WO2006111666A1 - Composition cosmetique pour lutter contre les consequences cutanees de la pollution - Google Patents

Composition cosmetique pour lutter contre les consequences cutanees de la pollution Download PDF

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WO2006111666A1
WO2006111666A1 PCT/FR2006/000896 FR2006000896W WO2006111666A1 WO 2006111666 A1 WO2006111666 A1 WO 2006111666A1 FR 2006000896 W FR2006000896 W FR 2006000896W WO 2006111666 A1 WO2006111666 A1 WO 2006111666A1
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complex
camellia sinensis
lampsana
extract
pollution
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PCT/FR2006/000896
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Olivier Courtin
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Laboratoires Clarins
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q17/00—Barrier preparations; Preparations brought into direct contact with the skin for affording protection against external influences, e.g. sunlight, X-rays or other harmful rays, corrosive materials, bacteria or insect stings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin

Definitions

  • the present invention relates to a new cosmetic composition capable of combating and preventing the effects of air pollution on the skin containing two plant extracts: Camellia sinensis and Lampsana commuais.
  • the skin of a surface of approximately 2m 2 is the largest organ of the body. Indispensable to life, a real interface between the body and the environment, it is an interactive barrier. She has great coping skills or reactions to aggression. It is also a privileged site for the absorption of pollutants from the environment, with passage of substances that can have a direct cutaneous toxic effect.
  • Clean air is a mixture of 78% nitrogen, 21% oxygen, 0.09% argon, 0.1% water vapor and other more or less rare gases including carbon dioxide, hydrogen , ozone.
  • Air pollution is defined by the modification of clean air, by modification of its components, or by addition of harmful elements. Very schematically, it is possible to consider that the pollutants currently listed are mainly produced by industry, heating and automobile traffic. It is usual to classify them into seven chemical families:
  • oxidizing agents such as ozone or nitrogen oxides are irritating and generate free radicals.
  • Dusts are suspended particles sometimes fixing polycyclic hydrocarbons. Their harmful role is modified by the temperature and the degree of humidity of the air, the acid particles are irritating; there is a decrease in the hydration and oxygenation of tissue.
  • organic chemicals are carcinogens, they come from industry waste and car combustion. - carbon monoxide causes tissue hypoxia, it comes 80% of cars.
  • hydrocarbons and solvents represent 50% of automobile pollution, they are toxic, irritating, carcinogenic and mutagenic. In the presence of light, they react with nitrogen oxides and produce ozone.
  • - Sulfur dioxide is one of the products of the combustion of oil and coal, it causes an alteration of the hydro-lipid film and irritation.
  • - metals such as lead, zinc, aluminum, mercury, ... can interfere with cellular metabolism, by attacking enzymatic reactions. They participate in oxidative damage with DNA damage and cellular lipids.
  • the effects of pollution on the skin are varied: there is an acidification of the cutaneous pH, a decrease of the hydration with increase of the transepidermal loss in water, an increase of the desquamation, a decrease of the horny flexibility, a modification of the surface lipids by the action of free radicals, a decrease in cellular energy metabolism.
  • the repetition of these aggressions initiates an inflammatory process and predisposes to the reactions of intolerance.
  • a cosmetic composition capable of combating and preventing the effects of air pollution on the skin must be able to combat these various phenomena.
  • the invention therefore particularly relates to a composition containing an extract of Camellia sinensis and Lampsana communis.
  • Camellia sinensis also called white tea is native to Southeast Asia, the variety used in the composition according to the invention is Pa ⁇ Mu Tan. It belongs to the tea family as well as green tea or black tea. It is distinguished from these other qualities by its preparation which is limited to minimalist operations allowing him to maintain its high content of polyphenols.
  • the Camellia sinensis extract used in the composition according to the invention is obtained by hydro-glycolic extraction of white tea leaves. This gives a translucent solution of dark orange color and characteristic odor. This solution is titrated in total polyphenols and in OPC (proanthocyanidic olygomers); it has the following analytical characteristics:
  • the Lampsana communis family Asteraceae, is a widespread annual plant, growing along roadsides and other sites subject to air pollution. It is a non-demanding plant and very resistant.
  • the Lampsana extract used in the composition according to the invention is obtained by hydro-glycolic extraction of the aerial part of the plant. This gives a clear brown liquid with a characteristic odor having the following analytical characteristics: - water content: 18 to 26%
  • composition according to the invention contains:
  • Lampsana extract commuais 0.05% by weight Lampsana extract commuais.
  • compositions according to the invention may also comprise one or more formulating agents or additives of known and conventional use in cosmetic and dermatological compositions such as, by way of examples and in a nonlimiting manner, softeners, colorants, film-forming active agents, surfactants, perfumes, preservatives, emulsifiers, oils, glycols, vitamins such as vitamin E, UV filters, etc.
  • formulating agents or additives of known and conventional use in cosmetic and dermatological compositions such as, by way of examples and in a nonlimiting manner, softeners, colorants, film-forming active agents, surfactants, perfumes, preservatives, emulsifiers, oils, glycols, vitamins such as vitamin E, UV filters, etc.
  • compositions according to the invention can be present in any form known to those skilled in the field of cosmetology and dermatology with no other pharmaceutical restriction than the application on the face and body.
  • the compositions according to the invention are in the form of a gel, a lotion, a cream, an emulsion, a milk, a spray, etc.
  • the present invention also relates to the cosmetic use of a composition according to the invention for combating and preventing the effects of pollution on the skin.
  • the present invention also relates to the use of extracts of Camellia sinensis and Lampsana commuais, for the preparation of a cosmetic composition for combating and preventing the effects of pollution on the skin.
  • the present invention finally relates to a cosmetic care method for combating and preventing the effects of pollution on the skin, characterized in that a suitable amount of a composition according to the invention is applied to the skin.
  • FIG. 1 shows the effects of the complex Camellia sinensis and Lampsana coimunis (CLALAMP complex) on the reversibility of the cytotoxic effect of the exhaust gas vis-à-vis the keratinocytes in culture.
  • the Camellia sinensis and Lampsana communis complex was tested at 0.01%, 0.025% and 0.05%,
  • FIG. 2 represents the anti-radical effects of the Camellia sinensis and Lampsana communis complex (CLALAMP complex tested at 0.01%, 0.025% and 0.05%) by measurement of the malondialdehyde (MDA) marker for lipoperoxidation on keratinocytes in culture previously exposed to gas. exhaust,
  • MDA malondialdehyde
  • FIG. 3 represents the effect of the Camellia sinensis and Lampsana communis complex (CLALAMP complex tested at 0.01%, 0.025% and 0.05%) on the respiration rate of the keratinocytes in culture previously exposed to the exhaust gas. The results are expressed in oxygen picoatoms per million cells per minute,
  • FIG. 4 represents the effect of the Camellia sinensis and Lampsana communis complex (CLALAMP complex tested at
  • FIG. 5 represents the effect of the Camellia sinensis and Lampsana communis complex (CLALAMP complex tested at 0.01%, 0.025% and 0.05%) on the synthesis of cellular basal ATP of keratinocytes in culture previously exposed to the exhaust gas. The results are expressed in nmoles per million cells and per minute,
  • FIG. 6 shows the effect of the Camellia sinensis and Lampsana communis complex (CLALAMP complex tested at 0.01%, 0.025% and 0.05%) on the rate of cellular mitochondrial ATP synthesis of cultured keratinocytes. previously exposed to the exhaust gas. The results are expressed in nmoles per million cells per minute.
  • the keratinocyte cultures are established from skin of human foreskins harvested during circumcisions and are amplified in KGM2 (Clonetics) medium supplemented with insulin, I 1 EGF and pituitary extract. The tests were carried out on keratinocytes between the 2 nd and 4 th passage, to ensure reproducibility between different experiments.
  • the exhaust gases were produced by an engine.
  • the gases were brought into contact with human keratinocytes in culture for 2 hours.
  • the cells were subsequently incubated with or without the product under investigation for an additional 22 hours.
  • This step was performed by the Formazan Blue Reduction Test (MTT).
  • MTT Formazan Blue Reduction Test
  • the wells containing the cells were emptied by gentle inversion, and then the cell mat was rinsed with the culture medium. 200 ⁇ l of a diluted MTT solution were distributed in all the wells. Plates were then incubated at 37 ° C for 2-4 hours. There is, then, formation of Formazan blue crystals, in an amount inversely proportional to the attainment of succinates dehydrogenases.
  • the wells were again emptied by The cells were then gently lysed and the crystals of Formazan blue dissolved, by adding 200 ⁇ l of dimethyl sulfoxide (DMSO). After homogenization of the staining, by stirring, the plates were read at 570 nm using a spectrophotometer.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the test was conducted after 24 hours contact of the Camellia sinensis complex and Lampsana commuais with the cells.
  • Lot 1 negative control not receiving any product
  • Lot 2 cells exposed to the exhaust gas
  • Lot 4 cells exposed to the exhaust gas and then treated with the complex (0.025%)
  • Lot 5 cells exposed to the exhaust gas and then treated with the complex (0.05%)
  • the test was conducted in triplicate after 24 hours of contact of the Camellia sinensis complex and Lampsana communis with the cells.
  • MDA malondialdehyde
  • Fluorescence detection was performed with excitation at 515 nm and emission at 553 nm.
  • the eluent used is composed of methanol: water, 40: 60 (v / v), the pH of which was adjusted with 1M KOH.
  • This step was to investigate the reversibility of the cytotoxic effect of the exhaust gases after treatment with the Camellia sinens ⁇ s complex and Lampsana communie with respect to human keratinocytes in culture. This study was performed by determining cell viability using the MTT Test.
  • the Camellia sinensis and Lampsana communis complex appeared to have an effect on the reversibility of the cytotoxicity and the pro-radical activity induced by the exhaust gases at the level of human keratinocytes in culture after 24 hours of exposure. contact.
  • the MDA assays show that the Camellia sinensis and Lampsana communis complex studied at concentrations of 0.01; 0.025 and 0.05% induced a significant protection of human keratinocytes against the lipoperoxidation caused by the exhaust gases.
  • the percentage reduction in MDA production is -17, -27 and -34%.
  • Camellia sinensis and Lampsana communis complex has a significant anti-radical effect with respect to free radicals induced by the exhaust gas.
  • the exhaust gases were produced by an engine.
  • the cells were placed in contact with the gases for 2 hours. They were subsequently incubated with or without the product under study for an additional 22 hours.
  • the addition of different amounts of the product in the tank of the oxygraphe shows a possible stimulation or inhibition of respiration.
  • the amount of dissolved oxygen in a medium incubation was determined using a Clark electrode. Oxygen diffusing through a teflon film is reduced at the level of the platinum cathode polarized at -0.8 volts. Under these conditions, the current passing between this cathode and the silver anode is proportional to the oxygen concentration in the solution.
  • the ion bridge is provided by a solution of half saturated KCl. The acquisition and the processing of the measurements are done on a microcomputer. Constitution of the lots:
  • Lot 1 negative control not receiving any product
  • Lot 2 cells exposed to the exhaust gas
  • Lot 3 cells exposed to the exhaust gas and then treated with the complex (0.01%)
  • Lot 4 cells exposed to the exhaust gas then treated with the complex (0.025%)
  • the test was carried out after 20 minutes of contact of the product Camellia sinensis complex and Lampsana coimunis with the cells.
  • the aim of this study is to evaluate the effect of the Camellia sinensis and Lampsana communis complex on the rate of basal and mitochondrial ATP synthesis in cultured keratinocytes. This determination is carried out by bioluminescence using the luciferin / luciferase kit.
  • the amount of basal and newly synthesized ATP in the different aliquots is measured through the light emitted during the following ATP consumption reaction:
  • I 1 ATP monitoring reagent ATP Bioluminescence Assay Kit HS II
  • RLU relative unit of brightness
  • the synthesis rate of ATP is expressed in nmol / min / 10 6 cells.
  • Keratinocytes in culture were cultured, in a CO 2 oven, at a rate of 10 6 per run in an ADM culture medium (Clonetics).
  • the treatment involves directly applying the complex Camellia sinensis and Lampsana coimunis to the desired concentration on the cells in suspension in the tank of the oxygraphe.
  • the cells at a concentration of 10 6 cells / ml are suspended in a "respiratory buffer" (Hanks-Hepes glucose 20 mM), in the vat of the oxygraphe thermostated at 30 0 C and stirred.
  • the cells are permeabilized with digitonin.
  • the addition of a respiratory substrate (10 mM pyruvate and 10 mM malate) makes it possible to observe an oxygen consumption rate (state 2 according to Chance).
  • Lot 1 negative control not receiving any product
  • Lot 2 cells exposed to the exhaust gas
  • Lot 3 cells exposed to the exhaust gas and treated with the complex (0.01%)
  • Lot 4 cells exposed to the exhaust gas and then treated with the complex (0.025%)
  • Lot 5 cells exposed to the exhaust gas and then treated with the complex (0.05%)
  • This assay was performed on whole non-permeabilized cells in the presence of glucose.
  • the Camellia sinensis and Lampsana communis complex incubated at different concentrations with the keratinocytes previously exposed to the exhaust gas, induced a significant effect on the ATP mitochondrial synthesis rate at concentrations of 0.025 and 0.05%.
  • the mitochondrial ATP synthesis rate increases by 19 and 29% respectively (FIG. 6).
  • Camellia sinensis and Lampsana communis complex is active at very low concentrations, a sign of the synergy between the two extracts.

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Abstract

La présente invention concerne une composition contenant un extrait de Camellia sinensis et un extrait de Lampsana communis. La présente invention concerne aussi l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau. La présente invention concerne également l'utilisation d'extraits de Camellia sinensis et Lampsana communis, pour la préparation d'une composition cosmétique pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau. La présente invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique, pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau, caractérisé en ce qu'on applique sur la peau une quantité adéquate d'une composition selon l'invention.

Description

COMPOSITION COSMÉTIQUE POUR LUTTER CONTRE LES CONSÉQUENCES
CUTANÉES DE LA POLLUTION
La présente invention concerne une nouvelle composition cosmétique capable de lutter et de prévenir les effets de la pollution atmosphérique sur la peau contenant deux extraits végétaux : Camellia sinensis et Lampsana commuais.
La peau d'une surface de 2m2 environ est le plus grand organe de l'organisme. Indispensable à la vie, véritable interface entre le corps et l'environnement, c'est une barrière interactive. Elle possède de grandes capacités d'adaptation ou de réactions face aux agressions. Elle est aussi un site privilégié d'absorption des polluants de l'environnement, avec passage de substances pouvant avoir un effet toxique cutané direct.
L'air pur est un mélange de 78% d'azote, 21% d'oxygène, 0.09% d'argon, 0.1% de vapeur d'eau et d'autres gaz plus ou moins rares dont le gaz carbonique, l'hydrogène, l'ozone. La pollution atmosphérique se définit par la modification de l'air pur, par modification de ses composants, ou par adjonction d'éléments nocifs. Très schématiquement, il est possible de considérer que les polluants actuellement répertoriés sont essentiellement produits par l'industrie, le chauffage et la circulation automobile. Il est habituel de les classer en sept familles chimiques :
- les agents oxydants tels que l'ozone ou les oxydes d'azote sont irritants et générateurs de radicaux libres.
- les poussières sont des particules en suspension fixant parfois des hydrocarbures polycycliques. Leur rôle nocif est modifié par la température et le degré d'humidité de l'air, les particules acides sont irritantes ; on observe une baisse de l'hydratation et de l'oxygénation des tissus. les produits chimiques organiques sont cancérigènes, ils proviennent des déchets de l'industrie et de la combustion des automobiles. - le monoxyde de carbone entraîne une hypoxie tissulaire, il provient à 80% des automobiles.
- les hydrocarbures et les solvants représentent 50% de la pollution automobile, ils sont toxiques, irritants, cancérigènes et mutagènes. En présence de lumière, ils réagissent avec les oxydes d'azote et produisent de l'ozone.
- le dioxyde de soufre est l'un des produits de la combustion du mazout et du charbon, il provoque une altération du film hydro-lipidique et des irritations. - les métaux tels que le plomb, le zinc, l'aluminium, le mercure, ... peuvent interférer avec le métabolisme cellulaire, par atteinte des réactions enzymatiques. Ils participent aux dommages oxydatifs avec lésions de l'ADN et des lipides cellulaires.
Pour tous ces polluants, les risques varient selon leur concentration, la durée d'exposition, leurs associations, mais surtout de la prédisposition du sujet. Ils présentent entre eux une synergie d'action.
Les effets de la pollution sur la peau sont variés : on observe une acidification du pH cutané, une baisse de l'hydratation avec augmentation de la perte transépidermique en eau, une augmentation de la desquamation, une diminution de la souplesse cornée, une modification des lipides de surface par action des radicaux libres, une baisse du métabolisme énergétique cellulaire. La répétition de ces agressions initie un processus inflammatoire et prédispose aux réactions d'intolérance. Ainsi une composition cosmétique capable de lutter et de prévenir les effets de la pollution atmosphérique sur la peau doit pouvoir lutter contre ces divers phénomènes.
Les travaux de la demanderesse ont permis de mettre en évidence que l'association de deux extraits végétaux de Camellia sinensis et Lampsana coπununis présentait un effet protecteur des effets de la pollution au niveau cutané.
L'invention concerne donc, tout particulièrement, une composition contenant un extrait de Camellia sinensis et de Lampsana communis.
Le Camellia sinensis appelé aussi thé blanc est originaire du sud-est asiatique, la variété utilisée dans la composition selon l'invention est le Paï Mu Tan. Il appartient à la famille des théacées au même titre que le thé vert ou le thé noir. Il se distingue de ces autres qualités par sa préparation qui se limite à des opérations minimalistes lui permettant ainsi de conserver sa forte teneur en polyphénols.
L'extrait de Camellia sinensis utilisé dans la composition selon l'invention est obtenu par extraction hydro-glycolique des feuilles de thé blanc. On obtient ainsi une solution translucide de couleur orange foncé et d'odeur caractéristique. Cette solution est titrée en polyphénols totaux et en OPC (olygomères proanthocyanidiques ) ; il présente les caractéristiques analytiques suivantes :
- extrait sec 2 à 4% - pH 5.3 à 7.3
- dosage des polyphénols totaux : > 5g/l équivalent acide gallique
- dosage des OPC : 2.5 g/1 équivalent cathéchine.
Le Lampsana communis, de la famille des astéracées, est une plante annuelle très répandue, poussant au bord des routes et autres sites soumis à la pollution atmosphérique. C'est une plante non exigeante et très résistante.
L'extrait de Lampsana commuais utilisé dans la composition selon l'invention est obtenu par extraction hydro-glycolique de la partie aérienne de la plante. On obtient ainsi un liquide limpide de couleur brune à odeur caractéristique présentant les caractéristiques analytiques suivantes : - teneur en eau : 18 à 26%
- pH : 6 à 8
- densité : 1.055 à 1.075
- indice de réfraction : 1.420 à 1.440
La composition selon l'invention contient :
- de l'ordre de 0,01 à 5 % en poids, de préférence 0,01 à 0,5 % en poids et tout préférentiellement de 0.01 à 0.05% en poids d'extrait de Camellia sinensis et
- de l'ordre de 0,01 à 5 % en poids, de préférence 0,01 à 0,5 % en poids et tout préférentiellement de 0.01 à
0.05% en poids d'extrait de Lampsana commuais.
Les compositions selon l'invention peuvent encore comprendre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs d'usage connu et classique dans les compositions cosmétiques et dermatologiques tels que, à titre d'exemples et de façon non limitative, des adoucissants, des colorants, des actifs filmogènes, des tensioactifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des vitamines comme la vitamine E, des filtres UV, etc. Grâce à ces connaissances en matière de cosmétique, l'homme du métier saura quels agents de formulation ajouter aux compositions de l'invention et en quelles quantités en fonction des propriétés recherchées.
Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toute forme connue de l ' homme du métier dans le domaine de cosmétologie et de la dermatologie sans autre restriction galénique que l'application sur le visage et sur le corps. De façon avantageuse, les compositions selon l'invention se présentent sous la forme d'un gel, d'une lotion, d'une crème, d'une émulsion, d'un lait, d'un spray, etc.
La présente invention concerne aussi l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau.
La présente invention concerne également l'utilisation d'extraits de Camellia sinensis et Lampsana commuais, pour la préparation d'une composition cosmétique pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau.
La présente invention concerne enfin un procédé de soin cosmétique, pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau, caractérisé en ce qu'on applique sur la peau une quantité adéquate d'une composition selon l'invention.
Les exemples ci-après sont donnés à titre illustratif et ne sauraient être interprétés comme limitant la portée de l'invention. Ils concernent, d'une part, l'évaluation de l'effet anti-radicalaire du complexe Camellia sinensis et
Lampsana communis vis-à-vis des kératinocytes humains en culture ainsi que l'évaluation de l'effet de ce même complexe sur le métabolisme énergétique, et d'autre part, des exemples de compositions objets de la présente invention.
Les exemples font références aux figures suivantes dans lesquelles : - la figure 1 représente les effets du complexe Camellia sinensis et Lampsana coimunis (complexe CLALAMP) sur la réversibilité de l'effet cytotoxique des gaz d'échappement vis-à-vis des kératinocytes en culture. Le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis a été testé à 0.01%, 0.025% et 0.05%,
- la figure 2 représente les effets anti-radicalaires du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis (complexe CLALAMP testé à 0.01%, 0.025% et 0.05%) par mesure du malondialdéhyde (MDA) marqueur de la lipoperoxydation sur kératinocytes en culture préalablement exposés au gaz d'échappement,
- la figure 3 représente l'effet du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis (complexe CLALAMP testé à 0.01%, 0.025% et 0.05%) sur la vitesse de respiration des kératinocytes en culture préalablement exposés au gaz d'échappement. Les résultats sont exprimés en picoatomes d'oxygène par million de cellules et par minute,
- la figure 4 représente l'effet du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis (complexe CLALAMP testé à
0.01%, 0.025% et 0.05%) sur la vitesse de respiration mitochondriale en présence du pyruvate-malate sur kératinocytes en culture préalablement exposés au gaz d'échappement. Les résultats sont exprimés en picoatomes d'oxygène Λpar million de cellules et par minute,
- la figure 5 représente l'effet du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis (complexe CLALAMP testé à 0.01%, 0.025% et 0.05%) sur la synthèse d'ATP basale cellulaire de kératinocytes en culture préalablement exposés au gaz d'échappement. Les résultats sont exprimés en nmoles par million de cellules et par minutes,
- la figure 6 représente l'effet du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis (complexe CLALAMP testé à 0.01%, 0.025% et 0.05%) sur la vitesse de synthèse d'ATP mitochondriale cellulaire de kératinocytes en culture préalablement exposés au gaz d'échappement. Les résultats sont exprimés en nmoles par million de cellules et par minute .
I. ÉVALUATION DE L'EFFET ANTI RADICALAIRE DU COMPLEXE Camellia sinensis et Lampsana communie VIS À VIS DES KÉRATINOCYTES HUMAINS EN CULTURE.
A. Matériel et méthodes.
1. Matériel. Les cultures de kératinocytes sont établies à partir de peau de prépuces humains récoltés lors de circoncisions et sont amplifiées dans du milieu KGM2 (Clonetics) supplémenté par l'insuline, I1EGF et de l'extrait pituitaire. Les essais ont été réalisés sur des kératinocytes entre le 2ème et le 4ème passage, afin d'assurer une reproductibilité entre les différentes expérimentations .
Les gaz d'échappement ont été produits par un moteur. Les gaz ont été mis au contact des kératinocytes humains en culture pendant 2 heures. Les cellules ont été par la suite incubées avec ou sans le produit à l'étude pendant 22 heures supplémentaires .
2. Étude de la cytotoxicité.
Cette étape a été réalisée par le Test de réduction au bleu de Formazan (MTT). Après 24 heures d'incubation des cellules en présence ou en absence du produit à l ' étude à différentes concentrations, les puits contenant les cellules ont été vidés par retournement doux, puis le tapis cellulaire a été rincé avec le milieu de culture. 200 μl d'une solution de MTT diluée ont été distribués dans tous les puits. Les plaques ont été ensuite incubées à 37°C pendant 2 à 4 heures. Il y a, alors, formation de cristaux de bleu de Formazan, en quantité inversement proportionnelle à l'atteinte des succinates déshydrogénases . Les puits ont été, de nouveau, vidés par retournement doux, les cellules ont été ensuite lysées et les cristaux de bleu de Formazan dissous, par ajout de 200 μl de Diméthyl suifoxyde (DMSO) . Après homogénéisation de la coloration, par agitation, les plaques ont été lues à 570 nm à l'aide d'un spectrophotomètre .
L'essai a été conduit après 24 heures de contact du complexe Camellia sinensis et Lampsana commuais avec les cellules.
Lot 1 : témoin négatif ne recevant aucun produit Lot 2 : cellules exposées au gaz d'échappement
Lot 3 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,01 %)
Lot 4 : cellules exposés au gaz d'échappement puis traité avec le complexe (0,025 %) Lot 5 : cellules exposés au gaz d'échappement puis traité avec le complexe (0,05 %)
3. Étude de l'activité anti-radicalaire.
L'essai a été conduit en triplicate après 24 h de contact du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis avec les cellules.
Constitution des lots
Lot 1 : témoin négatif ne recevant aucun produit
Lot 2 : cellules exposées au gaz d'échappement
Lot 3 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,01 %)
Lot 4 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,025 %)
Lot 5 : cellules exposés au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,05 %) a) Extraction du malondialdéhyde (MDA) .
Après 24 h de contact du produit avec les cellules, ces dernières ont été remises en suspension dans :
- 250 μl de tampon Tris 50 mM, pH8 contenant NaCl 0,1M ; EDTA 20 mM - 25 μl de SDS à 7 % - 300 μl de HCl ( 0 , 1 N )
- 38 μl d'acide phosphotungstique à 1 % dans l'eau
- 300 μl d'acide thiobarbiturique à 0,67 % dans l'eau Après 1 heure d'incubation dans l'obscurité à 5O0C et un refroidissement dans l'eau glacée, 300 ml de n-butanol ont été ajoutés dans chaque tube. Ceux-ci ont été centrifugés à 10000 g à O0C pendant 10 min. La phase supérieure a été récupérée pour le dosage du MDA. b) Dosage du malondialdéhyde (MDA). Le MDA a été dosé par mesure de la fluorescence après séparation du complexe MDA-TBA par HPLC.
- Pompe Bischoff Model 2.200
- Injecteur automatique Alcool Model 788 autosampler
- Colonne Ultrasep C18 (30 cm x 0,18 cm) 6 mm de porosité
- Détecteur de fluorescence, jasco 821-FI
La détection de la fluorescence a été effectuée avec une excitation à 515 nm et une émission à 553 nm. L'éluent utilisé est composé de méthanol : eau, 40 : 60 (v/v) dont le pH a été ajusté avec du KOH 1 M.
La quantification a été faite par rapport à des standards traités comme les échantillons (0,125 ; 0,25 ; 0,5 et 1 mM) à l'aide d'un logiciel informatique ICS (Pic 3) (Instrumentation, Consommable Service). B. RÉSULTATS.
1. Etude de la cytotoxicité.
Le but de cette étape était de rechercher la réversibilité de l'effet cytotoxique des gaz d'échappement après le traitement par le complexe Camellia sinens±s et Lampsana communie vis-à-vis des kératinocytes humains en culture. Cette étude a été réalisée par la détermination de la viabilité cellulaire en utilisant le Test de MTT.
Le complexe Camellia sinensis et Lampsana communie incubé respectivement aux concentrations de 0,025 et 0,05% avec les kératinocytes a induit un effet significatif sur la réversibilité de la cytotoxicité induite par les gaz d'échappement. Cette inhibition de la cytotoxicité se traduit par une augmentation de la viabilité cellulaire respectivement de 16 et 27 % (Figure 1). 2. Étude de l'activité anti-radicalaire.
Les résultats obtenus montrent une protection significative du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis (testé respectivement aux concentrations de 0,01, 0,025 et 0,05%) vis-à-vis de la lipoperoxydation provoquée par les gaz d'échappement. Le pourcentage de réduction de la production de MDA est respectivement de —17, -27 et —34 % (Figure 2) .
3. Conclusions.
Dans les conditions expérimentales retenues, le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis est apparu présenter un effet sur la réversibilité de la cytotoxicité et de l ' activité pro-radicalaire induite par les gaz d'échappement au niveau des kératinocytes humains en culture après 24 heures de contact. En effet, les dosages du MDA montrent que le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis étudié aux concentrations de 0,01 ; 0,025 et 0,05 % a induit une protection significative des kératinocytes humains contre la lipoperoxydation provoquée par les gaz d'échappement. Le pourcentage de réduction de la production de MDA est de — 17, -27 et -34 %.
En conclusion, le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis présente un effet anti-radicalaire significatif vis-à-vis des radicaux libres induits par les gaz d ' échappement .
II. ÉVALUATION DE L' EFFET DU COMPLEXE Camellia sinensis et Lampsana communis SUR LE MÉTABOLISME ENERGETIQUE .
A. Matériel et méthodes. 1. Matériel. Les cultures de kératinocytes sont établies à partir de peau de prépuces humains récoltés lors de circoncisions et sont amplifiées dans du milieu KGM2 (Clonetics) supplémenté par l'insuline, I1EGF et de l'extrait pituitaire. Les essais ont été réalisés sur des kératinocytes entre le 2eme et le 4ème passage, afin d'assurer une reproductibilité entre les différentes expérimentations .
Les gaz d'échappement ont été produits par un moteur. Les cellules ont été mises au contact des gaz pendant 2 heures. Elles ont été par la suite incubées avec ou sans le produit à l'étude pendant 22 heures supplémentaires.
2. Étude de l'effet du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis sur la vitesse de respiration (consommation d'oxygène en picoatomes d'oxygène par million de cellules et par minute).
Cet essai a été réalisé selon 2 conditions différentes : effet sur la vitesse de respiration basale cellulaire au niveau des cellules non perméabilisées et en présence du glucose, effet sur la vitesse de la respiration mitochondriale des cellules perméabilisées en présence du substrat respiratoire, pyruvate-malate. Cette étude a été réalisée sur des kératinocytes en culture dissociés à la trypsine. 5 à 10 millions des kératinocytes en cultures ont été mis en suspension dans 1 ml de milieu HBSS à 300C contenant soit du glucose (respiration basale) soit du pyruvate-malate (respiration mitochondriale). La respiration a été suivie en temps réel et exprimée en picoatomes d'oxygène consommés par minute et par 106 cellules. L'addition de différentes quantités du produit dans la cuve de l ' oxygraphe met en évidence une éventuelle stimulation ou inhibition de la respiration. La quantité d'oxygène dissous dans un milieu d'incubation a été déterminée à l'aide d'une électrode de Clark. L'oxygène qui diffuse à travers un film de téflon est réduit au niveau de la cathode de platine polarisée à — 0,8 Volt. Dans ces conditions, le courant passant entre cette cathode et l'anode d'argent est proportionnel à la concentration en oxygène dans la solution. Le pont ionique est assuré par une solution de KCl demi saturée. L'acquisition et le traitement des mesures sont faits sur un micro-ordinateur. Constitution des lots :
Lot 1 : témoin négatif ne recevant aucun produit Lot 2 : cellules exposées au gaz d'échappement Lot 3 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,01 %) Lot 4 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,025 %)
Lot 5 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,05 %)
L'essai a été réalisé après 20 minutes de contact du produit le complexe Camellia sinensis et Lampsana coimunis avec les cellules .
3. Étude de l'effet du produit sur la synthèse d'ATP basale et mitochondriale des kératinocytes en culture.
Le but de cette étude est d'évaluer l'effet du complexe Camellia sinensis et Lampsana communis sur la vitesse de la synthèse d'ATP basale et mitochondriale des kératinocytes en culture. Cette détermination est réalisée par bioluminescence à l'aide du kit luciférine/luciférase.
La quantité d'ATP basale et nouvellement synthétisée dans les différents aliquotes est mesurée à travers la lumière émise lors de la réaction de consommation d'ATP suivante :
Luciférase
ATP + LUCIFÉRINE > OXYLUCIFÉRINE+AMP+PPi+CO2+hv Mg2+ L'intensité de cette lumière émise lors de cette réaction est mesurée à l'aide d'un appareil de type Luminoscan en utilisant I1ATP monitoring reagent (ATP Bioluminescence Assay Kit HS II) de Boehringer Mannheim. Cet appareil transcrit la lumière émise lors de la réaction en RLU (unité relative de luminosité). Les RLU mesurées sont converties en moles d'ATP en se référant à une gamme étalon d'ATP.
La vitesse de synthèse d'ATP est exprimée en nmoles/min/106 cellules.
Des kératinocytes en culture ont été cultivés, en étuve à CO2, à raison de 106 par run dans un milieu de culture ADM (Clonetics).
Le traitement consiste à appliquer de manière directe le complexe Camellia sinensis et Lampsana coimunis à la concentration désirée sur les cellules en suspension dans la cuve de l'oxygraphe. Les cellules à la concentration de 106 cellules/ml sont mises en suspension dans un "tampon respiratoire" (Hanks-Hepes glucose 20 mM) , dans la cuve de l'oxygraphe thermostatée à 300C et agitée. Les cellules sont perméabilisées à l'aide de digitonine. L'ajout d'un substrat respiratoire (pyruvate 10 mM et malate 10 mM) permet d'observer une vitesse de consommation d'oxygène (état 2 selon Chance). Après l'ajout de différentes quantités du produit (concentrations finales : 0,01 ; 0,025 et 0,05 %) dans la cuve de l'oxygraphe et à intervalles réguliers, un aliquote est prélevé dans la cuve de l'oxygraphe pour y doser l'ATP selon la méthode décrite ci- dessus. L'addition de différentes quantités du produit dans la cuve de l'oxygraphe permet ainsi de mettre en évidence une éventuelle activation ou inhibition de la synthèse d ' ATP .
Constitution des lots :
Lot 1 : témoin négatif ne recevant aucun produit Lot 2 : cellules exposées au gaz d'échappement Lot 3 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,01 %)
Lot 4 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,025 %) Lot 5 : cellules exposées au gaz d'échappement puis traitées avec le complexe (0,05 %)
B. RÉSULTATS.
1. Étude de l'effet du complexe à différentes doses sur la vitesse de respiration (consommation d'oxygène) des kératinocytes en culture.
Cet essai a été réalisé selon 2 conditions expérimentales différentes. Les résultats sont exprimés en picoatomes d'oxygène par million de cellules et par minute.
Le complexe Camellia sinensis et Lampsana coimunis, incubé respectivement aux concentrations de 0,01, 0,025 et 0,05% avec les kératinocytes préalablement exposés aux gaz d'échappement, a induit un effet significatif, sur la vitesse de consommation d'oxygène aux concentrations étudiées. Cette stimulation de la respiration basale se traduit par une augmentation sensible de la vitesse de consommation d'oxygène respectivement de 14, 24 et 34 % (Figure 3) .
2. Effet du complexe sur la vitesse de la respiration mitochondriale . Cet essai a été réalisé sur les cellules perméabilisées en présence du substrat respiratoire, pyruvate-malate .
Le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis, incubé aux différentes concentrations avec les kératinocytes préalablement exposés aux gaz d'échappement, a induit un effet significatif, sur la vitesse de consommation d'oxygène aux concentrations de 0,025 et 0,05 %. Cette stimulation de la respiration mitochondriale se traduit par une augmentation sensible de la vitesse de consommation d'oxygène respectivement de 19 et 24 % (Figure 4).
3. Effet du complexe à différentes doses sur la synthèse d'ATP basale et πtitochondriale des kératinocytes en culture. Cet essai a été réalisé selon 2 conditions expérimentales différentes. Les résultats sont exprimés en nmoles par minute et par million de cellules. a) Effet sur la synthèse d'ATP basale cellulaire.
Cet essai a été effectué sur des cellules entières non perméabilisées en présence du glucose.
Le complexe Camellia sinensis et Lampsana communie, incubé aux différentes concentrations avec les kératinocytes préalablement exposés aux gaz d'échappement, a induit un effet significatif sur la vitesse de synthèse d'ATP basale aux concentrations de 0,025 et 0,05%. La vitesse de synthèse d'ATP basale augmente en effet respectivement de 23 et 29 % (Figure 5). b) Effet sur la vitesse de synthèse d'ATP mitochondriale cellulaire. Cet essai a été effectué sur des cellules entières perméabilisées en présence du pyruvate-malate.
Le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis, incubé aux différentes concentrations avec les kératinocytes préalablement exposés aux gaz d'échappement, a induit un effet significatif sur la vitesse de synthèse mitochondriale d'ATP aux concentrations de 0,025 et 0,05 %. La vitesse de synthèse d'ATP mitochondriale augmente en effet respectivement de 19 et 29 % (Figure 6).
III. CONCLUSIONS SUR LES RÉSULTATS OBTENUS. Dans les conditions expérimentales, au vu des résultats obtenus le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis a induit un effet : significatif sur la réversibilité de la cytotoxicité induite par les gaz d'échappement qui est respectivement de 16 et 27 % pour des concentrations de complexe Camellia sinensis et Lampsana coimunis de 0,025 et 0,05 % (Figure 1), significatif sur la vitesse de la respiration basale qui est respectivement de 24 et 34 % pour des concentrations de complexe Camellia sinensis et Lampsana communis de 0,025 et 0,05 % (Figure 3), significatif sur la vitesse de la respiration mitochondriale qui est respectivement de 19 et 24 % pour des concentrations de complexe Camellia sinensis et Lampsana communis de 0,025 et 0,05 % (Figure 4), significatif sur la vitesse de synthèse d'ATP basale qui est respectivement de 23 et 29 % pour des concentrations de complexe Camellia sinensis et Lampsana communis de 0,025 et 0,05 % (Figure 5), - significatif sur la vitesse de synthèse d'ATP mitochondriale qui est respectivement de 19 et 29 % pour des concentrations de complexe Camellia sinensis et Lampsana communis de 0,025 et 0,05 % (Figure 6).
On notera, que de manière surprenante, le complexe Camellia sinensis et Lampsana communis est actif à des concentrations très faibles, signe de la synergie entre les deux extraits.
IV. EXEMPLES DE COMPOSITIONS OBJET DE L'INVENTION.
A. GEL CRÈME ANTI-POLLUTION. EAU DÉMINÉRALISÉE q.s.p 100
PEMULEN TRl 0,5
GLYCÉRINE 5 , 0
SEPIGEL 305 1,0
EXTRAIT DE Camellia sinensis 0,05 EXTRAIT DE Lampsana communis 0,05
ISONONYL ISONONANOATE 7,0
C12 - C15 ALKYL BENZOATE 3,0
HUILE DE SILICONE 2,0
HYDROXYDE DE SODIUM 0,2 PARFUM 0 , 3 COLORANTS A 1 % 0,12
CONSERVATEURS 1, 0
B. CRÈME ANTI-POLLUTION.
EAU DÉMINÉRALISÉE q.s.p 100
CETEARYL GLUCOSIDE 5,0
TRIGLYCÉRIDES C8-C10 10
HUILE DE SILICONE 2,0 SILICONE VOLATILE 5,0
CARBOMÈRE 0 , 2
GLYCÉRINE 5 , 0
EXTRAIT DE Camellia sinensis 0,05
EXTRAIT DE Lampsana commuais 0,05 PARFUM 0,3
CONSERVATEURS 1 , 0

Claims

REVENDICATIONS
1) Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle contient un extrait de Camellia sinensis et un extrait de
Lampsana communis.
2) Composition cosmétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait de Camellia sinensis est un extrait hydro-glycolique des feuilles de cette plante.
3) Composition cosmétique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que l'extrait de Lampsana communis est un extrait hydro-glycolique de la partie aérienne de cette plante.
4) Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient :
- de l'ordre de 0,01 à 5 % en poids, de préférence 0,01 à 0,5 % en poids et tout préférentiellement de 0.01 à
0.05% en poids d'extrait de Camellia sinensis et
- de l'ordre de 0,01 à 5 % en poids, de préférence 0,01 à 0,5 % en poids et tout préférentiellement de 0.01 à 0.05% en poids d'extrait de Lampsana communis.
5) Composition cosmétique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un ou plusieurs agents de formulation ou additifs tels que des adoucissants, des colorants, des agents filmogènes, des tensio-actifs, des parfums, des conservateurs, des émulsionnants, des huiles, des glycols, des vitamines et des filtres UV.
6) Utilisation cosmétique d'une composition selon les revendications 1 à 5, pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau.
7) Utilisation d'extraits de Camellia sinensis et Lampsana coπununis, selon les revendications 1 à 4, pour la préparation d'une composition cosmétique pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau.
8) Procédé de soin cosmétique, pour lutter et prévenir les effets de la pollution sur la peau, caractérisé en ce qu'on applique sur la peau une quantité adéquate d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
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