WO2006097549A1 - Método de análisis para la identificación de especies de perdiz y detección de hibridos del género alectoris basado en el análisis de adn - Google Patents

Método de análisis para la identificación de especies de perdiz y detección de hibridos del género alectoris basado en el análisis de adn Download PDF

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WO2006097549A1
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rufa
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María Victoria ARRUGA LAVIÑA
Cristina Belén GARCÍA GARCÍA
Luis Vicente MONTEAGUDO IBÁÑEZ
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Universidad De Zaragoza
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to the identification of different species of the Alectoris genus and the detection of hybrids based on DNA analysis. More specifically, the invention is a method of identifying the species and detecting hybrids of said genus, by the use of single nucleotide polymorphisms or SNPs' s (Single Nucleotide Polymorphism) and RAPD patterns.
  • SNPs' s Single Nucleotide Polymorphism
  • the red partridge (Alectoris rufa) is the only Spanish native partridge, apart from redoubts of the moruna partridge ⁇ Alectoris barbara) in the south of the country.
  • red partridge when it is crossed with partridges of another species, hybrids are obtained that are easily identifiable by their external morphology.
  • the amplified DNA for example by means of the polymerase or PCR chain reaction (Mull ⁇ s and Faloona, 1987. Meth Enzymol 155: 335-350) can be used to generate patterns of DNA bands by electrophoresis in agarose or polyacrylamide gels. These band patterns are used to characterize or differentiate organisms using different primers or primers, designed based on different regions of the DNA.
  • the primers used originate band patterns that are different for each species. These primers are used in techniques based on repeated DNA sequences, which are generically called rep-PCR and in techniques based on random amplification of DNA that are called RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).
  • RAPD Random Amplified Polymorphic DNA
  • RAPD analysis for detection and eradication of hybrid partridges (Alectoris rufa x A graeca) in Spain.
  • Biological Conservation 98: 19-24) both develop a method based on a RAPD type analysis, from the analysis of a small number of supposedly pure partridge specimens, for the identification of A. rufa, A. graeca and their hybrids , which lacks reliability, since, by providing a single test, a single marker, its results cannot be conclusive, so it could be used as a complementary but not defining identification method and in the case of Cortés et al .
  • the study is also carried out with a single test, but also in a "pool" or group of animals, which does not allow to identify if a single specimen belongs, or not, to the desired species or if it is a hybrid.
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • the validation is the critical phase of the methods of identification and differentiation of species through SNPs, since in most cases the SNPs, which are not always going to be used to identify and differentiate species.
  • these methods consist of PCR amplification of the DNA fragment or fragments (amplicon) containing the SNP and an identification by sequencing, SSCP (Secondary Structural Conteni Prediction), restriction of the amplicon, in the event that the polymorphism changes Ia recognition sequence of some restriction enzyme or allelic discrimination by means of the methodology of RT-PCR (Real Time-PCR).
  • the present invention is the result of the search for new polymorphisms and RAPD patterns, which would allow the identification of Alectoris species, as well as their hybrids.
  • SNP ' s new nucleotide change polymorphisms
  • an initiator or primer that allows the obtaining of RADP patterns, which allow the aforementioned identification have been found.
  • This invention provides a method, compounds and analysis kits for the identification and differentiation of A. rufa specimens, of other species of the Alectoris genus, as well as of the hybrids obtained from their crossing with A. graeca or A. chukar by analyzing Nuclear and mitochondrial DNA.
  • a first aspect of the present invention provides an analysis method for the identification and differentiation of different species of the Alector ⁇ s genus, as well as hybrid partridges of the A. rufa species, whose maternal parental does not belong to said species, which comprises detecting in a sample biological (tissue or fluid), from a single specimen, the presence of a base change polymorphism (SNP1), Thymine by Cytosine, in position -234 of SEQ ID NO: 1, located in the mitochondrial cytochrome b gene .
  • SNP1 base change polymorphism
  • the method of analysis involves examining a partridge specimen, correlating it with the presence or absence of the polymorphism (that is, the presence or absence of the most frequent allele).
  • Said analysis uses the polymerase chain reaction (PCR, "polymerase chain reacction"), the single chain conformational polymorphism (SSCP) test, or other type of analysis that allow the identification of polymorphism.
  • PCR polymerase chain reaction
  • SSCP single chain conformational polymorphism
  • the method of analysis also includes the use of indicator means that react in the presence of one of the polymorphisms.
  • the initiator means typically induces a detectable signal to be produced in the presence of the polymorphism, and can induce a color change or a coagulation or a restriction site, detectable by additional analytical steps.
  • the initiating means also, can comprise an antibody that has binding affinity that distinguishes between the wild sequence and the polymorphism.
  • the method of analysis comprises detecting the presence of a base change polymorphism, Thymine for Cytosine, in
  • the position -234 of the mitochondrial cytochrome b gene is carried out using primers ("first") of
  • PCR which amplify a segment of DNA that contains the nucleotide in position -234 of the mitochondrial cytochrome b gene.
  • a pair of PCR primers with the SEQ sequences is used.
  • the method of analysis comprises a pair of PCR primers, which amplify a segment of mitochondrial DNA of the cytochrome b gene, where the segment of amplified DNA is approximately 800 bp in length, preferably up to 600 bp and more preferably up to 506 bp
  • the PCR primers would be those corresponding to SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • a second aspect of the invention provides another step to the method of analysis, which comprises the detection of a fragment of a DNA between 1000 and 1100 bp in RAPD type patterns obtained through the use of a primer.
  • a PCR primer with the sequence SEQ ID NO: 4 or derived analogs is used. In this way, and given the presence or absence of the aforementioned fragment or band diagnosed in the RAPD pattern can be determined if a specimen of red partridge is pure or hybrid (A. rufa-A, graeca and A. rufa-A, chukar)
  • This other step of the method of analysis also includes the joint detection of the diagnostic band, described above, and a second band (560 bp) in RAPD-like patterns obtained by using a primer.
  • a PCR primer with the sequence SEQ ID NO: 4 or derived analogs is used.
  • the presence of said pair of bands is indicative that the sample comes from a pure example of Greek partridge.
  • the separation and visualization of the fragments or bands that make up the RAPD patterns can be carried out by methods well known in the state of the art, although in a preferred embodiment, the amplification products are separated by underwater electrophoresis standard in agarose gel or, in general, in any matrix to which an electric current that allows the separation of molecules can be applied, and are visualized by ultraviolet light (W) after staining with ethidium bromide
  • a third aspect of the invention provides another step to the method of analysis for the identification and differentiation of hybrid partridges, which comprises detecting in a biological sample (tissue or fluid), from a single specimen, the presence of a second polymorphism (SNP2 ) base change, thymine for cytosine, in position -526 of intron 1 of the rhodopsin gene (RDP1) that corresponds to position -49 of the sequence, SEQ ID NO: 5, accessible in the database Genbank with access code AF394641. In said sequence (AF394641), SNP2 is in position 533.
  • SNP2 second polymorphism
  • the method of analysis involves examining a partridge specimen correlating it with the presence or absence of the polymorphism (that is, the presence or absence of the most frequent allele).
  • Said analysis can use the polymerase chain reaction (PCR, "polymerase chain reacction "), the single chain conformational polymorphism (SSCP) test, or other type of analysis that allows the identification of the polymorphism.
  • PCR polymerase chain reaction
  • SSCP single chain conformational polymorphism
  • this third aspect of the invention also provides a test to determine if a sample belongs to a pure specimen of A. chukar.
  • the method of analysis comprises detecting the presence of a base change polymorphism (SNP2), thymine by
  • Cytosine in position -526 of intron 1 of the rhodopsin gene.
  • the detection is carried out using primers
  • first of PCR which amplify a DNA fragment, which contains the nucleotide in position -526 of intron 1 of the rhodopsin gene.
  • a pair of PCR primers with the sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 is used.
  • the analysis method comprises a pair of PCR primers, which amplify a DNA segment of the rhodopsin gene, where the amplified DNA segment is approximately 800 bp in length, preferably up to 600 bp and more preferably up to 441 bp.
  • the PCR primers would be those corresponding to SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • the invention also provides diagnostic kits for the analysis and detection of pure and hybrid partridges of the A. rufa species, comprising diagnostic means according to the first, second and third aspects of the invention, optionally in a package.
  • the analysis kit comprises a transport means such as a compartmentalized box that accommodates the means of analyzing according to the invention, optionally within a container such as a vial, a tube, a vial or something similar.
  • Figure 1 shows a 1% agarose gel in which: streets C correspond to the streets in which a sample of DNA from pure specimens A. chukar was loaded and streets H correspond to streets in which a sample was loaded DNA from hybrids of A. rufa, whose maternal parent belongs to the species A. chukar. In both, the presence of two bands (271 and 235 bp) from the digestion of DNA can be seen; the rest of the streets correspond to samples from pure specimens of A. rufa or partridge hybrids whose maternal parent belongs to the species A. rufa, with a band of 506 bp.
  • Figure 2 shows a 2% agarose gel where: streets C correspond to streets in which a sample of DNA from pure specimens A. chukar was loaded and streets H correspond to streets in which a sample was loaded of DNA from hybrids of
  • A. lucia whose maternal parent belongs to the species A. chukar. In both, the presence of two bands (271 and 235 bp) from the digestion of DNA can be seen; the rest of the streets correspond to samples from pure specimens of A. rufa or partridge hybrids whose maternal parent belongs to the species A. rufa, with a band of 506 bp.
  • Figure 3 shows an agarose gel in which the streets C correspond to streets in which a sample of DNA from pure copies of A. chukar was loaded, the streets with the letter H correspond to streets in which a sample was loaded DNA from hybrid partridges (A. rufa-A, chukar), in both streets you can see the presence of a diagnostic band (1000-1100 bp), indicated with an arrow, which allows identification;
  • the streets with the letter R correspond to streets in which a sample from pure specimens of A. rufa was loaded.
  • the street with the letter M corresponds to the street with molecular weight marker.
  • Figure 4 shows an agarose gel in which the streets H correspond to streets in which a sample of DNA from hybrid partridges (A rufa-A, chukar) was loaded; G streets correspond to streets in which a sample of DNA from pure copies of A. chukar was loaded, in both streets you can see the presence of a diagnostic band of 1000 to 1100 bp (arrows c) and also in the streets G shows a second diagnostic band of 500 to 600 bp (arrows a); R streets correspond to streets where a sample from pure specimens of A. rufa was loaded.
  • the street with the letter M corresponds to the street with molecular weight marker.
  • Figure 5 shows an agarose gel in which: the streets with the letter C correspond to the streets in which a sample of DNA from pure A. chukar specimens was loaded, the streets with the letter H correspond to streets in which loaded a sample of DNA from hybrids of A. rufa, in both streets you can see the presence of two bands (354 and 87 bp) from the digestion of DNA; the rest of the streets correspond to samples from pure specimens of A. rufa (441 bp).
  • Figure 6 shows an agarose gel where: the streets with the letter C correspond to streets in which a sample of DNA from pure specimens A. chukar was loaded, the streets with the letter H correspond to streets in which loaded a sample of DNA from hybrids of A. rufa, in both streets you can see the presence of two bands (354 and 87 bp) from the digestion of DNA; the rest of the streets correspond to samples from pure specimens of A. rufa (band of 441 bp).
  • SNP1 SNP1
  • SNP1 was different in the A. chukar, A. graeca species, and also different for the Alectoris rufa species.
  • Extractions of DNA from the specimens to be analyzed were performed from blood in EDTA tubes, blood samples deposited on FTA® cards, pens or any other biological tissue, following the following blood extraction protocol: 1) Put in an Eppendorf tube (1.5 milliliters) 50 microliters of blood and 1.3 milliliters of sterile double-distilled water.
  • the PCR for the amplification of the DNA from the samples was performed using 50 to 100 nanograms of DNA, a pair of primers with the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 respectively, together with the reagents necessary for the realization of it.
  • the conditions of the PCR were the following: preheating at 94 ° C for 3 minutes; 35 cycles of denaturation at 94 ° C for 30 seconds; hybridization at 60 0 C for 1 minute; and elongation at 72 ° C for 30 seconds.
  • the PCR products were stored at 4 ° C and -2O 0 C in the event that the next step of the analysis was to be delayed more than two hours.
  • PCR product 8.5 microliters of PCR product were subjected to the enzymatic action of the BsaAl restriction enzyme (0.5 microliters of enzyme and 1 microliter of Buffer 10X recommended by the manufacturer), or any of its isosquizers, capable of recognizing The presence of the candidate SNP that had been detected at the beginning of the present example. Digestion was carried out at 37 ° C for 4 hours in a water bath.
  • an underwater standard electrophoresis was carried out, with the products of said digestion, in agarose gel at a concentration of 1% in TBExI (tris, boric acid, EDTA), at a voltage of 40 volts for 10 minutes and 100 volts for 30 minutes, and stained with ethidium bromide at a concentration of 0.5 micrograms per milliliter of TBE1X. Restriction patterns were visualized and photographed when, after electrophoresis, the agarose gel was subjected to ultraviolet light through a transluminator.
  • TBExI tris, boric acid, EDTA
  • a restriction pattern with a single band was obtained, corresponding to the amplified DNA fragment (506 base pairs), which had not been cut by the restriction enzyme, in the case of hybrid A. rufa specimens, whose parental maternal belonged to the species A. rufa, and of pure A. rufa specimens.
  • a second restriction pattern was obtained with two bands of 271 and 235 base pairs respectively ( Figures 1 and 2, lanes H and C), which corresponded to the two DNA fragments, originating from the digestion carried out by The restriction enzyme, in the case of hybrid specimens whose maternal parental did not belong to the A. rufa species, as well as for specimens belonging to other species of the Alector ⁇ s genus in purity
  • This first step of the method of identification and differentiation provides, according to the results obtained, two restriction patterns, which allow the identification of those hybrid specimens, whose maternal parent does not belong to the species A. rufa.
  • DNA extractions were obtained from the partridge specimens, which in the first stage of the identification and differentiation method had been identified as individuals belonging to the A. rufa species from samples following the same extraction protocol as in the first stage of the method.
  • the PCR for the amplification of the DNA, from the samples, was performed using 2.5 microliters of DNA, a single primer with the sequence SEQ ID NO: 4 or derived analogues, together with all those reagents necessary for the realization thereof.
  • the PCR conditions were the following: preheating at 94 ° C for 4 minutes; 45 cycles of denaturation at 94 ° C for 1 minute; hybridization at 36 ° C for 1 minute; elongation at 72 ° C for 2 minutes; and a final elongation at 72 0 C for 10 minutes.
  • the PCR products were stored at 4 ° C and at -20 0 C in the event that the next step of the analysis was to be delayed more than two hours.
  • This second step of the method of identification and differentiation provides, according to the results obtained, a series of RAPD patterns, which allow the differentiation of pure A. rufa specimens from A. rufa hybrids, which had not been possible to identify by means of First step of the identification method and other species of the Alectoris genus.
  • the presence of the aforementioned diagnostic band of 1000 to 1100 bp in the RAPD patterns, obtained through the use of a single initiator, provided by the present invention, or derived analogs, is indicative that the sample tested comes from a hybrid specimen of red partridge (A. rufa-A, graeca or A. rufa-A.chukar).
  • the joint presence of said diagnostic band together with a second band between 500 and 600 pb is indicative that the sample comes from a pure specimen of A. graeca ( Figure 4, arrows (a))
  • This test was carried out in order to obtain restriction patterns that allowed the identification of the A. rufa hybrid specimens, obtained from their crosses with specimens belonging to the A. chukar or A. graeca species, in such a way that a third test, which corroborates the results obtained in the second step of the method of identification of the present invention.
  • SNP2 SNP2
  • the comparison of gene sequences obtained by direct sequencing of PCR products and their analysis by means of the BIOEDIT program led to the detection of a possible candidate SNP (SNP2), present in the chromosomal DNA, more specifically in the RDP1 gene or gene of Rhodopsin
  • SNP2 is different in the A. rufa hybrid specimens mentioned with respect to the pure A. rufa specimens.
  • DNA extractions were made from the specimens to be analyzed from biological samples following the same protocol used in the two previous stages of the identification method.
  • the PCR for the amplification of the DNA, from the sample was performed using 1.6 microliters of DNA, a pair of primers with the sequences SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7 respectively, together with the reagents necessary for the realization of The same.
  • the conditions of the PCR were the following: preheating at 94 ° C for 4 minutes and 30 seconds; 35 cycles of denaturation at 94 0 C for 30 seconds; hybridization at 64 ° C for 45 seconds; and elongation at 72 0 C for 1 minute; to finish with one last step at 72 ° for 7 min.
  • the PCR products were stored at 4 0 C and at -20 0 C in the event that the next step of the analysis was to be delayed more than two hours.
  • PCR product 8 microliters of PCR product were subjected to the enzymatic action of the Apal restriction enzyme (0.5 microliters of enzyme, 0.5 microliters of sterile double-distilled water and 1 microliter of Buffer I recommended by the manufacturer), or some of its ischysomers, capable of recognizing the presence of the candidate SNP2, which had been detected at the beginning of the present example. Digestion was carried out at 37 ° C for 4 hours in a water bath.
  • Apal restriction enzyme 0.5 microliters of enzyme, 0.5 microliters of sterile double-distilled water and 1 microliter of Buffer I recommended by the manufacturer
  • a standard underwater electrophoresis was carried out, with the products of said digestion, in agarose gel at a concentration of 1.5 percent in TBExI (tris, boric acid, EDTA), at a voltage of 40 volts for 10 minutes and 100 volts for 30 minutes, and stained with ethidium bromide at a concentration of 0.5 micrograms per milliliter of TBE1X.
  • the restriction patterns were visualized and photographed when after the electrophoresis the agarose gel was subjected to ultraviolet light through a transluminator.
  • This third step of the method of identification and differentiation provides, according to the results obtained, two restriction patterns that allow: a) to identify those hybrid specimens of A. rufa, which had not been detected by performing the previous two steps of the method of identification presented in the present embodiment; b) corroborate or ratify the purity of the A. rufa specimens, which would have been detected as such by performing the two previous steps of the identification method presented in the present embodiment.

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Abstract

Método de análisis para la identificación de distintas especies del género Alectoris y sus híbridos basado en el análisis de ADN. El mencionado análisis se realiza empleando (i)dos polimorfismos, situados en la posición -234 del gen mitocondrial citocromo b y en la posición -526 del intrón 1 del gen de la rodopsina respectivamente, y (¡i) mediante el estudio de patrones tipo RAPD. Además la presente invención también aporta un kit de diagnóstico para la realización del mencionado análisis, junto con los iniciadores o primers necesarios.

Description

Método de análisis para Ia identificación de especies de perdiz y detección de híbridos del género Alectoris basado en el análisis de ADN
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a Ia identificación de distintas especies del género Alectoris y Ia detección de híbridos basada en el análisis de ADN. Más concretamente, Ia invención consiste en un método de identificación de las especies y detección de híbridos del citado género, mediante el empleo de polimorfismos de un solo nucleótido o SNP 's (Single Nucleotide polymorphism) y patrones RAPD.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En Ia actualidad son conocidas siete especies de perdiz diferentes que conforman el género Alectorís. La perdiz roja (Alectoris rufa) es Ia única perdiz autóctona española, aparte de reductos de Ia perdiz moruna {Alectoris barbara) en el sur del país.
En el caso de Ia perdiz roja, cuando ésta es cruzada con perdices de otra especie se obtienen híbridos que son fácilmente identificables por su morfología externa. El problema surge, cuando tras Ia realización de cruces sucesivos de un ejemplar híbrido de perdiz roja con un ejemplar puro de perdiz roja, las características morfológicas externas del híbrido terminan diluyéndose, de tal forma, que finalmente se obtiene una perdiz roja híbrida que es indistinguible a simple vista de una perdiz roja pura.
Esta circunstancia de dilución de las características morfológicas externas se manifiesta especialmente problemática en híbridos obtenidos del cruce de A. rufa con A. graeca y A. rufa con A. chukar, ya que el resto de híbridos muestra características en el plumaje, que los hacen fácilmente identificables a simple vista, aun cuando se realizan sucesivos cruces con ejemplares puros de A. rufa. La Ley 4/1989, de 27 de marzo, de Conservación de los Espacios Naturales y de Ia Flora y Ia Fauna Silvestre, prohibe Ia suelta de ejemplares de especies foráneas y de sus híbridos en territorio español. Es por Io tanto de interés productivo y ecológico, el desarrollo de sistemas que permitan Ia diferenciación, de un modo general, de especies autóctonas respecto de especies foráneas y sus híbridos y, en especial, de Ia especie autóctona Alectorís rufa respecto del resto de especies del género Alectoris (A. amblan, A. melanocephala, A. chukar, A. magna, A. graeca, A. philbyi y A. barbara) y los híbridos de A. rufa.
Se han desarrollado diversos métodos para Ia diferenciación de especies del género Alectorís (Randi et al. 1992. The Auk 111 (2): 416-426), basados en análisis proteicos.
Los estudios de material genético son otra de las alternativas que se vienen utilizando muy habitualmente en los últimos años. El ADN amplificado, por ejemplo mediante Ia reacción en cadena de Ia polimerasa o PCR (Mullís and Faloona, 1987. Meth Enzymol 155: 335-350) puede utilizarse para generar patrones de bandas de ADN mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida. Estos patrones de bandas se emplean para caracterizar o diferenciar organismos utilizando diferentes iniciadores o cebadores (primers), diseñados basándose en diferentes regiones del ADN.
Habitualmente, los iniciadores utilizados originan patrones de bandas que son diferentes para cada especie. Estos iniciadores se utilizan en técnicas basadas en secuencias repetidas de ADN, que se denominan genéricamente rep-PCR y en técnicas basadas en Ia amplificación al azar del ADN que se denominan RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). (Cortes et al., 2001 , Cortés, O.; Cañón, J y Dunner, S. 2001. Utilización de "pools" de ADN y RAPD para identificar diferencias genómicas entre Ia Perdiz Roja (Alectorís rufa) y Perdiz Griega (Alectoris graeca). III Congreso de Ia Sociedad Española de Genética. Sevilla 2001.pag.89. Negro et al. (Negro, JJ. , MJ. Torres & J.A. Godoy 2001. RAPD analysis for detection and eradication of hybrid partridges (Alectoris rufa x A. graeca) in Spain. Biological Conservation 98: 19-24) ambos desarrollan un método fundamentado en un análisis tipo RAPD, a partir del análisis de un reducido número de ejemplares de perdiz supuestamente puros, para Ia identificación de las especies A. rufa, A. graeca y sus híbridos, el cual carece de fiabilidad, ya que, al aportar una única prueba, un único marcador, sus resultados no pueden ser concluyentes, por Io que podría ser utilizado como un método de identificación complementario pero no definitorio y en el caso de Cortés et al. además el estudio se realiza igualmente con una sola prueba, pero además en un "pool" o conjunto de animales, Io cual no permite identificar si un único ejemplar pertenece, o no, a Ia especie deseada o si se trata de un híbrido.
Otra de las técnicas basada en análisis de ADN, utilizada en estudios poblacionales, consiste en el estudio de polimorfismos en un único nucleótido, más conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphism), los cuales son mutaciones estables de gran utilidad como marcadores genéticos. Su identificación puede realizarse mediante Ia amplificación por PCR de fragmentos de genes conocidos, secuenciación y comparación de secuencias o mediante el empleo de herramientas informáticas, que permiten identificar un gran número de SNPs candidatos, que posteriormente deben validarse mediante secuenciación e identificación en muestras de población (Buetow et al., 1999).
La validación es Ia fase crítica de los métodos de identificación y diferenciación de especies mediante SNPs, ya que en Ia mayoría de los casos los SNPs, que se encuentran no siempre van a servir para identificar y diferenciar especies.
Una vez se ha validado el SNP es necesario poner a punto un método para su detección rápida y fiable. Generalmente, estos métodos consisten en amplificación por PCR del fragmento o fragmentos de ADN (amplicón) que contienen el SNP y una identificación por secuenciación, SSCP (del inglés Secondary Structural Contení Prediction), restricción del amplicón, en el caso de que el polimorfismo cambie Ia secuencia de reconocimiento de algún enzima de restricción o por discriminación alélica mediante Ia metodología de Ia RT-PCR (Real Time-PCR).
Existe, a tenor de Io comentado, Ia necesidad de desarrollar un método fiable para Ia detección e identificación de perdices híbridas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención es el resultado de Ia búsqueda de nuevos polimorfismos y patrones RAPD, que permitiesen Ia identificación de las especies del género Alectorís, así como de sus híbridos. De este modo, se han encontrado dos nuevos polimorfismos de cambio de nucleótido (SNP's) y un iniciador o primer que permite Ia obtención de patrones RADP, que posibilitan Ia citada identificación.
Esta invención proporciona un método, compuestos y kits de análisis para Ia identificación y diferenciación de ejemplares A. rufa, de otras especies del género Alectorís, así como de los híbridos obtenidos de su cruce con A. graeca o A. chukar mediante el análisis de ADN nuclear y mitocondrial.
Un primer aspecto de Ia presente invención proporciona un método de análisis para Ia identificación y diferenciación de distintas especies del género Alectorís, así como perdices híbridas de Ia especie A. rufa, cuyo parental materno no pertenece a dicha especie, que comprende detectar en una muestra biológica (tejido o fluido), proveniente de un único ejemplar, Ia presencia de un polimorfismo de cambio de base (SNP1 ), Timina por Citosina, en Ia posición -234 de Ia SEQ ID NO:1 , localizada en el gen citocromo b mitocondrial.
En particular, el método de análisis implica el examen de un ejemplar de perdiz, correlacionándolo con Ia presencia o ausencia del polimorfismo (es decir, Ia presencia o ausencia del alelo más frecuente). Dicho análisis utiliza Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR, "polymerase chain reacction"), el ensayo de polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP, "single strand conformational polymorphisim"), u otro tipo de análisis que permitan Ia identificación del polimorfismo. De este modo, y dado el SNP anteriormente indicado, se puede determinar si un ejemplar de perdiz roja es híbrido o no.
El método de análisis comprende, además, el uso de medios indicadores que reaccionan en presencia de uno de los polimorfismos. Los medios iniciadores inducen, típicamente, que se produzca una señal detectable en presencia del polimorfismo, y pueden inducir un cambio de color o una coagulación o un sitio de restricción, detectables por pasos analíticos adicionales. Los medios iniciadores, también, pueden comprender un anticuerpo que tenga afinidad de unión que distinga entre Ia secuencia silvestre y el polimorfismo.
En una realización el método de análisis comprende el detectar Ia presencia de un polimorfismo de cambio de base, Timina por Citosina, en
Ia posición -234 del gen citocromo b mitocondrial. En una realización preferida, esta detección se lleva a cabo usando cebadores ("primer") de
PCR, que amplifican un segmento de ADN que contiene el nucleótido en Ia posición -234 del gen citocromo b mitocondrial. En una realización más preferida se utiliza un par de cebadores de PCR con las secuencias SEQ
ID NO:2 y SEQ ID NO:3.
En otra realización, el método de análisis comprende un par de cebadores de PCR, que amplifican un segmento de ADN mitocondrial del gen citocromo b, donde el segmento de ADN amplificado es de aproximadamente 800 pb de longitud, preferentemente hasta 600 pb y más preferentemente hasta 506 pb. En una realización preferida de esta realización, los cebadores de PCR serían los correspondientes a SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.
Un segundo aspecto de Ia invención aporta otro paso al método de análisis, que comprende Ia detección de un fragmento de un ADN de entre 1000 y 1100 pb en patrones tipo RAPD obtenidos mediante el uso de un cebador. En una realización preferida se utiliza un cebador de PCR con Ia secuencia SEC ID NO:4 o análogos derivados. De este modo, y dada Ia presencia o ausencia del citado fragmento o banda diagnostica en el patrón RAPD se puede determinar si un ejemplar de perdiz roja es puro o híbrido (A. rufa-A, graeca y A. rufa-A, chukar)
Éste otro paso del método de análisis también comprende Ia detección conjunta de Ia banda diagnostica, anteriormente descrita, y una segunda banda (560pb) en patrones tipo RAPD obtenidos mediante el uso de un cebador. En una realización preferida se utiliza un cebador de PCR con Ia secuencia SEC ID NO:4 o análogos derivados. De este modo, Ia presencia del citado par de bandas es indicativa de que Ia muestra procede de un ejemplar puro de perdiz griega.
En una realización particular, Ia separación y visualización, de los fragmentos o bandas que conforman los patrones RAPD, puede realizarse por métodos sobradamente conocidos en el estado de Ia técnica, aunque en una realización preferida, los productos de Ia amplificación se separan mediante electroforesis submarina estándar en gel de agarosa o, en general, en cualquier matriz a Ia que pueda aplicarse una corriente eléctrica que permita Ia separación de moléculas, y se visualizan mediante luz ultravioleta (W) tras tinción con bromuro de etidio
Un tercer aspecto de Ia invención aporta un otro paso al método de análisis para Ia identificación y diferenciación de perdices híbridas, que comprende detectar en una muestra biológica (tejido o fluido), proveniente de un único ejemplar, Ia presencia de un segundo polimorfismo (SNP2) de cambio de base, Timina por Citosina, en Ia posición -526 del intrón 1 del gen de Ia rodopsina (RDP1 ) que se corresponde con Ia posición -49 de Ia secuencia, SEQ ID NO:5, accesible en Ia base de datos Genbank con clave de acceso AF394641. En dicha secuencia (AF394641), el SNP2 se encuentra en Ia posición 533.
En particular, el método de análisis implica el examen de un ejemplar de perdiz correlacionándolo con Ia presencia o ausencia del polimorfismo (es decir, Ia presencia o ausencia del alelo más frecuente). Dicho análisis puede utilizar Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR, "polymerase chain reacction"), el ensayo de polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP, "single strand conformational polymorphisim"), u otro tipo de análisis que permitan Ia identificación del polimorfismo. De este modo, y dado el SNP2, se puede determinar si un ejemplar de perdiz roja es híbrido o puro. Adicionalmente, este tercer aspecto de Ia invención aporta también una prueba para determinar si una muestra pertenece a un ejemplar puro de A. chukar.
En una realización, el método de análisis comprende el detectar Ia presencia de un polimorfismo de cambio de base (SNP2), Timina por
Citosina, en Ia posición -526 del intrón 1 del gen rodopsina. En una realización preferida, Ia detección se lleva a cabo usando cebadores
("primer") de PCR, que amplifican un fragmento de ADN, que contiene el nucleótido en Ia posición -526 del intrón 1 del gen de Ia rodopsina. En una realización más preferida se utiliza un par de cebadores de PCR con las secuencias SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7.
En otra realización, el método de análisis comprende un par de cebadores de PCR, que amplifican un segmento de ADN del gen de Ia rodopsina, donde el segmento de ADN amplificado es de aproximadamente 800 pb de longitud, preferentemente hasta 600 pb y más preferentemente hasta 441 pb. En una realización preferida de esta realización, los cebadores de PCR serían los correspondientes a SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7.
La invención también proporciona kits de diagnostico para el análisis y detección de perdices puras e híbridas de Ia especie A. rufa, comprende medios de diagnostico según el primero, segundo y tercero aspecto de Ia invención, opcionalmente en un envase. En una realización particular, el kit de análisis comprende un medio de trasporte tal como una caja compartimentada que acomoda los medios de analizar según Ia invención, opcionalmente dentro de un envase tal como un vial, un tubo, una ampolla o algo similar.
A Io largo de toda Ia descripción y reivindicaciones de Ia especificación, Ia palabra "comprende" y las variaciones de Ia misma, tal como "comprendiendo", no pretende excluir otros aditivos, componentes, integrantes o etapas. Tanto el ejemplo de realización, como los dibujos que acompañan no pretenden ser limitantes de Ia invención, sino que deben ser tomados como un apoyo para Ia mejor compresión de ésta.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra un gel de agarosa al 1 % en donde: las calles C corresponden las calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de ejemplares puros A. chukar y las calles H corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de híbridos de A. rufa, cuyo parental materno pertenece a Ia especie A. chukar. En ambas se puede apreciar Ia presencia de dos bandas (271 y 235 pb) provenientes de Ia digestión del ADN; el resto de calles corresponden a muestras provenientes de ejemplares puros de A. rufa o híbridos de perdiz cuyo parental materno pertenece a Ia especie A. rufa, con una banda de 506 pb.
La Figura 2 muestra un gel de agarosa al 2% en donde: las calles C corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de ejemplares puros A. chukar y las calles H corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de híbridos de
A. rufa, cuyo parental materno pertenece a Ia especie A. chukar. En ambas se puede apreciar Ia presencia de dos bandas (271 y 235 pb) provenientes de Ia digestión del ADN; el resto de calles corresponden a muestras provenientes de ejemplares puros de A. rufa o híbridos de perdiz cuyo parental materno pertenece a Ia especie A. rufa, con una banda de 506 pb.
La Figura 3 muestra un gel de agarosa en donde las calles C corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de ejemplares puros de A. chukar, las calles con Ia letra H corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de perdices híbridas (A. rufa-A, chukar), en ambas calles se puede apreciar Ia presencia de una banda diagnostica (1000-1100 pb) , indicada con una flecha, que permite su identificación; las calles con Ia letra R corresponden a calles en las que se cargó una muestra proveniente de ejemplares puros de A. rufa. La calle con Ia letra M corresponde a Ia calle con marcador de peso molecular.
La Figura 4 muestra un gel de agarosa en donde las calles H corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de perdices híbridas (A rufa-A, chukar); las calles G corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de ejemplares puros de A. chukar, en ambas calles se puede apreciar Ia presencia de una banda diagnostica de 1000 a 1100 pb (flechas c) y además en las calles G se aprecia una segunda banda diagnostica de 500 a 600 pb (flechas a); las calles R corresponden a calles en las que se cargó una muestra proveniente de ejemplares puros de A. rufa. La calle con Ia letra M corresponde a Ia calle con marcador de peso molecular.
La Figura 5 muestra un gel de agarosa en donde: las calles con Ia letra C corresponden las calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de ejemplares puros A. chukar, las calles con Ia letra H corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de híbridos de A. rufa, en ambas calles se puede apreciar Ia presencia de dos bandas (354 y 87 pb) provenientes de Ia digestión del ADN; el resto de calles corresponden a muestras provenientes de ejemplares puros de A. rufa (441 pb).
La Figura 6 muestra un gel de agarosa en donde: las calles con Ia letra C corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de ejemplares puros A. chukar, las calles con Ia letra H corresponden a calles en las que se cargó una muestra de ADN proveniente de híbridos de A. rufa, en ambas calles se puede apreciar Ia presencia de dos bandas (354 y 87 pb) provenientes de Ia digestión del ADN; el resto de calles corresponden a muestras provenientes de ejemplares puros de A. rufa (banda de 441 pb). EJEMPLO DE REALIZACIÓN
El siguiente ensayo experimental ilustra Ia invención realizada y pone de manifiesto Ia especificidad y efectividad del método.
1. Obtención de patrones de restricción específicos que permitan Ia diferenciación de ejemplares puros e híbridos de A. rufa y de otras especies del género Alectoris.
Se realizó este ensayo con el fin de obtener patrones de restricción que permitiesen Ia identificación de ejemplares de A. rufa puros e híbridos.
1.1 Búsqueda de SNPs candidatos que permitiesen Ia identificación de distintas especies del género Alectoris, de A. rufa y sus híbridos.
La Comparación de secuencias de genes obtenidas a partir bases de datos publicas (GenBank Datábase) y su análisis mediante el programa BIOEDIT, llevó a Ia detección de un posible SNP candidato (SNP1 ), presente en el ADN mitocondrial, más concretamente en el gen del Citocromo B. El citado SNP1 era diferente en las especies A. chukar, A. graeca, y asimismo diferente para Ia especie Alectoris rufa.
1.2. Validación del SNP.
Se ensayaron diferentes híbridos de A. rufa-A, chukar, que se compararon con ejemplares puros de A. rufa y otras especies del género Alectoris.
1.3. Método
Se realizaron extracciones de ADN procedente de los ejemplares a analizar a partir de sangre en tubos con EDTA, muestras de sangre depositadas en tarjetas FTA®, plumas o cualquier otro tejido biológico, siguiendo el siguiente protocolo de extracción a partir de sangre: 1) Poner en un tubo Eppendorf (1 ,5 mililitros) 50 microlitros de sangre y 1 ,3 mililitros de agua bidestilada estéril.
2) Incubar 30 minutos a temperatura ambiente. Agitar 2 veces para que se homogenice bien. 3) Centrifugar durante 2 minutos y descartar el sobrenadante.
4) Añadir 200 microlitros de Chelex 5% al pellet.
5) Transferir todo el material a un tubo Eppendorf de 500 microlitros y vortear.
6) Incubar a 56° C durante 15 minutos. 7) Vortear e incubar a 1000C durante 15 minutos.
8) Conservar a -2O0C.
La PCR para Ia amplificación del ADN procedente de las muestras fue realizada utilizando de 50 a 100 nanogramos de ADN, un par de cebadores con las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3 respectivamente, junto con los reactivos necesarios para Ia realización de Ia misma.
Las condiciones de Ia PCR fueron las siguientes: precalentamiento a 94°C durante 3 minutos; 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos; hibridación a 600C durante 1 minuto; y elongación a 72°C durante 30 segundos. Los productos de Ia PCR se guardaron a 4°C y a -2O0C en el caso de que el siguiente paso del análisis fuese a retrasarse más de dos horas.
Una vez acabada Ia PCR, 8.5 microlitros de producto de PCR se sometieron a Ia acción enzimática de Ia enzima de restricción BsaAl (0.5 microlitros de enzima y 1 microlitro de Buffer 10X recomendado por el fabricante), o alguno de sus isoesquizómeros, capaz de reconocer Ia presencia del SNP candidato que había sido detectado al principio del presente ejemplo. La digestión se realizó a 37°C durante 4 horas en baño maría.
Finalizada Ia digestión, se realizó una electroforesis estándar submarina, con los productos de Ia citada digestión, en gel de agarosa a una concentración de 1% en TBExI (tris, ácido bórico, EDTA), a un voltaje de 40 voltios durante 10 minutos y 100 voltios durante 30 minutos, y se tiñeron con bromuro de etidio a una concentración de 0.5 microgramos por mililitro de TBE1X. Los patrones de restricción se visualizaron y fotografiaron cuando tras la electroforesis se sometió al gel de agarosa a luz ultravioleta a través de un transluminador.
1.4 Resultados
Los resultados pusieron de manifiesto que se obtenían dos patrones de restricción diferentes en función de Ia procedencia de las muestras ensayadas.
Se obtenía un patrón de restricción con una única banda, que correspondía al fragmento de ADN amplificado (506 pares de bases), el cual no había sido cortado por la enzima de restricción, para el caso de ejemplares de A. rufa híbridos, cuyo parental materno perteneciese a Ia especie A. rufa, y de ejemplares A. rufa puros. Y se obtenía un segundo patrón de restricción con dos bandas de 271 y 235 pares de bases respectivamente (Figuras 1 y 2, calles H y C), que correspondían a los dos fragmentos de ADN, originados a partir de Ia digestión llevada a cabo por Ia enzima de restricción, para el caso de ejemplares híbridos cuyo parental materno no pertenecía a Ia especie A. rufa, así como para los ejemplares pertenecientes a otras especies del género Alectorís en pureza
1.5. Interpretación de los resultados.
Este primer paso del método de identificación y diferenciación aporta, según los resultados obtenidos, dos patrones de restricción, que permiten Ia identificación de aquellos ejemplares híbridos, cuyo parental materno no pertenece a Ia especie A. rufa.
Los ejemplares puros de híbridos de A. rufa, cuyo parental materno pertenece a Ia especie A. rufa, y puros de A. rufa son indiferenciables con esta primera prueba, por Io que es necesario continuar con el método de identificación y diferenciación. 2. Obtención de patrones RAPD específicos que permitan Ia diferenciación de ejemplares puros de A. rufa e híbridos de A. rufa y otras especies del género Alectoris
Se realizó este ensayo con el fin de obtener patrones de RAPD que permitiesen diferenciar e identificar ejemplares puros de A. rufa e híbridos.
2.1. Método
Se realizaron extracciones de ADN procedente de los ejemplares de perdiz, que en Ia primera etapa del método de identificación y diferenciación habían sido identificados como individuos pertenecientes a Ia especie A. rufa a partir de muestras siguiendo el mismo protocolo de extracción que en Ia primera etapa del método.
La PCR para Ia amplificación del ADN, procedente de las muestras, fue realizada utilizando 2.5 microlitros de ADN, un único cebador con Ia secuencia SEQ ID NO :4 o análogos derivados, junto con todos aquellos reactivos necesarios para Ia realización de Ia misma.
Las condiciones de Ia PCR fueron las siguientes: precalentamiento a 94°C durante 4 minutos; 45 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 minuto; hibridación a 36°C durante 1 minuto; elongación a 72°C durante 2 minutos; y una elongación final a 720C durante 10 minutos. Los productos de Ia PCR se guardaron a 4°C y a -200C en el caso de que el siguiente paso del análisis fuese a retrasarse más de dos horas.
Finalizada Ia PCR, se cargó todo el producto obtenido de Ia misma en un gel de agarosa a una concentración del 1.5 % en TBExI (tris, ácido bórico, EDTA), a un voltaje de 40 voltios durante 10 minutos, 95 voltios durante 30 minutos y 120 voltios durante 45 minutos, y se tiñeron con bromuro de etídio a una concentración de 0.5 microgramos por mililitro de TBE1X. Una vez terminada Ia electroforesis, los patrones de RAPD se visualizaron y fotografiaron tras Ia iluminación del gel de agarosa luz ultravioleta a través de un transluminador.
2.2. Resultados
Los resultados obtenidos tras el ensayo de múltiples ejemplares híbridos con diferentes iniciadores ponían manifiesto Ia irreproductibilidad de éstos patrones RAPD, que variaban significativamente de un ejemplar híbrido a otro y no permitían su diferenciación respecto de los ejemplares puros.
La repetición de este ensayo con múltiples iniciadores llevó al descubrimiento de un iniciador, que permitía Ia diferenciación entre ejemplares híbridos, puros de A. graeca y puras de A. rufa. Este iniciador daba lugar a un patrón de bandas de RAPD (Figura 3 y 4), que aunque era diferente entre los diferentes ejemplares híbridos ensayados, presentaba un característica común, definida por Ia presencia de una banda diagnostica (Figuras 3 y 4, flechas (c)), de entre 1000 y 1100 pb. Adicionalmente, se detectó presencia de otra banda diagnostica más pequeña (500 a 600 pb) (Figura 3 y 4, flechas (a)).
2.3 Interpretación de los resultados
Este segundo paso del método de identificación y diferenciación aporta, según los resultados obtenidos, una serie de patrones RAPD, que permiten Ia diferenciación de los ejemplares puros de A. rufa respecto de híbridos de A. rufa, que no había sido posible identificar mediante el primer paso del método identificación y de otras especies del género Alectoris.
La presencia de Ia anteriormente citada banda diagnostica de 1000 a 1100 pb en los patrones RAPD, obtenidos mediante el uso de un único iniciador, aportado por Ia presente invención, o análogos derivados, es indicativa de que Ia muestra ensayada proviene de un ejemplar híbrido de perdiz roja (A. rufa-A, graeca o A. rufa-A.chukar). Además, Ia presencia conjunta de la citada banda diagnostica junto con una segunda banda de entre 500 y 600 pb es indicativa de que Ia muestra procede de un ejemplar puro de A. graeca (Figura 4, flechas (a))
3. Obtención de patrones de restricción específicos, que permitan Ia diferenciación e identificación de ejemplares puros e híbridos de A. rufa.
Se realizó este ensayo con el fin de obtener patrones de restricción que permitiesen Ia identificación de los ejemplares de A. rufa híbridos, obtenidos de su cruces con ejemplares pertenecientes a Ia especie A. chukar o A. graeca, de tal modo que se obtuviese una tercera prueba, que corroborase los resultados obtenidos en el segundo paso del método de identificación de Ia presente invención.
3.1 Búsqueda de SNPs candidatos, que permitiesen Ia identificación de ejemplares puros e híbridos de A. rufa.
La Comparación de secuencias de genes obtenidas por secuenciación directa de productos de PCR y su análisis mediante el programa BIOEDIT, llevó a Ia detección de un posible SNP candidato (SNP2), presente en el ADN cromosómico, más concretamente en el gen RDP1 o gen de la rodopsina. El citado SNP2 es diferente en los ejemplares de híbridos de A. rufa mencionados con respecto a los ejemplares puros de A. rufa.
3.2. Validación del SNP.
Se ensayaron diferentes híbridos de A. rufa, que se compararon con ejemplares puros de A. rufa y otras especies del género Alectoris.
3.3. Método
Se realizaron extracciones de ADN procedente de los ejemplares a analizar a partir de muestras biológicas siguiendo el mismo protocolo empleado en las dos etapas anteriores del método de identificación. La PCR para la amplificación del ADN, procedente de Ia muestra, fue realizada utilizando 1.6 microlitros de ADN, un par de cebadores con las secuencias SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7 respectivamente, junto con los reactivos necesarios para Ia realización de Ia misma.
Las condiciones de Ia PCR fueron las siguientes: precalentamiento a 94°C durante 4 minutos y 30 segundos; 35 ciclos de desnaturalización a 940C durante 30 segundos; hibridación a 64°C durante 45 segundos; y elongación a 720C durante 1 minuto; para terminar con un último paso a 72° durante 7 min. Los productos de Ia PCR se guardaron a 40C y a -200C en el caso de que el siguiente paso del análisis fuese a retrasarse más de dos horas.
Una vez acabada Ia PCR, 8 microlitros de producto de PCR se sometieron a Ia acción enzimática de Ia enzima de restricción Apal (0.5 microlitros de enzima, 0.5 microlitros de agua bidestilada estéril y 1 microlitro de Buffer I recomendado por el fabricante), o alguno de sus isoesquizómeros, capaz de reconocer Ia presencia del SNP2 candidato, que había sido detectado al principio del presente ejemplo. La digestión se realizó a 37 °C durante 4 horas en baño maría.
Finalizada Ia digestión, se realizó una electroforesis estándar submarina, con los productos de Ia citada digestión, en gel de agarosa a una concentración de 1.5 por ciento en TBExI (tris, ácido bórico, EDTA), a un voltaje de 40 voltios durante 10 minutos y 100 voltios durante 30 minutos, y se tiñeron con bromuro de etidio a una concentración de 0.5 microgramos por mililitro de TBE1X. Los patrones de restricción se visualizaron y fotografiaron cuando tras Ia electroforesis se sometió al gel de agarosa a luz ultravioleta a través de un transluminador.
3.4. Resultados
Los resultados pusieron de manifiesto que se obtenían dos patrones de restricción diferentes en función de Ia procedencia de las muestras ensayadas. Se obtenía un patrón de restricción con una única banda, que correspondía al fragmento de ADN amplificado (441 pares de bases), el cual no había sido digerido por Ia enzima de restricción, para el caso de ejemplares de A. rufa puros. Y se obtenía un segundo patrón de restricción con dos badas de 354 y 87 pares de bases respectivamente (Figuras 5 y 6), que correspondían a los dos fragmentos de ADN originados a partir de Ia digestión llevada a cabo por Ia enzima de restricción, para el caso de ejemplares híbridos de A. rufa y puros de A. chukar.
3.5. Interpretación de resultados
Este tercer paso del método de identificación y diferenciación aporta, según los resultados obtenidos, dos patrones de restricción que permiten: a) identificar aquellos ejemplares híbridos de A. rufa, que no hubiesen sido detectados mediante Ia realización de los dos pasos anteriores del método de identificación presentados en el presente ejemplo de realización; b) corroborar o ratificar Ia pureza de los ejemplares de A. rufa, que hubiesen sido detectado como tal mediante Ia realización de los dos pasos anteriores del método de identificación presentados en el presente ejemplo de realización.

Claims

REVINDICACIONES
1.- Método de identificación de distintas especies del género Alectoris y de sus híbridos, basado en el análisis de ADN, caracterizado porque comprende Ia detección, de Ia presencia o ausencia de (i) dos polimorfismos, situados en Ia posición -234 del gen mitocondrial citocromo b y en Ia posición -526 del intrón 1 del gen de Ia rodopsina respectivamente, y (ii) de varias bandas diagnósticas en patrones tipo
RAPD, a partir de una muestra de tejido o de fluido procedente de un único ejemplar.
2.- Método según reivindicación 1 , caracterizado porque uno de los polimorfismos es un cambio de Timina por Citosina en Ia posición -234, en el gen citocromo b mitocondrial.
3.- Método según reivindicación 2, caracterizado porque el polimorfismo se detecta usando cebadores de PCR que amplifican un fragmento de ADN mitocondrial, fragmento que comprende el nucleótido de Ia posición -234 del gen citocromo b mitocondrial.
4.- Método según reivindicación 3, caracterizado porque los cebadores de PCR tienen las secuencias SEQ ID NO:2 y SEQ ID N:3.
5.- Método según reivindicación 1 , caracterizado porque uno de los polimorfismos consiste en un cambio de Timina por Citosina localizado en Ia posición - 526 del intrón 1 del gen de Ia rodopsina.
6. Método según reivindicación 5, caracterizado porque el polimorfismo se detecta usando cebadores de PCR, que amplifican un fragmento de ADN, que comprende el nucleótido de Ia posición -526 del intrón 1 del gen de Ia Rodopsina.
7.- Método según Ia reivindicación 6, caracterizado porque los cebadores de PCR tienen las secuencias SEQ ID NO6: y SEQ ID N:7.
8.- Método según reivindicación 1 , caracterizado porque una de las bandas diagnosticas se corresponde con un fragmento de ADN de entre 1000 y 1100 pb.
9.- Método según reivindicación 1 , caracterizado porque otra de las bandas diagnosticas se corresponde con un fragmento de ADN de entre 500 y 600 pb.
10.- Método según reivindicación 8, caracterizado porque Ia obtención de los patrones tipo RAPD se realiza mediante el uso de un iniciador con Ia secuencia comprende SEC ID NO:4 o análogos derivados.
11.- ADN aislado caracterizado porque comprende una región del gen citocromo b mitocondrial, en Ia cual una Timina en Ia posición -234 ha sido sustituida por una Citosina.
12.- ADN según reivindicación 10, caracterizado porque comprende Ia secuencia SEQ ID NO:1.
13.- ADN aislado caracterizado porque comprende una región del intrón 1 del gen de Ia rodopsina, en Ia cual una Timina en Ia posición -526 ha sido sustituida por una Citosina.
14.- ADN según reivindicación 12, caracterizado porque comprende Ia secuencia SEQ ID NO:5.
15.- ADN aislado de entre 1000 y 1100 pares de bases, caracterizado porque se obtiene mediante el uso de un iniciador con Ia SEC ID NO:4.
16.- Par de cebadores de PCR que amplifican un fragmento de ADN del gen citocromo b, caracterizado porque el ADN amplificado tiene una longitud de hasta 800 pb, situándose en éste un SNP según reivindicación 2.
17.- Cebador seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:3.
18.- Cebador de PCR seleccionado del grupo formado por Ia secuencia SEQ ID NO:4 y análogos derivados.
19.- Par de cebadores de PCR que amplifican un fragmento de ADN del gen de Ia rodopsina, caracterizado porque el ADN amplificado tiene una longitud de hasta 800 pb, situándose en éste el SNP según reivindicación 5.
20.- Cebador seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO:6 y SEQ ID N0.7.
21.- Kit de identificación de híbridos del género Alectorís, caracterizado porque comprende cebadores según reivindicaciones 15, 17 y 18.
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