WO2006126589A1 - アワビ・マンナナーゼの遺伝子 - Google Patents

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WO2006126589A1
WO2006126589A1 PCT/JP2006/310357 JP2006310357W WO2006126589A1 WO 2006126589 A1 WO2006126589 A1 WO 2006126589A1 JP 2006310357 W JP2006310357 W JP 2006310357W WO 2006126589 A1 WO2006126589 A1 WO 2006126589A1
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polypeptide
mannanase
amino acid
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seq
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PCT/JP2006/310357
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Inventor
Satoru Fukuda
Nobuhiro Hasegawa
Original Assignee
Kyowa Concrete Industry Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C12N9/2491—Beta-mannosidase (3.2.1.25), i.e. mannanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01025—Beta-mannosidase (3.2.1.25), i.e. mannanase

Definitions

  • the present invention relates to a novel mannanase derived from Arabidopsis, a gene encoding the mannanase, an amino acid sequence of the enzyme deduced by the gene force, and a technique for using these.
  • Mannan is a structural polysaccharide that constitutes the cell wall and intercellular matrix of plants, and contains mannose as a structural unit.
  • Mannanases are enzymes that specifically degrade mannan (e.g., enzymes that randomly hydrolyze ⁇ -1,4-bonds between mannoses such as ⁇ -1,4-mannan, galatatomannan, dalcomannan). So far, bacteria (Non-patent document 1: Tamaru, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol, 61, 4454-4458 (1995); Non-patent document 2: Akino, T. et al., Agr. Biol.
  • Non-patent literature 3 Reese, T. et al. Can. J. Microbiol, 11, 167-183 (1965); non-patent literature 4: Stalb rand, H., J. Biotechnol, 29, 229-242 (1993)), higher plants
  • Non-Patent Document 5 Shimahara, H. et al., Agr. Biol. Chem., 39, 301-312 (1975)
  • Non-patent document 6 Marraccini, P. et al., Planta, 213, 296-308 (2001)
  • molluscs non-patent document 7: Yamaura, I. et al. Biosci.
  • Non-Patent Document 8 Yamaura, I. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 674-676 (1996); 9:. Xu, B. et al, J. Biotechnol, 92, have been isolated from 267-277 (2002)).
  • Mannanase is contained in digestive juices such as marine snails that feed on red algae. Mannanase is a useful enzyme for the production of manno-oligosaccharides and the production of red alga protoplasts.
  • mannanases are mainly derived from microorganisms.
  • microbial mannanases have problems such as productivity, substrate specificity, purity, and reaction efficiency, and it is difficult to say that they are widely used especially in technologies using seaweed.
  • Seaweed has long been used in Japan as a variety of medicines and industrial raw materials that are not only used as edible foods. It is expected to have high utility value as it is found to contain components having functions and biological activities.
  • seaweed plays an important role in the formation of habitats for marine production and other organisms in the beach area and the cultivation of marine resources, such as providing a suitable environment for spawning and habitat for various seafood as an algae place. It is thought to play a major role in maintaining the natural environment, such as by purifying water in the sea and absorbing carbon dioxide through photosynthesis.
  • seaweeds are classified as “algae”, and algae are all remaining except moss plants, fern plants and seed plants among organisms that carry out photosynthesis that generates oxygen.
  • seaweed There are three main types of seaweed: green algae (e.g., ganori, humanedasa, huasa, mill, etc.), red algae (e.g., eelfishes and tendosas), and brown algae (e.g., kombu, wakame, hijiki, mozuku).
  • green algae e.g., ganori, humanedasa, huasa, mill, etc.
  • red algae e.g., eelfishes and tendosas
  • brown algae e.g., kombu, wakame, hijiki, mozuku.
  • Non-patent literature 10 Nobuo Yamada, “Science of using seaweed (revised edition)”, Naruyamado Shoten (2001-05-28 publication; ISBN: 4425827929) and non-patent literature 1 1: Kunio Iwabuchi ⁇ Edited by Mitsuo Chihara, supervised by Shusuke Mawatari, “Biodiversity, Series 3 Algae Diversity and Lines” (July 1999; ISBN 4-7853-5826-2)].
  • seaweed research has been delayed compared to land plants because it is inhabited in the sea area and is extremely difficult to cultivate indoors.
  • seaweed processing technology In order to meet the increasing seaweed demand not only as a food resource but also for industrial use, it is necessary to develop technologies such as seaweed processing technology and seaweed breeding breed improvement. It has been demanded. For example, when cell fusion or genetic manipulation is performed using biotechnology, technologies such as enzymatic degradation of the cell wall and protoplasting are required, but the cell wall of seaweed is different from that of land plants. Because it is composed of complex polysaccharides, many seaweeds cannot be degraded by commercial cellulase preparations.
  • Non-patent Document 12 Hiroshi Ansai et al., Bull. Coll. Arg. & Vet. Med., Nihon Univ., No. 48, pp.119-127 ( 1991)
  • Strength Because raw oyster shells such as coconut shellfish are expensive and difficult to obtain in large quantities in terms of resources, it is not possible to actually isolate mannanase. It was an unsuccessful success.
  • Non-patent Document 13 Polne-Fuller, M. et al., J. PhycoL, 20, 609). -61 6 (1984);
  • Non-Patent Document 14 Saga, N. et al, Beihefte Zur Nova Hedwigia, 83, 37-43 (1 986)).
  • protoplast yields tend to be unstable.
  • Non-Patent Document 1 Tamaru, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol, 61, 4454-4458 (1995)
  • Non-Patent Document 2 Akino, T. et al "Agr. Biol. Chem., 52 , 773-779 (1988)
  • Non-Patent Document 3 Reese, T. et al. Can. J. Microbiol, 11, 167-183 (1965)
  • Non-Patent Document 4 Stalbrand, H., J. BiotechnoL, 29, 229-242 (1993)
  • Non-Patent Document 5 Shimahara, H. et al., Agr. Biol. Chem., 39, 301-312 (1975)
  • Non-Patent Document 6 Marraccini, P. et al., Planta, 213, 296-308 (2001)
  • Non-Patent Document 7 Yamaura, I. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 1316-1319 (1993)
  • Non-patent document 8 Yamaura, I. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 674-676 (1996)
  • Non-patent document 9 Xu, B. et al., J. Biotechnol., 92, 267- 277 (2002)
  • Non-Patent Document 10 Nobuo Yamada, “Science of Seaweed Utilization (Revised)”, Naruyamado Shoten (2001-05-28, published by ISBN: 4425827929)
  • Non-Patent Literature 11 Kunio Iwabuchi ⁇ Edited by Mitsuo Chihara, supervised by Shusuke Mawatari “Biodiversity Series • Diversity and strains of three algae” ⁇ ⁇ ⁇ (July 1999; ISBN 4-7853-5826-2)
  • Non-Patent Document 12 Hiroshi Ansai et al., Bull. Coll. Arg. & Vet. Med., Nihon Univ., No. 48, pp.119 -127 (1991)
  • Non-Patent Document 13 Polne- Fuller, M. et al., J. PhycoL, 20, 609-616 (1984)
  • Non-Patent Document 14 Saga, N. et al., Beihefte Zur Nova Hedwigia, 83, 37-43 (1986) Disclosure of the Invention
  • the present invention clarifies the characteristics of an enzyme contained in an alimentary digestive juice as a part of an enzyme search that can be used for the production of protoplasts of seaweeds such as Susavinori and clones the gene (cDNA) of the enzyme.
  • the goal is to develop and provide a means that enables mass production at low cost in culture expression systems such as Escherichia coli, yeast, and animal cells.
  • a high-purity arabic mannanase was prepared, and the characteristics of the enzyme were elucidated, and a technique for preparing a purified enzyme was further provided.
  • a purified enzyme is used.
  • the partial amino acid sequence is analyzed, and an oligonucleotide primer is synthesized based on the partial amino acid sequence and a rabbit liver spleen cDNA library is prepared.
  • the cDNA library the cDNA of mannanase was amplified by PCR, and after cloning this amplified cDNA, the base sequence was analyzed and the structure of the gene of the mannanase was successfully determined.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing, a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, or a polynucleotide having the base sequence of SEQ ID NO: 10 At least 50% homology, 60% homology, 70% homology, 80% homology, 90% homology, 95% homology, or 97% homology And a polynucleotide encoding a polypeptide having the biological activity mentioned in (2) above.
  • Mannanase gene consisting of nucleotide sequence from base 15 to 1,148 bases of SEQ ID NO: 10
  • mannanase gene consisting of base sequences of 69 to 1,145 bases of SEQ ID NO: 10, or 5 of SEQ ID NO: 15
  • a recombinant vector comprising the polynucleotide according to [2] or [3] above.
  • [5] A transformed host obtained by transforming a host cell with the polynucleotide according to [2] or [3] above or the recombinant vector according to [4] above Cell
  • a method for producing a seaweed or plant protoplast which comprises treating seaweed or a plant with the protein or polypeptide of [1] to obtain a fragmented seaweed cell or plant cell.
  • a mannan-containing substrate for example, seaweed etc.
  • the protein or polypeptide of [1] algae fish food, raw food, food processing material, Including edible materials for functional foods, medicinal materials, fertilizers, soil conditioners, dyes, lubricants, industrial ingredients including additives such as cosmetics, biomass energy sources, and of course, antitumor (Including pharmaceuticals, fertilizers
  • the present invention is a gene consisting of the sequence of nucleotides 15 to 1,148 of SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also includes an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence, and a base encoding a protein having mannanase enzyme activity.
  • mannanase can be produced by an expression system such as E. coli, yeast, or animal cells. That is, the present invention includes a microorganism or animal cell expression system transformed by introducing the above gene.
  • any expression vector known in the art may be used, but Escherichia coli, yeast, or insect cells are used as the host, but Escherichia coli or yeast is preferably used.
  • Escherichia coli, yeast, or insect cells are used as the host, but Escherichia coli or yeast is preferably used.
  • a promoter, SD sequence, terminator, enhancer, etc. can be used.
  • the present invention comprises culturing Escherichia coli, yeast, or animal cells, which are expression systems into which the above gene is introduced, and expressing the above gene, whereby the obtained culture force also separates mannanase. Includes manufacturing method of mannanase.
  • the present invention pioneers the industrial use of mollusc mannanase.
  • the present invention provides a novel urban mannanase in a purified form.
  • the enzyme can be produced at low cost and in large quantities by microorganisms such as Escherichia coli and yeast. Made it possible to do.
  • mollusk mannanase can be produced from manno-oligosaccharides, decomposition of unused red algae and red algae waste, red algae extract, red algae concentrate, red algae powder, red algae mannan oligo It can be used for various purposes such as sugar and monosaccharification, production of red algae seedlings, production of red algae protoplasts.
  • Other objects, features, excellence and aspects of the present invention will be apparent to those skilled in the art from the following description. However, the description of the present specification, including the following description and the description of specific examples, etc., shows preferred embodiments of the present invention and is shown only for explanation. It was understood that!
  • FIG. 1 Results of TOYOPEARL CM-650M chromatography of an mannmannase. Protein elution was detected by absorbance at 280 ° and indicated by white circles. Enzyme activity was measured by the Perk-Johson method and indicated by black circles.
  • FIG. 2 shows the results of hydroxyapatite chromatography of an mann mannanase. Protein elution and enzyme activity detection were performed as in FIG.
  • FIG. 3 Results of TOYOPEARL-HW55 gel filtration of mann mannanase. Protein Quality elution and detection of enzyme activity were performed as in Figure 1. The photograph in the figure shows the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the mann mannanase purified in this example! /
  • This temperature is found to be the optimum temperature for a 'mannanase'.
  • FIG. 6 Measurement results of the temperature stability of an aby'mannanase. As a result of measuring the residual activity after heating at each temperature for 30 minutes at pH 7.0, it was found that 90% of the activity of manabinanase remained even after heating at 40 ° C for 30 minutes. I understand.
  • FIG. 7 shows the results of measurement of substrate specificity of arabic mannanase.
  • Locust bean gum, Glucomannan, and jS— 1,4— Mannan is not degraded or does not degrade katsulose, xylan, dextran, and carboxymethylcellulose
  • FIG. 8 shows the results of thin-layer chromatography analysis of the products produced by the degradation of ⁇ -1,4-mannan and manno-oligosaccharides with an abimannanase.
  • -1,4-Mannan, Mannohexaose (M6) and Mannopentaose (M5) are decomposed by Manabinerase into Mannotetraose (M4), Mannotriose (M3), and Mannobiose (M2) Can be divided.
  • Ml is mannose.
  • FIG. 9 shows the result of degradation of the red alga Susavinori's frond by agar mannanase. It can be seen that the fronds are dispersed in cell masses of 10-20 cell force. This indicates that the coconut mannanase is effective for the production of clonal seedlings of red algae.
  • FIG. 10 is a diagram showing a schematic structure of an mann mannanase cDNA.
  • FIG. 11 is a diagram showing the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of an avian mannanase cDNA.
  • FIG. 12 shows a map (circular) of plasmid vector pET-101 DNA.
  • FIG. 13 shows the base sequence (nucleotide sequence) and deduced amino acid sequence of recombinant (recombinant) HdMan. The position and direction of the PCR primer is indicated by an arrow above the base sequence.
  • FIG. 14 shows the result of analyzing the expression level of recombinant HdMan. Analyzing with different induction times. A shows the result of SDS-PAGE, and B shows the result of Western blotting. M represents a marker protein.
  • FIG. 15 shows the results of examining the localization of expressed recombinant HdMan in cells.
  • A shows the result of SDS-PAGE
  • B shows the result of Western blotting.
  • M represents a single protein
  • lane 1 represents a whole cell fraction
  • lane 2 represents a periplasmic protein fraction
  • lane 3 represents an insoluble cytoplasmic fraction
  • lane 4 represents a soluble cytoplasmic fraction.
  • FIG. 16 shows the results of praying purified recombinant HdMan by SDS-PAGE and Western blotting.
  • A shows the result of SDS-PAGE
  • B shows the result of Western blotting.
  • M indicates marker protein
  • lane 1 is Ni-NTA agarose (invitrogen) force ram force Elution fraction 1
  • lane 2 is the same fraction 2
  • lane 3 is the same fraction 3
  • lane 4 is the same Fraction 4 is shown respectively.
  • FIG. 17 shows the measurement results of the optimum pH of recombinant HdMan.
  • -Mouth- indicates acetate buffer (pH 4.5-6.0)
  • -O- indicates phosphate buffer (pH 6.0-8.5)
  • - ⁇ - indicates glycine buffer (pH 8.5-10.5).
  • FIG. 18 shows the measurement results of the optimum temperature of recombinant HdMan.
  • Recombinant HdMan was added to 1 ml of a reaction mixture containing 10 mM sodium phosphate (pH 7.0) and 5 mg / ml Locust bean gum, reacted for 30 minutes, and the activity was measured.
  • FIG. 19 shows measurement results of temperature stability of recombinant HdMan. After heat treatment in 10 mM sodium phosphate (pH 7.0) at 20-60 ° C for 30 minutes, the remaining activity was measured at 30 ° C.
  • FIG. 20 shows measurement results of substrate specificity of recombinant HdMan.
  • the degradation activity at pH 7.0 was investigated. Activity was performed by incubating a mixture containing the substrate, 4 mM sodium phosphate (pH 7.0) and 1.0 U of recombinant HdMan at 30 ° C.
  • Substrate concentrations were locus t bean gum: 0.5%, glucomannan: 0.5%, j8-1,4-mannan: 0.5%, agarose: 0.2%, xylan: 0.2%, dextran: 0.2%, and carboxymethylcellulose: 0.6%.
  • FIG.21 Enzymatic treatment of the gametome (thalli) of Susabinori (Por_pija yezoensis) with recombinant HdMan As a result, the obtained algal bodies are shown.
  • the enzyme mannanase derived from snails, particularly arabi is widely distributed in the tissues of the organism, for example, visceral and visceral exudates, particularly the visceral tissues and digestive fluids of the digestive system. From these, after obtaining a crude enzyme such as an enzyme-containing extract from them, it can be obtained by a technique including a method of recovering mannanase as it is. Among these mannanases, it is possible to obtain a crude enzyme solution such as digestive juice which is a body fluid exuding from the anterior part of the liver and spleen of abalone, midgut gland, and the like.
  • mannanase As a method for purifying the recovered mannanase-containing solution, mannanase is added to a cold aqueous solution such as a buffer solution, and the obtained mannanase solution is treated with an adsorbent, ion exchange or gel filtration chromatography.
  • mannanase can be obtained as a purified product by obtaining the eluate.
  • the acquisition of crude enzyme solution from abalone should basically be performed under mild conditions.
  • Mannanase can also be extracted by bringing it into contact with each part or visceral exudate, or by adding a buffer or extract directly to the tissue or tissue exudate after excision from the shell. This extraction operation can be repeated several times (2 to 5 times) as necessary to efficiently recover the extract containing the desired mannanase. According to this method, the amount of elution of impurities such as lipids and pigment components can be reduced during extraction, and an extract exhibiting high mannanase activity can be obtained.
  • Extraction of mannanase 'Buffers or extracts used for purification include 5-15 mM sodium phosphate (pH 7.0), 1-5 mM sodium bicarbonate (pH 7.5), 10-20 mM Tris-HC1 (pH 7 .5) Buffers with neutral to weak alkaline buffering capacity can be used. In either case, it is preferable to use one cooled to 4 to 10 ° C.
  • the crude enzyme solution is left as it is, or diluted with an appropriate buffer and then filled with an ion-exchange resin carrier.
  • an ion-exchange resin carrier Perform ion exchange chromatography using a column.
  • a cation exchange type ion exchange resin preferably TOYOPEARL CM-650M ( Cation exchange chromatography using a carrier having a carboxymethyl group, such as Toso Co., Ltd.).
  • the cation exchange chromatography process can be repeated.
  • the eluted mannanase-containing fraction may be collected and appropriately concentrated.
  • the mannanase-containing solution is purified by column chromatography using an adsorbent, for example, Hyde Mouth Xylapatite (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). After adsorbing to the adsorbent, add an eluent or buffer solution such as NaCl, KC1, Na HPO, etc., with an ionic strength of 0.1 to 0.15, adjusted to neutral pH.
  • an eluent or buffer solution such as NaCl, KC1, Na HPO, etc.
  • the nannase is eluted from the adsorbent.
  • mannanase When elution from the adsorbent is performed with a linear concentration gradient, mannanase with higher purity can be obtained. Chromatography can be repeated.
  • the eluted mannanase-containing fraction may be collected and appropriately concentrated.
  • the mannanase-containing solution is then purified by size exclus ion chromatography.
  • a carrier for gel filtration a carrier based on a hydrophilic bull polymer can be suitably used.
  • TOYOPEARL HW-50F manufactured by Tosohichi Co., Ltd.
  • the obtained mannanase-containing fractions are collected and appropriately concentrated.
  • the purified lab mannanase is a sufficiently pure product, Its molecular weight is about 36 kDa to 42 kDa as seen from SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and the enzyme is considered to be a molecule consisting of a single polypeptide.
  • SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 3
  • the partial amino acid sequence in the internal region of the enzyme has the sequence described in SEQ ID NOs: 4 to 6 (SEQ ID NOs: 4 to 6) in the sequence listing.
  • the optimum pH is 6.5 to 8.5, more preferably 6.8 to 8.0, and more specifically, the optimum pH is around 7.5.
  • the optimum temperature is 35 to 53 ° C, more preferably 40 to 50 ° C, and more specifically, the optimum temperature is about 45 ° C.
  • the mannanase is thermostable when 90% of the activity remains even after heating at 40 ° C. for 30 minutes at pH 7.0.
  • the enzyme exhibits the relative activity (%) shown in Table 2 with the addition of the reagents listed in Table 2.
  • the activity of mannanase is almost 100% inhibited by Ag +, and 40-50% inhibited by Co 2+ , Fe 2+ , and Cu 2+ .
  • the substrate specificity of the enzyme acts on locust bean gum, Konjak mannan and ivory nut mannan (linear ⁇ -1,4-mannan) As a result, they are all decomposed well ( Figure 7). However, xylan, agarose, carboxymethylcellulose, and dextran are not degraded at all.
  • the Km value when Locust bean gum is used as a substrate is estimated to be about 0.8 mg / ml.
  • locust bean gum is a water-soluble natural high-molecular-weight polysaccharide produced from the endosperm portion of carob tree (Ceratonia siliaua) eggplant, and its main component is galatatomannan.
  • Zogeashi Mannan is a natural polysaccharide made from the fruit of Zogeashi (PhvteleDhas macrocaroa), the main component of which is linear j8-1,4-mannan.
  • mannanase activity is 11.5 U / mg (mannanase activity is 5 ml / ml of Locust bean gum (galactomannan) in 1 ml of 10 mM Na-phosphate (pH 7.0)).
  • Medium Measured at 30 ° C Reducing sugar released by mannanase action is quantified by the Park-Johnson method. The amount of enzyme that produces reducing sugar corresponding to 1 mole of mannose by 1 minute reaction is 1 U. did).
  • navi mannanase polypeptide (or navi mannanase protein) has an amino acid sequence different from that of known mannanase, and has a catalytically active region (domain) and Z or mannan.
  • the mannanase has at least a catalytic domain (domain) and is characterized by exhibiting an activity of degrading mannose-containing polysaccharide.
  • the present invention possesses all or part of the above characteristic regions (domains) within a range that does not impair their integrity. It may be considered to be within the range of the intended mannanase.
  • a mannanase polypeptide is produced by being encoded by DNA of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1) or SEQ ID NO: 10 (SEQ ID NO: 10) in the sequence listing.
  • Polypeptides such as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 9 (SEQ ID NO: 9) or SEQ ID NO: 11 (SEQ ID NO: 11)
  • polypeptides having equivalent amino acid sequences including truncation mutants, such as at least 5 to 377 amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 (or 360 to 377 or Having 5 to 358 consecutive amino acid residues and having substantially equivalent biological activity such as enzymatic activity or equivalent antigenicity, or those characteristics, and SEQ ID At least 50% higher with any one of the domains present in N 0: 2 Homology, or at least greater than 60%, or at least greater than 70%, or at least greater than 80%, or at least greater than 90%, or at least 50% higher with any one of
  • the amino acid mannanase polypeptide of the present invention includes amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, amino acid sequences of SEQ ID NO: 9 or amino acid sequences of SEQ ID NO: 11, and continuous amino acid residues including all or part of them.
  • amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 amino acid sequences of SEQ ID NO: 9 or amino acid sequences of SEQ ID NO: 11, and continuous amino acid residues including all or part of them.
  • 5 or more, preferably 10 or more, preferably 20 or more, more preferably 40 or more, more preferably more than 5 consecutive amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 9 and 11 60 or more, preferably 80 or more, more preferably 100 or more, more preferably 120 or more, more preferably 140 or more, more preferably 160 or more, most preferably 180 or more, and preferably 200 There are those with more than one.
  • polypeptide mannanase-related polypeptide of the present invention has a SEQ ID NO: 2, 9 and 11 group force having a part or all of the selected amino acid sequence! Lack the corresponding Met. Anything having such a sequence may be included, including truncated polypeptides (truncation mutants).
  • polypeptide of an abyss mannanase As a truncation mutant polypeptide of an abyss mannanase, (a) with respect to the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, the remainder from which 1 to 100 amino acid residues have been deleted from the N-terminal side Consisting of 1 to 50 polypeptides Of the remaining polypeptide from which 1 to 30 amino acid residues have been deleted, 1 to 30 amino acid residues from which the remaining polypeptide has been deleted, and 1 to 25 amino acid residues have been deleted.
  • the remaining polypeptide force 1-20 amino acid residues deleted, the remaining polypeptide force deleted, 1-15 amino acid residues deleted, remaining polypeptide force Consisting of the remaining polypeptide from which 1 to 10 amino acid residues have been deleted, or from the remaining polypeptide from which 1 to 5 amino acid residues have been deleted, and (B) Concerning the polypeptide of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, consisting of the remaining polypeptide from which 1 to 100 amino acid residues have been deleted from the C-terminal side, 1 to 50 Amino acid residues The remaining polypeptide that has been deleted, the remaining polypeptide that has 1 to 30 amino acid residues deleted, the remaining polypeptide that has 1 to 25 amino acid residues deleted Peptide strength, consisting of the remaining polypeptide from which 1 to 20 amino acid residues have been deleted, consisting of the remaining polypeptide from which 1 to 15 amino acid residues have been deleted, 1 to 10 May be selected from those consisting of the remaining polypeptide with one amino acid residue deleted or those consisting of the remaining poly
  • gene recombination technology (or “genetic engineering method”) is used to isolate and sequence a predetermined nucleic acid, produce a recombinant, Obtainable.
  • gene recombination techniques include those known in the art, such as: Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , New York (2nd E dition, 1989; ISBN 0-87969-309-6 & 3rd Edition, 2001; ISBN 0-87969-577-3); Cur rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc.
  • homology means each amino acid residue constituting the chain between two chains in a polypeptide sequence (or amino acid sequence) or a polynucleotide sequence (or base sequence). Means the number (number) of things that can be determined to be identical in each other's or each base's fitness relationship, and means the degree of sequence correlation between two polypeptide sequences or two polynucleotide sequences. To do. Homology can be easily calculated. Many methods for measuring homology between two polynucleotide or polypeptide sequences are known, and the term “homology” (also referred to as “identity”) is known to those skilled in the art. Are well known (eg Lesk, AM (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford
  • a preferred method for measuring homogeneity is one designed to obtain the largest fit between the two sequences tested. Such methods include those assembled as computer programs.
  • a preferred computer program method for measuring the homology between two sequences is the GCG program package (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12 (1): 387 (1984), BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul SF et al., J. Mol. Biol. Vol. 215, pp. 40 3-410 (1990); for example, protein-protein BLAST (BLASTP), nucleotide-nucleotide BL AST (BLASTN), bl2seq program (v. 2.0.12); Tatusova TA and Madden TL., FEMS Microbiol Lett., 174 (2): 247-50 (1999 May 15)), FASTA (Atschul, SF et al "J.
  • polypeptide may refer to any polypeptide as described below.
  • the basic structure of a polypeptide is well known and is described in numerous references and other publications in the art.
  • polypeptide refers to any peptide or any protein comprising two or more amino acids that are linked together by peptide bonds or modified peptide bonds. Means.
  • polypeptide refers in the art to, for example, peptides, oligopeptides or peptides. Short chains, also referred to as oligomeric oligomers, and proteins, commonly referred to as many forms, usually mean both long and chained ones.
  • Polypeptides may often contain amino acids other than the amino acids usually referred to as natural amino acids (naturally occurring amino acids: or amino acids encoded by genes). Polypeptides are also not only by natural processes, including terminal amino acid residues, many of which are translated and then processed and other modified (or modified) by those skilled in the art. It will be appreciated that the polypeptide can be altered (modified) by well-known chemical modification techniques. Many forms of alterations (modifications) made to the polypeptide are known, and they are well-known in basic reference books in the field, more detailed papers and numerous research literatures. Are described and are well known to those skilled in the art.
  • Some particularly conventional alterations' modifications include, for example, alkylation, acylation, esterification, amidation, glycosylation, lipid binding, sulfation, phosphorylation, ⁇ -carboxylation of dartamic acid residues, water Oxidation and ADP-ribosylation, etc., e.g.,., ⁇ . ⁇ . And reighton, Proteins: structure and Molecular Properties, Second Edition, WH Freeman and Company, New York, (1992); BCJohnson (Ed.), Posttranslatio nal Covalent Modification of Proteins, Academic Press, New York, (1983); Christopher T. Walsh, Posttranslational Modifications of Proteins, Robert & Company Pub.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR method involves repeating a cycle of primer extension synthesis using two oligonucleotide primers that can preferentially hybridize with a nucleic acid.
  • the primer used in the PCR method can use a primer complementary to the nucleotide sequence to be amplified inside the cage, for example, the nucleotide sequence to be amplified and Both ends
  • a force that is complementary that is, a DNA that is adjacent to the nucleotide sequence to be amplified can be preferably used.
  • the primer on the 5 'end side can be selected so that it can at least contain a start codon or can be amplified including the start codon. Further, the 3 ′ end primer is preferably selected so that it contains at least a termination codon (stop codon) or can be amplified including the termination codon.
  • Primers usually include oligonucleotides having 5 or more bases, preferably 10 or more basic forces, more preferably 15 to 45 bases, more preferably 18 to 35 basic oligonucleotides. It is done. This PCR also includes techniques such as reverse PCR (polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT—PCR), RACE, rapid amplification of cDNA ends), and reverse PCR (reverse PCR). .
  • the PCR reaction can be performed by a method known in the art, or a method or modification method substantially similar thereto.
  • a method known in the art for example, R. Saiki, et al., Science, 230: 1350, 1985; R. Sai ki, et al, Science, 239: 487 (1988); HA Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press (1989); DM Glover et al. ed " ⁇ DNA Cloning", 2nd ed “Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); MA Innis et al. Ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications, Academic Press, New York (1990)); MJ McPherson, P.
  • PCR Quirke and GR Taylor (Ed.), "PCR: a practical appro ach", IRL Press, Oxford (1991); MA Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988); Hiroki Sasaki Edited and experimented with biomedical experiment series that is a separate volume of attention (the latest PCR manual), Yodosha, 2003 (ISBN 4-89706-412-0), etc.
  • Modified method Can be done according to
  • the PCR method can be performed using a commercially available kit suitable for the PCR method, and can be performed according to a protocol that has been clarified by the kit manufacturer or the kit vendor.
  • LA PCR Long and Accurate PCR
  • TAKARA BIO Inc. TAKARA BIO Inc.
  • Hot Start PCR method TAKARA BIO Inc.
  • a PCR reaction is, for example, a cage (for example, DNA synthesized using mRNA as a cage; 1st strand DNA) and primers designed based on a predetermined gene.
  • 10X reaction buffer attached to DNA polymerase
  • dNTPs mixture of doxy nucleoside triphosphates dATP, dGTP, dCTP, dTTP
  • Taq DNA Polymerase TaKaRa Ex Taq TM, TaKaRa LA Taq TM, Pyrobest TM DNA Polymerase (TAKARA BIO Inc.) etc.
  • TAKARA BIO Inc. Pyrobest TM DNA Polymerase
  • PCR conditions include, for example, denaturation 90 to 95 ° C 5 to 100 seconds, annealing 40 to 60 ° C 5 to 150 seconds, extension 65 to 75 ° C 30 to 300 seconds, preferably denaturation 94 ° C 15 seconds, annealing 58 ° C 15 seconds, extension 72 ° C 45 seconds cycle
  • the reaction temperature and time of annealing can be appropriately selected by experiment, and the time of denaturation reaction and extension reaction An appropriate value can be selected according to the expected PCR product chain length. It is usually preferable to change the annealing reaction temperature according to the Tm value of the hybrid of the primer and the vertical DNA.
  • the extension reaction time is usually about 1 minute per 1000 bp of chain length, but a shorter time can be selected in some cases.
  • oligonucleotide is a relatively short single-stranded or double-stranded polynucleotide, preferably a polyoxynucleotide.
  • Polynucleotides (or nucleic acids) including oligonucleotides are described in David MJ Lilley and James E. Dahlberg ed., "Methods in Enzymology", Vol. 211 (DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA), Academic Press , New York (1992, ISBN: 0-12-182112-9) (MH Caruthers, G. Beaton, JV Wu and W.
  • the oligonucleotide may contain one or more modified bases, for example, it is unusual in nature such as inosine! /, A base or a tritylated base, etc. However, in some cases, it may contain a marked base.
  • the oligonucleotide of the present invention may include oligonucleotides such as oligo DNA and oligo RNA, and derivatives (derivative oligonucleotides) of the oligonucleotide.
  • Hybridization technology uses and utilizes a complementary single-stranded nucleic acid to identify, isolate, isolate the length of a nucleic acid, and determine the length of a nucleic acid. It can be used to analyze quantity, analyze specific genes, obtain information on gene regulation, and so on.
  • the hybridization can be carried out by the method described in the literature disclosing the “gene recombination technique” or a method or modification method substantially the same as that described above, and [row is J. Sambrook et al. , "Molecular loning: A Laooratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2nd Edition, 1989 & 3rd Edition, 2001), etc.
  • nanotechnology and hybridization techniques include Southern blotting, Northern blotting, dot Z slot blotting, colony Z plaque blotting, in situ hybridization, and microarrays including DNA arrays.
  • hybridization is performed by using a sample containing a nucleic acid such as DNA or RNA as a nylon filter, a nitrocell. After transferring to a carrier including a membrane such as a glass filter, if necessary, it is subjected to transformation treatment, immobilization treatment, washing treatment, etc., and then transferred to that carrier (for example, membrane). The reaction is carried out by reacting with the labeled probe DNA fragment modified accordingly in a hybridization buffer.
  • the hybridization treatment is usually about 35 to about 80 ° C, more preferably about 50 to about 65 ° C, about 15 minutes to about 36 hours, more preferably about 1 to about 24. It is possible to carry out by selecting the optimal conditions as appropriate. For example, the hybridization process is performed at about 55 ° C. for about 18 hours. As a buffer for hybridization, it is commonly used in this field. For example, Rapid-hyb Hybridization Buffer (Amersham Biosciences) etc. can be used.
  • Examples of the modification treatment of the transferred carrier include a method using an alkali-denatured solution, and it is preferable to treat with a neutralizing solution or a buffer solution after the treatment.
  • examples of the fixing method for fixing the carrier include a UV method, an Al force method, a baking method, and the like.
  • a UV method a UV crosslinker can be used, and the blotted surface is irradiated with UV.
  • the alkaline method place the blotted membrane surface on a filter paper soaked in 0.4 N NaOH solution and treat for 1 to 10 minutes. After treatment, use a neutral buffer (2 X SSC, etc.) To neutralize.
  • Baking is usually performed at about 40 to about 100 ° C, more preferably about 70 to about 90 ° C for about 15 minutes to about 24 hours, more preferably about 1 to about 4 hours.
  • the force performed by the step can be performed by appropriately selecting preferable conditions.
  • the fixing can be performed by lightly sandwiching a carrier such as a filter or membrane with filter paper and incubating in an oven at about 80 ° C for 30 minutes to 2 hours.
  • a washing solution commonly used in the art, for example, 50 mM Tris-HCl buffer containing 1 M NaCl, ImM EDTA and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), It can be performed by washing at pH 8.0 or the like.
  • the carrier including a membrane such as a nylon filter can be selected from those commonly used in the art, and examples thereof include membranes such as Hybond-N + (Amersham Biosciences).
  • alkali-denaturing solution neutralizing solution, and buffer solution
  • medium strengths commonly used in the field can be selected and used.
  • alkali-denaturing solution include 0.5M NaOH and 1.5M NaCl.
  • neutralizing solution include 0.5M aCl-containing 0.5M Tris-HCl buffer solution, pH 8.0.
  • buffer solution include 2 X SSPE (0.36M NaCl, 20mM NaH PO and 2mM EDTA)
  • the transferred carrier for example, a membrane
  • a pre-hybridization treatment can be performed, for example, by using a prehybridization solution [50% formamide, 5 X Denhardt's solution (0.2% blood (Stained albumin, 0.2% polyvinyl pyrrolidone), 5 X SSPE, 0.1% SDS ⁇ 100 ⁇ g / ml heat-denatured salmon sperm DNA), etc., and about 35 to about 50 ° C, preferably about 42 ° C, about The force that can be obtained by reacting for 4 to about 24 hours, preferably about 6 to about 8 hours.
  • a prehybridization solution [50% formamide, 5 X Denhardt's solution (0.2% blood (Stained albumin, 0.2% polyvinyl pyrrolidone), 5 X SSPE, 0.1% SDS ⁇ 100 ⁇ g / ml heat-denatured salmon sperm DNA), etc.
  • Denaturation of the labeled probe DNA fragment used for hybridization is carried out, for example, by heating at about 70 to about 100 ° C, preferably about 100 ° C, for about 1 to about 60 minutes, preferably about 5 minutes. it can.
  • the carrier such as a filter
  • the carrier is thoroughly washed to detect nucleic acids other than DNA fragments that have undergone a specific hybridization reaction.
  • the membrane may be thoroughly washed to remove the labeled probe other than the labeled probe DNA fragment that has undergone a specific hybridization reaction. Washing of the carrier such as a filter can be performed by selecting a medium force commonly used in the field, for example, a 0.5 X SSC (0.15MN aCl, 15 mM citrate) solution containing 0.1% SDS. It can be carried out by washing with.
  • stringency can be carried out by a method known per se or a method analogous thereto.
  • stringent conditions in this specification are about 15 to about 50 mM, preferably about sodium concentration.
  • the temperature is about 19 to about 40 mM, more preferably about 19 to about 20 mM, and the temperature is about 35 to about 85 ° C, preferably about 50 to about 70 ° C, more preferably about 60 to about 65 ° C.
  • the nucleic acid that has been or ibridized can typically be detected by autoradiography, but can be detected by selecting an appropriate method from methods used in the field.
  • the probe, DNA, oligo such as DNA can be suitably used RNA, [ ⁇ - 32 ⁇ ] of any radioactive isotope (RI) labeled compounds (e.g., redivue [a - 32 P] dCTP (Amersham Biosci ences Co.) ), Thermophilic alkaline phosphatase (AP), horseradish oxidase ( HRP), fluorescein (FI) -labeled nucleotides (for example, FI-labeled dUTP, etc.), piotin-avidin-based nucleotides, digoxin-labeled nucleotides, etc.
  • RI radioactive isotope
  • Labeling methods include direct labeling, indirect labeling, 3'-end labeling (using terminal 'deoxynucleotidyl' transferase (TdT), etc.), 5'-end labeling (T4 polynucleotide 'kinase, etc.) ), Random prime method, double translation method, RNA transcription method (using RNA polymerase, etc.), etc., those known in the art or modifications thereof can be applied without limitation.
  • the nucleic acid band corresponding to the detected signal can be obtained by using an appropriate buffer, for example, SM solution (50 mM Tris-HC1 buffer containing 10 mM MgSO and 10 mM MgSO, pH 7.5).
  • SM solution 50 mM Tris-HC1 buffer containing 10 mM MgSO and 10 mM MgSO, pH 7.5.
  • the desired nucleic acid can then be isolated-purified and then subjected to further amplification treatment, such as by suspending it and then moderately diluting this suspension.
  • nucleic acids such as PCR products obtained are usually subjected to 1-2% agarose gel electrophoresis, and the gel force is also excised as a specific band.
  • SUPRE C TM -EZ (Takara Bio) Extract with a commercially available extraction kit such as Strain.
  • the extracted DNA can be cleaved with an appropriate restriction enzyme, purified as necessary, and further 5 ′ as necessary.
  • the end is phosphorylated with T4 polynucleotide kinase, etc., and then ligated to an appropriate plasmid vector such as a pUC vector such as pUC18, and transformed into an appropriate competent cell.
  • p-Direct (Clontech), pCR-Script TM SK (+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp TM (Gibco—BRL) ) Etc.
  • the host cell transformation can be applied without limitation as long as it is a technique capable of host transformation, but can be carried out by a method known in the art or a method substantially similar thereto.
  • a phage vector can be used, or the calcium method, rubidium Z calcium method, calcium Z manganese method, TFB high-efficiency method, FSB freeze-combinant cell method, rapid colony method, electoral position method, etc. D. Hanahan, J. Mol.
  • RT-PCR Ribonucleic acid
  • 3'-RACE 3'-RACE
  • 5'-RACE 5'-RACE
  • RACE can be found in, for example, MA Innis et al. Ed., "PCR Protocols” (MA Frohman, "a guide to m ethods and applications, pp. 28-38, Academic Press, New York (1990)". Can be done according to different methods.
  • Phage particles, recombinant plasmids, phagemids, recombinant vectors, etc. that possess a given nucleic acid can be purified and separated by methods commonly used in the art, for example, glycerol It can be purified by gradient ultracentrifugation (T. Maniatis et al. Ed., “Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989), electrophoresis, etc.
  • the force of phage particles can also be used to purify and separate DNA by a method commonly used in the art.
  • the obtained phage and the like can be treated with TM solution (50 mM Tris-HC1 buffer containing 10 mM MgSO, pH 7. 8) Suspend in DNa, etc.
  • An appropriate primer (or probe) is designed based on the information obtained from the amino acid sequence analysis of the polypeptide of the target enzyme of the present invention, and the primer (or probe) and the target organism [for example, Using a sample derived from a mollusk (eg, abalone) (for example, total RNA or poly (A) + RNA fraction (mRNA fraction), cDNA library, or phage library)
  • a sample derived from a mollusk eg, abalone
  • the polynucleotide encoding the polypeptide can be obtained by carrying out the hybridization method, and the expressed polypeptide can be expressed using an appropriate expression system.
  • the desired polypeptide can be obtained by confirming that it exhibits mannanase activity, for example, by the method described in Example 1.
  • a primer or probe and use the primer or probe for example, (l) a method using PCR, (2) a conventional method A method using a gene recombination technique (that is, a method of selecting a transformant containing a desired cDNA from a transformant transformed with a cDNA library), or (3) a chemical synthesis method, etc. Nucleotides) can be produced, but the production method is not particularly limited thereto.
  • a DNA having a predetermined target base sequence is obtained and the base sequence is determined, it is based on the 5 ′ end and 3 ′ end base sequences of the base sequence.
  • Primer including degenerate primer
  • colony hybridization or plaque hybrids are synthesized against cDNA or cDNA libraries that also synthesize the mRNA force contained in mollusc tissues or cells using the full length or part of the DNA consisting of the target base sequence as a probe.
  • the target DNA can be obtained by performing the hydration.
  • the target DNA can also be obtained.
  • the DNA of the present invention can be prepared from mRNA.
  • a commercially available mRNA for example, Stratagene, Invitrogen, Clontech, etc.
  • a tissue for example, liver, spleen, etc.
  • cell cartridge may be prepared (purified).
  • Methods for preparing total RNA from tissues or cells include the guanidine HC1 method, the guanidine thiocyanate (guanidine isothiocyanate) method, the guanidine thiocyanate cesium monochloride centrifugation method, the thiocyanate Guazin hot phenol method [Methods in Enzymology, 152, 215-261 (1987)], Guazin thiocyanate triacetoacetate method [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], Acid thiocyanate gua -Jin 'Phenol' Chloroform (acid guanidinium thiocyanate-phenol / cnloroform; AuPC 3 ⁇ 4fe L Analytical Biochemistry, 162, 15 RI-159 (1987), Masaaki Muramatsu and Masaru Yamamoto, separate volume on experimental medicine (4th revised edition) [New gene Engineering Handbook], pp.20-23 and pp.32-34, Yod
  • RNA as total RNA power pol y (A) + RNA, Oligo (dT) immobilized cellulose column method (J. Samorook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Shiol d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989; ISBN 0-87 969-309-6)). If desired, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • kits such as TRIzol Reagent (Invitrogen Corp.), Concert RNA Purification Products, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen), QuickPrep Total RNA Extraction Kit and RNA Extraction Kit (Amersham Biosciences), EASYPrep RNA ⁇ Oligotex TM-dT30 TM Super>, Oligotex TM-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit and Oligotex TM -MAG mRNA Purification Kit (TAKARA)
  • ⁇ mRNA can be prepared by using ISOGEN and Poly (A) + Isolation Kit from Total RNA (-Tubon Gene Co.). Further, even if mRNA is not extracted, mRNA that is commercially available and extracted and purified can also be used.
  • a cDNA or cDNA library is prepared from the prepared tissue mRNA or cell mRNA.
  • the prepared poly (A) + RNA fraction is subjected to the reverse transcriptase reaction in the presence of, for example, random primer, oligo dT primer, and Z or a custom-synthesized primer. Is synthesized. This synthesis can be performed by a conventional method, or can be synthesized using a commercially available kit such as Marathon TM cDNA Amplification Kit (Clontech) or GeneRacer TM Kit (Invitrogen).
  • a cDNA can be prepared by using AMV Rrevers e Transcriptase with a poly (A) + RNA in a reaction mixture containing dNTPs and other reagents in the presence of a suitably designed oligo dT primer. Reverse transcription allows DNA first strand synthesis. Second strand synthesis is carried out using the resulting DNA: RNA hybrid as a cage. The second strand synthesis is carried out in a reaction mixture containing dNTPs and other reagents in a second strand synthesizing enzyme cocktail (for example, Escherichia coli) in the DNA: RNA neutralized solution obtained by the first strand synthesis. DNA polymerase I, E. coli DNA ligase, and E.
  • coli RNase H coli RNase H
  • T4 DNA polymerase is used to create a blunt end in the ds cDNA.
  • the blunt-ended ds cDNA is ligated with an adapter designed as appropriate for the following RACE by the action of T4 DNA ligase.
  • the obtained adapter-ligated cDNA is converted into a cage shape and the amino acid sequence of the target enzyme polypeptide (typically a partial RACE PCR is performed using primers designed based on the amino acid sequence information and primers that can be hybridized to the adapter to produce 5 ′ cDNA fragments and 3 ′ cDNA fragments.
  • a degenerate primer can be preferably used as the primer.
  • the 5 'cDNA fragment is characterized by 5'-RACE product obtained by 5'-RACE PCR, and the 3' cDNA fragment is characterized by 3'-RACE product obtained by 3'-RACE PCR.
  • Each can be confirmed, and based on the result of the sequence analysis, full-length cDNA can be prepared by cloning.
  • the desired DNA fragment can be obtained by cleaving the DNA with a restriction enzyme or the like and connecting them.
  • the target DNA fragment can also be obtained from genomic DNA.
  • any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can replicate autonomously in Escherichia coli K12.
  • Uni-ZAP TM XR, ZAP Express TM and HybriZAP TM 2.1 vecto rs [Stratagene], pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], ⁇ DASH TM IU ⁇ FIX TM IU ⁇ EMBL3, ⁇ ⁇ TM ⁇ (Stratagene), gtl0, gtl l, XT riplEx2 (BD Bioscience 'Clontech), pcD2 [Mol. Cell. Biol, 3, 280 (1983)] and pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] and the like.
  • any microorganism belonging to Escherichia coli can be used. Usually, it is derived from strain K12 or a strain derived therefrom. Specifically, coH XL1- Blue MRF '[Stratagene, Strategies, 5, 81 (1992)], coH C600 [Genetics, 39, 440 (1954) 1, E. coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983 )], E. coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], E. coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1 983)], K coH ⁇ 802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], K coH JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] and the like.
  • E. coli Escherichia coli
  • the cDNA library for analysis can be used as it is, but the oligo cap method developed by Kanno et al. [Gene, 138] has been developed in order to reduce the percentage of incomplete-length cDNA and to obtain full-length cDNA as efficiently as possible. , 171, (1994), Gene, 200, 149 (1997), protein nucleic acid enzyme, 41, 603 (1996), experimental medicine, 11, 2491 (1993), cDNA cloning, Yodosha (1996), gene library Using a cDNA library prepared using the method of preparation of Yodosha (1994)].
  • Obtaining the polynucleotide (nucleic acid) encoding the target enzyme of the present invention is based on the partial amino acid sequence (or the base sequence of the target polynucleotide (nucleic acid)) elucidated by analyzing the amino acid sequence of the target protein.
  • This can be achieved by designing primers and performing PCR using the single-stranded cDNA or cDNA library obtained as described above in a saddle shape.
  • the primer may be a degenerate primer.
  • Representative primers include, for example, a sense primer corresponding to the 5′-end base sequence and an antisense primer (antisense oligonucleotide) corresponding to the 3′-end base sequence in a part of the base sequence of the target mRNA.
  • the base corresponding to uracil in mRNA is thymidine for oligonucleotide primers.
  • Examples of the sense primer and the antisense primer include oligonucleotides whose melting temperature (Tm) and number of bases do not change extremely, and those having 5 to 60 bases, preferably 10 to 50 bases.
  • oligonucleotides include those in which the phosphodiester bond in the oligonucleotide is replaced with a phosphoroate bond, the phosphodiester bond in the oligonucleotide converted to a ⁇ 3'- ⁇ 5 'phosphoramidate bond, Liposes and phosphodiester bonds in oligonucleotides converted to peptide nucleic acid bonds, substituted with uracilca C-5 propyluracil in oligonucleotide, uracilca C-5 thiazoleuracil in oligonucleotide Substituted, cytosine force in oligonucleotide replaced with C-5 propylcytosine, cytosine in oligonucleotide replaced with phenoxazine-modified cytosine, in oligonucleotide Ribose is 2'-methoxyethoxyribo And the like substituted with a cell Engineering, 16,
  • the fragment is subcloned into an appropriate plasmid.
  • Subcloning can be performed by treating the amplified fragment as it is or after treating it with a restriction enzyme or DNA polymerase and then incorporating it into a vector by a conventional method.
  • subcloning can be performed using Escherichia coli as a host and a plasmid vector.
  • Vectors ⁇ include pBluescnpt SK, —) (Stratagene), pBluescnpt II SK (+) (tratagene), pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)], pPCR— Script TM Amp SK (+) (Stratagene), pPCR-Script Cam SK (+) (Stratagene), pT7Blue (Novagen), pE TBlue-1 Blunt (Novagen), pSTBlue-1 Blunt (Novagen), pCRII (Invitrogen), pCR-TRAP (GeneHunter) etc. can be mentioned.
  • PCR amplified fragments can be obtained from commercially available kits such as PCR—Script TM Amp Cloning Kit (Stratagene), pCMV—Script TM PCR Cloning Kit (Stratagene), Seamless Cloning Kit (Stratagene), TaKaRa LA PCR TM in vitro Cloning. Kit (TAKARA BIO Inc.) ⁇ TaKaRa LA PCR TM Kit Ver.2.1 (TAKARA BIO In) etc. may be used for cloning.
  • Target DNA can be obtained in large quantities by subcloning, etc., and DNA obtained by subcloning is purified by methods such as centrifugation, electrophoresis, phenol extraction, and ethanol precipitation in the same manner as above. Can be separated.
  • Nucleic acid samples including gene libraries and cDNA libraries can be repeatedly screened for the target nucleic acid by using a treatment such as hybridization or hybridization.
  • DNA can be cloned as necessary.
  • plasmid, ⁇ phage, cosmid, P1 phage, F factor, YAC, etc. can be used.
  • the determination of the base sequence can be carried out using a dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], for example, M13 dideoxy method, Maxam-Gilbert method, etc.
  • a dideoxy method Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)
  • Use commercially available sequencing kits such as Taq die primer cycle sequencing kits, automated base sequencing equipment such as fluorescent DNA sequencers such as ABI PRISM TM 377 DNA Sequencer (PE / Applied Biosystems), etc. Can be used.
  • the amino acid sequence of the polypeptide encoded by this DNA can be obtained.
  • the obtained nucleotide sequence is homologous to the nucleotide sequence in the nucleotide sequence database such as GenB ank TM and EMBL, such as BLAST and FASTA.
  • GenB ank TM and EMBL such as BLAST and FASTA.
  • the nucleic acid encoding the mannanase or polypeptide of the present invention is typically a peptide represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 10 in the sequence listing and a part thereof.
  • a base sequence encoding a continuous amino acid sequence of, for example, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, or SEQ ID NO: 9 in the sequence listing
  • Any peptide may be used as long as it contains a nucleotide sequence having the same effect as that of a peptide having a biological activity.
  • the encoding nucleic acid encodes the above-mentioned mannmannase polypeptide (or ubiquitin mannanase protein) (including truncation mutant), for example, SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence, amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or SEQ ID ⁇ : 11 encoding amino acid sequences including all or part of the amino acid sequence (including those encoding truncation mutants) Are).
  • the encoding nucleic acid (polynucleotide) may include those in which the codon used is replaced with a codon suitable for the host cell, depending on the host cell in which it is expressed.
  • nucleic acids are single-stranded DNA, double-stranded DNA, RN A, DNA: RNA hybrid, synthetic DNA, etc., and may be genomic DNA, genomic DNA library, mollusc tissue tissue-derived cDNA, synthetic cDNA, or synthetic RNA.
  • the base sequence of the nucleic acid can be modified (for example, added, removed, substituted, etc.), and such modified ones can also be included.
  • the nucleic acid preferably encodes a peptide described in the present invention or a part thereof, and DNA is preferable.
  • the nucleic acid is a polypeptide (protein) of interest, such as a peptide mannanase enzyme or a peptide having substantially the same biological activity as that of an antigenicity equivalent to its partial sequence (substantially the same as that).
  • a polypeptide (protein) of interest such as a peptide mannanase enzyme or a peptide having substantially the same biological activity as that of an antigenicity equivalent to its partial sequence (substantially the same as that).
  • high homology refers to a force depending on the length of the target sequence, for example, 50% or more, further 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, or 90%. Above, and in certain cases 95% or more, particularly preferably 97% or more.
  • the “same-effect base sequence” can be, for example, one that hybridizes to a sequence having an interesting sequence under stringent conditions, for example, 5 or more consecutive bases in the base sequence. Sequence, preferably 10 or more nucleotide sequences, more preferably 15 or more nucleotide sequences, more preferably 20 or more (in some cases 30 or more or 40 or more), and further 45 or more (if any) And those that hybridize with 50 or more base sequences) and encode an amino acid sequence substantially equivalent to the polypeptide. Nucleic acids can also be obtained by chemical synthesis. In that case, it is also possible to synthesize the fragments and combine them enzymatically.
  • one to a plurality of are appropriately added to the amino acid sequence of a predetermined polypeptide.
  • a corresponding polypeptide into which a mutation such as substitution, deletion, insertion, transfer or attachment of more than 5 amino acids is introduced can be produced.
  • Such mutation / conversion modification methods include, for example, the Japan Biochemical Society, “Sequence Biochemistry Experiment Course 1, Genetic Research Method II”, pl05 (Susumu Hirose), Tokyo Kagaku Doujin (1986); New Chemistry Experiment Course 2, Nucleic Acid III (Recombinant DNA Technology) ”, p233 (Susumu Hirose), Tokyo Chemical Doujin (1992); R. Wu, L. Grossman, ed., “Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, ed., “Methods in Enzymology” , Vol. 100, p. 457 & p.
  • Examples include site-directed mutagenesis using synthetic oligonucleotides (site-directed mutagenesis) (Zoller et al, Nucl Acids Res "10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331, 1986), cassette mutagenesis: Cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985 ), Restriction site selection mutation introduction method (restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc.
  • Polypeptides of the present invention are described, for example, in J. Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Labora tory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
  • a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the polypeptide is prepared based on the full-length cDNA, if necessary. Recombination by inserting the DNA fragment or full-length cDNA downstream of the promoter of an appropriate expression vector Create a vector.
  • a transformant producing the polypeptide of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • the expression vector can be autonomously replicated in the above host cell! /, Or can be integrated into the chromosome and contains a promoter at a position where the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be transcribed. What is used is used.
  • the DNA fragment is used as it is or as a DNA fragment to which an appropriate control sequence is added, or incorporated into an appropriate vector and introduced into a host cell or host animal! Transformed cells, transgenic animals, or transgenic plants that express can be produced.
  • the animal may be a mammal or an insect, for example, a mouse, a rat, a rabbit, a guinea pig, a rabbit, or a silkworm.
  • the DNA fragment can be introduced into a fertilized egg of an animal such as a mouse to create a transgenic animal.
  • Appropriate host cells prokaryotic cells, eukaryotic cells, insect cells, mollusc cells, etc.
  • Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, filamentous form which have been transformed with the foreign gene to confirm the predetermined gene product It can be performed using bacteria (for example, Aspergillus spp.), 293T cells, CHO cells, COS cells, Sf21 and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing a gene into a host cell, and a method known in the art or substantially the same as that.
  • the calcium phosphate method e.g. F.
  • a vector including a plasmid
  • a host cell eg, Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.
  • Prokaryotic host yeast, filamentous fungi (eg Aspergillus sp.), 293T cells, CHO cells, eukaryotic hosts such as COS cells, insect cell hosts such as Sf21, plants, etc.
  • Any vector including plasmid may be used, but it may be prepared (constructed) to suit the purpose. Of course, it is possible to select from the ones attached to commercially available kits and reagents.
  • sequences can include, for example, codons that are suitably modified to be expressed in the selected host cell, can include restriction enzyme sites, and are of interest.
  • Control sequences and facilitating sequences to facilitate gene expression such as linkers and adapters useful for binding target genes, antibiotic resistance, and metabolism control.
  • Sequences that contain sequences useful for detection including tags, tags that code for hybrid proteins and fusion proteins, etc.
  • a prokaryote such as a bacterium
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention can autonomously replicate in the prokaryote, and at the same time, a promoter and a ribosome binding sequence.
  • a vector composed of a sequence, a gene encoding the polypeptide of the present invention, and a transcription termination sequence is preferred.
  • the vector may contain a gene that controls the promoter.
  • the expression vector has a ribosome binding sequence (for example, a Shine-Dalgarno sequence (SD sequence) and an initiation codon adjusted to an appropriate distance (eg, 6 to 18 bases).
  • SD sequence Shine-Dalgarno sequence
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in the host cell, and examples of suitable promoters include tryptophan promoter (trp), latato promoter (lac), and lipoprotein.
  • trp tryptophan promoter
  • lac latato promoter
  • lipoprotein e.g, lipoprotein promoter (1 ⁇ ), ⁇ PP promoter, P promoter, T7 promoter, etc.
  • Examples include LTR promoter, CMV promoter, SRa promoter and the like, GAL1, GAL10 promoter motor, sp01 promoter, sp02 promoter, pen p promoter and the like. Furthermore, control systems such as CYC1, HIS3, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TP1, and AOX1 can also be used. In addition, a promoter (PX 2) in which two tryptophan promoters (trp; P) are connected in series, tryptophan 'latatose
  • promoter t ac
  • lacT7 promoter letl promoter [Gene, 44, 29 (1986)]
  • letl promoter [Gene, 44, 29 (1986)]
  • An enhancer can be inserted into the vector to promote transcription of the DNA encoding the desired polypeptide, and such enhancer usually acts as a promoter and has the effect of promoting transcription.
  • Examples include elements having a cis action of 10 to 100 bp.
  • Many han hunsers are also known for their mammalian genetic powers such as globin, elastase, albumin, ⁇ -fetoprotein, and insulin.
  • Enono which is capable of obtaining eukaryotic infectious virus, can be suitably used.
  • SV40 enhancer 100-270 bp
  • early promoter of cytomegaloinores examples include enhancers in the rate domain of polio-matrix replication origin and adenovirus enhancers.
  • a signal sequence suitable for the host can be added, and those well known to those skilled in the art can be used. By substituting the base sequence of the portion encoding the polypeptide of the present invention so as to be an optimal codon for host expression, the production rate of the target polypeptide can be improved.
  • the transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention! /, But it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Examples of expression vectors include pBR322, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP 64, pSP65, pTZ-18R / -18U, pTZ—19R / —19U, pGEM—3, pGEM-4, pGEM—3Z , pGEM -4Z, pGEM— 5Z —), pGEMEX—Promega), pBC KS (Stratagene), pBC SK (Stra tagene), pBluescript SK (Stratagene), pBluescript II SK (Stratagene), pBl uescript II KS (Stratagene), pBS (Stratagene), pAS, pKK223-3 (Amersham Pharmacia Biotech), pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET— B (Invitrogen), pSE280 (Invitrogen), pBTrp2 (
  • virus vector a retroviral vector, P cD, pcD-SR a , CDM8, pCEV4, pME18S, pBC12BI, pSG5 (Stratagene , Inc.), Yip type vector, YEp type vector, YRp type base Kuta one, YCp type vector Examples include pGPD-2, pUBHO, pHSG399 pRS403 pRS404 pRS405 pRS406, and the like.
  • examples of the host cell include those derived from E. coli K12 strain, such as NM533, XLl-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5a, DH10B, HB101, Examples of the strain derived from MC1061, JM109, STBL2, and B834 include BL21 (DE3) pLy sS.
  • the host microorganisms described above can also be used.
  • yeast for example, the genus Saccharomvces, the genus Schizosaccharomumes, the genus Ekhk, and the like.
  • Kluweromvces strains, Candida. Tnchoderma r eesia, and other yeast strains Can be mentioned.
  • Specific examples include Saccharomyces cerevisiae AH22R-.
  • yeast When yeast is used as a host cell, examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, pHS15 and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in yeast strains.
  • glycolytic gene promoters such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter. , Gall promoter, gallO promoter, heat shock protein promoter, MF1 promoter, CUP1 promoter, and the like.
  • any method for introducing the recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the Elect Mouth Position Method [Methods in Enzymol ogy, 194: 182 (1990)]
  • the spheroplast method Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the host cell is a filamentous fungus, the genera Acremonium, Asper gillus, Fusarium, Penicillium, Mucor, Neurospora, Trichoderma More specifically, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, etc. can be raised.
  • expression vectors include those having one or more of the filamentous fungal enzyme single-base sequence, or the expression of alkaline protease (Alp) produced by filamentous fungi.
  • Expression vectors suitable for expression in filamentous fungi include those having an enhancer sequence and a promoter region on the ⁇ -darcosidase gene (agdA) promoter of Aspergillus oryzae.
  • the promoter for introducing the enhancer sequence is not particularly limited as long as it can function in filamentous fungi.
  • Promoters of hydrolytic enzymes such as hydrase and acetoamidase, and glycolytic enzyme genes such as 3-phosphodallyserate kinase, dalyceraldehyde-3-phosphine dedehydrogenase and alcohol dehydrogenase.
  • Suitable promoters can also be isolated from Aspergillus ⁇ -amylase, darcoamylase, and hyal-darcosidase. More preferred examples include the promoter of Aspergillus oryzae ⁇ -darcosidase gene. Even if the promoter is a partial sequence, it can function as a promoter in filamentous fungi. It is included as long as it has the ability.
  • an expression plasmid that can be preferably used in the present invention has a promoter that functions in the improved filamentous fungus as described above and a terminator, and has a marker gene that is suitable for selection of a host transformant. And has a DNA region replicable in E. coli.
  • the introduction site of the enhancer sequence into the promoter is not particularly limited as long as it is a promoter region.
  • the terminator is not particularly limited as long as it functions in filamentous fungi. For example, the terminator of the ⁇ -darcosidase gene of Aspergillus oryzae or the terminator containing a partial sequence thereof is more preferably used.
  • Preferred selectable markers include the genes for nitrate reductase (niaD), orthin-powered rubamoyltransferase (argB), tryptophan synthase (trpC), and acetamidase (amdS).
  • a more preferred selectable marker gene is the nitrate reductase gene (niaD).
  • Suitable expression vectors for use include, for example, those disclosed in JP-A-09-9968, JP-A-5-268972, etc., or those derived therefrom by known techniques.
  • a plasmid P NLH2, pNAN8142 can be suitably used.
  • synthetic DNA can be used as an adapter DNA between genes.
  • the synthetic DNA may be any DNA as long as the frames of both genes match and the activity of the target gene is not lost.
  • create a fusion gene so that the frame of the target gene and the site derived from the APase gene match. Is done by.
  • the target substance By secreting the APase secretion signal downstream of the translation initiation codon in a frame, the target substance can be secreted and produced outside the cell. As long as the function of the promoter is not lost, some DNA fragments can be deleted. Moreover, even if the DNA base sequence of the region including the promoter and the translation initiation site is modified so as to increase the expression ability so as to change the functions of the promoter and the translation initiation site, it can be used conveniently. And promote It is also possible to modify the DNA base sequence of a region not related to the function of the translational start site and the translation start site.
  • a host for introducing a vector having a promoter of an APase gene and having a translation initiation site and a target polypeptide gene linked downstream of a region encoding Z or a secretion signal is used as the host.
  • Any organism that operates and expresses can be used.
  • it is appropriately selected from eukaryotic microorganisms such as yeast and filamentous fungi.
  • transformation methods for introducing genes into these hosts include protoplast transformation methods.
  • transformation can be performed by a method such as contacting protoplasty cells prepared using an appropriate cell wall lytic enzyme with DNA in the presence of calcium chloride, polyethylene glycol or the like.
  • the transformation method includes an electoral position method (for example, E.
  • the fusion gene may be inserted into a plasmid having an appropriate selection marker gene that functions in the host, and then the host may be transformed with the plasmid.
  • the selection marker gene any gene can be used as long as it can selectively isolate transformed cells.
  • a negromycin B resistance gene Normally, the host must use a strain that does not have any functional gene for the selected selectable marker.
  • the host cell is an animal cell, for example, COS-7 cells derived from African green monkey fibroblasts, COS-1 cells, CV-1 cells, 293 cells derived from human kidney cells, A431 cells derived from human epidermis cells, humans Colon-derived 205 cells, mouse fibroblast-derived COP cells, MOP cells, WOP cells, Chinese 'cells, Muster cell-derived CHO cells, CHO DHFR-cells, human HeLa cells, mouse cell-derived C127 cells, mouse cells NIH 3T3 cells, mouse L cells, 9BHK, HL-60, U937, HaK, Jurkat cells, other transformed cell lines, normal diploid cells, in vitro primary tissue strength Cell lines and the like.
  • COS-7 cells derived from African green monkey fibroblasts, COS-1 cells, CV-1 cells, 293 cells derived from human kidney cells, A431 cells derived from human epidermis cells, humans Colon-derived 205 cells, mouse fibroblast-derived COP cells, MOP cells, WOP cells,
  • baculovirus Baculovirus us
  • Uinoresu Autogmpha californica nucle ar polyhedrosis virus
  • those derived therefrom may be mentioned.
  • the recombinant gene introduction vector for example, a P VL1392, pVL1393, pBlueBacIII (both an in Vitorogen Co.)
  • Spodoptera frueiperda cat erpillar
  • Aedes aegypti mosquito
  • Aedes albopictus mosquito, Drosophila melang aster (fruitfly)
  • silkworm larvae or silkworm cultured cells such as BM-N cells.
  • High5 Invitrogen
  • Luckow et al. Bio / Technology, 6: 47-55 (1988); Setlow, JK et al. (Ed.), Genetic Engineering, Vol.
  • plant cells When plant cells are used as host cells, Agrobacterium tumefaciens, Ti plasmids, tobacco mosaic virus vectors, and the like can be used. Plant cell expression vectors are widely known in the art. As the promoter, any promoter can be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include cauliflower mosaic winoles (CaMV) 35S promoter, rice actin 1 promoter and the like. Examples of the host cell include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, rape, alfalfa, rice, wheat and barley. As a method for introducing a recombinant vector, DNA is introduced into plant cells.
  • CaMV cauliflower mosaic winoles
  • Any method can be used, for example, Agrobacterium (JP 59-140885, JP 60-70080, WO94 / 00977), electoral position And a particle gun (gene gun) method (Patent No. 2606 856, Patent No. 2517813).
  • a restriction enzyme, reverse transcriptase, or DNA fragment known or widely used in the art is modified or converted into a structure suitable for cloning. Is an enzyme
  • DNA modification 'degrading enzyme DNA polymerase, terminal nucleotidyl transferase, DNA ligase, etc.
  • restriction enzymes include RJ Roberts, Nucleic Acids Res., 13: rl65, 1985; b. Linn et al. Ed. Nucleases, p. 109, Cold bpnng Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982 RJ Roberts, D. Macelis, Nucleic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991 and the like.
  • the mannanase gene (including related genes such as the mannanase and its mutants (variants), modifications, derivatives, etc.) or a recombinant DNA molecule capable of expressing the mannanase is transferred to a host, and the mannanase is expressed.
  • a method for obtaining the desired mannanase is provided.
  • the present invention also provides a recombinant or transfectant that substantially expresses the mannanase gene, a method for producing the same, and its use.
  • the peptide or polypeptide (or protein) derived from the present invention has one or more amino acid residues that are different from the natural ones in terms of identity, and one or more amino acid residues are naturally located. It may be different.
  • the peptide derived from the present invention is A corresponding polypeptide having a mutation such as substitution, deletion, insertion, transfer or addition of one or more (or several) amino acids, as appropriate, in the amino acid sequence of a given polypeptide.
  • amino acid residues unique to mannanase for example, 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, especially 1 to 10 or 1-5 missing deletion analogs (including truncation mutants), one or more unique amino acid residues (eg 1-80, preferably 1-60) More preferably 1-40, more preferably 1-20, in particular 1-10 or 1-5, etc.) substituted analogs substituted with other residues, one or more (eg 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, Preferably to 1 to 20, in particular also includes amino acid residues are added ⁇ Ru addition analogs 1 such 10 or 1 to 5).
  • amino acid residues unique to mannanase for example, 1 to 80, preferably 1 to 60, more preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, especially 1 to 10 or 1-5 missing deletion analogs (including truncation mutants), one or more unique amino acid residues (eg 1-80, preferably 1-60) More preferably 1-40, more
  • amino acid substitutions, deletions, or insertions often do not cause significant changes in the physiological properties or physicochemical properties of the polypeptide, in which case the substitutions, deletions, or insertions are not.
  • the applied polypeptide will be substantially identical to those without such substitutions, deletions or insertions.
  • Substantially identical substitutions of amino acids in the amino acid sequence can also be selected from other amino acids in the class to which the amino acid belongs.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids include lanine, phenylalanine, leucine, isoleucine, norin, proline, tryptophan, methionine, etc.
  • polar (neutral) include glycine, serine, threonine, Examples include cysteine, tyrosin, asparagine, and glutamine.
  • positively charged amino acids basic amino acids
  • negatively charged amino acids acidic amino acids
  • the peptide or polypeptide of the present invention has a primary structure conformation that is substantially the same as that of natural mannmannase, and it is considered that the peptide or polypeptide includes a part thereof.
  • the protein (or peptide or polypeptide) derived from the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 60%, or in some cases, those having a homology higher than 70%, preferably 80% or 90% or more homologous amino acid sequences. On the other hand, those having 95% or 98% or more homologous amino acid sequences are preferable.
  • the part of the protein derived from the present invention is a part of the peptide derived from the protein (that is, a partial peptide of the protein), which is substantially the same as the protein of the present invention. As long as they have similar activity, any of them may be used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention has at least 5 or more, preferably 20 or more, more preferably 50 or more, more preferably 70 or more of the amino acid sequences constituting the abimannanase. And preferably 100 or more, and in some cases 200 or more peptides having an amino acid sequence, preferably those corresponding to consecutive amino acid residues or, for example, SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: ll those having homology similar to the above with respect to the homology to the corresponding region can be mentioned.
  • substantially equivalent means that the protein activities such as sugar chain binding, enzyme activity, physiological activity, and biological activity are substantially the same. Furthermore, the meaning of the term includes a case where the activity is substantially the same, and the substantially the same activity includes specific sugar chain binding property, polysaccharide decomposition activity, etc. Can be mentioned.
  • the substantially homogeneous activity indicates that these activities are qualitatively homogeneous, for example, physiologically, enzymatically, or biologically homogeneous.
  • enzyme activity or the like has the same activity (for example, about 0.001 to about 1000 times, preferably about 0.01 to about 100 times, more preferably about 0.1 to about 20 times, more preferably about 0.5 to about 2 times)
  • quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • fusion polypeptide when it is produced by a genetic recombination method, and biologically equivalent to the desired polypeptide in vivo or in vitro. It may be converted into a product having activity.
  • fusion polypeptides can be purified by affinity chromatography using the fusion part.
  • Such fusion polypeptides include those fused to a histidine tag, or ⁇ -galatatosidase (j8-gal), maltose binding protein (MBP), glutathione-S-transferase (GST), thioredoxin (TRX ) Or those fused with the amino acid sequence of Cre Recombinase.
  • a polypeptide can be tagged with a heterogeneous epitope and can be purified by immunoaffinity chromatography using an antibody that specifically binds to the epitope. it can.
  • a polyhistidine (poly-His) or polyhistidine-glycine (poly-His-Gly) tag, and the epitope tag include, for example, AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, HA, Ha.ll, KT3, FLAG (registered trademark, Sigma— Aldrich), Omni—probe, S-probe, T7, Lex A, V5, VP16, GAL4, VSV-G (Field et al., Molecular and Cellular Biology, 8: pp.2159-2165 (1988); Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5: pp.3610-3616 (1985); Paborsky et al.
  • the fusion polypeptide may be one with a marker that becomes a detectable protein.
  • the detectable marker may be a biotin Avi tag based on the Piotin Z streptavidin system, a fluorescent substance, or the like.
  • the fluorescent substance examples include green fluorescent protein (GFP) derived from luminescent jellyfish, such as Aeauorea coerulescens and Aeau orea victorea, and mutants (GFP variants) obtained by modifying the fluorescent protein, such as EGFP (Enhanced-humanize d GFP), AcGFPl protein, rsGFP (red-shift GFP), yellow fluorescent protein (YFP), green fluorescent protein (GFP), indigo fluorescent Protein (cyan fluorescent protein: CFP), blue fluorescen t protein: BFP), GFP derived from Renilla reniformis, red fluorescent protein derived from a species of sponge (Discosoma) that lives in coral reefs, such as BD Living Colors DsRed-Monomer (DsRed-Monmer or monomer) DsRed) (Clontech).
  • GFP green fluorescent protein
  • Discosoma that lives in coral reefs, such as BD Living Colors DsRed-Monomer (DsRed-Monmer or
  • Detection can also be performed using an antibody (including a monoclonal antibody and a fragment thereof) that specifically recognizes the fusion tag.
  • Expression and purification of such a fusion polypeptide can be carried out using a commercially available kit suitable for it, and can also be carried out according to a protocol disclosed by the kit manufacturer or the kit vendor.
  • a nucleic acid encoding the mannanase or polypeptide (polynucleotide, e.g. D
  • NA also simply referred to as mannanase gene
  • the reporter gene is such that it expresses the reporter protein.
  • Reporter protein refers to a protein produced by a reporter gene so that it is relatively easy to confirm how much and how much a recombinant gene created by recombinant DNA technology can be produced.
  • it may include an enzyme that emits light or develops color by reacting with a specific substrate, or a fluorescent protein that emits fluorescence by excitation light, but is not limited thereto and can achieve a desired purpose. It can be used without any restrictions.
  • Various reporter proteins are known in the art, and can be easily obtained as commercial products. From these, appropriate ones can be selected and used.
  • the reporter gene itself is supposed to have functions other than visualization!
  • Various organism genes are used as reporter genes for knowing the activity of protein motors and the behavior of proteins, and all of them may be included.
  • This reporter gene is linked to the downstream of the promoter of a gene and is used to know the presence or absence of the original gene and the intensity of its expression by measuring the activity of the product of the fusion gene. It can be a gene. Reporter gene products are easy to measure activity, are not cytotoxic, and can be detected by staining at the force, tissue or individual level! / It is also preferable.
  • Representative examples include, for example, chloramphie-cholase chininotransferase (CAT), Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (DsRed), the above-mentioned GFP and its variants or analogs, beta glucurodase (GUS), lacZ, The ability to mention luciferase and the like is not limited to these.
  • CAT chloramphie-cholase chininotransferase
  • DsRed Discosoma sp. Red Fluorescent Protein
  • GFP beta glucurodase
  • lacZ lacZ
  • the polypeptide can be produced.
  • Various conditions for culturing the transformed cells obtained in the present invention vary depending on the type of cells such as strains to be used, but generally the transformed cells are assimilated or assimilated with respect to the medium.
  • a medium containing a carbon source or a nitrogen source capable of being used is used. Any carbon source may be used as long as the transformed cells can be assimilated or assimilated.
  • ammonia ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium acetate.
  • -Ammonium salts such as ammonium and phosphate, nitrates such as sodium nitrate and potassium nitrate, urea, peptone, casamino acids, corn steep liquor, corn gluten meal, casein hydrolyzate, bran, yeast extract, dry yeast ,
  • nutrients such as inorganic salts, minerals, vitamins, and trace metal salts can be arbitrarily added appropriately.
  • inorganic salts include magnesium sulfate, sodium chloride, calcium carbonate, magnesium phosphate, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate and the like, ferrous sulfate, copper sulfate, manganese sulfate, etc.
  • Manganese salts and other Examples of nutrient sources include malt extract. In addition, those generally used in this field can be appropriately selected and used. Culture is usually performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration agitation culture, but it is generally advantageous to cultivate deeply under aerobic conditions.
  • the culture time is usually about 2 hours to 20 days, preferably about 16 hours to 14 days, more preferably about 1 to 10 days, and the medium pH is 3 to 9, Perform at a temperature of 10-50 ° C.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acid, alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • antibiotics such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG) or the like with a recombinant vector using the trp promoter
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • IAA indoleacrylic acid
  • a commonly used medium can be appropriately selected and used, or a modified version thereof can be used, for example, RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199: 519 (196)), Eagle's MEM medium (Science, 122: 501 (1952)), Dulbecco's modified MEM medium (Virol ogy, 8: 396 (1959)), 199 medium [ Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73: 1 (1950)] or a medium obtained by adding fetal calf serum or the like to these mediums can be used.
  • the culture is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium as needed during the culture.
  • the MTX concentration is gradually increased and cultured, and a resistant strain is selected to amplify the DNA encoding the polypeptide of the present invention, thereby obtaining higher expression.
  • Cell lines can be obtained.
  • a commonly used medium can be appropriately selected and used, or a modified version thereof can be used, for example, a TNM-FH medium.
  • a TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCel 1400, ExCell405 (JRH Biosciences), Grace's Insect Medium [Nature, 195: 788 (19 62)] etc. can be used. Cultivation is usually carried out for 1 to 5 days under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C, etc.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium as needed during the culture.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a medium for culturing the transformant a commonly used medium can be appropriately selected and used, and a modified version thereof can also be used.
  • MS Murashige & 'Sturg
  • White white
  • plant hormones such as auxin and cytokinin, etc.
  • Cultivation is usually carried out under conditions of pH 5-9 and 20-40 ° C for 3-60 days.
  • antibiotics such as kanamycin, no, and idaromomycin may be added to the medium as needed during the culture.
  • Examples of the method for producing the polypeptide of the present invention include a method for producing the polypeptide in a host cell and a method for producing the polypeptide outside the host cell.
  • the method can be achieved by changing the host cell used and the structure of the polypeptide to be produced. Can be selected.
  • a technique for actively secreting a polypeptide produced in a host cell outside the host cell is known. For example, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264: 17619 (1989)], These methods [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8227 (1989), Genes Develop., 4: 1288 (1990)], or JP-A-5-336963, WO94 / 23021, etc.
  • a polypeptide containing the active site of the present invention is expressed in a form in which a signal peptide is added in front of the polypeptide containing the active site of the present invention, so that the polypeptide of the present invention is actively released outside the host cell. Can be secreted.
  • the production amount can be increased by using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like.
  • the polypeptide of the present invention can also be produced.
  • the transformant is an animal individual or plant individual
  • the polypeptide is reared or cultivated according to a conventional method, the polypeptide is produced and accumulated, and the polypeptide is collected from the animal individual or plant individual.
  • the said mannanase polypeptide (protein) of the present invention and its mutants, modified products, derivatives, etc. can be subjected to the separation and purification treatment as described above.
  • fragment In the present invention, the terms “fragment”, “derivative” and “analog” are defined as SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: ll polypeptide, SEQ ID NO: l sequence, SEQ ID NO: l In relation to the polypeptide encoded by mRNA transcribed from the sequence of nucleotide numbers 55 to 1134 of the sequence of ID NO: l or the sequence of SEQ ID NO: 10, or the polypeptide encoded by genomic DNA When referred to as a “fragment”, “derivative” or “analog” thereof, it means a polypeptide having essentially the same biological function or activity as such a polypeptide.
  • analogs include truncation mutants (truncated polypeptides derived from the polypeptide of SEQ ID NO: 2), active proteins whose proprotein portion is cleaved to produce an active polypeptide. Proproteins that can be drought are included.
  • the polypeptide of the present invention may be a recombinant polypeptide, a natural polypeptide or a synthetic polypeptide. In certain preferred embodiments, this is a recombinant polypeptide.
  • the present invention relates to a DNA sequence encoding the above-described polypeptide, and a polypeptide of the avian mannanase protein having all or part of its natural characteristics, and its analogs or derivatives (including truncation mutants). DNA sequences encoding (including) are also included.
  • the polynucleotide of the present invention is a mature protein having an additional amino acid at the amino terminus or an additional amino acid at the carboxyl terminus, or a polypeptide endogenous to the mature protein (for example, when it has one or more polypeptide chains in the mature form) ).
  • Such sequences may also play a role in the processing of the precursor to the mature form of the protein, for example, to facilitate protein transport and transport, or to increase the half-life of the protein. It may be one that can be shortened or manipulated to facilitate its detection or production. In general, for example, additional amino acids are processed by cellular enzymes and the mature protein force is removed.
  • a precursor protein having a mature form polypeptide fused to one or more prosequences can be an inactive form polypeptide. When the prosequence is removed, such inactive precursors are usually activated. Some or all of the prosequences can be removed before the activity. Usually before this The precursor is called a proprotein.
  • the polypeptide of the present invention may be a mature protein, a marker sequence or a mature protein to which a reporter sequence has been added.
  • the probe sequence can be removed in a processing step that usually yields an active form polypeptide and a mature form polypeptide.
  • a transformant expressing a predetermined gene product can be used as it is, but it can also be used as its cell homogenate, or a predetermined gene product can be isolated and used.
  • Polypeptides (enzymes) produced by transformed cells obtained in the present invention are obtained from enzyme-producing materials such as transformant cells, including various raw materials such as cell culture broth and cell culture debris. It can be obtained according to a conventionally known method. For example, when accumulated in the medium, a supernatant containing the target substance is obtained by centrifugation or filtration. On the other hand, when the target substance accumulates in cells such as bacterial cells, after culturing, the cells are collected by a known method such as centrifugation or filtration, and the cells are collected with a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride and the like.
  • enzyme-producing materials such as transformant cells, including various raw materials such as cell culture broth and cell culture debris. It can be obtained according to a conventionally known method. For example, when accumulated in the medium, a supernatant containing the target substance is obtained by centrifugation or filtration. On the other hand, when the target substance accumulates in cells such as bacterial cells
  • a surfactant such as Z or Triton X-100 (trade name) or Tween-20 (trade name)
  • stir in a cool place and centrifuge to remove the supernatant containing the protein of interest.
  • a buffer solution crushing the cells by grinding with glass beads, French press, sonication, freeze-thawing, enzyme treatment, etc., and then centrifuging, filtering, etc.
  • the method of obtaining is used suitably.
  • Separation and purification of the target protein from the supernatant can be performed by an appropriate combination of per se known separation and purification methods, such as salting out and ethanol such as ammonium sulfate precipitation.
  • Solvent precipitation methods such as the use of cereals, gel filtration methods such as cephadex, for example ion exchange chromatography using a carrier having a basic group or acidic group such as a dimethylaminoethyl group or a carboxymethyl group, for example, Hydrophobic chromatography using a carrier with a hydrophobic group such as butyl, octyl, and fuller groups, dye gel chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, and affinity chromatography It can be obtained by purification by one method, high performance liquid chromatography method or the like.
  • solubilized by solubilization treatment, for example, treatment with a denaturing agent such as guanidine hydrochloride or urea.
  • a denaturing agent such as guanidine hydrochloride or urea.
  • the lysate is diluted or dialyzed to
  • the repeptide can be returned to a normal three-dimensional structure (refolding), and then a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • an active enzyme can be obtained by treatment in the presence of a reducing agent such as 2-mercaptoethanol or dithiothreitol.
  • a method known in the peptide synthesis field for example, a chemical synthesis method such as a liquid phase synthesis method or a solid phase synthesis method is used. can do.
  • a protein or peptide synthesizing resin is used, and an appropriately protected amino acid is sequentially bonded onto the desired amino acid sequence on the resin by various condensation methods known per se.
  • various activating reagents known per se are preferably used.
  • calpositimides such as dicyclohexylcarbopositimide can be preferably used.
  • the desired product can be obtained by removing the protecting group as appropriate.
  • it can be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorylmethyloxycarbol method), tBoc method (tbutyloxycarbon method), and Advanced ChemTech, Perkin-Elmer. Chemical synthesis can also be performed using peptide synthesizers such as Amersham, Amersham Biosciences, Protein Technologies, Applied Biosystems, Shimadzu Corporation.
  • the peptide (or polypeptide) of the present invention is obtained as a free form, it can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and they can also be converted as a salt. When obtained, it can be converted into a free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • an enzyme-producing cell can be used as it is, or it can be used as a crude enzyme, a purified enzyme, or a fixed enzyme.
  • the immobilized enzyme include those obtained by immobilizing an enzyme or an enzyme-producing cell by a method known in the art. I can do it.
  • immobilization of microbial cells on an alginate gel can also be suitably used.
  • a condensing agent such as daltal aldehyde, hexamethylene diisocyanate, hexamethylene diisothiocyanate can be used as necessary to fix the mixture.
  • a monomer method in which monomers are gelled by a polymerization reaction a prepolymer method in which molecules larger than ordinary monomers are polymerized
  • examples include polymer methods performed by gelling limer, immobilization using polyacrylamide, immobilization using natural polymers such as alginic acid, collagen, gelatin, agar, and ⁇ -carrageenan, photocuring resin.
  • culture of a mannanase-producing transformant introduced with a DNA encoding a DNA mannanase or a coding DNA containing a signal peptide region of an analog mannanase (or a derivative DNA thereof) or a vector into which the DNA has been inserted A product, its cells, or a cell-treated product, and the transformant strength obtained by contacting a mannan-containing substrate with a mannan-containing substrate, and separating the resulting hydrolyzate or salt thereof from the reaction system, A process for the production of mannan digested products or salts thereof is provided.
  • the transformant used is a culture obtained by culturing the strain in a liquid medium, a cell isolated from the culture solution, or a cell or culture.
  • Any form of dried microbial cells obtained by treating sucrose, or fixed gonococcal microbial cells can be used, and the enzyme isolated from the transformant was purified from a crude product. It can be used in any form, such as fixed ones or fixed ones.
  • the operation can be carried out either batchwise, semibatchwise or continuously.
  • Mannan-containing substrate used or mannose-containing polysaccharide substrate or mannose-containing sugar chain group
  • concentration of the quality is not particularly limited, and a range in which suitable results can be obtained can be appropriately selected.
  • the reaction temperature is usually 10-60 ° C, preferably 20-50 ° C, more preferably 30-47 ° C. In the case of a batch system, the reaction time is usually several hours to 7 days.
  • the pH of the reaction system is usually about 3 to 9, but more preferably 6 to 8.
  • the polypeptide such as the mannanase of the present invention has a function such as the biological activity of the mannanase protein identified in the present invention (for example, a catalyst such as binding to mannan and mannose-containing glycolytic activity). It is useful as a reagent for screening a compound (promoter) that promotes activity, an inhibitory compound (inhibitor), or a salt thereof.
  • a catalyst such as binding to mannan and mannose-containing glycolytic activity.
  • a polypeptide such as the mannanase protein of the present invention, a part of the peptide or a salt thereof, the polypeptide of the present invention as the mannanase protein, a part of the peptide (truncation mutant) (Including mutants) or a salt thereof, a compound (promoter or agonist) or a compound that inhibits a biological activity such as a salt thereof (eg, mannan affinity, sugar chain degrading activity)
  • a method for screening agents or antagonists) or salts thereof is also provided.
  • a polypeptide of the present invention for example, (a polypeptide of the present invention, a part of the peptide, or a salt thereof (which may include a transformant expressing the polypeptide, the same shall apply hereinafter)) Comparison is made between the case of contact and the case where the substrate and test sample are brought into contact with the protein of the present invention, a part of the peptide or a salt thereof, etc.
  • Biological activity for example, activity related to interaction between each mannose-containing sugar chain and the polypeptide having the mannanase activity, proteolytic activity, etc. is measured and compared.
  • any substrate can be used as long as it can serve as a substrate for each mannanase.
  • it can be selected from among the known ones known as mannanase substrates, but preferably mannan, mannose-containing polysaccharides, mannose-containing sugar chain compounds, synthesized compounds, etc. Can be used.
  • the substrate can be used as it is, but preferably a substrate labeled with a fluorescent substance such as fluorescein, an enzyme or a radioactive substance can be used.
  • Test samples include, for example, proteins, peptides, non-peptide compounds, sugar-containing compounds
  • examples include compounds, synthetic compounds, fermentation products, plant extracts, algae extracts, tissue extracts such as animals, and cell extracts.
  • Examples of the test compound used for the test sample may preferably include an anti-mannanase antibody, an enzyme inhibitor, a compound having various inhibitor activities, particularly a synthetic compound. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the screening can be carried out according to a usual method for measuring binding activity or enzyme activity. For example, the screening can be carried out with reference to methods known in the art.
  • various labels, buffer systems, and other appropriate reagents can be used, or the procedures described therein can be performed.
  • the peptide used can be treated with an activator, or its precursor can be converted into an active form in advance.
  • the measurement is usually performed in a buffer solution that does not adversely affect the reaction such as Tris-HCl buffer or phosphate buffer.
  • the pH is about 4 to about 10 (preferably about pH 6 to about 8). ).
  • the usual conditions and procedures in each method are added to the ordinary technical considerations of those skilled in the art, and the mannanase of the present invention or a polypeptide having substantially the same activity as that of the present invention.
  • a measurement system related to peptides may be constructed. Details of these general technical means can be referred to reviews, books, etc. (see, for example, “Methods in Enzymology” series, published by Academic Press (USA)).
  • the present invention relates to a native mannanase polypeptide (especially an endogenous mannanase active polypeptide) belonging to the 'mannanase protein family', and the activity associated with the mannanase polypeptide (eg, (E.g., mannan-binding or mannose-containing glycan degradation activity), and the group power consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is also selected Selected from the group consisting of (1) a catalytically active core domain, (2) a mannan binding domain, (3) a mannan recognition domain, and / or (4) a truncation mutant (mutant).
  • a native mannanase polypeptide especially an endogenous mannanase active polypeptide belonging to the 'mannanase protein family'
  • the activity associated with the mannanase polypeptide eg, (
  • the present invention relates to a nucleic acid such as DNA or RNA that enables expression of a polypeptide having at least a part or all of the polypeptide having a form in prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as animal cells. .
  • such a nucleic acid is a sequence in which (a) an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, and an amino acid sequence of SEQ ID N 0:11 are also selected. Or a sequence that can encode the fragment or a sequence complementary thereto, (b) a sequence that can hybridize with the DNA sequence of (a) or a fragment thereof, and (c) the sequence of (a) or (b) It can be an array with a degenerate code that can be hybridized.
  • the conditions for the nodding and the equalizing can be stringent conditions.
  • Prokaryotic organisms such as Escherichia coli or eukaryotic organisms such as animal cells that can be transformed with such a nucleic acid and express the polypeptide of the present invention are also a feature of the present invention.
  • the DNA sequence of the present invention provides information on the amino acid sequence of a mammalian protein that has not been known so far, the use of such information is also included in the present invention.
  • uses include, for example, molluscs that encode the avian mannanase and related polypeptides, preferably snails and bivalves (particularly preferably including abi and its intermediates, sazae, periwinkle) and the like. Examples include probe design for cDNA isolation and detection.
  • the target enzyme protein disclosed in this specification and related proteins, fragments thereof, and nucleic acids including DNA can be used alone or organically, and further It can be applied to genomics and proteomics technologies in combination with other technologies such as sense methods, antibodies including monoclonal antibodies, and transgenic algae.
  • gene polymorphism analysis centered on single nucleotide polymorphism (SNP), gene expression analysis using nucleic acid array and protein array, gene function analysis, protein-protein interaction analysis, physiological function Analysis and control Drug sensitivity analysis can be performed.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a cDNA library can be used, or DNA obtained by PCR technology can be placed on a substrate with a spotting device at high density, and samples can be analyzed using nano-hybridization. Done.
  • the array can be used with a needle or pin, or with ink jet printing technology. This can be done by attaching DNA to each unique position of the substrate such as id glass, silicon plate, plastic plate. Data is acquired by observing a signal obtained as a result of hybridization on the nucleic acid array.
  • the ternary may be obtained from a label such as a fluorescent dye (for example, Cy3, Cy5, BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes (trade name), Texas red (trade name), etc.).
  • a laser scanner or the like can be used for detection, and the obtained data may be processed by a computer system equipped with a program according to an appropriate algorithm.
  • 2_DE two-dimensional electrophoresis
  • MS mass spectrometry
  • ESI electrospray ionization
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • MALDI—TOF analyzer ESI-3 quadruple Polar analyzers
  • ESI-ion trap analyzers etc.
  • staining techniques isotope labeling and analysis, image processing techniques, etc.
  • cDNA of the present invention may also include software related to target enzymes that can be used or available and antibodies to them, databases, etc.
  • cDNA of the present invention is used as a probe, for example, Northern blotting, Zan 'boutting, in situ hybridization, etc. can measure the expression of the mannanase mRNA and the mannanase protein gene itself in yarn and weaving. It can contribute to the development of research on biological processes (processes) that occur in connection with the process, and also helps to elucidate the metabolism and expression regulation related to the mannanase protein.
  • antibody is used in a broad sense and may be a single monoclonal antibody or a specific epitope for various desired mannanase polypeptides and related peptide fragments. It also includes monovalent or polyvalent antibodies, polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and also represents natural molecules (intact molecules) and fragments and derivatives thereof. Including fragments such as F (ab ′), Fab ′ and Fab, and at least
  • Chimeric or hybrid antibodies having two antigens or an epitope binding site Or, for example, bispecific recombinant antibodies such as quadrome and triome, interspecific hybrid antibodies, anti-idiotype antibodies, and chemically modified or strength derivatives thereof.
  • bispecific recombinant antibodies such as quadrome and triome
  • interspecific hybrid antibodies such as interspecific hybrid antibodies
  • anti-idiotype antibodies and chemically modified or strength derivatives thereof.
  • known cell fusion or high-pridoma technology and antibody engineering antibodies obtained using synthetic or semi-synthetic technology, and the viewpoint power of antibody production.
  • Including antibodies prepared using DNA recombination techniques antibodies having neutralizing properties or binding properties with respect to the target antigenic substances or target epitopes described and defined herein. ! / Hurry!
  • Particularly preferred antibodies of the present invention are those that can specifically identify the natural mannanase polypeptide, such as those that can be distinguished from known mannanase proteins.
  • a characteristic sequence of the mannanase of the present invention for example, a contiguous amino acid sequence present in SEQ ID NO: 3 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, a sequence of any one of SEQ ID NOs: 4 to 6, Examples thereof include antibodies that can specifically recognize those that substantially maintain the characteristic sequence of the catalytically active core domain of mannanase.
  • Monoclonal antibodies made against antigenic material are produced using any method that can provide for the production of antibody molecules by a series of cell lines in culture.
  • the modifier "monoclonal" is derived from a substantially homogeneous population of antibodies and indicates the nature of the lie antibody, and the antibody needs to be produced by some specific method. Do not take it.
  • Each monoclonal antibody contains a population of antibodies that are otherwise identical, except that there may be only a small amount of mutants that may not occur naturally and may be powerful. .
  • Monoclonal antibodies have a high specificity and are directed against sites with a single antigenicity. In contrast to conventional (polyclonal) antibody preparations, which typically contain different antibodies directed against different antigenic determinants (epitotops), each monoclonal antibody is a single antibody on that antigen. It is directed against antigenic determinants. In addition to its specificity, monoclonal antibodies are also superior in that they are synthesized by high-pridoma culture and are free or free of other immunoglobulins. Monoclonal antibodies include hybrid antibodies and recombinant antibodies.
  • variable region domains that are independent of their origin and type of immunoglobulin class or subclass. It can be obtained by replacing with a constant region domain, replacing a light chain with a heavy chain, replacing one chain with another chain, or fusing it with a heterogeneous protein.
  • the monoclonal antibody of the present invention was obtained using cell fusion technology using myeloma cells (for example, G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495-497 (1975)). For example, it can be prepared by the following steps.
  • an antigen isolated from the mannanase polypeptide or a fragment from which the force was derived can be used as described above. However, based on the determined amino acid sequence information of the mannanase.
  • An appropriate oligopeptide can be chemically synthesized and used as an antigen.
  • a typical example is a peptide having at least 5 consecutive amino acids among amino acid residues present in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
  • the antigen can be used as it is to immunize an animal by mixing it with an appropriate adjuvant, but may be an immunogenic conjugate or the like.
  • the antigen used as an immunogen is A fragment obtained by fragmenting mannanase or a synthetic polypeptide fragment obtained by chemically synthesizing a polypeptide by selecting a characteristic sequence region based on its amino acid sequence may be used.
  • the fragments are combined with various carrier proteins via an appropriate condensing agent to form an immunogenic conjugate such as a hapten-protein, which can be used to react only with a specific sequence.
  • a cysteine residue or the like can be added in advance to the designed polypeptide to facilitate the preparation of the immunogenic conjugate.
  • the carrier proteins In binding to carrier proteins, the carrier proteins can first be activated. One example of such activity is introduction of an activity bond group.
  • Examples of the active bond group include (1) an active ester or active carboxyl group, such as a -trophyl ester group, a pentafluorophenyl ester group, a 1-benzotriazole ester group, an N-succinimide ester group, etc. (2) An active group, such as a 2-pyridyl group.
  • Examples of carrier proteins include keyhole 'Limpet' hemoyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, globulin, polypeptides such as polylysine, and bacterial cell components such as BCG.
  • Immunization can be performed by methods known to those skilled in the art. For example, Shigeru Muramatsu, et al., Laboratory Biochemistry Course 14, Immunobiology, Maruzen Co., Ltd., 1985, Japan Biochemical Society, secondary biochemistry Laboratory Lecture 5, Immunobiochemical Research Method, Tokyo Kagaku Doujin, 1986, Japan Biochemistry Society, Neoplastics Laboratory Lecture 12, Molecular Immunology III, Antigen ⁇ Antibody ⁇ Complement, Tokyo Kagaku Doujin, 1992; D Catt y (ed.), 'Antibodies: a practical approach, Vol. 1 & 2, IRL Press, Oxford, England (1989). Immunization is accomplished by injecting the immunizing agent one or more times (along with an adjuvant) into the mammal.
  • the immunizing agent and Z or adjuvant are administered to a mammal by multiple subcutaneous injections or intraperitoneal injections.
  • the immunizing agent include those containing the above antigen peptide or a related peptide fragment thereof.
  • the immunizing agent is a protein known to be immunogenic in mammals to be immunized (for example, the above carrier tamper). And the like may be used in the form of a conjugate.
  • adjuvants include Freund's complete adjuvant, Ribi adjuvant, pertussis vaccine, BCG, Lipip A, ribosome, aluminum hydroxide, silica and the like. Immunization is carried out using mice such as BALB / c, mice, musters, and other suitable animals.
  • the dose of the antigen is, for example, about 1 to about 400 g / animal for mice, generally injected intraperitoneally or subcutaneously into the host animal, and thereafter every 1 to 4 weeks, preferably every 1 to 2 weeks. Repeat booster immunization 2-10 times intraperitoneally, subcutaneously, intravenously or intramuscularly.
  • mice for immunization BALB / c mice, BA1 / c mice and F1 mice of other mice can be used.
  • an antibody titer measurement system can be prepared and the antibody titer measured to confirm the degree of animal immunity.
  • the antibodies of the present invention may be those obtained from immunized animal mice thus obtained and include, for example, antisera, polyclonal antibodies and the like.
  • the infinitely proliferative strain (tumor cell line) used for cell fusion can be selected from cell lines that do not produce immunoglobulins, such as P3-NS-l-Ag4-l (NS-1, Eur. Immunol., 6: 511-519, 1976), SP— 2 / 0—Agl4 (SP— 2, Nature, 276: 269—270, 1978), P3-X63-Ag8- from mouse myeloma MOPC-21 cell line Ul (P3U1, Curr. Topics Microbiol. Immunol, 81: 1-7, 1978), P3- X63- Ag8 (X63, Nature, 256: 495-497, 1975), P3- X 63- Ag8- 653 (653, J.
  • P3-NS-l-Ag4-l NS-1, Eur. Immunol., 6: 511-519, 1976
  • SP— 2 / 0—Agl4 SP— 2, Nature, 276: 269—270, 1978
  • 8- Aza-Guan mouse myeloma cell lines are prepared in cell culture media such as Dulbecco's MEM medium (DMEM medium) and RPMI-1640 medium, for example, antibiotics such as penicillin, amikacin, gentamicin, and fetal calf serum (FCS). , Glutamine, 2-mercaptoethanol, etc. as needed, and further subcultured in a medium containing 8-azaguanine (for example, 5-45 g / ml). Passed in normal medium 2-5 days before cell fusion. Instead, the required number of cell lines can be prepared.
  • DMEM medium Dulbecco's MEM medium
  • RPMI-1640 medium for example, antibiotics such as penicillin, amikacin, gentamicin, and fetal calf serum (FCS).
  • FCS fetal calf serum
  • Glutamine, 2-mercaptoethanol, etc. as needed, and further subcultured in a medium containing 8-
  • the cell line used was prepared by thawing the cryopreserved strain completely at approximately 37 ° C, washing it with normal medium such as RPMI-1640 medium three times or more, and then culturing in normal medium to prepare the required number of cell lines. It may be.
  • mice Animals immunized according to step 2 above, such as mice, are 2-5 days after the final immunization.
  • the spleen is removed and a spleen cell suspension is obtained from it.
  • lymph node cells from various parts of the body can be obtained and used for cell fusion.
  • the splenocyte suspension thus obtained and the myeloma cell line obtained according to the above step 3 are placed in a cell medium such as a minimum essential medium (MEM medium), DMEM medium, RPMI-1640 medium, and the like.
  • An agent such as polyethylene glycol is added.
  • the cell fusion agent those known in other various fields can be used.
  • polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 8,000 can be used, and polyethylene glycol having a molecular weight of 1,000 to 4,000 can be used. It can be used more preferably.
  • concentration of polyethylene glycol in the fusion medium is preferably 30 to 60%, for example. If necessary, for example, a small amount of dimethyl sulfoxide can be added to promote fusion.
  • the ratio of splenocytes (lymphocytes): myeloma cell line used for the fusion can be, for example, 1: 1 to 20: 1, more preferably 4: 1 to 7: 1.
  • the fusion reaction treatment can be performed multiple times. After the fusion reaction treatment, the cells are separated by centrifugation and then transferred to the selection medium.
  • the selection medium examples include media such as FCS-containing MEM media and RPMI-1640 media (so-called HAT media) containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine. Selection The medium can be exchanged by adding a volume equal to the volume dispensed to the culture plate on the next day, and then replacing the HAT medium half by half every 1-3 days. You can also change this. On the 8th to 16th day after the fusion, the medium can be changed every 1 to 4 days with a so-called HT medium excluding aminobuterin. As a feeder, for example, mouse thymocytes can be used, which may be preferred.
  • the culture supernatant of various culture wells for the growth of cell cultures such as radioimmunoassay (RIA), enzyme immunoassay (ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), or fluorescence-induced cell separator (FACS) or the like is used for screening by using a predetermined fragment peptide as an antigen or measuring a target antibody using a labeled anti-mouse antibody. Clone hyperidoma producing the desired antibody. Cloning is agar This can be done by the ability to pick up colonies in the medium or by limiting dilution. More preferably, the limiting dilution method can be used. It is preferable to do crawling multiple times.
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • FFA fluorescence immunoassay
  • FACS fluorescence-induced cell separator
  • the obtained Hypridoma strain can be cultured in an appropriate growth medium such as an FCS-containing MEM medium, RPMI-1640 medium, etc., and the desired supernatant of the medium can be obtained.
  • an appropriate growth medium such as an FCS-containing MEM medium, RPMI-1640 medium, etc.
  • the desired supernatant of the medium can be obtained.
  • each of the hybridomas is transplanted into the abdominal cavity of a histocompatibility animal syngeneic with the myeloma cell-derived animal and allowed to proliferate, or each mouse and hybridoma are transplanted and proliferated in, for example, a nude mouse.
  • the monoclonal antibody produced in the ascites can be recovered and obtained.
  • animals Prior to transplantation of hyperidoma, animals can be administered intraperitoneally with mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane). It can also be collected. Ascites fluid is used as it is or in a conventionally known method, for example, salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using cephadex, ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration, It can be purified as a monoclonal antibody by purification using a physical chromatography method or a high performance liquid chromatography method.
  • mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane). It can also be collected. Ascites fluid is used as it is or in a conventionally known method, for example, salting out such as ammonium sulfate precipitation, gel filtration using cephadex, ion exchange chromatography, electrophoresis, dialysis, ultrafiltration
  • the ascites containing the monoclonal antibody can be purified and separated by treatment with ammonium sulfate fractionation, followed by treatment with an anion exchange gel such as DEAE-Sepharose and an affinity column such as Sanchez A column.
  • an affinity chromatograph that immobilizes an antigen or antigen fragment (for example, a synthetic peptide, recombinant antigen protein or peptide, or a site that is specifically recognized by an antibody), and immobilizes protein A.
  • affinity chromatography and hydroxyapatite chromatography is particularly preferred.
  • nucleic acid sequence encoding an antibody that has also obtained the ability of an ibridoma strain. there.
  • the nucleic acid encoding the monoclonal antibody should be isolated and sequenced by conventional techniques such as using an oligonucleotide probe that can specifically bind to the gene encoding the heavy or light chain of the mouse antibody. Can do.
  • the DNA can be placed into an expression vector and host cells as described above. The DNA can be modified, for example, by replacing it with a sequence encoding the constant region domain of the heavy chain or light chain of another specific animal in place of the homogenous mouse sequence.
  • a chimeric antibody or a hybrid antibody having a desired binding specificity.
  • the antibody can be modified such as preparing a chimeric antibody or a hybrid antibody by applying chemical protein synthesis technology including the use of a condensing agent as described below.
  • Methods for producing bispecific antibodies are also known in the art (Millstein et al, Nature, 305: pp. 537-539 (1983); WO93 / 08829; Traunecker et al., EMBO J., 10 : pp.3655— 3659 (1991); Suresh et al., "Methods in Enzymology", Vol. 121, pp.210 (1986)).
  • antibodies such as Fab, Fab ', and F (ab') obtained by treating these antibodies with enzymes such as trypsin, papain, and pepsin, and optionally reducing them.
  • the target polypeptide of the present invention or a yarn or tissue (sample) containing the polypeptide is immunologically analyzed. Can be detected.
  • Immunological detection and quantification methods include immunohistochemistry such as fluorescent antibody method, enzyme immunoassay (ELISA method), radioimmunoassay (RIA), immunohistochemical staining, immunocytochemical staining, etc. Staining method (ABC method, CSA method, etc.), Western blotting method, dot blotting method, immunoprecipitation method, sandwich ELISA method (Shinji Toyama et al.
  • the antibody of the present invention is reacted with a microorganism, animal cell or insect cell or tissue in which a target polypeptide is expressed intracellularly or extracellularly, and further fluorescent such as fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the anti-mouse IgG antibody labeled with a substance is a method in which a fluorescent dye is measured with a flow cytometer after reacting the fragment.
  • the enzyme immunoassay (ELISA method) is a method in which a microorganism, animal cell, insect cell or tissue expressing the polypeptide in the cell or extracellularly is reacted with the antibody of the present invention and further subjected to fermentation such as peroxidase and alkaline phosphatase.
  • An anti-mouse IgG antibody that has been subjected to an elementary labeling or a piotin-avidin labeling is a method in which a colored fragment is measured with an absorptiometer after reacting a binding fragment.
  • RIA refers to the reaction of the antibody of the present invention with a microorganism, animal cell, insect cell or tissue expressing the polypeptide intracellularly or extracellularly, and further reacting with a radiolabeled anti-mouse IgG antibody or fragment thereof. Then, measure with a scintillation counter or the like.
  • the immune cell staining method and the immunohistochemical staining method are those in which an antibody that specifically recognizes the polypeptide is reacted with a microorganism, animal cell or insect cell or tissue in which the polypeptide is expressed intracellularly or extracellularly.
  • This is a method in which an anti-mouse IgG antibody or fragment thereof labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase or alkaline phosphatase or a piotin-avidin label is reacted and then observed using a microscope.
  • Western blotting refers to microorganisms, animal cells, or insect cells or tissues in which the polypeptide is expressed intracellularly or extracellularly.
  • SDS-polyacrylamide Genore Denki [Antibodies— A Laboratory Manual, old SpnngHarbor Laboratory, 988)
  • blotting the gel on a PVDF membrane or -trocellulose membrane causing the antibody to specifically recognize the polypeptide to react with the membrane, This is a method of confirming after reacting an anti-mouse IgG antibody or a fragment thereof applied with an enzyme label such as a light substance, peroxidase, alkaline phosphatase or the like or a biotin-avidin label.
  • an extract of a microorganism, animal cell, insect cell or tissue expressing the polypeptide inside or outside the cell is blotted onto a nitrocellulose membrane, and the antibody of the present invention is reacted with the membrane. This is confirmed by further reacting with an anti-mouse IgG antibody or binding fragment to which a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase or alkaline phosphatase, or a biotin-avidin label is applied.
  • a fluorescent substance such as FITC
  • an enzyme label such as peroxidase or alkaline phosphatase, or a biotin-avidin label is applied.
  • the immunoprecipitation method is a method in which an extract of a microorganism, animal cell, insect cell or tissue in which the polypeptide of the present invention is expressed intracellularly or extracellularly is reacted with an antibody that specifically recognizes the polypeptide.
  • a carrier having a specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added to precipitate the antigen-antibody complex.
  • Sandwich ELISA is an antibody that specifically recognizes a target polypeptide
  • one of the two antibodies is adsorbed on the plate, and the other is labeled with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme label such as peroxidase or alkaline phosphatase, or piotin-avidin.
  • FITC fluorescent substance
  • an enzyme label such as peroxidase or alkaline phosphatase
  • piotin-avidin After labeling with an antibody label, the antibody adsorption plate is reacted with a microorganism, animal cell or insect cell or tissue extract that expresses the polypeptide in or outside the cell, and then the labeled antibody. This is a method of reacting according to the labeling substance.
  • labels for antibodies include enzymes, enzyme substrates, enzyme inhibitors, prosthetic molecules, coenzymes, enzyme precursors, apoenzymes, fluorescent substances, dye substances, chemiluminescent compounds, luminescent substances, coloring substances, magnetic substances, metals
  • the particles include radioactive materials such as gold colloid.
  • Enzymes include oxidoreductases such as dehydrogenases, reductases, and oxidases, such as transferases that catalyze the transfer of amino groups, carboxyl groups, methyl groups, acyl groups, phosphate groups, etc., such as ester bonds.
  • hydrolase lyase, isomerase, ligase and the like that hydrolyze glycoside bonds, ether bonds, peptide bonds, and the like.
  • Enzymes can be used for detection by using multiple enzymes in combination. For example, enzymatic citring can be used.
  • Natural or modified cells such as coalesced, cross-linked albumin, collagen, gelatin, dextran, agarose, cross-linked agarose, cellulose, microcrystalline cellulose, carboxymethylcellulose, cenorelose acetate, etc.
  • the binding between the carrier and those involved in the antigen-antibody reaction is performed by a physical method such as adsorption, a chemical method using a condensing agent or an activated one, and a mutual method. This can be done by using a chemical bonding reaction.
  • ⁇ Abi '' is the generic name for the clams of GastroDoda, Prosobranchia, VetigastroDoda, Pleurotomarioidea, and Haliotidae.
  • the Japanese aviation inhabiting in Japan is black crocodile (black oyster, scallop, scientific name: Halioti s discus discus. ), Megabi (Haliotis diversicolor aauatilis), etc., which may be included in the abalone, and mollusks in this specification include animals belonging to the gastropod and bivalve species.
  • Sazae is a moth from the Trobinidae turfoida trophozoic anterogastric antagonist (Trochoidea) Shellfish, English name: horned turban, 'Gi name: Turbo (Batnlus cornutus, similar to Sydney Sazae (English: Shidoni-Sazae, Scientific name: Turbo torau atus), Ryuten Sazae (Ryuten Sakae) Screw, English name: tapestry turban, Scientific name: Turbo petholatus), Tsuyasazae (English name: crown turban ⁇ Scientific name: Turbo cidaris), Natanore Sazae (English name: nat al turban, Name: Turbo cidaris natalensis), Butterfly sensor name: silver-mouth tur ban ⁇ Scientific name: Turbo argyrostomus), Hidatori Sazae (English name: squamose turoan, Ghi name: fur bo sauamosus),
  • Opisthobranchia (Anaspidea) Aplvsioidea (Aplvsii d ⁇ ) shell, English name: Tatsunami-Gai, scientific name: Dolabella auricularia.
  • Scallops hard clam, Meretrix lusoria), scallops (Scallop ⁇ Pationopecten _ essoensis), Minoreigai (Kaimatsu Goku, Keen's gaper ⁇ fresus keenae), Locogai, Nari Abalone, English name : Chilean abalone, 'Ghi name: Concholepas concholepas. Mouth ⁇ Cal name: Loco (Mouth co)), Locate (Chili Sazae, English name: tops chocolata, Local name: Caracol Locate (Caracol Locate)), Soft clam (Tumbao, English name: Solid Semele, Scientific name:
  • Semele solida Gray local name: Tumbao (Tumbao)), white clam (Krengue, English name: pacific clam (while clam entered 'Gi solid name, Gari solida, low power name: Culengue)), La Paz guy (English name) : Limpet, scientific name: Sissurella SDD, local name: Lapa), mate (navaja, English name: razor shall, scientific name: Ensis macha, local name: Navaja).
  • Seaweed contains polysaccharides as the main useful ingredients, including mannan. Therefore, representative examples of the mannan-containing substrate (or mannose-containing polysaccharide substrate or mannose-containing sugar chain substrate) include seaweed. As described above, seaweeds are green algae (eg, Anori, Hitedasa, Aosa, Mill, etc.), red algae (eg, Amanori, , Etc.) and brown algae (eg, kombu, wakaji hijiki, mozuku, etc.). In particular, red algae are considered promising as substrates. Treating seaweed with the mannanase is advantageous in applications such as extraction of useful components contained in the seaweed, conversion of waste seaweed into useful products, and formation of algal protoplasts.
  • green algae eg, Anori, Hitedasa, Aosa, Mill, etc.
  • red algae eg, Amanori, , Etc.
  • brown algae eg, kombu, wakaji hijiki, mozuku,
  • polysaccharides extracted from seaweed pods can be widely used for agar, aromatic deodorants, denture impressions, and cosmetic ingredients.
  • it is expected to be useful for the utilization of substances having antitumor activity and antihypertensive action such as fucoidan gallium potassium which is a kind of polysaccharide.
  • Seaweed contains polysaccharides as the main useful ingredients, and the polysaccharides extracted from seaweed moss are useful as agar, aromatic deodorants, denture tooth impressions, cosmetic ingredients, etc.
  • Fucoidan and potassium alginate which are a kind of polysaccharides, have been confirmed to have antitumor activity, an antihypertensive action and the like, and seaweed-derived polysaccharides are highly useful.
  • the products obtained from the action of mannanase from seaweed are alga-eating fish and shellfish food, raw food 'food processing materials, food materials for functional foods, medicinal materials, fertilizers, soil conditioners, dyes, lubricants It can be used for industrial raw materials including additives such as cosmetics and biomass energy sources.
  • seaweed includes green algae, red algae and brown algae, including red algal plants including Primi red alga (Protoflorid eophycidae (Bangiophycidae) and those belonging to the true red algae subclass (Florideophycidae) (Rhodophyta),
  • Genus for example, those belonging to the order of the genus Uriala (Bangiales), EoiEta (for example, Pororora tenera Kjellman, Porphyra vezoensi s Ueda), and the genus Lepidoptera (Gelidiales) (Eg, Gelidiella, Gelidium) (eg, Gelidium elegans Kuetzing, amansii La usine usine), genius (Gelidium iaponicum (Harvey) Okamura), pterocladia (Gelidium ciicum), etc.)
  • Genus for example, Pterocladiella tenuis (Oka mura) Shimada), Ptilophora, Yatabella), Gigartinales (eg, Ahnfeltiopsis), Calosiph onia, Catenella, Caulacanthus, Cerato dictyon, Chondrus Eucheuma (eucheuma), GelidioDsi
  • Acanthophora eg, Acanthophora
  • Schizvmenia Schmitzia, Solieria
  • Stenoeramma Tvlotus
  • Ceramiale s eg, Acanthophora
  • Acrocvstis A crosorium, Acrothamnion, Amansia, Antithamnio n (Futus genus), Ardissonula (Hydrox genus), Benzaitenia (Bentenmo genus), Bostrvchia (Brown genus), Brachioelossum (Callus genus), Callithamnion, Caloglossa (Aegeanu), CamDvlaephora (eg , Egonori ampvlaephora hvpnaeoides J.
  • Brown algae plant For example, those belonging to the order Ralfsialesae (Ralfsiaceae) (for example, Ana hpus (Manomo moth, row f? Matsumoto (Analipus iaponicus (Harvey) Wynne; Heterochoraar ia abietina), etc.), Diplura (Chronomon genus) , Endoplura, Heteror alfsia, Ralfsia, and Chordariales (eg, Acrothrix, Chordaria, Cladosiph on) (Okina Mozuku, for example, Cladosiphon okamuranus Tokida), Elachista, Eudesme, Halothrix, I shiee, Leathesia, Mr.
  • Ralfsiaceae for example, Ana hpus (Manomo moth, row f? Matsumoto (Analipus iaponicus (Harve
  • Nemacvstis (Mozuku, eg, cit (Nemacvstus decipiens (Sunngar) KUCKUCK, etc.), Papenlussiella (Purple), Petrospongium, Sphaerotrichia ( Shimoku, Stilophora, Tinocladia, F row; ⁇ , Fuso cits (Tinocladia crassa (Suringar) Kylin, etc.), those belonging to the order of the Laminariales (for example, Aearum) Genus), Alaria (Chiga isogenus, Ainuwakame), Arthrothamnus (Nekosicombu), Chorda (Culmo), Costar ia, Cvmathaere, Ecklonia, Eckloniopsis , Eisenia, Hedophvllum, Kiellmaniella, Laminaria (for example, "V ⁇ 3 (Laminana laponica AreschougA), Pseudochorda, etc.),
  • Chlorella Chlorella, Dunaliella, Ulvales (for example, Blidineia, Enteromorpha, for example, Enteromorpha prolifera (Mueller) J. Agardh), Po, Hua inoriinal (test) )), Kornmannia And the like, including Ulva (eg, Ulva pertusa Kiellman), Ulvaria (Corotia fragile (Suringar) Hariot), and egret (Monostroma nitidum Wittrock).
  • Ulva eg, Ulva pertusa Kiellman
  • Ulvaria Corotia fragile (Suringar) Hariot
  • egret Monostroma nitidum Wittrock
  • Mannanase is an industrially useful enzyme that produces high-value-added manno-oligosaccharides such as mannobiose and mannotriose as food additives and pharmaceutical materials. Furthermore, mannanase degrades mannan, which is one of the hemicelluloses that make up the cell wall of some seaweeds, so it is considered that mannanase is a useful enzyme for producing seaweed protoplasts.
  • mannanase contained in the digestive juice of Ezoabi was isolated and purified, and the basic enzyme characteristics were successfully analyzed. Furthermore, from the viewpoint of preparing a large amount of low-cost mannanase derived from ezobi used for the production of seaweed protoplasts, we succeeded in constructing an expression system using Escherichia coli. For example, an expression system was constructed using a pET-101 plasmid vector in which cDNA encoding HdMan excluding the signal peptide was incorporated and host E.
  • Recombinant HdMan showed some differences in optimal temperature, optimal pH, and temperature stability compared to natural HdMan, but it was confirmed that Susabiori was dispersed in the cell mass, similar to natural HdMan. Yes.
  • Protoplast production of plant cells is a basic technology with high utility value, such as cell fusion, extraction of cell strength of DNA and organelles, introduction into cells, observation of cells, and creation of mutants. Yes (Edited by Masahiro Notoya, “Biotechnology of Useful Seaweed”, pp. 62-72 (Toshiyoshi Araki, Protoplast Isolation Technology), Hoshiseisha Koseikaku, Tokyo (1997)), not only for research but also in the field of breeding Is also available. Protoplasts are also transformed in the genus Amanori (Mazu Hado, Aquaculture, 51, 355-360 (2003)), cell fusion (Mizukami, Y.
  • seaweed culture seedlings are supplied as oyster shell filaments, but this requires a half-year culture period, and protoplasts are used as seedlings for direct cultivation in order to eliminate the labor and cost during this period. It is also considered to do this (Kawamura Yoshio et al., Monthly Ocean, 27, 661-665 (1995)). The technology of the present invention will be applied to such use.
  • amino acid sequences such as proteins and peptides:
  • G Glycine (Gly) S: Serine (Ser)
  • Y cytosine or thymine
  • N guanine, adenine, cytosine or thymine
  • R Adenine or guanine
  • abi was used as a marine snail. If you use this method, mannanase can also be isolated from sazae, periwinkle, sea urchin, stingray, mussel, etc.
  • the mannanase highly active fraction adsorbed on TOYO PEARL CM-650M (fraction 63-68) was collected and re-chromatographed on the same TOYOPEARL CM-650M column, and then the active fraction was added to 10 mM Na-phosphate ( The solution was dialyzed to pH 7.0) and applied to a Hyde mouth xiapatite column (1.5 20 cm) equilibrated in the same solution. As a result, mannanase was eluted in fractions 57-63 ( Figure 2).
  • the specific activity of the mannaniase purified by the above method was 11.5 U / mg, the yield was 1.59%, and the purity from the crude enzyme was about 143.1 times (Table 1).
  • Mannanase activity was measured at 30 ° C. in lml of 10 mM Na-phosphate (pH 7.0) containing 5 mg / ml of Locust bean gum. That is, 0.1 ml of the reaction solution is taken at regular intervals and added to 0.5 ml of 0.1% SDS that has been heated at 100 ° C in advance to stop the reaction, and the reducing sugar released by mannanase action is removed from the Park- Quantified by Johnson method. The amount of enzyme that produces a reducing sugar equivalent to 1 mole of mannose in a 1-minute reaction was defined as 1 U.
  • the vinyl mannanase was purified to high purity by performing various chromatographies.
  • Example 2 the temperature dependence of the enzymatic activity of the mannmannase obtained in Example 1 was examined.
  • the activity was measured at about 0.5 U carotenase at 15-60 ° C. .
  • the optimum temperature of the abbreviation mannanase was about 45 ° C (Fig. 5).
  • pH 7.0 90% of the activity remained even after heating at 40 ° C for 30 minutes (Fig. 6).
  • Example 1 the substrate specificity of the glass mannanase obtained in Example 1 was examined. That is, the mannose mannanase obtained in Example 1 was applied to Locust bean gum (Garatato mannan), Konja k mannan (Dalcomannan) and ivory nut mannan (linear ⁇ -1,4-mannan). . As a result, it was found that they all decomposed well (Fig. 7). The Km value when L ocust bean gum was used as a substrate was estimated to be about 0.8 mg / ml. On the other hand, xylan, agarose, carboxymethylcellulose and dextran were not decomposed at all.
  • Locust bean gum Garatato mannan
  • Konja k mannan Konja k mannan
  • ivory nut mannan linear ⁇ -1,4-mannan
  • the coffee mannanase obtained in Example 1 was allowed to act on the leaf-like body of the red alga Susavinori, and it was confirmed that it had cell dispersibility. That is, put a 5 mm leaf sausobiori ( ⁇ ⁇ mk) frond into a 1.5 ml test tube, add 1 ml of artificial seawater containing 5 U of mannanase and 0.7 M sorbitol at 22 ° C. Dissolved in the incubator. As a result, it was clarified that the leaves of Susavino were broken down and dispersed into cell masses with 10-20 cell force (Fig. 9). This indicates that the navy mannanase has the ability to degrade mannan, an adhesion structure polysaccharide between red algae cells, and reduce intercellular adhesion.
  • the partial amino acid sequence of the rabbit mannanase obtained in Example 1 was determined, and the cDNA was further cloned. That is, the N-terminal amino acid sequence of the purified mannmannase was analyzed with a Procise492 type protein sequencer manufactured by ABI. As a result, the amino acid sequence of the N-terminal 27 residues was identified as Asp Arg Leu Ser Val Gin Gly Asn His Phe Val Lys Gly Gly Gin Lys Val Phe Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Ala VaK SEQ ID NO: 3].
  • Oligotex TM -dT30 ⁇ Super> (TaKaRa, Japan) was used. The operation followed the kit protocol. After adding Oligo tex- (1-30 ⁇ 3 61 ") to the sample solution and forming a hybrid between poly (A) -oligo (dT) at 37 ° C in the presence of NaCl with a final concentration of about 0.8M, Recover the mRNA-Oligotex complex and then
  • Elute mRNA by adding sterile water or low salt buffer to the body and heat-treating at 65 ° C for 5 minutes.
  • the mRNA force obtained in this way was also used to create cDNA by reverse transcription. Furthermore, the determined N-terminal sequence (Asp Arg Leu Ser Val Gin Gly Asn His Phe Val Lys Gly Gly Gin Lys Val Phe Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Ala Val self-sequence number 3)) and internal amino acid sequence (Asp
  • degenerate primers for PCR shown in Table 3 were synthesized. Using primers of SEQ ID NOs: 7 and 8 (SEQ ID NOs: 7 & 8) and Marathon TM cDNA Amplification Kit (Clontech), SEQ ID NOs: 7 and 8 (SEQ ID NOs: 7 & 8) First-strand synthesis, second-strand synthesis, adapter ligation, 5'-RACE PCR, and 3'-RACE PCR (The operation was performed according to the user manual attached to the kit). as a result As a result, cDNA encoding almost the entire enzyme could be amplified.
  • the Fwl primer is a forward primer synthesized based on the amino acid sequence of the N-terminal region of the enzyme
  • the Rvl primer is a reverse primer synthesized based on the amino acid sequence of the C-terminal region of the enzyme. It is one.
  • a wide range of nucleotide sequence region including the untranslated region of this enzyme is amplified by 5'-RACE and 3'_RACE methods, and the nucleotide sequence of cDNA completely containing from N-terminal to C-terminal of this enzyme It was determined.
  • Cloning vectors and host bacteria are as follows. That is, pT7-Blue (Novagen) was used as the cloning vector, and the human mannanase gene (HdMan) was subcloned into this vector.
  • the cloned vector was named “HdMan-PT7J.
  • the subcloning host strain was coH JM109 strain.
  • Fig. 10 and Fig. 11 The structural schematic diagram and the total nucleotide sequence of the thus determined mannmannanase cDNA are shown in Fig. 10 and Fig. 11 (see SEQ ID NO: 10 in the Sequence Listing), respectively.
  • the full length of the abi mannanase cDNA is 1,232 bp, and its l, 134 bp from the 15th base to the 1,148th base is the translation region and encodes 377 amino acids.
  • 57 bp up to 15th base strength of 69th base at the 5 'end of the translation region encoded a signal peptide consisting of a translation initiation codon and 18 amino acid residues. It is therefore concluded that the mature enzyme consists of 359 amino acid residues.
  • the 5'-end 14-base portion and the 3'-end 84-base portion are untranslated regions, and the 3'-end poly (A) with 6 base strength and the AATAAA polyadulylated signal sequence are found upstream of that 13-base. .
  • the production of the recombinant mannanase can be confirmed by incorporating the cDNA mannanase cDNA into an expression vector and expressing it in a host cell.
  • HdMan E. coli expression system was constructed using the cDNA clone of the above-described obtained mannanase (sometimes abbreviated simply as “HdMan”), and a recombinant (recombinant) protein was constructed.
  • HdMan mannanase
  • mannobiase HdMan
  • E. coli E. coli
  • the Champion pET Directional TOPO Expression Kit Invitorogen
  • the FL-cDNA obtained in the previous chapter was used as a saddle and PCR was performed.
  • Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) was used for PCR reaction.
  • the composition of the PCR reaction mixture was 0.25 ⁇ 1 (1.25 U) for Pvrobest DNA Polymerase, 5 ⁇ 1 for 10 X Pvrobest Buffer II, 4 ⁇ 1 for 2.5 mM dNTP Mixture, 10 pmol for each primer, and 50 ng for plasmid DNA.
  • sterilized distilled water was added to prepare a total volume of 50 ⁇ 1.
  • the reaction conditions were as follows: (1) 95 ° C for 30 seconds, (2) 55 ° C for 60 seconds, and (3) 72 ° C for 90 seconds for one cycle.
  • Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems) was used.
  • the PCR product was incorporated into the plasmid vector pET-101 (FIG. 12) using the Champion pET Directional TOPO Expression Kit. Specifically, TOPO 101 vector 0.5 ⁇ 1 and Salt solution 0.5 ⁇ 1 were added to PCR product 41 and incubated at 25 ° C. for 5 minutes. The ligation reaction was stopped by cooling with ice.
  • coli BL2KDE3 (Stratagene) was used as a host E. coli for expression. Specifically, 120 ⁇ l of the competent cell coli BL21 (DE3) frozen at ⁇ 80 ° C. was gently thawed on ice. Gently add the plasmid DNA solution to this and leave it on ice for 30 minutes. Mido was attached to the surface of the cells. Next, it was incubated at 42 ° C. for 45 seconds to incorporate the plasmid into the host E. coli. Immediately thereafter, the mixture was ice-cooled for 2 minutes, SOC medium 250 1 was added, and the mixture was shaken at 90 rpm and 37 ° C for 1 hour.
  • the acrylamide gel was equilibrated by soaking in Transfer buffer (0.1 M Tris-0.192 M glycine-20% methanol) for 10 minutes. Set three pieces of filter paper soaked in Transfer buffer, anode filter, nitrocellulose membrane (ADVANTEC), equilibrated acrylamide gel and three pieces of filter paper soaked in Transfer buffer in order from anode to semi-dry blotter (ATTO). The protein was transferred to a nitrocellulose membrane. After transcription, the protein nonlocalized portion was blocked by shaking for 15 minutes in 20 ml Blocking solution (20 mM Tris-HCl (pH 7.5)-1 50 mM NaCl-0.05% Tween20-2% skim milk).
  • TTBS solution 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) -150 mM NaCI-0.05% Tween20
  • TTBS solution 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) -150 mM NaCI-0.05% Tween20
  • the nitrocellulose membrane was washed 3 times with TTBS solution, and then 2-5 ml of secondary antibody diluted appropriately with TTBS solution containing 0.2% skim milk was added and shaken for 90 minutes.
  • the -trocellulose membrane was washed with a TTBS solution three times, and then immersed in a chemiluminescent substrate SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (PIERCE) for detection by chemiluminescence.
  • the antibody used was Ant to His as the primary antibody and Anti-rabbit IgG (SIGMA) as the secondary antibody.
  • the properties of recombinant HdMan were analyzed by the methods shown in Examples 2 and 4.
  • the enzyme treatment of the leaf-like gametophyte using HdMan expressed in E. coli was performed under the same conditions as in Example 6 except that the amount of enzyme added was 0.5 U.
  • the pellet was suspended in SDS-P AGE sample buffer and subjected to SDS-PAGE (FIG. 14-A).
  • the expression of the target protein was confirmed by Western blotting (Fig. 14-B).
  • SDS-P AGE showed no apparent band that could be expressed protein.
  • Powerful Western blotting detected a protein band that was considered to be HdMan at a molecular weight of about 43,000. It was done. The expression was confirmed 6 hours after the start of IPTG induction. After 18 hours, multiple bands that were considered to be degradation products of HdMan were confirmed.
  • E. coli BL21 (DE3) carrying recombinant pET-101 was inoculated into 1,000 ml of 2 XYT medium (containing 50 g / ml ampicillin) and cultured with shaking at 150 rpm and 15 ° C. After the turbidity reached 0.6 at an absorbance of 600 nm, IPTG was added to a final concentration of 0.5 mM and further cultured for 12 hours.
  • the cells are collected by centrifugation at 5,000 X g for 5 minutes, suspended in 20 ml of 0.75 M sucrose buffer (0.1 mM Tris-HCl (pH 7.8) -0.75 M sucrose), and then 0.2 ml of Lysozyme solution (2% lysozyme-0.1 mM Tris-HCl (pH 7.8)-0.75 M sucrose) was added and gently stirred. After 10 minutes on ice, 40 ml of 2.5 mM EDTA (pH 7.8) was added in portions with gentle stirring. After 10 minutes on ice, it was dispensed into a 50 ml centrifuge tube and centrifuged at 12,000 xg for 10 minutes.
  • the obtained supernatant was recovered as a periplasmic protein fraction.
  • Precipitated spheroplasts were mixed with 20 ml of Tris-HC1 buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.8) -0.5 M NaCl) and mixed well with a pipette to destroy the cells. Furthermore, sonication was repeated several times to destroy the cells, and then centrifuged at 12,000 ⁇ g for 10 minutes. The resulting precipitate was recovered as an insoluble cytoplasmic fraction, and the supernatant was recovered as a soluble cytoplasmic fraction.
  • the cells suspended in sucrose buffer, the periplasmic protein fraction, the insoluble cytoplasmic fraction, and the soluble cytoplasmic fraction were each dissolved in SDS-PAGE sample buffer. Thereafter, it was subjected to SDS-PAGE (Fig. 15-A) and Western blot (Fig. 15-B). As a result, it was confirmed that the cell, the insoluble cytoplasmic fraction, and the soluble cytoplasmic fraction suspended in sucrose buffer contained a protein considered to be recombinant HdMan. Therefore, an attempt was made to purify recombinant HdMan contained in the soluble cytoplasmic fraction.
  • the soluble cytosolic fraction is applied to a column packed with Ni-NTA agarose (invitrogen), adsorbed with recombinant HdMan with His tag, and then washed with buffer (20 mM imidazole-20 mM Tris- HC1 (pH 7.8)-0.5 M NaCl).
  • buffer 20 mM imidazole-20 mM Tris- HC1 (pH 7.8)-0.5 M NaCl.
  • the elution buffer 150 mM imidazole-20 mM Tris-HCl (pH 7.8) -0.5 M NaCl
  • the eluate was collected as 0.5 ml fractions, and 2 ml of eluate was collected in total and subjected to SDS-PAGE and Western plot.
  • Recombinant HdMan is the power of Locust bean gum, the power of locust bean gum, which is the same as HdMan purified from the digestion solution of ezabi (natural zezobi), xylan, agarose, carboxymethyl cellulose Dextran did not degrade at all ( Figure 20).
  • a cDNA encoding HdMan excluding the signal peptide is amplified by PCR, and an expression system using the pET-101 plasmid vector and host E. coli BL2KDE3) incorporating this is constructed, and HdMan expression is attempted.
  • HdMan expression is attempted in the soluble cytoplasmic fraction under IPTG induction.
  • Whether the expressed protein was the target protein was confirmed by Western blotting, and a band considered to be recombinant HdMan was detected at a molecular weight of about 43,000. This almost coincided with the molecular weight 43,296 calculated from the amino acid sequence.
  • recombinant HdMan was purified by affinity chromatography using a Ni column. As a result, 0.66 mg of protein was eluted. The obtained recombinant Hd Man was confirmed to have mannanase activity. Its specific activity was 2.12 U / mg, which was about one-fifth of the specific activity compared to natural HdMan. This is thought to be due to insufficient purification, as is evident in the SDS-PAGE pattern.
  • the substrate specificity of the recombinant HdMan is similar to that of the natural HdMan, Locust bean Decomposition of gum, dalcomannan, and linear j8-1,4-mannan decomposed xylan, agarose, carboxymethylcellulose, and dextran.
  • the recombinant H dMan fragmented the leaf-like gametophyte of Susavinori.
  • the algal body fragmentation did not progress much. This is thought to be because the amount of the enzyme is only one-tenth that of the treatment with natural HdMan! Expected to be fragmented into cell clumps.
  • the optimum pH, optimum temperature, and thermal stability of the recombinant HdMan were slightly different from those of the natural Hd Man.
  • the optimum pH is the optimum pH of ezabi natural HdMan 3 ⁇ 4H 7.5
  • recombinant HdMan is biased to alkaline with pH 8.0
  • the optimum temperature is 45 ° C for ezabi natural HdMan.
  • the thread and HdMan had a low temperature of 40 ° C.
  • the temperature stability of Ezabi natural HdMan remained 90% after heating at 40 ° C for 30 minutes at pH 7.0, whereas recombinant HdMan 30% at 40 ° C at pH 7.0.
  • arginine has 8 residues in the cDNA encoding H dMan.
  • the codons encoded are 3 codons AGA, 1 AGG, and CGG, which are very rarely used in E. coli. One included.
  • 3 of 19 isoleucine residues and 3 of 28 leucine residues were used with less frequently used codons.
  • degradation of recombinant HdMan confirmed by Western blotting may also contribute to a decrease in expression level.
  • HdMan is slightly different in nature from ezabi natural HdMan, but similar to ezabi natural HdMan, its optimum pH is close to that of seawater and the optimum temperature is derived from other mollusks. It is considered to have characteristics that can be used as one of the enzymes for producing Susavino protoplasts, such as low compared with mannanase.
  • HdMan was successfully expressed in E. coli using recombinant DNA technology.
  • HdMan expression it has been found that it is preferable to select more appropriate conditions and conditions such as E. coli culture and induction conditions, expression vectors, etc., such as temperature and IPTG concentration.
  • an expression system (Xu, B. et al., Eur. J. Biochem., 269, 1753-1760 (Michigan Yeast), which has been successfully expressed in large quantities in the mussel mannanase (Pichia Dastoris). It may be effective to use a host system other than E. coli such as 2002)).
  • HdMan and others can be used for efficient production of susbinori protoplasts. Therefore, it is difficult to prepare a large amount of natural natural Hd Man in consideration of the unit price of the aviation. Therefore, it is important to prepare Hd Man in large quantities, inexpensively and simply in a large expression system using E. coli.
  • the mannanase of the present invention has a novel amino acid sequence, and provides genetic information on mannanases derived from clams.
  • the mannanase of the present invention is derived from mussels and has a high utility value in fishery processing, fishery-related biotechnology, the use of mannan that is available in large quantities, the production of oligosaccharides, and feed for increasing feed efficiency It can be widely used for applications such as additive manufacturing and seaweed protoplast formation, and the present invention It is useful for the effective use of waste and resource recovery associated with aquaculture and fishery processing.
  • High quality mannanase can be produced by the method of the present invention. However, since the method of the present invention is suitable for mass production, it is excellent in terms of cost.

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Abstract

　巻貝類由来、特には、アワビ由来のマンナナーゼの諸特性を解明し、水産分野で利用可能な且つ有用な酵素を大量製造する技術を開発する。アワビよりマンナナーゼを単離精製し、該酵素の部分アミノ酸配列の解析よりプライマーを作製し、アワビ由来cDNAライブラリーを構築し、その遺伝子のクローニングを行い、シークエンシング解析してアワビ・マンナナーゼをコードする遺伝子を解明し、該酵素の全長のアミノ酸配列を解明した。これにより、遺伝子工学技術を利用して、アワビ・マンナナーゼの大量生産技術の開発が可能となり、該酵素を利用した応用技術の開発が可能となる。特には、海藻プロトプラストの作製技術に貢献する。

Description

明 細 書
ァヮビ ·マンナナーゼの遺伝子
技術分野
[0001] 本発明は、ァヮビに由来する新規なマンナナーゼ、該マンナナーゼをコードする遺 伝子、この遺伝子力 演繹されたこの酵素のアミノ酸配列、及びこれらの利用技術に 関する。
背景技術
[0002] マンナンは植物の細胞壁および細胞間マトリクスを構成する構造多糖であり、マンノ ースを構成単位として含有して 、る。マンナナーゼ (mannanases)はマンナンを特異的 に分解する酵素 (例えば、 β - 1 ,4-マンナン、ガラタトマンナン、ダルコマンナンなどの マンノース間の β -1 ,4-結合をランダムに加水分解する酵素)で、これまでに細菌（非 特許文献 1 : Tamaru, Y. et al. , Appl. Environ. Microbiol , 61 , 4454-4458 (1995);非 特許文献 2: Akino, T. et al., Agr. Biol. Chem., 52, 773-779 (1988))、真菌（非特許 文献 3: Reese, T. et al. Can. J. Microbiol, 11 , 167-183 (1965);非特許文献 4: Stalb rand, H.， J. Biotechnol, 29, 229-242 (1993))、高等植物（非特許文献 5: Shimahara, H. et al. , Agr. Biol. Chem., 39, 301-312 (1975);非特許文献 6: Marraccini, P. et al . , Planta, 213, 296-308 (2001))および軟体動物（非特許文献 7: Yamaura, I. et al. B iosci. Biotechnol. Biochem. , 57, 1316—1319 (1993);非特許文献 8: Yamaura, I. et al. , Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 674-676 (1996);非特許文献 9: Xu, B. et al. , J. Biotechnol, 92, 267-277 (2002))から単離されている。マンナナーゼは、紅藻を摂餌 する海産の巻貝などの消化液に含まれる。マンナナーゼは、マンノオリゴ糖の生産や 紅藻プロトプラストの作成などに有用な酵素である力 現在は主に微生物起源のもの が使用されている。ただし、微生物のマンナナーゼは、その生産性や基質特異性、 純度、反応効率などの問題もあり、特に海藻を利用した技術では広く活用されている とは言い難い。
一方、紅藻類を食物として 、るァヮビなどの海産巻貝のマンナナ一ゼは比活性が 高ぐマンノオリゴ糖の製造や紅藻プロトプラスト作成に適していると考えられるが、原 料の巻貝自身が高価なため産業的利用は困難であり、現在のところ全く利用されて いない。また、軟体動物のマンナナーゼの研究例も多くなぐこれまでにタマキビガイ 、ォォタ -シ、ムラサキイガイのものがあるに過ぎない。
海藻は、わが国では古くから食用として利用されるだけでなぐ種々の医薬品、ェ 業用原料などとして様々に利用されてきたが、近年、健康食品、陸上植物にはみら れない特有の生理的機能や生物活性を有する成分が含まれることが見出されるなど 、その利用価値が高いと期待されている。また、海藻は、藻場として、さまざまな魚介 類の産卵や棲息に好適な環境を提供するなど、海浜域における生物生産や他の生 物の生息場所の形成、水産資源の育成に重要な役割を果たしており、海域の水質 浄化や光合成により炭酸ガスを吸収するなど、自然環境の保持にも大きな役割を果 たしていると考えられている。一般に海藻は、「藻類」に分類され、藻類は酸素を発生 する光合成を行う生物の中カゝらコケ植物、シダ植物及び種子植物を除いた残りの全 てとされている。海藻は主に、緑藻類 (例えば、ァォノリ、ヒトェダサ、ァォサ、ミルなど )、紅藻類 (例えば、アマノリ類やテンダサ類など）、褐藻類 (例えば、コンブ、ワカメ、ヒ ジキ、モズクなど)の 3つの群に大別される〔非特許文献 10:山田信夫著『海藻利用の 科学 (改訂版)』成山堂書店 (2001-05-28出版； ISBN: 4425827929)及び非特許文献 1 1：岩槻邦男 ·馬渡峻輔監修千原光雄編集『バイオディバ一シティ，シリーズ 3藻類 の多様性と系統』裳華房 (1999年 7月； ISBN 4-7853-5826-2)〕。このように広範な利用 が期待されるにもかかわらず、海藻の研究は、海域に生息することとか室内での培養 に非常な困難を伴うなどのため、陸上植物などと比較して遅れて 、るのが現状である 食糧資源としてだけでなく産業的な利用の上からも、増大する海藻需要を満たすた めにも、海藻の加工技術、海藻の育種品種改良などの技術を開発することが求めら れている。例えば、バイオテクノロジーを用いて細胞融合や遺伝子操作などを行う場 合、細胞壁を酵素で分解し、プロトプラストィ匕するなどの技術が必要であるが、海藻の 細胞壁は陸上植物のものとは異なり、複雑な多糖で構成されているため、多くの海藻 は市販のセルラーゼ製剤では分解することができない。
ァヮビやサザェなどの海藻を常食としている卷貝類の消化液などの中には、多糖 消化酵素が含まれていることは知られている〔非特許文献 12:安斎寛ら、 Bull. Coll. A rg. & Vet. Med., Nihon Univ., No. 48, pp.119- 127 (1991)〕力 原料のァヮビゃサザ ェなどの卷貝類は高価であることや、資源的に大量に得ることが難しいことから、それ らから、実際に、マンナナ一ゼを単離することには成功していな力つた。
海藻類ゃ卷貝類を含めた軟体動物の需要が増大するにつれ、その水産加工により 生じる不可食部位を大量に廃棄することが必要になっている力 近年では、その処 理コスト、廃棄場所などが問題となってきている。環境への悪影響などを解決するた め、こうした廃棄物を有用資源化する技術の開発が試みられているが、当該廃棄物 を分解処理するに有用な酵素がないという問題があった。こうしたことから、ァヮビや サザェなどの卷貝類力もの消化酵素を利用することは、有望であるが、前記したよう に、当該酵素は粗酵素の状態の、精製は不十分なもので、その諸性質も不明であり 、その利用は不可能であった。
[0004] アマノリ属植物のプロトプラスト調製法のひとつとして、ァヮビの消化液のアセトン粉 末が用いられている（非特許文献 13: Polne- Fuller, M. et al.， J. PhycoL, 20, 609-61 6 (1984);非特許文献 14: Saga, N. et al, Beihefte Zur Nova Hedwigia, 83, 37-43 (1 986))が、その品質は、ァヮビの採取時期や個体差に影響される。その結果としてプ ロトプラストの収量が不安定になる傾向がある。また、アセトン粉末中のどの成分がど のくらい加えられると高品質なスサビノリのプロトプラストが得られるのかなど、不明な 点も未だ多い。このような問題を解消するためには、ァヮビよりプロトプラストの作出に 関わる酵素を単離 ·精製し、それらの酵素作用とアマノリ属植物のプロトプラスト形成 の関係を明らかにすることが重要である。し力しながら、ァヮビから酵素を単離'精製 し、大量に調製することは、ァヮビの単価を考慮すると経済的に困難である。
[0005] 非特許文献 1 : Tamaru, Y. et al., Appl. Environ. Microbiol, 61, 4454-4458 (1995) 非特許文献 2 :Akino, T. et al" Agr. Biol. Chem., 52, 773-779 (1988)
非特許文献 3 : Reese, T. et al. Can. J. Microbiol, 11, 167-183 (1965)
非特許文献 4 : Stalbrand, H.， J. BiotechnoL, 29, 229-242 (1993)
非特許文献 5 : Shimahara, H. et al., Agr. Biol. Chem., 39, 301-312 (1975) 非特許文献 6 : Marraccini, P. et al., Planta, 213, 296-308 (2001) 非特許文献 7 :Yamaura, I. et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 57, 1316-1319 (1993 )
非特許文献 8 :Yamaura, I. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 674-676 (1996) 非特許文献 9 : Xu, B. et al., J. Biotechnol., 92, 267-277 (2002)
非特許文献 10 :山田信夫著『海藻利用の科学 (改訂版)』成山堂書店 (2001-05-28出 版； ISBN: 4425827929)
非特許文献 11：岩槻邦男 ·馬渡峻輔監修千原光雄編集『バイオディバ一シティ ·シリ ーズ 3藻類の多様性と系統』裳華房 (1999年 7月； ISBN 4-7853-5826-2)
非特許文献 12 :安斎寛ら、 Bull. Coll. Arg. & Vet. Med., Nihon Univ., No. 48, pp.119 -127 (1991)
非特許文献 13 : Polne- Fuller, M. et al., J. PhycoL, 20, 609-616 (1984)
非特許文献 14 : Saga, N. et al., Beihefte Zur Nova Hedwigia, 83, 37-43 (1986) 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、スサビノリなどの海藻のプロトプラストの作出に利用できる酵素探索の一 環としてァヮビ消化液に含まれる酵素の特性を明らかにすると共に、当該酵素の遺 伝子 (cDNA)をクローンィ匕し、大腸菌、酵母、動物細胞などの培養発現系で大量安 価に生産可能とする手段を開発提供することを目的としている。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するために、ァヮビ（abalones)のマンナナ一ゼを抽 出単離して、精製し、その基本的諸性質を明らかにし、さらに研究を進め、該マンナ ナーゼの cDNAをクローン化することに成功して、ァヮビ 'マンナナーゼをコードする 塩基配列を解明し、ァヮビ 'マンナナーゼのアミノ酸配列も解明することに成功した。 さらに、当該ァヮビ由来のマンナナーゼの、クローニングされた cDNAを利用し、大量 •安価に調製することを目的とし、大腸菌を用いた発現系の構築にも成功した。本発 明は、本知見に基づいている。
本発明では、高純度のァヮビ 'マンナナーゼが調製され、力べして、該酵素の特性 が解明され、さらに精製酵素の調製技術が提供された。本発明では、精製酵素を使 用して、その部分アミノ酸配列が解析され、さらに、その部分アミノ酸配列に基づきォ リゴヌクレオチドプライマーを合成すると共に、ァヮビ肝脾臓 cDNAライブラリーを作成 して、次に、これらのオリゴヌクレオチドプライマーと cDNAライブラリーを用いて、マン ナナーゼの cDNAを PCRにより増幅し、この増幅 cDNAをクローン化した後、塩基配列 を解析し、ァヮビ 'マンナナーゼの遺伝子の構造を決定することに成功し、さらに、こ の遺伝子によりコードされるアミノ酸配列を検討することにより、クローンィ匕した cDNA がァヮビ 'マンナナーゼをコードするものであることを確認した。そして、微生物宿主 細胞による発現系の構築、発現産物の取得並びにその特性の確認に成功している。 本発明は、次なる態様を提供する。
〔 1〕（1)巻貝のァヮビに由来し、下記の特性を有するタンパク質、
(a)作用：本酵素は、ガラタトマンナンを分解して、還元糖を遊離する
(b)基質特異性:本酵素は、ローカストビーンガム (ガラタトマンナン)、コンニヤクマンナ ン（ダルコマンナン）およびゾゥゲヤシマンナン (直鎖状 β -1,4-マンナン)を!、ずれも 良く分解する力 キシラン、ァガロース、カルボキシメチルセルロース、デキストランは 全く分解しない
(c)分子量:約 39,000の単一バンド（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
(d)至適温度： 35〜53°C
(e)至適 pH :pH6.5〜8.5
(ί)Ν末端アミノ酸配列：配列表の配列番号 3のアミノ酸配列
(g)熱安定性: ρΗ 7.0においては 40°C30分間の加熱によっても 90%の活性が残存
(2)配列表の配列番号 2、 9又は 16のアミノ酸配列を有して 、るポリペプチド
(3)配列表の配列番号 2又は 9のアミノ酸配列において 1もしくは複数個（例えば、 1〜 10個あるいは 1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し ており、且つ、マンナナーゼ酵素活性を有するポリペプチド
(4)配列表の配列番号 2又は 9のアミノ酸配列に対して少なくとも 50%より高い相同性、 60%より高い相同性、 70%より高い相同性、 80%より高い相同性、 90%より高い相同性、 9 5%以上の相同性、あるいは少なくとも 98%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し ており、且つ、マンナナーゼ酵素活性を有するポリペプチド 力もなる群力も選択されたものであることを特徴とするマンナナーゼポリペプチド。
〔2〕（1)上記〔1〕に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(2)配列表の配列番号 1、 10又は図 11に示された DNA力 なる群力 選択され た 10個以上又は 15個以上の連続した塩基配列を有するヌクレオチド配列又はそれと 相補的な塩基配列を有するヌクレオチド配列とストリンジヱントな条件でノヽイブリダィ ズし、且つ上記〔1〕の (1)のタンパク質又は上記〔1〕の (2)のポリペプチドの示す生物 学的活性を有する力、あるいは上記〔1〕の (3)又は (4)のポリペプチドの示す生物学的 活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(3)配列表の配列番号 9のアミノ酸配列力 なるポリペプチドをコードするポリヌク レオチド、配列番号 2のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ド、又は配列番号 10の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも 50%以上 の相同性、 60%以上の相同性、 70%以上の相同性、 80%以上の相同性、 90%以上の相 同性、 95%以上の相同性、あるいは 97%以上の相同性を有し、且つ、上記 (2)で言及し た生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
力もなる群力も選択されたものであることを特徴とするマンナナーゼポリヌクレオ チド。
〔3〕配列番号 10の 15番塩基から 1,148番塩基の塩基配列力 成るマンナナーゼ遺伝 子、配列番号 10の 69番塩基から 1,145番塩基の塩基配列から成るマンナナーゼ遺伝 子、あるいは配列番号 15の 5番塩基から 1,180番塩基の塩基配列から成るマンナナ ーゼ遺伝子であることを特徴とする上記〔2〕に記載のポリヌクレオチド。
〔4〕上記〔2〕又は〔3〕に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えべ クタ一。
〔5〕上記〔2〕又は〔3〕に記載のポリヌクレオチド又は上記〔4〕に記載の組換えべクタ 一で宿主細胞を形質転換されて得られたことを特徴とする形質転換された宿主細胞
〔6〕上記〔5〕に記載の形質転換宿主細胞を培養条件下に維持して、上記〔1〕記載の タンパク質又はポリペプチドを発現せしめることを特徴とする上記〔1〕記載のタンパク 質又はポリペプチドの製造法。 〔7〕上記〔1〕に記載のタンパク質又はポリペプチド、上記〔2〕に記載のポリヌクレオチ ド、上記〔4〕に記載の組換えベクター及び上記〔5〕に記載の形質転換宿主細胞から なる群から選択されたものを含有することを特徴とする組成物。
〔8〕組換え又は合成タンパク質あるいはポリペプチド生産のため、配列番号 1〜11か らなる群力も選択された配列の全部あるいはその一部の使用。
〔9〕上記〔1〕に記載のタンパク質又はポリペプチドの一部のフラグメント。
〔10〕上記〔2〕に記載のポリヌクレオチドの一部のフラグメント。
〔11〕上記〔1〕に記載のタンパク質又はポリペプチドで海藻又は植物を処理して断片 化された海藻細胞又は植物細胞を取得することを特徴とする海藻又は植物のプロト プラスト作成法。
〔12〕上記〔1〕に記載のタンパク質又はポリペプチドでマンナン含有基質 (例えば、海 藻など)を処理して加水分解された生成物 (藻食性魚貝類用餌、生食，食品加工用 素材，機能性食品等用食用材料、薬用材料、肥料、土壌改良剤、染料，潤滑油，ィ匕 粧品等の添加剤を含めた工業用原料、バイオマスエネルギー源などを含むし、もち ろん、抗腫瘍活性や高血圧低下作用等を有する医薬品、肥料、食品、寒天、芳香- 消臭剤、入れ歯の歯形の印象剤、マンノオリゴ糖なども含まれる）を取得することを特 徴とするマンナン成分加水分解法。
即ち、本発明は、配列番号 1の 15番塩基から 1,148番塩基の配列から成る遺伝子で ある。本発明はまた、配列番号 2のアミノ酸配列または該アミノ酸配列において 1もし くは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列から成り、マンナナ ーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列から成る遺伝子である。この ような cDNAを適当な発現ベクターに組み込むことにより、大腸菌、酵母、あるいは動 物細胞などの発現系によりマンナナーゼを生産することができる。即ち、本発明は上 記の遺伝子を導入することにより形質転換された微生物あるいは動物細胞発現系を 含む。このような発現系には、当該分野で知られているいかなる発現ベクターを用い ても良いが、宿主としては大腸菌、酵母、あるいは昆虫細胞が使用されるが、好ましく は大腸菌あるいは酵母を用いる。このような発現ベクターに上記遺伝子を組み込む 方法には特段の制限は無ぐ通常法によって行うことができる。その際、適宜適当な プロモーター、 SD配列、ターミネータ一、ェンハンサ一等を用いることができる。また、 本発明は上記遺伝子を導入した発現系である大腸菌、酵母、あるいは動物細胞を培 養し、上記遺伝子を発現させることによって、得られた培養物力もマンナナ一ゼを分 離することから成るマンナナーゼの製造法を含む。
発明の効果
[0010] 本発明は、軟体動物のマンナナーゼを産業的に利用する途を拓くものである。本 発明は、新規なァヮビ 'マンナナーゼを精製された形態で提供しており、該ァヮビ 'マ ンナナーゼの cDNAを提供することにより、同酵素が大腸菌や酵母などの微生物によ り安価かつ大量に生産することを可能とした。それにより、軟体動物のマンナナーゼ を、マンノオリゴ糖の製造、未利用紅藻や紅藻廃棄物の分解、紅藻エキスの製造、紅 藻濃縮物の製造、紅藻粉末の製造、紅藻マンナンのオリゴ糖および単糖化、紅藻種 苗の生産、紅藻プロトプラストの生産など、様々な用途に使用できるようになった。 本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当 業者にとっては明白であろう。し力しながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記 載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のた めにのみ示されて 、るものであることを理解された!、。本明細書に開示した本発明の 意図及び範囲内で、種々の変化及び Z又は改変（あるいは修飾)をなすことは、以 下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明ら かであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目 的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて 解釈されるべきものである。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]ァヮビ 'マンナナーゼの TOYOPEARL CM- 650Mクロマトグラフィーの結果であ る。タンパク質の溶出は 280應の吸光度で検出し、白丸で示した。酵素活性は Perk-J ohnson法で測定し、黒丸で示した。
[図 2]ァヮビ ·マンナナーゼのハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果である。 タンパク質の溶出と酵素活性の検出は図 1と同様に行った。
[図 3]ァヮビ ·マンナナーゼの TOYOPEARL- HW55ゲル濾過の結果である。タンパク 質の溶出と酵素活性の検出は図 1と同様に行った。図中の写真は、本実施例で精製 したァヮビ ·マンナナーゼの SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示して！/、る
[図 4]ァヮビ.マンナナ一ゼの至適 pHの測定結果である。最大活性は pH7.5に示され
、この pHがァヮビ ·マンナナ一ゼの至適 pHであることが分かる。
[図 5]ァヮビ 'マンナナ一ゼの至適温度の測定結果である。最大活性は 45°Cに示され
、この温度がァヮビ 'マンナナ一ゼの至適温度であることが分かる。
[図 6]ァヮビ 'マンナナーゼの温度安定性の測定結果である。 pH7.0において各温度 で 30分間加熱した後の残存活性を測定した結果、ァヮビ 'マンナナーゼは 40°C、 30 分間の加熱によっても 90%の活性が残存し、この温度まで安定であることが分かる。
[図 7]ァヮビ ·マンナナ一ゼの基質特異性の測定結果である。ァヮビ ·マンナナーゼは
Locust bean gum、 Glucomannan、および jS— 1,4— mannanを分解するか、ァ刀ロース、 キシラン、デキストラン、およびカルボキシメチルセルロースを分解しないことがわかる
[図 8]ァヮビ 'マンナナーゼで β -1,4-マンナンおよびマンノオリゴ糖を分解した際の産 物を、薄層クロマトグラフィーで分析した結果である。 - 1,4-マンナン、マンノへキサ オース（M6)、マンノペンタオース (M5)はァヮビ 'マンナナーゼにより、マンノテトラオ一 ス (M4)、マンノトリオース (M3)、およびマンノビオース (M2)に分解されることが分力る。 Mlはマンノース。
[図 9]ァヮビ 'マンナナーゼにより紅藻スサビノリの葉状体を分解した結果である。葉 状体は、 10〜20細胞力も成る細胞塊に分散されることが分かる。このことは、ァヮビ' マンナナーゼが紅藻のクローン種苗生産に有効であることを示している。
[図 10]ァヮビ ·マンナナーゼ cDNAの摸式構造を示す図である。
[図 11]ァヮビ ·マンナナーゼ cDNAの塩基配列と演繹アミノ酸配列を示す図である。
[図 12]プラスミドベクター pET- 101 DNAのマップ（環状）を示す。
[図 13]組換え（リコンビナント） HdManの塩基配列（ヌクレオチド配列）及び推定される アミノ酸配列を示す。 PCRプライマーの位置及び方向を塩基配列の上側に矢印でも つて示してある。 [図 14]組換え HdManの発現レベルを解析した結果を示してある。誘導時間を変えて 分析してある。 Aは、 SDS-PAGEの結果、 Bは、ウェスタンブロッテイングの結果を示す 。 Mは、マーカータンパクを示す。
[図 15]発現せしめられた組換え HdManの菌体内での局在について調べた結果を示 す。 Aは、 SDS-PAGEの結果、 Bは、ウェスタンブロッテイングの結果を示す。 Mは、マ 一力一タンパクを示し、レーン 1は全菌体からなる画分、レーン 2はペリプラズムタンパ ク質画分、レーン 3は不溶性細胞質画分、レーン 4は可溶性細胞質画分を示す。
[図 16]精製処理された組換え HdManを SDS-PAGE及びウェスタンブロッテイングで分 祈した結果を示す。 Aは、 SDS-PAGEの結果、 Bは、ウェスタンブロッテイングの結果 を示す。 Mは、マーカータンパクを示し、レーン 1は Ni- NTAァガロース (invitrogen)力 ラム力 溶出された順序で画分 1、レーン 2は同画分 2、レーン 3は同画分 3、レーン 4 は同画分 4をそれぞれ示す。
[図 17]組換え HdManの至適 pHの測定結果である。 -口-は酢酸緩衝液 (pH4.5〜6.0) 、 -〇-はリン酸緩衝液 (pH6.0〜8.5)、そして-△ -はグリシン緩衝液 (pH8.5〜10.5)を示 す。
[図 18]組換え HdManの至適温度の測定結果である。 10mMリン酸ナトリウム (pH 7.0) と 5mg/mlの Locust bean gumを含む 1 mlの反応混液中に、組換え HdManを加え、 30 分間反応させ、活性を測定した。
[図 19]組換え HdManの温度安定性の測定結果である。 10mMリン酸ナトリウム (pH 7. 0)中、 20-60°Cで 30分間加熱処理した後、残存する活性を 30°Cで測定した。
[図 20]組換え HdManの基質特異性の測定結果である。 Locust bean gum (拳）、 Gluco mannan (園）、 j8 - 1,4- mannan (A)、ァガロース（X )、キシラン（+ )、デキストラン（△) 、およびカルボキシメチルセルロース（口）について、 30°C、 pH7.0での分解活性を調 ベた。活性は、基質、 4mMリン酸ナトリウム（pH 7.0)及び 1.0Uの組換え HdManを含 有する混合物を 30°Cでインキュベーションして行った。基質濃度は、それぞれ、 locus t bean gum: 0.5%、 glucomannan: 0.5%、 j8 -1,4- mannan: 0.5%、ァガロース： 0.2%、キシ ラン： 0.2%、デキストラン： 0.2%、およびカルボキシメチルセルロース： 0.6%とした。
[図 21]組換え HdManでスサビノリ (Por_p ija yezoensis)の配偶体 (thalli)を酵素処理し た結果、得られた藻体を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明では、巻貝由来、特にはァヮビ由来の酵素マンナナーゼは、当該生物の組 織、例えば、内臓や内臓滲出液、特に消化器系の内臓組織や消化液に多く分布し ていることから、それらから酵素含む抽出液などの粗酵素を得た後、マンナナーゼを そのまま回収する方法などを包含する手法で得ることができる。当該マンナナーゼは 、中でもァヮビの肝脾臓前部、中腸腺やここから滲出する体液である消化液等力 粗 酵素液を得ることができる。また、回収したマンナナーゼ含有液を精製する方法とし ては、マンナナーゼを緩衝液などの冷水溶液に加え、得られたマンナナ一ゼ液を吸 着剤で処理するか、イオン交換あるいはゲルろ過クロマトグラフィー処理して、溶出液 を得ることで精製物としてマンナナーゼを得ることができる。例えば、ァヮビからの粗 酵素液の取得は、基本的に穏やかな条件下で実施すべきである。マンナナ一ゼを含 む抽出液を得る場合に、ワーリンダブレンダーを用いることもできる力 内臓の適当な 部分に切り込みを入れ、この部分から内蔵内に緩衝液又は抽出液を静かに注入して 内蔵各部や内臓滲出液と接触させるか、もしくは貝殻から切除した後の組織や組織 滲出液に直接緩衝液又は抽出液を加えることによって、マンナナーゼを洗い出すよ うに抽出することもできる。この抽出操作を、必要に応じて数回（2〜5回)繰り返して、 目的とするマンナナーゼを含有する抽出液を効率よく回収することができる。この方 法によれば、抽出に際して脂質や色素成分などの不純物の溶出量を低減させること ができ、高いマンナナーゼ活性を示す抽出液が得られる。マンナナーゼの抽出'精 製に使用する緩衝液又は抽出液としては、 5〜15mMリン酸ナトリウム (pH7.0)、 1〜5 mM炭酸水素ナトリウム (pH7.5)、 10〜20mM Tris- HC1 (pH7.5)等の中性〜弱アルカリ 性に緩衝能を持つ緩衝液が使用可能である。いずれも、 4〜10°Cに冷却したものを 用いることが好ましい。
[0013] このようにして得た粗マンナナーゼ酵素液からマンナナーゼの精製を行う場合、粗 酵素液はそのままある 、は適当な緩衝液で希釈してから、イオン交換榭脂担体を充 填してあるカラムを使用したイオン交換クロマトグラフィーを行う。イオン交換榭脂とし ては、陽イオン交換タイプのイオン交換榭脂、好ましくは TOYOPEARL CM-650M ( 東ソ一社製)などのカルボキシメチル基を有して ヽる担体を使用する陽イオン交換ク 口マトグラフィー (cation exchange chromatography)が挙げられる。当該陽イオン交換 クロマトグラフィー処理は繰り返し行うこともできる。次に、溶出されたマンナナーゼ含 有画分は、集められて、適宜濃縮処理されてよい。マンナナーゼ含有液は、吸着剤、 例えばハイド口キシルアパタイト (和光純薬工業 (株)製)などを使用したカラムクロマト グラフィーを行って精製される。当該吸着剤に吸着させた後、中性 pHに調整した、ィ オン強度 0.1〜0.15の NaCl、 KC1、 Na HPOなどの溶離液又は緩衝液を加えて、マン
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ナナーゼを吸着剤から溶出させる。吸着剤からの溶出は、直線濃度勾配で行うと、よ り高純度のマンナナーゼを得ることができる。クロマトグラフィー処理は繰り返し行うこ ともできる。次に、溶出されたマンナナーゼ含有画分は、集められて、適宜濃縮処理 されてよい。次いで、マンナナーゼ含有液は、ゲル濾過クロマトグラフィー (size exclus ion chromatography)により精製される。ゲル濾過の担体としては、親水性ビュルポリ マーを基材としたものを好適に使用でき、例えば、 TOYOPEARL HW-50F (東ソ一社 製)などを使用できる。得られたマンナナーゼ含有画分は、集められて、適宜濃縮処 理されてょ 、。こうして得られたマンナナーゼ含有液を SDS-ポリアクリルアミドゲル電 気泳動にかけたところ、分子量約 39,000の単一バンドを示すことから、精製ァヮビ 'マ ンナナ一ゼは、十分に純品標品であり、その分子量は SDS-ポリアクリルアミドゲル電 気泳動より見て、 36kDa〜42 kDa程度であり、酵素は単一のポリペプチドよりなる分子 であると考えられる。該ァヮビ 'マンナナーゼのアミノ酸配列を解析した結果、 N末端 アミノ酸配列：配列表の配列番号: 3 (SEQ ID NO: 3)を有している。該酵素の内部領 域の部分アミノ酸配列としては、配列表の配列番号: 4〜6 (SEQ ID NO: 4〜6)に記載 の配列を有する。
該ァヮビ 'マンナナーゼ精製標品を使用しての酵素特性を調べた結果、次のような ものである：
至適 pHは、 6.5〜8.5、より好適には 6.8〜8.0であり、より具体的には、至適 pHは 7. 5付近である。
至適温度は、 35〜53°C、より好適には 40〜50°Cであり、より具体的には、至適温 度は約 45°Cである。 該ァヮビ 'マンナナーゼは、 pH 7.0においては 40°C30分間の加熱によっても 90% の活性が残存すると 、う熱安定性を有して 、る。
該酵素は、表 2に挙げられた試薬の添加で、表 2に示す相対活性 (%)を示す。すな わち、マンナナーゼの活性は Ag+によってほぼ 100%阻害され， Co2+, Fe2+, Cu2+によつ て 40〜50%阻害される。
該酵素の基質特異性は、ローカストビーンガム (Locust bean gum;ガラタトマンナ ン)、コンニヤク (Konjak)マンナン (グノレコマンナン)およびゾゥゲヤシ (ivory nut)マンナ ン (直鎖状 β -1,4-マンナン)に作用させた結果、それらはいずれも良く分解される（図 7)。し力し、キシラン、ァガロース、カルボキシメチルセルロース、デキストランは全く 分解しない。また、 Locust bean gumを基質とした際の Km値は約 0.8 mg/mlと見積られ るというものである。
ところで、ローカストビーンガムとはカロブ榭 (carob tree: Ceratonia siliaua)の糠子の 胚乳部分より製造される水溶性天然高分子多糖類で、主成分はガラタトマンナンで ある。
ゾゥゲヤシマンナン はゾゥゲヤシ (PhvteleDhas macrocaroa)の実より製诰される天 然多糖類で、主成分は直鎖状 j8 - 1,4-マンナンである。
ァヮビ ·マンナナ一ゼの比活¾は 11.5U/mgを得ることが可能（マンナナーゼ活 ¾は 、 5mg/mlの Locust bean gum (ガラクトマンナン)を含む lmlの 10 mM Na— phosphate (p H 7.0)中 30°Cで測定した力 マンナナーゼ作用により遊離した還元糖を Park-Johnso n法により定量するもので、 1分間の反応により 1 moleのマンノースに相当する還元 糖を生成する酵素量を 1 Uとした)。
本明細書において「ァヮビ 'マンナナーゼポリペプチド」（又はァヮビ 'マンナナーゼ タンパク質）とは、それぞれ既知のマンナナ一ゼとは相違するアミノ酸配列を有するも のであって、触媒活性領域 (ドメイン)及び Z又はマンナン結合領域 (ドメイン)を有し ているペプチドであって、本発明で開示されている新規なペプチドを指している。該 マンナナーゼは、少なくとも触媒領域 (ドメイン)を有しており、マンノース含有多糖を 分解する活性を示すと ヽうことを特徴として ヽる。上記した特徴的な領域 (ドメイン)の 全部あるいはその一部をその一体性を損なわない範囲で保有するものは、本発明で 意図するマンナナーゼの範囲内にあると考えてよい。本発明の代表的なァヮビ 'マン ナナーゼポリペプチドとしては、配列表の配列番号: 1(SEQ ID ΝΟ:1)あるいは配列番 号: 10(SEQ ID NO:10)の DNAでコードされて産生されるポリペプチド、例えば配列表 の配列番号: 2(SEQ ID NO:2)、配列番号: 9(SEQ ID NO:9)あるいは配列番号: 11(SEQ ID ΝΟ:11)のアミノ酸配列またはそれと実質的に同等なアミノ酸配列を有するポリべ プチド（トランケーシヨンミュータントを含む）が挙げられ、例えば、 SEQ ID NO:2のアミ ノ酸配列のうちの少なくとも 5〜377個 (あるいは 360〜377個又は 5〜358個)の連続した アミノ酸残基を有し且つ酵素活性あるいは同等の抗原性などといった実質的に同等 の生物学的活性を有するもの、あるいはそれらの特徴を有し且つ配列表の SEQ ID N 0:2に存在する各ドメインのいずれか一つと少なくとも 50%より高い相同性、あるいは 少なくとも 60%より高い相同性、あるいは少なくとも 70%より高い相同性、あるいは少なく とも 80%より高い相同性、あるいは少なくとも 90%より高い相同性、あるいは少なくとも 95 %以上の相同性、あるいは少なくとも 98%以上の相同性を有するものなどで、新規なも のが挙げられる。
本発明のァヮビ 'マンナナーゼポリペプチドとしては、 SEQ ID NO:2のアミノ酸配列 、 SEQ ID NO:9のアミノ酸配列又は SEQ ID NO: 11のアミノ酸配列の、全部又は一部 を含む連続したアミノ酸残基、あるいは該 SEQ ID NO:2, 9及び 11のアミノ酸配列のう ちの連続したアミノ酸残基 5個以上、好ましくは 10個以上、また好ましくは 20個以上、 さらに好ましくは 40個以上、より好ましくは 60個以上、また好ましくは 80個以上、さらに 好ましくは 100個以上、もっと好ましくは 120個以上、また好ましくは 140個以上、さらに 好ましくは 160個以上、もっとも好ましくは 180個以上、また好ましくは 200個以上を有 するものが挙げられる。本発明のァヮビ 'マンナナーゼ関連ポリペプチドとしては、 SE Q ID NO:2, 9及び 11力 成る群力 選ばれたアミノ酸配列の一部または全部を有し て!、てもよ 、（開始コドンに対応する Metを欠 、て 、てもよ 、)。こうした配列を有する ものは、トランケートされたポリペプチド（トランケーシヨンミュータント）を含めてすべて 包含されてよい。ァヮビ ·マンナナーゼのトランケーシヨンミュータントポリペプチドとし ては、（a) SEQ ID NO:9のアミノ酸配列のポリペプチドに関して、その N末端側より、 1 〜100個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチドからなるもの、 1〜50個 のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチドからなるもの、 1〜30個のァミノ 酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチド力 なるもの、 1〜25個のアミノ酸残基 を欠失せしめてある残りのポリペプチド力 なるもの、 1〜20個のアミノ酸残基を欠失 せしめてある残りのポリペプチド力もなるもの、 1〜15個のアミノ酸残基を欠失せしめ てある残りのポリペプチドからなるもの、 1〜10個のアミノ酸残基を欠失せしめてある 残りのポリペプチドからなるもの、あるいは、 1〜5個のアミノ酸残基を欠失せしめてあ る残りのポリペプチドからなるもの、並びに、 (b) SEQ ID NO:9のアミノ酸配列のポリべ プチドに関して、その C末端側より、 1〜100個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残り のポリペプチドからなるもの、 1〜50個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリべ プチドからなるもの、 1〜30個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチド 力 なるもの、 1〜25個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチド力 なる もの、 1〜20個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチドからなるもの、 1 〜15個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチドからなるもの、 1〜10個 のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチドからなるもの、あるいは、 1〜5 個のアミノ酸残基を欠失せしめてある残りのポリペプチドからなるものから選択された ものを包含してよい。
本発明では、「遺伝子組換え技術」 (又は「遺伝子工学的手法」とも ヽぅ)を利用して 所定の核酸を単離 ·配列決定したり、組換え体を作製したり、所定のペプチドを得る ことができる。本明細書中使用できる遺伝子組換え技術としては、当該分野で知られ たものが挙げられ、例えば】. Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Ma nual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2nd E dition, 1989; ISBN 0-87969-309-6 & 3rd Edition, 2001; ISBN 0-87969-577-3); Cur rent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. (updatable since 1987, Last updated: April, 2003; ISBN: 0—471— 50338— X); D. M. Glover et al. ed.， "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);日本生化学会編、「続生化学実験講座 1、遺伝子研究法 II」 、東京化学同人（1986);日本生化学会編、「新生化学実験講座 2、核酸 III (組換え D NA技術リ」、東京ィ匕学同人 (1992); Methods in Enzvmology series, Academic Pres s, New York,例えば R. Wu ed., ibid., Vol. 68 (Recombinant DNA), (1980); R. Wu e t al. ed., ibid., Vol. 100 (Recombinant DNA, Part B) & 101 (Recombinant DNA, Part
C), (1983); R. Wu et al. ed., ibid., Vol. 153 (Recombinant DNA, Part D), 154 (Reco mbinant DNA, Part E) & 155 (Recombinant DNA, Part F), (1987); J. H. Miller ed., i bid., Vol. 204, (1991); R. Wu ed., ibid., Vol. 216 (Recombinant DNA, Part G), (1992 ); R. Wu ed., ibid., Vol. 217 (Recombinant DNA, Part H) & 218 (Recombinant DNA,
Part I), (1993); P. M. Conn ed., ibid., Vol. 302 (Green Fluorescent Protein), (1999) ； S. Weissman ed., ibid., Vol. 303 (cDNA Preparation and Characterization), (1999);
Miriam M. Ziegler and Thomas O. Baldwin ed., ibid., Vol. 305 (Bioluminescence an d Chemiluminescence , Part C), (2000); Joseph C. Glorioso and Martin C. Schmidt e d., ibid., Vol. 306 (Expression of Recombinant Genes in Eukaryotic Systems), (1999) ； Jeremy Thorner, Scott D. Emr and John N. Abelson ed., ibid., Vol. 326 (Applicatio ns of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part A), Vol. 327 (Applications ofし hime ric Genes and Hybrid Proteins, Part B) & Vol. 328 (Applications of chimeric Genes and Hybrid Proteins, Part C), (2000); Christine Guthrie and Gerald R. Fink ed., ibid ., Vol. 350 (Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B) & Vol.
351 (Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part C), (2002); Dan
E. Robertson and Joseph P. Noel ed., ibid., Vol. 388 (Protein Engineering), (2004) などに記載の方法あるいはそこで引用された文献記載の方法あるいはそれらと実質 的に同様な方法や改変法が挙げられる（それらの中にある記載はそれを参照するこ とにより本明細書の開示に含められる)。
本明細書中、「相同性」とは、ポリペプチド配列（あるいはアミノ酸配列）又はポリヌク レオチド配列（あるいは塩基配列）における 2本の鎖の間で該鎖を構成している各アミ ノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるよ うなものの量 (数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配 列の間の配列相関性の程度を意味するものである。相同性は容易に算出することが できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の相同性を測定する方 法は数多く知られており、「相同性」（「同一性」とも言われる)なる用語は、当業者に は周知である（例えば、 Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford
University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H.
G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (
1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, Ne w York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M- St ockton Press, New York, (1991)等）。二つの配列の相同性を測定するのに用いる一 般的な方法には、 Martin, J. Bishop (Ed.), Guide to Huge Computers, Academic Pre ss, San Diego, (1994); Carillo, H. & Lipman, D" SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1
988)等に開示されているものが挙げられる力 これらに限定されるものではない。相 同性を測定するための好まし 、方法としては、試験する二つの配列間の最も大きな 適合関係部分を得るように設計したものが挙げられる。このような方法は、コンビユー タープログラムとして組み立てられているものが挙げられる。二つの配列間の相同性 を測定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、 GCGプログラムパッ ケージ (Devereux, J. et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984》、 BLAST (Ba sic Local Alignment Search Tool, Altschul S.F. et al., J. Mol. Biol. Vol. 215, pp. 40 3-410 (1990);例えば、 protein-protein BLAST (BLASTP), nucleotide-nucleotide BL AST (BLASTN), bl2seq program (v. 2.0.12); Tatusova TA and Madden TL.， FEMS Microbiol Lett., 174(2):247-50 (1999 May 15)など)、 FASTA (Atschul, S. F. et al" J.
Mol. Biol, 215: 403 (1990))等が挙げられる力 これらに限定されるものでなぐ当該 分野で公知の方法を使用することができる。
本明細書で用いる用語「ポリペプチド」としては、以下に記載するような如何なるポリ ペプチドを指すものであってもよい。ポリペプチドの基本的な構造は周知であり、当 該技術分野において非常に数多くの参考書及びその他の刊行物に記載がある。こう したことに鑑み、本明細書で用いる用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合又は修飾し たペプチド結合により互いに結合しているような 2個又はそれ以上のアミノ酸を含む 任意のペプチド又は任意のタンパク質を意味する。本明細書で用いる用語「ポリぺプ チド」としては、当該分野において、例えばペプチド、オリゴペプチドあるいはぺプチ ドオリゴマーとも称せられる短い鎖のもの、及びタンパク質と一般的に言われ、多くの 形態のものが知られて 、る長 、鎖のものの両方を通常意味してょ 、。ポリペプチドは 、しばしば、通常、天然型アミノ酸 (天然に存在しているアミノ酸：あるいは遺伝子でコ ードされるアミノ酸）と称されるアミノ酸以外のアミノ酸を含有していてもよい。ポリぺプ チドは、また末端アミノ酸残基を含めて、その多くのアミノ酸残基が翻訳された後にプ ロセッシング及びその他の改変（あるいは修飾）されるといった天然の工程によるのみ ならず、当業者に周知の化学的改変技術によっても、上記のポリペプチドはそれが 改変 (修飾)できることは理解されよう。該ポリペプチドに加えられる改変 (修飾）につ いては、多くの形態のものが知られており、それらは当該分野の基礎的な参考書及 びさらに詳細な論文並びに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業 者に周知である。幾つかのとりわけ常套的な改変 '修飾としては、例えばアルキルィ匕 、ァシル化、エステル化、アミド化、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、リン酸化、ダル タミン酸残基の γ -カルボキシル化、水酸化及び ADP-リボシル化等が挙げられ、例 Χ,ίί . Ε. し reighton, Proteins: structure and Molecular Properties, Second Edition, W. H. Freeman and Company, New York, (1992); B.C.Johnson (Ed.), Posttranslatio nal Covalent Modification of Proteins, Academic Press, New York, (1983); C hristoph er T. Walsh, Posttranslational Modifications of Proteins, Robert & Company Pub. (IS BN: 0-9747077-3-2); Seifter et al., "Analysis for Protein Modifications and nonprot ein cofactors , Methods in Enzymology, 182: 626-646 (1990); Rattan et al., "Protei n Synthesis, Posttranslational Modification and Aging", Ann. N. Y. Acad. Sci" 663: p.48-62 (1992)等の記載を参照できる。
本明細書中、「ポリメラーゼ'チェイン'リアクション (polymerase chain reaction)」又は 「PCR」とは、一般的に、所望のヌクレオチド配列をインビトロで酵素的に増幅するた めの方法を指している。一般に、 PCR法は、铸型核酸と優先的にハイブリダィズする ことのできる 2個のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、プライマー伸長合成を行 うようなサイクルを繰り返し行うことを含むものである。典型的には、 PCR法で用いられ るプライマーは、铸型内部の増幅されるべきヌクレオチド配列に対して相補的なブラ イマ一を使用することができ、例えば、該増幅されるべきヌクレオチド配列とその両端 にお 、て相補的である力、ある ヽは該増幅されるべきヌクレオチド配列に隣接して!/ヽ るものを好ましく使用することができる。 5'端側のプライマーとしては、少なくとも開始 コドンを含有する力、あるいは該開始コドンを含めて増幅できるように選択することが できるし、好ましい。また、 3'端側のプライマーとしては、少なくともターミネーシヨンコド ン (ストップコドン）を含有するか、あるいは該ターミネーシヨンコドンを含めて増幅でき るように選択することが好ましい。プライマーは、通常、 5個以上の塩基、好ましくは 10 個以上の塩基力 なるオリゴヌクレオチド、さらに好ましくは 15〜45個の塩基、より好 ましくは 18〜35個の塩基力 なるオリゴヌクレオチドが挙げられる。本 PCRには、逆転 与 Pし R (polymerase chain reaction coupled reverse transcription; RT— PCR), RACE、 cDNA末端の迅速増幅； rapid amplification of cDNA ends),逆 PCR (reverse PCR)な どの技術も含まれる。
PCR反応は、当該分野で公知の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変 法により行うことができるが、例えば R. Saiki, et al.， Science, 230: 1350, 1985; R. Sai ki, et al, Science, 239: 487 (1988); H. A. Erlich ed.， PCR Technology, Stockton Pr ess (1989); D. M. Glover et al. ed"〃DNA Cloning", 2nd ed" Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995); M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols: a guide to methods and applications , Academic Press, New York ( 1990)); M. J. McPherson, P. Quirke and G. R. Taylor (Ed.), "PCR: a practical appro ach", IRL Press, Oxford (1991); M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002 (1988);佐々木博己編集、実験医学別冊注目のバイオ実験シリーズ〔 ここまでできる PCR最新活用マニュアル〕、羊土社、 2003年 (ISBN 4-89706-412-0)な どに記載された方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法に従って行うことがで きる。また、 PCR法は、それに適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造 業者あるいはキット販売業者により明らかにされているプロトコルに従って実施するこ ともでき、 LA PCR (Long and Accurate PCR)(TAKARA BIO Inc.)ゝ Hot Start PCR法（ TAKARA BIO Inc.)も含まれる。
PCR反応は、代表的な場合には、例えば铸型 (例えば、 mRNAを铸型にして合成さ れた DNA; 1st strand DNA)と所定の遺伝子に基づいてデザインされたプライマーと を、 10 X反応緩衝液（DNAポリメラーゼに添付されている)、 dNTPs (デォキシヌクレオ シド三リン酸 dATP, dGTP, dCTP, dTTPの混合物）、 Taq DNA Polymerase, TaKaRa Ex Taq™, TaKaRa LA Taq™, Pyrobest™ DNA Polymerase (TAKARA BIO Inc.)など カゝら選択された DNAポリメラーゼ及び脱イオン蒸留水と混合する。混合物を、例えば 、 Applied Biosystems 9800 Fastサーマルサイクラ一、 GeneAmp™ 9700 PCR system や GeneAmp™ 2400 PCR system (Applied Biosystems社)などの自動サーマルサイク ラーを用いて一般的な PCRサイクル条件下にそのサイクルを 25〜60回繰り返すが、 増幅のためのサイクル数は適宜目的に応じて適当な回数とすることができる。 PCRサ イタル条件としては、例えば、変性 90〜95°C 5〜100秒、アニーリング 40〜60°C 5〜1 50秒、伸長 65〜75°C 30〜300秒のサイクル、好ましくは変性 94°C 15秒、ァニーリン グ 58°C 15秒、伸長 72°C 45秒のサイクルが挙げられる力 アニーリングの反応温度 及び時間は適宜実験によって適当な値を選択できるし、変性反応及び伸長反応の 時間も、予想される PCR産物の鎖長に応じて適当な値を選択できる。アニーリングの 反応温度は、通常プライマーと铸型 DNAとのハイブリッドの Tm値に応じて変えること が好ましい。伸長反応の時間は、通常 1000bpの鎖長当たり 1分程度がおおよその目 安であるが、より短い時間を選択することも場合により可能である。
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短い一本鎖又は二本鎖のポリヌクレ ォチドで、好ましくはポリデォキシヌクレオチドが挙げられる。オリゴヌクレオチドを含 めたポリヌクレオチド（又は核酸）は、 David M.J. Lilley and James E. Dahlberg ed.， " Methods in Enzymology", Vol. 211 (DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA), Academic Press, New York (1992, ISBN: 0-12-182112-9) (M. H. Caruthers, G. Beaton, J. V. Wu and W. Wiesler, "Chemical synthesis of deoxyoligo nucleotides and deoxyoligonucleotide analogs , pp. 3—20など)に記載された既知の 方法、例えば、フォスフォトリエステル法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5956 (1984) )、フォスフォジエステル法、フォスファイト法、フォスフォアミダイト法 (Nucleic Acid Res. , 12: 4539 (1984》、フォスフォネート法 (Nucleic Acid Res., 14: 5399 (1986》などの方 法により化学合成されることができる。通常合成は、修飾された固体支持体上で合成 を便利に行うことができることが知られており、例えば、 自動化された合成装置を用い て行うことができ、該装置は市販されており、例えば、 Applied Biosystems 3400 DNA 合成機、 ABI 3900ハイスループット核酸合成機 (Applied Biosystems社)、 H- 8 DNA 合成装置 (和光純薬工業)などが挙げられる。該オリゴヌクレオチドは、一つ又はそれ 以上の修飾された塩基を含有していてよぐ例えば、イノシンなどの天然においては 普通でな!/、塩基あるいはトリチルイ匕された塩基などを含有して 、てよ 、し、場合によ つては、マーカーの付された塩基を含有していてよい。本発明のオリゴヌクレオチドは 、オリゴ DNA、オリゴ RNA等のオリゴヌクレオチド、および該オリゴヌクレオチドの誘導 体 (誘導体オリゴヌクレオチド)等が包含されてよ ヽ。
[0022] ハイブリダィゼーシヨン技術は、相補的な一本鎖の核酸をノヽイブリダィズさせること 及びそれを利用するもので、所定の核酸を同定したり、単離したり、鎖の長さや核酸 の量を解析したり、所定遺伝子の解析、遺伝子制御についての情報取得などをする のに利用することができる。該ハイブリダィゼーシヨンは、上記「遺伝子組換え技術」 を開示する文献記載の方法あるいはそれと実質的に同様な方法や改変法により行う こと力 eさ、 [列 は、 J. Sambrook et al., "Molecularし loning: A Laooratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2nd Edition, 1989 & 3rd Edition, 2001)などに記載されている方法に準じて行うことができる。典型 的なノ、イブリダィゼーシヨン利用技術としては、サザンブロティング、ノーザンブロティ ング、ドット Zスロットブロティング、コロニー Zプラークブロティング、 in situハイブリダ ィゼーシヨン、 DNAアレイを含めたマイクロアレイなどが挙げられる。代表的な手法で は、例えば、ハイブリダィゼーシヨンは、 DNA, RNAなどの核酸を含有しているサンプ ルをナイロンフィルター、ニトロセルロースフィルターなどの膜を含めた担体に転写せ しめ、必要に応じ変成処理、固定化処理、洗浄処理などを施した後、その担体 (例え ば、膜など）に転写せしめられたものを、必要に応じ変成させた標識プローブ DNA断 片と、ハイブリダィゼーシヨン用緩衝液中で反応させて行われる。
[0023] ハイブリダィゼーシヨン処理は、普通約 35〜約 80°C、より好適には約 50〜約 65°Cで 、約 15分間〜約 36時間、より好適には約 1〜約 24時間行われる力 適宜最適な条件 を選択して行うことができる。例えば、ハイブリダィゼーシヨン処理は、約 55°Cで約 18 時間行われる。ノ、イブリダィゼーシヨン用緩衝液としては、当該分野で普通に使用さ れるものの中から選んで用いることができ、例えば、 Rapid-hyb Hybridization Buffer ( Amersham Biosciences社)などを用いることができる。転写した担体（例えば、ポジテ イブチャージナイロンメンブレンなど）の変成処理としては、アルカリ変性液を使用す る方法が挙げられ、その処理後中和液や緩衝液で処理するのが好ましい。また担体 (例えば、膜など）の固定ィ匕処理としては、固定ィ匕法としては、例えば、 UV法、アル力 リ法、ベーキング法などが挙げられる。 UV法では、 UVクロスリンカ一などを使用でき、 ブロットした面を UV照射する。アルカリ法では、 0.4 N NaOH溶液に浸したろ紙などの 上に、ブロットしたメンブレンの面を置き、 1〜10分処理するなどし、処理後は十分な 中性バッファー（2 X SSCなど）でメンブレンを洗浄して中性にする。ベーキング法では 、普通約 40〜約 100°C、より好適には約 70〜約 90°Cで、約 15分間〜約 24時間、より好 適には約 1〜約 4時間べ一キングすることにより行われる力 適宜好ましい条件を選択 して行うことができる。例えば、フィルター、メンブレンなどの担体をろ紙で軽くはさみ、 約 80°Cのオーブンで 30分〜 2時間インキュベートするなどで固定ィヒが行われる。転写 した担体 (例えば、膜など)の洗浄処理としては、当該分野で普通に使用される洗浄 液、例えば 1M NaCl、 ImM EDTAおよび 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS)含有 50m M Tris-HCl緩衝液， pH8.0などで洗うことにより行うことができる。ナイロンフィルター などの膜を含めた担体としては、当該分野で普通に使用されるものの中から選んで 用いることができ、例えば、 Hybond- N+ (Amersham Biosciences社)などのメンブレン などが挙げられる。
上記アルカリ変性液、中和液、緩衝液としては、当該分野で普通に使用されるもの の中力も選んで用いることができ、アルカリ変性液としては、例えば、 0.5M NaOHおよ び 1.5M NaClを含有する液などを挙げることができ、中和液としては、例えば、 1.5M N aCl含有 0.5M Tris-HCl緩衝液， pH8.0などを挙げることができ、緩衝液としては、例え ば、 2 X SSPE (0.36M NaCl, 20mM NaH POおよび 2mM EDTA)などを挙げることがで
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きる。またノヽイブリダィゼーシヨン処理に先立ち、非特異的なハイブリダィゼーシヨン 反応を防ぐために、必要に応じて転写した担体 (例えば、膜など）はプレハイブリダィ ゼーシヨン処理することが好ましい。このプレハイブリダィゼーシヨン処理は、例えば、 プレハイブリダィゼーシヨン溶液〔50% formamide、 5 X Denhardt's溶液（0.2 %ゥシ血 清アルブミン、 0.2 % polyvinyl pyrrolidone)、 5 X SSPE、 0.1% SDSゝ 100 μ g/ml熱変 性サケ精子 DNA〕などに浸し、約 35〜約 50°C、好ましくは約 42°Cで、約 4〜約 24時間 、好ましくは約 6〜約 8時間反応させることにより行うことができる力 こうした条件は当 業者であれば適宜実験を繰り返し、より好ましい条件を決めることができる。ハイプリ ダイゼーシヨンに用いる標識プローブ DNA断片の変性は、例えば、約 70〜約 100 °C 、好ましくは約 100 °Cで、約 1〜約 60分間、好ましくは約 5分間加熱するなどして行う ことができる。
[0025] ノ、イブリダィゼーシヨン完了後、フィルターなどの担体を十分に洗浄処理し、特異的 なノ、イブリダィゼーシヨン反応をした DNA断片以外の核酸を取り除くなどして力 検 出処理をすることができる。例えば、メンブレンなどを十分に洗浄処理し、特異的なハ イブリダィゼーシヨン反応をした標識プローブ DNA断片以外の標識プローブを取り除 くなどされる。フィルターなどの担体の洗浄処理は、当該分野で普通に使用されるも のの中力 選んで用いて行うことができ、例えば、 0.1% SDS含有 0.5 X SSC (0.15M N aCl、 15mMクェン酸)溶液などで洗うことにより実施できる。
ノ、イブリダィゼーシヨンは、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で行うこ とができる力 本明細書でストリンジェントな条件とは、例えばナトリウム濃度に関し、 約 15〜約 50mM、好ましくは約 19〜約 40mM、より好ましくは約 19〜約 20mMで、温度 については約 35〜約 85°C、好ましくは約 50〜約 70°C、より好ましくは約 60〜約 65°Cの 条件を示す。例えば、ストリンジェントな条件のハイブリダィゼーシヨンとは、 DNAを固 定したフィルターを使用し、 0.7〜1.0mol/Lの塩ィ匕ナトリウム存在下、約 65°Cで核酸鎖 を互いに反応させた後、（0.1〜2) X SSC溶液(l X SSC液=150mmol/L NaCl及び 15mm ol/Lクェン酸ナトリウム含有水溶液)を用いて、約 65°Cで当該フィルターを洗浄処理す ることを含むものであってよ 、。
[0026] ノ、イブリダィズした核酸は、代表的にはオートラジオグラフィ一により検出することが できるが、当該分野で用いられる方法の中から適宜適切な手法を選択して検出など される。プローブとしては、 DNA、オリゴ DNA、 RNAなどを好適に使用でき、 [ α -32Ρ]な どの放射性同位体 (RI)標識化合物（例えば、 redivue [ a -32P]dCTP (Amersham Biosci ences社）など）、而熱性アルカリフォスファターゼ (AP)、西洋ヮサビペルォキシダーゼ ( HRP)、フルォレセイン (FI)標識ヌクレオチド (例えば、 FI標識 dUTPなど）、ピオチン一 アビジン系標識ヌクレオチド、ジゴキシン標識ヌクレオチドなどを使用して標識するこ とができる力 これらには限定されず、当該分野で知られたものあるいはその改変体 を選択して使用することもできる。標識方法としては、直接標識、間接標識、 3'-末端 標識 (ターミナル'デォキシヌクレオチジル 'トランスフェラーゼ (TdT)などを使用する)、 5'-末端標識 (T4ポリヌクレオチド 'キナーゼなどを使用する)、ランダムプライム法、二 ックトランスレーション法、 RNAトランスクリプション法（RNAポリメラーゼなどを使用する )などが挙げられるが、当該分野で知られたものあるいはその改変法などを制限なく 適用できる。
検出したシグナルに相当する核酸バンドは、必要であれば、適切な緩衝液、例えば 、 SM溶液 (lOOmM NaClおよび 10mM MgSO含有 50mM Tris- HC1緩衝液、 pH7.5)な
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どに懸濁し、ついでこの懸濁液を適度に希釈するなどして、それから所定の核酸を単 離-精製したり、そしてさらなる増幅処理にかけることができる。
本明細書において、得られた PCR産物などの核酸 (DNAを含む)は、通常 1〜2%ァガ ロースゲル電気泳動にかけて、特異なバンドとしてゲル力も切り出し、例えば、 SUPRE C™-EZ (タカラバイオ (株》などの市販の抽出キットを用いて抽出する。抽出された DN Aは適当な制限酵素で切断処理されることができ、必要に応じ精製処理したり、さら には必要に応じ 5 '末端を T4ポリヌクレオチド ·キナーゼなどによりリン酸化した後、 pU C18などの pUC系ベクターといった適当なプラスミドベクターにライゲーシヨンし、適当 なコンビテント細胞を形質転換する。クローユングされた PCR産物はその塩基配列を 解析される。 PCR産物のクローニングには、例えば、 p-Direct (Clontech社)， pCR-Sc ript™ SK (+) (Stratagene社)， pGEM— T (Promega社)， pAmp™ (Gibco— BRL社)などの 市販のプラスミドベクターを用いることが出来る。宿主細胞の形質転換は、宿主形質 転換可能な手法であれば制限なく適用できるが、当該分野で知られた方法あるいは それと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばファージベクターを使用したり、 カルシウム法、ルビジウム Zカルシウム法、カルシウム Zマンガン法、 TFB高効率法 、 FSB凍結コンビテント細胞法、迅速コロニー法、エレクト口ポレーシヨンなどで行うこ とができる（D. Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557, 1983など）。 目的とする DNAを単離 '取得するためには、 RT- PCR, 3'- RACE, 5'- RACEを適用することが出来る。 RACE は、例えば、 M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols" (M. A. Frohman, "a guide to m ethods and applicationsつ, pp.28— 38, Academic Press, New York (1990)などに，己 れた方法に従って行うことができる。
[0028] 所定の核酸を保有する、ファージ粒子、組換えプラスミド、ファージミド、組換えべク ターなどは、当該分野で普通に使用される方法でそれを精製分離することができ、例 えば、グリセロールグラジェント超遠心分離法 (T. Maniatis et al. ed., "Molecular Clo ning, a laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd ed. 78, 1989)、電 気泳動法などにより精製することができる。ファージ粒子など力もは、当該分野で普 通に使用される方法で DNAを精製分離することができ、例えば、得られたファージな どを TM溶液（10mM MgSO含有 50mM Tris- HC1緩衝液、 pH7.8)などに懸濁し、 DNa
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se Iおよび RNase Aなどで処理後、 20mM EDTA、 50 μ g/ml Proteinase K及び 0.5 %S DS混合液などを加え、約 65°C、約 1時間保温した後、これをフエノール抽出ジェチル エーテル抽出後、エタノール沈殿により DNAを沈殿させ、次に得られた DNAを 70% エタノールで洗浄後乾燥し、 TE溶液（10mM EDTA含有 10mM Tris-HCl緩衝液、 pH 8.0)に溶解するなどして得られる。
[0029] 本発明の標的酵素のポリペプチドのアミノ酸配列解析より得られた情報を基にして 適当なプライマー (又はプローブ)を設計し、前記プライマー (又はプローブ)と、 目的と する生物〔例えば、軟体動物（例えば、ァヮビなど)〕由来の試料 (例えば、総 RNA若し くは poly(A)+ RNA画分 (mRNA画分)、 cDNAライブラリー、又はファージライブラリー）と を用いて PCR又はノ、イブリダィゼーシヨン法を実施することにより、ポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチドを取得することができるし、さらに、そのポリヌクレオチドを適当 な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、例えば、実施例 1に記載の方 法により、マンナナーゼ活性を示すことを確認することにより、所望のポリペプチドを 取得することができる。ー且、本発明の標的酵素ポリペプチドのアミノ酸配列の情報 及び Z又は当該酵素ポリペプチドをコードする核酸 (又はポリヌクレオチド)の塩基配 列の情報が得られたなら、該情報を基にして適当なプライマー又はプローブを設計し 、前記プライマー又はプローブを利用し、例えば、（l)PCRを用いた方法、（2)常法の 遺伝子組換え技術を用いる方法 (すなわち、 cDNAライブラリーで形質転換した形質 転換株から、所望の cDNAを含む形質転換株を選択する方法)、又は (3)化学合成法 などで該核酸 (又はポリヌクレオチド)を製造することができるが、該製造方法は、特に それに限定されるものではない。一つの具体的な態様では、標的とする所定の塩基 配列からなる DNAがー且取得され、その塩基配列が決定された後は、該塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に基づいたプライマー (縮重プライマーを含む)を調製し 、当該軟体動物の組織または細胞に含まれる mRNA力 合成した cDNAあるいは cDN Aライブラリーを用いて DNAの増幅を行うことにより、該標的 DNAを取得することがで きる。また、標的の所定塩基配列よりなる DNAの全長あるいは一部をプローブとして、 軟体動物の組織または細胞に含まれる mRNA力も合成した cDNAあるいは cDNAライ ブラリーに対してコロニーハイブリダィゼーシヨンやプラークハイブリダィゼーシヨンを 行うことにより、該標的 DNAを取得することができる。決定された DNAの塩基配列に基 づいて、ホスフォアミダイト法などを利用して合成でき、例えば、 ABI 3900ハイスルー プット核酸合成機 (Applied Biosystems社)等の DNA合成機でィ匕学合成することにより 、該標的 DNAを取得することもできる。
本発明の DNAの調製は、 mRNAから製造することができる。 mRNAは、市販のもの（ 例えば、 Stratagene社， Invitrogen社， Clontech社など）を用いてもよいし、組織（例え ば、肝臓、脾臓など)又は細胞カゝら調製 (精製)してもよい。組織又は細胞力ゝら全 RNA を調製する方法としては、グァ-ジン ' HC1法、チォシアン酸グァ-ジン (イソチオシァ ン酸グァ-ジン）法、チォシアン酸グァ-ジン一塩化セシウム遠心法、チォシアン酸 グァ-ジン.ホット.フエノール法 [Methods in Enzymology, 152, 215-261 (1987)〕、チ オシアン酸グァ-ジン トリフルォロ酢酸セシウム法 [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)〕、酸性チォシアン酸グァ-ジン'フエノール'クロロフオルム (acid guanidinium thiocyanate- phenol/ cnloroform; AuPC ¾fe L Analytical Biochemistry, 162, 15り— 159 ( 1987)、村松正實及び山本雅編、実験医学別冊 (改訂第 4版)〔新遺伝子工学ハンドブ ック〕、 pp.20- 23及び pp.32- 34、羊土社 (2003)〕等が挙げられる。また、全 RNA力 pol y(A)+ RNAとして mRNAを調製する方法としては、オリゴ (dT)固定化セルロースカラム 法 (J. Samorook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 2nd Edition, し ol d Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989; ISBN 0-87 969-309-6))等が挙げられる。所望により、ショ糖密度勾配遠心法等により mRNAを更 に分画することもできる。さらに、市販のキット、例えば、 TRIzol Reagent (Invitrogen C orp.社)、 Concert RNA Purification Products, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invi trogen社）、 QuickPrep Total RNA Extraction Kit及び RNA Extraction Kit (Amersha m Biosciences社）、 EASYPrep RNAゝ Oligotex™- dT30く Super〉、 Oligotex™- dT30 <S uper〉 mRNA Purification Kit及び Oligotex™- MAG mRNA Purification Kit (TAKARA
BIO Inc.)ゝ ISOGEN及び Poly(A)+ Isolation Kit from Total RNA (-ツボン.ジーン (株） )等を用いることにより mRNAを調製できる。また、 mRNAを抽出しなくても、市販されて V、る抽出精製済みの mRNAを用いることもできる。
調製した組織 mRNA又は細胞 mRNAから cDNAあるいは cDNAライブラリーを作製す る。調製された poly(A)+ RNA画分を、例えば、ランダムプライマー、オリゴ dTプライマ 一、及び Z又はカスタム合成したプライマーの存在下で、逆転写酵素 (reverse transc riptase)反応を行ない、ファーストストランド cDNAを合成する。この合成は、常法によつ て行なうことができるし、市販のキット、例えば、 Marathon™ cDNA Amplification Kit ( Clontech社)、 GeneRacer™ Kit (Invitrogen社)などを使用して合成できる。 cDNA作製 法としては、例えば、好適にデザインされたオリゴ dTプライマー存在下、 dNTPs及び その他の試薬を含有している反応用混合物中で、铸型 poly(A)+ RNAを AMV Rrevers e Transcriptaseでもって逆転写することで DNAファーストストランド合成ができる。得ら れた DNA:RNAハイブリッドを铸型に、セカンドストランド合成がなされる。該セカンドス トランド合成は、 dNTPs及びその他の試薬を含有している反応用混合物中で、前記フ アーストストランド合成で得られた DNA:RNAノヽイブリツド含有液にセカンドストランド合 成酵素カクテル (例えば、大腸菌 DNAポリメラーゼ I、大腸菌 DNAリガーゼ、大腸菌 RN ase Hを含有している）を反応させて、セカンドストランド cDNAを合成し、その後 T4 DN Aポリメラーゼを作用させて ds cDNAにブラントエンドを作る。ブラントエンド化された ds cDNAには、 T4 DNAリガーゼの作用で、以下の RACEにおいて好適なようにデザィ ンされたアダプターを付カ卩（ライゲーシヨン)せしめる。得られたアダプターがライゲー シヨンされた cDNAを铸型に、標的酵素ポリペプチドのアミノ酸配列（代表的には部分 アミノ酸配列）の情報を基にして設計されたプライマー及び該アダプターにハイブリダ イス可能なプライマーを使用して、 RACE PCRを行なって、 5'cDNA断片及び 3'cDNA 断片を作製する。プライマーは縮重プライマーを好適に使用できる。 5'cDNA断片は 、 5'- RACE PCRにより得られた 5'- RACE産物の特性決定により、 3'cDNA断片は、 3'- RACE PCRにより得られた 3'-RACE産物の特性決定により、それぞれ確認でき、その 配列解析の結果に基づき、クローユングにより全長 cDNAを作製できる。所望により、 前記 DNAを制限酵素等で切断し、接続することによって目的とする DNA断片を得るこ ともできる。また、ゲノム DNAから目的とする DNA断片を得ることもできる。
cDNAライブラリ一作製法としては、例えば、 J. Sambrook et al.， "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2nd Edition, 1989; ISBN 0-87969-309-6 & 3rd Edition, 2001; ISBN 0-87 969- 577- 3)等に記載された方法、あるいは市販のキット、例えば Superscript™ Plasmi d System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (with Gateway Technology) (Inv itrogen Corp.社)、 TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Amersham Biosciences社)、 cDNA Synthesis Kit (ZAP- cDNA Synthesis Kit) (Stratagene社)、 cDNA Library Construe tion Kit (TAKARA BIO In )を用いる方法等が挙げられる。
cDNAライブラリーを作製するためのクローユングベクターとしては、大腸菌 K12株中 で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも 使用できる。具体的には、 Uni-ZAP™ XR, ZAP Express™及び HybriZAP™ 2.1 vecto rs [Stratagene社〕、 pBluescript II SK (+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)〕、 λ DASH™IU λ FIX™IU λ EMBL3, λ ΖΑΡ™Π (Stratagene社）、 gtl0、 gtl l、 X T riplEx2(BDバイオサイエンス 'クロンテック (Clontech)社）、 pcD2〔Mol. Cell. Biol, 3, 2 80 (1983)〕および pUC18〔Gene, 33, 103 (1985)〕等を挙げることができる。
宿主微生物としては、大腸菌 (Escherichia coli: E. coli)に属する微生物であればい ずれのものでも用いることができる力 通常は Ε^ £2ΐί K12株又はそれ由来のものであ る。具体的には、 coH XL1- Blue MRF' [Stratagene社、 Strategies, 5, 81 (1992)〕、 coH C600 [Genetics, 39, 440 (1954) 1、 E. coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)〕 、 E. coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)〕、 E. coli NM522 [J. Mol. Biol., 166, 1 (1 983) ] , K coH Κ802 [J. Mol. Biol., 16, 118 (1966) ] , K coH JM105 [Gene, 38, 275 ( 1985)〕等が用いられる。
解析用 cDNAライブラリ一としては、そのまま使用してもよいが、不完全長 cDNAの割 合を下げ、なるべく完全長 cDNAを効率よく取得するために、菅野らが開発したオリゴ キャップ法〔Gene, 138, 171, (1994)、 Gene, 200, 149 (1997)、蛋白質核酸酵素， 41, 603 (1996)、実験医学， 11, 2491 (1993)、 cDNAクローニング，羊土社（1996)、遺伝子 ライブラリーの作製法，羊土社（1994)〕を用いて調製した cDNAライブラリーを用いて ちょい。
本発明の標的酵素をコードしているポリヌクレオチド (核酸)の取得は、標的タンパク 質のアミノ酸配列の解析により解明された部分アミノ酸配列（あるいは標的ポリヌクレ ォチド (核酸)の塩基配列）を基に、プライマーを設計し、上記のようにして取得した一 本鎖 cDNAまたは cDNAライブラリーを铸型として PCRを行うことで達成できる。プライ マーは縮重プライマーであってもよい。代表的なプライマーは、例えば、標的 mRNA の一部の塩基配列において、 5'末端側の塩基配列に相当するセンスプライマー及び 3'末端側の塩基配列に相当するアンチセンスプライマー（アンチセンスオリゴヌクレオ チド)等を挙げることができる（mRNAにおいてゥラシルに相当する塩基は、オリゴヌク レオチドプライマ一にお ヽてはチミジンとなる）。センスプライマーおよびアンチセンス プライマーとしては、両者の融解温度 (Tm)および塩基数が極端に変わることのな ヽォ リゴヌクレオチドで、 5〜60塩基、好ましくは 10〜50塩基数のものが挙げられる。誘導 体オリゴヌクレオチドとしては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフ ォロチォエート結合に交換されたもの、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合 が Ν3'-Ρ5'ホスフォアミデート結合に変換されたもの、オリゴヌクレオチド中のリポース とリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたもの、オリゴヌクレオチド中 のゥラシルカ C-5プロピ-ルゥラシルで置換されたもの、オリゴヌクレオチド中のゥラシ ルカ C-5チアゾールゥラシルで置換されたもの、オリゴヌクレオチド中のシトシン力 C- 5プロピ-ルシトシンで置換されたもの、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジ ン修飾シトシン（phenoxazine-modified cytosine)で置換されたもの、オリゴヌクレオチ ド中のリボースが 2'-メトキシエトキシリボースで置換されたもの等が挙げられる〔細胞 工学， 16, 1463 (1997)〕。
[0034] 増幅断片が得られた場合、該断片を適当なプラスミドにサブクローユングする。サブ クロー-ングは、増幅断片をそのまま、あるいは制限酵素や DNAポリメラーゼで処理 後、常法によりベクターに組込むことにより行うことができる。例えばサブクローユング は、宿主として大腸菌を用いプラスミドベクターなどを用いて行うことができる。ベクタ ~~としては、 pBluescnpt SK、— ) (Stratagene社)、 pBluescnpt II SK(+) ( tratagene社)、 pDIRECT [Nucleic Acids Research, 18, 6069 (1990)〕、 pPCR— Script™ Amp SK (+) (S tratagene社)、 pPCR- Script Cam SK (+) (Stratagene社)、 pT7Blue (Novagen社)、 pE TBlue-1 Blunt (Novagen社)、 pSTBlue- 1 Blunt (Novagen社)、 pCRII (Invitrogen社）、 pCR- TRAP(GeneHunter社）等を挙げることができる。 PCR増幅断片は、市販のキット 、例えば PCR— Script™ Amp Cloning Kit (Stratagene社）、 pCMV— Script™ PCR Cloni ng Kit (Stratagene社)、 Seamless Cloning Kit (Stratagene社)、 TaKaRa LA PCR™ i n vitro Cloning Kit (TAKARA BIO Inc.)ゝ TaKaRa LA PCR™ Kit Ver.2.1 (TAKARA BIO In )等を使用してクローユングなどをしてよい。標的 DNAは、サブクロー-ングな どにより大量に得ることも可能であり、サブクローユングにより得られた DNAも、上記と 同様にして遠心分離、電気泳動、フエノール抽出、エタノール沈殿などの方法により 精製分離できる。遺伝子ライブラリーや cDNAライブラリーなどを含めた核酸サンプル 力も目的核酸をスクリーニングする処理は、ノ、イブリダィゼーシヨン処理などを利用す ることにより繰り返して行うことができる。 DNAは、必要に応じてクローユングでき、例え ば、プラスミド、 λファージ、コスミド、 P1ファージ、 F因子、 YACなども利用できる。
[0035] 塩基配列の決定は、ダイデォキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977) 〕、例えば M13ダイデォキシ法など、 Maxam- Gilbert法などを用いて行うことができるが 、市販のシークェンシングキット、例えば Taqダイプライマーサイクルシークェンシング キットなどを用いたり、自動塩基配列決定装置、例えば蛍光 DNAシーケンサー装置（ ABI PRISM™ 377 DNAシークェンサ一（PE/Applied Biosystems社）等)などを用いて 行うことができる。得られた塩基配列をアミノ酸配列に翻訳することにより、この DNAが コードするポリペプチドのアミノ酸配列を得ることができる。得られた塩基配列を GenB ank™、 EMBL等の塩基配列データベース中の塩基配列と BLAST、 FASTA等の相同 性解析プログラムを用いて比較することにより、得られた塩基配列が新規な塩基配列 かどうか、また得られた塩基配列と相同性をもつ塩基配列を検索することができる。ま た塩基配列より得られたアミノ酸配列を SwissProt、 PIR、 GenPept等のアミノ酸配列デ ータベースと比較することにより、その塩基配列がコードするポリペプチドと相同性を もつポリペプチド、例えばァヮビとは別の生物種での相当する遺伝子に由来するポリ ペプチドや同じような活性や機能をもっと推定されるファミリータンパク質を検索する ことができる。
[0036] 本発明の当該マンナナーゼ又はポリペプチドをコードする核酸は、代表的には配 列表の SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:9あるいは SEQ ID NO:10で表されるペプチド及び その一部の連続したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するもの、例えば、配 列表の SEQ ID NO:l、 SEQ ID NO:3、 SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:7あるいは SEQ ID NO:9で表される塩基配列の少なくともペプチドコード領域により構成される塩基配列 を含有するもの（各特徴的なドメインのみをコードするもの及びトランケーシヨンミュー タントをコードするものも包含する）、コード配列に開始コドン (Metをコードするコドン） 及びターミネーシヨンコドン（終止コドン)を付加したもの、また、該塩基配列がコード するタンパク質と少なくとも 50%の相同性を有するアミノ酸配列を持ち且つ SEQ ID N 0:2、 SEQ ID NO:9あるいは SEQ ID NO:llのアミノ酸配列のうちの少なくとも特徴的 な連続したアミノ酸残基を有し、尚且つ酵素活性あるいは同等の抗原性などのそれと 実質的に同等の生物学的活性を有するペプチドをコードするといつたそれと同効の 塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよ 、。当該コードする核酸 (ポリヌクレオチド）は、上記したァヮビ 'マンナナーゼポリペプチド（又はァヮビ 'マン ナナーゼタンパク質）（トランケーシヨンミュータントを含む）をコードするものであり、例 えば、 SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、 SEQ ID NO:9のアミノ酸配列又は SEQ ID ΝΟ:1 1のアミノ酸配列の、全部又は一部を含む連続したアミノ酸残基をコードするものなど (トランケーシヨンミュータントをコードするものも含められる）が挙げられる。該コードす る核酸 (ポリヌクレオチド）は、それを発現させる場合の宿主細胞に応じて、使用コドン を当該宿主細胞に適したコドンに置き換えられているものも含められてよい。
[0037] 本明細書にぉ 、て、核酸（又はポリヌクレオチド)は、一本鎖 DNA、二本鎖 DNA、 RN A、 DNA:RNAハイブリッド、合成 DNAなどであり、またゲノム DNA、ゲノミック DNAライ ブラリー、軟体動物組織'細胞由来の cDNA、合成 cDNA、合成 RNAのいずれであつ てもよい。核酸の塩基配列は、修飾 (例えば、付加、除去、置換など)されることもでき 、そうした修飾されたものも包含されてよい。核酸は、本発明で記載するペプチドある いはその一部をコードするものであってよぐ好ましいものとしては DNAが挙げられる 。また核酸は、対象ポリペプチド (タンパク質）、例えばァヮビ 'マンナナーゼ酵素、あ るいはその部分配列と同等の抗原性などのそれと実質的に同等の生物学的活性を 有するペプチド (それと実質的に同一のアミノ酸配列を含有するものを含むし、それと 高 、相同性又は同一性を有するものも含まれてょ 、）をコードすると 、つたそれと同 効の塩基配列を含有するものであれば如何なるものであってもよい。本明細書で「高 い相同性」といった場合、当該対象配列の長さにもよる力 例えば 50%以上、さらには 60%以上、好ましくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上、あるいは 90%以上、そして特 定の場合には 95%以上で、特に好ましくは 97%以上であってよい。該「同効の塩基配 列」とは、例えばストリンジ工ントな条件で興味のある配列を有するものにハイブリダィ ズするものであってよぐ例えば当該塩基配列のうちの連続した 5個以上の塩基配列 、好ましくは 10個以上の塩基配列、より好ましくは 15個以上の塩基配列、さらに好まし くは 20個以上 (ある場合には 30個以上又は 40個以上）、さらに 45個以上 (ある場合に は 50個以上又は 60個以上）の塩基配列とハイブリダィズし、当該ポリペプチドと実質 的に同等のアミノ酸配列をコードするものなどが挙げられる。核酸は、化学合成によ つて得ることも可能である。その場合断片をィ匕学合成し、それらを酵素により結合する ことによってもよ ヽ。
本発明に係わる遺伝子の塩基配列を基に遺伝子工学的に常用される方法を用い ることにより、所定のポリペプチドのアミノ酸配列中に適宜、 1個ないし複数個（例えば 、 1〜10個あるいは 1〜5個）以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付カロ したごとき変異を導入した相当するポリペプチドを製造することができる。こうした変異 •変換'修飾法としては、例えば日本生化学会編、「続生化学実験講座 1、遺伝子研 究法 II」、 pl05 (広瀬進)、東京化学同人 (1986); 日本生化学会編、「新生化学実験 講座 2、核酸 III (組換え DNA技術)」、 p233 (広瀬進）、東京化学同人 (1992); R. Wu, L. Grossman, ed. , "Methods in Enzymology", Vol. 154, p. 350 & p. 367, Academic Press, New York (1987); R. Wu, L. Grossman, ed., "Methods in Enzymology", Vol. 100, p. 457 & p. 468, Academic Press, New York (1983); J. A. Wells et al., Gene, 3 4: 315, 1985; T. Grundstroem et al" Nucleic Acids Res. , 13: 3305, 1985; J. Taylor et al" Nucleic Acids Res., 13: 8765, 1985; R. Wu ed., "Methods in Enzymology", V ol. 155, p. 568, Academic Press, New York (1987); A. R. Oliphant et al" Gene, 44: 177, 1986などに記載の方法が挙げられる。例えば合成オリゴヌクレオチドなどを利 用する位置指定変異導入法 (部位特異的変異導入法） (Zoller et al , Nucl. Acids Re s" 10: 6487, 1987; Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 , 1986),カセット変異導 入法（cassette mutagenesis: Wells et al., Gene, 34: 315, 1985),制限部位選択変異 導入法 (restriction selection mutagenesis: Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. Londo n Ser A, 317: 415, 1986),ァラニン 'スキャンユング法（Cunningham & Wells, Science, 244: 1081-1085, 1989), PCR変異導入法， Kunkel法， dNTP[ a S]法（Eckstein),亜硫 酸や亜硝酸などを用いる領域指定変異導入法等の方法が挙げられる。また、それに 適した市販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者に より明らかにされているプロトコルに従って実施することもでき、例えば、 RTS 500 (Rap id Translation System)(Roche Diagnostics Corp.)などを使用することができる。
本発明のポリペプチドは、例えば J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Labora tory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
(2nd Edition, 1989; ISBN 0-87969-309-6 & 3rd Edition, 2001 ; ISBN 0-87969-577- 3); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. (updatable since
1987, Last updated: April, 2003; ISBN: 0-471- 50338- X)等に記載された方法等を 用い、例えば以下の方法により、本発明の DNAを宿主細胞中で発現させて、製造す ることができる。宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、軟体動物細胞、昆虫細 胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることが できる。典型的な態様では、全長 cDNAをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチド をコードする部分を含む適当な長さの DNA断片を調製する。該 DNA断片、または全 長 cDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え ベクターを作製する。該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導 入することにより、本発明のポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。 発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお!、て自律複製可能な!/、しは染色体中への 組込みが可能で、本発明のポリペプチドをコードする DNAを転写できる位置にプロモ 一ターを含有して ヽるものが用いられる。
[0040] 該 DNA断片は、そのままあるいは適当な制御配列を付加した DNA断片として、また は適当なベクターに組込み、そして宿主細胞又は宿主動物ある!、は宿主植物に導 入して、所定の遺伝子を発現する形質転換された細胞又はトランスジエニック動物あ るいはトランスジエニック植物を作成することができる。動物としては、軟体動物が挙 げられる力 哺乳動物や昆虫であってもよぐ例えば、マウス、ラット、ゥサギ、モルモ ット、ゥシ、カイコなどが含まれてよい。好ましくは、マウスなどの動物の受精卵に該 D NA断片を導入して、トランスジエニック動物を作成することができる。所定の遺伝子 産物の確認を、当該外来遺伝子をトランスフエクシヨンした、適当な宿主細胞 (原核細 胞、真核細胞、昆虫細胞、軟体動物細胞など）、例えば、大腸菌、枯草菌、酵母、糸 状菌（例えばァスペルギルス属菌など）、 293T細胞、 CHO細胞、 COS細胞、 Sf21など を用いて行うことができる。
[0041] 外来遺伝子を宿主細胞に導入する方法としては、宿主細胞に遺伝子を導入する方 法であればどのような方法でも用いることができ、当該分野で知られた方法あるいは それと実質的に同様な方法で行うことができ、例えばリン酸カルシウム法 (例えば、 F. し Graham et al, Virology, 52: 456, 1973;村松正實及び山本雅編、実験医学別冊 ( 改訂第 4版)〔新遺伝子工学ノヽンドブック〕、 pp.152-156、羊土社 (2003)など）、リポフエ クシヨン法 (村松正實及び山本雅編、実験医学別冊 (改訂第 4版)〔新遺伝子工学ハン ドブック〕、 PP.157- 162、羊土社 (2003)など)、 DEAE-デキストラン法（例えば、 D. Ward en et al., J. Gen. Virol, 3: 371, 1968など）、エレクト口ポレーシヨン法（例えば、 E. Ne umann et al, EMBO J, 1: 841, 1982;横田崇，新井賢一編集、実験医学、別冊バイ ォマニュアルシリーズ 4〔遺伝子導入と発現'解析法〕， p.23、羊土社、 1994年；村松 正實及び山本雅編、実験医学別冊 (改訂第 4版)〔新遺伝子工学ハンドブック〕、 pp.16 3-165、羊土社 (2003)など）、マイクロインジェクション法〔横田崇，新井賢一編集、実 験医学、別冊バイオマニュアルシリーズ 4〔遺伝子導入と発現'解析法〕， pp.36- 42、 羊土社、 1994年;村松正實及び山本雅編、実験医学別冊 (改訂第 4版)〔新遺伝子ェ 学ハンドブック〕、 pp.179-182、羊土社 (2003)など〕、ウィルス感染法、ファージ粒子法 などが挙げられる。こうして所定の遺伝子をトランスフエクシヨンされた宿主細胞の産 生する遺伝子産物は、それを解析することもできる。
[0042] 所定の遺伝子など (本発明で得られた DNAなど）を組込むベクター（プラスミドを含 む）としては、好適には遺伝子工学的に常用される宿主細胞 (例えば、大腸菌、枯草 菌等の原核細胞宿主、酵母、糸状菌（例えばァスペルギルス属菌など）、 293T細胞、 CHO細胞、 COS細胞等の真核細胞宿主、 Sf21等の昆虫細胞宿主、植物など）中で 該 DNAが発現できるものであればどのようなベクター（プラスミドを含む）でもよ 、が、 目的に適合するように作製 (構築）されたものであってもよい。もちろん、市販のキット や試薬に添付のものから選んで使用することもできる。こうした配列内には、例えば選 択した宿主細胞で発現するのに好適に修飾されたコドンが含まれて ヽることができる し、制限酵素部位が設けられていることもできるし、 目的とする遺伝子の発現を容易 にするための制御配列、促進配列など、 目的遺伝子を結合するのに役立つリンカ一 、アダプターなど、さらには抗生物質耐性などを制御したり、代謝を制御したりし、選 別 ·分離 ·検出などに有用な配列 (タグ、ハイブリドタンパク質や融合タンパク質をコー ドするものも含む)等を含んで、ヽることができる。細菌等の原核生物を宿主細胞として 用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードする DNAを含有してなる組換えべクタ 一は原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配 列、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子、および転写終結配列より構成された ベクターであることが好ましい。なお、ベクターには、プロモーターを制御する遺伝子 が含まれていてもよい。
[0043] 発現ベクターは、リボソーム結合配列（例えば、シャインーダルガーノ (Shine-Dalgar no)配列 (SD配列》と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節したも のを用いることが好ましい。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであ ればいかなるものでもよい。適当なプロモーターとしては、例えば、トリプトファンプロ モーター (trp)、ラタトースプロモーター (lac)、リポプロテインプロモーター (1ρρ)、 λファ ージ pプロモーター、 Pプロモーター、 T7プロモーター等の、大月昜菌ゃファージ等
L R
に由来するプロモーター、 SV40レートプロモーター、 MMTV LTRプロモーター、 RSV
LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 SR aプロモーター等、さらに GAL1、 GAL10プ 口モーター、 sp01プロモーター、 sp02プロモーター、 penpプロモーター等を挙げるこ とができる。さらに CYC1, HIS3, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TP1, AOX1等の制御系を使用することもできる。また、トリプトファンプロ モーター (trp; P )を 2つ直列させたプロモーター（P X 2)、トリプトファン 'ラタトース
trp trp
プロモーター (tac)、 lacT7プロモーター、 letlプロモーター〔Gene, 44, 29 (1986)〕のよう に人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
[0044] 所望ポリペプチドをコードする DNAのトランスクリプションを促進するためェンハンサ 一をベクターに挿入することができ、そうしたェンハンサ一としてはプロモーターに働 いてトランスクリプションを促進する作用を持つ、通常約 10〜100 bpの cis作用を持つ エレメントのものが挙げられる。多くのェンハンサ一が、グロビン、エラスターゼ、アル ブミン、 α -フエトプロテイン、インシュリンなどの哺乳動物遺伝子力も知られている。 代表的には、真核細胞感染性ウィルス力 得られるェンノ、ンサ一が好適に使用でき 、例えばレプリケーシヨンオリジンのレート領域にある SV40ェンハンサー（100-270 bp )、サイトメガロウイノレスの初期プロモーターのェンハンサー，ポリオ一マのレプリケー シヨンオリジンのレート領域にあるェンハンサー、アデノウイルスのェンハンサーなど の例が挙げられる。また、必要に応じて、宿主にあったシグナル配列を付加することも でき、それらは当業者によく知られているものを使用できる。本発明のポリペプチドを コードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換 することにより、 目的とするポリペプチドの生産率を向上させることができる。本発明の 組換えベクターにおいては、本発明の DNAの発現には必ずしも転写終結配列は必 要ではな!/、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ま 、。
[0045] 発現用ベクターとしては、例えば pBR322、 pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pSP 64, pSP65, pTZ-18R/-18U, pTZ— 19R/— 19U, pGEM— 3, pGEM-4, pGEM— 3Z, pGEM -4Z, pGEM— 5Z — ), pGEMEX— Promega社)， pBC KS (Stratagene社)， pBC SK (Stra tagene社), pBluescript SK (Stratagene社), pBluescript II SK (Stratagene社), pBl uescript II KS (Stratagene社), pBS (Stratagene社), pAS, pKK223-3(Amersham Pha rmacia Biotech社)， pMC1403, pMC931, pKC30, pRSET— B (Invitrogen社)， pSE280(I nvitrogen社), pBTrp2(Boehringer Mannheim社), pBTac 1 (Boehringer Mannheim社), pBTac2(Roche¾：), pGEX(Amersham Biosciences社)， pQE series(QIAGEN¾：), pET Expression System (Novagen社)， SV40ベクター、ポリオ一マ 'ウイノレスベクター、ワク シニア.ウィルスベクター、レトロウイルスベクター， PcD, pcD-SR a , CDM8, pCEV4, pME18S, pBC12BI, pSG5 (Stratagene社)， Yip型ベクター、 YEp型ベクター、 YRp型べ クタ一、 YCp型ベクターなどが挙げられ、それらから誘導されたものが含まれてよぐ 例えば pGPD- 2, pUBHO, pHSG399 pRS403 pRS404 pRS405 pRS406などが含まれて よい。
宿主細胞としては、宿主細胞が大腸菌の場合、例えば大腸菌 K12株に由来するも のが挙げられ、例えば、 NM533, XLl-Blue, C600, DH1, DH5, DH11S, DH12S, DH5 a , DH10B, HB101, MC1061, JM109, STBL2, B834株由来としては、 BL21(DE3)pLy sSなどが挙げられる。上記した宿主微生物を使用することもできる。宿主細胞が酵母 の場合、例えば、サッカロミセス (Saccharomvces)属、シゾサッカロミセス (Schizosacchar omvces)属、ピキア (Ekhk)属菌などである。より具体的には、サッカロミセス'セレビッ ンェ feaccharomvces cerevisiae .ンンサッカロ セス ·ホンへ fechizosaccharomvces DO mbe)、ピ3 rァ 'ノヽストリス（Picma pastons). Kluweromvces株、 Candida. Tnchoderma r eesia、その他の酵母株などを挙げることができる。具体的には、サッカロミセス'セレビ ッシェ AH22R-などを挙げることができる。酵母を宿主細胞として用いる場合には、発 現ベクターとして、例えば、 YEP13 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (AT CC37419)、 pHS19、 pHS15等を挙げることができる。プロモーターとしては、酵母菌株 中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよぐ例えば、へキソースキナ ーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロモーター、 gallプロモーター、 gallOプロモーター、ヒート ショックタンパク質プロモーター、 MF1プロモーター、 CUP1プロモーター等を挙げるこ とができる。組換えベクターの導入方法としては、酵母に DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Methods in Enzymol ogy, 194: 182 (1990)〕、スフエロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1929 (19 78)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153: 163 (1983)〕、 Hinnen, A. et al, Proc. Nat 1. Acad. Sci. USA, 75: 1929 to 1933 (1978)記載の方法等を挙げることができる。 宿主細胞が糸状菌の場合、アクレモニゥム (Acremonium)属、ァスペルギルス (Asper gillus)属、フサリウム (Fusarium)属、ぺニシリウム (Penicillium)属、ムコール (Mucor)属、 ノイロスポラ (Neurospora)属、トリコデルマ (Trichoderma)属菌などが举げられる より具 体的には、ァスペルギルス ·二ガー (Aspergillus niger)、ァスペルギルス ·ォリゼ (Asper gillus orvzae)、ァスペルギルス ·ァヮモリ (Aspergillus awamori)などを举げることができ る。さらに具体的には、ァスペルギルス '二ガー ND48、ァスペルギルス '二ガー 1208- 160、ァスペルギルス 'ォリゼ ATCC 91002、ァスペルギルス 'ォリゼ IFO5240、ァスぺ ルギルス ·ァヮモリ IFO4033などを挙げることができる。糸状菌を宿主細胞として用い る場合には、発現用ベクターとしては、糸状菌のェンノヽンサ一塩基配列の 1個または 複数個を有するもの、糸状菌の産生するアルカリプロテアーゼ (Alp)の発現に係るプ 口モーター領域を有するもの、糸状菌のェンノヽンサ一塩基配列の 1個または複数個 を糸状菌で機能するプロモーター領域に導入したもの、シグナルペプチド領域が、 該 Alpの分泌に係るシグナル配列領域又は該ラクトナーゼのシグナル配列領域であ るように構成できるものなどが挙げられる。糸状菌での発現に適した発現用ベクター としては、ァスペルギルス'ォリゼの α—ダルコシダーゼ遺伝子 (agdA)プロモーター上 のェンハンサー配列とプロモーター領域をもつものが挙げられる。該ェンハンサー配 列を導入するプロモーターとしては、糸状菌において機能するものであれば特に制 限されないが、具体的には、 α -アミラーゼ、ダルコアミラーゼ、 α -ダルコシダーゼ、 プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、セロビオハイドラーゼ、ァセトアミダーゼ等の加 水分解酵素遺伝子、 3-ホスホダリセレートキナーゼ、ダリセルアルデヒド- 3-ホスフエ 一トデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ等の解糖系酵素遺伝子のプロモ 一ターが挙げられる。好適なプロモーターは、ァスペルギルス属の α—アミラーゼ、 ダルコアミラーゼ、 ひ -ダルコシダーゼの遺伝子力も単離することができる。より好適に は、ァスペルギルス'ォリゼの α -ダルコシダーゼ遺伝子のプロモーターが挙げられる 。そのプロモーターは、部分配列であっても糸状菌におけるプロモーターとしての機 能を有する限り含まれる。
[0048] さらに、本発明で好適に使用できる発現プラスミドは、上述の如く改良された糸状菌 で機能するプロモーターと、ターミネータ一を有し、宿主の形質転換体の選択に好適 なマーカー遺伝子を有し、大腸菌で複製可能な DNA領域を有するものである。当該 ェンハンサー配列のプロモーターへの導入部位は、プロモーター領域であれば特に 制限されるものではない。ターミネータ一は、糸状菌において機能するものであれば 特に制限されないが、例えば、ァスペルギルス 'ォリゼの α -ダルコシダーゼ遺伝子の ターミネータ一、あるいは、その部分配列を含むターミネータ一がより好適に用いられ る。好ましい選択マーカーとしては、硝酸還元酵素 (niaD)、オル-チン力ルバモイルト ランスフェラーゼ (argB)、トリプトファンシンターゼ (trpC)、ァセトアミダーゼ (amdS)の遺 伝子が挙げられる。より好適な選択マーカー遺伝子は、硝酸還元酵素遺伝子 (niaD) である。これらのプラスミドは、プロモーターとターミネータ一の間に設けられた制限酵 素認識サイトを利用して、本発明の発現させるべき目的のタンパク質をコードする DN A断片を挿入される。
[0049] 使用するに好適な発現用ベクターとしては、例えば特開平 09-9968号公報、特開平 5-268972号公報などに開示のもの、あるいはそれから公知の技術で誘導されたもの が挙げられる。例えば、プラスミド PNLH2、 pNAN8142などが好適に使用できる。遺伝 子を連結する場合、遺伝子間にアダプター DNAとして合成 DNAを用いることもできる 。該合成 DNAとしては、両遺伝子のフレームが一致し、目的とする遺伝子の活性が 失われないものであればいかなるものでもよい。例えば、 APァーゼ遺伝子プロモータ 一と、翻訳開始部位および Zまたは分泌シグナルを用いた目的遺伝子の発現は、該 APァーゼ遺伝子由来部位と目的とする遺伝子のフレームが一致するように融合遺伝 子を作製することによって行われる。 APァーゼの分泌シグナルを翻訳開始コドンの下 流にフレームを合わせて連結されることにより、目的物質を菌体外に分泌生産させる ことができる。プロモーターの機能が失われない限りは、一部の DNA断片を欠失させ ても差し支えない。また、プロモーターおよび翻訳開始部位の機能を変化させるよう に、例えば、発現力が増加するようにプロモーターおよび翻訳開始部位を含む領域 の DNA塩基配列を改変したものであっても好都合に用いることができるし、プロモー ターおよび翻訳開始部位の機能に関係しない領域の DNA塩基配列を改変させて用 いることも可能である。
[0050] APァーゼ遺伝子のプロモーター有しており且つ翻訳開始部位および Zまたは分泌 シグナルをコードする領域の下流に連結した目的ポリペプチド遺伝子を有するベクタ 一を導入するための宿主としては、その遺伝子が作動、発現する生物ならばどのよう なものであってもよい。好ましくは、例えば酵母、糸状菌などの真核微生物より適宜選 択される。これら宿主に遺伝子を導入する形質転換法としては、例えばプロトプラスト 形質転換法などが挙げられる。例えば、適当な細胞壁溶解酵素を用いて調製したプ ロトプラストイ匕した細胞に、塩化カルシウム、ポリエチレングリコールなどの存在下 DN Aを接触させるなどの方法で形質転換を行うことができる。また、形質転換法としては 、エレクト口ポレーシヨン法（例えば、 E. Neumann et al.， "EMBO J", Vo. 1, pp.841 (1 982)など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃により打ち込む方法などが挙げられ る。形質転換された細胞を効率良く分離するためには、宿主内で機能する適切な選 択マーカー遺伝子を持つプラスミドに該融合遺伝子を挿入した後、該プラスミドで宿 主を形質転換してよい。該選択マーカー遺伝子としては、形質転換された細胞を選 択的に分離できるものであるならどのようなものも使用可能である。代表的なものとし ては、例えばノヽィグロマイシン B耐性遺伝子などを挙げることができる。普通、宿主は 、選定された選択マーカーにつ 、ての機能的遺伝子を有しな 、株を用いなければな らない。
[0051] 宿主細胞が動物細胞の場合、例えばアフリカミドリザル線維芽細胞由来の COS-7 細胞、 COS-1細胞、 CV-1細胞、ヒト腎細胞由来 293細胞、ヒト表皮細胞由来 A431細 胞、ヒト結腸由来 205細胞、マウス線維芽細胞由来の COP細胞、 MOP細胞、 WOP細 胞、チャイニーズ'ノ、ムスター細胞由来の CHO細胞、 CHO DHFR—細胞、ヒト HeLa細 胞、マウス細胞由来 C127細胞、マウス細胞由来 NIH 3T3細胞、マウス L細胞、 9BHK、 HL-60、 U937、 HaK、 Jurkat細胞、その他の形質転換されて得られたセルライン、通 常の二倍体細胞、インビトロの一次培養組織力 誘導された細胞株などが挙げられ る。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば Current Protocols in Molecular Biol ogy, Ι EXPRESSION OF PROTEINS IN INSECT CELLS USING BACULOVIRUS VECTORS", John Wiley & Sons Inc. (updatable since 1987, Last updated: April, 20 03; ISBN: 0-471- 50338- X); O'Reilly, D.R., Miller, L.K. and Luckow, V.A., "Baculo virus Expression Vectors: a Laboratory Manual", W. H. Freeman and Company, Ne w York (1992)等に記載された方法によって、本発明のポリペプチドを発現することが できる。
[0052] 昆虫細胞に遺伝子を導入するためのベクターとしては、バキュロウィルス (Baculovir us)、カイコ核多角体 ウイルス (Bombvx mon nuclear polyhedrosis virus入ァ1/トグフ ファ 'カリフオノレニ力 .ヌクレア一 .ポリへドロシス .ウイノレス (Autogmpha californica nucle ar polyhedrosis virus)及びそれに由来するものが挙げられる。また、組換え遺伝子導 入ベクターを使用することができ、例えば、 PVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに In vitorogen社）等を挙げることができる。昆虫細朐 しては、 Spodoptera frueiperda (cat erpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquitoノ, Drosophila melang aster (fruitfly),カイコ幼虫あるいはカイコ培養細胞、例えば BM- N細胞など、 High5 (I nvitrogen社)が挙げられる（例えば、 Luckow et al., Bio/Technology, 6: 47-55 (1988) ； Setlow, J. K. et al. (ed.), Genetic Engineering, Vol. 8, pp.277- 279, Plenum Publish ing, 1986; Maeda et al., Nature, 315: pp.592- 594 (1985》。組換えウィルスの調製、 昆虫細胞への上記ベクターの導入 (上記バキュロウィルス共導入を含む)方法は、例 えば、リン酸カルシウム法（特開平 2-227075号公報）、リボフヱクシヨン法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:7413 (1987)〕等などによって達成できる。
[0053] 植物細胞を宿主細胞として使用する場合には、ァグロパクテリゥム'ッメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)、 Tiプラスミド、タバコモザイクウィルスベクターなどを利 用することができる。植物細胞用発現ベクターは当該分野で広く知られている。プロ モーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよ く、例えば、カリフラワーモザイクウイノレス (CaMV)の 35Sプロモーター、ィネアクチン 1 プロモーター等を挙げることができる。宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、 ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、ォォムギ等の植物細胞等 を挙げることができる。組換えベクターの導入方法としては、植物細胞に DNAを導入 する方法であればいずれも用いることができ、例えば、ァグロバタテリゥム (Agrobacte rium) (特開昭 59-140885号公報、特開昭 60-70080号公報、 WO94/00977)、エレクト 口ポレーシヨン法 (特開昭 60-251887)、パーティクルガン (遺伝子銃)法 (特許第 2606 856、特許第 2517813)等を挙げることができる。本発明の遺伝子工学的手法におい ては、当該分野で知られたあるいは汎用されている制限酵素、逆転写酵素、 DNA断 片をクローンィ匕するのに適した構造に修飾したりあるいは変換するための酵素である
DNA修飾'分解酵素、 DNAポリメラーゼ、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、 D NAリガーゼなどを用いることが出来る。制限酵素としては、例えば、 R. J. Roberts, N ucleic Acids Res., 13: rl65, 1985; b. Linn et al. ed. Nucleases, p. 109, Cold bpnng Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York, 1982; R. J. Roberts, D. Macelis, Nucle ic Acids Res., 19: Suppl. 2077, 1991などに記載のものが挙げられる。遺伝子の発現 方法としては、直接発現以外に、 J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laborato ry Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ( 2nd Edition, 1989; ISBN 0-87969-309-6 & 3rd Edition, 2001; ISBN 0-87969-577-3 ); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. (updatable since 1987, Last updated: April, 2003; ISBN: 0-471- 50338- X)に記載されている方法等に 準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。糖あるいは糖鎖が付 カロされたポリペプチドを得る目的で、酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞を宿 主として発現させることができる。
本発明では当該マンナナーゼ遺伝子（当該マンナナーゼ及びそのミュータント (変 異体）、修飾体、誘導体などの関連遺伝子を含む)あるいはマンナナーゼを発現でき る組換え DNA分子を宿主に移入し、当該マンナナーゼを発現させ、目的とする当該 マンナナーゼを得る方法が提供される。こうして本発明によれば、当該マンナナーゼ の遺伝子を実質的に発現する組換え体あるいはトランスフエクタント及びその製造法 、さらにはその用途も提供される。
本発明のァヮビ由来のペプチドあるいはポリペプチド (又はタンパク質）は、 1個以 上のアミノ酸残基が同一性の点で天然のものと異なるもの、 1個以上のアミノ酸残基 の位置が天然のものと異なるものであってもよい。本発明のァヮビ由来のペプチドは 、所定のポリペプチドのアミノ酸配列中に適宜、 1個ないし複数個（あるいは数個）以 上のアミノ酸の置換、欠失、挿入、転移あるいは付加したごとき変異を導入した相当 するポリペプチドであってよぐァヮビ 'マンナナーゼに特有なアミノ酸残基が 1個以上 (例えば、 1〜80個、好ましくは 1〜60個、さらに好ましくは 1〜40個、さらに好ましくは 1〜20個、特には 1〜10個あるいは 1〜5個など)欠けている欠失類縁体（トランケ一 シヨンミュータントを含む）、特有のアミノ酸残基の 1個以上 (例えば、 1〜80個、好まし くは 1〜60個、さらに好ましくは 1〜40個、さらに好ましくは 1〜20個、特には 1〜10個 あるいは 1〜5個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、 1個以上 (例えば、 1〜80個、好ましくは 1〜60個、さらに好ましくは 1〜40個、さらに好ましくは 1〜20個、 特には 1〜 10個あるいは 1〜 5個など）のアミノ酸残基が付加されて ヽる付加類縁体も 包含する。
次に、アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、しばしばポリペプチドの生理的な特 性やィ匕学的な特性に大きな変化を生ぜしめないし、こうした場合、その置換、欠失、 あるいは挿入を施されたポリペプチドは、そうした置換、欠失、あるいは挿入のされて いないものと実質的に同一であるとされるであろう。該アミノ酸配列中のアミノ酸の実 質的に同一な置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ 酸類力も選ぶことができうる。例えば、非極性 (疎水性)アミノ酸としては、了ラニン、フ ェニルァラニン、ロイシン、イソロイシン、ノ リン、プロリン、トリプトファン、メチォニンな どが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロシ ン、ァスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸 (塩基性アミノ酸） としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸 (酸性 アミノ酸）としては、ァスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
天然のァヮビ 'マンナナーゼの特徴であるドメイン構造あるいは基質結合能が維持 されていれば、上記のごとき変異体は、全て本発明に包含される。また本発明のぺプ チドあるいはポリペプチドは天然のァヮビ 'マンナナーゼと実質的に同等の一次構造 コンフオメーシヨンある 、はその一部を有して 、るものも含まれてょ 、と考えられ、さら に天然のものと実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考 えられる。さらに天然に生ずるミュータント (変異体)の一つであることもできる。本発明 のァヮビ由来のタンパク質 (又はペプチドあるいはポリペプチド）は、例えば、配列表 の SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、 SEQ ID NO:9のアミノ酸配列及び SEQ ID ΝΟ:11の アミノ酸配列から成る群力 選ばれたアミノ酸配列に対し、 60%、場合によっては 70%よ り高い相同性を有しているものが挙げられ、好ましくはそれに対し、 80%あるいは 90% 以上の相同アミノ酸配列を有するもの、より好ましくはそれに対し、 95%あるいは 98%以 上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。本発明のァヮビ由来のタンパク質 の一部のものとは、該ァヮビ由来のタンパク質の一部のペプチド（すなわち、該タンパ ク質の部分ペプチド)であって、本発明の、ァヮビマンナナーゼと実質的に同等な活 性を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、該本発明のタンパク 質の部分ペプチドは、該ァヮビマンナナーゼの構成アミノ酸配列のうち少なくとも 5個 以上、好ましくは 20個以上、さらに好ましくは 50個以上、より好ましくは 70個以上、もつ と好ましくは 100個以上、ある場合には 200個以上のアミノ酸配列を有するペプチドが 挙げられ、好ましくはそれらは連続したアミノ酸残基に対応するものである力 あるい は、例えば、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:9又は SEQ ID NO:llで示されるアミノ酸配 列のうち対応する領域に対する相同性に関して、上記と同様の相同性を有するもの が挙げられる。
本明細書において、「実質的に同等」とはタンパク質の活性、例えば、糖鎖結合性 、酵素活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。 さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含し ていてよぐ該実質的に同質の活性としては、特定の糖鎖結合性、多糖分解活性な どを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質 であることを示し、例えば、生理的に、酵素的に、あるいは生物学的に同質であること を示す。例えば、酵素活性などの活性力 同等 (例えば、約 0.001〜約 1000倍、好まし くは約 0.01〜約 100倍、より好ましくは約 0.1〜約 20倍、さらに好ましくは約 0.5〜約 2倍 )であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要 素は異なっていてもよい。
また、遺伝子組換え法で製造する時に融合ポリペプチド (融合タンパク質)として発 現させ、生体内あるいは生体外で、所望のポリペプチドと実質的に同等の生物学的 活性を有しているものに変換'加工してもよい。遺伝子工学的に常用される融合産生 法を用いることができる力 こうした融合ポリペプチドはその融合部を利用してァフィ 二ティクロマトグラフィーなどで精製することも可能である。こうした融合ポリペプチドと しては、ヒスチジンタグに融合せしめられたもの、あるいは、 β -ガラタトシダーゼ（ j8 -g al),マルトース結合タンパク（MBP)、グルタチオン- S-トランスフェラーゼ（GST)、チォ レドキシン（TRX)又は Cre Recombinaseのアミノ酸配列に融合せしめられたものなど が挙げられる。同様に、ポリペプチドは、ヘテロジーニアスなェピトープのタグを付カロ され、該ェピトープに特異的に結合する抗体を用いてのィムノアフィ-ティ'クロマトグ ラフィー〖こよる精製をなし得るよう〖こすることもできる。より適した実施態様においては 、ポリヒスチジン (poly-His)又はポリヒスチジン-グリシン (poly-His-Gly)タグ、また該ェ ピトープタグとしては、例えば AU5, c-Myc, CruzTag 09, CruzTag 22, CruzTag 41, Glu-Glu, HA, Ha.l l, KT3, FLAG (registered trademark, Sigma— Aldrich), Omni— pro be, S- probe, T7, Lex A, V5, VP16, GAL4, VSV-Gなどが挙げられる（Field et al., M olecular and Cellular Biology, 8: pp.2159- 2165 (1988); Evan et al., Molecular and C ellular Biology, 5: pp.3610- 3616 (1985); Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6): pp.547— 553 (1990); Hopp et al., BioTechnology, 6: pp.1204— 1210 (1988); Martin et al" Science, 255: pp.192 - 194 (1992); Skinner et al., J. Biol. Chem., 266: pp.15163 - 15166 (1991); Lutz— Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: pp.6393— 639 7 (1990)など)。
さらに融合ポリペプチドとしては、検出可能なタンパク質となるようなマーカーを付さ れたものであることもできる。より好適な実施態様においては、該検出可能なマーカ 一は、ピオチン Zストレプトアビジン系の Biotin Avi Tag,螢光を発する物質などであ つてよい。該螢光を発する物質としては、ォワンクラゲ (Aeauorea coerulescens)、 Aeau orea victoreaなどの発光クラゲ由来の緑色螢光タンパク質 (green fluorescent protein: GFP)、それを改変した変異体 (GFPバリアント)、例えば、 EGFP (Enhanced- humanize d GFP), AcGFPlタンパク質， rsGFP (red-shift GFP),黄色螢光タンパク質 (yellow flu orescent protein: YFP),緑色螢光タンノ ク質 (green fluorescent protein: GFP),藍色 螢光タンパク質 (cyan fluorescent protein: CFP),青色螢光タンパク質 (blue fluorescen t protein: BFP),ゥミシィタケ (Renilla reniformis)由来の GFP、珊瑚礁に生息するカイメ ンの一種（Discosoma)に由来する赤色蛍光タンパク質、例えば、 BD Living Colors D sRed- Monomer (DsRed- Monmerあるいは単量体 DsRed) (Clontech社）などが挙げら れる。宫脇敦史編、実験医学別冊ポストゲノム時代の実験講座 3〔GFPとバイオィージ ング〕、羊土社（2000年)などの記載を参照することができる。また、上記融合タグを特 異的に認識する抗体 (モノクローナル抗体及びそのフラグメントを含む）を使用して検 出を行うこともできる。こうした融合ポリペプチドの発現及び精製は、それに適した巿 販のキットを用いて行うことができ、キット製造業者あるいはキット販売業者により明ら かにされているプロトコルに従って実施することもできる。
当該マンナナーゼ又はポリペプチドをコードする核酸 (ポリヌクレオチド、例えば、 D
NA) (単に、マンナナーゼ遺伝子ともいう）は、レポーター遺伝子と組み合わされて使 用されるものであってもよい。典型的な場合、レポーター遺伝子はレポータータンパク 質を発現するようなものである。レポータータンパク質としては、組換え DNA技術によ つて作成された組換え遺伝子が、 V、つどこでどのくら ヽできて ヽるのかを比較的簡単 に確認できるようにレポーター遺伝子により産生されるものを指してよぐ例えば、特 定の基質と反応して発光あるいは発色する酵素や、励起光によって蛍光を発する蛍 光蛋白質などが含まれてよいが、それには限定されず所要の目的を達成できるもの であれば制限なく使用できる。レポータータンパク質は当該分野で各種のものが知ら れており、また巿販物として簡単に入手できるので、そうしたものの中から適宜適切な ものを選択して使用できる。上記した光や色を測定することで組換え遺伝子の発現を 見ることができるものが好適に使用できる。通常、レポーター遺伝子自体には、可視 化する以外の機能は想定されて ヽな 、ものであってよ!、。様々な生物の遺伝子がプ 口モーターの活性や蛋白質の挙動を知るためのレポーター遺伝子として利用されて おり、そうしたものはすべて包含されてよい。このレポーター遺伝子は、ある遺伝子の プロモーターの下流に連結し、その融合遺伝子の産生物の活性を測定する事によつ て元の遺伝子の発現の有無や、その発現の強さを知るために用いられる遺伝子であ つてよい。レポーター遺伝子の産物としては、活性の測定が容易であるとか、細胞毒 性がな!、と力、組織または個体レベルでの染色による検出が可能であるなどと!/、つた ものであることも好ましい。代表的なものとしては、例えば、クロラムフエ-コールァセ チノレトランスフェラーゼ (CAT)、 Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (DsRed)、上 記した GFP及びその改変体又は類縁体、ベータグルクロ-ダーゼ（GUS)、 lacZ、ルシ フェラーゼなどを挙げることができる力 これらに限定されるものではない。
本発明の DNAを組み込んだ組換え発現ベクターを保有する形質転換体を培地に 培養し、培養物中に本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリぺプ チドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。本発明で得られる 形質転換された細胞を培養する場合の各種条件は、使用する菌株など細胞の種類 により異なるが、一般的には培地に関しては、該形質転換細胞が同化したり、資化す ることが可能な炭素源や窒素源などを含有する培地を使用する。炭素源としては、該 形質転換細胞が同化したり、資化することができるものであればどのようなものでもよ いが、例えば、グルコース、シュクロース、フラクトース、糖蜜、でんぷん、可溶性でん ぶん、デンプン加水分解物、デキストリンなどの糖類あるいは炭水化物、パラフィン類 などが挙げられ、さらに、酢酸、クェン酸、酪酸、フマール酸、安息香酸などの有機酸 類、メタノール、エタノール、ブタノール、グリセリンなどのアルコール類、ォレイン酸、 ステアリン酸などの脂肪酸およびそのエステル類、大豆油、菜種油、ラード油などの 油脂類などが挙げられ、それらは単独又は混合して用いることができる。窒素源とし ては、資化することができるものであればどのようなものでもよいが、例えば、アンモ- ァ、塩化アンモ-ゥム、硫酸アンモ-ゥム、硝酸アンモ-ゥム、酢酸アンモ-ゥム、リン 酸アンモニゥムなどのアンモニゥム塩類、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩 類、尿素、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、コーングルテンミール、カゼ イン加水分解物、ふすま、酵母エキス、乾燥酵母、各種発酵菌体およびその消化物 、大豆粉、大豆粕および大豆粕加水分解物、綿実粉、肉エキス、その他の有機また は無機の窒素含有物などが挙げられ、それらは単独又は混合して用いることができ る。培地には、無機塩類、ミネラル、ビタミン、微量金属塩などの栄養素を任意に適宜 カロえることもできる。無機塩類としては、硫酸マグネシウム、塩ィ匕ナトリウム、炭酸カル シゥム、リン酸マグネシウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウムなどのリン酸 塩類、硫酸第一鉄、硫酸銅、硫酸マンガンなどのマンガン塩類などが挙げられ、他の 栄養源として、麦芽エキスなども挙げられる。その他、当該分野で一般的に使用され るものを適宜選択して用いることができる。培養は通常振盪培養または深部通気攪 拌培養等の好気的条件下で行うが、好気条件下で深部培養するのが一般に有利で
、好気的に行なう場合、通常、培養時間 2時間〜 20日程度であり、好ましくは 16時間 〜14日程度であり、さらに好ましくは 1〜10日程度で、培地の pH 3〜9、培養温度、 10 〜50°Cで行なう。 pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カル シゥム、アンモニア等を用いて行う。また、培養中必要に応じて、アンピシリンゃテトラ サイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ 、。プロモーターとして誘導性のプロ モーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要 に応じてインデューサーを培地に添カ卩してもよい。例えば、 lacプロモーターを用いた 組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル- β -D-チォ ガラクトピラノシド (IPTG)等を、 trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換し た微生物を培養するときにはインドールアクリル酸 (IAA)等を培地に添加してもよい。 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れているものを適宜選択して使用できるほか、それを改変したものも使用でき、例え ば、 RPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199: 519 (19 67)〕、 Eagleの MEM培地 [Science, 122: 501(1952)〕、ダルベッコ改変 MEM培地〔Virol ogy, 8: 396 (1959)〕、 199培地 [Proceeding of the Society for the Biolog ical Medicine , 73: 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることがで きる。培養は、通常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下等の条件下で 1〜7日間行う。
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また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加し てもよい。さらに、例えば、 dhfr遺伝子を選択マーカーとして利用した場合、 MTX濃度 を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、本発明のポリペプチドをコード する DNAを増幅させ、より高い発現を得られる細胞株を得ることができる。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れているものを適宜選択して使用できるほか、それを改変したものも使用でき、例え ば、 TNM- FH培地（Pharmingen社）、 Sf- 900 II SFM培地 (Life Technologies社)、 ExCel 1400、 ExCell405 (JRH Biosciences社）、 Grace's Insect Medium [Nature, 195: 788 (19 62)〕等を用いることができる。培養は、通常 pH6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5 日間行う。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加し てもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器 官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般 に使用されているものを適宜選択して使用できるほか、それを改変したものも使用で き、例えば、ムラシゲ ·アンド'スターグ (MS)培地、ホワイト (White)培地、またはこれら培 地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添カ卩した培地等を用いることがで きる。培養は、通常 pH5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。また、培養中必 要に応じて、カナマイシン、ノ、イダロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細 胞外に分泌させる方法などがあり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの 構造を変えることにより、該方法を選択することができる。宿主細胞内に生産されるポ リペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させる手法は知られており、例えば、ポール ソンらの方法〔J. Biol. Chem., 264: 17619 (1989)〕、ロウらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 8227 (1989)、 Genes Develop., 4: 1288 (1990)〕、または特開平 5- 3369 63号公報、 WO94/23021等に記載の方法などを参考にできる。例えば、遺伝子組換 えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前に シグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主 細胞外に積極的に分泌させることができる。また、特開平 2-227075号公報に記載さ れている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利 用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子 が導入された動物個体 (トランスジ ニック軟体動物)または植物個体 (トランスジェ- ック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明のポリペプチドを製造することもで きる。形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育 または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポ リペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。 本発明の当該ァヮビ 'マンナナーゼポリペプチド (タンパク質)及びそのミュータント 、修飾体、誘導体などは、上記で説明したような分離'精製処理を施すことができる。 本発明では、「断片」、「誘導体」及び「類縁体」なる用語は、 SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:9あるいは SEQ ID NO:llのポリペプチド、 SEQ ID NO:lの配列、 SEQ ID NO:lの 配列のうちの塩基番号 55〜1134の配列あるいは SEQ ID NO:10の配列から転写され た mRNAによりコードされるポリペプチド、又はゲノミック DNAによりコードされるポリべ プチドに関連して、その「断片」、「誘導体」又は「類縁体」と称した場合、このようなポ リペプチドと本質的に同一の生物学的機能又は活性を有しているポリペプチドを意 味する。従って、類似体にはトランケーシヨンミュータント（SEQ ID NO:2のポリべプチ ドより導かれるトランケートされたポリペプチド）、プロタンパク質部分が切断されて活 性ポリペプチドを産生するような、活性ィ匕できるプロタンパク質等が包含される。本発 明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドでよ い。特定の好ましい態様では、これは組換えポリペプチドである。
一方では、本発明は上記したポリペプチドをコードする DNA配列、そして天然の特 性の全部あるいは一部を有する当該ァヮビマンナナーゼタンパク質のポリペプチド、 さらにその類縁体あるいは誘導体（トランケーシヨンミュータントを包含する）をコード する DNA配列も包含する。本発明のポリヌクレオチドは、ァミノ末端に付加アミノ酸又 はカルボキシル末端に付加アミノ酸をカ卩えた成熟タンパク質、又は成熟タンパク質に 内在するポリペプチド (例えば、成熟形態で一つ以上のポリペプチド鎖を有する場合) のアミノ酸をコードしているものであることができる。このような配列は、前駆体から成 熟形態のタンパク質へのプロセッシングにおいても何らかの働きをなすものであって よぐ例えば、タンパク質の移動や輸送を促進したり、タンパク質の半減期を延長もし くは短縮したり、又はタンパク質を操作してその検出もしくは産生を容易にすることが できるものであってよい。一般的には、例えば、付加アミノ酸は、細胞酵素によりプロ セッシングされ、成熟タンパク質力 取り除かれる。 1又はそれ以上のプロ配列と融合 した成熟形態ポリペプチドを有する前駆タンパク質は、不活性形態ポリペプチドであ ることができる。プロ配列が除去されると、このような不活性前駆体は、通常活性化さ れる。プロ配列のいくつか又は全ては、活性ィ匕の前に除去できる。通常、このような前 駆体はプロタンパク質と称される。本発明のポリペプチドは、成熟タンパク質、マーカ 一配列又はレポーター配列を付加してある成熟タンパク質であってよい。また、該プ 口配列は通常活性形態ポリペプチド及び成熟形態ポリペプチドを産み出すようなプロ セッシングの段階で除去されることができる。
所定の遺伝子産物を発現している形質転換体はそのまま利用可能であるが、その 細胞ホモジュネートとしても利用できるし、所定の遺伝子産物を単離して用いることも できる。
本発明で得られる形質転換された細胞により産生されるポリペプチド (酵素）は、各 種原料、例えば細胞培養液、細胞培養破砕物などを含めた、形質転換体細胞など の酵素産生材料から、従来公知の方法にしたがって得ることができる。例えば、培地 中に蓄積された場合には、遠心分離または濾過によって目的物質を含む上澄液を 得る。一方、 目的物質が菌体など細胞中に蓄積される場合には、培養後、遠心分離 または濾過などの公知の方法で細胞などを集め、細胞を尿素や塩酸グァ-ジンなど の蛋白質変性剤及び Z又はトリトン X-100 (商品名）、ッウィーン- 20 (商品名）などの 界面活性剤を含む緩衝液に懸濁し、冷所で撹拌したのち遠心分離等により目的物 質の蛋白質を含む上澄液を得たり、細胞を緩衝液に懸濁したのち、ガラスビーズによ る粉砕、フレンチプレス、超音波処理、凍結融解あるいは酵素処理等で細胞を破砕 したのち遠心分離、ろ過等により上清液を得るなどの方法が適宜用いられる。
前記上清液から目的蛋白質を分離'精製するには、自体公知の分離'精製法を適 切に組合わせて行うことができ、例えば硫酸アンモ-ゥム沈殿法などの塩析、ェタノ ールを使用するなどの溶媒沈澱法、セフアデックスなどによるゲルろ過法、例えばジ ェチルアミノエチル基あるいはカルボキシメチル基などの塩基性基あるいは酸性基を 持つ担体などを用いたイオン交換クロマトグラフィー法、例えばブチル基、ォクチル 基、フ -ル基など疎水性基を持つ担体などを用いた疎水性クロマトグラフィー法、 色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、ァフィ-ティ'クロマ トグラフィ一法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製して得ることができる。ま た封入体として得られた場合には、可溶化処理、例えば、塩酸グァ-ジン、尿素とい つた変成剤で処理して可溶化する。可溶化液は希釈または透析することにより、該ポ リペプチドを正常な立体構造に戻すこと (リフォールデイング)ができ、次に、上記と同 様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。必要に応じて は、 2—メルカプトエタノール、ジチオスレィトールなどの還元剤存在下に処理して活 性型酵素とすることもできる。
[0063] 本発明のポリペプチド (タンパク質)及びその一部のペプチドの合成には、当該べ プチド合成分野で知られた方法、例えば液相合成法、固相合成法などの化学合成 法を使用することができる。こうした方法では、例えばタンパク質あるいはペプチド合 成用榭脂を用い、適当に保護したアミノ酸を、それ自体公知の各種縮合方法により 所望のアミノ酸配列に順次該榭脂上で結合させていく。縮合反応には、好ましくはそ れ自体公知の各種活性化試薬を用いるが、そうした試薬としては、例えばジシクロへ キシルカルポジイミドなどカルポジイミド類を好ましく使用できる。生成物が保護基を 有する場合には、適宜保護基を除去することにより目的のものを得ることができる。例 えば、 Fmoc法（フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法（t ブチルォキシ カルボ-ル法）等の化学合成法によって製造することができ、また、 Advanced ChemT ech社、 Perkin- Elmer社、 Amersham Biosciences社、 Protein Technologies社、 Applied Biosystems社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもでき る。本発明のペプチド (又はポリペプチド）は、それが遊離型のものとして得られた場 合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じた方法で塩に変換することができ 、またそれらは塩として得られた場合には、それ自体公知の方法あるいはそれに準じ た方法で遊離型のものあるいは他の塩に変換することができる。
[0064] 酵素としては酵素産生細胞をそのまま用いることが出来るし、粗酵素、精製酵素ま たは固定ィ匕酵素として用いることができる。固定ィ匕酵素としては、当該分野で知られ た方法で酵素又は酵素産生細胞などを固定化したものが挙げられ、共有結合法や 吸着法といった担体結合法、架橋法、包括法などにより固定ィ匕できる。また、微生物 菌体のアルギン酸ゲルへの固定化も好適に用いることができる。例えばダルタルアル デヒド、へキサメチレンジイソシァネート、へキサメチレンジイソチオシァネートなどの 縮合剤を必要に応じて使用し、固定ィ匕できる。またモノマーを重合反応でゲルィ匕させ て行うモノマー法、通常のモノマーよりも大きな分子を重合させるプレポリマー法、ポ リマーをゲルイ匕させて行うポリマー法などが挙げられ、ポリアクリルアミドを用いた固定 ィ匕、アルギン酸、コラーゲン、ゼラチン、寒天、 κ -カラギーナンなどの天然高分子を 用いた固定化、光硬化性榭脂、ウレタンポリマーなどの合成高分子を用いた固定ィ匕 などが挙げられる。酵素や微生物菌体の固定ィ匕技術及びその利用は、例えば、千畑 一郎編「固定化酵素」、 P75、講談社サイエンティフィック (1975年);千畑一郎編「固定 化生体触媒」、 P67、講談社サイエンティフィック (1986年);鈴木智雄監修「微生物ェ 学技術ハンドブック」、朝倉書店 (1990年 5月）;今中忠行編「Maruzen Advanced Tech nologyく生物工学編〉微生物工学」、 pl80〜194、丸善株式会社 (平成 5年 9月 30日 )、日本生化学会編「新生化学実験講座 13バイオテクノロジー」、 p50〜54、東京化学 同人 (ISBN: 4-8079-1079-5)などに記載の方法ある!/、はそこで引用された文献記載 の方法あるいはそれらと実質的に同様な方法や改変法により行うことができる。それ らの手法は、本発明の目的に合わせて公知の手法に独自の改変改良を加えたもの であることちでさる。
本発明では、ァヮビ 'マンナナーゼをコードする DNAあるいはァヮビ 'マンナナーゼ のシグナルペプチド領域を含んでいるコード DNA (又はその誘導体 DNA)又はそれを 挿入したベクターを導入されたマンナナ一ゼ産生形質転換体の培養物、その細胞、 または細胞処理物、及び該形質転換体力 得られた組換えマンナナーゼなどに、マ ンナン含有基質を接触せしめ、得られた加水分解物又はその塩を反応系から分離 することにより、マンナンが消化を受けた産物又はその塩の製造法が提供されるので ある。
本製造法において、使用する形質転換体、特には形質転換された微生物は、液体 培地に菌株を培養して得られた培養物、培養液から分離した菌体、あるいは菌体ま たは培養物を処理して得られる乾燥菌体、もしくは固定ィ匕菌体などのいずれの形態 のものも用いることができ、さらに該形質転換体から単離された酵素はそれを粗製の ものも、精製したものも、また固定ィ匕されたものなどのいずれの形態のものも用いるこ とがでさる。
操作は回分式、半回分式、または、連続式のいずれでも行なうことができる。使用 するマンナン含有基質 (あるいはマンノース含有多糖基質又はマンノース含有糖鎖基 質)の濃度は、特に、限定されず、好適な結果が得られる範囲を適宜選択できる。反 応温度は、通常、 10〜60°Cである力 好ましくは 20〜50°C、より好ましくは 30〜47°C である。反応時間は、回分式の場合、通常、数時間から 7日間である。反応系の pHは 、通常、 3〜9程度であるがより好ましくは 6〜8である。
本発明の当該マンナナーゼなどのポリペプチド等は、本発明で同定された当該マ ンナナーゼタンパク質等の、生物学的活性などの機能 (例えば、マンナンへの結合、 マンノース含有糖鎖分解活性などの触媒活性など)を促進する化合物 (促進剤)や阻 害する化合物（阻害剤)又はそれらの塩をスクリーニングするための試薬として有用 である。力べして、本発明の当該マンナナーゼタンパク質などのポリペプチド、その一 部のペプチド又はそれらの塩を用いた、本発明の当該マンナナーゼタンパク質とい つたポリペプチド、その一部のペプチド（トランケーシヨン'ミュータント（変異体）を含む )又はそれらの塩などの生物学的活性などの機能 (例えば、マンナン親和性、糖鎖分 解活性など)を促進する化合物 (促進剤又はァゴニスト)や阻害する化合物（阻害剤 又はアンタゴ-スト)又はそれらの塩のスクリーニング方法も提供される。
該スクリーニングでは、例えば (0本発明のポリペプチド、その一部のペプチド又は それらの塩 (該ポリペプチドを発現する形質転換体を含んで ヽてもよヽ、以下同様） などに適当な基質を接触させた場合と、 GO本発明のタンパク質、その一部のぺプチ ド又はそれらの塩などに基質及び試験試料を接触させた場合との比較を行う。具体 的には、上記スクリーニングでは、当該生物学的活性 (例えば、各マンノース含有糖 鎖と当該マンナナーゼ活性を持つポリペプチドとの間の相互作用に関連した活性、 タンパク分解活性など)を測定して、比較する。
基質としては、各マンナナ一ゼの基質となることのできるものであれば何れのもので あってよい。例えば、公知のマンナナ一ゼの基質として知られているものの中力ら選 んで用いることができるが、好ましくはマンナン、マンノース含有多糖、マンノース含 有糖鎖化合物、合成されたィ匕合物などを使用できる。基質は、そのまま使用できるが 、好ましくはフルォレツセインなどの蛍光、酵素や放射性物質で標識したものを使用 できる。
試験試料としては、例えばタンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、糖含有ィ匕 合物、合成化合物、発酵生産物、植物抽出物、藻類抽出物、動物などの組織抽出 物、細胞抽出物などが挙げられる。試験試料に使用される試験化合物の例には、好 ましくは抗マンナナーゼ抗体、酵素阻害剤、各種インヒビター活性を有する化合物、 特には合成化合物などを含んでいてよい。これら化合物は、新規な化合物であって もよいし、公知の化合物であってもよい。該スクリーニングは、通常の結合活性あるい は酵素活性の測定法に準じて実施することができ、例えば当該分野で公知の方法な どを参考にして行うことができる。また、各種標識、緩衝液系その他適当な試薬等を 使用したり、そこで説明した操作等に準じて行うことができる。使用ペプチドなどは、 活性化剤で処理したり、その前駆体を活性型のものに予め変換しておくこともできる。 測定は通常 Tris-HCl緩衝液、リン酸塩緩衝液などの反応に悪影響を与えな ヽような 緩衝液等の中で、例えば、 pH約 4〜約 10 (好ましくは、 pH約 6〜約 8)において行うこ とができる。これら個々のスクリーニングにあたっては、それぞれの方法における通常 の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発明の当該マンナナ一 ゼあるいはそれと実質的に同等な活性を有するポリペプチドあるいはペプチドに関連 した測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説 、成書などを参照することができる〔例えば、 "Methods in Enzymology" series, Acade mic Press社 (USA)発行)など参照〕。
別の面では、本発明はァヮビ 'マンナナーゼタンパク質ファミリーに属する天然型（ ネイティブ）のマンナナーゼポリペプチド（特には、内在性 (endogenous)マンナナーゼ 活性ポリペプチド)に関し、該マンナナーゼポリペプチドに関連付けられる活性 (例え ば、マンナン結合性あるいはマンンース含有糖鎖分解活性など）を有し且つ SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、 SEQ ID NO:9のアミノ酸配列及び SEQ ID ΝΟ:11のアミノ酸配 列から成る群力も選ばれた配列のうちの、（1)触媒活性コアドメイン、（2)マンナン結合 ドメイン、（3)マンナン認識ドメイン、及び/又は (4)トランケーシヨン'ミュータント (変異 体)からなる群から選択された連続したアミノ酸残基を少なくとも有するポリペプチドの 一種であり且つ天然の当該ァヮビマンナナ一と実質的に同等な活性を有することを 特徴とするポリペプチドまたはその塩、より好ましくは当該ァヮビマンナナーゼまたは その塩と、実質的に同等な活性を有するか、あるいは実質的に同等の一次構造コン フオメーシヨンを持つ該ポリペプチドの少なくとも一部あるいは全部を有するポリぺプ チドを、大腸菌などの原核生物ある 、は動物細胞などの真核生物で発現させること を可能にする DNAや RNAなどの核酸に関する。またこうした核酸、特には DNAは、（a) 配列表の SEQ ID NO:2のアミノ酸配列、 SEQ ID NO:9のアミノ酸配列及び SEQ ID N 0:11のアミノ酸配列から成る群力も選ばれた配列またはその断片をコードできる配列 あるいはそれと相補的な配列、（b)該 (a)の DNA配列またはその断片とハイブリダィズ することのできる配列、及び (c)該 (a)又は (b)の配列にノ、イブリダィズすることのできる 縮重コードを持った配列であることができる。ここでノ、イブリダィズの条件としては、ス トリンジヱントな条件であることができる。こうした核酸で形質転換され、本発明の該ポ リペプチドを発現できる大腸菌などの原核生物あるいは動物細胞などの真核生物も 本発明の特徴をなす。
本発明の DNA配列は、これまで知られていなかった哺乳動物のタンパク質のァミノ 酸配列に関する情報を提供しているから、こうした情報を利用することも本発明に包 含される。こうした利用としては、例えば当該ァヮビマンナナーゼ及び関連ポリべプチ ドをコードする軟体動物、好ましくは巻貝や二枚貝（特に好ましくはァヮビ及びその仲 間、サザェ、タマキビを含む）などの、ゲノム DNA及び cDNAの単離及び検知のため のプローブの設計などが挙げられる。
本明細書中で開示した標的酵素タンパク質及びそれに関連したタンパク質、そのフ ラグメント、さらには DNAを含めた核酸 (mRNAやオリゴヌクレオチドを含む)は、それら を単独あるいは有機的に使用し、更にはアンチセンス法、モノクローナル抗体を含め た抗体、トランスジェ-ク藻類などの技術とも適宜組合わせて、ゲノミックス及びプロテ ォミックス技術に応用できる。力べして、一塩基多型 (SNP; single nucleotide polymorp hisms)を中心とした遺伝子多型解析、核酸アレイ、タンパク質アレイを使用した遺伝 子発現解析、遺伝子機能解析、タンパク質間相互作用解析、生理機能解析、制御 薬物感受性解析をすることが可能となる。例えば、核酸アレイ技術では、 cDNAライブ ラリーを使用したり、 PCR技術で得た DNAを基板上にスポッティング装置で高密度に 配置して、ノ、イブリダィゼーシヨンを利用して試料の解析が行われる。該アレイィ匕は、 針あるいはピンを使用して、あるいはインクジエトプリンティング技術などでもって、スラ イドガラス、シリコン板、プラスチックプレートなどの基板のそれぞれ固有の位置に DN Aが付着せしめられることによりそれを実施することができる。該核酸アレイ上でのハ イブリダィゼーシヨンの結果得られるシグナルを観察してデータを取得する。該シダナ ルは、螢光色素などの標識（例えば、 Cy3, Cy5, BODIPY, FITC, Alexa Fluor dyes ( 商品名)， Texas red (商品名)など)より得られるものであってよい。検知にはレーザー スキャナーなどを利用することもでき、得られたデータは適当なアルゴリズムに従った プログラムを備えたコンピューターシステムで処理されてよい。また、タンパク質アレイ 技術では、タグを付された組換え発現タンパク質産物を利用してよぐ二次元電気泳 動 (2_DE)、酵素消化フラグメントを含めての質量分析 (MS)(これにはエレクトロスプレ 一イオン化法 (electrospray ionization: ESI),マトリックス支援レーザー脱離イオン化法 (.matrix-assisted laser desorption/ionization: MALDI)などの技 fe"か含まれ、 MALDI— TOF分析計、 ESI-3連四重極分析計、 ESI-イオントラップ分析計などを使用してよい） 、染色技術、同位体標識及び解析、画像処理技術などが利用されることができる。し たがって、本発明には上記で得られるあるいは利用できる標的酵素及びそれに対す る抗体に関連したソフトウェア、データベースなども含まれてよい。本発明の cDNAを プローブなどとして用いれば、例えばノーザン 'ブ口ティング、サザン 'ブ口ティング、 in situハイブリダィゼーシヨンなどにより糸且織中での当該マンナナーゼ mRNAの発現や 当該マンナナーゼタンパク質遺伝子自体などを検出'測定でき、その酵素活性の役 割、酵素産生機構などに関連して生起する生物学的過程 (プロセス)等の研究の発 展に貢献できる。当該マンナナーゼタンパク質に関連した代謝及び発現制御の解明 にも役立つ。
本明細書中、「抗体」との用語は、広義の意味で使用されるものであってよぐ所望 の当該マンナナーゼポリペプチド及び関連ペプチド断片に対するモノクローナル抗 体の単一のものや各種ェピトープに対する特異性を持つ抗体組成物であってよぐ また 1価抗体または多価抗体並びにポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を 含むものであり、さらに天然型 (intact)分子並びにそれらのフラグメント及び誘導体も 表すものであり、 F(ab') , Fab'及び Fabといったフラグメントを包含し、さらに少なくとも
2
二つの抗原又はェピトープ（epitope)結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体 、又は、例えば、クヮドローム (quadrome),トリオーム (triome)などの二重特異性組換え 抗体、種間雑種抗体、抗イディォタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは力卩ェな どされてこれらの誘導体と考えられるもの、公知の細胞融合又はハイプリドーマ技術 や抗体工学を適用したり、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体 生成の観点力 公知である従来技術を適用したり、 DNA組換え技術を用 、て調製さ れる抗体、本明細書で記載し且つ定義する標的抗原物質あるいは標的ェピトープに 関して中和特性を有したりする抗体又は結合特性を有する抗体を包含して!/ヽてよ!、 。特に好ましい本発明の抗体は、天然型の当該マンナナーゼポリペプチドを特異的 に識別できるものであり、例えば、公知のマンナナーゼ類タンパク質とは区別してそ れを認識できるものである。本発明のマンナナーゼの特徴的な配列、例えば SEQ ID NO:2のアミノ酸配列のうちの SEQ ID NO:3に存在する連続したアミノ酸配列、 SEQ ID NO:4〜6の 、ずれかの配列、該マンナナーゼの触媒活性コアドメインの特徴的な配 列を実質的に維持しているものなどを特異的に認識できる抗体なども挙げられる。 抗原物質に対して作製されるモノクローナル抗体は、培養中の一連のセルラインに より抗体分子の産生を提供することのできる任意の方法を用いて産生される。修飾語 「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団から得られて 、ると 、うその抗体の 性格を示すものであって、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要が あるとみなしてはならない。個々のモノクローナル抗体は、 自然に生ずる力もしれない 変異体が僅かな量だけ存在して 、る力もしれな 、と 、う以外は、同一であるような抗 体の集団を含んでいるものである。モノクローナル抗体は、高い特異性を持ち、それ は単一の抗原性をもつサイトに対して向けられているものである。異なった抗原決定 基 (ェピトープ)に対して向けられた種々の抗体を典型的には含んでいる通常の（ポリ クローナル)抗体調製物と対比すると、それぞれのモノクローナル抗体は当該抗原上 の単一の抗原決定基に対して向けられているものである。その特異性に加えて、モノ クローナル抗体は、ハイプリドーマ培養により合成され、他のィムノグロブリン類の夾 雑がないあるいは少ない点でも優れている。モノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体 及びリコンビナント抗体を含むものである。それらは、所望の生物活性を示す限り、そ の由来やィムノグロブリンクラスやサブクラスの種別に関わりなぐ可変領域ドメインを 定常領域ドメインで置き換えたり、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を 別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合せし めたりして得ることができる。
[0071] モノクローナル抗体を製造する好適な方法は、 G. Kohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495- 497 (1975)); J.J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (Immunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal A ntibodies), Academic Press, New York (198b;; Edward Harlow and David Lane (ed.), "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988; I SBN: 0-87969-314-2)ある!/ヽはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれ を参照することにより本明細書の開示に含められる)を参照できる。
以下、モノクローナル抗体を例に挙げて、抗体の作製につき詳しく説明する。本発 明のモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術 (例えば、 G. K ohler and C. Milstein, Nature, 256, pp.495- 497 (1975》など)を利用して得られたモノ クローナル抗体であってよぐ例えば次のような工程で作製できる。
1.免疫原性抗原の調製
2.免疫原性抗原による動物の免疫
3.ミエローマ細胞 (骨髄腫細胞）の調製
4.抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
5.ハイプリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローンィ匕
6.モノクローナル抗体の製造
[0072] 1.免疫原性抗原の調製
抗原としては、上記で記載してあるように、当該マンナナーゼポリペプチド又はそれ 力も誘導された断片を単離したものを用いることもできるが、決定された当該マンナナ ーゼのアミノ酸配列情報を基に、適当なオリゴペプチドをィ匕学合成しそれを抗原とし て利用することができる。代表的には配列表の SEQ ID NO :2に存在するアミノ酸残基 のうちの連続した少なくとも 5個のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる。
抗原は、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できるが、 免疫原性コンジュゲートなどにしてもよい。例えば、免疫原として用いる抗原は、当該 マンナナーゼを断片化したもの、あるいはそのアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領 域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成して得られた合成ポリペプチド断片 であってもよい。また、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体タンパク質類と 結合させてハプテン—タンパク質の如き免疫原性コンジュゲートとし、これを用いて特 定の配列のみと反応できる（ある 、は特定の配列のみを認識できる）モノクローナル 抗体をデザインするのに用いることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシ スティン残基などを付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにして おくことができる。担体タンパク質類と結合させるにあたっては、担体タンパク質類は まず活性化されることができる。こうした活性ィ匕にあたり活性ィ匕結合基を導入すること が挙げられる。
活性ィ匕結合基としては、（1)活性ィ匕エステルあるいは活性ィ匕カルボキシル基、例え ば-トロフエ-ルエステル基、ペンタフルオロフェ-ルエステル基、 1-ベンゾトリァゾー ルエステル基、 N-スクシンイミドエステル基など、（2)活性ィ匕ジチォ基、例えば 2-ピリジ ルジチォ基などが挙げられる。担体タンパク質類としては、キーホール 'リンペット'へ モシァニン (KLH)、牛血清アルブミン (BSA)、卵白アルブミン、グロブリン、ポリリジンな どのポリぺプタイド、細菌菌体成分、例えば BCGなどが挙げられる。
2.免疫原性抗原による動物の免疫
免疫は、当業者に知られた方法により行うことができ、例えば村松繁、他編、実験生 物学講座 14、免疫生物学、丸善株式会社、昭和 60年、 日本生化学会編、続生化学 実験講座 5、免疫生化学研究法、東京化学同人、 1986年、日本生化学会編、新生化 学実験講座 12、分子免疫学 III、抗原 ·抗体 ·補体、東京化学同人、 1992年； D Catt y (ed.)、 'Antibodies: a practical approach , Vol. 1 & 2, IRL Press, Oxford, England (1989)などに記載の方法に準じて行うことができる。免疫化剤を (必要に応じアジュバ ントと共に）一回又はそれ以上の回数哺乳動物に注射することにより免疫化される。 代表的には、該免疫化剤及び Z又はアジュバントを哺乳動物に複数回皮下注射あ るいは腹腔内注射することによりなされる。免疫化剤は、上記抗原ペプチドあるいは その関連ペプチド断片を含むものが挙げられる。免疫化剤は、免疫処理される哺乳 動物にお!、て免疫原性であることの知られて 、るタンパク質 (例えば上記担体タンパ ク質類など）とコンジュゲートを形成せしめて使用してもよい。アジュバントとしては、例 えばフロイント完全アジュバント、リビ (Ribi)アジュバント、百日咳ワクチン、 BCG、リピッ A、リボソーム、水酸化アルミニウム、シリカなどが挙げられる。免疫は、例えば BALB /cなどのマウス、ノ、ムスター、その他の適当な動物を使用して行われる。抗原の投与 量は、例えばマウスに対して約 1〜約 400 g/動物で、一般には宿主動物の腹腔内 や皮下に注射し、以後 1〜4週間おきに、好ましくは 1〜2週間ごとに腹腔内、皮下、 静脈内あるいは筋肉内に追加免疫を 2〜10回程度反復して行う。免疫用のマウスとし ては BALB/c系マウスの他、 BALB/c系マウスと他系マウスとの F1マウスなどを用いる こともできる。必要に応じ、抗体価測定系を調製し、抗体価を測定して動物免疫の程 度を確認できる。本発明の抗体は、こうして得られ免疫された動物カゝら得られたもの であってよぐ例えば、抗血清、ポリクローナル抗体等を包含する。
[0074] 3.ミエローマ細胞 (骨髄腫細胞）の調製
細胞融合に使用される無限増殖可能株 (腫瘍細胞株）としては免疫グロブリンを産 生しない細胞株から選ぶことができ、例えば P3-NS-l-Ag4-l (NS-1, Eur. J. Immunol ., 6: 511-519, 1976)、 SP— 2/0— Agl4 (SP— 2, Nature, 276: 269—270,1978)、マウスミエ ローマ MOPC- 21セルライン由来の P3- X63- Ag8- Ul (P3U1, Curr. topics Microbiol. Immunol, 81: 1-7, 1978 )、 P3- X63- Ag8 (X63, Nature, 256: 495-497, 1975 )、 P3- X 63- Ag8- 653 (653, J. Immunol, 123: 1548-1550, 1979)などを用いることができる。 8- ァザグァ -ン而す性のマウスミエローマ細胞株はダルベッコ MEM培地 (DMEM培地)、 R PMI-1640培地などの細胞培地に、例えばペニシリン、アミカシン、ゲンタマイシンなど の抗生物質、牛胎児血清 (FCS)、グルタミン、 2-メルカプトエタノールなどを適宜カロえ 、さらに 8-ァザグァニン (例えば 5〜45 g/ml)をカ卩えた培地で継代される力 細胞融 合の 2〜5日前に正常培地で継代して所要数の細胞株を用意することができる。また 使用細胞株は、凍結保存株を約 37°Cで完全に解凍したのち RPMI-1640培地などの 正常培地で 3回以上洗浄後、正常培地で培養して所要数の細胞株を用意したもの であってもよい。
[0075] 4.抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合
上記 2.の工程に従い免疫された動物、例えばマウスは最終免疫後、 2〜5日後に その脾臓が摘出され、それから脾細胞懸濁液を得る。脾細胞の他、生体各所のリン パ節細胞を得て、それを細胞融合に使用することもできる。こうして得られた脾細胞 懸濁液と上記 3.の工程に従い得られたミエローマ細胞株を、例えば最小必須培地（ MEM培地)、 DMEM培地、 RPMI-1640培地などの細胞培地中に置き、細胞融合剤、 例えばポリエチレングリコールを添加する。細胞融合剤としては、この他各種当該分 野で知られたものを用いることができる。好ましくは、例えば 30〜60%のポリエチレン グリコールを 0.5〜2mlカ卩えることができ、分子量力 l,000〜8,000のポリエチレングリコ ールを用いることができ、さらに分子量力 1,000〜4,000のポリエチレングリコールがよ り好ましく使用できる。融合培地中でのポリエチレングリコールの濃度は、例えば 30〜 60%となるようにすることが好ましい。必要に応じ、例えばジメチルスルホキシドなどを 少量加え、融合を促進することもできる。融合に使用する脾細胞（リンパ球）：ミエロー マ細胞株の割合は、例えば 1:1〜20:1とすることが挙げられる力 より好ましくは 4:1〜 7:1とすることができる。融合反応を 1〜10分間行い、次に RPMト 1640培地などの細胞 培地を加える。融合反応処理は複数回行うこともできる。融合反応処理後、遠心など により細胞を分離した後選択用培地に移す。
5.ハイプリドーマ（融合細胞）の選択及びモノクローンィ匕
選択用培地としては、例えばヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む、 F CS含有 MEM培地、 RPMI-1640培地などの培地（所謂 HAT培地）が挙げられる。選択 培地交換の方法は、一般的には培養プレートに分注した容量と等容量を翌日加え、 その後 1〜3日ごとに HAT培地で半量ずつ交換するというように処理することができ る力 適宜これに変更を加えて行うこともできる。また融合後 8〜16日目には、アミノブ テリンを除いた、所謂 HT培地で 1〜4日ごとに培地交換をすることができる。フィーダ 一として、例えばマウス胸腺細胞を使用することもでき、それが好ましい場合がある。 ノ、イブリドーマの増殖のさかんな培養ゥエルの培養上清を、例えば放射免疫分析 (R IA)、酵素免疫分析 (ELISA)、蛍光免疫分析 (FIA)などの測定系、あるいは蛍光惹起細 胞分離装置 (FACS)などで、所定の断片ペプチドを抗原として用いたり、あるいは標 識抗マウス抗体を用いて目的抗体を測定するなどして、スクリーニングしたりする。 目的抗体を産生しているハイプリドーマをクローユングする。クロー-ングは、寒天 培地中でコロニーをピック'アップする力、あるいは限界希釈法によりなされうる。限界 希釈法でより好ましく行うことができる。クローユングは複数回行うことが好まし 、。
[0077] 6.モノクローナル抗体の製造
得られたハイプリドーマ株は、 FCS含有 MEM培地、 RPMI-1640培地などの適当な 増殖用培地中で培養し、その培地上清力 所望のモノクローナル抗体を得ることが 出来る。大量の抗体を得るためには、ハイプリドーマを腹水化することが挙げられる。 この場合ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性動物の腹腔内に各ハイプリ ドーマを移植し、増殖させるか、あるいは例えばヌード'マウスなどに各ノ、イブリドーマ を移植し、増殖させ、該動物の腹水中に産生されたモノクローナル抗体を回収して得 ることが出来る。動物はハイプリドーマの移植に先立ち、プリスタン (2,6,10,14-テトラメ チルペンタデカン)などの鉱物油を腹腔内投与しておくことができ、その処理後、ハイ プリドーマを増殖させ、腹水を採取することもできる。腹水液はそのまま、あるいは従 来公知の方法、例えば硫酸アンモニゥム沈殿法などの塩析、セフアデックスなどによ るゲルろ過法、イオン交換クロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外ろ過法、ァ フィ-ティ ·クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグラフィー法などにより精製してモ ノクローナル抗体として用いることができる。好ましくは、モノクローナル抗体を含有す る腹水は、硫安分画した後、 DEAE—セファロースの如き、陰イオン交換ゲル及びプ 口ティン Aカラムの如きァフィ二ティ'カラムなどで処理し精製分離処理できる。特に好 ましくは抗原又は抗原断片（例えば合成ペプチド、組換え抗原タンパク質あるいはぺ プチド、抗体が特異的に認識する部位など)を固定ィ匕したァフィ二ティ'クロマトグラフ ィー、プロテイン Aを固定ィ匕したァフィ二ティ'クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイト' クロマトグラフィーなどが挙げられる。
[0078] またこうして大量に得られた抗体の配列を決定したり、ノ、イブリドーマ株力も得られ た抗体をコードする核酸配列を利用して、遺伝子組換え技術により抗体を作製するこ とも可能である。当該モノクローナル抗体をコードする核酸は、例えばマウス抗体の 重鎖や軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプロ一 ブを使用するなどの慣用の手法で単離し配列決定することができる。一旦単離され た DNAは、上記したようにして発現ベクターに入れ、宿主細胞に入れることができる。 該 DNAは、例えばホモジーニアスなマウスの配列に代えて、他の特定の動物の重鎖 や軽鎖の定常領域ドメインをコードする配列に置換するなどして修飾することが可能 である。カゝくして所望の結合特異性を有するキメラ抗体やハイブリッド抗体も調製する ことが可能である。また、抗体は、下記するような縮合剤を用いることを含めた化学的 なタンパク質合成技術を適用して、キメラ抗体やハイブリッド抗体を調製するなどの修 飾をすることも可能である。バイスぺシフィックな抗体を製造する方法も当該分野で知 られている (Millstein et al, Nature, 305: pp.537- 539 (1983); WO93/08829; Traunec ker et al., EMBO J., 10: pp.3655— 3659 (1991); Suresh et al., "Methods in Enzymolo gy", Vol. 121, pp.210 (1986))。さらにこれら抗体をトリプシン、パパイン、ペプシンなど の酵素により処理して、場合により還元して得られる Fab、 Fab'、 F(ab') といった抗体
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フラグメントにして使用してもよい。
本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体を用い、抗原抗体反応を行わせる ことにより、本発明の標的ポリペプチドまたは該ポリペプチドを含む糸且織あるいはサン プル (試料)を免疫学的に検出することができる。
免疫学的に検出および定量する方法としては、蛍光抗体法、酵素免疫測定法 (ELI SA法)、放射免疫測定法 (RIA)、免疫組織染色法、免疫細胞染色法等の免疫組織ィ匕 学染色法 (ABC法、 CSA法等)、ウェスタンブロッテイング法、ドットブロッテイング法、免 疫沈降法、サンドイッチ ELISA法〔富山朔二ら (編)、「単クローン抗体実験マニュアル（ 講談社サイエンティフィック）」、講談社 (1987; ISBN: 4061535021); 日本生化学会 (編) 、「続生化学実験講座 5、免疫生化学研究法」、東京化学同人 (1986; ISBN: 4807910 396);安東民衛ら (著）、「単クローン抗体実験操作入門」講談社 (1991; ISBN: 406153 520X)〕等が挙げられる。蛍光抗体法とは、標的ポリペプチドを細胞内あるいは細胞 外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本発明の抗体を 反応させ、さらにフルォレツセイン ·イソチオシァネート (FITC)等の蛍光物質でラベル した抗マウス IgG抗体ある 、はその断片を反応させた後、蛍光色素をフローサイトメ一 ターで測定する方法である。酵素免疫測定法 (ELISA法)とは、該ポリペプチドを細胞 内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、本 発明の抗体を反応させ、さらにペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵 素標識あるいはピオチン-アビジン系標識等を施した抗マウス IgG抗体ある 、は結合 断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法である。 RIAとは、該ポ リペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞 または組織に、本発明の抗体を反応させ、さらに放射標識を施した抗マウス IgG抗体 あるいはその断片を反応させた後、シンチレーシヨンカウンタ一等で測定する方法で ある。免疫細胞染色法、免疫組織染色法とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞 外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織に、該ポリペプチドを 特異的に認識する抗体を反応させ、さらに FITC等の蛍光物質、ペルォキシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ等の酵素標識あるいはピオチン-アビジン系標識等を施した 抗マウス IgG抗体あるいはその断片を反応させた後、顕微鏡を用いて観察する方法 である。
ウェスタンブロッテイング法とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現し た微生物、動物細胞ある 、は昆虫細胞または組織の抽出液を SDS-ポリアクリルアミド ゲノレ電: [Antibodies— A Laboratory Manual, し old SpnngHarbor Laboratory, 988)〕で分画した後、該ゲルを PVDF膜あるいは-トロセルロース膜にブロッテイング し、該膜に該ポリペプチドを特異的に認識する抗体を反応させ、さらに FITC等の蛍 光物質、ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素標識あるいはビォチ ン-アビジン系標識等を施した抗マウス IgG抗体あるいはその断片を反応させた後、 確認する方法である。ドットブロッテイング法とは、該ポリペプチドを細胞内あるいは細 胞外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液をニトロセ ルロース膜にブロッテイングし、該膜に本発明の抗体を反応させ、さらに FITC等の蛍 光物質、ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等の酵素標識あるいはビォチ ン-アビジン系標識等を施した抗マウス IgG抗体あるいは結合断片を反応させた後、 確認する方法である。免疫沈降法とは、本発明のポリペプチドを細胞内あるいは細胞 外に発現した微生物、動物細胞あるいは昆虫細胞または組織の抽出液を該ポリぺプ チドを特異的に認識する抗体と反応させた後、プロテイン G-セファロース等ィムノグロ ブリンに特異的な結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法で ある。サンドイッチ ELISA法とは、標的ポリペプチドを特異的に認識する抗体で、抗原 認識部位の異なる 2種類の抗体のうち、あら力じめ一方の抗体をプレートに吸着させ 、もう一方の抗体を FITC等の蛍光物質、ペルォキシダーゼ、アルカリフォスファタ一 ゼ等の酵素標識あるいはピオチン-アビジン系標識等で標識しておき、抗体吸着プ レートに、該ポリペプチドを細胞内あるいは細胞外に発現した微生物、動物細胞ある いは昆虫細胞または組織の抽出液を反応させた後、標識した抗体を反応させ、標識 物質に応じた反応を行う方法である。
抗体などの標識としては、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、補欠分子類、補酵素 、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物 質、発色物質、磁気物質、金属粒子、例えば金コロイドなど、放射性物質などを挙げ ることができる。酵素としては、脱水素酵素、還元酵素、酸化酵素などの酸化還元酵 素、例えばアミノ基、カルボキシル基、メチル基、ァシル基、リン酸基などを転移する のを触媒する転移酵素、例えばエステル結合、グリコシド結合、エーテル結合、ぺプ チド結合などを加水分解する加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどを 挙げることができる。酵素は複数の酵素を複合的に用いて検知に利用することもでき る。例えば酵素的サイタリングを利用することもできる。
抗原あるいは抗体を固相化できる多くの担体が知られており、本発明ではそれらか ら適宜選んで用いることができる。担体としては、抗原抗体反応などに使用されるもの が種々知られており、本発明にお 、ても勿論これらの公知のものの中から選んで使 用できる。特に好適に使用されるものとしては、例えばガラス (例えば活性ィ匕ガラス、 多孔質ガラスなど）、シリカゲル、シリカ—アルミナ、アルミナ、磁化鉄、磁化合金など の無機材料、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビ-リデン、ポ リ酢酸ビュル、ポリメタタリレート、ポリスチレン、スチレン ブタジエン共重合体、ポリ アクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、スチレン メタタリレート共重合体、ポリダリシジ ルメタタリレート、ァクロレイン エチレングリコールジメタタリレート共重合体など、架 橋化アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、デキストラン、ァガロース、架橋ァガロース、セ ルロース、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、セノレロースアセテートな どの天然または変成セルロース、架橋デキストラン、ナイロンなどのポリアミド、ポリウレ タン、ポリエポキシ榭脂などの有機高分子物質、さらにそれらを乳化重合して得られ たもの、細胞、赤血球などで、必要に応じ、シランカップリング剤などで官能性基を導 入してあるものが挙げられる。さら〖こ、ろ紙、ビーズ、試験容器の内壁、例えば試験管 、タイタープレート、タイターゥエル、ガラスセル、合成樹脂製セルなどの合成材料か らなるセル、ガラス、合成材料力もなる固体物質 (物体)の表面などが挙げられる。 これら担体へは、抗体を結合させることができ、好ましくは本発明で得られる抗原に 対し特異的に反応するモノクローナル抗体を結合させることができる。担体とこれら抗 原抗体反応に関与するものとの結合は、吸着などの物理的な手法、あるいは縮合剤 などを用いたり、活性化されたものなどを用いたりする化学的な方法、さらには相互の 化学的な結合反応を利用した手法などにより行うことが出来る。
これら個々の免疫学的測定法を含めた各種の分析'定量法を本発明の測定方法 に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれ の方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて、本発 明の当該対象物質あるいはそれと実質的に同等な活性を有する物質に関連した測 定系を構築すればよい。
これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することがで きる〔例えば、入江寛編， 「ラジオィムノアッセィ」，講談社，昭和 49年発行;入江寛編 , 「続ラジオィムノアッセィ」，講談社，昭和 54年発行;石川栄治ら編， 「酵素免疫測定 法」，医学書院，昭和 53年発行;石川栄治ら編， 「酵素免疫測定法」（第 2版)，医学 書院，昭和 57年発行;石川栄治ら編， 「酵素免疫測定法」（第 3版)，医学書院，昭和 62年発? T ; H. V. Vunakis et ai. \ea.), "Methods in Enzymology , Vol. 70 (Immunoch emical Techniques, Part A), Academic Press, New York (1980); J. J. Langone et al. ( ed.)， "Methods in Enzymology", Vol. 73 (Immunochemical Techniques, Part B), Aca demic Press, New York (1981); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 74 (Immunochemical Techniques, Part C), Academic Press, New York (1981); J . J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 84 (Immunochemical Techn iques, Part D: Selected Immunoassays), Academic Press, New York (1982); J. J. Lan gone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 92 (Immunochemical Techniques, Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), Academic Press , New York (1983); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 121 (I mmunochemical Techniques, Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibod ies), Academic Press, New York (1986); J. J. Langone et al. (ed.), "Methods in Enzy mology", Vol. 178 (Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry), Academic Press, New York (1989); M. Wilchek et al. (ed.), "Methods in Enzymology", Vol. 184 (Avid in- Biotin Technology), Academic Press, New York (1990); J. J. Langone et al. (ed.),
"Methods in Enzymology", Vol. 203 (Molecular Design and Modeling: Concepts and
Applications, Part B: Anibodies and Antigens, Nucleic Acids, Polysaccharides, and Drugs), Academic Press, New York (1991)などあるいはそこで引用された文献（それ らの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる)〕。
本明細書中、「ァヮビ」とは、朥足綱 (GastroDoda)前覦新綱 (Prosobranchia)古朥足 目 (VetigastroDoda)ォキナェビス招科 (Pleurotomarioidea)ミミガイ科 (Haliotidae)の卷貝 の総称で、標準和名：鮑、あわび、英名： giant abalone,学名： Haliotis (Nordotis) dis £ である。 日本国内に生息するァヮビは、クロァヮビ（クロガイ、ォガイ、学名： Halioti s discus discus.英名： Disk abaloneノ、ェゾフクビ (Haliotis discus hannai义は Nordotis discus hannai (Ino. 1951))、マダカァヮビ（ァォガイ： Haliotis madaka)、メガィァヮビ（ ビヮガイ： Haliotis eieantea).トコブシ (Haliotis diversicolor aauatilis)などがあり、これ らは該ァヮビに含められてよい。本明細書中の軟体動物には、腹足綱及び二枚貝綱 に属する動物が含まれてよぐ以下の卷貝類、二枚貝類が包含されてよい。サザェ（ 栄螺）は、腹足綱前鰓亜綱古腹足目二シキゥズ超科 (Trochoidea)リュウテンサザ工科 ( Turbinidae)の卷貝で、英名： horned turban、 'ギ名： Turbo (Batnlus cornutusで これに類するものとしては、シドニーサザェ（英名： Shidoni- Sazae、学名： Turbo torau atus)、リュウテンサザェ（龍天栄螺、英名： tapestry turban,学名： Turbo petholatus) 、ツヤサザェ（英名： crown turbanゝ学名： Turbo cidaris)、ナターノレサザェ（英名： nat al turban、 名： Turbo cidaris natalensis)、チョウセンササェ 名： silver-mouth tur banゝ学名： Turbo argyrostomus) ,ヒダトリサザェ（英名： squamose turoan、ギ名： fur bo sauamosus)、コガタマキミゾサザェ（英名： filose turban,学名： Turbo cailletii)、コ シダカサザェ（英名： Koshidaka- Sazaeゝ学名： Turbo stenqgyrus)、タリイロサザェ（英 名： chestnut turban,学名： Turbo castanea)、 -シキサザェ（錦栄螺、英名： Nishiki- Sazae、学名： Turbo excellens)などが包含される タマキビは、腹足綱前鰓亜綱盤足 目 (Discopoda)タマキビ超科 (Littorinoidea)タマキビガイ科 (Littorinidae)の貝で、英名 ： periwinkle,学名： Littorina breviculaである これに類するものとしては、ェゾタマキ ビガイ（学名： Littorina saualida)などが包含される タツナミガイは、腹足綱後鰓亜綱 (Opisthobranchia)無椐目 (Anaspidea)ァメフラシ超科 (Aplvsioidea)ァメフラシ科 (Aplvsii d^)の貝で、英名： Tatsunami- Gai、学名： Dolabella auriculariaである ァメフラシは、 腹足綱後覦亜綱 (Opisthobranchia)無椐目 (Anaspidea)ァメフラシ科 (Aplvsiidae)の牛. 物で、英名： aplysia kurodai、学名： Aplvsia kurodaiである ムラサキイガイは、二枚貝 綱 (Bivalvia)黧形新綱 (Pteriomorohia)ィガイ目 (Mvtiloida)ィガイ招科 (Mvtiloidea (Mvtil acea))ィ刀ィ科 (Mvtilidae)の貝で、英名： common blue mussel、学名： Mvtilus edulis L innaeusである。その他、ァカガイ（赤貝、 Scapharca brouehtonii (Schrenck))、サノレボ ゥ、モガィ、 Ark snelU Scapharca bcrenata)、トリカイ (Japanese Cockie、 Fulvia mutica) 、 ノ ィガイ (Balylonia iaponica (Reeve))、 ノ ; ^ガイ (Hem clam、 Mactra cninensis). ノヽマ グリ (給、 hard clam、 Meretrix lusoria)、ホタテガイ (帆立貝、 Scallop ^ Pationopecten _ essoensis)、ミノレガイ（海松喰、 Keen' s gaper ^ fresus keenae)、ロコガイ、ナリあわび、 英文名： Chilean abalone、 'ギ名： Concholepas concholepas.口 ~~カル名： Loco (口コ)) 、ロカテ（チリサザェ、英文名： topshell、学名： Thais chocolata、ローカル名： Caracol Locate (カラコール'ロカテ))、ソフトハマグリ（トゥンバオ、英文名： Solid Semele、学名：
Semele solida Gray,ローカル名： Tumbao (トゥンバオ))、ホワイトクラム（クレンゲ、英 文名： pacific clam (while clam入 'ギ名： Gari solida,ロー力ノレ名： Culengue (クレング)) 、ラパスガイ（英文名： limpet、学名： Sissurella SDD、ローカル名： Lapa)、マテガイ（ナ バハ、英文名： razor shall,学名： Ensis macha、ローカル名： Navaja)などが含まれて よい。
海藻は、主な有用成分として多糖類が含まれ、そのなかにはマンナンも挙げられる 。よって、マンナン含有基質 (あるいはマンノース含有多糖基質又はマンノース含有 糖鎖基質)の代表的なものとしては、海藻が挙げられる。海藻は、上記したように、緑 藻類 (例えば、ァォノリ、ヒトェダサ、ァォサ、ミルなど）、紅藻類 (例えば、アマノリ類や テンダサ類など）、褐藻類 (例えば、コンブ、ワカ入ヒジキ、モズクなど）を包含してい る。特に、紅藻類は、基質として有望視されている。海藻は当該マンナナーゼで処理 することにより、該海藻に含有される有用成分の抽出処理、廃棄海藻から有益産物 への変換処理、藻類プロトプラストの形成などの応用において有利である。例えば、 海藻カゝら抽出された多糖類は、寒天、芳香'消臭剤、入れ歯の歯形の印象剤、化粧 品の成分など幅広く利用することができる。また、多糖類の一種であるフコイダンゃァ ルギン酸カリウムなどの抗腫瘍活性や高血圧低下作用等を有する物質の利用を図る のに役立つと期待される。
海藻は、主な有用成分として多糖類が含まれ、海藻カゝら抽出された多糖類は、寒 天、芳香'消臭剤、入れ歯の歯形の印象剤、化粧品の成分、などとして有用で、多糖 類の一種であるフコィダンやアルギン酸カリウムなどには、抗腫瘍活性や高血圧低下 作用等が確認されつつあり、海藻由来多糖類は有用性が高い。海藻より当該マンナ ナーゼを作用させて得られた産物は、藻食性魚貝類用餌、生食 '食品加工用素材 · 機能性食品等用食用材料、薬用材料、肥料、土壌改良剤、染料，潤滑油，化粧品等 の添加剤を含めた工業用原料、バイオマスエネルギー源等に利用できる。
本明細書中、海藻には緑藻類、紅藻類、褐藻類が包含され、原始紅藻 (Protoflorid eophycidae (Bangiophycidae》や真正紅藻亜綱 (Florideophycidae)に属するものを ¾i 含して 、る紅藻植物 (Rhodophyta)、
例えば、ゥシケノリ目（Bangiales)ゥシケノリ属 (E Sk)やアマノリ属 (EoiEta)に属す るもの (例えば、アサクサノリ (Porohyra tenera Kjellman),スサビノリ (Porphyra vezoensi s Ueda)など)、テングサ目（Gelidiales)に属するもの (例えば、 Gelidiella (シマテングサ 属）， Gelidium (テングサ属、例えば、マクサ (Gelidium elegans Kuetzing, amansii L amouroux)、才ニクサ (Gelidium iaponicum (Harvey) Okamura)、ォォブサ (Gelidium ciiicum)など). Pterocladia (ォバクサ属、例えば、ォバクサ (Pterocladiella tenuis (Oka mura) Shimada)など)， Ptilophora (ヒラクサ)， Yatabella (ャタベグサ)など)、スギノリ目（G igartinales)に属するもの (例えば、 Ahnfeltiopsis (ォキッノリ属、ハリガネ属)， Calosiph onia (ヌメリグサ属)， Catenella (イソモッカ属)， Caulacanthus (イソダンッゥ属)， Cerato dictyon (カイメンソゥ属)， Chondrus (ッノマタ属)， Eucheuma (キリンサイ属)， GelidioDsi s (テンダサモドキ属)， Gieartina (スギノリ属)， Gracilaris (ォゴノリ属、例えば、ォゴノリ（ Gracilaria verrucosa)など), Halarachnion (ススカケベニ属)， Hypnea (イノ ラノリ属)， M astocarpus (イボノリ属)， Mazzaella (アカバギンナンソゥ属)， Meristotheca (トサ力ノリ 属）， Phacelocarpus (キジノォ属)， Platoma (二クホウノォ属)， Plocamiumn (ユカリ属)， P ortiena (Chondracoccus) (ナ ノノヽナ , Rhoaoglossum、ィホヤンナン属), Sarcodia ( アツバグサ属)， Schizvmenia (ベニスナゴ属)， Schmitzia (ホウノォ属)， Solieria (ミリン 属)， Stenoeramma (ノヽスジグサ属)， Tvlotus (ナミイワタケ属)など)、ィギス目（Ceramiale s)に属するもの (例えば、 Acanthophora (トゲノリ属)， Acrocvstis (ックシホウヅキ属)， A crosorium (ハイウスバ属）, Acrothamnion (リュウノタマ属）， Amansia (ウスノ ヒォドシ属） , Antithamnion (フタツガサネ属)， Ardissonula (ヒョクソゥ属)， Benzaitenia (ベンテンモ 属）， Bostrvchia (コケモドキ属)， Brachioelossum (ヒゲムラサキ属)， Callithamnion (キヌ イトグサ属)， Caloglossa (アヤギヌ属)， CamDvlaephora (エゴノリ属、例えば、エゴノリ ampvlaephora hvpnaeoides J. Agardh)など),トゲイキス, Ceramium (ィ3 rス禺、例 は 、ィ =^ス (し eramium kondoi Yendo など), し hondna (ュナ属ノ, し ongregatocarous、ノコ ノヽノリ属)， Dasva (ダジァ属)， Delesseria (ヌメノヽノリ属)， Delesseriopsis (ウスムラサキ 属)， Dieenea (マタリ属)， Enantiocladia (アイソメグサ属)， Enelithosiphonia (マキイトグ サ属)， Euptilota (ョッガサネ属)， Griffithsia (カザシグサ属)， Herpochondria (二クサェ グ J¾), Herposiphonia (ヒメゴケ腐), Heterosiphonia (イソノヽ3 r属), Hvpoglossum、ベニ ノヽノリ属)， Leveillea (ジヤノくラノリ属)， Marionella (ハブタエノリ属)， Martensia (アヤ- シキ属)， Melanamansia (ヒォドシグサ属）， Membranoptera (ホソベ-ヤノくネグサ属)， M urravella (ナガミグサ属)， Mvriogramme (スジギヌ属)， Neoholmesia (スズシロノリ属)， Neoptilota (カタヮベ-ヒバ属)， Nithophvllum (ウスバノリ属)， Phvcodrvs (力シヮバコノ ノヽノリ属)， Platvsiphonia (ヒゲウスバ属), Polvsiphonia (イトグサ属）， Pterosiphonia (ノヽ ネグサ属)， Ptilota (クシべ-ヒバ属)， Reinboldiella (チリモミジ属)， Rhodomela (フジマ ツモ属)， Schizoseris (ベニヤハズ属）, Sorella (ウスべ-属)， Spermathamnion (ヒビダ マ属)， Spvridia (ゥブゲグサ属)， S葡 hvocladia (イソムラサキ属)， Tolvpiocladia (ィトク ズグサ属)， Vidalia (力エリナミ属)など)、
褐藻植物 (Phaeophyta)、 例えば、イソガワラ目（Ralfsiales)イソガワラ科 (Ralfsiaceae)に属するもの (例えば、 Ana hpus (マノモ厲、 f列？ マツモ (Analipus iaponicus (Harvey) Wynne; Heterochoraar ia abietina)など), Diplura (クロノヽンモン属)， Endoplura (キンイロノヽンモン属)， Heteror alfsia (イシツギゴビア属)， Ralfsia (イソガワラ属)など)、ナガマツモ目 (Chordariales)に 属するもの (例えば、 Acrothrix (-セモズク属)， Chordaria (ナガマツモ属)， Cladosiph on (ォキナヮモズク属、例えば、ォキナヮモズク (Cladosiphon okamuranus Tokida)など ), Elachista (ナミマクラ属)， Eudesme (-セフトモズク属)， Halothrix (ソメヮケグサ属)， I shiee (イシゲ属)， Leathesia (ネノ リモ属)， Mvrionema. Nemacvstis (モズク属、例えば 、モスク (Nemacvstus decipiens (Sunngar) KUCKUCKなど), Papenlussiella (クロモ属), Petrospongium (シヮノカヮ属)， Sphaerotrichia (イシモズク属)， Stilophora (ヒモマクラ 厲), Tinocladia (フ卜モズク腐、 f列;^ば、フ卜モスク (Tinocladia crassa (Suringar) Kylin など)、コンブ目（Laminariales)に属するもの (例えば、 Aearum (アナメ属)， Alaria (チガ イソ属，アイヌワカメ)， Arthrothamnus (ネコァシコンブ属)， Chorda (ツルモ属)， Costar ia (スジメ属)， Cvmathaere (ミスジコンブ属)， Ecklonia (カジメ属)， Eckloniopsis (アント タメ属)， Eisenia (ァラメ属)， Hedophvllum (クロシオメ属)， Kiellmaniella (トロロコンブ属） , Laminaria (コンブ属、例 ば、 "V^3 (Laminana laponica AreschougAジンジ ノフ、 ochotensis Miyabe)など)， Pseudochorda (二セッノレモ属)， Undaria (ワカメ属、例え ば、ワカメ (Undaria pinnatifida (Harvev) Suringar)など)、ヒバマタ目（Fucales)に属する もの (例えば、 CoccoDhora (スギモク属)， Cvstoseira (ゥガノモク属)， Fucus (ヒバマタ属 ), Hizikia (ヒジキ属、例えば、ヒジキ (Hizikia lusiformis (Harvey) Okamura)など)， Hor mophvsa (ヤノくネモク属)， Pelvetia (ェゾイシゲ属)， Sargassum (ホンダワラ属)， Turbin aria (ラッパモク属)など)、
緑藻植物 (Chlorophyta)
例えば、 Chlorella (クロレラ属)、 Dunaliella (ドウナリエラ属)、ァォサ目 (Ulvales)に属 するもの (例えば、 Blidineia (ヒメァォノリ属)， Enteromorpha (ァオノリ属、例えば、スジ ,ォノリ (Enteromorpha prolifera (Mueller) J.Agardh)、ポ、ゥァ才ノリ intestinalis (Lin naeus) Nees),ヒファオノリ (E^ compressa (Linaeus) Nees)、ウスノヽァォノリ (E^ linza (Lin naeus) J. Agardh)、ボウァォノリ intestinalis (Linnaeus) Nees)など), Kornmannia (モ ツキヒトェグサ属)， Ulva (ァォサ属、例えば、アナァォサ (Ulva pertusa Kiellman)など), Ulvaria (クロヒトェグサ属),ミノレ (Codium fragile (Suringar) Hariot)、ヒトェグサ (Monostr oma nitidum Wittrock)など)が包含される。
[0088] マンナナーゼは、マンナンからマンノビオースやマンノトリオースなど、食品添加物 や医薬品素材として付加価値の高いマンノオリゴ糖を生成する産業上有用な酵素で ある。さらに、マンナナーゼは、一部の海藻の細胞壁を構成するへミセルロースの一 つであるマンナンを分解することから、海藻のプロトプラストの作出に有用な酵素であ ると考免られる。
本発明では、スサビノリなどの海藻のプロトプラストの作出に利用できる酵素探索の 一環としてェゾァヮビ消化液中に含まれるマンナナ一ゼを単離 '精製し、その基本的 酵素特性を分析することに成功した。さらに海藻類のプロトプラストの作出に利用する ェゾァヮビ由来のマンナナーゼを大量'安価に調製する観点から、ェゾァヮビ由来の マンナナーゼの cDNAをクローユングし、大腸菌を用いた発現系の構築にも成功した 。例えば、シグナルペプチドを除く HdManをコードしている cDNAを組み込んだ pET-1 01プラスミドベクターと宿主大腸菌 BL21(DE3)を用いて発現系を構築し、組換え HdM anの発現に成功している。結果は、 1,000 mlの大腸菌培養液力も比活性 2.12 U/mg の組換え HdManが 0.66 mg得られている。組換え HdManはェゾァヮビ天然 HdManと 比較して至適温度、至適 pH、温度安定性に若干の違いが見られたが、ェゾァヮビ天 然 HdManと同様スサビノリを細胞塊に分散することが確認されている。
[0089] 植物細胞のプロトプラストの作出は、細胞融合、 DNAや細胞小器官の細胞力 の抽 出ならびにそれらの細胞への導入、細胞の観察、変異体の作出など利用価値の高 い基礎技術であり（能登谷正浩 編、「有用海藻のバイオテクノロジー」、 pp. 62-72 ( 荒木利芳、プロトプラストの単離技術)、恒星社厚生閣、東京 (1997))、研究のみなら ず育種の分野にも利用可能である。アマノリ属植物においても、プロトプラストは、形 質転換（羽土 真 ほ力、水産増殖， 51, 355-360 (2003))、細胞融合（Mizukami, Y. et al, Aquaculture, 108, 193-205 (1992))、 in situハイブリダィゼーシヨン（Shimizu, Y. et al., J. Appl. PhycoL, 16, 329-333 (2004))などの実験に利用されている。また、 プロトプラストをストレス下で再生させ藻体の選抜を繰り返すことでストレス耐性の品種 を選抜育種することが報告されている（谷田圭亮 ほか、兵庫水試研報， 29, 17-23 ( 1991);増田恵一 ほか、月刊海洋， 27, 655-660 (1995))。海苔養殖で扱われている アマノリ属植物の葉状の配偶体は単相世代であり、交雑の効果は顕著に現れてこな いため（Suto, S., Bull. Jap. Soc. Sci. Fish., 29, 739-748 (1963))、このようなプロトプ ラストを用いた選抜育種は重要な技術である。また、現在、海苔養殖の種苗はカキ殻 糸状体として供給されるが、半年間の培養期間を必要とし、この間の大変な労力と経 費を解消するため、プロトプラストを直接養殖用の種苗として利用することも考えられ ている（川村嘉応 ほか、月刊海洋， 27, 661-665 (1995))。こうした利用に本発明の 技術は応用されよう。
上記したようなプロトプラストを用いた研究や育種を可能にするためには、高品質の プロトプラストを高収率で安定に調製するための方法を確立しなければならな 、。そ のため、プロトプラストの作出に用いる酵素の種類や、最適濃度などについて、純ィ匕 した酵素を用いた詳細な検討が必要であり、このような実験に、本発明で得られた Hd Manは応用できると期待される。さらに、スサビノリのプロトプラストの作出においてそ の効果が認められるキシラナーゼなど、ェゾァヮビマンナナーゼ以外のプロトプラスト の作出に関わる酵素との組合せた利用についても研究が可能となる。
明細書及び図面において、用語は、 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nom enclatureによる力、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基 づくものである。代表的な用語の意味を以下に示す。
タンパク質、ペプチドなどのアミノ酸配列に関しては：
A:ァラニン (Ala) M:メチォニン (Met)
C:システィン (Cys) N:ァスパラギン (Asn)
D:ァスパラギン酸 (Asp) P:プロリン (Pro)
E:グルタミン酸 (Glu) Q:グルタミン (Gin)
F:フエ-ルァラニン (Phe) R:ァノレギ-ン (Arg)
G:グリシン (Gly) S:セリン (Ser)
H:ヒスチジン (His) T:スレオニン (Thr)
I：イソロイシン (He) V：パリン (Val) K:リジン (Lys) W:トリプトファン (Trp)
L:ロイシン (Leu) Y:チロシン (Tyr)
ヌクレオチド配列に関しては：
A:アデニン G:グァニン C:シトシン T:チミン
Y:シトシン又はチミン N:グァニン、アデニン、シトシン又はチミン
R:アデニン又はグァニン
[0091] 以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の 説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの 例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示 する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明で は、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきで ある。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施し たもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なも のである。以下の実施例において、特に指摘が無い場合には、具体的な操作並びに 処理条件などは、 DNAクロー-ングでは J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ne w York (2nd Edition, 1989; ISBN 0-87969-309-6 & 3rd Edition, 2001; ISBN 0-8796 9- 577- 3)及び D. M. Glover et al. ed., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1 to 4, (The P ractical Approach Series), IRL Press, Oxford University Press (1995);特【こ PCR法で は、 H. A. Erlich ed" PCR Technology, Stockton Press, 1989; D. M. Glover et al. ed ., "DNA Cloning", 2nd ed., Vol. 1, (The Practical Approach Series), IRL Press, Oxf ord University Press (1995)及び M. A. Innis et al. ed., "PCR Protocols , Academic Press, New York (1990)に記載の方法に準じて行っているし、また市販の試薬あるい はキットを用いて!/、る場合はそれらに添付の指示書 (protocols)や添付の薬品等を使 用している。
実施例 1
[0092] 本実施例では海産巻貝としてァヮビを用いた。なお、本方法を用いればァヮビ以外 にも、サザェ、タマキビ、タツナミガイ、ァメフラシ、ムラサキイガイ、などからもマンナナ 一ゼを単離できる。
中型ェゾァヮビ（殻長 7 X 8 cm) 20個力 得た粗酵素液（約 40ml)を、 10 mM Na-pho sphate (pH 7.0)に平衡化してある TOYO PEARL CM- 650Mカラム（東ソ一（株）、 2.5 X 26.5 cm)に供した。その結果、マンナナーゼ活性は主に画分 63- 68に溶出した（図 1) 。 TOYO PEARL CM-650Mに吸着したマンナナーゼ高活性画分（画分 63-68)を集め 、もう一度同じ TOYOPEARL CM-650Mカラムで再クロマトグラフィーを行った後、活 性画分を 10 mM Na-phosphate (pH 7.0)に透析し、同溶液に平衡化してあるハイド口 キシアパタイトカラム（1.5 20 cm)に供した。その結果、マンナナ一ゼは画分 57-63 に溶出した（図 2)。上記クロマトグラフィーで得られた高活性画分 (画分 57-63)を Apo llo Centrifogal Concentrator 20ml (Apollo, MA USA)を用いて約 3mlに濃縮した後、こ の濃縮物を TOYOPEARL HW- 50Fカラム（東ソ一（株）、 2 X 90 cm)でゲル濾過した。 その結果、マンナナ一ゼは画分 76-79に溶出した（図 3)。 SDS-ポリアクリルアミドゲル 電気泳動によれば、このように精製したマンナナーゼは分子量約 39,000の単一バン ドを示した（図 3中の写真)。上記の方法で精製したァヮビ ·マンナナ一ゼの比活性は 11.5U/mg、収量は 1.59%であり、粗酵素からの精製度は約 143.1倍であった (表 1)。な お、マンナナーゼ活性は、 5mg/mlの Locust bean gum (ガラタトマンナン）を含む lml の 10 mM Na-phosphate (pH 7.0)中 30°Cで測定した。即ち、一定時間ごとに反応液の 0.1mlを分取し、あらかじめ 100°Cで加熱してある 0.5 mlの 0.1% SDSに加えることにより 反応を停止し、マンナナーゼ作用により遊離した還元糖を Park-Johnson法により定量 した。 1分間の反応により 1 moleのマンノースに相当する還元糖を生成する酵素量 を 1 Uとした。以上のように、ァヮビ 'マンナナーゼは各種クロマトグラフィーを行うこと により高純度に精製された。
[表 1] 口 タンパク質量 全活性 比活性 収率 (%) 精製倍率 粗酵素
精製
ノ、イドロキシアパタイト精製
精製 実施例 2
[0094] 実施例 1で得たァヮビ 'マンナナーゼの酵素活性の pH依存性を調べた。即ち、酢 酸ナトリウム（pH 4.5- 6.0)、リン酸ナトリウム（pH 6.0- 8.5)、およびグリシン- NaOH (pH 8.5- 10.5)で所定の pHに調整した 5mg/mlの Locust bean gumを含む lmlの反応混液 に、ァヮビ 'マンナナーゼ約 0.5Uを加えて酵素反応を行い、反応生成物である還元 糖を定量することにより活性値を算出した。その結果、ァヮビ 'マンナナ一ゼの至適 p Hは 7.5付近であることが明らかになった（図 4)。次に、実施例 1で得たァヮビ 'マンナ ナーゼの酵素活性の温度依存性を調べた。即ち、 10mMリン酸ナトリウム (pH 7.0)と 5 mg/mlの Locust bean gumを含む 1 mlの反応混液中に、ァヮビ 'マンナナ一ゼを約 0.5 Uカロえ 15- 60°Cで活性を測定した。その結果、ァヮビ 'マンナナ一ゼの至適温度は約 4 5°Cであることが明らかになった（図 5)。また、 pH 7.0においては 40°C30分間の加熱 によっても 90%の活性が残存した（図 6)。
実施例 3
[0095] 実施例 1で得たァヮビ 'マンナナーゼの活性におよぼす各種試薬の影響を調べた。
その結果、表 2に示すようにァヮビ 'マンナナーゼの活性は Ag+によってほぼ 100%阻 害され， Co2+, Fe2+, Cu2+によって 40〜50%阻害されることが分かった。
[0096] [表 2]
試薬 相対活性 （
無添加 100
AgN03 0
し丄つ 119. 44
CdCl2 87. 85
CoCl2 49. 65
CuS04 51. 04
ジチオトレイ トール 74, 31
FeCl2 60. 76
MgCl2 96. 18
MnCl2 93. 75
2-メルカプトエタノール 111, . 46 実施例 4
[0097] 本実施例では、実施例 1で得たァヮビ ·マンナナ一ゼの基質特異性を調べた。即ち 、実施例 1で得たァヮビ 'マンナナーゼを、 Locust bean gum (ガラタトマンナン)、 Konja kマンナン（ダルコマンナン）および ivory nutマンナン (直鎖状 β -1,4-マンナン)に作 用させた。その結果、それらはいずれも良く分解されることが分力つた（図 7)。また、 L ocust bean gumを基質とした際の Km値は約 0.8 mg/mlと見積られた。一方、キシラン、 ァガロース、カルボキシメチルセルロース、デキストランは全く分解しなかった。
実施例 5
[0098] 本実施例では、実施例 1で得たァヮビ 'マンナナーゼにより 13 -1,4-マンナンあるい はマンノオリゴ糖を分解した際にどのような生成物が得られる力を分析した。即ち、 β -1,4-マンナン、マンノへキサオース、マンノペンタオース、マンノテトラオース、マンノ トリオースおよびマンノビオース（いずれも Megazyme社）を 4 mM Na- phosphate (pH 7 .0)に 5 mg/mlになるように懸濁あるいは溶解し、 0.5U/mlのァヮビ 'マンナナ一ゼを加 えて分解し、その反応物を薄層クロマトグラフィーで分析した。その結果、図 8に示す ように、ァヮビ 'マンナナーゼは、 j8 - 1,4-マンナンを分解して主にマンノテトラオース 、マンノトリオース、およびマンノビオースを生成した。また、マンノへキサオースをマ ンノテトラオース、マンノトリオース、マンノビオースに、マンノペンタオースをマンノトリ オースとマンノビオースに分解した力 マンノテトラオース、マンノトリオース、およびマ ンノビオースを分解しないことが明らかになった。この結果は、ァヮビ 'マンナナーゼ が j8 - 1,4-マンナンからマンノテトラオース、マンノトリオース、およびマンノビオースを 製造する酵素製剤として有効であることを示して 、る。
実施例 6
[0099] 本実施例では、実施例 1で得たァヮビ 'マンナナーゼを紅藻スサビノリの葉状体に 作用させ、細胞分散能があることを確認した。即ち、葉長約 5 mmのスサビノリ (^ §mk)葉状体を 1.5 mlのテストチューブに入れ、ここにァヮビ 'マンナナーゼを 5U、お よび 0.7Mソルビトールを含む人工海水 lmlを加えて 22°Cのインキュベータ一中で分 解した。その結果、スサビノリの葉状体は 10〜20細胞力も成る細胞塊に分解 ·分散さ れることが明らかになった（図 9)。このことは、ァヮビ 'マンナナーゼが紅藻細胞間の 接着構造多糖であるマンナンを分解し、細胞間接着力を低下させる能力を有するこ とを示している。
実施例 7
[0100] 本実施例では、実施例 1で得たァヮビ 'マンナナーゼの部分アミノ酸配列を決定し、 さらに cDNAをクローユングした。即ち、精製したァヮビ 'マンナナーゼの N末端アミノ 酸配列を ABI社製 Procise492型プロテインシーケンサーで分析した。その結果、 N末 端 27残基のアミノ酸配列は Asp Arg Leu Ser Val Gin Gly Asn His Phe Val Lys Gly G ly Gin Lys Val Phe Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Ala VaK配列番号 3〕と同定された 。さらに、タンパク質内部領域のアミノ酸配列を明らかにするために、 ABI社製 4700型 質量分析計により de novo解析を行った。その結果、 Asp Phe Leu Argほ S列番号 4〕、 Asn His Tyr Ser Asp Ala Cysほ S列番号 5〕、 Asp Thr Trp Ala His Lysほ S列番号 6〕 の配列が決定された。 次に、ァヮビ 'マンナナーゼの cDNAをクローユングするために、ァヮビ肝脾臓から 定法に従い mRNAを調製した。ァヮビの Total RNA抽出は、次のように行った。ァヮビ 内臓組織 (5g)を 4M GTC溶液（4M GTC, 25mMクェン酸ナトリウム (pH7.0), 0.5%サル コシル）（50ml)でホモジナイズ処理した後、 2M酢酸ナトリウム (5ml, pH4.0)をカ卩ぇ均一 化し、次に等量の水飽和フ ノールをカ卩えて均一化し、遠沈管に分注後、クロ口ホル ム 'イソァミルアルコール (50:1)を 1/5量カ卩ぇボルテックスし、氷上に 15分間静置し、次 に 4°Cで遠心 (5000g, 20min)して遠心上層を回収後、等量のイソプロパノール、 1/2量 の 0.8Mクェン酸ナトリウム- 1.2M NaClをカ卩えて、室温で 10分間放置後、 4°Cで遠心 (5 OOOg, lOmin)して、上清を捨て、次に得られた沈殿を 4M GTC溶液を加え溶解し、イソ プロパノール， 1/2量 0.8Mクェン酸ナトリウム- 1.2M NaClをカ卩え、 - 20°Cで 30分間静置 後、 4°Cで遠心（12000rpm、 lOmin)して上清を捨て、得られた沈殿を 80%エタノール で洗浄してから、 4°Cで遠心（12000rpm、 lOmin)し、 Total RNAサンプルを得た。
Total RNAサンプルから mRNAを精製するには、 Oligotex™- dT30〈Super〉 (TaKaRa 、 日本)を使用して行った。操作は当該キットのプロトコルに従った。試料溶液に Oligo tex- (1丁30〈3 61"〉を加え、終濃度 0.8M程度の NaCl存在下、 37°Cで poly(A)- oligo(dT) 間にハイブリッドを形成させた後、 mRNA-Oligotex複合体を回収し、次にこの複合
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体に滅菌水、あるいは低塩濃度のバッファーを加えて 65°C、 5分間の熱処理を行い、 mRNAを溶出する。
こうして得られた mRNA力も逆転写反応により cDNAを作成した。さらに、決定した上 記 N末端配列（Asp Arg Leu Ser Val Gin Gly Asn His Phe Val Lys Gly Gly Gin Lys Val Phe Leu Ser Gly Ala Asn Leu Ala Ala Valほ己列番号 3〕 )と内部アミノ酸配列（Asp
Thr Trp Ala His Lysほ S列番号 6〕）に基づき、表 3に示す PCR用の縮重プライマーを 合成した。配列表の配列番号 7及び 8(SEQ ID NOs:7 & 8)のプライマーと Marathon™ cDNA Amplification Kit (Clontech社)を使用し、配列表の配列番号 7及び 8(SEQ ID NOs:7 & 8)のプライマーと当該キットに添付のプライマー類（CDS Primer, Marathon cDNA Adaptor, API Primer, AP2 Primer)でもってファーストストランド合成、セカンド ストランド合成、アダプターライゲーシヨン、 5'- RACE PCR及び 3'- RACE PCRを実施 した (操作は当該キットに添付のユーザーマニュアルにしたがって行った)。その結果 、本酵素のほぼ全体をコードする cDNAを増幅できた。なお、 Fwlプライマーは本酵 素の N-末端領域のアミノ酸配列に基づ 、て合成した順方向プライマーであり、 Rvlプ ライマーは本酵素の C末端領域のアミノ酸配列に基づいて合成した逆方向プライマ 一である。本酵素の非翻訳領域までを含む広範囲の塩基配列領域を 5'-RACEおよ び 3'_RACE法により増幅して、本酵素の N-末端から C-末端までを完全に含む cDNA の塩基配列を決定した。
クロー-ングベクターおよび宿主菌は、次のようである。すなわち、クローニングべク ターは pT7- Blue (Novagen社)を用い、このベクターにァヮビ 'マンナナーゼ遺伝子（H dMan)をサブクローユングした。そして、そのクローユングしたベクター名は「HdMan- PT7Jと名づけた。サブクローユングの宿主菌は coH JM109株を使用した。
[0101] [表 3] ァヮビ'マンナナーゼ cDNAの PCR増幅に使用した縮重プライマ一の塩基配列
Fw l ： TTYGTNAARGGNGGNCARAARGT
Rv 1 ： YTTRTGNGCCCANGTRTC
[0102] このようにして決定したァヮビ ·マンナナーゼ cDNAの構造模式図および全塩基配 列を図 10と図 11 (配列表の配列番号 10(SEQ ID NO: 10)参照）にそれぞれ示す。ァ ヮビ ·マンナナーゼ cDNAの全長は 1 ,232bpから成り、その 15番塩基から 1 , 148番塩基 までの l,134bpが翻訳領域で、 377アミノ酸をコードしている。そのうち、翻訳領域の 5' 末端 15番塩基力 69番塩基までの 57bpは翻訳開始コドンおよび 18アミノ酸残基から 成るシグナルペプチドをコードしていた。従って、成熟酵素は 359アミノ酸残基から成 ると結論される。なお、 5'端 14塩基部分と 3'端 84塩基部分が非翻訳領域で、 3'末端に は 6塩基力 成る poly(A)とその 13塩基上流には AATAAAのポリアデュル化シグナル 配列が認められる。このことは、本 cDNAが真核細胞生物起源であることを示すもので ある。本明細書で開示されているようにして、当該ァヮビ 'マンナナーゼ cDNAを発現 ベクターに組み込んで宿主細胞で発現させて、ァヮビ 'マンナナ一ゼの産生を確認 できる。 実施例 8
[0103] 〔ァヮビ ·マンナナーゼの大腸菌による発現〕
本実施例では、上記で得られたァヮビ 'マンナナーゼ (以下、単に「HdMan」と略記 する場合もある)の cDNAクローンを用いて HdManの大腸菌発現系を構築し、組換え（ リコンビナント： recombinant)タンパク質を発現させた。
〔材料と方法〕
1.大腸菌による発現系の構築
ァヮビ 'マンナナーゼ (HdMan)の大腸菌による発現は、 Champion pET Directional TOPO Expression Kit (Invitorogen)を用 ヽ飞 Tつ 7こ。
[0104] 1)発現用 cDNA断片の PCRによる増幅
発現用ベクターに組み込むための cDNA断片を調製するため、前章で得られた FL- cDNAを铸型とし、 PCRを行った。 PCR反^には Pyrobest DNA Polymerase (TaKaRa) を用いた。 PCR反応混液の組成は、 Pvrobest DNA Polymeraseを 0.25 μ 1 (1.25 U)、 1 0 X Pvrobest Buffer IIを 5 μ 1、 2.5 mM dNTP Mixtureを 4 μ 1、各プライマーを 10 pmol 、プラスミド DNAを 50 ngおよび滅菌蒸留水を加え全量が 50 μ 1になるよう調製した。 反応条件は (1)95°C 30秒間、（2)55°C、 60秒間、 (3)72°C 90秒間を 1サイクルとして、こ れを 30回繰り返す条件で行った。サーマルサイクラ一は Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems)を用いた。
[0105] 2) PCR産物のクロー-ング
i)発現ベクターへのライゲーシヨン
PCR産物は、 Champion pET Directional TOPO Expression Kitを用いてプラスミド ベクター pET- 101 (図 12)へ組み込んだ。具体的には、 PCR産物 4 1に、 TOPO 101 vector 0.5 μ 1、 Salt solution 0.5 μ 1を加え、 25°Cで 5分間インキュベートした。ライゲ ーシヨン反応は氷冷することにより停止した。
[0106] ii)大腸菌の形質転換
発現用の宿主大腸菌としては、 coli BL2KDE3) (Stratagene)を用いた。具体的に は、 -80°Cで凍結した 120 μ 1のコンビテント細胞 coli BL21(DE3)を氷上で穏やかに 融解した。これにプラスミド DNA溶液を静かに加えて氷冷下で 30分間静置し、プラス ミドを菌体の表面に付着させた。次に 42°Cで 45秒間インキュベートし、宿主大腸菌に プラスミドを取り込ませた。その後、直ちに 2分間氷冷し、 SOC培地 250 1を加えて、 9 0 rpm、 37°Cで 1時間振とうした。反応後、適当量の培養液を、あらかじめ 50 μ 1の X-g al (5— Bromo— 4— Chloro— 3— Indolyl β—D— Galactoside) (20 mg/ml)および 25 μ 1の IPTG (Isopropyl β -D-Thiogalactopyranoside) (200 mg/ml)を塗布しておいた LB寒天培地 (50 g/mlアンピシリン含有)にスプレッダ一で塗布し、 37°Cでー晚倒置培養した。
[0107] 2. ウェスタンブロッテイング
試料タンパク質を SDS-PAGEで分離した後、アクリルアミドゲルを 10分間 Transfer bu ffer(0.1 M Tris - 0.192 M glycine - 20% methanol)に浸して平衡化させた。セミドライ ブロッター (ATTO)に陽極から順に Transfer bufferに浸したろ紙 3枚、ニトロセルロース 膜 (ADVANTEC)、平衡化したアクリルアミドゲルおよび Transfer bufferに浸したろ紙 3 枚をセットし、 120 mAで 60分間通電し、ニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。 転写後、タンパク質非局在部分を 20 mlの Blocking溶液 (20 mM Tris- HCl(pH 7.5) - 1 50 mM NaCl - 0.05% Tween20 - 2%スキムミルク)中で 15分間振とうしてブロッキング した後、 0.2%のスキムミルクを含む TTBS溶液 (20 mM Tris- HCl(pH 7.5) - 150 mM Na CI - 0.05% Tween20)で適宜稀釈した 2〜5 mlの 1次抗体を加えて 90分間浸透した。 反応後、ニトロセルロース膜は TTBS溶液で 3回洗浄した後、 0.2%のスキムミルクを含 む TTBS溶液で適宜稀釈した 2〜5 mlの 2次抗体をカ卩え、 90分間振とうした。次に、 -ト ロセルロース膜を TTBS溶液で 3回洗浄した後、化学発光基質 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(PIERCE)に浸し、化学発光による検出を行った。抗体は 、 1次抗体として Antト Hisを、 2次抗体として Anti-rabbit IgG(SIGMA)を用いた。
[0108] 3.組換え HdManの性状
組換え HdManの性状の分析は、実施例 2および 4で示した方法で行った。また、大 腸菌で発現した HdManを用いたスサビノリの葉状の配偶体の酵素処理は、加える酵 素の量を 0.5 Uとしたこと以外は実施例 6で示した方法と同条件で行った。
[0109] 〔結果〕
1. HdManの大腸菌発現系の構築
pET-101プラスミドベクターに挿入する cDNAを調製するため、シグナルペプチドを コードする領域を除く 5'末端領域に、ライゲーシヨンに必要な配列（CACC)および開 始コドン (ATG)を導入するように設計したフォワードプライマー EPF (配列表の配列番 号 12(SEQ ID NO: 12))およびリバースプライマー EPR (配列表の配列番号 13(SEQ ID NO: 13))を設計し (表 4)、それらを用いて PCRを行った。
[表 4]
Names Sequences
EPF CACCATGGACAGACTGTCCGTGCAAGGCAACC
EPR CAGGGTGAACTTAACGAGGCCGTG
[0111] その結果、約 1,000塩基対の cDNAが増幅された。この PCR増幅断片は pET-101プ ラスミドベクターにライゲーシヨンした。この糸且換え pET-101が pET-101プラスミドベクタ 一と HdManの組換え体であることを確認するため coH JM109 (TaKaRa)に導入した 後、塩基配列の決定を行った（図 13、配列表の配列番号 15(SEQ ID NO: 15)参照）。 決定された塩基配列より、発現されるタンパク質は pET-101に由来する Hisタグを含 む 32残基のアミノ酸配列力も成るペプチド領域力 C末端に付加された、 358残基のァ ミノ酸配列力 なることが推定された (配列表の配列番号 16(SEQ ID NO: 16)参照)。 また、そのアミノ酸配列力も発現されるタンパク質の分子量は 43,296と算出された。
[0112] 2. HdManの発現の確認
HdManが大腸菌内において発現可能であるかどうかを検討した。上述した組換え p ET-101を導入した大腸菌 BL21(DE3)のシングルコロニーを釣菌して、 100 mlの 2 XY T培地 (50 μ g/mlアンピシリン含有)に植菌し、 150 rpm、 15°Cで振とう培養した。吸光 度 600 nmにおいて濁度が 0.6になってから IPTGを終濃度 0.5 mMになるよう添カ卩して 、さらに培養した。この時、 IPTG添カ卩直前、また、培養 2、 4、 6、 10、 14、 18、 22および 2 4時間経過ごとに培養液の一部を分取し、遠心分離して集めた菌体ペレットを SDS-P AGEの試料緩衝液に懸濁した後、 SDS-PAGEに供した（図 14-A)。また、ウェスタンブ ロッテイングにより、 目的のタンパク質の発現を確認した（図 14-B)。その結果、 SDS-P AGEでは発現タンパク質と考えられる明らかなバンドは認められな力 た力 ウェスタ ンブロッテイングでは、分子量約 43,000に HdManと考えられるタンパク質バンドが検出 された。また、その発現は IPTG誘導開始 6時間後から確認された。 18時間経過後に は、 HdManの分解物と思われる複数のバンドが確認された。
3. HdManの大量発現および精製
組換え pET- 101を保有する大腸菌 BL21(DE3)を 1,000 mlの 2 XYT培地 (50 g/ml アンピシリン含有)に植菌し、 150 rpm、 15°Cで振とう培養した。吸光度 600 nmにおい て濁度が 0.6になってから IPTGを終濃度 0.5 mMになるよう添カ卩し、さらに 12時間培養 した。菌体は 5,000 X g、 5分間の遠心分離により集め、 20 mlの 0.75 Mショ糖緩衝液 (0.1 mM Tris-HCl(pH7.8)- 0.75 Mショ糖)に懸濁した後、 0.2 mlのリゾチーム溶液 (2% リゾチーム - 0.1 mM Tris- HCl(pH 7.8)- 0.75 Mショ糖)を加え、静かに撹拌した。氷 上に 10分間置いた後、 40 mlの 2.5 mM EDTA(pH7.8)を少しずつ静かに撹拌しながら 加えた。氷上に 10分間置いた後、 50 mlの遠沈管に分注し、 12,000 X g、 10分間遠 心分離した。得られた上清はペリブラズムタンパク質画分として回収した。また、沈殿 したスフエロプラストは、細胞を破壊するため、 20 mlの Tris- HC1緩衝液 (10 mM Tris- HCl(pH 7.8) - 0.5 M NaCl)をカ卩え、ピペットでよく撹拌した。さらに、超音波処理を数 回繰り返し、細胞を破壊した後、 12,000 X g、 10分間遠心分離した。得られた沈殿は 、不溶性細胞質画分として、また、上清は可溶性細胞質画分として回収した。
目的のタンパク質の局在について確認するため、ショ糖緩衝液に懸濁した菌体、ぺ リブラズムタンパク質画分、不溶性細胞質画分、可溶性細胞質画分をそれぞれ SDS- PAGEの試料緩衝液で溶解した後、 SDS- PAGE (図 15- A)およびウェスタンブロットに 供した（図 15-B)。その結果、ショ糖緩衝液に懸濁した菌体、不溶性細胞質画分、可 溶性細胞質画分に、組換え HdManと考えられるタンパク質が含まれて ヽることが確認 された。そこで、可溶性細胞質画分に含まれている組換え HdManの精製を試みた。 可溶性細胞質画分を Ni-NTAァガロース (invitrogen)を充填したカラムに供し、 His タグを持つ組換え HdManを吸着後、洗浄緩衝液 (20 mMイミダゾール - 20 mM Tris- HC1 (pH 7.8) - 0.5 M NaCl)で洗浄した。次にに溶出緩衝液 (150 mMイミダゾール - 20 mM Tris-HCl (pH 7.8) - 0.5 M NaCl)を力卩ぇ溶出した。溶出液は 0.5 mlずつのフ ラタシヨンとして回収し、全量で 2 mlの溶出液を採取し、 SDS-PAGEおよびウェスタン プロットに供した。その結果、 Niカラム力ゝら溶出した組換え HdManを含む溶出液中に は、 SDS- PAGEにより複数のバンドが確認された（図 16- A)。また、ウェスタンブロット で Anti-His抗体で検出したところ、組換え HdManと考えられる分子量約 43,000のバン ドの他に、その分解物と考えられる複数のバンドが検出された（図 16-B)。このとき Ni カラム力も溶出した総タンパク量は 0.66 mgであり、比活性は 2.12 U/mgであった。
[0114] 4.組換え HdManの性状
組換え HdManの至適 pHは pH 8.0であり（図 17)、至適温度は 40°Cであった（図 18)。 また、 pH 7.0においては 40°C以上の温度では著しく失活、 35°Cでは 30分間の加熱に よっても 97%の活性が残存した（図 19)。組換え HdManはェゾァヮビの消化液より精製 した HdMan (ェゾァヮビ天然 HdMan)と同じく Locust bean gumのほ力、ダルコマンナン 、直鎖状 j8 - 1,4-マンナンを分解した力 キシラン、ァガロース、カルボキシルメチル セルロース、デキストランはまったく分解しなかった（図 20)。次に、組換え HdManがェ ゾァヮビ天然 HdManと同じくスサビノリの葉状の配偶体を断片化することを確認する ために、組換え HdManを藻体に作用させた。その結果、 4日間の酵素処理で藻体が 断片化されることを確認した（図 21)。しかし、ェゾァヮビ天然 HdManで藻体を処理し たときほど小さな細胞塊は生じな力つた。
[0115] 〔考察〕
シグナルペプチドを除く HdManをコードして!/、る cDNAを PCRにより増幅し、これを組 み込んだ pET-101プラスミドベクターと宿主大腸菌 BL2KDE3)を用いた発現系を構築 し、 HdManの発現を試みた結果、 IPTG誘導下で、可溶性細胞質画分に HdManの発 現が確認された。発現したタンパク質が目的のものであるカゝ否かは、ウェスタンブロッ ティングにより確認を行い、分子量約 43,000に組換え HdManと考えられるバンドが検 出された。これは、アミノ酸配列から算出した分子量 43,296とほぼ一致した。
上記実施例では、組換え HdManを Niカラムを用いたァフィユティークロマトグラフィ 一により精製した。その結果、 0.66 mgのタンパク質が溶出された。得られた組換え Hd Manは、マンナナーゼ活性を有することが確認された。その比活性は 2.12 U/mgであ り、これはェゾァヮビ天然 HdManと比較して約 5分の 1の比活性であった。これは、 SDS -PAGEパターンでも明らかであるように、精製が不十分であるためだと考えられる。 組換え HdManの基質特異性は、ェゾァヮビ天然 HdManと同様であり、 Locust bean gumのほ力、ダルコマンナン、直鎖状 j8 - 1,4-マンナンを分解し、キシラン、ァガロース 、カルボキシルメチルセルロース、デキストランは全く分解しなかった。また、組換え H dManは、スサビノリの葉状の配偶体を断片化することが確認された。ェゾァヮビ天然 HdManで処理したときと比較して、藻体の断片化はあまり進まなかった。これは酵素 の量がェゾァヮビ天然 HdManを用いた処理と比べ 10分の 1しか入って!/ヽな 、ためで あると考えられ、酵素の量を増やすことによりェゾァヮビ天然 HdManと同様に藻体を 細胞塊に断片化できると期待される。
ところで、組換え HdManの至適 pH、至適温度および熱安定性はェゾァヮビ天然 Hd Manと比較して若干の相違があった。すなわち、至適 pHは、ェゾァヮビ天然 HdManの 至適 pH力 ¾H 7.5であるのに対して、組換え HdManでは pH 8.0とアルカリ性に偏り、至 適温度はェゾァヮビ天然 HdManでは 45°Cであるのに対して、糸且換え HdManでは 40°C と低くなつていた。また、温度安定性はェゾァヮビ天然 HdManでは、 pH 7.0において 4 0°Cで 30分間の加熱によっても 90%の活性が残存したのに対して、組換え HdManでは 、 pH 7.0において 40°Cで 30分間の加熱では 26.5%の活性しか残存せず、熱安定性の 低下が認められた。これらは、原核生物である大腸菌を用いて真核生物であるェゾ ァヮビ由来のマンナナーゼを発現させたため、立体構造の形成や翻訳後修飾が正 常に行われて ヽな 、ためとの可能性が考えられる。
また、組換え HdManの大腸菌による発現量は低いものであった。これは、ェゾァヮ ビと大腸菌の間で使用されるコドンの頻度に偏りがあって互いに異なっているために 翻訳が妨げられているのではないかとも推測される。例えば、大腸菌による発現系に おいて、 目的遺伝子中に使用頻度の低いコドンが多く使われることによって、発現の 低下の原因となることが知られている（Sorensen, M. A. et al.， J. Mol. Biol., 207, 365 -377 (1989); Zhang, S. et al.， Gene, 105, 61-72 (1991))。また、大腸菌において、ァ ルギニン (Arg)コドンの AGA、 AGG、 CGG、 CGAゝイソロイシン (lie)コドンの AUA、ロイ シン (Leu)コドンの CUA、 Glyコドンの GGA、プロリン (Pro)コドンの CCCはほとんど使用 されないことが知られている（Ikemura, T" J. Mol. Biol, 146, 1-21 (1981))。一方、 H dManをコードする cDNA中にアルギニンは 8残基存在する力 これをコードするコドン には大腸菌において使用頻度が非常に低いコドン AGAが 3つ、 AGGが 1つ、 CGGが 1つ含まれる。また、 19残基あるイソロイシンの内 3残基で、 28残基あるロイシンの内 3 残基で使用頻度が低いコドンが使用されていた。
また、ウェスタンブロッテイングで確認された組換え HdManの分解も発現量低下の 一因となっているとも考えられる。
以上のように、組換え HdManは、ェゾァヮビ天然 HdManとわずかに性状が異なるも のの、ェゾァヮビ天然 HdManと同様、その至適 pHは海水の pHに近ぐ至適温度は他 の軟体動物由来のマンナナーゼと比較して低いなど、スサビノリのプロトプラストの作 出用酵素のひとつとして利用できる特性を持つと考えられる。
[0117] 本発明で、組換え DNA技術を用いて HdManを大腸菌により発現することに成功し ている。効率の良い組換え HdManの発現のために、例えば、温度や IPTGの濃度など 大腸菌の培養や誘導条件、発現ベクターなど、より適切なものや条件を選択するの が好ましいことが判明した。また、ムラサキイガイのマンナナーゼにおいて大量の発 現が成功している、メタノール代謝酵母 (Pichia Dastoris)を用いた発現系 (Xu, B. et al ., Eur. J. Biochem., 269, 1753-1760 (2002))など大腸菌以外の宿主系を使用するこ とも有効である可能性があると考えられる。さらに、宿主-ベクタ一系に適したコドンに 置換えた遺伝子を使用することも好ましい可能性があることに注意されるべきでもある また、効率的なスサビノリのプロトプラストの作出のためは、 HdManと他の酵素類を 組み合わせるなどの様々な実験を行う必要がある力 そのためにェゾァヮビ天然 Hd Manを大量に調製することは、ァヮビの単価を考慮すると困難である。したがって、 Hd Manを大腸菌などによる大量発現系で大量、安価かつ簡便に調製することは重要で ある。
産業上の利用可能性
[0118] 本発明のマンナナーゼは、新規なアミノ酸配列を有し、卷貝類由来のマンナナーゼ に関する遺伝的情報を提供するものである。本発明のマンナナーゼは、卷貝類に由 来しており、水産加工、水産関係バイオテクノロジーにおいてその利用価値が高ぐ 大量に入手可能なマンナンの利用、オリゴ糖の生産、飼料効率を高めるための飼料 添加剤製造、海藻プロトプラスト形成などの用途に広く利用できると共に、本発明は 養殖や水産加工に伴なう廃棄物の有効利用や資源化の実現に有用である。本発明 の方法により、高品質のマンナナーゼを製造することができる。し力も、本発明の方法 は、大量生産に適しているので、コストの面でも優れている。本発明の製造方法によ れば、従来と比較して、簡便な操作で高純度のマンナナーゼを、短時間で得ることが できる。それ故、本発明の技術は、上記優れた特質を有し、産業上の利用性も高い し、特徴あるマンナナーゼの効率的な製造手段を与えるもので極めて有用である。 本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らか である。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従って それらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
配列表フリーテキスト
SEQ ID NO: 7, Description of Artincial Sequence: Oligonucleotide to act as a prime r for PCR; y stands for c or t at position 3; n does for g， a, c or t at positions 6， 12 and 15; and r does for a or g at positions 9， 18 and 21
SEQ ID NO: 8， Description of Artincial Sequence: Oligonucleotide to act as a prime r for PCR; y stands for c or t at position 1; r does for a or g at positions 4 and 16; a nd n does for g， a, c or t at positions 7 and 13
SEQ ID NO: 12, Description of Artincial Sequence: Oligonucleotide to act as a prim er for PCR
SEQ ID NO: 13， Description of Artincial Sequence: Oligonucleotide to act as a prim er for PCR
SEQ ID NO: 14, Description of Artincial Sequence: Designed fusion protein for Hd Man
SEQ ID NO: 15， Description of Artincial Sequence: Designed polynucleotide to act as an expression gene for HdMan

Claims

請求の範囲
[1] (1)巻貝のァヮビに由来し、下記の特性を有するタンパク質、
(a)作用：本酵素は、ガラタトマンナンを分解して、還元糖を遊離する
(b)基質特異性:本酵素は、ローカストビーンガム (ガラタトマンナン)、コンニヤクマンナ ン（ダルコマンナン）およびゾゥゲヤシマンナン (直鎖状 β -1,4-マンナン)を!、ずれも 良く分解する力 キシラン、ァガロース、カルボキシメチルセルロース、デキストランは 全く分解しない
(c)分子量:約 39,000の単一バンド（SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
(d)至適温度： 35〜53°C
(e)至適 pH :pH6.5〜8.5
(ί)Ν末端アミノ酸配列：配列表の配列番号 3のアミノ酸配列
(g)熱安定性: ρΗ 7.0においては 40°C30分間の加熱によっても 90%の活性が残存
(2)配列表の配列番号 2、 9又は 16のアミノ酸配列を有して 、るポリペプチド
(3)配列表の配列番号 2又は 9のアミノ酸配列において 1もしくは複数個のアミノ酸が 欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有しており、且つ、マンナナーゼ酵素活 性を有するポリペプチド
(4)配列表の配列番号 2又は 9のアミノ酸配列に対して少なくとも 50%より高い相同性、 60%より高い相同性、 70%より高い相同性、 80%より高い相同性、 90%より高い相同性、 9 5%以上の相同性、あるいは少なくとも 98%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し ており、且つ、マンナナーゼ酵素活性を有するポリペプチド
力もなる群力も選択されたものであることを特徴とするマンナナーゼポリペプチド。
[2] (1)請求項 1に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(2)配列表の配列番号 1、 10又は図 11に示された DNAからなる群力 選択された 10 個以上又は 15個以上の連続した塩基配列を有するヌクレオチド配列又はそれと相補 的な塩基配列を有するヌクレオチド配列とストリンジェントな条件でノ、イブリダィズし、 且つ請求項 1の (1)のタンパク質又は請求項 1の (2)のポリペプチドの示す生物学的活 性を有するか、あるいは請求項 1の (3)又は (4)のポリペプチドの示す生物学的活性を 有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド (3)配列表の配列番号 9のアミノ酸配列力 なるポリペプチドをコードするポリヌクレオ チド、配列番号 2のアミノ酸配列力 なるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、 又は配列番号 10の塩基配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも 50%以上の 相同性、 60%以上の相同性、 70%以上の相同性、 80%以上の相同性、 90%以上の相同 性、 95%以上の相同性、あるいは 97%以上の相同性を有し、且つ、上記 (2)で言及した 生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
力もなる群力も選択されたものであることを特徴とするマンナナーゼポリヌクレオチド。
[3] 配列番号 10の 15番塩基から 1,148番塩基の塩基配列力 成るマンナナーゼ遺伝子、 配列番号 10の 69番塩基から 1,145番塩基の塩基配列力 成るマンナナーゼ遺伝子、 あるいは配列番号 15の 5番塩基から 1,180番塩基の塩基配列力 成るマンナナーゼ 遺伝子であることを特徴とする請求項 2に記載のポリヌクレオチド。
[4] 請求項 2又は 3に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする組換えベクター
[5] 請求項 2若しくは 3に記載のポリヌクレオチド又は請求項 4に記載の組換えベクターで 宿主細胞を形質転換されて得られたことを特徴とする形質転換された宿主細胞。
[6] 請求項 5に記載の形質転換宿主細胞を培養条件下に維持して、請求項 1記載のタン ノ ク質又はポリペプチドを発現せしめることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質又 はポリペプチドの製造法。
[7] 請求項 1に記載のタンパク質又はポリペプチド、請求項 2に記載のポリヌクレオチド、 請求項 4に記載の組換えベクター及び請求項 5に記載の形質転換宿主細胞力 なる 群から選択されたものを含有することを特徴とする組成物。
[8] 組換え又は合成タンパク質あるいはポリペプチド生産のため、配列番号 1〜16力もな る群力 選択された配列の全部あるいはその一部の使用。
[9] 請求項 1に記載のタンパク質又はポリペプチドの一部のフラグメント。
[10] 請求項 2に記載のポリヌクレオチドの一部のフラグメント。
[11] 請求項 1に記載のタンパク質又はポリペプチドで海藻又は植物を処理して断片化さ れた海藻細胞又は植物細胞を取得することを特徴とする海藻又は植物のプロトプラ スト作成法。 請求項 1に記載のタンパク質又はポリペプチドでマンナン含有基質を処理して加水 分解された生成物を取得することを特徴とするマンナン成分加水分解法。
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