site added to the 5' end with reference to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 and
  • TCCCGAGATCTTGAAGGTCCGCGTCACCGT-3 ′ SEQ ID NO: 36
  • PCR reaction was performed using these two primers (DM-BglF and DM-BglR) and the A-1544 strain genomic DNA obtained in Reference Example 2 (1) as a template.
  • the PCR reaction was performed using Takara LA Taq (Takara Bio) and a PCR amplification device (Biometra T Gradient). Denaturation at 98 ° C for 20 seconds, annealing at 63 ° C for 30 seconds, extension at 68 ° C, 4
  • the three-step reaction performed for 30 minutes was repeated 30 times.
  • a DNA fragment having a size of about 3.5 kbp containing natural psmA and psmB (hereinafter referred to as PopsmAB) was recovered by agarose gel electrophoresis and SUPREC 01 (Takara Bio Inc.). The obtained DNA fragment was digested with the restriction enzyme Bglll.
  • pUC19aph:: oriT:: intphiC31 was digested with the restriction enzyme BamHI.
  • the vector thus obtained and PopsmAB were ligated using DNA Ligation Kit ver. 2.1 (Takara Bio Inc.). This allows PopsmAB to be used as a recombination vector.
  • pUC19aph oriT :: Recombination plasmid inserted into intphiC3l
  • Example 12 Recombinant introduction plasmid pUC19aph:: oriT:: intphiC31,
  • Recombinant transfer vector pUC19aph : oriT :: intphiC31 and Examples 10 0 and 1 pAOC :: PepsmAB and pAOC :: PopsmAB obtained in 1 were conjugated to Escherichia coli S17-1
  • PoepsmAB strain was obtained.
  • the 3 strains obtained were inoculated into 10 mL of LB medium (1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) containing 25 ⁇ g / mL kanamycin and shaken at 30 ° C for 2 hours. After culture, the cells were collected, washed twice with 10 mL of LB medium, and suspended in 5 mL of LB medium. This was used as a donor cell suspension.
  • LB medium 1% bactotryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl
  • the Mer-11107 strain was inoculated into TSB medium (Trypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical) 10n) L, and after shaking culture at 30 ° C for 5 hours, The cells were collected, washed twice with 10 mL of sterilized water, and suspended in 1 mL of sterilized water. This was used as a recipient bacterial suspension.
  • TSB medium Terypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical 10n
  • Example 1 3 Pragenolide production test of Mer-11107:: pA0C strain, Mer-11107:: pA0C :: PepsmAB strain and Mer-11107:: pA0C :: PopsmAB strain
  • seed medium soluble starch 2%, Soy flour (Ajinomoto Co., Inc .: Essan Meat) 2%, yeast extract 0.3%, K 2 HP0 4 0.1%, MgS0 4 ⁇ 7H 2 0 0.25%, CaC0 3 0.3% pH unadjusted
  • the seed culture solution obtained was inoculated into 30 mL of the main culture medium (soluble starch 5%, glucose 1%, Pharmamedia 3 %, CaC0 3 0.1%, pH 7.5) at 25 ° C For 4 days. After completion of the culture, 9 times the amount of acetonitrile was added to the obtained culture solution for extraction. About the obtained extract, the amount of pragenolide B and its 16-position hydroxide pragenolide D was measured by HPLC. Table 6 shows the measurement results. The HPLC measurement conditions are shown below. .
  • Example 14 Production of pPampsmAB containing modified psmA
  • mutations were introduced using the QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit into the pPapsmAB prepared in Example 1 in a saddle type.
  • primers R91C-F and R91C-R (see SEQ ID NOS: 37 and 38) consisting of the sequences shown below were synthesized,
  • R91C-F 5 '-TTCGCGGCCGTCTGCGACCGGCGGGTG-3'
  • R91C-R 5 '-CACCCGCCGGTCGCAGACGGCCGCGAA-3'
  • R195L-F .. 5 '-TCGCAAGGGGCGCTCGAGCGGCTCGAG-3'
  • R 195L-R 5'-CTCGAGCCGCTCGAGCGCCCCTTCCGA-3 '
  • pPampsmAB—CL with pPampsmAB-CL was introduced using the QuickChange TM Site-Directed Mutagenes kit to replace the 195th arginine of PsmA with leucine.
  • primers L403M-F and L403M-R consisting of the sequences shown below were synthesized,
  • L403M-F 5 '-ACGATCCAGGGGATGATGGAACTCCCCGTGA-3'
  • L403M-R 5 '-TCACGGGGAGTTCCATCATCCCCTGGATCG-3'
  • pPampsmAB PPampsmAB-CLM was prepared in which a mutation was introduced so that the 403rd leucine in PsmA was replaced with methionine using QuickChange TM Site-Directed Mutagenes is Kit.
  • primers R236L-F and R236L-R consisting of the sequences shown below were synthesized,
  • R236L-F 5 '-AGCTGGACCGACTCGACGTGGTGGCGCTGG-3'
  • R236L-R 5 '-AGCGCCACCACGTCGAGTCGGTCCAGCTC-3'
  • the PPampsmAB- CLM to ⁇ was prepared Qui ckChange TM Si te-Directed Mutagenesi s Ki t 23 6 th alginic of PsmA was used to introduce a mutation to replace the leucine pPampsmAB- CLLM.
  • primers I244F-F and I244F-R consisting of the sequences shown below were synthesized,
  • I244F-F 5 '-TGGCGCTGGCCGTCTTCCTGCTCGTGG-3'
  • I244F-R 5 '-CCACGAGCAGGAAGACGGCCAGCGCCACCA-3' pPampsmAB-CLFM was constructed using pPampsmAB-CLM as a saddle and a mutation introduced so that phenylalanine was substituted for the 244th isoleucine of PsmA using the QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit.
  • primers M112T-F and M112T-R (see SEQ ID NOS: 47 and 48) having the sequences shown below were synthesized,
  • M112T-F 5 '-CAGCGGCGGATGACGATCCCGTCGTTC-3'
  • M112T-R 5'-GAACGACGGGATCGTCATCCGCCGCTG-3 '
  • pPampsmAB-T was prepared by introducing a mutation so that the 112th methionine of PsmA was replaced with threonine. Then, primers R195Y-F and R195Y-R (see SEQ ID NOS: 49 and 50) having the sequences shown below were synthesized,
  • R195Y-R 5 '-GGTACTCCTCGAGGTACTCGCGCGCCCCT Ding-3'
  • pPampsmAB-T was transformed into pPampsmAB-TY using the QuickChange TM Site-Directed Mutagenes Kit, in which mutations were introduced so that the 195th arginine of PsmA was replaced with tyrosine.
  • Reference Example 1 Based on the determination of the base sequence of the pragenolide biosynthetic gene cluster, using the base sequence including the DNA involved in the biosynthesis of the pragenolide and the surrounding DNA, a double homologous group We thought that it was possible to introduce psmAB or its modified form by replacement, and made a plasmid for introduction by the following method.
  • pldout- L-Bgl2F 5 '-GGGAGATCTGCAGGTCATCGGGGGGAAGAACCACA-3'
  • pldout L-SphlR 5 '-TCTCCAGCCGCATGCGGTCCCGGGTCACCGT-3'
  • pldout-R- SphlF 5 '-CCCGCATGCGGCTGGAGATCATCCAGAGCGCA-3'
  • pldout- R-Bgl2R 5 '-GGGAGATCTAGAACATGCCGGGCCAGAGGCTGAC-3'' PCR was performed using these primers under the following conditions:
  • dNTP mixed solution (2.5 mM each for dATP, dGTP, dTTP, dCTP) 16 L
  • pldout-L— SphlR or pldout- R- Bgl2R 50 pmol/ / i L) 1 ⁇ ⁇
  • DNA fragment LZ a 2.08kb DNA fragment
  • pldout-L-Bgl2F and pldout-L-SphlR pldout-R-SphlF and pldout-R-Bgl2R were used.
  • DNA fragment RX a 2.73 kb DNA fragment
  • DNA fragments LZ and RX were purified with QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN) and then digested with restriction enzymes Bglll and Sphl.
  • hyg-SpeSphF 5 '-GGGGCATGCGGACTAGTACACCGTCGCCTCGGT-3'
  • hyg2-SphR 5 '-GCCGCATGCGTCAGGCGCCGGGGGCGGTGT-3'
  • LA Taq polymerase (5u / ⁇ L, Takara Shuzo) 1 ⁇ L
  • the 1.21 kb DNA fragment (DNA fragment hyg2) amplified as a result of this reaction was purified with the QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN) and then digested with the restriction enzyme Sphl.
  • Example 16 Insertion of psmAB or its variant into plasmid pKU253-LZ-hyg2-RX for introduction by double homologous recombination
  • PPapsmAB constructed in Example 1 and pPampsmAB-CLM, pPampsmAB-CLLM, pPampsmAB-CLFM, and pPampsmAB-TY constructed in Example 14 were digested with the restriction enzyme Spel. Limit 0.8% each DNA digested with enzymes Spel of Certified TM Molecular Biology Agarose (BI0- RAD Co.) on electrophoresis (Mupid- ex: Advance Co., Ltd.), and pldA promoter isolated 1.
  • psmAB or its modified plasmid introduced by double homologous recombination of about 24 kb pKU253-LZ-hyg2-PapsmAB-RX, pKU253-LZ-hyg2- PampsmAB- CLM-RX, pKU253-LZ-hyg2- PampsmAB-CLLM -RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLFM-RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-TY-RX were constructed.
  • Example 17 Insertion of psmAB or its variant into Mer-11107 strain by double homologous recombination
  • PKU253-LZ- hyg2-PapsmAB-RX PKU253-LZ-hyg2-PapsmAB-RX, P KU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CL -RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLLM-RX, pKU253_LZ- hyg2-PampsmAB- CLFM- RX, pKU253- LZ-hyg2- PampsmAB-TY-RX was transformed into conjugated Escherichia coli S17-1 using the electroporation method, respectively.
  • the Mer-11107 strain was inoculated into TSB medium (Trypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical) lOmL, shaken at 30 ° C for 5 hours, and collected. After washing twice with 10 mL of sterilized water, it was suspended in 1 mL of sterilized water. This was used as a recipient bacterial suspension.
  • TSB medium Terypto-Soya broth: Nissui Pharmaceutical
  • the hygromycin B resistance gene hyg2 and psmAB or a variant thereof are inserted downstream of the DNA involved in the biosynthesis of pragenolide in the genome (between base 73362 and base 73369 of SEQ ID NO: 1).
  • Example 1 8 Mer-11107-ZX :: hyg2 :: PapsmAB strain, Mer-11107-ZX :: hyg2 :: PampsmAB-CLM strain, Mer-11107- ⁇ :: hyg2 :: PampsmAB-CLLM strain, Mer- 11107-ZX :: hyg2 :: Pragenolide production of PampsmAB-CLFM strain, Mer-11107-ZX :: hyg2 :: PampsmAB-TY strain
  • Example 11 Mer-11107-ZX :: hyg2 :: PapsmAB strain, Mer-11107-ZX :: hyg2 :: PampsmAB-CLM strain, Mer-11107-Z :: hyg2 :: PampsmAB-CLLM obtained in Example 7 Stock, Mer- 11107-ZX :: hyg2 :: PampsmAB-CLFM strain, Mer-11107-ZX :: hyg2 :: Freezing PampsmAB-TY strain Seed medium, 500 L each of seed medium (soluble starch 2%, soybean flour (Ajinomoto Co., Inc.) : Essent Mito) 2%, yeast extract 0.
  • seed medium soluble starch 2%, soybean flour (Ajinomoto Co., Inc.) : Essent Mito
  • the cells were cultured at 25 ° C for 3 days. 300 ⁇ L of the obtained seed culture solution was added to the main culture medium (soluble starch 5%, glucose 1%, Pharmamedia 3%, Sypro 1%, Adecanol LG-126 0. 05%, / 3 -CD 2.0%, CaC0 3 0.1%, pH 7.5) Inoculated into 30mL and cultured at 25 ° C for 6 days. '
  • pragenolide D by introducing a modified version of psmAB, the 16-position hydroxylase gene of pradenolide B, into the Mer-11107 strain, which produces pragenolite B. It was shown that the production of degradation products of pragenolide D can be reduced.

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Abstract

本発明は、16位水酸化マクロライド系化合物を直接生産する遺伝子組換え微生物、およびそれらの遺伝子組換え微生物を用いた16位水酸化マクロライド系化合物の製造方法を提供する。詳しくは、マクロライド系化合物プラジエノライドの生合成に関与するポリペプチドをコードするDNAおよびプラジエノライドの16位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードするDNAを有する遺伝子組換え微生物、およびそれらの遺伝子組換え微生物を培地で培養し、その培養液から16位水酸化マクロライド系化合物を採取することを特徴とする、16位水酸化マクロライド系化合物の製造方法である。

Description

明細書 遺伝子組換え微生物およびそれらの微生物を用いるマクロライ ド系化合物の製造 方法 技術分野
本発明は、 16位水酸化マクロライ ド系化合物を生産する能力を'有する遺伝子組 換え微生物、 およびそれらの微生物を用いた 16位水酸化マクロライ ド系化合物の 製造方法に関する。 背景技術
放線菌の生産する様々な代謝産物のなかには生理活性物質として重要な物質が 見出されている。 とりわけ構造上ポリケチドを母核にもつ化合物 （以下、 ポリケ チド化合物という） が多く見出されている。 例えば、 抗菌性物質として知られる エリスロマイシン、 ジョサマイシン、 タイ口シン、 ミデカマイシン、 マイシナマ イシン、 抗真菌性物質として知られるナイスタチン、 アンフォテリシン、 殺虫性 物質として知られるミルべマイシン、 エバーメクチン、 免疫抑制物質として知ら れるタクロリムス、 ラパマイシンおよび抗腫瘍性物質として知られるダウノマイ シン、 アドリアマイシン、 アクラシノマイシン等、 種々の生物活性を有する化合 物が知られている。
そのようなポリケチド化合物の 1つとしてプラジェノライドと命名された優れ た抗腫瘍活性を示す一群のマクロライド系化合物がある。 プラジェノライ ドは、 放線菌ストレプトミセス · エスピー（Streptomyces sp. ) Mer- 11107株の培養物か ら見出された化合物群の総称であり、 下記式 (A)で示される 11107B (プラジェノラ ィド Bというときがある） をはじめとして 50種以上の類縁体が知られている（W O 2 0 0 2 / 0 6 0 8 9 0参照）。
Figure imgf000003_0001
このようなプラジェノライドのうち、 下記式（I)で示される 16位水酸化体は、 強い抗腫瘍活性等の優れた性質を有しているが、 その生産性は 11107Bの生産性よ りも少なく、 効率的な製造は難しかった。
Figure imgf000003_0002
(但し、 Rは水素原子または水酸基を示す）
なお、 式（I)において、 Rが水素原子である化合物を ME - 282、 Rが水酸基である 化合物を 11107Dまたはプラジェノライド Dというときがある。
その後、 本出願人らの研究グループは、 11107Bの 16位水酸化反応を行う、 プラ ジエノライ ド生産菌とは別の放線菌を見出し （WO 2003/09981 3およ び WO 2004/050890参照） 、 それらの放線菌から 11107Bの 16位水酸 化反応に関与する DNA (16位水酸化酵素およびそのフェレドキシンをコードする DNA) を取得、 同定した （2005年 6月 9日頒布の WO- A 2005/052152参照） 。 また、 プラジェノライド生産菌であるス トレプトミセス 'エスピー (Streptomyces sp. ) ¾^:-11107株から 11107Bの生合成に関与するポリペプチドお よびそれらのポリペプチドをコードする DNAについても取得、 同定した （2 0 0 6年 1月 2 6日頒布の W0 - A 2006/009276参照） 。
こうしてストレプトミセス 'エスピー（Streptomyces sp. ) Mer-11107株または その改変体を用いて 11107B等を生産し、 得られた 11107B等をそれらの 16位水酸 化反応を行う他の放線菌により 16位水酸化体へと変換することで、 これまでより 16位水酸化体を効率的に製造できるようになった。 しかし、 2 ¾階の反応を行う ため作業上の手間も 2倍となり、 より効率的な製造方法の確立が望まれていた。 一方、 ポリケチド化合物を生産する菌株に、 そのポリケチド化合物を修飾する 酵素をコードする遺伝子を発現できる形で導入することにより、 導入した酵素に より修飾されたポリケチド化合物を直接生産した例は知られている。 例えば、 テ トラセノマイシン Cを生産するストレプトミセス 'グラウセスセンス
(Streptomyces glaucescens) GLA. 0株に、 ス卜レプ卜ミセス · フラジェ' (Streptomyces fradiae) Tu2717株の水酸化遺伝子を導入することにより、 6 _ ヒドロキシ -テトラセノマイシン Cが直接生産できることが報告されている (J. Bacteriol, 1995, vol. 177, 6126- 6136参照) 。
また、 ポリケチド化合物を修飾する酵素をもつ菌株にそのポリケチド化合物の 生合成遺伝子を発現できる形で導入することにより、 宿主となる菌株が本来持つ 酵素により修飾されたポリケチド化合物が直接生産された例も知られている。 例 えば、 テトラセノマイシン Cの 6位を水酸化する酵素をもつス トレプトミセス - フラジェ (Streptomyces fradiae) Tu2717株に、 ストレプトミセス ·グラウセス センス （Streptomyces glaucescens) GLA. 0株のテトラセノマイシン Cの生合成遺 伝子を導入することにより、 6—ヒドロキシ -テトラセノマイシン Cを直接生産で きることが報告されている (J. Bacterid, 1995, vol. 177, 6126-6136参照） 。 さらに、 ポリケチド化合物の生合成遺伝子と、 そのポリケチド化合物を修飾す る酵素をコードする遺伝子の両方を異種菌株に導入することにより、 異種菌株に よる修飾ポリケチド化合物の生産ができる場合がある。 例えば、 ストレプトミセ ス - リビダンス （Streptomyces l ividans) K4- 114株を宿主に、 サッカロポリスポ ラ 'エリスレア （Saccharopolyspora erythraea) 株由来の 6 -ェリスロノライ K B 合成酵素をコードする遺伝子とストレプトミセス 'アンチビォテカス
(Streptomyces antibioticus) ATCC11891株由来の P- 450遺伝子の両方を導入す ることにより、 8， 8a-ジハイ ドロキシ- 6 -エリスロノライ ド Bが直接生産されたこ とが報告されている (J. Antibiot.， 2000, vol. 53， 502-508参照） 。 発明の開示
本発明の課題は、 前記式（I)で表わされる 16位水酸化マクロライド系化合物を 生産する能力を有する遺伝子組換え微生物を提供することである。 さらには、 そ れら遺伝子組換え微生物を用いた 16位水酸化マクロライ ド系化合物の製造方法を 提供することである。
本発明者らは、 前記課題を解決するため、 先に分離同定された 11107Bの生合成 に関与する DNAと 11107Bの 16位水酸化反応に関与する DNAを両方とも持つ微生 物を遺伝子工学の手法により作製 （育種） したところ、 その培養液に多量の 16位 水酸化マクロライ ド系化合物が蓄積されていることを見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明は、 以下の [ 1 ] 〜 [ 2 1 ] に関する。
[ 1 ] 式 (I)
Figure imgf000005_0001
(但し、 Rは水素原子または水酸基を示す） で表わされる 16位水酸化マクロライ ド系化合物を生産する能力を有する微生物であって、
(a) 式 (I I)
Figure imgf000006_0001
(但し、 Rは水素原子または水酸基を示す） で表わされるマクロライ ド系化合物 の生合成に関与するポリべプチドを一部にまたは全体としてコードする DNA、 およ び .
(b) 前記式（II)で表わされるマクロライ ド系化合物の 16位水酸化酵素活性を 有するポリべプチドを一部にまたは全体としてコードする DNA、
を有する遺伝子組換え微生物。
[ 2 ] 前記（a)で表わされる DNA力 ポリケチド合成酵素活性を有するポリべ プチド、 7位ァセチル化酵素活性を有するポリペプチド、 18， 19位エポキシ化酵素 活性を有するポリぺプチドおよび転写調節因子活性を有するポリべプチドを一部 にまたは全体としてコードする DNAである [ 1 ] 記載の遺伝子組換え微生物。
[ 3 ] 前記（a)で表わされる DNA力
(a-1) 配列番号 1の塩基 8340から塩基 27935までの連続した塩基配列
(a-2) 配列番号 1の塩基 28021から塩基 49098までの連続した塩基配列
(a - 3) 配列番号 1の塩基 49134から塩基 60269までの連続した塩基配列
(a-4) 配列番号 1の塩基 60269から塩基 65692までの連続した塩基配列
(a-5) 配列番号 1の塩基 68160から塩基 66970までの連続した塩基配列
(a-6) 配列番号 1の塩基 69568から塩基 68270までの連続した塩基配列、 および (a-7) 配列番号 1の塩基 72725から塩基 70020までの連続した塩基配列
を含んでなる DNAまたはその改変体である [ 1 ] または [ 2 ] 記載の遺伝子組換 え微生物。 [ 4 ] 前記（a)で表わされる DNAが、 さらに 6位水酸化酵素活性を有するポリ ペプチドを一部にまたは全体としてコードする DNAを含む [ 2 ] または [ 3 ] 記 載の遺伝子組換え微生物。
[ 5 ] 6位水酸化酵素活性を有するポリぺプチドを一部にまたは全体としてコ 一ドする DNAが、 配列番号 1の塩基 65707から塩基 66903までの連続した塩基配 列を含む DNAまたはその改変体である [ 4 ] 記載の遺伝子組換え微生物。
[ 6 ] 前記（b)で表わされる DNAが、
(b - 1) 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列、
(b-2) 配列番号 3の塩基 420から塩基 1604までの連続した塩基配列、 および (b-3) 配列番号 4の塩基 172から塩基 1383までの連続した塩基配列
からなる群より選択される DNAまたはその改変体である [ 1 ] から [ 5 ] までの いずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
[ 7 ] 前記（b)で表わされる DNAが、 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548ま での連続した塩基配列を含んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からな る群より選択される改変部位を 1または 2以上有する、 [ 1 ] 力 [ 6 ] までの いずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 メチォニン以外のァミノ酸を コードするコ ドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のアミノ酸を コ一ドするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 ィソロイシン以外のァミノ酸 をコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 ロイシン以外のアミノ酸をコ ードするコドンに改変した改変部位 [ 8 ] 前記（b)で表わされる DNAが、 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548ま での連続した塩基配列を含んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からな る群より選択される改変部位を 1または 2以上有する、 [ 1 ] 力 [ 6 ] までの いずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィン、 メチォニンまた はプロリンをコ一ドするコドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンまたはセリンをコ 一ドするコ ドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシン、イソロイシン、 プロ リン、 チロシンまたはフエ二ルァラニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシン、 イソロイシンまた はプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フエ二ルァラニンまたはバリ ンをコードするコ ドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 メチォニン、システィンまたは イソロイシンをコードするコ ドンに改変した改変部位
[ 9 ] 前記（b)で表わされる DNAが、 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548ま での連続した塩基配列を含んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からな る群より選択される改変部位を 1または 2以上有する、 [ 1 ] から [ 6 ] までの いずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィンをコードするコド ンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンをコ一ドするコド ンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシンまたはチロシンをコ ードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシンをコードするコドン に改変した改変部位 5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フ; ^二ルァラニンをコードす るコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 メチォニンをコードするコド ンに改変した改変部位
[ 1 0] 前記 (a)で表わされる DNAを有する宿主に、 異種微生物由来の前記 (b)で表わされる DNAを組み込んだ [ 1 ] 記載の遺伝子組換え微生物。
[ 1 1 ] 前記 (b)で表わされる DNAを有する宿主に、 異種微 物由来の前記 (a)で表わされる DNAを組み込んだ [ 1 ] 記載の遺伝子組換え微生物。
[ 1 2] 前記（a)および（b)で表わされるいずれの DNAも有しない宿主に、 異 種微生物由来の前記（a)および（b)で表わされる DNAを两方とも組み込んだ [ 1 ] 記載の遺伝子組換え微生物。
[ 1 3 ] 式（I)で表わされる 16位水酸化マクロライ ド系化合物を生産する能 力を有する遺伝子組換え微生物が、 ストレプトミセス （Streptomyces) 属に属す る菌株である [ 1〕 から [ 1 2] までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
[ 1 4] 下記の培地 30mLを入れた 250mL容の三角フラスコに遺伝子組換え微 生物を植菌し、 25°Cで 4日間回転振とう培養 （220rpm) した後、 ァセトニトリル 270mLを加えて抽出し、 得られた抽出液を下記の測定条件で HPLC分析し、 式（I)で 表わされる 16位水酸化マクロライ ド系化合物を定量したときに、 式（I)で表わさ れる 16位水酸化マクロライ ド系化合物を培養液 1 L当り 50mg以上生産する能力を 有する [ 1 ] から [ 1 3] までのいずれかに記載の遺伝子組換え微生物。
(培地)
溶性デンプン 5%、 グルコース 1%、 フアルマメディア 3%、 CaC03 0.1%、 pH7.5
(HPLC測定条件）
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil ODS UG - 3 ( φ 4.6mm X 50mm 3μ π)
移動相： 45%〜55%メタノール（0〜5分）、 55%メタノール（5〜13分）、 55%〜 70%メタノ一ル（13〜21分）、 70%メタノール (21〜25分） 流速： 1.2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5 L
カラム温度： 40°C
[1 5] [1] から [1 4] までのいずれかに記載された遺伝子組換え微生 物を、 栄養培地中で培養し、 その培養液から式（I)で表わされる 16位水酸化マク 口ライ ド系化合物を採取することを特徴とする、 式（I)で表わさ る 16位水酸化 マクロライ ド系化合物もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの水和物 の製造方法。
[1 6] 培養液中にシクロデキストリン類を存在させることを特徴とする [1 5] に記載の方法。
[1 7] シクロデキストリン類が、 β—シクロデキス トリン、 γ—シクロデ キストリン、 部分メチル化 3—シクロデキストリン、 ジメチル一 β—シクロデキ ス トリン、 トリメチル _ j3—シクロデキストリン、 グリコシルー ]3—シクロデキ ストリンおよびヒ ドロキシプロピル一 ;3—シクロデキストリンからなる群から選 択されるシクロデキストリン類である [1 6] に記載の方法。
[1 8] 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列を含 んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる群より選択される改変部 位を 1または 2以上含んでなる DNA改変体。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コードするコ ドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 メチォニン以外のアミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のアミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 ィソロイシン以外のァミノ酸 をコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 ロイシン以外のァミノ酸をコ 一ドするコドンに改変した改変部位
[ 1 9 ] 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列を含 んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1；)〜 6)からなる群より選択される改変部 位を 1または 2以上含んでなる DNA改変体。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィン、'メチォニンまた はプロリンをコ一ドするコドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンまたはセリンをコ ードするコ ドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシン、イソロイシン、 プロ リン、 チロシンまたはフエ二ルァラニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシン、 イソロイシンまた はプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フエ二ルァラニンまたはバリ ンをコ一ドするコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 メチォニン、システィンまたは イソロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
[ 2 0 ] 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列を含 んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる群より選択される改変部 位を 1または 2以上含んでなる DNA改変体。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィンをコ一ドするコド ンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンをコードするコド ンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシンまたはチロシンをコ ードするコドンに改変した改変部位 一
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシンをコ一ドするコドン に改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フヱニルァラニンをコードす るコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 c.tgを、 メチォニンをコードするコド ンに改変した改変部位
[ 2 1 ] [ 1 8 ] から [ 2 0 ] までのいずれかに記載された DNA改変体によ りコードされるポリペプチド。 '
なお、 本明細書における各用語の定義は以下のとおりである。
「遺伝子組換え微生物」 とは、 遺伝子組換え技術を用いて特定の微生物に別の 生物由来の遺伝子を導入した微生物 （細菌、 放線菌、 酵母、 糸状菌等） を意味し、 それに用いる遺伝子導入の手法は、 プラスミ ド等のベクタ一を用いた遺伝子組換 えだけでなく、 相同組換え等の手法も包含する。
「DNAの改変体」 とは、
(1) 元の DNAとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA、
(2) 元の DNAの塩基配列との相同性が 70%以上である塩基配列を有する DNA、
(3) 元の DNAの塩基配列と相補的な塩基配列を有する DNA、 または
(4) 遺伝暗号の縮重のため、 元の DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズしないが、 （1)項から（3)項までのいずれかの項で定義された DNAがコードす るァミノ酸配列と同じ配列をコードする塩基配列を有する DNA
を意味する。
なお、 「ス トリ ンジェントな条件下でハイブリダイズする DNA」 とは、 例えば、 元の DNAをプローブとして、 コロニー 'ハイブリダィゼ一シヨン法、 プラーク ' ハイブリダィゼ一シヨン法あるいはサザンハイブリダイゼーシヨン法等を用いる ことにより得られる DNAを意味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来 の DNAを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜L 0Mの塩化ナトリゥム存在下、 65°Cでハイブリダイゼ一ションを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC溶液 （1倍濃度 の SSC溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウムよりな る） を用レ、、 65°C条件下でフィルタ一を洗浄することにより同定できる DNAを挙 げることができる。
「類縁体」 とは、 化学構造を特徴づける主骨格が同じで、 修飾の様式や側鎖の 形状などが異なる化合物を意味する。
「16位水酸化酵素活性」 とは、 マクロライド系化合物（II)の 16位水素原子を水 酸基に変換する活性を意味する。
「6位水酸化酵素活性」 とは、 下記式 (B)で表わされるマクロライド系化合物 ( E-265 というときがある） の 6位水素原子を水酸基に変換ずる活性を意味する c
Figure imgf000013_0001
「ポリケチド合成酵素活性」 とは、 下記式 (E)で表わされるマクロライド系化合 物を合成する活性を意味する。
Figure imgf000013_0002
「7位ァセチル化酵素活性」 とは、 下記式 (C)で表わされるマクロライ ド系化合 物の 7位水酸基をァセチル基に変換する活性を意味する。
Figure imgf000014_0001
(但し、 Rは水素原子または水酸基を示す）
「転写調節因子活性」 とは、 マクロライド系化合物（Π)の生合成に関与するポ リぺプチドをコ一ドする DNAの転写を調節する活性を意味する。
本発明により、 マクロライ ド系化合物（II)の生合成に関与するポリペプチドを コードする DNAおよびマク口ライ ド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活性を有する ポリペプチドをコードする DNAをもつ、 16位水酸化マクロライド系化合物（I)を直 接発酵生産することが可能な遺伝子組換え微生物を得ることができる。 またその 遺伝子組換え微生物を培養し培養液中から採取することにより 16位水酸化マク口 ラィ ド系化合物（I)を効率よく生産することができる。
特に 16位水酸化酵素活性を有するポリぺプチドのァミノ酸配列を一部改変した ポリべプチドをコ一ドする DNAを上述の方法に適用することにより、 16位水酸化 マクロライ ド系化合物（I)をさらに効率よく選択的に生産することができる 図面の簡単な説明
図 1は、 Mer- 11107株におけるプラジェノライ ドの生合成経路を示した図である 図 2は、 Mer- 11107株におけるプラジェノライドの生合成に関与する DNAの各 0RFとコスミ ドの対応関係を示した図である。
図 3は、 プラスミ ド pKU253の構造を示す図である。 '
図 4は、 プラスミ ド pUC19aph : : oriT: : intphiC31の構造を示す図である。 発明の詳細な説明
以下、 本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明における、 マクロライド系化合物（II)の生合成に関与するポリペプチド をコードする DNAは、 当該技術分野で周知の方法 （例えば、 モレキユラ ·クロー ユング第 2版に記載されたコロニーハイブリダィゼーシヨン法） に従って、 当該 マクロライ ド系化合物を生産する能力を有する微生物の培養菌体から得ることが できる。 このような微生物としては、 当該マクロライド系化合物を生産する能力 を有するものであれば種および株の種類を問うことなく使用できる力 好ましい 微生物としてストレプトミセス（Streptomyces)属放線菌に属する菌株を挙げるこ とができる。 その一例として、 土壌から分離されたス トレプトミセス 'エスピー (Streptomyces sp. ) Mer- 11107株を挙げることができる。 Mer- 11107株は、 FERM P-18144として平成 12年 12月 19日付で日本国 305-8566 茨城県つくば巿東 1丁 目 1番 3号在の工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、さらに平成 13年 11月 27日付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独 立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（IP0D)において、国際寄託 FERM BP-7812に移管された。
以下、 Mer- 11107株の場合を例に挙げ、 目的の DNAを取得する操作の概要を説明 する。 まず Mer-11107株のゲノム DNAを適当な制限酵素で部分分解したものを、 大腸菌内で複製可能なコスミ ドベクターを適当な制限酵素で分解したものと連結 して得た組換え DNAを大腸菌に組込み、 形質導入株を得る。 次に公知の水酸化酵 素（シトクロム P450酵素）遺伝子の断片をプローブとして、 先に得られた多数の形 質導入株をスクリーニングし、 プローブと結合する形質導入株を選択する。 そし て選択されたコスミ ド中に存在する水酸化酵素遺伝子と結合する DNAを取得し、 配列を決定する。 さらにこれを大腸菌に導入し、 形質転換された大腸菌が 6位水 酸化酵素活^~生をもっことを確認した上で、 この 6位水酸化酵素をコードする DNA をプローブに用いてサザンハイブリダイゼーションを行い、 先 取得した多数の 陽性クローン（コスミ ド）カゝら 6位水酸化酵素をコードする DNAに隣接するマクロ ライ ド系化合物の生合成遺伝子クラスタ一を含むコスミ ドを選択し整列化するこ とにより取得することができる。 これらの操作全体についての詳細は、 参考例 1 に記載されており、 また本出願人らによる W0 - A 2006/009276明細書にも記載され ており、 これらの記載を参照することができる。
こうして取得されるマクロライド系化合物（II)の生合成に関与するポリべプチ ドをコ一ドする DNAの周辺領域を含むヌクレオチド配列 （コ一ド配列におけるァ ミノ酸配列） を配列表の配列番号 1に示す。
この配列番号 1で示される DNAには、 pldA I (±盒基 8340〜27935) 、 pldA II
(± 基 28021〜49098) 、 pldA III (塩基 49134〜60269) 、 pldA IV (塩基 60269〜 65692) 、 pldB (塩基 65707〜66903) 、 pldC (塩基 68160〜66970) ； pldD (塩基 69568〜68270) および pldR (± 基 72725〜70020) の 8つのオープン ' リーデイン グ - フレーム（0RF)が含まれている。
これらの DNAのうち、 pldA I、 pldA II、 pldA IIIおよび pldA IVには、 既に明 らかにされている他のポリケチド生合成遺伝子と同様にモジュールと呼ばれる 1 またはそれ以上の反復単位をそれぞれ含むいくつかの転写解読枠がある。 そして 各モジュールは後述するとおりポリケチド合成の縮合反応に関与するァシルキヤ リア一タンパク質 （ACP) 、 -ケトァシル ACP合成酵素 （KS) 、 ァシル転移酵素
(AT) と、 J3位カルボニル基修飾反応に関与するケトァシル還元酵素 （KR) 、 脱 水酵素 （DH) およびエノィル還元酵素 （ER) から選択されるドメインの全てある いはいくつかをコードしており最後のモジュールにはポリケチド鎖をポリケチド 合成酵素から切り離すチォエステラーゼ （TE) ドメインが存在している。
図 1に、 Mer - 11107株におけるマクロライド系化合物の生合成経路を示した。 開 始モジュール （loading module) は他のモジュールと違って活性中心のシスティ ンがグルタミンに置換されていることより、 pldA Iは初発反応に関与しているこ とがわかる。 またモジュール 10にはチォエステラーゼ （TE) ドメインがあること より、 pldA IVはポリケチド基本骨格の合成の最後の反応に関与していることがわ かる。 こう してポリケチドの基本骨格が形成された後、 さらに、' pldDがコードし ている 18, 19位エポキシ化酵素、 pldCがコ一ドしている 7位ァセチル化酵素およ び pldBがコードしている 6位水酸化酵素により修飾を受け、 マクロライド系化合 物（II)が生合成される。 なお、 マクロライド系化合物（II)のうち、 Rが水素原子 である化合物は、 pldBを欠失させる力 機能を発現しないように改変することに より製造することができる。 また pldRはエバーメクチン生合成における転写調節 因子をコードする遺伝子 aveRとの相同性が高く、 マクロライ ド系化合物の生合成 に関与する DNAの転写調節因子をコードしている。
本発明における、 マク口ライド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活性を有するポ リペプチドをコードする DNAも、 当該技術分野で周知の方法 （例えば、 モレキュ ラ . クローニング第 2版に記載されたコロニーハイブリダィゼーシヨン法） に従 つて、 当該マクロライ ド系化合物の 16位水酸化能を有する微生物の培養菌体から 得ることができる。 このような微生物としては、 当該マクロライ ド系化合物の 16 位水素原子を水酸基に変換する能力を有するものであれば種および株の種類を問 うことなく使用できるが、 好ましい微生物として放線菌に属する菌株を挙げるこ とができる。 その例として、 土壌から分離された、 ストレプトミセス ' エスピー (Streptomyces sp. ) A - 1544株、 ス トレプ卜 セス · エスピー (Streptomyces sp. ) Mer- 11107株あるレ、はス トレプトミセス 'エスピー（Streptomyces sp. ) A-1560株 を挙げることができる。 A - 1544株は、 FERM P-18943として平成 14年 7月 23日付 で日本国 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産 業技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、 さらに平成 15年 7月 30日 付で日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人 産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（IP0D)において、国際寄託 FERM BP - 8446に移管された。 A-1560株は、 FERM P- 19585として平成 15年 11月 13日付で 日本国 305-8566茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産業 技術総合研究所、特許生物寄託センターに寄託され、さらに平成 16年 8月 19日付 で日本国 305-8566茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6在の独立行政法人産 業技術総合研究所、特許生物寄託センター（IP0D)において、国際寄託 FERM BP- 10102 に移管された。
以下、 A- 1544株の場合を例に挙げ、 目的の DNAを取得する操作の概要を説明す る。 まず A-1544株のゲノム DNAを調製し、 次に公知の水酸化酵素（シトクロム P450酵素）遺伝子の配列情報を基にプライマーを調製して PCR反応を行い、 特異的 に増幅された DNA断片を取得し、 その配列を決定する。 さらに得られた配列情報 を基にインバース PCR法（細胞工学 14卷、 p. 591- 593， 1995年）によって、 クロー二 ングされた DNA断片の上流、 下流域に広がる周辺領域の塩基配列を増幅、 クロー ニング、 配列解析することにより取得することができる。 これらの操作全体につ いての詳細は、 参考例 2 (A- 1544株） 、 参考例 3 (Mer- 11107株） および参考例 4 (A- 1560株） に記載されており、 また 2 0 0 5年 6月 9日頒布の W0 - A
2005/052152にも記載されており、 これらの記載を参照することができる。
こうして A-1544株から取得されるマクロライド系化合物（I I)の 16位水酸化酵 素活性を有するポリペプチドをコードする DNA (周辺領域を含む） は配列表の配列 番号 2に示すとおりである。 この配列番号 2で示される DNAには、 psmA (塩基 1322〜塩基 2548) および psmB (塩基 2564〜塩基 2761) の 2つのオープン ' リ一 デイング . フレーム（0RF)が含まれており、 それぞれ、 16位水酸化酵素およびフエ レドキシンをコ一ドしている。
同様に Mer - 11107株から取得されるマクロライ ド系化合物（I I)の 16位水酸化酵 素活性を有するポリペプチドをコードする DNA (周辺領域を含む） は配列表の配列 番号 3に示すとおりである。 この配列番号 3で示される DNAには、 bpmA (塩基 420 〜塩基 1604) および bpmB (塩基 1643〜塩基 1834) の 2つのオープン ' リ一ディ ング. フレーム（0RF)が含まれており、 それぞれ、 16位水酸化酵素およびフェレド キシンをコードしている。
A - 1560株から取得されるマクロライ ド系化合物（Π)の 16位水酸化酵素活性を有 するポリぺプチドをコ一ドする DNA (周辺領域を含む） は配列表の配列番号 4に示 すとおりである。 この配列番号 4で示される DNAには、 tpmA (塩基 172〜塩基 1383) および tpmB (塩基 1399〜塩基 1593) の 2つのオープン ' リーディング' フ レニム（0RF)が含まれており、 それぞれ、 16位水酸化酵素およびフェレドキシンを コードしている。 ''
また上述した 16位水酸化酵素活性を有するポリペプチドをコードする各種 DNA の改変体は、 次のようにして取得することができる。 まず元の DNAの配列情報を 基に部位特異的な改変処理を行い、 次いで得られた部位特異的 DNA改変体を宿主 に組み込み、 その遺伝子組換え微生物の 16位水酸化酵素活性の強さおよび選択性 の高さを指標として選択し、 取得することができる。 部位特異的な改変処理は、 例えば元の DNAがクロ一エングされているプラスミ ドを錶型とし、 その配列情報 を基に設計したプライマ一を用いて、 市販のキット、 例えば、 QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (ス卜ラタジーン社） (Stratagene Co. )など用レヽて 行うことができる。
このような改変体のうち 16位水酸化酵素活性が強くしかも選択性が高いものと して、 例えば A-1544株から得られる 16位水酸化酵素をコードする psmAの場合、 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列を含み、 以下の 1) 〜6)からなる群より選択される改変部位を 1または 2以上含んでなる DNA改変体 を挙げることができる。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸、 好ましくはシスティンをコ一ドするコドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 メチォニン以外のアミノ酸、 好ましくはスレオニンをコードするコドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のアミノ酸、 好ましくはロイシンまたはチロシンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のアミノ酸、 好ましくはロイシンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ate を、 イソロイシン以外のアミノ酸、 好ましくはフエ二ルァラニンをコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 ロイシン以外のアミノ酸、 好 ましくはメチォニンをコードするコドンに改変した改変部位
本発明の組換え体は、 前記 「マクロライ ド系化合物（II)の生合成に関与するポ リペプチドをコードする DNA」 および 「マクロライド系化合物（ΓΪ)の 16位水酸化 酵素活性を有するポリぺプチドをコ一ドする DNA」 を保有する遺伝子組換え微生物 であり、 以下の A)〜C)に示す方法により作製することができる。
A) 「マクロライ ド系化合物（II)の生合成に関与するポリペプチドをコードする DNAJ を元々もっている宿主に 「マクロライド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活 性を有するポリべプチドをコ一ドする DNA j を組み込む。
B) 「マクロライド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活性を有するポリペプチド をコードする DNAj を元々もっている宿主に 「マクロライ ド系化合物（II)の生合成 に関与するポリペプチドをコードする DNA」 を組み込む。
C) 「マクロライド系化合物（II)の生合成に関与するポリペプチドをコードする DNA」 および 「マクロライ ド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活性を有するポリべ プチドをコードする DNA」 の両方とももっていない宿主に、 これらの DNAの両方を 組み込む。
本発明の組換え体における宿主は、 目的の DNAを組み込むことができ、 目的の 16位水酸化マク口ライド化合物を生産できる微生物であれば特に制限はなく使用 できるが、 好ましい微生物としてス トレプトミセス（Streptomyces)属放線菌に属 する菌株を挙げることができる。 例えば前記 A)の場合は、 ストレプトミセス 'ェ スピ一（Streptomyces sp. ) Mer- I I IO7株等、 前記 B)の場合は、 ス トレプトミセ ス 'エスピー（Streptomyces sp. ) A- 1544株、 ス トレプトミセス 'エスピー
(Streptomyces sp. ) Mer- 11107株あるいはス トレプトミセス 'エスピー
(Streptomyces sp. ) A- 1560株等を挙げることができる。 また前記 C)の場合は、 大腸菌 (Escherichia coli)に属する菌株等を挙げることができる。 このような宿主に目的の DNAを組み込み発現させるためには、 特に制限はない が、 例えばモレキュラー ' クロ一ニング第 2版、 カレント ' プロ トコ一ルズ 'ィ ン - モレキュラー ·バイオロジー等に記載された方法を用いて行うことができる。 宿主、 プラスミ ド-ベクター系は、 目的の DNAが宿主中で安定に保持、 発現できる 系であれば特に制限はない。 またプラスミ ドは、 目的の DNA以外に、 自律複製配 列、 プロモーター配列、 ターミネータ一配列、 薬剤耐性遺伝子等を含んでいても よく、 プラスミ ドの種類としては、 自律複製性プラスミ ドだけで :なく、 使用が予 定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型プラスミ ドであつ てもよレ、。 目的の DNAを組み込む部位は、 プラスミ ド上または宿主微生物のゲノ ム上のいずれでもあってもよい。
宿主として放線菌あるいはその類縁株を宿主とするならば、 自律複製型べクタ 一 PIJ6021 (Gene, 166， 133- 137 (1995) )やゲノム組み込み型ベクター KC515 [The bacteria, vol. 9, Antibiotic-producing Streptomyces (ed : Queener, S. E. and Day,し E. ) , p. 119- 158, Academic Press, Orlando, Fgla. ) などが利用できる。
自律複製配列としては、 rep pIJlOl (1988, J. Bacteriol. , 170, 4634-4651)、 rep SCP2 (1981, J. Gen. Microbiol. , 126, 427-442)、 pUC19 (Gene, 33 (1) , 103- 119 (1985) )等を、 プロモーター配列としては、 ermEp (Mol Microbiol. , 1994, Nov ; 14 (3) : 533-45. )、 SnpA Q Bacteriol. , 1992, May ; 174 (9)： 2797- 2808)等を、 ターミネータ一配列としては、 ter (mmr) (Gene, 1987； 58 (2-3)： 229- 41)、 fd terminator (Nucleic Acids Res. , 5 (12) , 4495- 4503 (1978) )等を、 薬剤耐性遺伝 子としては、 hyg (Nucleic Acids Res. , 4 (14) , 1565-1581 (1986) )、
tsr (Mol. Gen. Genet. , 199 (1) , 26- 36 (1985) )等を、 それぞれ挙げることができる。 なお、 本発明の遺伝子組換え微生物は当業者であれば本明細書の記載に従って容 易に作製することができる。
このようにして調製した遺伝子組換え微生物を培養し、 16位水酸化マクロライ ド系化合物（I)の生産性を、 以下の方法により評価、 選択することにより、 当該マ クロライド系化合物の高生産株を得ることができる。 すなわち、 当該マクロライ ド系化合物を培養液 1 L当り 50mg以上生産する能力を有する遺伝子組換え微生物 は、 約 40%の確率で、 培養液 1 L当り lOOmg以上生産する能力を有するものは、 約 30%の確率で得ることができ、 いずれも高い確率で得ることができる。
(生産性評価方法） .
培地 （溶性デンプン 5%、 グノレコース 1°/0、 フアルマメディア 3%、 CaC03 0. 1 %、 ρΉ7. 5) 30mLを入れた 250mL容の三角フラスコに遺伝子組換え微生物を植菌し、 25°Cで 4日間回転振とう培養 （220rPm) した後、 ァセトニトリル 270mLを加えて 抽出し、 得られた抽出液を下記の測定条件で HPLC分析し、 16位'水酸化マクロライ ド系化合物（I)の蓄積濃度を定量する。
(HPLC測定条件）
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ .
カラム： Develosil ODS UG-3 ( 4. 6mm X 50mm 3 μ m)
移動相： 45%〜55%メタノール（0〜5分）、 55%メタノール（5〜13分）、 55%〜 70%メタノール（13〜21分）、 70%メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5 L
カラム温度： 40°C
本発明の遺伝子組換え微生物を栄養源培地に接種し、 好気的に培養することに より、 その培養液から 16位水酸化マクロライド系化合物（I)もしくはその薬理学 上許容される塩またはそれらの水和物を採取することができる。
これら遺伝子組換え微生物の培養方法は、 原則的には一般微生物の培養方法に 準ずるが、 通常は液体培養による振とう培養、 通気撹拌培養等の好気的条件下で 実施するのが好ましい。 培養に用いられる培地としては、 これらの微生物が利用 できる栄養源を含有する培地であればよく、 各種の合成、 半合成培地、 天然培地 などいずれも利用可能である。 培地組成としては炭素源としてのグルコース、 シ ユークロース、 フルクトース、 グリセリン、 デキストリン、 デンプン、 糖蜜、 大 豆油等を単独または組み合わせて用いることができる。 窒素源としてはフアルマ メディア、 ペプトン、 肉エキス、 大豆粉、 カゼイン、 アミノ酸、 酵母エキス、 尿 素等の有機窒素源、 硝酸ナトリウム、 硫酸アンモニゥムなどの無機窒素源を単独 または組み合わせて用いうる。 その他例えば塩化ナトリゥム、 塩化力リゥム、 炭 酸カルシウム、 硫酸マグネシウム、 リン酸ナトリゥム、 リン酸カリゥム、 塩化コ バルト等の塩類、 重金属類塩、 ビタミン Bおよびピオチン等のビタミン類も必要 に応じ添加使用することができる。 なお、 培養中発泡が著しい場合には、 各種消 泡剤を適宜培地中に添加することもできる。 また、 必要に応じて薬剤耐性遺伝子 を維持するのに必要な薬剤を添加しても良い。 消泡剤の添加にあたってほ、 目的 物質の生産に大きな影響を与えない濃度とするのが望ましい。
また本発明の遺伝子組換え微生物を培養し、 16位水酸化マクロライド系化合物 (I)を製造するに際して、 培養液中にシクロデキストリン類を存在させることによ り、 16位水酸化マクロライ ド系化合物の蓄積濃度を増大することができる。 本発 明において使用できるシクロデキストリン類としては、 ]3—シクロデキストリン、 γ—シクロデキス トリン、 部分メチル化 /3—シクロデキス トリン、 ジメチルー β —シクロデキス トリン、 トリメチノレー 一シクロデキス トリン、 グリ コシル一 3 ーシクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル一；3—シクロデキストリンを挙 げることができ、 これらを単独または組み合わせて用いることができる。
培養液へのシクロデキス トリン類の添加量は、 0. 5%〜5%が好ましい。 添加時 期は培養初期、 または培養途中で添加しても良い。
培養条件は、 当該菌株が良好に生育して 16位水酸化マクロライ ド系化合物（I) を生産し得る範囲内で適宜選択し得る。 例えば培地の pHは 5〜 9程度、 通常中性 付近とするのが望ましい。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましくは 23〜35°Cに保 つのがよい。 培養日数は 2〜 1 2日程度で、 通常 3〜1 0日程度である。 上述し た各種の培養条件は、 使用微生物の種類や特性、 外部条件等に応じて適宜変更で き、 最適条件を選択できるのはいうまでもない。 培養液中に蓄積された 16位水酸 化マクロライ ド系化合物（I)を分離精製するためには、 一般に微生物代謝産物をそ の培養液から単離するために用いられる分離、 精製の方法が利用できる。 例えば、 メタノーノレ、 エタノール、 ブタノ一ノレ、 酢酉变ェチノレ、 クロロホノレム、 アセ トン、 トルエン等を用いた有機溶媒抽出、 各種のイオン交換クロマトグラフィー、 セフ アデックス LH-20等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、 活性炭、 シリカゲル、 吸着樹脂 （ダイヤイオン HP20) 等による吸着クロマトグラフィー、 もしくは薄層 クロマトグラフィ一による吸脱着処理、 あるいは逆相カラム等を用いた高速液体 クロマトグラフィ一等の公知のあらゆる方法がこれにあたるが、 ここに示した方 法に限定されるものではない。 これらの方法を単独あるいは任意の順序に組み合 わせ、 まだ反復して用いることにより、 16位水酸化マクロライド系化合物（I)を単 離 -精製することができる。 ' 実施例
以下に実施例を示して本発明.を具体的に説明するが本発明はこれらの実施例に より何ら限定されるものではない。 また下記の説明中、 培地成分については、 特 に記載がない限り表示濃度は重量％である。
参考例 1 ：マクロライ ド系化合物（II)の生合成に関与するポリペプチドをコー ドする DNAの取得
( 1 ) Mer - 11107株の培養およびゲノム DNAの取得
ス トレプトミセス 'エスピ一（Streptomyces sp. ) Mer- 11107株の菌糸を 25mLの Tryptic Soy Brothに接種し、 28°C、 3日間振とう培養した。 この結果得られた培 養液から、 D. A. Hopwoodらの放線菌遺伝子実験書 Practical Streptomyces
Genetics (The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000)の Isolation genomic DNA (P162〜170)記載の方法に従ってゲノム DNAを調製した。
( 2 ) Mer- 11107株のゲノムライブラリーの調製
滅菌精製水 160 _i Lと、 Mer - 11107株のゲノム DNA溶液（lmg/mL) 200 と、 10 倍濃度の M緩衝液 [lOOmM Tri s-HCl (pH7. 5) , lOOmM MgCl2, lOm ジチォスレイ ト一 ル， 500mM NaCl] 40 ;u Lと制限酵素
Figure imgf000024_0001
とを混合し、 37°Cで 3分 インキュベートした。 その後、 50 /i Lを取り出し、 50 Lのフエノール-クロロホ ルム混液 （フユノール： ク口口ホルム ：ィソァミルアルコール =25： 24： 1,容量 比） で抽出し、 水相を回収し、 さらに 50 x Lのクロ口ホルムで抽出し、 再び水相 を回収した。 この液に の 3M酢酸ナトリゥム（pH6. 0)と 150 /z Lのエタノール を加えて、 一 80°Cに 30分置き、 遠心することで沈殿してくる DNAを回収した。 こ の DNAを 70%エタノールで洗浄した後、 90 Lの滅菌精製水に溶解し、 10 丄の 10倍濃度 BAP緩衝液 [500mM Tris-HCl (pH9. 0) , ΙΟιτιΜ MgCl2]および 5 μ L bacterial alkaline phosphatase (0. 5unit/ L, タカラバイオ社）を加えて 37°Cで 3時間イン キュペートした。 この反応液を 100 μしのフエノール-クロ口ホルム混液 （フエノ ール： ク口 πホルム：ィソァミルアルコール =25： 24： 1,容量比） で抽出し、 水 相を回収し、 さらに 100 /x Lのクロ口ホルムで抽出し、 再び水相 回収した。 この 液に の 3M酢酸ナトリゥム (pH6. 0)と 300 z Lのエタノールを加えて、 _80°C に 30分置き、 遠心することで沈殿してくる DNAを回収した。 この DNAを 70%エタ ノ一ルで洗浄した後、 20 μ Lの TE緩衝液 [10mM Tris-HCl (pH8. 0) , ImM EDTA]に溶解 した。
一方で SuperCosコスミ ドベクター（Stratagene社） 10 μ gを Stratagene社のマ ニュアルに従い制限酵素） (balで消化後、 calf intestional alkaline
phosphatase (タカラバイオ社）により DNA末端の脱リン酸化を行い、 さらに制限 酵素 BamHIで消化、 精製後、 10 μ Lの TE緩衝液に溶解した。 このコスミ ド DNA溶 液 1 μ Lに、 前述の Mer- 11107株 DNAの Sau3Al部分分解物の溶液 2. 5 /i Lを加え、 さらに滅菌精製水 1. 5 μ L、 DNA Ligation Kit (タカラバイオ社）の Solution IIを 5 L、 Solution Iを 10 i L順次加えた後、 23°Cで 10分インキュベートした。 この 反応液 を Gigapack III XL Kit (Stratagene社）を用いてラムダファージにノ、 ° ッケ一ジングした。 得られたパッケ一ジング液（全量 500 μ L)について形質導入試 験を実施して、 コロニー形成能を検定した結果、 380cfu (colony forming unit) / ； u Lであった。
( 3 ) 各種プローブの調製
( 3 - 1 ) ケト合成酵素コ一ド領域 含むプローブの調製
一般にポリケチド合成酵素のケト合成酵素領域（keto synthase domain)におい て保存されている配列に基づいて以下に示すような配列からなる 2種のプライマ 一、 KS- 3Fおよび KS- 4Rを合成した（配列番号 5および 6参照）。
KS- 3F: 5' -GACCGCGGCTGGGACGTGGAGGG-3' KS - 4R: 5' -GTGCCCGATGTTGGACTTCAACGA-3'
これらのプライマーを用いて PCRを以下の条件にて行った
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 31 し
2倍濃縮 GC buffer 50 μ L
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2.5m ) 16μΙ
KS-3F(100pmol/ML) Ο.δμΙ
KS-4R(l00pmol/ML) 0.5μΙ
Mer- 11107株 total DNA (lOOng/ U ΙβΙ
LA Taq polymerase (5u/ L，タカラノくィォ社） 1 μ L
(反応温度条件）
95。C 3分
(98°C 20秒， 63°C 30秒， 68°C 2分） 30サイクノレ
72°C 5分
この反応の結果増幅された 930bp DNA断片を 0· 8%ァガロースゲル上で電気泳動 し、 分離した 930bp DNA断片を切り出し、 SUPREC-01(タカラバイオ社）を用いて DNAを回収精製した。 さらに得られた DNA断片 10ngを錶型として反応サイクル数 を 20サイクルとする以外は前述の PCRと同じ反応条件でケト合成酵素コード領域 を含む 930bp DNA断片を再増幅した。 この DNA断片を SUPREC - 02(タカラバイオ社） を用いて濃縮精製して得られた 50/iLの TE溶液をプローブ溶液とした。
(3 - 2) シトクロム P450遺伝子領域を含むプローブの調製
シトクロム P450遺伝子プローブを調製するために公知の 2種のシトクロム P450 遺伝子を放線菌から増幅した。 すなわちス トレプトミセス ·サーモトレランス (Streptomyces thermotolerans) ATCC11416由来 0RF - A逾ィ; πナ (Biosci.
Biotechnol. Biochem. 59:582- 588, 1995)を増幅するために以下に示すような配列 からなる 2種のプライマー、 CB-1Fおよび CB-2Rを合成した（配列番号 7および 8 参照)。
CB-1F： 5' -ATGACAGCTTTGAATCTGATGGATCCC-3' CB-2R : 5' -TCAGAGACGGACCGGCAGACTCTTCAGACG-3'
—方でストレプトミセス 'ベネズェラエ（Streptomyces venezuelae) ATCC15439 由来 pikC遺伝子（Chem. Biol. 5 : 661- 667, 1998)を增幅するために以下に示すよう な配列からなる 2種のプライマー、 PKC- 1Fおよび PKC- 2Rを合成した（配列番号 9 および 1 0参照）。
PKC- IF : 5' -GTGCGCCGTACCCAGCAGGGAACGACC-3'
P C-2R： 5' - TCACGCGCTCTCCGCCCGCCCCCTGCC- 3' '"
これらのプライマーを用いて PCRを以下の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 31 /i L
2倍濃縮 GC buffer 50 l
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 L
primer-F dOOpmol/ μ L) 0. 5 μ L
primer-R dOOpmol/ μ L) 0. 5 L
ATCC11416株または ATCC15439株のゲノム DNA (100ng / L) 1 L
LA Taq polymerase (5u/ μ L,タカラノくィ才社） 1 μ L
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63°C 30秒， 68°C 2分） 30サイクル
72°C 5分
この反応の結果増幅された 2種の 1· 2kb DNA断片を QIAGEN PCR Purification Kit (QIAGEN社）で精製した後、 各 DNA断片 lOng/ w Lずつを含む等量混合溶液を調 製してプロ一ブ溶液とした。
( 4 ) ケト合成酵素コード領域を含むプローブを用いたスクリーニング
前項 （2 ) で調製した Mer-11107株のゲノム DNAライブラリ一のパッケージン グ液を使って大腸菌 XL- lBlue MR (Stratagene社）を宿主とし、 Stratagene社のマ ニュアルに従って形質導入した。 形質導入操作後の菌液を 10枚の LB- 50 g/mLァ ンピシリン- 1. 5%寒天培地シャーレ （内径 90mm、 高さ 15mm) に分注して広げ、 37°Cで 18時間培養した。 各シャーレに生育したコロニーを HybondoN+フィルター (amersham biosciences社) ίこ $5写し、 HybondoN+ 'ィノレター ίこ添ィ寸のマ二ユアノレ ίこ 記載された条件でアル力リ処理、 中和処理を行い、 80°Cで 2時間乾燥することで フイ ノレター上にコロニー由来の DNAを固定ィ匕した。
前項 （ 3— 1 ) にて調製したケト合成酵素領域を含む 930bp DNA断片 lOOngを フ。口一フにして AlkPhos Direct System (amersham biosciences社) ¾ "用レヽてヮノ ム DNA ライブラリーをコロニーハイブリダィゼーシヨン法でズクリーニングした。 ハイブリダイゼ一ションは塩濃度 0. 5M NaClで 65°Cで 2時間行った。 プローブ DNAの標識、 ハイブリダイゼーションおよび検出の条件については AlkPhos
Direct Systemに添付されたマニュアルに記載された条件に従った。 試験した約 7, 600コロニーのうち、 アル力リホスファターゼで標識したプローブと強くハイブ リダィズした 59コロニーを分離した。 このコロニーから派生した大腸菌クローン からコスミ ドを抽出精製した。
( 5 ) シトクロム P450遺伝子領域を含むプロ一プを用いたプラジェノライ ド生合 成遺伝子領域を有するコスミ ドク口一ンの選択確認
前項 （4 ) で得られた各コスミ ドの DNA溶液 2 Lを HybondoN+フィルター上に スポットし、 添付のマニュアルに記載された条件でアルカリ処理、 中和処理を行 レ、、 さらに 80°Cで 2時間乾燥することでフィルター上に DNAを固定化した。 この フィルターを用いて、 前項 （3 ) にて記述したシトクロム P450遺伝子断片をプロ —ブとして、 前項 （4 ) と同じ条件でハイブリダィゼーシヨンを行った。 この結 果プローブと強くハイブリダィズしたコスミ ド 1つを選択し、 pKS58と命名した。 pKS58 DNAを制限酵素 Sau3AIで部分分解した後、 ファージベクター Zap Express, BamHI - CIAP処理済（Stratagene社）にライゲーシヨンし、 Gigapack III XL Kit (Str a t agene社）を用いてラムダファージにパッケージングした。 このファージ液 を大腸菌 XL1 - Blue MRF' に感染させて、 プラークを形成させた。 前項 （3— 2 ) で調製したシトクロム P450遺伝子プローブを用いてプラークハイブリダイゼーシ ョンを行うことで、 約 2 kbのシトクロム P450遺伝子を含む DNA断片をサブクロー ニングした。 このシトクロム P450遺伝子 DNA断片の配列を決定し、 シトクロム P450コード 領域とされる N -末端および C-末端から以下に示すような配列からなる 2種のブラ イマ一、 PDL58-1Fおよび PDL58- 2Rを合成した（配列番号 1 1および 1 2参照）。 PDL58- 1F: 5' -GCCCCGCATATGGATCTGGAAACCCAACTTCTC-3'
PDL58- 2R: 5' - GCACTAGTCAGCCGCGCTCGACGAGGAGGTG - 3'
こ''れらのプライマ一を用いて PCRを以下の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 31
2倍濃縮 GC buffer 50 μ L
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2.5mM) 16 μ L
PDL58- lF(100pmol/ iL) 0.5μΙ
PDL58-2R(100pmol/ML) 0.5WL
pKS58醒（lOng/μ ΙβΙ
LA Taq polymerase (5u/ i L,タカラノくィォ社 ) 1 μ L
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63°C 30秒， 68°C 2分） 20サイクル
72°C 5分
この反応の結果増幅された 1.2kb DNA断片を QIAGEN PCR Purification
Kit(QIAGEN社）で精製した後、 制限酵素 Ndelと Spelで分解した。 反応後 DNAを 0.8%ァガロースゲル上で電気泳動し、 分離した 1.2kb DNA断片を切り出し、 QIAGEN GelExtraction Kit (QIAGEN社）を用いて DNAを回収精製した。 この DNA断 片をシトクロム P450遺伝子発現用プラスミ ド pT7NS- camAB (参考例 5および W003/087381参照） の Ndelおよび Spel部位へ挿入することで pPDL96を構築した このプラスミ ドで大腸菌 BL2KDE3)を形質転換し、 M9CG培地 (1.28% Na2HP04 - 7H20、 0.3% KH2P04、 0.05% NaCl、 0.1% NH 1、 1%カザミノ酸、 0.4%ダルコ一 ス、 lmM MgCl2、 ΙΟΟμΜ CaCl2、 50 μ g/mLアンピシリン） にて菌密度として 0D600 (optical density at 600 nm)が 0.8に達するまで培養した。 5 -ァミノレブリ ン酸および IPTGをそれぞれ 80 μ g/mし 0. ImMになるよう添加した後、 22°Cで 25 時間培養を継続し、 シトクロム P450タンパク質を誘導させた。 誘導後、 菌体を集 めて CV緩衝液 [50mM NaP04 (pH7. 3)、 ImM EDTA、 10%グリセロール、 ImMダルコ一 ス] 5mLに懸濁した。 この液 lmLを試験管に取り、 プラジェノライ ド Bの 6位デォ キシ体である ME- 265の DMS0溶液（50mg/mL)を 5 L添加して 28°Cで 15時間インキ ュペートした。 この反応液に lmLのァセトニトリルを加えて混合した後、 遠心分 離して上淸を以下の条件にて HPLCで分析することでプラジエノ 'ライド Bへの変換 を認めた。 このことから pKS58にプラジェノライ ド生合成遺伝子領域が含まれて いることを確認した。
(HPLCの分析条件）
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム ： Develosil ODS UG-3 ( φ 4. 6mm X 50mm 3 μ ιπ)
移動相 ： 45° 〜 55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分）
55°ゾ。〜 70% メタノ一ル（13〜21分）
45% メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2tnL/分
検出： UV240nm
インジェクション容量： 5 し
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間： ME-265； 20分、 プラジエノライド B ； 13分
( 6 ) シトクロム P450遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスタ一を含むコスミ ド の選定
前項 （4 ) で得られた、 59個のコスミ ド DNAの中で、 前項 （5 ) で得られたシ トクロム P450遺伝子に隣接する生合成遺伝子クラスターを含むコスミ ドを選定し た。
59個のコスミ ド DNAを制限酵素 EcoRI, BamHIで消化し、 得られた各々の DNAを ァガロースゲル電気泳動し、 エバーメクチンァグリコン合成酵素遺伝子
(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 9509 - 9514、 特開平 2000-245457号公報ま たは W0 00/50605パンフレツ ト参照） の KS ドメインの DNA (aveA2 の KS6 domain)、 AT ドメインの DNA (aveAlの AT2 domain) , および前項 （5 ) で得られたシトクロ ム P450遺伝子をプローブに用いたサザンハイプリダイゼーションを行った。
制限酵素 EcoRI， BamHIで消化した DNAの電気泳動パターンと、 各プローブでの ハイブリダィズしたバンドパターンの結果から、 まず、 同じ長さ'でハイブリダィ ズした DNA断片を持つコスミ ドをグループ化した。 そのうち、 ほぼ同等のパター ンを示したコスミ ドについては 1つを残して削除し、 残ったものでバンドパター ンが部分一致するものについて整列化した。 そして、 ( 5 ) で得られたシトクロ ム P450遺伝子を含むコスミ ド pKS58を中心とし、 シトクロム P450遺伝子側から ポリケチド合成酵素遺伝子を含む側に隣接するコスミ ドとして PKS54を選出し、 さらに PKS54に隣接するコスミ ドとして pKS35を選出した。 また、 コスミ ド pKS58 とシトクロム P450遺伝子側からポリケチド合成酵素遺伝子を含まない側に隣接す るコスミ ドとして PKS23を選出した。 その結果、 図 2に示すようにプラジェノラ ィ ド生合成遺伝子クラスターを包括するコスミ ドクローンとして
pKS23, pKS58, pKS54, pKS35が選定された。
( 7 ) プラジェノライ ド生合成遺伝子クラスターの塩基配列の決定
プラジェノライ ド生合成遺伝子をコードする一群の DNA の塩基配列を決定した。 前項 （6 ) で選出した各コスミ ドを、 塩化セシウム法を用いて単離後、
HydroShear (Genomic solutions社）を用いて約 lkbに剪断し、 BKL Kit (タカラノく ィォ社） を用いて、 サブクローン化した。
得られたサブクローンに対し、 蛍光標識プライマーを用いたサイクルシークェ ンス反応 （amersham biosciences社） を行い、 それぞれの断片の塩基配列を決定 (MegaBACE 1000 : amer sham biosciences社） することにより、 プラジェノライド の生合成に関連する DNAを含む約 75kbの塩基配列を決定した（配列番号 1参照）。
( 8 ) プラジェノライドの 6位水酸化酵素遺伝子 （pldB) 破壊株の作製
前項 （ 7 ) で決定されたプラジエノライドの生合成に関連する DNAを含む約 75kbの塩基配列 （配列番号 1参照） より、 図 1に示された生合成経路でブラジェ ノライドが生合成されることが明らかとなった。 そこで、 そのうちのシトクロム P450遺伝子 pldBのみを破壊することで、 プラジェノライ ド Bの 6位デォキシ体で ある ME-265のみを生産する株を取得可能と考え、 以下の方法で pldB破壊株を作 製した。
配列番号 1記載の塩基配列に基づいて、 以下に示す配列からなる 4種のプライ マー、 pldB-L- Bgl2F、 pldB- L- Hind3R、 pldB- R_Hind3Fおよび P13B-R-Bgl2R (配列 番号 1 3、 1 4、 1 5および 1 6参照） を合成した。
pldB-L- Bgl2F : 5' -GGGAGATCTAGAGGCCGGTTACCTCTACGAGTA-3'
pldB- L-Hind3R : 5' - GGGAAGCTTGCGA丁 GAGCTGTGCCAGATAG - 3'
pldB- R- Hind3F : 5' -GGGAAGCTTGAACTGGCGCGACAGTGTCTT-3'
pldB-R-Bgl2R： 5' - GGGAGATC丁 GCAGCGGATCGTCTTCGAGACCCT丁 - 3'
これらのプライマ一を用いて PCRを以下の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 30 L
2倍濃縮 GC buffer 50 μ L
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 L
PldB-L-Bgl2F または pldB - R - Hind3F (50pmol/ /i L) Ι μ Ι
pldB-L-Hind3R または pldB- R-Bgl2R (50pmol/ μ L) Ι μ Ι
Mer一 11107株 total DNA (lOOng/ μ L) Ι μ Ι
し A Taq polymerase (5u/ μし，タカラノくィ才社） 1 μし
(反応温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒， 63°C 30秒， 68°C 2分） 30サイクル
72°C 5分
この反応の結果、 pldB-L- Bgl2Fと pldB- L_Hind3Rを用いた反応から、 配列番号 1の塩基 64756から塩基 66302を含む 1. 57kbの DNA断片 （DNA断片 L1) が増幅さ れ、 pldB-R-Hind3Fと pldB - R- Bgl2Rを用いた反応から、 配列番号 1の塩基 66849 から塩基 68368を含む L 54kbの DNA断片 （DNA断片 R1) が増幅された。 DNA断片 L1および R1を QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN社）で精製した後、 制限酵 素 Bgl l lと Hindlllで消化した。
制限酵素 Bgll lと Hindl llで消化した DNA断片 L1および R1 と、 制限酵素 Hindl l lで消化した 2. 3kbのハイグロマイシン B耐性遺伝子
(pHP45omegahyg ： Gene 190, 315-317, 1997 由来。 以下 hygと略記することがあ る） 、 および制限酵素 BamHIで消化したシャ トルベクター PKU25 （図 3参照）、 の 計 4者を DNA l igation kit ver. 2. 1 (タカラバイオ社） で連結した。 こうして DNA断片 L1 と R1の間にハイグロマイシン B耐性遺伝子が挿入された形の約 5. 4kb の DNA断片が、 pKU253に挿入された約 21. 4kbのプラスミ ド pKU253- U - hyg- R1が 構築された。
得られた PKU253-L1- hyg-Rlを、 接合大腸菌 S17-1へエレクトロポレーション法 を用いて形質転換し、 S17- l/pKU253- Ll-hyg- R1株を得た。 得られた S17- l/pKU253-Ll-hyg-Rl株を、 25 g/mLのカナマイシンおよび lOO /i g/mLのハイグロ マイシン Bを含む LB培地（1 %バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%
NaCl) 10mLに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 lOmLで 2回洗浄 後、 LB培地 5IIILに懸濁した。 これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地（Trypto- Soya broth :日水製薬社） 10mLに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅菌水 lOniLで 2回洗浄後、 滅菌水 lmLに懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 得られ た S17- l/pKU253- LI- hyg- R1株供与菌懸濁液 500 μ Lを、 Mer- 11107株受容菌懸濁液 と混ぜ、 Actino Medium No. 4寒天培地 （日本製薬社） に塗布した。 30°Cで 18時間培養後、 2mg/mLのリポスタマイシンを含む 2. 5mLの SNA (0. 8%栄養培地： Difco社、 0. 4%寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培養し、 リボスタマイシンに耐性 な pKU253- Ll-hyg-Rl形質転換株を得た。
得られた PKU253-L1- hyg- R1形質転換株を、 リポスタマイシンを含まない TSB培 地 10mLに植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養した。 pKU253-Ll- hyg-Rl形質転換株培 養液を集菌し、 滅菌水 lOmLで 2回洗浄後、 滅菌水 10mLに懸濁した。 適当に希釈 した懸濁液を、 200 g/mLのハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地 （0. 4%酵母 エキス、 1 %麦芽エキス、 0. 4%溶性デンプン、 2%寒天、 10mM塩化カルシウム） に 塗布し、 30°Cで 4日間培養した。 ハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地で生育 したシングルコロニーを 200 μ g/mLのハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地お よび 200 μ g/mLのリボスタマイシンを含む YMS寒天培地に植えかえ、 30°Cで 2日 間培養した。 培養後、 ハイグロマイシン B'耐性で、 リボスタマイシン感受性の株 を選択した。 得られた菌株は、 ゲノム中の pldB遺伝子内の 546 ' （配列番号 1の 塩基 66303から塩基 66848) を欠失し、 その間にハイグロマイシン B耐性遺伝子が 挿入された pldB破壊株であり、 Mer - 11107pldB : : hyg株とした。
( 9 ) プラジェノライ ドの 6位水酸化酵素遺伝子 （pldB) 破壊株のプラジェノラ ィド生産性試験
前項 （8 ) で得られた Mer- 11107 pldB : : hyg株の凍結種母 200 μ Lを、 種母培地 (溶性デンプン 2%、 大豆粉 （味の素社：エスサンミート） 2%、 酵母エキス 0. 5%、 K2HP04 0. 1%、 MgS04 · 7Η20 0. 25% 、 CaC03 0. 3% pH無調整） 20mLに植菌 し、 25°Cで 2日間培養した。 得られた種母培養液の 300 /z Lを、 本培養培地 （溶性 デンプン 5%、 グルコース 1 %、 フアルマメディア 3%、 ]3 -シクロデキストリン 2%、 CaC03 0. 1 % pH7. 5) 30mLに植菌し、 25°Cで 4日間および 5日間培養した。 培養終了後、 得られた培養液 20mLに同量のァセトニトリルを加えて抽出した。 そ の抽出液の一部を分取しァセトニトリルで 5倍量に希釈し、 以下の条件にて HPLC でプラジェノライド Bおよび ME- 265の量を測定した。 測定結果を表 1に示す。 (HPLC分析条件） .
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosi l ODS UG-3 ( 4. 6mm X 50mm 3 μ m)
移動相： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
. 55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜17分）
70% メタノール（17〜35分）
45% メタノール（35〜40分） 流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 10 L
カラム温度： 40°C
分析時間： 35分
保持時間 : ME - 265； 22分、 プラジエノライ ド B ； 16分
表 1
Figure imgf000035_0001
参考例 2 ：マクロライ ド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活性を有するポリぺプ チドをコードする DNA-1
( 1 ) ストレプトミセス 'エスピー A- 1544株のゲノム DNAの調製
グノレコース 1 %、 麦芽エキス 0. 4%、 酵母エキス 1 %からなる培地に A - 1544株を 接種し、 28°C、 3日間培養した。 得られた培養液を 3000rpm、 10分間遠心して菌体 を集めた。 その菌体から Blood & Cell Culture kit (QIAGEN社）を用いてゲノム DNAを調製した。
( 2 ) マクロライ ド系化合物' 11107Bの 16位水酸化活性を有するタンパク質をコ 一ドする DNAの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス 'セリカラ一 A3 (2)のチトクロム P450 (CYP105D5)と推定される アミノ酸配列を参考にして以下のようなミックス 'プライマー（5Dm - 3Fおよび 5Dm-3R)を設計し作成した（配列番号 1 7および 1 8参照）。
5Dm-3F： 5' - TTCGCSCTSCCSGTCCCSTCSATGGTSAT- 3'
5Dm-3R： 5' - GTTGATSAYSGASGTSGAGAA- 3'
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、 混合塩基 S (=C + G)、 Y (=C + 丁）を使用した。 次に、 この 2種のプライマ一（5Dm- 3Fおよび 5Dm- 3R)と前項 （1 ) で得た A - 1544 株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (タカラバイオ社）と PCR增幅装置（Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20秒間、 アニーリングを 50°C、 2分間、 伸長を 68°C、 30秒間行う 3段階の 反応を 35回繰り返した。 その結果、 約 500bpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断 片- Al という）が増幅された。 この DNA断片- A1は水酸化活性を有するタンパク質 をコードする DNAの一部分である可能性が高い。 PCR反応にて増幅した DNA断片 - A1を、 反応液から SUPREC PCR (タカラバイオ社）によって回収した。
次に得られた DNA断片 - A1の塩基配列を解析するに足る量の DNA断片- A1を得る ために、 プラスミ ドベクタ一 pT.7Blue T (Novagen社）に DNA Ligation kit ver. 2 (タカラバイオ社）を用いて DNA断片- Alを連結し、 大腸菌 JM109株を形質転換した その後、 アンピシリン（50 g/mL)、 X- gal (5-bromo- 4-chloro- 3- indolyl- /3 -D- galactoside； 40 μ, g/mL) IPTG usopropyl- β -D-thiogalactopyranoside； 100 μ M)を含む L- Broth寒天培地（1. 0%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% NaCl、 1. 5%寒天）を用いて、 形質転換された大腸菌を選択した。 こうして分離し た形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50 μ g/mL)を含む L-Broth液体培地 (1%バタ トトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl)で培養した。 増殖した形質 転換大腸菌の菌体からプラスミ ド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いてプラスミ ド DNAの分離精製を行い、 一定量の DNA断片- A1を得 た。
( 3 ) クローニングされた DNA断片- A1の塩基配列の解析
前項 （ 2 ) で得られた DNA断片- A1の塩基配列を DNA塩基配列解析装置（PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 'サイクル ' シークェンス法で解 析した。 塩基配列解析の結果、 PCR反応で増幅された DNA断片- A1は電気泳動で約 500bpと測定されたが、 塩基配列分析の結果、 正確には 528bpであることが明らか となった（配列番号 2の塩基 1775〜塩基 2302参照）。 クローニングされた前記の 528bpの DNA配列の両端には前記の PCR反応の時に使用した 2種類のプライマーに 対応する DNA配列が見出されたので、 前記の PCR反応では DNA断片 -A1がこの 2種 類のプライマー（5Dm - 3Fおよび 5Dm-3R)により特異的に増幅されたことが明らかと なった。
( 4 ) DNA断片- A1の周辺領域の解析
前記のとおり、 A - 1544株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードする DNAの部分的配列が決定されたのでィンパース PCR法（細胞工学 14巻、 p. 591 - 593， 1995年）によって、 クローニング断片の上流、 下流域に広がる周辺領域の塩基 配列を増幅、 クローニング、 配列解析した。 すなわち、 A-1544株ゲノム DNA (前項 ( 1 ) 参照）を H緩衝液（50mM Tris-HCl, pH7. 5, lOmM MgCl2, lOmMジチォスレイ ト一 ル， lOOmM NaCl)中において制限酵素 Pstlと Sailでそれぞれ消化した。 得られた 各制 K酵素切断 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (タカラバイオ社）を用いて自 己環状化させた。
他方、 DNA断片- A1の塩基配列から、 以下のようなプライマ一（6PIN-2Fおよび 6PIN-2R)を設計し作成した（配列番号 1 9および 2 0参照）。
6PIN-2F： 5' -GCTGCGCCTGGCCCTGGAGGACATCGAGAT-3'
6PIN-2R： 5' -CTGTTCCTCGAAGAACTCGTGGTCGGCGTA-3'
次にこの 2種のプライマ一（6PIN-2Fおよび 6PIN-2R)と前記の自己環状化させた A-1544株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (タカラバイオ社）と PCR増幅装置（Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20秒間、 ァニ一リングと伸長を 68°C、 5分間行う 2段階の反応を 35 回繰り返した。
この結果、 約 3. 5kbpの大きさの DNA断片（DNA断片 - B1)と約 2. 8kbpの大きさの DNA断片（DNA断片- C1)が増幅したが、 これらは、 水酸化活性を有するタンパク質 をコードする DNAおよびその上流と下流領域を含む DNA配列を有する DNAである 可能性が高い。
この PCR増幅反応液から DNA断片- B1および DNA断片- C1を SUPREC PCR (タカラ バイオ社）によって回収した。 次に得られた DNA断片 - B1および DNA断片- C1につ いて、 塩基配列を解析するに足る量の各 DNA断片を得るために、 前項 （2 ) と同 様にプラスミ ドベクター pT7Blue T (Novagen社）、 DNA Ligation kit ver. 2 (タカラ バイオ社）、 大腸菌 JM109株およびプラスミ ド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いて、 一定量の各 DNA断片を得た。
( 5 ) DNA断片- B1 (約 3. 5kbpのサイズ）および DNA断片- C1 (約 2. 8kbpのサイズ）の 塩基配列の解析
前項 （4 ) で得られた DNA断片- B1および DNA断片- C1の塩基配列を DNA塩基配 列解析装置 (PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネ一ター 'サイクル ' シー クエンス法で解析した。 このように塩基配列の解析を行い、 DNA fci片- B1および DNA断片- C1配列から、 配列番号 2に示された 3793bpの塩基配列の情報を得た。 この 3793bp中のオープン · リーディング ' フレーム（0RF)を検索したところ、 2 種類のタンパク質がコードされていることが判明した。 これらのタンパク質のァ ミノ酸配列を BLAST searchにて検索した結果、 配列番号 2の塩基 1322〜塩基 2548にチトクロム P450と高い相同性を有する 409個のアミノ酸からなるタンパク 質をコードする 0RF (以下、 psmAとレ、う）が存在した。 そして psmAは、 ストレプト ミセス .セリカラー A3 (2)のチトクロム P450 (CYP105D5)と推定されるァミノ酸配列 と、 ス トレプトミセス ' リ ビダンスのチトクロム P450 (CYP105D4)と推定されるァ ミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性 72. 6%)、 さらにス トレプトミセス - グリセウスのチトクロム P450soy (SoyC)にも比較的高い相同性を有した（相同性 69. 4%)。 このことから psmAはチトクロム P450タイプの水酸化酵素をコードする 遺伝子である可能性が高いと考えられた。
また psmAのすぐ下流（配列番号 2の塩基 2564〜塩基 2761)には 2Fe- 2Sタイプの フェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードする 0RF (以下、 psmBと いう）が存在した。 psmBがコードするタンパク質は 66個のアミノ酸からなり、 ス トレプトミセス .セリカラー A3 (2)のチトクロム P450 CYP105D5)と推定されるアミ ノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定されるァミノ酸配列に最も高い相同 性を有し（83. 3%)、 さらにストレプトミセス ' グリセウスのフェレドキシン soy (soyB)にも比較的高い相同性を有した（相同性 57. 6%)。 そのため、 psmBは電 子伝達を担い、 psmAと共に水酸化を行うフヱレドキシンをコ一ドしていると考え られた。 ( 6 ) プラスミ ド pTC-DMの構築
pT7NS- camAB (参考例 5および W003/087381参照）を H緩衝液（50mM Tris- HC1， pH7. 5, lOmM gCl2, lOmMジチォスレイ トール， lOOmM NaCl)中で制限酵素 Ndel と Spelにより消化してプラスミ ド消化物を得た。 一方、 配列番号 2の塩基配列を 参考にして、 5 ' 末端に Ndelサイトを付加したプライマー DM- NdeF (5' - GCCCCCATATGACGGAACTGACGGACATCA-3' ：配列番号 3 3参照）および 5 ' 末端に Spel サイ トを付加したプライマー DM-SpeR (5' -GGGCCACTAGTCAGCCGGCCdGTTCGGTCA-3' ： 配列番号 3 4参照）を設計し作成した。 次に、 この 2種のプライマー（DM-NdeFおよ び DM- SpeR)と前項 （1 ) で得た A- 1544株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (宝酒造社）と PCR增幅装置
(Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 2分間行う 2段階の反応を 30回繰り返した。 この PCR増幅反応液から psmA および psmBを含む約 1. 5kbpの大きさの DNA断片を SUPREC PCR (宝酒造社）によつ て回収した。 得られた DNA断片を制限酵素 Ndelと Spelで消化し、 その消化物と 前記 pT7NS-camABプラスミ ド消化物とを、 DNA Ligation Kit ver. 2 (タカラバィ ォ）を用いて連結した。 これによつて、 psmAおよび psmBの両方を内部に含有する DNA断片と、 プラスミ ド pT7NS- camABとが連結された約 9. 5kb のサイズのプラス ミ ド（プラスミ ド pTC-DMというときがある）が構築された。
参考例 3 ：マクロライ ド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活性を有するポリぺプ チドをコードする DNA-2
( 1 ) ス トレプトミセス · エスピー Mer- 11107株ゲノムの DNAの調製
グルコース 1 %、 麦芽エキス 0. 4%、 酵母エキス 1 %からなる培地に Mer-11107 株を接種し、 28°C、 3日間培養した。 得られた培養液を 3000rpm、 10分間遠心して 菌体を集めた。 その菌体から Blood & Cel l Culture ki t (QIAGEN社）を用いてゲノ ム DNAを調製した。
( 2 ) マクロライ ド系化合物 11107Bの 16位水酸化活性を有するタンパク質をコ 一ドする DNAの部分的配列のクローニング
ス トレプトミセス ·セリカラ一 A3 (2)のチトクロム P450 (CYP105D5)と推定される アミノ酸配列を参考にして以下のようなミックス 'プライマー（5Dm-3Fおよび 5D- 1R)を設計し作成した（配列番号 1 7および 2 1参照）。
5Dm-3F： 5' - TTCGCSCTSCCSGTCCCSTCSATGGTSAT-3'
5D-1R： 5' -AGGTGCCCAGCGAGATCATGTT-3'
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、 混合塩基 S (=C + G)、 Y (=C + T)を使用した。
次に、 この 2種のプライマー（5Dm- 3Fおよび 5D- 1R)と前項 （ 1') で得た Mer - 11107株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (タカラバイオ社）と PCR增幅装置（Biometra 社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20秒間、 アニーリングを 50°C、 2分間、 伸長を 68°C、 30秒間行う 3 段階の反応を 35回繰り返した。 その結果、 約 300bpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断片- A2という）が増幅された。 この DNA断片 - A2は水酸化活性を有するタンパ ク質をコードする DNAの一部分である可能性が高い。 PCR反応にて増幅した DNA断 片 -A2を、 反応液から SUPREC PCR (タカラバイオ社）によって回収した。
次に得られた DNA断片- A2の塩基配列を解析するに足る量の DNA断片- A2を得る ために、 プラスミ ドベクター pT7Blue T (Novagen社）に DNA Ligation kit ver. 2 (タカラバイオ社）を用いて DNA断片- A2を連結し、 大腸菌 JM109株を形質転換した。 その後、 アンピシリン（50 t g/niし）、 X- gal (5- bromo - 4- chloro- 3 - indolyl - ]3 - D- galactoside； 40 μ g/mL) 丄 PTb dsopropyl - j3 - D - thiogalactopyranoside； 100 μ Μ)を含むい Broth寒天培地（1. 0%バク トトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% NaCl、 1. 5%寒天）を用いて、 形質転換された大腸菌を選択した。 こうして分離し た形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（SO i g/mL)を含む L- Broth液体培地 (1%パク ト トリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl)で培養した。 増殖した形質 転換大腸菌の菌体からプラスミ ド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いてプラスミ ド DNAの分離精製を行い、 一定量の DNA断片- A2を得 た。
( 3 ) クローニングされた DMA断片- A2の塩基配列の解析
前項 （ 2 ) で得られた DNA断片- A2の塩基配列を DNA塩基配列解析装置 (PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイタ一ミネ一ター 'サイクル 'シークェンス法で解 析した。 塩基配列解析の結果、 PCR反応で増幅された DNA断片- A2は電気泳動で約 300bpと測定されたが、 塩基配列分析の結果、 正確には 325bpであることが明らか となった（配列番号 3の塩基 837〜塩基 1161参照）。 クローニングされた前記の 325bpの DNA配列の両端には前記の PCR反応の時に使用した 2種類のプライマ一に 対応する DNA配列が見出されたので、 前記の PCR反応では DNA断片- A2がこの 2種 類のプライマ一（5Dm - 3Fおよび 5D-1R)により特異的に増幅されだことが明らかと なった。
( 4 ) DNA断片- A2の周辺領域の解析
前記のとおり、 Mer-11107株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコードする DNAの部分的配列が決定されたのでィンバース PCR法（細胞工学 14巻、 p. 591 - 593, 1995年）によって、 クローニング断片の上流、 下流域に広がる周辺領域の塩基 配列を増幅、 クローニング、 配列解析した。 すなわち、 Mer-11107株ゲノム DNA (前項 （1 ) 参照）を、 K緩衝液（50mM Tris-HCl，pH8. 5, 10mM MgCl2, ImMジチォス レイトール， lOOmM KC1)中で制限酵素 BamHIで、 H緩衝液（50mM Tris- HC1, pH7. 5， lOmM MgCl2, ImMジチォスレイ トール， lOOmM NaCl)中で制限酵素 Sailで それぞれ消化した。 得られた各制限酵素切断 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (タカラバィォ社）を用いて自己環状化させた。
他方、 DNA断片 - A2の塩基配列から、 以下のようなプライマー（7PIN-2Fおよび 6PIN-2R)を設計し作成した（配列番号 2 2および 2 0参照）。
7PIN-2F： 5' -CCATGATCCTGCTGGTGGCCGGCCATGAGA-3'
6PIN-2R： 5' -CTGTTCCTCGAAGAACTCGTGGTCGGCGTA-3'
次にこの 2種のプライマー（7PIN - 2Fおよび 6PIN-2R)と前記の自己環状化させた Mer-11107株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応 は、 Takara LA Taq (タカラバイオ社）と PCR增幅装置（Biometra社 T Gradient)を 用い、 変性を 98°C、 20秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 5分間行う 2段階の反 応を 35回繰り返した。
この結果、 約 1. 3kb の大きさの DNA断片（DNA断片 - B2)と約 1. 4kbpの大きさの DNA断片（DNA断片- C2)が増幅したが、 これらは、 水酸化活性を有するタンパク質 をコードする DNAおよびその上流と下流領域を含む DNA配列を有する DNAである 可能性が高い。
この PCR增幅反応液から DNA断片- B2および DNA断片 - C2を SUPREC PCR (タカラ バイォ社）によって回収した。 次に得られた DNA断片- B2および DNA断片- C2につ いて、 塩基配列を解析するに足る量の各 DNA断片を得るために、 前項 （2 ) と同 様にプラスミ ドベクタ一 pT7Blue T (Novagen社）、 DNA Ligation' kit ver. 2 (タカラ バイオ社）、 大腸菌 JM109株およびプラスミ ド精製キット（QIAfi lter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いて、 一定量の各 DNA断片を得た。
( 5 ) DNA断片- B2 (約 L 3kbpのサイズ）および DNA断片- C2 (約 1. 4kbpのサイズ）の 塩基配列の解析
前項 （ 4 ) で得られた DNA断片- B2および DNA断片- C2の塩基配列を DNA塩基配 列解析装置（PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 ·サイクル 'シ一 クエンス法で解析した。 このように塩基配列の解析を行い、 DNA断片- B2および DNA断片- C2配列から、 配列番号 3に示された 2329bpの塩基配列の情報を得た。 この 2329bp中のオープン ' リーディング . フレーム（0RF)を検索したところ、 2 種類のタンパク質がコードされていることが判明した。 これらのタンパク質のァ ミノ酸配列を BLAST searchにて検索した結果、 配列番号 3の塩基 420〜塩基 1604 にチトクロム P450と高い相同性を有する 395個のアミノ酸からなるタンパク質を コードする 0RF (以下、 bpmAという）が存在した。 そして bpmAは、 A-1544株から単 離した psmAのアミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性 67. 4%)、 さらにス ト レプトミセス ·グリセウスのチトクロム P450soy (SoyC)にも比較的高い相同性を有 した（相同性 64. 8%)。 このことから bpmAがチトクロム P450タイプの水酸化酵素 をコ一ドする可能性が高いと考えられた。
また bpmAのすぐ下流（配列番号 3の塩基 1643〜塩基 1834)には 2Fe-2Sタイプの フェレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードする 0RF (以下、 bpmBと いう）が存在した。 bpmBがコードするタンパク質は 64個のアミノ酸からなり、 A - 1544株から単離した psmBのァミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性 81. 0%)、 さらにストレプトミセス ·セリカラー A3 (2)のチトクロム P450 (CYP105D5)と推定されるアミノ酸配列のすぐ下流のフェレドキシンと推定さ れるアミノ酸配列にも比較的高い相同性を有した（76. 2%)。 そのため、 bpmBは電 子伝達を担い、 bpmAと共に水酸化を行うものと考えられた。
参考例 4 ：マクロライド系化合物（II)の 16位水酸化酵素活性を有するポリぺプ チドをコードする DNA-3
( 1 ) A-1560株ゲノムの DNAの調製 '■'
グルコース 1 %、 麦芽エキス 0. 4%、 酵母エキス 1 %からなる培地に A- 1560株を 接種し、 28°C、 3日間培養した。 得られた培養液を 3000rpm、 10分間遠心して菌体 を集めた。 その菌体から Blood & Cel l Culture kit (QIAGEN社）を用いて A- 1560 株ゲノム DNAを調製した。
( 2 ) マクロライ ド系化合物 11107Bの 16位水酸化活性を有するタンパク質をコ ―ドする DNAの部分的配列のクローニング
ストレプトミセス ·セリカラー A3 (2)のチトクロム P450 (CYP105D5)と推定される アミノ酸配列を参考にして以下のようなミックス ·プライマー（5Dm-3Fおよび 5Dm-2R)を設計し作成した（配列番号 1 7および 2 3参照）。
5Dm-3F： 5' -TTCGCSCTSCCSGTCCCSTCSATGGTSAT-3'
5Dm-2R： 5' - CTGGATSGTGTCSCCSGGYTT-3'
コドンの揺らぎを考慮して反応性を高めるために、 混合塩基 S (=C+G)、 Y (=C+ T)を使用した。
次に、 この 2種のプライマー（5Dm- 3Fおよび 5Dm-2R)と前項 （1 ) で得た A- 1560 株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (タカラバイオ社）と PCR増幅装置（Biometra社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20秒間、 アニーリングを 50°C、 2分間、 伸長を 68°C、 30秒間行う 3段階の 反応を 35回繰り返した。 その結果、 約 750bpの大きさの DNA断片（以下、 DNA断 片- A3という）が増幅された。 この DNA断片- A3は水酸化活性を有するタンパク質 をコードする DNAの一部分である可能性が高い。 PCR反応にて増幅した DNA断片 - A3を、 反応液から SUPREC PCR (タカラバイオ社）によって回収した。 次に得られた DNA断片- A3の塩基配列を解析するに足る量の DNA断片- A3を得る ために、 プラスミ ドべクタ一 p丁 7Blue T (Nova gen社）に DNA Ligation kit ver. 2 (タカラバイオ社）を用いて DNA断片- A3を連結し、 大腸菌 JM109株
(Stratagene社） を形質転換した。 その後、 アンピシリン（50 μ g/mL)、 X-gal (5- bi-omo— 4一 chloro— 3— indolyl— ]3— D— galactoside； 40 μ g/mL) IPTG usopropyl- β - D-thiogalactopyranoside； 100 μ M)を含むし- Broth寒天培地（1. 0%バタ トトリプ トン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl、 1. 5%寒天）を用いて、 形質 |5換された大腸 菌を選択した。 こうして分離した形質転換大腸菌のコロニーをアンピシリン（50 μ g/mL)を含む L- Broth液体培地（1%バクトトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5% NaCl)で培養した。 増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミ ド精製キット (QlAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いてプラスミ ド DNAの分離精製を行 レ、、 一定量の DNA断片 - A3を得た。
( 3 ) クロ一ニングされた DNA断片- A3の塩基配列の解析
前項 （ 2 ) で得られた DNA断片- A3の塩基配列を DNA塩基配列解析装置（PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 'サイクル 'シークェンス法で解 析した。 塩基配列解析の結果、 PCR反応で増幅された DNA断片- A3は電気泳動で約 750bpと測定されたが、 塩基配列分析の結果、 正確には 741bpであることが明らか となった（配列番号 4の塩基 616〜塩基 1356参照）。 クローニングされた前記の 741bpの DNA配列の両端には前記の PCR反応の時に使用した 2種類のプライマーに 対応する DNA配列が見出されたので、 前記の PCR反応では DNA断片- A3がこの 2種 類のプライマー（5Dm-3Fおよび 5Dm-2R)により特異的に増幅されたことが明らかと なった。
( 4 ) DNA断片- A3の周辺領域の解析
前記のとおり、 A-1560株由来の水酸化活性を有するタンパク質をコ一ドする DNAの部分的配列が決定されたのでィンバース PCR法（細胞工学 14巻、 p. 591 - 593， 1995年）によって、 クローニング断片の上流、 下流域に広がる周辺領域の塩基 配列を增幅、 クローニング、 配列解析した。 すなわち、 A- 1560株ゲノム DNA (前項 ( 1 ) 参照）を、 K緩衝液（50m Tris-HCl, pH8. 5, lOmM MgCl2， Im ジチォスレイ ト一 ノレ， lOOmM KC1)中において制限酵素 BamHIで、 L緩衝液（10m Tris-HCl, pH7. 5, 10mM MgCl,, ImMジチォスレイ トール）中において制限酵素 Kpnlで、 Η緩衝液（50m Tris- HCl, PH7. 5, lOmM MgCl,, ImMジチォスレイ トール， lOOmM NaCl)中において制限酵素 Sailでそれぞれ消化した。 得られた各制限酵素切断 DNA断片を DNA Ligation Kit ver. 2 (タカラバィォ社）を用いて自己環状化させた。
他方、 DMA断片- A3の塩基配列から、 以下のようなプライマー（5PIN - 2Fおよび 6PIN-2R)を設計し作成した（配列番号 2 4および 2 0参照）。 ''
5PIN-2F： 5' -CGGAATCCACCAGTGCCTCGGCCAGAACCT-3'
6PIN-2R： 5' -CTGTTCCTCGAAGAACTCGTGGTCGGCGTA-3'
次にこの 2種のプライマー（5PIN- 2Fおよび 6PIN-2R)と前記の自己環状化させた A - 1560株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (タカラバイオ社）と PCR増幅装置（Biometra 社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20秒間、 アニーリングと伸長を 68°C、 5分間行う 2段階の反応を 35 回繰り返した。
この結果、 約 4. 5kbpの大きさの DNA断片（DNA断片 - B3)と約 3. Okbpの大きさの DNA断片（DNA断片- C3)と約 1. 7kbpの大きさの DNA断片（DNA断片- D3)が増幅したが、 これらは、 水酸化活性を有するタンパク質をコードする DNAおよびその上流と下 流領域を含む DNA配列を有する DNAである可能性が高い。
この PCR増幅反応液から DNA断片- B3および DNA断片- C3および DNA断片- D3を SUPREC PCR (タカラバイオ社）によって回収した。 次に得られた DNA断片- B3および DNA断片- C3および DNA断片 - D3について、 塩基配列を解析するに足る量の各 DNA 断片を得るために、 前項 （2 ) と同様にプラスミ ドベクター pT7Blue T (Novagen 社）、 DNA Ligation kit ver. 2 (タカラバイオ社）、 大腸菌 JM109株およびプラスミ ド精製キット（QIAfilter Plasmid Midi Kit, QIAGEN社）を用いて、 一定量の各 DNA 断片を得た。
( 5 ) DNA断片- B3 (約 4. 5kbpのサイズ）、 DNA断片- C3 (約 3. Okbpのサイズ）および DNA断片- D3 (約 1. 7kbpのサイズ）の塩基配列の解析
前項 （4 ) で得られた DNA断片- B3、 DNA断片- C3および DNA断片- D3の塩基配列 を DNA塩基配列解析装置（PE Biosystems 377XL)を用い、 ダイターミネータ一 ·サ ィクル .シークェンス法で解析した。 このように塩基配列の解析を行い、 DNA断 片 -B3、 DNA断片- C3および DNA断片- D3の配列の中から、 配列番号 4に示された 1860bpの塩基配列の情報を得た。
この 1860bp中のオープン ' リーディング ' フレーム（0RF)を検索したところ、 2 種類めタンパク質がコードされていることが判明した。 これらのタンパク質のァ ミノ酸配列を BLAST searchにて検索した結果、 配列番号 4の塩基 172〜塩基 1383 にチトクロム P450と高い相同性を有する 404個のァミノ酸からなるタンパク質を コードする 0KF (以下、 tpmAという）が存在した。 そして tpmAは、 ストレプトミセ ス -セリカラ一 A3 (2)のチトクロム P450 (CYP105D5)と推定されるァミノ酸配列に最 も高い相同性を有し（相同性 77. 4%)、 A-1544株から単離した psmAのアミノ酸配 列にも高い相同性を有した（相同性 76. 6%)。 このことから tpmAはチトクロム P450タイプの水酸化酵素をコードする遺伝子である可能性が高いと考えられた。 また tpmAのすぐ下流（配列番号 4の塩基 1399〜塩基 1593)には 2Fe_2Sタイプの フエレドキシンに高い相同性を有するタンパク質をコードする 0RF (以下、 tpmBと いう）が存在した。 tpmBがコードするタンパク質は 65個のアミノ酸からなり、 A- 1544株から単離した psmBのァミノ酸配列に最も高い相同性を有し（相同性
87. 3%)、 ス トレプトミセス ' セリカラー A3 (2)のチトクロム P450 (CYP105D5)と推 定されるァミノ酸配列のすぐ下流のフュレドキシンと推定されるァミノ酸配列に も高い相同性を有した（82. 5%)。 そのため、 tpmBは電子伝達を担い、 tpmAと共に 水酸化を行うフェレドキシンをコードしていると考えられた。
参考例 5 ： プラスミ ド pT7NS- camABの構築
Pseudomonas put ida ATCC 17453のゲノム DNAを錄型にして、 以下に示す配列か らなるプライマ一 PRR - 1F (配列番号 2 9参照） と PRR 2R (配列番号 3 0参照） を 用いて下記の条件で PCRを行った。
PRR-1F： 5' -GCCCCCCATATGAACGCAAACGACAACGTGGTCATC-3'
PRR-2R： 5' -GCGGATCCTCAGGCACTACTCAGTTCAGCTTTGGC-3'
(反応液組成） 滅菌精製水 15 μ 1
2倍濃縮 GC緩衝液 I (宝酒造） 25 l
dNTP混合溶液 （dATP， dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5 mM) 8 1
PRR-1Fプライマー (100 pmol/ μ 1) 0. 5 l
PRR-2Rプライマー (100 pmol/ ^u 1) 0. 5 μ 1
Pseudo匪 as putida ATCC 17453ゲノム DMA (10 ng / μ 1) 0. 5 μ 1
L A Taq (5 units/ /z 1, 宝酒造） 0. 5 μ 1
(温度条件）
95°C 3分
(98°C 20秒、 63°C 30秒、 68°C 2分） 30サイクル
72°C 5分
得られた put idaredoxin reductase遺伝子 (camA) およびその遺伝子すぐ下流 の putidaredoxin遺伝子（camB)を含む 1. 5kbの増幅された断片（camAB断片）を制限 酵素 Nde Iおよび BamHIで処理したのち、 0· 8%ァガロースゲルにて電気泳動した 泳動後、 このゲルから切り出した camAB断片を含むゲル切片から同断片を SUPREC- 01 (宝酒造） を用いて回収 '精製した。 この断片を大腸菌プラスミ ドベクター pETl la (Stratagene社)の Nde I部位および BamHI部位に T4 DNAリガーゼにより 連結した後、 大腸菌 DH5 aに形質転換して、 プラスミ ド PT7-camABを構築した。 次 に以下に示す配列からなる 2種の合成オリゴ DNA SP-1 (配列番号 3 1参照） およ び SP-2 (配列番号 3 2参照） をァニールして得られるリンカ一 1分子をこのプラ スミ ドの Nde I部位に T4 DNAリガーゼにより連結し、 大腸菌 DH5 aに形質転換し て、 プラスミ ド pT7NS- camABを構築した。
SP-1： 5' -TATGCGTCACTAGTCGGGAGTGCGTTA-3'
SP-2： 5' -TATAACGCACTCCCGACTAGTGACGCA-3'
実施例 1 ： pldAプロモーターと psmABを連結させたプラスミ ド pPapsmABの作製 psmABをプラジェノライド B生合成遺伝子と連動して発現させるため、 プラジェ ノライ ド B生合成遺伝子の pldAのプロモータ一領域を psmABと連結させた。 配列 番号 1の塩基配列情報をもとに、 pldAのプロモーター領域を増幅するために以下 に示すような配列からなる 2種のプライマー、 pldApro- SpeNdeF(5' 末端に Spel および Ndelサイ トを付加：配列番号 2 5参照）および pldApro-NdeR (5' 末端に Ndelサイ トを付カ卩：配列番号 26参照） を合成した。
pldApro-SpeNdeF ： 5' -GGGCATATGACTAGTAGCCGTGTCCTGCCCGCC-3'
pldApro-NdeR ： 5' -GGGCATATGTTCGGACGTGAATTCATTCG-3'
ごれらのプライマーを用いて PCRを以下の条件にて行った。
"(PCR反応液組成：東洋紡績社 K0D- plus-を使用）
滅菌精製水 71
10倍濃縮 PCR buffer ΙΟμΙ
dNTP混合溶液 （dATP, dGTP, dCTP, dTTP 各 2mM) ΙΟμΙ
MgS04 (25mM) 4μί
K0D+ 2μΙ
pldApi-o - SpeNdeF (50pmol//iL) l^L
pldApro-NdeR (50pmol/ μ L) 1 μΐ
pKS35 (参考例 1 (6) 10ng/ L) ΙμΙ
(反応条件： Biometra社 T GRADIENTを使用）
95°C 5分
(98°C 20秒、 63°C 1分、 68°C 1分） 25サイクル
72°C 5分
この反応の結果、 増幅された 360bpの DNA断片を QlAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて回収した。 得られた 360bpの DNA断片を制限酵素 Ndelで消 化した。 同様にプラスミ ド pTC- DM (参考例 2 (6) ) を制限酵素 Ndelで消化した。 得られた 360bpの DNA断片の消化物とプラスミ ド消化物とを、 DNA Ligation Kit ver.2.1 (タカラバイオ社） を用いて連結した。 これにより、 pldAプロモーターと psmABを連結させた、 約 9.9kbpのサイズのプラスミ ド pPapsmABを構築した。
実施例 2 ：組み換え導入用プラスミ ドの作製
実施例 1で調製したプラスミ ド pPapsmABを制限酵素 Spelで消化した後、 BKL Kit (タカラバイオ社） を用いて末端を平滑化した。 得られた DNAを 0.8%の
41 Molecular Biology Agarose (登録商標、 BIO- RAD社） 上で電気泳動 （Mupid-ex： ア ドバンス社） し、 分離した 1. 8kbpの pldAプロモーターと psmABを含む DNA断 片 （以後、 PapsmABというときがある） を切り出し、 QIAquick Gel Extraction Ki t (QIAGEN社） にて回収精製した。 また、 図 4に示す組み換え導入用ベクター pUC19aph : : oriT: : intphiC31を制限酵素 BamHIで消化した後、 BKL Kit (タカラバ ィォ社） を用いて末端を平滑化した。 こうして得られたベクターと PapsmABとを DNA Ligation Kit ver. 2. 1 (タカラバイオ社） を用いて連結した。 これにより、 PapsmABを組み換え導入用ベクター pUC19aph : : oriT :： intphiC31に挿入した、 組み 換え導入用プラスミ ド pAOC :： PapsmABを構築した。
実施例 3 ：組み換え導入用プラスミ ド pAOC:： PapsmABの Mer- 11107株への導入 得られた pAOC:： PapsmABを、 接合大腸菌 S17-1 (ATCC47055) へエレク トロボレ ーシヨン法を用いて形質転換し、 Sl7-l/pA0C: : PapsmAB株を得た。 得られた S17 - 1/pAOC : : PapsmAB株を、 25 g/mLのカナマイシンを含む LB培地（1%バク トトリプ トン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 10mLに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集 菌し、 LB培地 10mLで 2回洗浄後、 LB培地 5mLに懸濁した。 これを供与菌懸濁液 とした。 供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地 (Trypto-Soya broth:日水製薬社） lOtnLに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌 し、 滅菌水 10mLで 2回洗浄後、 滅菌水 lmLに懸濁した。 これを受容菌懸濁液とし た。 得られた S17 - 1/pAOC: : PapsmAB株供与菌懸濁液 500 / Lを、 Mer- 11107株受容 菌懸濁液 10 L と混ぜ、 Actino Medium No. 4寒天培地 （日本製薬社） に塗布した 30°Cで 18時間培養後、 2mg/mLのリボスタマイシンを含む 2. 5mLの SNA (0. 8%栄養 培地： Difco社、 0. 4%寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培養し、 リボスタマイシン に耐性な pAOC:： PapsmAB形質転換株 Mer-11107 :： pAOC:： PapsmAB株を得た。
実施例 4 ： Mer- 11107 : : pA0C : : PapsmAB株のプラジェノライド生産試験 実施例 3で得られた Mer- 11107 : : pA0C: :PapsmAB株とコントローノレとして親株の Mer-11107株について、 プラジェノライ ド Bおよびその 16位水酸化体であるプラ ジエノライ ド Dの生産性を試験した。
Mer - 11107 : : pA0C:： PapsmAB株と、 Mer - 11107株の各々の凍結種母 300 μ Lを、 種 母培地 （溶性デンプン 2%、 大豆粉 （味の素社：エスサンミート） 2%、 酵母ェキ ス 0. 3%、 K2HP04 0. 1 %、 MgS04 · 7H20 0. 25%、 CaC03 0. 3% pH無調整） 60mLに植 菌し、 25°Cで 3日間培養した。 得られた種母培養液の 600 μ ίを、 本培養培地 （溶 性デンプン 5%、 グルコース 1 %、 フアルマメディア 3%、 アデ力ノール LG- 126 0. 05%、 CaC03 0. 1 %、 pH7. 5) 60mLに植菌し、 25。Cで 3日間、 4日間、 5日間およ び' 6日間培養した。 培養終了後、 得られた培養液に対して 4倍量のァセトニトリ ルを加えて抽出した。 得られた抽出液について HPLCにてプラジ 'エノライ ド Bおよ びその 16位水酸化体であるプラジェノライド Dの量を測定した。 測定結果を表 2 に示す。 また、 HPLCの測定条件を以下に示す。 . ；
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil ODS UG - 3 ( φ 4. 6mm X 50mm 3 /z m)
移動相： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜21分）
70% メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nm
インジェクション容量： 5 /z L ·
カラム温度： 40。C
分析時間： 25分
保持時間：プラジエノライド B 12. 4分
プラジェノライド D 4. 3分
表 2 er-11107::pAOC::PapsmAB株 Mer-11107^
プラジェノライド Bプラジェノライド Dプラジェノライド B プラジェノライド D (mg/L) (mg/L) (mg/L) (mg/L)
3曰培養（72hr) 36.2 148.4 180.5 0.0
4日培養（96hr) 93.2 289.3 338.1 0.0
5曰培養（120hr) 122.3 ' 420.6 402.2 0.0
6日培養（144hr) 118.3 535.8 372.2 0.0 この結果、 親株である Mer- 11107株ではプラジェノライド Dの生産がほとんど みられなかったのに対して、 pAOC:： PapsmABを導入した Mer -
11107: :pA0C: :PapsmAB株ではプラジェノライ ド Dを生 していた。 このことより、 プラジェノライ ド B生産株である Mer-11107株に、 プラジェノライド Bの 16位水 酸化酵素遺伝子である psmABを導入することにより、 プラジェノライド Dを直接 生産できることが示された。 、
実施例 5 ： Mer - 11107: :pA0C: :PapsmAB株のプラジェノライド D生産における /3_
CD添加効果
実施例 3で得られた Mer- 11107：： pAOC：： PapsmAB株におけるプラジェノライ KB およびその 16位水酸化体であるプラジェノライ ド Dの生産性について、 β -シク ロデキス トリ ン （/3- CD) の添加効果を調べた。 Mer- 11107： :pA0C: :PapsmAB株の凍 結種母 300/iLを、 種母培地 （溶性デンプン 2%、 大豆粉 （味の素社：エスサンミ ート） 2%、 酵母エキス 0.3%、 K2HP04 0.1%、 MgS04■ 7H20 0.25%、 CaC03 0.3% pH無調整） 30mLに植菌し、 25°Cで 3日間培養した。 得られた種母培養液の 300 μ L を、 /3- CDを 2%加えた本培養培地 （溶性デンプン 5%、 グルコース 1%、 フアル マメディア 3%、 アデ力ノール LG - 126 0.05%、 β -CD 2.0%、 CaC03 0.1%、 pH7.5) 30mL、 または /3 -CDを加えない本培養培地 （溶性デンプン 5%、 ダルコ一 ス 1%、 フアルマメディア 3%、 アデ力ノール LG- 126 0.05%、 CaC03 0.1%、 PH7.5) 30mLに植菌し、 25°Cで 3日間、 4日間、 5日間および 6日間培養した。 培 養終了後、 得られた培養液に対して 4倍量のァセトニトリルを加えて抽出した。 得られた抽出液について HPLCにてプラジェノライ ド Bおよびその 16位水酸化体 であるプラジェノライド Dの量を測定した。 測定結果を表 3に示す。 また、 HPLC の測定条件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosi l ODS UG-3 ( 4. 6mm X 50mm 3 μ m)
移動相： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分） '"
55%〜70% メタノール（13〜21分）
70% メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nin
ィンジェクション容量： 5 L
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間：プラジェノライド B 12. 4分
プラジェノライド D 4. 3分
表 3
Figure imgf000052_0001
この結果、 /3 -CD 2%添加によりプラジェノライ ド Dの蓄積量が約 1. 4倍に增大 したことより、 i3 - CDの添加がプラジェノライド Dの直接生産に効果があることが 示された。 実施例 6 ： Mer- 11107: :pA0 ： PapsmAB株のプラジェノライ ド生産 （2) 実施例 3で得られた Mer-11107: :pA0C:： PapsmAB株の凍結種母 300 MLを種母培 地 （溶性デンプン 2%、 大豆粉 （味の素社：エスサンミート） 2%、 酵母エキス 0.3%、 K2HP04 0.1%、 MgS04 · 7H20 0.25%、 CaC03 0.3% pH無調整) 30mLに植菌 し、 25°Cで 3日間培養した。 得られた種母培養液の 300 しを、 本培養培地 （溶性 デンプン 5%、 グルコース 1%、 フアルマメディア: 3%、 大豆粉 （J-オイルミルズ 社：豊年ソィプロ） 1%、 アデ力ノール LG- 126 0.05%、 β -CD 2.0%, CaC03 0.1%、 PH7.5) 30mLに植菌し、 25°Cで 3日間、 4日間、 5日間、 6日間および 7日 間培養した。
培養終了後、 得られた培養液に対して 4倍量のァセトニトリルを加えて抽出し た。 得られた抽出液について HPLCにてプラジェノライ ド Bおよびその 16位水酸 化体であるプラジェノライ ド Dの量を測定した。 測定結果を表 4に示す。 また、 HPLCの測定条件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil ODS UG - 3 ( φ 4.6mm X 50mm 3 μ m)
移動相： 45%〜55% メタノ一ノレ（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノーノレ（13〜21分）
70% メタノール（21〜25分）
流速： 1.2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5M L
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間：プラジェノライ ド B 12.4分
プラジェノライ ド D 4.3分
表 4 プラジェノライド B (mg /し） プラジェノライド D (mg/L)
3曰培養（72hr) 378.3 230.6
4曰培養（96hr) 601.4 567.9
5曰培養（120hr) 480.4 874.2
6曰培養（144hr) 387.4 985.4
7日培養（168hr) 439.1 1215.9 前記の培養液に等量のァセトニトリルを添加して得た抽出液 50mL をろ過した後、 菌体を水 30iiiLにて洗浄した。 ろ液に水 70mLを加え酢酸ェチル lOOmLで 1回、 50mLで 2回抽出した。 酢酸ェチル層を合わせ、 飽和食塩水 50mLで 2回洗浄後、 無 水硫酸ナトリウムにて乾燥した。 溶媒を除去した後、 得られた残渣を薄層クロマ トグラフィー（MERCK Si l icagel 60 F254 0. 5mm展開液； トルエン：ァセトン =1 : 1)により精製することによりプラジェノライド Bが 12. 8mg、 プラジェノライ ド Dが 23. lmg得られた。 プラジェノライ ド B及びプラジェノライ ド Dの1 H - NMR分析 結果を以下に示す。
プラジェノライ K B ； .
JH - NMRスぺク トル（CD30D, 500MHz) ： δ ppm (積分、 多重度、 結合定数 J (Hz) ) ： 0. 93 (3H, d, J=7. 0Hz)， 0. 94 (3H, d, J=6. 8Hz)， 0. 98 (3H, t, J=8. 0Hz)，
1. 12 (3H, d, J=6. 8Hz)， 1. 23 (3H, s) , 1. 25 (1H， m) , 1. 2 (2H, m) , 1. 53—1. 70 (6H, m) , 1. 79 (3H, d, J=l. 0Hz)， 2. 10 (3H, s)， 2. 52 (1H, m) , 2. 56 (2H， m) , 2. 60 (1H, m) ,
2. 70 (1H, dd， J=2. 4, 8. 3Hz) , 2. 76 (1H, dt, J=2. 4, 5. 7Hz) ' 3. 56 (1H, dt, J=8. 3, 4. 4Hz) ,
3. 82 (1H, m) , 5. 08 (2H, d, J=9. 8Hz)， 5. 60 (1H， dd, J=9. 8, 15. 2Hz) ,
5. 70 (1H, dd, J=8. 3, 15. 2Hz)， 5. 74 (1H, dd, J=9. 8, 15. 2Hz) , 6. 13 (1H, d, J=9. 8Hz) ,
6. 36 (1H, dd, J=9. 8, 15. 2Hz)
プラジェノライド D；
W -剛 Rスぺク トル（CD30D, 500MHz) ： δ ppm (積分、 多重度、 結合定数 J (Hz) ) :
0. 93 (3H, d , J=7. 0Hz) , 0. 95 (3Η, d, J=6. 8Hz) , 0. 98 (3Η, t， J=8. ΟΗζ) , 1.23 (3H, s)， 1.30(lH,m), 1.36-1.66 (9H, m), 1.70 (1H, dd, J=6.4, 14.2Hz),
1.82 (3H, d, J=l.0Hz) , 1.90 (1H， dd, J=6.4, 14.2Hz) , 2.10 (3H, s) , 2.52 (2H, m) ,
2.62 (1H, m)， 2.72 (1H, dd, J=2..4， 8.3Hz)， 2.94 (1H, dt, J=2.4, 5.7Hz) ,
3.55 (1H， dt, J=8.3， 4.4Hz) , 3.82 (1H， m) , 5.10( (1H, d, J=9.8Hz) ,
5.11 (1H, d， J=10.8Hz),5.60 (1H, dd, J=9.8， 15.2Hz), 5.74(1H， dd, J=8.3, 15.2Hz), 5.92 (1H, d, J=15.2Hz) , 6.18 (1H, d, J=10.8Hz) , 6.57 (1H， dd, J=10.8， 15.2Hz)
実施例 Ί ：組み換え導入用プラスミ ド pAOC:： PapsmABの Mer-1'1107 pldB:： hyg 株への導入
実施例 3で得られた S17」l/pA0C:： PapsmAB株を、 25 g/mLのカナマイシンを含 む LB培地（1%バクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、 0.5%NaCl)10mLに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 lOniLで 2回洗浄後、 LB培地 5mLに懸 濁した。 これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 参考例 1 (8) で作製した Mer-11107 pldB:： hyg株を TSB培地（Trypto_Soya broth:日水製薬社） 10mLに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅菌水 10mLで 2回洗浄後、 滅菌水 lmLに懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 得られた Sn-1/pAOC:： PapsmAB株供与菌懸濁液 500 Lを、 Mer - 11107 pldB:： hyg株受容菌懸濁 ί夜 10 Lと混ぜ、 Actino Medium No.4寒 天培地 （日本製薬社） に塗布した。 30°Cで 18時間培養後、 2mg/mLのリポスタマイ シンを含む 2.5mLの SNA(0.8%栄養培地： Difco社、 0.4%寒天）を重層した。 30°C で 7日間培養し、 リボスタマイシンに耐性な pAOC:： PapsmAB形質転換株 Mer- 11107 pldB:： hyg:： pAOC:： PapsmAB株を得た。
実施例 8 ： Mer-11107 pldB: :hyg: :pA0C: :PapsmAB株のプラジェノライ ド生産試 験
実施例 Ίで得られた Mer-11107 pldB:： hyg:： pAOC:： PapsmAB株とコントロールと して親株の Mer- 11107 pldB: :hyg株について、 ME- 265およびその 16位水酸化体で ある ME-282の生産性を試験した。 Mer - 11107 pldB:： hyg: :pA0C:： PapsmAB株と、 Mer-11107 pldB：： hyg株の各々の凍結種母 300 Lを、 種母培地 （溶性デンプン 2%、 大豆粉 （味の素社：エスサンミート） 2%、 酵母エキス 0.3。/。、 K2HP04 0.1% gS04 · 7H20 0.25%、 CaC03 0.3% pH無調整） 30mLに植菌し、 25。Cで 3日間培養し た。 得られた種母培養液の 300 を、 3- CDを 2%加えた本培養培地 （溶性デン プン 5%、 グノレコース 1%、 フアルマメディア 3%、 アデ力ノール LG-126 0.05%、 /3-CD 2.0%、 CaC03 0.1%、 pH7.5) 30mLに植菌し、 25°Cで 3日間、 4日間、 5日 間および 6日間培養した。 培養終了後、 得られた培養液に対して 4倍量のァセト 二トリルを加えて抽出した。 得られた抽出液について HPLCにて ME- 265およびそ の 16位水酸化体である ME- 282の量を測定した。 測定結果を表 5に示す。 また、 HPLCの測定条件を以下に示す。
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム ： Develosil ODS UG - 3 ( <H.6画 X 50mm 3 μ m)
移動相： 45%〜55% メタノール（0〜5分）
55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜17分）
70% メタノール（17〜35分）
流速： 1.2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5μΙ
カラム温度： 40°C
分析時間： 35分
保持時間： ME-265 21.0分
ME - 282 15.6分
表 5
Mer-1 1 107 pldB::hyg::pAOC::PapsmAB株 Mer-1 1 107 pldB::hyg株
ME - 265 ME- 265 ME-282 (mg/L) (mg/L) (mg/L)
3曰培養（72hr) 47.8 153.8 485.7 0.0
4曰培養（96hr) 63.5 222.1 907.0 0.0
5日培養（120hr) フ 0.5 280.5 1534.4 0.0
6日培養（144hr) 71.8 309.6 2031.3 0.0 この結果、 親株である Mer-11107 pldB : : hyg株では ME-282の生産がほとんどみ られなかったのに対して、 pAOC :： PapsmABを導入した Mer- 11107
ョ m
pldB : : hyg : : pA0C : : PapsmAB株では ME-282を生産していた。 このことより、 ME- 265 生産株である Mer-11107 pldB :： hyg株に、 ME- 265の 16位水酸化酵素遺伝子である psmABを導入することにより、 ME-282を直接生産できることが示された。
前記の Mer-11107 pldB : : hyg : : pA0C : : PapsmAB株の培養液に等量のァセトニトリ ルを添加して得た抽出液約 90mLに濾過助剤を加えて混合後、 桐山ロート 60 φ (桐 山濾紙 No. 4) で濾過して菌体を分離した。 菌体を水 50mLで洗浄して、 菌体分離濾 液を得た。 菌体分離濾液を、 酢酸ェチル lOOmLで 2回抽出した。 無水硫酸ナトリ ゥムにて乾燥後、 溶媒を除去して残渣を得た。 薄層クロマトグラフィー (MERCK Si l icagel 60 F254 0. 5 展開液 トルエン ァセトン =1 1)により精製し、 ME- 265を 0. 5mg ME-282を 12. 5mg得た。 ME- 265及び ME- 282の NMR分析結果を以 下に示す。
ME- 265
】H -剛 Rスぺク トル（CD30D, 500MHz) ： δ ppm (積分，多重度，結合定数 J (Hz) ) ：
0. 87 (3H, d J=7. 0Hz) 0. 90 (3H, d, J=7. 0Hz) , 0, 94 (3H, d, J=7. 3Hz) ,
0. 97 (3H, d J=7. 0Hz) 1. 08 (3H, d, J=7. 0Hz) , 1. 17—1. 21 (1H, m) , 1. 24-1. 36 (2H, m) ,
1. 42—1. 52 (3H, m) , 1. 61—1. 66 (3H, m) , 1. 74 (3H, d, J=l. 1Hz) , 1. 89—1. 96 (1H m)
2. 00 (3H, s) , 2. 41-2. 47 (1H, m) , 2. 43 (1H, dd, J=5. 5, 13. 9Hz) , 2. 51-2. 58 (1H, m) ,
2. 56 (1H, dd, J=3. 7 13. 9Hz) , 2. 65 (1H, dd, J=2. 2 8, 1Hz) , 2. 72 (1H, dt, J=2. 2, 5. 9Hz) , 3. 51 (IH, dt, J=4. 4， 8. 4Hz) , 3. 75-3. 80 (IH, m) , 4. 91 (IH, dd, J=8. 8, 10. 6Hz)，
5. 00 (IH, d, J=10. 6Hz)， 5. 42 (IH, dd, J=9. 2, 15. OHz) , 5. 49 (IH, dd, J=9. 2, 15. OHz) , 5. 65 (IH, dd, J=8. 4， 15. OHz) , 6. 08 (1H， d, J=10. 6Hz)， 6. 32 (1H， dd, J=10. 6, 15. OHz) E-282；
'Η -剛 Rスぺク トル（CD30D， 500MHz) ： δ ppm (積分，多重度，結合定数 J (Hz) ) ：
0. 87 (3H, d， J=7. 0Hz)， 0. 90 (3H, d, J=7. 0Hz)， 0. 94 (3H, t, J=7. 3Hz) ,
0. 97 (3H, d， J=6. 6Hz)， 1. 21—1. 26 (1H， m) , 1. 29-1. 37 (3H, m) , 1. 34 (3 s) ,
1. 44-1. 52 (2H, m) , 1. 60-1, 64 (1H, m)， 1. 65 (IH, dd, J=6. 2， 13. 9Hz)，
1. 77 (3H, d， J=l. 1Hz) , 1. 86 (IH, dd, J=5. 4, 13. 9Hz) , 1. 89-1. 94 (IH, m) ,
2. 00 (3H, s) , 2. 43 (IH, dd, J=5. 5, 13. 9Hz) , 2. 50-2. 60 (IH, m) ,
2. 56 (IH, dd, J=3. 3, 13. 9Hz) , 2. 66 (IH, dd, J=2. 2, 7. 7Hz)， 2. 89 (IH, dt, J=2. 2, 6. 2Hz) ,
3. 52 (IH, dt, J=4. 8, 8. 4Hz) , 3. 75—3. 80 (IH, m)， 4. 90 (IH, overlapped with D20)，
5. 01 (IH, d, J=10. 6Hz) , 5. 42 (IH, dd, J=9. 2, 15. OHz) , 6. 13 (IH, d, J=10. 6Hz) ,
6. 52 (IH, dd, J-l l. 0， 15. OHz)
実施例 9 ： ermEプロモーターと psmABを連結させたプラスミ ド pPepsmABの作製 psmABを ermEプロモーターを用いて発現させるため、 ermEプロモ一ター領域を psmABと連結させた。 配列番号 2の塩基配列情報をもとに、 psmABを増幅するため に以下に示すような配列からなる 2種のプライマー、 eDM_SphF (5'末端に Sphlサ ィトを付加：配列番号 2 7参照）および eDM- SphR (5'末端に Sphlサイトを付加： 配列番号 2 8参照） を合成した。
eDM-SphF : 5' - TCCCCGCATGCCGGAACTGACGGACATCAC-3'
eDM- SphR : 5' -CCCGGGCATGCAGACGACGACGTAGAGGAA-3'
これらのプライマーを用いて PCRを以下の条件にて行った。
(PCR反応液組成：タ力ヲバイォ社 LA Taqを使用）
滅菌精製水 17 し
2倍濃縮 GC buffer II 25 μ L
dNTP混合溶液 （dATP， dGTP, dCTP, dTTP各 2m ) 5 μ L
LA Taq 0. 5 /i L eDM-SphF(50pmol/ μΐ) 0.5 μ L eDM-SphR (50pmol/ μ L) 0.5 zL
ストレプトミセス -エスピー A-1544株ゲノム DNA
(参考例 2 ( 1 ) lOng/^L) ΙμΙ
(反応条件： Biometra社 T GRADIENTを使用）
95°C .3分
(98°C 20秒、 68°C 4分） 30サイクノレ '
68°C 5分
この反応の結果、 増幅された I570bpの psmABを含む DNA断片を QlAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社） にて回収した。 得られた 1570bpの DNA断片を制限 酵素 Sphlで消化した。 同様にプラスミ K pSK117 (J. Bacteriol. vol.2002
184, 6417-6423参照）を制限酵素 Sphlで消化した。 得られた 1570bpの psmABを含 む DNA断片の消化物とプラスミ ド消化物とを、 DNA Ligation Kit ver.2.1 (タカ ラバイオ社） を用いて連結した。 これにより、 ermEプロモ一ターと psmABを連結 させたプラスミ ド pPepsmABを構築した。
実施例 1 0 ： ermEプロモーターと連結させた psmABの入った組み換え導入用プ ラスミ ドの作製
実施例 9で調製したプラスミ ド pPepsmABを制限酵素 Kpnlおよび Bglllで消化 した後、 BKL Kit (タカラバイオ社） を用いて末端を平滑化した。 得られた DNA を 0.8%の Molecular Biology Agarose (登録商標、 BIO- RAD社） 上で電気泳動
(Mupid - ex:アドバンス社） し、 分離した 2060bpの ermEプロモーターと psmABを 含む DNA断片 （以後、 PepsmABという） を切り出し、 QlAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社） にて回収精製した。 また、 図 4に示す組み換え導入用ベクター pUC19aph: :oriT: :intphiC31を制限酵素 BamHIで消化した後、 BKし Kit (タカラバ ィォ社） を用いて末端を平滑化した。 こうして得られたベクターと PepsmABとを DNA Ligation Kit ver.2.1 (タカラバイオ社） を用いて連結した。 これにより、 PepsmABを組み換え導入用ベクター pl)C19aph: :oriT: :intphiC31に挿入した、 組み 換え導入用プラスミ ド pAOC:： PepsmABを構築した。 実施例 1 1 ：天然型 psmABの入った組み換え導入用プラスミ ドの作製
配列番号 2の塩基配列を参考にして、 5' 末端に Bglllサイ トを付加したプライ マ一 DM- BglF (5' -CGCATAGATCTTCACCCGAGCGGGTGATCA-3' ：配列番号 3 5参照）および
5' 末端に Bglllサイ トを付加したプライマー DM_BglR (5' -
TCCCGAGATCTTGAAGGTCCGCGTCACCGT-3' ：配列番号 3 6参照）を設計し作成した。 次 に：この 2種のプライマー（DM- BglFおよび DM- BglR)と参考例 2 ( 1 ) で得た A - 1544株ゲノム DNAをテンプレートとして用いて PCR反応を行った。 PCR反応は、 Takara LA Taq (タカラバイオ社）と PCR増幅装置（Biometra 社 T Gradient)を用い、 変性を 98°C、 20秒間、 ァニーリングを 63°C、 30秒間、 伸長を 68°C、 4分間行う 3段階の反応を 30回繰り返した。 この PCR増幅反応液から天然型の psmAおよび psmBを含む約 3. 5kbpの大きさの DNA断片 （以後、 PopsmABという） をァガロース ゲル電気泳動と SUPREC 01 (タカラバイオ社）によって回収した。 得られた DNA断片 を制限酵素 Bglllで消化した。 また、 図 4に示す組み換え導入用ベクター
pUC19aph : : oriT: : intphiC31を制限酵素 BamHIで消化した。 こうして得られたべク ターと PopsmABとを DNA Ligation Kit ver. 2. 1 (タカラバイオ社） を用いて連結 した。 これにより、 PopsmABを組み換え導入用ベクター
pUC19aph : : oriT:： intphiC3lに挿入した、 組み換え導入用プラスミ ド
pAOC:： PopsmABを構築した。
実施例 1 2 ：組み換え導入用プラスミ ド pUC19aph : : oriT: : intphiC31、
pAOC:： PepsmABおよび pAOC:： PopsmABの Mer- 11107株への導入
組み換え導入用べクタ一 pUC19aph：： oriT：： intphiC31および実施例 1 0および 1 1で得られた pAOC:： PepsmABおよび pAOC :： PopsmABを、 接合大腸菌 S17 - 1
(ATCC47055) へエレク ト口ポレーシヨン法を用いて各々形質転換し、 それぞれ S17-l/pUC19aph : : oriT :： intphiC31株、 S17- 1/pAOC :： PepsmAB株および S17_
1/pAOC : : PoepsmAB株を得た。 得られた 3株を、 25 μ g/mLのカナマイシンを含む LB 培地（1%バク トトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 10mLに植菌し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 10mLで 2回洗浄後、 LB培地 5mLに懸濁した。 これを供与菌懸濁液とした。 供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地（Trypto- Soya broth:日水製薬社） 10n)Lに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅菌水 10mLで 2回洗浄後、 滅菌水 lmLに懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 得られ た 3株の供与菌懸濁液 500 しの各々を、 Mer-11107株受容菌懸濁液 lO L と混ぜ、 Actino Medium No.4寒天培地 （日本製薬社） に塗布した。 30°Cで 18時間培養後、 2mg/mLのリボスタマイシンを含む 2.5mLの SNA(0.8%栄養培地： Difco社、 0.4% 寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培養し、 リポスタマイシンに耐性な
pUC19aph: :oriT:： intphiC31形質転換株 Mer_11107:： pAOC株、 pAOC:： PepsmAB形質 転換株 Mer- 11107：： pAOC：： PepsmAB株および pAOC：： PopsmAB形質転換株 Mer- 11107： :pA0C:： PopsmAB株を得た。
実施例 1 3 ： Mer- 11107: :pA0C株、 Mer- 11107: :pA0C:： PepsmAB株および Mer - 11107: :pA0C:： PopsmAB株のプラジェノライド生産試験
実施例 1 2で得られた Mer-11107: :pA0C株、 Mer - 11107: :pA0C:： PepsmAB株およ び Mer- 11107: :pA0C:： PopsmAB株について、 プラジェノライド Bおよびその 16位 水酸化体であるプラジェノライド Dの生産性を試験した。 Mer-11107: :PA0C株、 Mer-11107:： pAOC:： PepsmAB株および Mer- 11107:： pAOC:： PopsmAB株の各々の凍結種 母 300/ Lを、 種母培地 （溶性でんぷん 2%、 大豆粉 （味の素社：エスサンミー ト） 2%、 酵母エキス 0.3%、 K2HP04 0.1%、 MgS04 · 7H20 0.25%、 CaC03 0.3% pH 無調整） 20mLに植菌し、 25°Cで 2 日間培養した。 得られた種母培養液の 300 μ Lを、 本培養培地 （溶性デンプン 5%、 グルコース 1%、 フアルマメディア 3%、 CaC03 0.1%、 pH7.5) 30mLに植菌し、 25°Cで 4日間培養した。 培養終了後、 得られた培 養液に対して 9倍量のァセトニトリルを加えて抽出した。 得られた抽出液につい て HPLCにてプラジェノライド Bおよびその 16位水酸化体であるプラジェノライ ド Dの量を測定した。 測定結果を表 6に示す。 また、 HPLCの測定条件を以下に示 す。 .
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil 0DS UG_3 ( φ 4.6mmX 50 mm 3 μ m)
移動相： 45%〜55% メタノ一ル（0〜5分） 55% メタノール（5〜13分）
55%〜70% メタノール（13〜21分)
70% メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクショ ン容量： 5 /i L
カラム温度： 40°C
分析時間： 25分
保持時間：プラジェノライド B 12. 4分
プラジェノライド D 4. 3分
表 6
Figure imgf000062_0001
この結果、 ベクターのみを導入した Mer- 11107 : : pA0C株ではプラジェノライ ド Dの生産がほとんどみられなかったのに対して、 pAOC : : PepsmAB または
pAOC: : PopsmABを導入した Mer-11107 :： pAOC :： PepsmAB株および Mer- 11107 : : pA0C : :.PopsmAB株ではプラジェノライ ド Dを生産していた。 このことより、 プラジェノライ ド B生産株である Mer- 11107株に、 プラジェノライド Bの 16位水 酸化酵素遺伝子である psmABを導入することにより、 プラジェノライド Dを直接 生産できることが示された。
実施例 1 4 ：改変型 psmAをふくむ pPampsmABの作製
psmAに位置特異的変異を加えるため、 実施例 1で作製した pPapsmABを銹型に QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて変異を導入した
pPampsmAB-CLM, pPampsmAB- CLLM, pPampsmAB-CLFM, pPampsmAB- TYを作製した。 まず、 以下に示すような配列からなるプライマー R91C- Fおよび R91C-R (配列番 号 37および 38参照） を合成し、
R91C-F : 5' - TTCGCGGCCGTCTGCGACCGGCGGGTG - 3'
R91C-R : 5' -CACCCGCCGGTCGCAGACGGCCGCGAA-3'
pPapsmABを鎳型に QuickChange™ S i te-Directed Mutagenes i s Ki tを用いて PsmA の 91番目のアルギニンをシスティンに置換するように変異を導入した pPampsmAB - Cを作製した。 次に、 以下に示すような配列からなるプライマー R'i95L-Fおよび R195L-R (配列番号 39および 40参照） を合成し、
R195L-F :.. 5' - TCGCAAGGGGCGCTCGAGCGGCTCGAG-3'
R 195L-R： 5' -CTCGAGCCGCTCGAGCGCCCCTTCCGA-3 '
pPampsmAB— Cを踌型に Qui ckChange™ Site-Directed Mutagenes i s Kitを用いて PsmAの 195番目のアルギニンをロイシンに置換するように変異を導入した pPampsmAB-CLを作製した。 次に、 以下に示すような配列からなるプライマー L403M- Fおよび L403M- R (配列番号 41および 42参照） を合成し、
L403M-F : 5' -ACGATCCAGGGGATGATGGAACTCCCCGTGA-3'
L403M-R : 5' -TCACGGGGAGTTCCATCATCCCCTGGATCG-3'
pPampsmAB— Cしを錄型に QuickChange™ S i te-Directed Mutagenes is Ki tを用レヽて PsmAの 403番目のロイシンをメチォニンに置換するように変異を導入した pPampsmAB- CLMを作製した。 次に、 以下に示すような配列からなるプライマー R236L-Fおよび R236L-R (配列番号 43および 44参照） を合成し、
R236L-F : 5' -AGCTGGACCGACTCGACGTGGTGGCGCTGG-3'
R236L-R : 5' - AGCGCCACCACGTCGAGTCGGTCCAGCTC - 3'
pPampsmAB- CLMを錡型に Qui ckChange™ Si te-Directed Mutagenesi s Ki tを用いて PsmAの 236番目のアルギ ンをロイシンに置換するように変異を導入した pPampsmAB- CLLMを作製した。 次に、 以下に示すような配列からなるプライマー I244F-Fおよび I244F-R (配列番号 45および 46参照） を合成し、
I244F - F : 5' -TGGCGCTGGCCGTCTTCCTGCTCGTGG-3'
I244F-R : 5' -CCACGAGCAGGAAGACGGCCAGCGCCACCA-3' pPampsmAB- CLMを鑲型に QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて PsmAの 244番目のイソロイシンをフヱニルァラニンに置換するように変異を導入 した pPampsmAB- CLFMを作製した。 また、 以下に示すような配列がらなるプライマ 一 M112T-Fおよび M112T-R (配列番号 47および 48参照） を合成し、
M112T-F: 5' -CAGCGGCGGATGACGATCCCGTCGTTC-3'
M112T-R ： 5' -GAACGACGGGATCGTCATCCGCCGCTG-3'
pPapsmABを銹型に QuickChange™ Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて PsmA の 112番目のメチォニンをトレオニンに置換するように変異を導入した pPampsmAB- Tを作製した。 そして、 以下に示すような配列からなるプライマー R195Y- Fおよび R195Y-R (配列番号 49および 50参照） を合成し、
R195Y-F: 5' -AGGGGCGCGCGAGTACCTCGAGGAGTACCT-3'
R195Y-R : 5' -GGTACTCCTCGAGGTACTCGCGCGCCCCT丁 - 3'
pPampsmAB- Tを銬型に QuickChange™ Site-Directed Mutagenesi s Kitを用いて PsmAの 195番目のアルギニンをチロシンに置換するように変異を導入した pPampsmAB-TYを作製した。
実施例 1 5 ： 2重相同組換えによる導入プラスミ ドの作製
参考例 1 ( 7 ) プラジェノライ ド生合成遺伝子クラスタ一の塩基配列の決定に より、 決定されたプラジェノライ ドの生合成に関与する DNAとその周辺の DNAを 含む塩基配列を用いて、 2重相同組換えにより psmABまたはその改変体を導入する ことが可能と考え、 以下の方法で、 導入用のプラスミ ドを作製した。
2重相同組換えのための相同配列を増幅させるため、 プラジェノライドの生合成 に関与する DNAの下流の塩基配列に基づいて、 以下に示す配列からなる 4種のプ ライマー、 pldout-L- Bgl2F、 pldout- L_SphlR、 pldout- R-SphlFおよび pldout - R— Bgl2R (配列番号 51、 52、 53および 54参照） を合成した。
pldout- L-Bgl2F : 5' -GGGAGATCTGCAGGTCATCGGGGGGAAGAACCACA-3'
pldout L-SphlR : 5' - TCTCCAGCCGCATGCGGTCCCGGGTCACCGT- 3'
pldout-R- SphlF : 5' - CCCGCATGCGGCTGGAGATCATCCAGAGCGCA - 3'
pldout- R-Bgl2R : 5' -GGGAGATCTAGAACATGCCGGGCCAGAGGCTGAC-3' ' これらのプライマーを用いて PCRを以下の条件にて行った
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 30 /i L
2倍濃縮 GC buffer II 50 μ ΐ
dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 L
pldout- L— Bgl2Fまたは pldout- R- SphlF (50pmol/ ,u L) l ^ L
pldout-L— SphlRまたは pldout- R- Bgl2R (50pmol/ /i L) 1 μ ΐ
Mer-11107 ¾ total DNA (lOOng/ μ L) 1 μ ΐ
LA Taq polymerase (5u/ z L,宝酒造社） 1 M L
(反応温度条件）
95°C 3分（98°C 20秒， 65°C 30秒， 68°C 3分） 30サイクル
72°C 5分
この反応の結果、 pldout- L-Bgl2Fと pldout - L-SphlRを用いた反応から、 2. 08kb の DNA断片 （DNA断片 LZ) が增幅され、 pldout-R- SphlFと pldout- R-Bgl2Rを用い た反応から、 2. 73kbの DNA断片 （DNA断片 RX) が増幅された。 DNA断片 LZ及び RX を QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN社）で精製した後、 制限酵素 Bgl llと Sphlで消化した。
次に、 ハイグロマイシン耐性遺伝子を增幅させるため、 塩基配列に基づき、 以 下に示すような配列からなる 2種のプライマー hyg-SpeSphFおよび hyg2- SphR (配 列番号 55および 56参照） を合成した。
hyg-SpeSphF : 5' -GGGGCATGCGGACTAGTACACCGTCGCCTCGGT-3'
hyg2-SphR : 5' -GCCGCATGCGTCAGGCGCCGGGGGCGGTGT-3'
これらのプライマーを用いて PCRを以下の条件にて行った。
(PCR反応液組成）
滅菌精製水 30
2倍濃縮 GC buffer II 50 L dNTP混合溶液（dATP, dGTP, dTTP, dCTP各 2. 5mM) 16 U L hyg - SpeSphF (50pmol/ L) 1 μ L hyg2 - SphR (50pmol/ / L) l ^ L
Streptomyces hygroscopicus JCM 4772株 total DNA (lOOng/ μ U 1 μ L
LA Taq polymerase (5u/ μ L,宝酒造社） 1 μ L
(反応温度条件）
95°C 6分（98°C 20秒， 63°C 30秒， 68°C 2分） 30サイクル
72°C 5分 .
この反応の結果増幅された 1. 21kbの DNA断片（DNA断片 hyg2)を QIAGEN PCR purification Kit (QIAGEN社）で精製した後、 制限酵素 Sphlで消化した。
制限酵素 Bglllと Sphlで消化した DNA断片 LZ及び RXと、 制限酵素 Sphlで消 化した DNA断片 hyg2、 および制限酵素 BamHIで消化したシャトルべクタ一 pKU253 (図 3参照）、 の計 4者を DNA ligation kit ver. 2. 1 (タカラバイオ社） で 連結した。 こうして DNA断片 LZと RXの間に DNA断片 hyg2が挿入された形の約 6. Okbの DNA断片が、 pKU253に挿入された約 22kbの 2重相同組換えによる導入用 プラスミ ド pKU253-LZ-hyg2 - RXが構築された。
実施例 1 6 ： 2重相同組換えによる導入用プラスミ ド pKU253-LZ-hyg2-RXへの psmABまたはその改変体の挿入
実施例 1で構築した pPapsmABおよび実施例 1 4で構築した pPampsmAB-CLM, pPampsmAB-CLLM, pPampsmAB-CLFM, pPampsmAB- TYを制限酵素 Spelで消化した。 制 限酵素 Spelで消化した各 DNAを 0. 8%の Certified™ Molecular Biology Agarose (BI0-RAD社） 上で電気泳動 （Mupid- ex ： アドバンス社） し、 分離した 1. 8kbPの pldAプロモーターと psmABまたはその改変体を含む DNA断片 （以後、 PapsmAB ， PampsmAB-CLM, PampsmAB- CLLM, PampsmAB-CLF , PampsmAB-TYというときがある） を切り出し、 QlAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社） にて回収精製した。 そ うして得られた各 DNA断片 （PapsmAB , PampsmAB-CLM, PampsmAB- CLLM,
PampsmAB-CLFM, PampsmAB-TY) を、 実施例 1 5で作製した pKU253- LZ_hyg2 - RXを 制限酵素 Spelで消化したものと DNA ligation kit ver. 2. 1 (タカラバイオ社） で 連結した。 こうして各 DNA断片 （PapsmAB , PampsmAB-CLM, PampsmAB- CLLM, PampsmAB-CLFM, PampsmAB-TY ) が pKU253- LZ- hyg2- RX の hyg2の上流に挿入され た、 約 24kbの 2重相同組換えによる psmABまたはその改変体導入プラスミ ド pKU253-LZ-hyg2-PapsmAB-RX, pKU253-LZ-hyg2- PampsmAB- CLM-RX, pKU253-LZ - hyg2- PampsmAB-CLLM- RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB- CLFM-RX, pKU253- LZ-hyg2- PampsmAB- TY-RXが構築された。
実施例 1 7 ： 2重相同組換えによる Mer- 11107株への psmABまたはその改変体の 挿入
得られた pKU253 - LZ- hyg2 - PapsmAB - RX, PKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CL -RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLLM-RX, pKU253_LZ- hyg2-PampsmAB- CLFM- RX, pKU253 - LZ - hyg2- PampsmAB- TY-RXを、 それぞれ接合大腸菌 S17-1へエレク トロポレーショ ン法を用いて形質転換し、 S17-l/pKU253-LZ-hyg2- PapsmAB-RX株， S17-1/ pKU253 - LZ-hyg2-PampsmAB-CLM-RX株， S17_l/pKU253-LZ-hyg2- PampsmAB- CLLM-RX株， S17 - 1/ pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLFM-RX株， S17-l/pKU253_LZ- hyg2-PampsmAB- TY - RX 株を得た。 得られた S17-l/pKU253_LZ-hyg2- PapsmAB- RX株， S17-1/ PKU253- LZ - hy g2-Pamp smAB-CLM-RX株， S17- l/pKU253- LZ- hyg2-PampsmAB- CLLM- RX株， S17- l/pKU253-LZ-hyg2- PampsmAB- CLFM-RX株， S17_l/pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-TY- RX 株を、 それぞれ 25 μ g/mLのカナマイシンおよび 100 μ g/mLのハイグロマイシン B を含む LB培地（1%バク トトリプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%NaCl) 10mLに植菌 し、 30°Cで 2時間振盪培養後、 集菌し、 LB培地 lOmLで 2回洗浄後、 LB培地 5mL に懸濁した。 これを供与菌懸濁液とした。
供与菌懸濁液を調製するのと同時進行で、 Mer- 11107株を TSB培地 (Trypto- Soya broth :日水製薬社） lOmLに植菌し、 30°Cで 5時間振盪培養後、 集菌し、 滅菌水 10mLで 2回洗浄後、 滅菌水 lmLに懸濁した。 これを受容菌懸濁液とした。 S17 - 1 /pKU253-LZ-hyg2-PapsmAB-RX株， S17-1/ PKU253-LZ-hyg2- PampsmAB- CLM-RX株， S 17-l/pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLLM-RX株， S 17- 1 /pKU253_LZ-hyg2- PampsmAB - CLFM-RX株， S17-l/pKU253-LZ-hyg2- PampsmAB- TY-RX株供与菌懸濁液 500 /z Lを、 Mer- 11107株受容菌懸濁液 lO Lと混ぜ、 Actino Medium No. 4寒天培地 （日本製 薬社） に塗布した。 30°Cで 18時間培養後、 2mg/mLのリボスタマイシンを含む 2. 5mLの SNA (0. 8%栄養培地： Difco社、 0. 4%寒天）を重層した。 30°Cで 7日間培 養し、 リボスタマィシンに耐性な pKU253-LZ- hyg2- PapsmAB- RX, pKU253- LZ-hyg2- PampsmAB-CLM-RX, pKU253- LZ-hyg2_PampsmAB- CLLM- RX, pKU253-LZ-hyg2- PampsmAB- CLFM-RX, pKU253_LZ- hyg2-PampsmAB- TY- RX形質転換株を得た。
得られた pKU253-LZ-hyg2- PapsmAB- RX, pKU253-LZ- hyg2- PampsmAB- CLM-RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLLM-RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB- CLFM-RX, pKU253- LZ-hyg2- PampsmAB- TY- RX形質転換株を、 リポスタマイシンを含まない TSB培地 10mLにそれぞれ植菌し、 30°Cで 24時間振盪培養した。 pKU253- - liyg2- PapsmAB- RX, pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLM-RX, pKU253 - LZ- hyg2 - PampsmAB_CLLM - RX' pKU253-LZ-hyg2-PampsmAB-CLFM-RX, pKU253_LZ- hyg2- PampsmAB-TY-RX形質転換株 培養液を集菌し、 滅菌水 10mLで 2回洗浄後、 滅菌水 10mLに懸濁した。 適当に希 釈した懸濁液を、 200μ /ιΛのハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地 （0.4%酵 母エキス、 /。麦芽エキス、 0.4%溶性デンプン、 2%寒天、 10mM塩化カルシウム） に塗布し、 30°Cで 4日間培養した。 ハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地で生 育したシングルコロニーを 200;U g/mLのハイグロマイシン Bを含む YMS寒天培地 および 200/ig/mLのリボスタマイシンを含む YMS寒天培地に植えかえ、 30°Cで 2 日間培養した。 培養後、 ハイグロマイシン B耐性で、 リボスタマイシン感受性の 株を選択した。 得られだ菌株は、 ゲノム中のプラジェノライ ドの生合成に関与す る DNAの下流 （配列番号 1の塩基 73362と塩基 73369の間） にハイグロマイシン B 耐性遺伝子 hyg2および psmABまたはその改変体が挿入された株であり、 各々 Mer- 11107-ZX:： hyg2:： PapsmAB株， Mer- 11107- ZX:： hyg2:： PampsmAB- CLM株， Mer- 11107-ZX:： hyg2:： PampsmAB- CLLM株， Mer- 11107- ZX:： hyg2：： PampsmAB-CLFM株， Mer-11107-ΖΧ: :hyg2:： PampsmAB- TY株とした。
実施例 1 8： Mer- 11107- ZX: :hyg2: : PapsmAB株， Mer- 11107- ZX: :hyg2: : PampsmAB- CLM株， Mer-11107-ΖΧ: :hyg2: : PampsmAB- CLLM株， Mer- 11107 - ZX:： hyg2:： PampsmAB-CLFM株， Mer- 11107- ZX:： hyg2:： PampsmAB-TY株のプラジェノ ライド生産
実施例 1 7で得られた Mer - 11107-ZX : :hyg2: : PapsmAB株， Mer- 11107- ZX：: hy g2： : PampsmAB- CLM株， Mer- 11107-Z ：： hyg2：： PampsmAB-CLLM株， Mer - 11107-ZX :： hyg2 :： PampsmAB- CLFM株， Mer-11107- ZX :： hyg2 :： PampsmAB-TY株の凍結 種母、 各 500 Lを種母培地 （溶性デンプン 2%、 大豆粉 （味の素社：エスサンミ 一ト） 2%、 酵母エキス 0. 3%、 K2HP04 0. 1 %、 MgSO, · 7H20 0. 25%、 CaC03 0. 3% pH無調整） 25mLに植菌し、 25°Cで 3日間培養した。 得られた種母培養液の 300 μ L を、 本培養培地 （溶性デンプン 5%、 グルコース 1 %、 フアルマメディア 3%、 ソ ィプロ 1 %、 アデカノ一ル LG- 126 0. 05%、 /3 -CD 2. 0%、 CaC03 0. 1 %、 pH7. 5) 30mLに植菌し、 25°Cで 6日間培養した。 '
培養終了後、 得られた培養液に対して 4倍量のァセトニトリルを加えて抽出し た。 得られた抽出液について HPLCにてプラジェノライド D、 およびプラジェノラ ィド Dの 20位水酸化体であるプラジェノライ ド H13、 およびプラジェノライ ド D の 21位ケト体であるプラジエノライ ド C2、 そしてプラジェノライド Dの 20位水 酸化、 21位ケト体であるプラジェノライ ド C3の量を測定した。 測定結果を表 7に 示す。 また、 HPLCの測定条件を以下に示す。
(HPLCの分析条件）
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil ODS UG-3 (4. 6 X 50mm 3 μ m)
移動相： 20%〜35% ァセトニトリル（0〜13分）
35%〜100% ァセトニトリル（13〜17分）
20% ァセトニトリル（17〜22分）
流速： 1. OmL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5 / L
カラム温度： 40°C
分析時間： 22分
保持時間： プラジェノライド H13； 5. 5分、
プラジェノライド C3； 8. 3分、
プラジェノライド D； 9. 0分、
プラジェノライド C2； 11. 1分
Figure imgf000070_0001
*7 この結果、 PapsmABを導入した Mer- 11107- ZX :： hyg2 :： PapsmAB株ではプラジェノ ライド Dの生産とともプラジェノライ ド Dの分解物であるプラジエノライ ド H13、 プラジェノライ ド C2、 プラジェノライ ド C3が大量に生産されていたのに対して、 PampsmAB-CLM, PampsmAB-CLLM, PampsmAB-CLFM, PampsmAB- TYを導入した Mer- 11107-ZX :： hyg2 :： PampsmAB-CLM株， Mer- 1 1 107-ZX :： hyg2：： PampsmAB-CLLM株, Mei— 1 1107-ZX :： hyg2：： PampsmAB- CLFM株， Mer- 1 Π 07- ZX :： hyg2 : : PampsmAB- TY株で はプラジェノライド Dを生産しながらプラジェノライ ド Dの分角?'物であるプラジ エノライ ド Η13、 プラジエノライ ド C2、 プラジエノライ ド C3の生産が約 4分の 1 以下に減少した。 このことより、 プラジェノライト " B生産株である Mer- 11107株 に、 プラジエノライド Bの 16位水酸化酵素遺伝子である psmABの改変体を導入す ることにより、 プラジェノライド Dを直接生産できるとともにプラジェノライ ド Dの分解物の生産を低減できることが示された。

Claims

請求の範囲 式 (I) (但し、 Rは水素原子または水酸基を示す） で表わされる 16位水酸化マクロライ ド系化合物を生産する能力を有する微生物であって、 (a) 式 (Π) (但し、 Rは水素原子または水酸基を示す） で表わされるマクロライ ド系化合物 の生合成に関与するポリぺプチドを一部にまたは全体としてコードする DNA、 およ び (b) 前記式（Π)で表わされるマクロライド系化合物の 16位水酸化酵素活性を 有するポリぺプチドを一部にまたは全体としてコードする DNA、 を有する遺伝子組換え微生物。 2 . 前記（a)で表わされる DNAが、 ポリケチド合成酵素活性を有するポリぺプ チド、 7位ァセチル化酵素活性を有するポリペプチド、 18, 19位エポキシ化酵素活 性を有するポリぺプチドおよび転写調節因子活性を有するポリぺプチドを一部に または全体としてコードする DNAである請求項 1記載の遺伝子組換え微生物。 3 . 前記（a)で表わされる DNAが、
(a - 1) 配列番号 1の塩基 8340から塩基 27935までの連続した塩基配列
(a - 2) 配列番号 1の塩基 28021から塩基 49098までの連続した塩基配列
(a - 3) 配列番号 1の塩基 49134から塩基 60269までの連続した塩基配列
(a-4) 配列番号 1の塩基 60269から塩基 65692までの連続した塩基配列
(a - 5) 配列番号 1の塩基 68160から塩基 66970までの連続した塩基配列
(a - 6) 配列番号 1の塩基 69568から塩基 68270までの連続した塩基配列、 および
(a-7) 配列番号 1の塩基 72725から塩基 70020までの連続した塩基配列 を含んでなる DNAまたはその改変体である請求項 1または 2記載の遺伝子組換え 微生物。
4 . 前記（a)で表わされる DNAが、 さらに 6位水酸化酵素活性を有するポリべ プチドを一部にまたは全体としてコードする DNAを含む請求項 2または 3記載の 遺伝子組換え微生物。
5 . 6位水酸化酵素活性を有するポリぺプチドを一部にまたは全体としてコー ドする DNAが、 配列番号 1の塩基 65707から塩基 66903までの連続した塩基配列 を含む DNAまたはその改変体である請求項 4記載の遺伝子組換え微生物。
6 . 前記（b)で表わされる DNAが、
(b-1) 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列、
(b - 2) 配列番号 3の塩基 420から塩基 1604までの連続した塩基配列、 および
(b-3) 配列番号 4の塩基 172から塩基 1383までの連続した塩基配列
からなる群より選択される DNAまたはその改変体である請求項 1から 5までのい ずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
7 . 前記（b)で表わされる DNAが、 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548まで の連続した塩基配列を含んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる 群より選択される改変部位を 1または 2以上有する、 請求項 1から 6までのいず れかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コ一ドするコ ドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 メチォニン以外のアミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のアミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 ィソロイシン以外のァミノ酸 をコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 ロイシン以外のァミノ酸をコ ―ドするコドンに改変した改変部位
8 . 前記（b)で表わされる DNA力 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548まで の連続した塩基配列を含んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる 群より選択される改¾部位を 1または 2以上有する、 請求項 1から 6までのいず れかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィン、 メチォニンまた はプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンまたはセリンをコ —ドするコ ドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシン、イソロイシン、 プロ リン、 チロシンまたはフエ二ルァラニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシン、 イソロイシンまた はプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フエ二ルァラニンまたはバリ ンをコードするコドンに改変した改変部位 6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 メチォニン、システィンまたは イソロイシンをコ一ドするコ ドンに改変した改変部位
9 . 前記（b)で表わされる DNA力 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548まで の連続した塩基配列を含んでなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる 群より選択される改変部位を 1または 2以上有する、 請求項 1から 6までのいず れ の請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィンをコ一ドするコド ンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンをコードするコド ンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシンまたはチロシンをコ —ドするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシンをコードするコドン に改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フ; ^二ルァラニンをコードす るコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 メチォニンをコードするコド ンに改変した改変部位
1 0 . 前記（a)で表わされる DNAを有する宿主に、 異種微生物由来の前記（b) で表わされる DNAを組み込んだ請求項 1記載の遺伝子組換え微生物。
1 1 . 前記（b)で表わされる DNAを有する宿主に、 異種微生物由来の前記（a) で表わされる DNAを組み込んだ請求項 1記載の遺伝子組換え微生物。
1 2 . 前記（a)および（b)で表わされるいずれの DNAも有しない宿主に、 異種 微生物由来の前記（a)および（b)で表わされる DNAを両方とも組み込んだ請求項 1 記載の遺伝子組換え微生物。
1 3 . 式（I)で表わされる 16位水酸化マクロライド系化合物を生産する能力 を有する遺伝子組換え微生物が、 ストレプトミセス （Streptomyces) 属に属する 菌株である請求項 1から 1 2までの一いずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生 物。
1 4 . 下記の培地 30mLを入れた 250mL容の三角フラスコに遺伝子組換え微生 物を植菌し、 25°Cで 4日間回転振とう培養 （220rpm) した後、 ァセトニトリル 270mLを加えて抽出し、 得られた抽出液を下記の測定条件で HPLC分析し、 式（I)で 表わされる 16位水酸化マクロライド系化合物を定量したときに、 式（I)で表わさ れる 16位水酸化マクロライ ド系化合物を培養液 1 L当り 50mg以上生産する能力を 有する請求項 1から 1 3までのいずれかの請求項に記載の遺伝子組換え微生物。
(培地）
溶性デンプン 5%、 グルコース 1%、 フアルマメディア 3%、 CaC03 0. 1 %、 pH7. 5
(HPLC測定条件）
分析装置： Shimadzu HPLC ΙΟΑνρ
カラム： Develosil ODS UG - 3 ( <H. 6mm X 50mm 3 μ m)
移動相： 45%〜55%メタノール（0〜5分）、 55%メタノール（5〜13分）、 55%〜 70%メタノール（13〜21分）、 70%メタノール（21〜25分）
流速： 1. 2mL/分
検出： UV240nm
ィンジェクション容量： 5 L
カラム温度： 40°C
1 5 . 請求項 1カゝら 1 4までのいずれかの請求項に記載された遺伝子組換え 微生物を、 栄養培地中で培養し、 その培養液から式（I)で表わされる 16位水酸化 マクロライド系化合物を採取することを特徴とする、 式（I)で表わされる 16位水 酸化マクロライ ド系化合物もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの水 和物の製造方法。
1 6 . 培養液中にシクロデキストリン類を存在させることを特徴とする請求 項 1 5に記載の方法。
1 7 . シクロデキス トリン類が、 ーシクロデキストリン、 ？ーシクロデキ ストリン、 部分メチル化 i3—シクロデキストリン、 ジメチルー β—シクロデキス トリン、 トリメチルー —シクロデキス トリン、 グリコシル一 j3—シクロデキス トリンおよびヒ ドロキシプロピル一 —シクロデキストリンからなる群から選択 されるシクロデキストリン類である請求項 1 6に記載の方法。
1 8 . 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列を含ん でなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる群より選択される改変部位 を 1または 2以上含んでなる DNA改変体。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 メチォニン以外のアミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のァミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 アルギニン以外のアミノ酸を コードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 イソロイシン以外のアミノ酸 をコードするコドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 ロイシン以外のアミノ酸をコ ードするコドンに改変した改変部位
1 9 . 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した塩基配列を含ん でなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる群より選択される改変部位 を 1または 2以上含んでなる DNA改変体。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィン、 メチォニンまた はプロリンをコ一ドするコドンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンまたはセリンをコ ードするコドンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシン、イソロイシン、 プロ リン、 チロシンまたはフエ二ルァラニンをコードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 2027から塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシン、 イソロイシンまた はプロリンをコードするコドンに改変した改変部位
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フヱニルァラニンまたはバリ ンをコードするコ ドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 メチォニン、システィンまたは ィソロイシンをコードするコ ドンに改変した改変部位
2 0 . 配列番号 2の塩基 1322から塩基 2548までの連続した埠基配列を含ん でなる DNAの改変体であって、 以下の 1)〜6)からなる群より選択される改変部位 を 1または 2以上含んでなる DNA改変体。
1)塩基 1592から塩基 1594にかけての配列 cgcを、 システィンをコードするコド ンに改変した改変部位
2)塩基 1655から塩基 1657にかけての配列 atgを、 スレオニンをコードするコド ンに改変した改変部位
3)塩基 1904から塩基 1906にかけての配列 cgcを、 ロイシンまたはチロシンをコ ードするコドンに改変した改変部位
4)塩基 202ァから塩基 2029にかけての配列 cgcを、 ロイシンをコードするコドン に改変した改変部位.
5)塩基 2054から塩基 2056にかけての配列 ateを、 フエ二ルァラニンをコードす るコ ドンに改変した改変部位
6)塩基 2528から塩基 2530にかけての配列 ctgを、 メチォニンをコードするコド ンに改変した改変部位
2 1 . 請求項 1 8から 2 0までのいずれかの請求項に記載された DNA改変体 によりコードされるポリぺプチド。
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