WO2006098430A1

WO2006098430A1 - 細胞内物質導入装置、細胞クランプ装置及び流路の形成方法

Info

Publication number: WO2006098430A1
Application number: PCT/JP2006/305392
Authority: WO
Inventors: Hidetoshi Kotera; Isaku Kanno; Takaaki Suzuki; Masao Washizu
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2005-03-17
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2006-09-21
Also published as: JPWO2006098430A1; US20080206828A1; JP2009145361A

Abstract

　細胞の大きさに依存しないエレクトロポレーションにより、高効率の外来物質の導入を実現することができる細胞内物質導入装置、細胞を多くの部位でクランプすることが可能な細胞クランプ装置、流路を効率よく形成することができる流路の形成方法を提供する。　細胞内物質導入装置１０ａは、小孔１を有する絶縁性薄膜２と、小孔１に対向して絶縁性薄膜２の両側に配置された一対の電極６，７とを備える。小孔１に細胞９を固定するとともに、空間５に細胞９内に導入したい物質４を含む流体を満たした状態で、電極６，７間にパルス電圧を印加することによって、小孔部分への電界集中を利用して細胞膜を破壊して、細胞９内に物質４を導入する。

Description

細胞内物質導入装置、細胞クランプ装置及び流路の形成方法技術分野

[0001] 本発明は、細胞内物質導入装置、細胞クランプ装置及び流路の形成方法に関し、詳しくは、細胞の内部に外来物質を導入するための細胞内物質導入装置、細胞の機能を評価するための細胞クランプ装置及びそれらの装置の形成に特に好適な流路の形成方法に関する。

背景技術

[0002] 従来、細胞内に遺伝子等の外来物質を導入するための手法としては、ガラスキヤピラリーにより細胞 1つ 1つに注入するマイクロインジェクション法や、細胞懸濁液に電界を印加して細胞膜を可逆的に破壊 ·透過化することによるエレクト口ポレーシヨン法が用いられる。

[0003] マイクロインジェクション法は、 1つ 1つの細胞に確実に外来物質を導入できるが、煩雑な微細操作を伴うため、大量の細胞を処理することは困難である。これに対し、エレクト口ポレーシヨン法は、大量の細胞を処理するのには向いている。例えば、特許文献 1には、エレクト口ポレーシヨン法のための細胞用薬液注入器が開示されている

[0004] また、細胞の持つ電気的特性や機械的特性や力学的刺激に対する応答を計測する手法として、ノ^チクランプ法が一般的である。例えば、ガラス管を熱間で引き抜いて作製したマイクロピペットを細胞表面に接触させて、細胞表面の電気特性の変化を計測する。

[0005] また、非特許文献 2には、高アスペクト比の構造物を作製できるレジスト SU— 8 (mi crohem社製)を用いて、網目状などのマイクロ構造を形成する技術が開示されて!ヽる。

特許文献 1：特開平 10— 337177号公報

非特許文献 1 : U.Zimmermann, Electrical breakdown, electropermeabilization and el ectrofusion", Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 15, p.175— 345 (1986) 非特許文献 2 : Hironobu Sato, Takayuki Kakinuma, Jeung Sang Go and Shuichi Shoji ,〃In- channel 3-D micromesh structures using maskless multi-angle exposures and t heir microfilter application", Sensors and Actuators A: Physical, Volume 111, Issue 1, 1 March 2004, Pages 87-92

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] エレクト口ポレーシヨン法には、以下のような問題点がある。

[0007] 一様電界 Eの中に置かれた半径 aの細胞の細胞膜に力かる膜電圧 V ( 0 )は、 [0008] V ( 0 ) = 1.5 X a X E X cos 0 (1)

m

で与えられる。ただし、 θは、電気力線と半径のなす角である。（非特許文献 1参照）

[0009] 式（1)は、細胞膜に力かる電圧の大きさは、電気力線の最上流側（北極： 0 =0)の位置および最下流側（南極： θ = π )の位置で最大となり、その値は細胞の半径 aに比例することを述べている。従って、細胞に一様な電界パルスを印加すると、北極および南極の位置での膜がまず破壊されることになる。

[0010] 膜電圧が約 IVとなるような適度なパルス電圧が印加された場合は、この破壊はいわゆる可逆的破壊となり、膜は自復することが知られている。この可逆的破壊の過程で、膜の透過性が上昇するので、細胞周囲におかれた外来物質が細胞膜内へと取り込まれることになる。

[0011] し力しながら、過度の電圧が印加された場合は、膜の破壊は非可逆的で自復できず、破壊が膜全体に伝搬する結果、細胞自体が破壊され、細胞は死滅することになる。

[0012] ところで、この膜電圧は式（1)に示すように細胞の半径 aに比例する。一方、細胞は、その直径は一様ではなぐある広がりをもった分布を持つのが通常である。従って、多数の細胞の懸濁液に一様なパルス電界を印加した場合には、 a)大きい細胞には過大な膜電圧が発生し細胞自体が破壊されてしまう、 b)小さ、細胞にカゝかる膜電圧は低すぎて膜の透過化が生じず、外来物質が導入されないということになる。すなわち、ある範囲の大きさの細胞のみにしか外来物質が導入できない。

[0013] 本発明は、斯かる実情に鑑み、細胞の大きさに依存しないエレクト口ポレーシヨンにより、高効率の外来物質の導入を実現することができる細胞内物質導入装置を提供しょうとするちのである。

[0014] また、ノツチクランプ法では、多くて 2から 3個のガラス管を細胞に接続することが限界であり、細胞内の物質移動や細胞間の物質移動およびより小さな細胞内'細胞間の作用を計測することは困難である。

[0015] 本発明は、斯かる実情に鑑み、細胞を多くの部位でクランプすることが可能な細胞クランプ装置を提供しょうとするものである。

[0016] さらに、細胞内物質導入装置や細胞クランプ装置では、流路を形成する必要がある

。一般には、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する方法で流路が形成される。しかし、この方法では、基板の反りなどにより接合不良が生じやすぐ流路を効率よく形成することが困難である。

[0017] 本発明は、斯かる実情に鑑み、流路を効率よく形成することができる流路の形成方法を提供しょうとするものである。

課題を解決するための手段

[0018] 本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した細胞内物質導入装置を提供する。

[0019] 細胞内物質導入装置は、小孔を有する絶縁性薄膜と、前記小孔に対向して前記絶縁性薄膜の両側に配置された一対の電極とを備える。細胞内物質導入装置は、前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に細胞を固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する空間に前記細胞内に導入した、物質を含む流体を満たした状態で、前記一対の電極間にパルス電圧を印加することによって前記細胞の細胞膜を破壊して前記細胞内に前記物質を導入する。

[0020] 上記構成において、一対の電極間にパルス電圧を印加すると、絶縁性薄膜に設けた小孔に電界が集中するので、小孔に接した細胞膜を可逆的あるいは非可逆的に破壊して、小孔に連続する空間に満たした流体中に含まれる物質を、細胞内に導入することができる。

[0021] エレクト口ポレーシヨンに実際に用いられるパルス幅の電圧に対して小孔部分に電界集中が生じるためには、絶縁性薄膜の厚さを d、誘電率を ε、前記一対の電極の間隔を L、流体の抵抗率を pとした時、系の時定数 τ = ε p LZdが 10ミリ秒以下となるように、前記絶縁性薄膜の厚さ d、前記誘電率 ε、前記一対の電極の間隔 L、前記流体の抵抗率 pを選ぶこと力好ましい。

[0022] 好ましくは、前記絶縁性薄膜の細胞が存在する側に置かれた電極が、前記小孔ょり、前記小孔直径の 10倍以上離れた位置に置く。これにより、小孔に十分な電界を集中することができる。

[0023] 好ましくは、前記小孔の直径が、前記細胞の直径の 1Z3以下である。この場合、細胞膜の小孔に接する部分に十分に電界を集中し、細胞膜の小孔に接する部分のみを透過化することができる。

[0024] 好ましくは、前記一対の電極間に印加する前記パルス電圧が 10V以下である。 10 V以下のパルス電圧を用いれば、細胞膜の他の部分にダメージを与えることなぐ小孔に集中した電界を用いて、小孔部分の膜のみを透過化することができる。

[0025] 小孔への細胞の固定は、吸引固定、もしくは重力による沈降、誘電泳動，電気泳動を利用することも可能である

[0026] 好ましくは、前記絶縁性薄膜に関して前記他方の領域において、前記小孔に連続する前記空間が、前記小孔の部分を除いて密閉される。上記構成によれば、小孔に連続する空間が、前記小孔の部分を除いて密閉されているので、空間に満たされる流体を吸引することにより、小孔での細胞の固定を安定ィ匕することができる。

[0027] 好ましくは、前記絶縁性薄膜の前記小孔周辺に、前記細胞に接着する表面修飾を施す。上記構成によれば、細胞膜の小孔部分で発生した破壊が周囲に伝搬することを、積極的に防止することができる。

[0028] 本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した細胞クランプ装置を提供する。

[0029] 細胞クランプ装置は、光硬化性榭脂からなる榭脂膜を備える。該榭脂膜は、該榭脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、該開口に連続する小孔と、該小孔に連通する連通孔とを複数組有する。

[0030] 上記構成において、小孔及び連通孔を介して細胞を吸引することにより、細胞を開口に固定することができる。複数の開口を備えるので、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。細胞クランプ装置は、細胞をクランプした状態で、外来物質を細胞内に導入するなどの操作や、刺激に対する機械的、電気的、化学的な応答などの細胞機能の測定などに用いることができる。

[0031] 好ましくは、前記榭脂膜を支持する基板を備える。該基板に、前記開口に対向する前記小孔の底面力前記連通孔に沿って延在する導電膜が形成される。

[0032] 上記構成によれば、導電膜は、電極や電気配線として用いることができる。例えば、細胞内に導入したい物質を含む流体を小孔及び連通孔に満たした状態で、細胞側に配置した電極と導電膜との間にパルス電圧を印加し、細胞内に物質を導入するために用いることができる。また、細胞側に配置した電極と導電膜との間の電位ゃ電流を計測するために用いることもできる。

[0033] 好ましくは、柱状支持部材をさらに備える。前記柱状支持部材は、前記一方の主面に沿って配置されるベース部と、前記ベースを介して前記開口に対向し、前記べ一ス部から前記開口とは反対側に突出する突起部と、前記突起部の先端と前記開口との間を連通する貫通孔とを有する。

[0034] 上記構成にお、て、柱状支持部材の突起部の先端により、細胞を、柱状支持部材のベース部力浮いた状態で支持することができる。このとき、榭脂膜の貫通孔及び小孔と柱状支持部材の連通孔とを介して、細胞を吸引固定することができる。

[0035] 上記構成によれば、柱状支持部材の突起部の先端から細胞内に外来物質を瞬時に導入したときの応答 (細胞内濃度ジャンプ)以外に、細胞の周囲に、一定濃度の試薬や分子などを瞬時に導入したときの応答 (細胞外濃度ジャンプ)を測定することができる。応答は、柱状支持部材の突起部ごとの電位や電流値のほか、応答に伴う突起部の橈み (変形、変位)を測定することができる。

[0036] また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した流路の形成方法を提供する。

[0037] 流路の形成方法は、第 1ないし第 4のステップを備える。前記第 1のステップにおいて、透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する。前記第 2のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面又は他方の主面に光硬化性榭脂を塗布する。前記第 3のステップにおいて、前記基板に関して前記光硬化性榭脂とは反対側から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性榭脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性榭脂の前記光が透過した部分を硬化させる。前記第 4のステップにおいて、前記前記光硬化性榭脂の前記非透過領域を除去する。前記第 1のステップにおいて、前記遮光パターンは、細長い第 1部分と、該第 1部分に連続しかつ該第 1部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第 2 部分との少なくとも一方を含む。前記第 3のステップにおいて、前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第 1部分に対応する第 1領域と、前記遮光パターンの前記第 2部分に対応する第 2領域との少なくとも一方を含む。前記第 1領域は、前記光硬化性榭脂内の前記基板側に延在する。前記第 2領域は、前記光硬化性榭脂内の前記基板側から前記光硬化性榭脂の前記基板とは反対側の主面まで延在する。前記第 4のステップにおいて、前記非透過領域の前記第 1領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、前記非透過領域の前記第 2領域を除去して、前記前記光硬化性榭脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成する

[0038] 上記方法にお!、て、遮光パターンは、第 1部分のみ又は第 2部分のみであっても、第 1部分が複数であっても、第 2部分が複数であってもよい。さらには、複数組の第 1 部分及び第 2部分を備えてもよい。また、横孔又は縦孔のいずれか一方のみの流路を形成してもよい。上記方法によれば、主面に溝を形成した基板に他の基板を接合する場合に比べ、流路の形成が簡単である。

[0039] 好ましくは、前記第 1のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成する。前記第 2のステップにおいて、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性榭脂を塗布する。この場合、小孔の開口に対向する部分から流路に沿って延在する導電パターンを同時に形成することができる。この導電パターンは、電極や電気配線として用いることができる。

[0040] また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した流路の形成方法を提供する。 [0041] 流路の形成方法は、第 1ないし第 4のステップを備える。前記第 1のステップにおいて、透明な基板の一方の主面に光硬化性榭脂を塗布する。前記第 2のステップにおいて、前記基板の他方の主面に沿って、遮光パターンを有するマスク部材を配置する。前記第 3のステップにおいて、前記マスク部材側から、前記マスク部材に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性榭脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性榭脂の前記光が透過した部分を硬化させる。前記第 4のステップにおいて、前記前記光硬化性榭脂の前記非透過領域を除去する。前記第 1のステップにおいて、前記遮光パターンは、細長い第 1部分と、該第 1部分に連続しかつ該第 1部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第 2部分との少なくとも一方を含む。前記第 3のステップにおいて、前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第 1部分に対応する第 1領域と、前記遮光パターンの前記第 2部分に対応する第 2領域との少なくとも一方を含む。前記第 1領域は、前記光硬化性榭脂内の前記基板側に延在する。前記第 2 領域は、前記光硬化性榭脂内の前記基板側から前記光硬化性榭脂の前記基板とは反対側の主面まで延在する。前記第 4のステップにおいて、前記非透過領域の前記第 1領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、前記非透過領域の前記第 2領域を除去して、前記前記光硬化性榭脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成する。

発明の効果

[0042] 本発明の細胞内物質導入装置によれば、細胞の大きさに関係なくエレクト口ポレーシヨンが行えるため、高効率の外来物質の導入が実現される。また、絶縁性薄膜の上に多数の小孔を配列することにより、大量の細胞に同時並列的に外来物質を導入することがでさる。

[0043] また、本発明の細胞クランプ装置によれば、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。

[0044] さらに、本発明流路の形成方法によれば、流路を効率よく形成することができる。

図面の簡単な説明

[0045] [図 1]細胞内物質導入装置の構成を示す断面図である。（実施例 1) 圆 2]細胞内物質導入装置の構成を示す断面図である。（実施例 2)

圆 3]細胞クランプ装置の最小構成単位を示す説明図である。（実施例 3) 圆 4]照射の説明図である。（実施例 3)

圆 5]細胞クランプ装置の構成を示す断面図である。（実施例 4)

圆 6]細胞クランプ装置の構成を示す平面図である。（実施例 5)

圆 7]柱状支持部材の構成を示す斜視図である。（実施例 6)

圆 8]細胞クランプ装置に柱状支持部材を用いたときの構成を示す要部断面である。 (実施例 6)

圆 9]細胞クランプ装置に柱状支持部材を用いた計測の説明図である。（実施例 6) 圆 10]柱状支持部材の製作方法の説明面である。（実施例 6)

符号の説明

1 小孔

2 絶縁性薄膜

6, 7 電極

9 細胞

10a, 10b 細胞内物質導入装置

11 絶縁性薄膜

12 小孔

14, 15 電極

20 細胞クランプ装置

21 基板

22, 22a, 22b 導電膜

23 榭脂膜

24s 開口

24a, 24b, 24t 小孔（縦孔）

25a, 25b, 25t 連通孔（横孔）

30 細胞クランプ装置

32 基板 33 榭脂膜

34a〜34h 小孔（縦孔）

35a〜35h 連通孔 (横孔）

50 柱状支持部材

52 ベース部

54 突起部

54a 先端

56 貝通孑し

80 細胞

発明を実施するための最良の形態

[0047] 以下、本発明の実施の形態として実施例について図 1〜図 10を参照しながら説明する。

[0048] まず、細胞内物質導入装置について、図 1及び図 2を参照しながら説明する。

[0049] 図 1に示すように、細胞内物質導入装置 10aは、小孔 1を持つ絶縁性薄膜 2の両側に、バッファー（例えば生理食塩水）を満たしたチャンバ一 3および外来物質 4の水溶液を満たしたチャンバ一 5があり、各々に電極 6および 7が接触している。 8は電極を保持するためのスぺーサで、電極とともにチャンバ一壁を兼ねている。小孔 1のバッファーを満たしたチャンバ一 3の側に、細胞 9を吸引固定し、電極 6と 7の間にパルス電圧を印加する。なお、絶縁性薄膜 2は、電極 6, 7間の流体を分離する必要がある力特にチャンバ一 5が小孔 1の部分を除いて密閉されている場合には、細胞 9を小孔 1に吸引固定することが容易になる上、チャンバ一 5からの液漏れもなくなる。

[0050] 絶縁性薄膜 2は、例えば、 SiO膜である。具体的には、 Si基板を熱酸化すること〖こ

2

SiO膜を形成し、 SiO膜にフォトレジストを塗布してマスクパターンを転写した後、現

2 2

像を行い、 SiO膜の小孔 1となる部分をエッチングし、最後に、 Si基板をエッチング

2

等により除去することにより、 SiO膜の絶縁性薄膜 2が得られる。 Si基板を全部除去

2

するのではなく一部を残し、残した Si基板で絶縁性薄膜 2を支持するようにしてもょヽ [0051] または、有機薄膜に、レーザーまたはフォトリソグラフィ一によつて小孔を開口したものを、絶縁性薄膜 2として用いることも可能である。

[0052] 図 1にお、て点線で示したように、絶縁性薄膜 2の厚さを d、誘電率を ε、一対の電極 6, 7の間隔を L、チャンバ一 3, 5内の流体の抵抗率を pとした時、系の時定数 τ = ε β LZdが 10ミリ秒以下となるように、絶縁性薄膜 2の厚さ d、誘電率 ε、一対の電極 6, 7の間隔 L、チャンバ一 3, 5内の流体の抵抗率 pを選んだ条件下では、電気力線 10は絶縁性薄膜 2を通過することができないので、小孔 1を通ることになる。すなわち、電気力線 10が収束するため、小孔の位置での電界強度が、溶液中での電界強度に比べて極めて強くなる。これにより、細胞膜の小孔に接している部分にのみ、ェレクト口ポレーシヨンすなわち膜の透過化が生じ、チャンバ一 5の中にある外来物質 4 力拡散または電気泳動により、細胞内へと導入されることになる。

[0053] 十分な電界の集中を得て、細胞膜の小孔に接する部分のみを透過化するためには、小孔が細胞直径に比して十分小さいこと、特に細胞直径の 1Z3以下であることが望ましい。この時、小孔に接する部分の細胞膜に力かる膜電圧は、小孔部分の電界集中によってのみ決まり、細胞の直径に依存しない。すなわち、本装置を用いれば、細胞の直径に依存しない外来物質の導入が可能になる。

[0054] ここで、一対の電極 6, 7間に 10V以下の適度なパルス電圧を選択すれば、小孔 1 に接した部分の膜が可逆的に破壊され、自復するため、細胞に大きなダメージを与えることなく外来物質の導入が可能になる。溶液中に懸濁された細胞にパルス電圧を印加する通常のエレクト口ポレーシヨンの場合には、細胞膜の部分的破壊が細胞全体に伝搬して、細胞全体の破壊 '死滅につながる力本装置の場合には、細胞膜が絶縁性薄膜に固定されているので、小孔部分力発生する破壊の伝搬が生じにくい。さらに積極的にこの伝搬を防止するためには、小孔周辺の薄膜に細胞接着性の表面修飾を施すことが有効で、それを行うための物質としては、たとえば細胞付着性修飾剤 BAM (Biocompatible Anchor for Membrane；日本油脂株式会社）、ポリ—D—リジン（poly—D— lysine)、リン酸塩（phosphates)、ゥシ胎仔血清（FBS ； fetal bovine serum)が例示される。このことにより、本法は、通常のエレクトロポレーシヨンに比して、細胞を死滅させずに印加できる電圧の許容範囲が広ぐひいては高、効率での外来物質導入が行える。 [0055] なお、本発明の細胞内物質導入装置は図 1に示した構造に限定されるものではなぐ小孔を持つ絶縁性薄膜の両側に 2つの電極と接するあるいは電極を浸漬した溶液がありさえすれば、スぺーサ 8や電極 6, 7によってチャンバ一壁を構成する必要もなぐチャンバ一 3とチャンバ一 5が電気的に絶縁されていない構造でも、電気力線の集中は生ずるので、適用可能である。細胞の固定も吸引に限定されるものではなく、重力による沈降、電気泳動、誘電泳動を利用することも可能である。

[0056] 図 2は、本発明による、外来物質の細胞への同時並列導入の例である。絶縁性薄膜 11多数の小孔 12を設け、各々に細胞 13を固定して、電極 14と 15の間にノルス電圧を印加することにより、外来物質 16をすベての細胞内に同時に導入することができる。したがって、大量並列測定や、細胞膜電位の同時計測が可能である。

[0057] 本発明の細胞内物質導入装置によれば、細胞の直径に依存しないエレクトロボレーシヨンが実現されるので、細胞が広い粒径分布を持つ場合にも、高い効率での外来物質の導入が行える。また、細胞内外の溶液組成が任意にとれ、コンダクタンスが大きぐ膜透過性がない物質や、 caged物質 (光などで励起 '分離し発現する物質）以外の物質に対する測定が可能である。

[0058] 次に、細胞クランプ装置について、図 3〜図 10を参照しながら説明する。

[0059] 図 3に、細胞クランプ装置の最小構成単位 20sの要部構成を示す。

[0060] 細胞クランプ装置は、透明な基板 21の上面 21aに、絶縁性の樹脂からなる榭脂膜 23が配置されている。

[0061] 基板 21の上面 21aには、光の透過を阻止するとともに導電性を有する導電膜 22が形成されている。導電膜 22は、細長い第 1部分 22yと、第 1部分 22yの両端に連続しかつ第 1部分 22yの延在方向に対して略直角方向に広がった略長円形状の第 2部分 22x, 22zとを含む。導電膜 22は、第 1部分 22y又は第 2部分 22x, 22zに接続された他の部分を含んでもょ、。

[0062] 榭脂膜 23の上面 23aには、開口 24s, 26sが形成され、例えば、一方の開口 24sに細胞を固定し、他方の開口 26sからシリンジポンプや真空ポンプなどで吸引を行う。榭脂膜 23には、開口 24s, 26sに連続する小孔 24t, 26tと、小孔 24t, 26tに連通する連通孔 25tとが形成されている。小孔 24t, 26tは、それぞれ、導電膜 22の第 2部分 22x, 22zに対応して形成され、導電膜 22の第 2咅分 22x, 22zは/ J、孑し 24t, 26t の底面となる。連通孔 25tは、導電膜 22の第 1部分 22yに対応して形成され、導電膜 22の第 1部分 22yは連通孔 25tの底面となる。

[0063] 次に、製造方法について、図 4を参照しながら説明する。図 4は、大略、導電膜 22 の細長、第 1部分 22yが延在する方向に見た断面図である。

[0064] まず、透明な基板 21の上面 21aに、所定パターンの導電膜 22を形成する。具体的には、基板 21にはガラス基板を用いる。基板 21に Si基板ゃ榭脂基板を用いてもよい。導電膜 22は、基板 21にフォトレジストを塗布し、マスクパターンを転写した後、現像し、 A1を蒸着することにより形成する。 Pt、 Au、 Agなど、 A1以外の金属を蒸着してもよい。また、蒸着以外の方法によってもよい。

[0065] 次いで、基板 21の上面 21aに光硬化性の榭脂膜 23 (具体的には、 microchem社製のネガレジストである SU— 8)を塗布する。

[0066] 次いで、矢印 44a, 44bで示すように、基板 21の下面 21b側（すなわち、基板 21に関して榭脂膜 23とは反対側)から、基板 21の下面 21bに対して異なる角度で光を照射し、榭脂膜 23の光が透過した部分を硬化させる。

[0067] このとき、光を照射する方向 44a, 44bは、導電膜 22の細長い第 1部分 22yが延在する方向から見ると、基板 21の下面 21bに対して斜めに傾き、かつ、互いに略対称となる 2方向である。矢印 44aで示す方向力も光を照射したとき、榭脂膜 23内には、導電膜 22によって影となり、光が透過しない領域 44tが形成される。一方、矢印 44bで示す方向から光を照射したとき、榭脂膜 23内には、導電膜 21sによって影となり、光が透過しない領域 44sが形成される。 2つの影の領域 44s, 44tが重なり合う領域 44k は、光が全く透過しない非透過領域となる。榭脂膜 23は、非透過領域 44k以外の部分が硬化する。

[0068] 具体的には、紫外線の照射方向に対して基板 21を ±45° 傾けて配置した状態で、露光装置を用いて紫外線の平行光を、基板 21側力も榭脂膜 23に照射した後、榭脂膜 23の SU— 8が硬化を開始する温度よりも高い温度 (例えば、 95°C)まで加熱する。

[0069] 次いで、榭脂膜 23の非透過領域 44kを除去する。榭脂膜 23が SU— 8の場合には、現像液に浸して、榭脂膜 23の非透過領域 44kを溶出させる。

[0070] 非透過領域 44kは、導電膜 22に沿って延在する。非透過領域 44kは、導電膜 22 の第 1部分 22yに対応する第 1領域と、導電膜 22の第 2部分 22x, 22zに対応する第 2領域と含む。

[0071] 導電膜 22の第 1部分 22yの幅が狭いので、非透過領域 44kの第 1領域は、榭脂膜 23内において断面三角形となり、榭脂膜 23内のガラス基 21板側にのみ延在する。そのため、非透過領域 44kの第 1領域に対応して断面三角形のトンネル状の連通孔 (横孔) 25tが形成される。

[0072] 一方、導電膜 22の第 2部分 22x, 22zの幅が広いので、非透過領域 44kの第 2領域は、榭脂膜 23内において榭脂膜 23の上面 23aにまで達する断面台形となり、榭脂膜 23内の基板 21側カゝら反対側の上面 23aまで延在する。そのため、榭脂膜 23の上面 23aに開口 24s, 26sが形成され、非透過領域 44kの第 2領域に対応して、大略、円錐台状の小孔 (縦孔） 24t, 26tが形成される。

[0073] 例えば、基板 21にガラス基板を用い、榭脂膜 23に SU— 8を用い、導電膜 22として A1を蒸着することにより、榭脂膜 23の膜厚が 10 m、連通孔 25tの幅が 5 m、開口 24sの直径が 3 m、開口 26sの直径が 6 μ mとなる細胞クランプ装置を製作することができる。

[0074] 上記の製造方法は、基板を化学的、物理的にエッチングしたり、溝を形成した基板を接合したりする一般的なマイクロチャネル (流路)の形成方法に比べ、大規模な製造装置が不要であり、製造工程が簡単であり、製造コストも少なくてすむ。したがって、流路を効率よく形成することができる。また、流路の形成と同時に、電極や電気配線ち形成することができる。

[0075] 細胞クランプ装置は、複数の小孔及び連通孔を備えることにより、細胞の複数の部位を小孔で固定した状態で、種々の用途に用いることができる。

[0076] 図 5に示すように、細胞クランプ装置 20力第 1組の小孔 24a, 26a及び連通孔 25 aと、第 2組の小孔 24b, 26b及び連通孔 25bとを備える場合、小孔 26a, 26bに設けたシリンジポンプ 28a, 28bで矢印 29a, 29bで示すように吸引し、細胞 80の 2つの部位を小孔 24a, 24bに固定し、小孔 24a, 24bを通る電流を、導電膜 22a, 22b、外部端子 22p, 22qを介して電流計 30a, 30bで計測する。

[0077] 細胞クランプ装置 20は、細胞の上方に電極を配置すれば、細胞内物質導入装置として用いることもできる。例えば、細胞の一方の部位力外来物質を導入し、細胞の他方の部位での応答を検知すれば、ギャップ結合を有する物質輸送 (イオン、小分子（cAMP, cGMP他）の通過）を測定することができる。

[0078] 図 6に、多数の小孔 34a〜34hを設けた細胞クランプ装置 30の構成を示す。

[0079] 細胞クランプ装置 30は、最小構成単位の細胞クランプ装置 20sと同様に、透明なガラス基板 32に、ガラス基板 32より小さい絶縁性榭脂の榭脂膜 33が配置されている。榭脂 33には、複数組の細胞固定用の小孔 34a〜34h、連通孔 35a〜35h、吸引用の小孔 36a〜36hが形成されている。ガラス基板 32上に形成される導電膜は、細胞固定用の小孔 34a〜34h、連通孔 35a〜35h、吸引用の小孔 36a〜36hを形成する部分のほか、これらの部分力延長された延長部分 32a〜32hと、延長部分 32a 〜32hの端部に設けられた外部端子 31a〜31hとを含む。

[0080] 細胞クランプ装置 30は、光硬化性榭脂の榭脂膜 33に異なる角度で光を照射することによって、細胞固定用の小孔 34a〜34h、連通孔 35a〜35h、吸引用の小孔 36a 〜36hが形成されるが、同時に、ガラス基板 32上に形成される導電膜の延長部分 3 2a〜32hに対応して流路が形成される。そのため、延長部分 32a〜32hはできるだけ幅を狭くすることが好ましい。また、延長部分 32a〜32hに対応して形成される流路は、例えばクリップ等で榭脂膜 33を押さえて塞ぐことが好ましい。

[0081] 細胞クランプ装置 30は、細胞 80の複数の部位をクランプした状態で、種々の計測や細胞 80に対する操作のために用いることができる。

[0082] 細胞クランプ装置は、図 7〜図 10に示すように、柱状支持部材 50とともに用いることちでさる。

[0083] 図 7に示すように、柱状支持部材 50は、板状のベース部 52と、ベース部 52の上面 52aから突出した複数の柱状の突起部 54と、各突起部 54の先端 54aからベース部 5 2の下面 52bまで貫通する貫通孔 56とを有する。

[0084] 柱状支持部材 50は、例えば図 10に示す方法で作製することができる。すなわち、図 10 (a)に示すように、透明なガラス基板 60の一方の主面 60aに、リング状の遮光パターン 62を形成する。次いで、図 10 (b)に示すように、ガラス基板 60の上面 60aに光硬化性榭脂 64 (例えば、ネガレジスト SU— 8)をスピンコートした後、矢印 61で示すように、ガラス基板 60の下面 60b側から、ガラス基板 60の下面 60bに垂直方向に、平行光を露光し、榭脂 64内の光が透過した部分を硬化させる。次いで、図 10 (c) に示すように、榭脂 64の未露光部分を除去し、筒状の空間 65を形成する。次いで、図 10 (c)に示すように、榭脂 64の上面 64aに、所定厚さで榭脂 66 (例えば、 PDMS ； Polydimethylsiloxane)を塗布し、榭脂 66を筒状の空間 65に充填した後、榭脂 6 6を硬化させる。そして、図 10 (d)に示すように、榭脂 66を榭脂 64から分離する。このとき、榭脂 66には、筒状の突起部 67が形成される力突起部 67の中心孔 68は非貫通の状態であるので、最後に、中心孔 68底をレーザーでカ卩ェし、中心孔 68を貫通させる。

[0085] 図 8に示すように、柱状支持部材 50は、細胞クランプ装置 30の榭脂膜 33に沿って配置される。このとき、柱状支持部材 50の各突起部 54は、それぞれ、ベース部 52を介して、榭脂膜 33の上面に形成された小孔 34の開口に対向し、柱状支持部材 50の貫通孔 56は、細胞クランプ装置 30の小孔 34と連通する。細胞クランプ装置 30の小孔 36からシリンジポンプ 38により矢印 39で示すように吸引し、連通孔 35、小孔 34、貫通孔 56を介して、柱状支持部材 50の突起部 54の先端 54aに、細胞を吸着することがでさる。

[0086] このとき、図 9に示すように、細胞 80は、柱状支持部材 50のベース部 52から浮いた状態で、複数の部位が柱状支持部材 50の突起部 54で支持される。柱状支持部材 5 0の突起部 54が適宜な剛性を有するように構成し、突起部 54の先端の変位を、カメラ 58で撮影し、撮影画像を分析することによって、細胞 80の各部位の変位を計測する。あるいは、導電膜 37、外部端子 31を介して、細胞 80の支持部位を通る電流を計測する。例えば、細胞 80の周囲に一定濃度の試薬や分子などを瞬時に導入し、このときの細胞 80の応答 (細胞外濃度ジャンプ)を計測する。

[0087] 柱状支持部材 50と細胞クランプ装置 30とを組み合わせることによって、細胞 80の複数の部位を安定して支持することができる。また、柱状支持部材 50の突起部 54の先端 54に細胞を吸着することにより、細胞 80の支持部位がずれないように支持することができる。また、柱状支持部材 50の突起部 54のたわみによって、細胞 80に対する拘束が少なぐ細胞 80は高い自由度で動くことができる。したがって、細胞 80の各部位の状態を正確に計測することができる。

[0088] 以上に説明したように、細胞内物質導入装置は、細胞の大きさに関係なくエレクト口ポレーシヨンが行えるため、高効率の外来物質の導入が実現される。また、絶縁性薄膜の上に多数の小孔を配列することにより、大量の細胞に同時並列的に外来物質を導人することができる。

[0089] また、細胞クランプ装置は、細胞を多くの部位でクランプすることが可能である。

[0090] さらに、細胞クランプ装置を製作する流路の形成方法は、流路を効率よく形成することができる。この流路の形成方法は、細胞クランプ装置に限らず、種々の分野に広く適用することがでさる。

[0091] なお、本発明は、上記した実施の形態に限定されるものではなぐ種々変更を加えて実施することができる。

[0092] 例えば、光硬化性榭脂に、ネガレジストの代わりに、ポジレジストを用いてもょ、。この場合、遮光パターンは反転すればよい。遮光パターンは、導電膜以外でもよぐ流路形成後に除去するようにしてもょ、。

[0093] また、流路の形成を行うための遮光パターンを、一方の主面に光硬化性榭脂を塗布した透明な基板の他方の主面に形成し、遮光パターンを介して光硬化性榭脂〖こ異なる角度で光を照射してもよい。また、遮光パターンを有するマスク部材を、一方の主面に光硬化性榭脂を塗布した透明な基板の他方の主面に沿って配置し、マスク部材の遮光パターンを介して光硬化性榭脂に異なる角度で光を照射してもよい。いずれの場合も、照射した光が透過しない非透過領域は、遮光パターン力離れた状態で、遮光パターンに沿って延在する。

産業上の利用可能性

[0094] 本発明の細胞内物質導入装置及び細胞クランプ装置は、分子生物学をはじめ、生理学 ·再生医科学 ·医療 '創薬の分野の研究方法を一新するものであると同時に、ポイントォブケア一やテーラーメード医療をより簡便かつ低侵襲に行うことを可能にするデバイスである。また、本発明の流路の形成方法は、細胞クランプ装置、 TAS (To tal Analysis Systems)など、 MEMS技術を利用したマイクロデバイスやマイクロ構造物などの製作に用いることができる。

Claims

請求の範囲

[1] 小孔を有する絶縁性薄膜と、

前記小孔に対向して前記絶縁性薄膜の両側に配置された一対の電極とを備え、前記絶縁性薄膜に関して一方の領域において前記小孔に細胞を固定するとともに、前記絶縁性薄膜に関して他方の領域において前記小孔に連続する空間に前記細胞内に導入した、物質を含む流体を満たした状態で、前記一対の電極間にパルス電圧を印加することによって生ずる小孔部分への電界集中を利用して、前記細胞の細胞膜を破壊して前記細胞内に前記物質を導入することを特徴とする、細胞内物質導入装置。

[2] 前記絶縁性薄膜の厚さを d、誘電率を ε、前記一対の電極の間隔を L、流体の抵抗率を pとした時、系の時定数 τ = ε p LZdが 10ミリ秒以下となるように、前記絶縁性薄膜の厚さ d、前記誘電率 ε、前記一対の電極の間隔 L、前記流体の抵抗率 pが選ばれたことを特徴とする、請求項 2に記載の細胞内物質導入装置。

[3] 前記一対の電極のうち、前記絶縁性薄膜の細胞が存在する側に置かれた電極が、前記小孔より、前記小孔直径の 10倍以上離れた位置に置かれていることを特徴とする、請求項 1又は 2に記載の細胞内物質導入装置。

[4] 前記小孔の直径が、前記細胞の直径の 1Z3以下であることを特徴とする、請求項

1、 2又は 3に記載の細胞内物質導入装置。

[5] 前記一対の電極間に印加する前記パルス電圧が 10V以下であることを特徴とする

、請求項 1な!、し 4の、ずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。

[6] 前記絶縁性薄膜に関して前記他方の領域において、前記小孔に連続する前記空間力前記小孔の部分を除いて密閉されることを特徴とする、請求項 1ないし 5のいずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。

[7] 前記絶縁性薄膜の前記小孔周辺に、前記細胞に接着する表面修飾を施したことを特徴とする、請求項 1ないし 6のいずれか一つに記載の細胞内物質導入装置。

[8] 光硬化性榭脂からなる榭脂膜を備え、

該榭脂膜は、

該榭脂膜の一方の主面に形成された、細胞を固定するための開口と、該開口に連続する小孔と、

該小孔に連通する連通孔とを複数組有することを特徴とする、細胞クランプ装置。

[9] 前記榭脂膜を支持する基板を備え、

該基板に、前記開口に対向する前記小孔の底面力前記連通孔に沿って延在する導電膜が形成されたことを特徴とする、請求項 8に記載の細胞クランプ装置。

[10] 前記一方の主面に沿って配置されるベース部と、

前記ベースを介して前記開口に対向し、前記ベース部から前記開口とは反対側に突出する突起部と、

前記突起部の先端と前記開口との間を連通する貫通孔とを有する、柱状支持部材をさらに備えたことを特徴とする、請求項 8又は 9に記載の細胞クランプ装置。

[11] 透明な基板の少なくとも一方の主面に、光の透過を阻止する遮光パターンを形成する第 1のステップと、

前記基板の前記一方の主面又は他方の主面に光硬化性榭脂を塗布する第 2のステツプと、

前記基板に関して前記光硬化性榭脂とは反対側から、前記基板に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性榭脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性榭脂の前記光が透過した部分を硬化させる第 3のステップと、

前記前記光硬化性榭脂の前記非透過領域を除去する第 4のステップとを備え、前記第 1のステップにおいて、前記遮光パターンは、細長い第 1部分と、該第 1部分に連続しかつ該第 1部分の延在方向に対して略直角方向に広がった第 2部分との少なくとも一方を含み、

前記第 3のステップにおいて、前記非透過領域は、前記遮光パターンの前記第 1部分に対応する第 1領域と、前記遮光パターンの前記第 2部分に対応する第 2領域との少なくとも一方を含み、

前記第 1領域は、前記光硬化性榭脂内の前記基板側に延在し、

前記第 2領域は、前記光硬化性榭脂内の前記基板側から前記光硬化性榭脂の前記基板とは反対側の主面まで延在し、前記第 4のステップにお!/、て、

前記非透過領域の前記第 1領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、

前記非透過領域の前記第 2領域を除去して、前記前記光硬化性榭脂の前記基板とは反対側の前記主面に開口を有する縦孔を形成することを特徴とする、流路の形成方法。

[12] 前記第 1のステップにおいて、前記基板の一方の主面に、導電材料を用いて前記遮光パターンを形成し、

前記第 2のステップにお、て、前記基板の前記一方の主面に前記光硬化性榭脂を塗布することを特徴とする、請求項 11に記載の流路の形成方法。

[13] 透明な基板の一方の主面に光硬化性榭脂を塗布する第 1のステップと、

前記基板の他方の主面に沿って、遮光パターンを有するマスク部材を配置する第 2のステップと、

前記マスク部材側から、前記マスク部材に対して異なる角度で光を照射し、前記光硬化性榭脂内において、前記遮光パターンに沿って延在する非透過領域以外の領域を前記光が透過するようにして、前記光硬化性榭脂の前記光が透過した部分を硬化させる第 3のステップと、

前記第 2領域は、前記光硬化性榭脂内の前記基板側から前記光硬化性榭脂の前記基板とは反対側の主面まで延在し、

前記第 4のステップにお!/、て、前記非透過領域の前記第 1領域を除去して、前記基板に沿って延在する横孔を形成し、