WO2006093276A1

WO2006093276A1 - 心臓組織由来の多能性幹細胞

Info

Publication number: WO2006093276A1
Application number: PCT/JP2006/304111
Authority: WO
Inventors: Hidemasa Oh; Kento Tateishi; Hiroaki Matsubara
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2006-09-08
Also published as: CA2600653C; EP2295541A1; EP1857544A4; US9867854B2; EP1857544B1; EP2295541B1; CA2600653A1; US20160228472A1; JP4783909B2; WO2006093276A8; JPWO2006093276A1; EP1857544A1

Abstract

　本発明の目的は、再生治療方法に実用可能な幹細胞を提供すること、及び該細胞を利用して再生治療を行う技術を提供することである。　採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液を利用して、(1)密度勾配法による細胞の分離、(2)繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地での浮遊培養、(3)浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択分離することにより、多能性幹細胞を得、これを利用して再生治療を行う。

Description

明細書

心臓組織由来の多能性幹細胞

技術分野

[0001] 本発明は、心臓組織由来の多能性幹細胞、特に心筋細胞への分化能に優れている多能性幹細胞に関する。更に、本発明は、該幹細胞の調製方法、及び該幹細胞を利用した心疾患の治療方法に関する。

背景技術

[0002] 近年、再生医学において、幹細胞を移植することにより、目的とする組織及び臓器を修復し、再生する医療技術が精力的に研究されている。これまでに、各種組織や臓器の成熟細胞に分化する幹細胞が見出され、細胞移植への臨床的応用が検討されている。

[0003] 例えば、心臓組織由来の心筋幹細胞として、 c-kit陰性 ZCD31陽性 ZCD34陰性 /Sca-1陽性のマウス幹細胞 (非特許文献 1参照)や C- kit陽性 ZCD31陽性 ZCD34 陽性のラット幹細胞 (非特許文献 2及び 3参照）が報告されている。しかしながら、前者の心筋幹細胞ではヒトでの検討はなされておらず、臨床的に実用できるかが明らかにされていない。また、後者の心筋幹細胞では、単離が極めて困難であることにカロえ、増殖能が乏しく移植目的の大量培養に適していないという欠点がある。また、上記の両心筋幹細胞は、多能性幹細胞ではなぐあくまで心臓への細胞移植にのみに適用されるものである。

[0004] また、心筋幹細胞に関しては、心臓組織由来の心筋幹細胞の他に、骨髄由来の造血細胞や間葉系幹細胞を中心に心筋細胞に分化する幹細胞の検索が行われている力従来報告されている細胞では、心筋細胞への分化度は極めて低ぐ臨床的に実用できるものではない。

[0005] このように、幹細胞として機能し得る細胞は見出されていても、実際に臨床的に実用可能なものは殆ど知られていないのが現状である。このような従来技術を背景として、心筋細胞を初めとする各種成熟細胞への分ィ匕能を有し、再生治療方法に実用可能な多能性幹細胞の開発が望まれて、る。 [0006] なお、これまでに、筋肉起源の c-kit陰性 Zc-met陰性 ZCD34陰性 ZSca-1陰性 Z Pax(3/7)陰性の心筋細胞前駆細胞は、自発的に拍動する心筋細胞への分ィ匕能を有していることが報告されている (特許文献 1参照)。し力しながら、この特許文献 1に記載された幹細胞は、筋肉を起源とすることにより単離できるものであり、心臓組織からは単離できな、ことが分力つて、る（特許文献 1の実施例 11参照)。

特許文献 1： WO2003/035838

^^特干文献 1： Oh H., et. AL, 'し ardiac progenitor cells from adult myocardium: Ho ming, differentiation, and fusion after infarction", Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 100, 12313-12318, October 14, 2003

非特許文献 2 : Messina E., et. AL, "Isolation and expansion of adult cardiac stem eel Is from human and murine heart", Circ Res., Vol. 95, 911-921, 2004

非特許文献 3 : Beltrami AP., et. AL, "Adult cardiac stem cells aremultipotent and su pport myocardial regeneration , Cell, Vol. 114, 763—776, September 19, 2003 発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 本発明の目的は、上記従来技術の課題を解決することである。詳細には、本発明は、再生治療方法に実用可能な幹細胞を提供すること、及び該細胞を利用して再生治療を行う技術を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製し、該細胞懸濁液を利用して、（1)密度勾配法による細胞の分離、（2)繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地での浮遊培養、（3)浮遊状のスフエアーを形成してヽる細胞塊を選択分離することにより、特に心筋細胞への分化能に優れた多能性幹細胞が得られることを見出した。また、該幹細胞は、上記した分化能のみならず、自己複製能の点でも優れており、細胞移植による再生治療に実用化できることを確認した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることによって完成したものである。

[0009] 即ち、本発明は、下記に掲げる多能性幹細胞の調製方法を提供する：項 1. 下記工程を経て調製される、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞を調製する方法：

(0ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、

(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液力心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び

(m)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフエアーを形成して!/ヽる細胞を選択し分離する工程。

項 2. 多能性幹細胞力 c-kit陰性、 CD31陰性及び CD34陰性である、項 1に記載の調製方法。

項 3. 多能性幹細胞が、更に CD105陽性である、項 2に記載の調製方法。

項 4. 多能性幹細胞がヒト由来である、項 1に記載の調製方法。

項 5. 多能性幹細胞が、少なくとも心筋細胞に分ィ匕する能力を有するものである、項

1に記載の調製方法。

項 6. 多能性幹細胞が、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群力選択される 1種又は 2種以上の細胞に分ィ匕する能力を有するものである、項 1に記載の調製方法。

また、本発明は、下記に掲げる多能性幹細胞を提供する：

項 7. 項 1乃至 6のいずれかに記載の調製方法によって得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。

項 8. c-kit陰性、 CD31陰性及び CD34陰性である、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。

項 9. CD 105陽性である、項 8に記載の幹細胞。

項 10. ほ乳動物がヒトである、項 8に記載の幹細胞。

項 11. 少なくとも心筋細胞に分ィ匕する能力を有する多能性幹細胞である、項 8に記載の幹細胞。

項 12. 心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群力選択される 1種又は 2種以上の細胞に分ィ匕する能力を有する多能性幹細胞である、項 8に記載の幹細胞。

[0011] また、本発明は、下記に掲げる治療方法を提供する：

項 13. 項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞の治療有効量を、患者の組織又は臓器に移植することを特徴とする、組織又は臓器の疾患の治療方法。

項 14. 心疾患の治療方法である、項 13に記載の治療方法。

項 15. 心疾患の治療方法であって下記工程を含有する、項 13に記載の治療方法

(0ヒトから採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程

(ii)密度勾配法により、上記細胞懸濁液力心臓組織由来細胞群を分離する工程、

(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフエアーを形成して!/ヽる細胞を選択し分離する工程、

(iv)上記工程 (iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び

(V)上記工程 (iv)で増殖させた細胞の治療有効量を心疾患の患者の心臓に移植する工程。

[0012] 更に、本発明は、下記に掲げる組成物を提供する：

項 16. 項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、組織又は臓器の疾患の治療用組成物。

項 17. 項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、心疾患の治療用組成物。

[0013] そして更に、本発明は、下記に掲げる態様の幹細胞の使用を提供する：

項 18. 項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞の、心疾患の治療用組成物を調製するための使用。

項 19 項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用組成物を調製するための使用。

発明の効果 [0014] 本発明は、心臓組織に由来し、心筋細胞、血管平滑筋細胞、血管内皮細胞等に分化して、心臓を初めとする各種組織や臓器を再生できる幹細胞を提供する。故に、本発明の多能性幹細胞によれば、細胞移植という新たな手法により、各種組織や臓器の疾患の治療が可能になる。

[0015] また、本発明の多能性幹細胞は、心臓組織由来の細胞群を特定条件下で浮遊培養し、浮遊状態のスフア一を取得すると、う簡便な方法で取得できると、う利点があり、臨床上の有用性が高い。また、このように浮遊状態のスフエアーを取得することにより、単一細胞力増殖した幹細胞が選択分離されるので、幹細胞自体の均一性が高、と、う利点も得られ、臨床上の有用性が高、。

[0016] 更に、本発明の多能性幹細胞は、特に心筋細胞への分ィ匕能が優れているので、心臓移植に頼らざるを得ない重症心不全患者に細胞移植による新たな治療方法を提供でき、心臓移植に替わる心臓疾患の治療方法として有用である。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1]パーコールの密度勾配遠心法により分離したマウス由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフエアー (細胞塊)を示す写真である。図 1中、 A、 C、 E及び Gは蛍光顕微鏡にて撮影した写真を示し、 B、 D、 F及び Hは位相差顕微鏡により撮影した写真であり、 Aと B、 Cと D、 Eと F、 Gと Hは、それぞれ同一視野を撮影したものである。 A及び Bは、野生型マウス由来のスフエアーと GFP発現マウス由来のスフエアーが混在して浮遊している状態を示している。 C及び Dは、 GFP 発現マウス由来のスフエアーを示している。 E及び Fは、野生型マウス由来のスフエア一を示している。 G及び Hは、野生型マウス由来の細胞と GFP発現マウス由来の細胞が混合して形成されて、るスフエアーを示して、る。

[図 2]マウス由来のスフエアー形成細胞の各種細胞表面抗原（Sca-1、 c-kit、 CD34、 CD45、 CD31、 CD38、 CD90及び CD105)を FACS分析した結果である。図中、太 (濃）線がスフエアー形成細胞の分析結果であり、細 (薄)線がコントロール (標識無しの細胞)の分析結果である。

[図 3]マウス由来のスフア一形成細胞及び ES細胞における各種マーカー（Bmi 1、 T ERT、 Bcrp 1、 Oct 4、 UTF 1、 Nanogゝ Brachvury, Sox 2、 Nestinゝ Islet 1)の発現を PC Rにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、 GAPDHをコントロールとした。

[図 ₄]パーコールの密度勾配遠心法により分離したマウス由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフエアーにつ!、て、ブロモデォキシゥリジン (BrdU)の発現を観察した結果を示す図である。図中、 Aは BrdU染色したスフエァ一の像を示し、 Bは Aの位相差像を示す。

[図 5]パーコールの密度勾配遠心法により分離したマウス由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフエアーにっ、て、テロメラーゼの発現を分析した結果を示す図である。

[図 6]GFP発現マウス由来のスフア一形成細胞を心筋細胞に分ィ匕誘導する過程において観察した細胞の形状を示す図である。図 6中、 Aは蛍光観察した像を示し、 B は Aと同一視野の位相差像を示す。

[図 7]マウス由来のスフア一形成細胞力も分ィ匕した心筋細胞の写真である。図 7中、 Bは Aを拡大したものである。

[図 8]スフア一形成細胞力分化した心筋細胞の各種マーカー（Nkx 2.5、 GATA 4 、 ANPゝトロポニン一 I(TnI)、 MLC2v、 MLC2aゝ -MHC( -myosin heavy chain), β - MHC( β -myosin heavy chain), GAPDH)の発現を PCRにより分析した結果を示す図である。

[図 9]スフア一形成細胞、及び該細胞力分ィ匕した各種細胞の写真を示す図である。図 9中、 Aはスフエアー形成細胞; Bはスフエアー形成細胞から分化した平滑筋細胞； Cはスフエアー形成細胞から分化した血管内皮細胞； Dはスフエアー形成細胞から分化した脂肪細胞; Eはスフエアー形成細胞から分化したグリア細胞;及び Fはスフエアー形成細胞から分化した上皮細胞を示す。

[図 10]実施例 1で得られたマウス由来スフエアー形成細胞（多能性幹細胞）をマウス梗塞心筋に移植し、該細胞のマウスの心筋における生着の状態を示す図である。 A は、ホスト心筋におけるスフエアー形成細胞 (緑色）の生着を示す図である。 Bは、 A 図と同一視野において、 cTnT染色 (赤色を呈する）した結果を示す図である。 Cは上記 A及び Bを重ね合わせた図であり、 Dは Cを拡大した図である。圆 11]パーコールの密度勾配遠心法により分離したヒト由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフエアー (細胞塊)を示す写真である。図

11中、 Aは培養 1日後に観察されたスフエアーを示し、 Bは培養 7日後に観察されたスフエアーを示す。

[図 12]ヒト由来のスフエアー形成細胞の各種マーカー（Rex 1、 TERT、 Oct 4、 Nanog、

Brachyury, Sox 2)の発現を PCRにより分析した結果を示す図である。

[図 13]ヒト由来のスフア一形成細胞の各種細胞表面抗原（c-kit、 CD34、 CD90及び

CD105)を FACS分析した結果である。図中、太 (濃)線がスフエアー形成細胞の分析結果であり、細 (薄)線がコントロール (標識無しの細胞）の分析結果である。

[図 14]ヒト由来のスフエアー形成細胞力も分ィ匕した心筋細胞の写真である。

[図 15]ヒト由来スフエアー形成細胞力も分ィ匕した心筋細胞の各種マーカー (Nkx-2.5

、 GATA4、 ANPゝ — ca— actinゝ TnTゝ MLC2v、 MLC2aゝ — MHC( -myosin heavy ch ain)、 β -MHC( β -myosin heavy chain))の発現を PCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、 j8 actinをコントロールとした。

[図 16]ヒト由来スフエアー形成細胞力も分ィ匕した平滑筋細胞の写真である。

[図 17]ヒト由来スフエアー形成細胞力も分ィ匕した平滑筋細胞の各種マーカー（SM-22 α及び calponin)の発現を PCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、 j8 actinをコントロールとした。

圆 18]ヒト由来スフエアー形成細胞力も分ィ匕した血管内皮細胞の写真である。

[図 19]ヒト由来スフエアー形成細胞力も分ィ匕した血管内皮細胞の各種マーカー（CD3 1及び VEGF-R2)の発現を PCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、 j8 actinをコントロールとした。

[図 20]実施例 3で得られたヒト由来スフエアー形成細胞（多能性幹細胞）をマウス梗塞心筋に移植し、該細胞のマウスの心筋における生着の状態を示す図である。 Aは、ホスト心筋において、ヒト由来スフエアー形成細胞が心筋細胞に分化し、生着した細胞 (cTnl染色により赤色を呈する）を示す図である。 Bは、 Aと同一視野において DAPIを用いて細胞内の核を青色に染色した図と、 Aを重ね合わせた図である。 Cは、心筋梗塞中心部にも、ヒト由来スフエアー形成細胞が分ィ匕した心筋細胞 (cTnl染色により赤色を呈する）が生着していることを示している図である。 Dは、菲薄化した梗塞巣内に、ヒト由来スフエアー形成細胞が心筋細胞に分化して生着した細胞 (cTnl染色により赤色を呈する）を示している図である。 Eは、 Dと同一視野において DAPIを用いて細胞内の核を青色に染色した図と、 Dを重ね合わせた図である。 Fは、 DAPIを用いて青色に染色された核と、 CD31の染色により赤色に染色された CD31陽性血管内皮細胞を示す図であり、ヒト由来スフエアー形成細胞力も分ィ匕した CD31陽性血管内皮細胞が生着して、ることを示して！/、る。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 以下、本発明を詳細に説明する。

[0019] A.本明の細胞の調製法

以下、本発明の多能性幹細胞の調製方法を工程毎に詳述する。

1.細胞懸濁液の調製

まず、ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する (工程 (0)。

[0020] 本発明では、多能性幹細胞の採取源となる心臓組織は、ほ乳動物由来のものである限り、特に制限されない。本発明において、ほ乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ノ、ムスター、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ヒッジ、ブタ、ゥシ、ャギ、サル、ヒト等が挙げられる。調製される多能性幹細胞をヒトの心疾患の治療に使用する場合には、ヒト由来であることが好ましい。また、本工程で使用される心臓組織の部位についても特に制限されるものではな、。

[0021] ほ乳動物力の心臓組織片の採取は、通常の外科的手法により心臓組織片を摘出することにより行われる。また、摘出された心臓組織片は、酵素処理に先立って、心臓組織以外の組織 (例えば、血管、神経組織等)を極力取り除いておくことが望ましい。また、酵素処理の効率を高めるために、採取された心臓組織片は、約 lmm³以下の断片になるまで細切した後に酵素処理に供することが望ましい。

[0022] また、酵素処理は、生体組織片力細胞懸濁液を調製する際に一般的に使用される酵素を使用して行われる。使用される酵素として、具体的には、コラーゲナーゼ、トリプシン、キモトリブシン、ペプシン等のプロテアーゼが例示される。これらの中で、好ましくはコラーゲナーゼが挙げられる。かかるコラーゲナーゼとして、具体的には、 coll agenase type 2 (Worthington社製； 205U/mg)が例示される。なお、本明細書において、コラーゲナーゼ 1Uとは、 pH7.5、 37°C、 5時間で、コラーゲンから 1 μモノレの L ロイシンを遊離できる酵素量を表す。

[0023] また、酵素処理条件についても、特に制限されないが、一例として、下記酵素処理条件が例示される：

酵素濃度：例えば、 collagenase type 2 (Worthington社製; 205U/mg)を使用する場合であれば、マウス由来の心筋組織を処理する場合、通常 0.1〜0.3重量％、好ましくは 0.2重量％程度;ヒト由来の心筋組織を処理する場合、通常 0.2〜0.6重量％、好ましくは 0.4重量％程度となる濃度が挙げられる。また、例えば、酵素濃度は、心筋組織 100 mg当たり、通常 4100〜12300U、好ましくは 8200U程度となる濃度が例示される。

Mi :通常 37°C程度となる温度が挙げられる。

処理時間及び回数:诵常 20〜30分の処理時間で酵素処理を 2回線り返す条件、好ましくは 20分程度の処理時間で酵素処理を 2回繰り返す条件が挙げられる。

[0024] 斯くして得られた細胞懸濁液は、酵素処理後に、遠心分離して上清を除去し、細胞の生育に適した培地を添カ卩しておくことが望ましい。細胞の生育に適した培地としては、例えば 10容量％び牛胎児血清 (FBS)及び 1容量％のペニシリンストレプトマイシン（5000U/ml penicillin及び 5000 μ g/ml streptomycin sulfateの混合物）を含むダルべッコ改変イーグル培地（DMEM)培地が例示される。

[0025] 2.心臓糸且織由来細胞群の分離

次いで上記細胞懸濁液から、密度勾配法により心臓組織由来細胞群を分離する（工程 (ii))。

[0026] 本工程において、心臓組織由来細胞群の分離は、細胞の分離に通常採用されている密度勾配法により実施することができる。心臓組織由来細胞群の分離の好ましい実施態様の一例として、パーコール (percoll)の密度勾配遠心法により心臓組織由来細胞群を分離する方法が例示される。パーコールの密度勾配遠心法は、シリカゲルの一種であるパーコールを用いて遠心分離する公知の方法であり、パーコールを層状に用いて、るため、遠心力により細胞を破壊することなく分離することができる。 [0027] パーコールの密度勾配遠心法により、上記細胞懸濁液から目的の幹細胞を含む心臓組織由来細胞群を分離するには、例えば、上記細胞懸濁液を、 30容量％バーコール溶液及び 70容量％パーコール溶液カゝらなる不連続密度勾配にて、室温で 100 OGで 20分間遠心分画すればよぐこれによつて 30容量％パーコール溶液と 70容量 %パーコール溶液の界面に、目的の幹細胞を含む心臓組織由来細胞群が得られる

[0028] 3.多能性幹細胞の分離

次いで、上記工程 GOで得られた心臓組織由来細胞群を、上皮細胞増殖因子 (EG F ; epidermal growth factor)及び繊維芽細胞成長因子 (FGF; fibroblast growth facto r)を含有する培地で浮遊培養した後に、浮遊状のスフエアー（細胞塊）を形成して!/、る細胞を選択し分離する（工程 (iii))。

[0029] 当該浮遊培養に先立って、上記工程 (ii)で得られた心臓組織由来細胞群を更に酵素処理に供して、細胞同士の結合や付着を解消しておくことが望ましい。かかる酵素処理の具体的方法については、特に制限されず、プロテア一ゼ等を使用した公知の方法により行うことができる。該酵素処理の一例として、心臓組織由来細胞群を 0. 0 5重量％のトリプシン及び 0. 53mMの EDTAを含有する溶液で、 37°Cで 10分間程度処理する方法が例示される。また、当該酵素処理後にはプロテアーゼ阻害剤を添加し、プロテアーゼ活性を失活させた後に本工程 (iii)に供されることが望ましい。

[0030] 本工程で使用される培地は、通常の細胞培養 (浮遊培養）に使用される培地に、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子が添加されて!ヽればよ!ヽ。該培地の好適なものとして、例えば、ヒト血清又は牛血清アルブミンを含む DMEMZF12HAM培地に、上記上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子が添加されてる培地が例示される。また、本工程で使用される培地は、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質； B27サプリメント（GIBCO社製）； HEPES (5mM)等を含有していてもよい。

[0031] また、本工程で培地に添加される上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子の割合については、例えば、上皮細胞増殖因子が 10〜20ng/ml、好ましくは 20ng/ml程度であり、繊維芽細胞成長因子が 10〜40ng/ml、好ましくは 40ng/ml程度が例示される。

[0032] 本工程にぉ、て、培養開始時の細胞濃度が 1 X 10⁴〜2 X 10⁴cells/ml、好ましくは 2

X 10⁴cells/mlとなるように設定して、培養を行うことが望ましい。

[0033] 本工程における浮遊培養は、通常 37°Cで、 5%CO下で、通常 14

2 〜21間、好ましくは 14日間行う。

[0034] 斯くして培養を行うことにより、多能性幹細胞が細胞分裂を繰り返してスフア一（細胞塊）を形成し、これが培養液中に浮遊する。従って、このスフエアーを回収することにより、目的とする多能性幹細胞を取得することができる。

[0035] B.多能性幹細胞の特徴

斯くして得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞は、自己複製能と共に、心筋細胞を初めとする各種成熟細胞に分ィ匕する能力を備えている。当該多能性幹細胞が分化可能な細胞の一例として、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞が例示される。特に、当該多能性幹細胞は、心筋細胞への分ィ匕能に優れていることが 1つの特徴として挙げられる。

[0036] また、上記調製方法により得られる多能性幹細胞の細胞表面抗原の特性として、 c- kit陰性、 CD31陰性及び CD34陰性が挙げられる。更に、当該多能性幹細胞の一例として、細胞表面抗原の特性として CD105陽性を示すものが挙げられる。また、当該多能性幹細胞の一例として、細胞表面抗原の特性として Sca-1陽性、 CD45陰性、 CD38 陽性、及び CD90陽性を示すものが挙げられる。このような細胞表面抗原の特性は、公知の方法で特定することができる。このような細胞表面抗原の特性を有する多能性幹細胞は、上記浮遊培養 (上記工程 (iii))を行う方法以外に、上記工程 (ii)で得られた心臓組織由来細胞群から、前述する細胞表面抗原の特徴を有する細胞を公知の方法で分取することにより取得することもできる。このように細胞を分取する方法の一例として、ソーティング機能を備えるフローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。

[0037] C.多能件榦細胞の焙着 (増殖)

上記多能性幹細胞を、上皮細胞増殖因子及び繊維芽細胞成長因子を含有する培地で培養することにより、該多能性幹細胞を増殖させることができる（工程 Gv))。

[0038] 本工程では、培養に先立って、上記工程 (iii)で得られたスフエアーをプロテアーゼで処理してスフエアーを分解して、多能性幹細胞を浮遊させておくことが望ましい。このように多能性幹細胞を浮遊させる方法としては、例えば、 0.05重量％の濃度のトリプシンで、 37°Cで 20分間程度処理する方法が例示される。当該プロテアーゼ処理後には、プロテアーゼ阻害剤を添加して、プロテアーゼの作用を阻害しておくとよい。

[0039] また、本工程で使用される培地には、前記工程 (iii)で使用される培地と同様である。

[0040] 本工程にぉ、て、例えば、培養開始時の細胞濃度を 20cells/ μ 1として、 37°C、 5% CO下で、通常 14〜21日間培養を行うことにより、上記多能性幹細胞を所望量に増

2

殖させることができる。

[0041] D.多能件榦細胞の目的細胞への分化誘導

上記多能性幹細胞を、心筋細胞を初めとする各種細胞に分化誘導させる方法としては、例えば、増殖させた上記多能性幹細胞を、デキサメサゾンを含有する培地で培養する方法が挙げられる。

[0042] 分化誘導に使用される培地において、添加されるデキサメサゾンの割合については、心筋細胞への分ィ匕誘導が可能である限り特に制限されないが、通常、培地中にデキサメサゾンが 1 X 10— ⁸モル /1程度の割合で含まれていればよい。

[0043] 分ィ匕誘導に使用される培地の種類については特に制限されないが、好適な培地として MEM培地（minimum essential medium, GIBCO社製）に、デキサメサゾンが添カロされている培地が例示される。また、該培地は、多能性幹細胞の増殖に使用する培地と同様に、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質； HEPES (5mM)等を含有して!/ヽてもよ！/ヽ。

[0044] 上記培地を用いて、通常 37°Cで、 5%CO下で、通常 7〜21日間、好ましくは 14

2

日間程度、上記多能性幹細胞を培養することにより、一定の割合で上記多能性幹細胞を心筋細胞を初めとする各種細胞に分ィ匕誘導することができる。

[0045] 特に、デキサメサゾンを含有する培地で培養する上記方法は、上記多能性幹細胞を心筋細胞に分化誘導させるのに好適に採用される。

[0046] また、上記培地を使用する分化誘導方法の他に、平滑筋細胞への分化誘導方法として、増殖させた上記多能性幹細胞を、血小板由来増殖因子 (PDGF-BB)を含有する培地で培養する方法が挙げられる。当該方法において、培地中の血小板由来増殖因子濃度は通常 lOng/ml程度であり、培養条件としては、上記心筋細胞への分ィ匕誘導の場合と同様である。

[0047] 更に、上記培地を使用する分化誘導方法の他に、血管内皮細胞に分化誘導させる方法として、増殖させた上記多能性幹細胞を、血管内皮成長因子 (VEGF)を含有する培地で培養する方法が挙げられる。当該方法において、培地中の血管内皮成長因子濃度は通常 lOng/ml程度であり、培養条件としては、上記心筋細胞への分ィ匕誘導の場合と同様である。

[0048] E.疾唐、の '治療方法

上記多能性幹細胞は、各種組織又は臓器の再生や修復に使用することができる。具体的には、組織又は臓器に疾患がある患者に、上記多能性幹細胞の治療有効量を組織又は臓器の疾患部位に移植することにより、該疾患を治療することができる。

[0049] 上記多能性幹細胞を用いた治療にお!、て、対象となる疾患として、好ましくは、心疾患が挙げられる。上記多能性幹細胞は心臓組織由来のものであり、心筋細胞への分ィ匕能は特に優れているので、上記疾患の中でも心疾患に対する治療に好適に使用される。

[0050] 対象となる心臓疾患としては、心筋若しくは冠動脈に障害を来し、収縮力が低下するような心臓疾患が挙げられ、具体的には、心筋梗塞、拡張型心筋症、虚血性心疾患、うつ血性心不全等が例示される。

[0051] 多能性幹細胞を移植する方法として、例えば、治療目的の組織又は臓器の疾患部位にカテーテルを利用して上記多能性幹細胞を注入する方法、或いは切開して治療目的の組織又は臓器の疾患部位に上記多能性幹細胞を直接注入する方法等が挙げられる。

[0052] また、患部に移植される多能性幹細胞の投与量にっ、ては、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢や性別等に応じて、適宜設定すればよいが、例えば、 1回の移植において 1.0 X 10⁶〜1.0 X 10⁸個の多能性幹細胞を投与することができる。

[0053] 本発明の治療方法では、疾患を有する患者以外の者力採取した多能性幹細胞を使用してもよいが、拒絶反応を抑制する観点から、患者自身の心臓組織由来の多能性幹細胞を使用することが望ま、。 [0054] なお、本発明の治療方法には、心疾患の治療方法として、下記の態様の方法が包含される：

下記工程 (i)〜(v)を含有する心疾患の治療方法：

(iii)得られた心臓組織由来細胞群を、繊維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後に、浮遊状のスフエアーを形成して!/ヽる細胞を選択し分離する工程、

(iv)上記工程 (iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び

(V)上記工程 (iv)で増殖させた細胞を心疾患の患者の心臓に移植する工程。

[0055] F.細は臟器の唐、の' 7合 ffl Hfe

前述するように、上記多能性幹細胞は、糸且織又は臓器の疾患の治療に有用である。故に、本発明は、更に、上記多能性幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する組織又は臓器の疾患の治療用組成物を提供する。当該組成物は、組織又は臓器の疾患の治療において、疾患部位に投与されることにより使用される。

[0056] ここで、薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水、緩衝液等が使用される。また、当該治療用組成物における上記多能性幹細胞の配合量については、患部に移植される多能性幹細胞の量に基づいて適宜設定される。

[0057] 特に、上記多能性幹細胞は心臓組織由来のものであり、心筋細胞への分ィ匕能が優れているので、当該組成物は、心疾患の治療用組成物として好適である。

実施例

[0058] 以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明する力本発明はこれらによって限定されるものではない。

[0059] 実施例 1

マウス由来多能性幹細胞の取得及び該幹細胞の分化誘導

Π )糸田の 6〜8週齢の雌 C57B1/6Jマウス (清水実験材料株式会社製）（以下、野生型マウスと表記することもある）又は同マウスに緑色蛍光色素タンパク (GFP)発現能を付与したマウス（以下、 GFP発現マウスと表記することもある）を、ジェチルエーテル麻酔下に用手的に頸椎脱臼にて安楽死させ、 70容量 %エチルアルコール水溶液に浸して全身を消毒した。前もって高圧蒸気滅菌を施した尖鋭のピンセット及びはさみを用い、胸骨正中切開した後、心臓を摘出した。摘出した心臓を氷上の冷 PBS (Phosphate buffere d saline)入りシャーレ内に置いて、 23ケージ針付き注射器を用い、大動脈弁輪部から 2mlの冷 PBSを 3回注入し、心臓内の血液を除去した。次いで、心臓中間部に切開を入れ、新たな冷 PBS入りシャーレ内で心腔内を洗浄した。更に、この心腔内の洗浄を二回繰り返し、最後に PBSを除去した。その後、滅菌済みのはさみを用いて破砕した心臓組織断片を約 lmm³以下になるまで細切した。細切した心臓組織片 (約 lOOmg )を 100ml容三角フラスコに移し、更に 0.2重量％ collagenase type2 (Worthington社製）含有溶液 20mlを添加し、 37°C恒温漕内で 20分間震盪して酵素処理を行った。次いで、更に 10mlの電動ピぺッターを用いて 3ml/secの速度でピペッティングを行い、よく撹拌した後、更に 0.1重量％ DNAse I(Worthington社製)含有溶液 2.²mlを添カ卩し、 37 °C恒温漕内で 3分間震盪した。かかる酵素処理後、 20mlの 10容量 %FBS (牛胎仔血清) (Hyclone社製)及び 1容量％ペニシリンストレプトマイシンを含有する DMEM(GIBCO 社製)培地 (以下、「培地 1」と表記する）を加えて酵素を中和し、細胞含有液を調製した後、 70 m cell strainer(FALCON社製)及び 40 μ m cell strainer(FALCON社製)で濾過した。濾過後の細胞含有液を 1500rpmで 5分間遠心分離して、その上清を除去した後に、 10mlの培地 1を添加して細胞懸濁液 (以下、細胞懸濁液 1と表記する）を調製し、これを氷中保存した。また、 100ml容三角フラスコに残存した心臓組織片に対しても、再度同様の処理を行い、同様に細胞懸濁液 (以下、細胞懸濁液 2と表記する）を調製した。斯くして得られた細胞懸濁液 1及び 2を混合し、以下記載する工程に供した。

(₂)パーコールの密度勾配遠心法による心臓組織由細胞群の分離

パーコール（_percoii)原液（Amersham Biosciences社製）： 10 X PBS(- XGIBCO社製） = 9:1 (容量比）の溶液をパーコールストックとした。パーコールストックを 1 X PBS(- )(GI BCO社製)で希釈し、パーコールストックの濃度が 30容量％、 70容量 %の溶液を作成した。 30容量 %パーコール溶液にはフエノールレッド (SIGMA社製)を 0.1容量 %力卩えて着色した。容量 15mlの円錐状チューブに、まず 30容量％パーコール溶液を 3ml注ぎ、続、て電動ピぺッターを用いて 30容量％パーコール溶液の下層に 70容量％パーコール溶液を慎重に加えた。続いて、野生型マウス又は GFP発現マウス由来の上記細胞縣濁液 3mlを 30容量％パーコール溶液の上層に慎重に重層した。室温、 1000G 20分で、加速減速を極力遅くして遠心分画した。遠心後、目的の細胞集団は、 30容量 %パ一コール溶液と 70容量 %パーコール溶液の界面に分布して、ることが確認された。また、一番底には血球成分が分布しており、 30容量 %パーコールの上層には主に細胞破砕物が分布してヽることが確認された。パスツールピペットにてまず細胞破砕物を除去した後、別のピペットで界面に存在する目的の細胞集団を容量 50mlの円錐状チユーブに回収した。円錐状チューブに、 DMEM/F12Ham(GIBCO社製)培地を 30mlカロえ、十分に撹拌した後、遠心して上清を除去した。次いで、トリプシン- EDTA(0.05重量⁰ /₀トリプシン、 0.53mM EDTA'4Na含有）（GIBCO社製)溶液 lmlを添カ卩して、 37°C恒温漕内で 10分間震盪し、細胞同士の凝集や結合を解消させた。次いで、トリプシン阻害剤（Roche社製） 500 μ 1を添カ卩し、更に DMEM/F12Ham培地 (GIBCO社製) 8.5ml を添加し、十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。

[0061] (3)スフア一の形成 1

上記（2)で得られた、野生型マウス又は GFP発現マウス由来の心臓組織由来細胞群を、 mouse expansion medium [DMEM/F12Ham (GIBCO社製)、 2重量⁰ /₀B27サプリメント (GIBCO社製)、 1容量％ penicillin-streptomycin^ 40ng/ ml recombinant human ba sic FGF(Promega社製)、及び 20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有]を用いて、細胞培養ディッシュ（noncoat cell culture dish) (Becton Dickinson社製）上で、 37。C、 5 %CO下で 14日間、浮遊培養を行った。なお、培養開始時の細胞濃度は、 2.0 X 10⁴

2

cells/mlになるように設定した。

[0062] 斯くして培養した後、培養液に浮遊して!/ヽるスフエアー（細胞塊）を回収した。

[0063] (4)スフア一の形成 2

参考として、上記 (2)で得られた野生型マウス心臓組織由来細胞群と、上記 (2)で得られた GFP発現マウス心臓組織由来細胞群とを 1： 1の比率で混合して、上記（3)と同様の条件で浮遊培養を行った。

[0064] 培養後の培養液に浮遊するスフエアーを観察した結果を図 1に示す。図 1中、 A、 C 、 E及び Gは蛍光顕微鏡にて撮影した写真を示し、 B、 D、 F及び Hは位相差顕微鏡により撮影した写真を示す。なお、蛍光顕微鏡では GFP発現マウス由来のスフエアーのみが観察され、位相差顕微鏡では野生型マウス及び GFP発現マウスの双方のスフエアーが観察される。 Aと B、 Cと D、 Eと F、 Gと Hは、それぞれ同一の被写体を撮影したものである。 A及び Bの写真から、培養液中に、野生型マウス由来のスフエアーと G FP発現マウス由来のスフエアーが混在していることが確認された。また、 C及び Dの写真には、共に同一形状のスフエアーが観察されていることから、 C及び Dの被写体のスフエアーは GFP発現マウス由来のものであることが確認された。一方、 Eの写真には、スフエアーは撮影されな力つた力 Fの写真にはスフエアーが観察されたことから、 E及び Fの被写体のスフエアーは野生型マウス由来のものであることが明らかである。また、 G及び Hの写真では、相異なる形状のスフエアーが観察されたことから、 G及び Hの被写体のスフエアーは、野生型マウス由来の細胞と GFP発現マウス由来の細胞が混合して形成されたことが明らかとなった。

[0065] (5)スフア一形成細胞の増殖

回収したスフエアーを 2mlの DMEM/F12Ham(GIBCO社製)培地に入れ、よく混合した後に、これを遠心分離 (4°C、 1500rpm、 5分間）して、上清を十分に除去した。次いで、トリプシン- EDTA(0.05重量⁰ /₀トリプシン、 0.53mM EDTA'4Na含有）（GIBCO社製 )溶液 lmlを添加し、 37°C恒温漕内で 20分間震盪することにより、スフエアーを分解して、スフエアーを形成している細胞（以下、スフエアー形成細胞と表記する）を浮遊させた。次いで、トリプシン阻害剤（Roche社製) 500 1を添加し十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。

[0066] 斯くして浮遊させたスフエアー开成細胞を、 mouse expansion medium [DMEM/F12 Ham (GIBCO社製)、 2重量⁰ /₀B27サプリメント (GIBCO社製)、 1容量％ penicillin- strept omycin、 40ng/ ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び 20ng/ml mous e EGF (SIGMA社製)含有]を用いて、培養開始時の細胞濃度を 20cell_S/ 1として、フイブロネクチンコーティング細胞培養ディッシュ上で、 37°C、 5%CO下で 3日間培養

2

を行った。

[0067] (6)スフエアー形成細胞の特徴の確認

上記（5)で増殖させたスフエアー形成細胞につ!、て各種細胞表面抗原 (Sca-1, c- kit、 CD34、 CD45、 CD31、 CD38、 CD90及び CD105)を FACS分析した。得られた結果を図 2に示す。この結果から、得られたスフエアー形成細胞は c-kit陰性、 CD31陰性及び CD34陰性であると共に、 CD105陽性であることが確認された。また、該細胞は、 Sea- 1陽性、 CD45陰性、 CD38陽性、及び CD90陽性であることも確認された。

[0068] 更に、上記（5)で増殖させたスフア一形成細胞について、各種マーカー（Bmi 1、 TERT、 Bcrp 1、 Oct 4、 UTF 1、 Nanog、 Brachyury, Sox 2、 Nestin、及び Islet 1)の発現を、 PCRにより分析した。得られた結果を図 3に示す。この結果、スフエアー形成細胞は、胚性幹細胞のマーカーである Oct 4及び UTF 1の発現が認められないことが確認された。一方、該細胞は、中胚葉系幹細胞のマーカーである Brachyuryや、外胚葉系幹細胞のマーカーである Sox 2及び Nestinの発現が認められた。また、該細胞は、 Bmi 1や TERTを強く発現していることから、自己複製能が高いことが示唆された。

[0069] また、上記（3)で得られたスフエアーをサイトスピンにてスライドに付着させ、ブロモデォキシゥリジン（BrdU)染色を行!、、スフア一形成細胞内の BrdUの有無を確認した。この結果を図 4に示す。図 4から分力るように、スフエアー形成細胞の約半数が Br dU陽性であり、細胞分裂が盛んに起きていることが確認された。

[0070] そして更に、上記（3)で得られたスフエアーにおけるテロメラーゼの発現を分析した。なお、分析には、 5、 10又は 30個のスフエアーをサンプルとして、これを加熱処理（8 5°C、 15分間）をしたもの（heat(+))と加熱処理して、な、もの（heat(-))を使用し、更に対照サンプルとして、テロメァ陽性細胞（positive control)、培地のみ（negative contr ol)、テロメァテンプレート（positive template)についても分析した。得られた結果を図 5に示す。この結果、上記（3)で得られたスフエアーには、テロメラーゼが強く発現しているこが確認された。

[0071] (7)心筋細胞への分化の確認

上記（5)で増殖させたスフエアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を 1 X 1 0 モル /1のデキサメサゾン及び 1容量％のpenicillin-streptomycinを含有する MEM培地（GIBCO社製)で、 37°C、 5%CO下で 21日間培養した。力かる培養により、上記ス

2

フェアー形成細胞が拍動性の心筋細胞に分ィ匕することが確認された。また、培養中の細胞の形態を観察した写真を図 6に示す。図 6に示すように、スフエアー形成細胞は、心筋細胞への分ィ匕過程において同心円状に増殖して分ィ匕することが分力た。なお、心筋細胞への分ィ匕は、下記の分析結果からも確認された。

く心筋特異的トロポニン- 1染色による分析 >

培養 21日後の細胞を心筋特異的トロポニン Iで染色して観察したところ、心筋細胞の存在が確認された（図 7図参照)。

< PCRによる分析 >

PCRにより、分ィ匕誘導開始 21日後において、培養細胞の各種マーカー（Nkx 2.5、 G ATA 4、 ANPゝトロポニン一 I(TnI)、 MLC2v、 MLC2aゝ -MHC( -myosin heavy chain )、 β -MHC( β -myosin heavy chain))の発現を分析した。得られた結果を図 8に示す。この結果、心筋細胞のマーカーである cTnI、及び α - MHCの発現が強く認められることが確認された。

[0072] (8)他の細胞への分化の確認

上記（5)で増殖させたスフア一形成細胞（図 9の Α参照）について、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞への分化能を確認するために、下記の方法で分ィ匕誘導を行った。

[0073] (8 - 1)平滑筋細胞への分ィ匕

上記（5)で増殖させたスフエアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を、 I X 10 ⁸ Mのデキサメサゾンを含む MEM培地（GIBCO社製）で、 37°C、 5%CO下で 14

2 日間培養した。培養後の細胞を a -SMA ( a -smooth muscle actin)を用いて染色して観察したところ、平滑筋細胞の存在が確認された（図 9の B参照)。

[0074] (8— 2)血管内皮細胞への分ィ匕

上記（5)で増殖させたスフエアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を 1 X 1 0— ⁸Mのデキサメサゾンを含む MEM培地（GIBCO社製）で、 37°C、 5%CO下で 14日

2 間培養した。培養後の細胞を CD31を用いて染色して観察したところ、 CD31陽性の血管内皮細胞の存在が確認された（図 9の C参照)。

[0075] (8- 3)脂肪細胞への分ィ匕

上記（5)で増殖させたスフエアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を 1 X 1 0 ⁸ Mのデキサメサゾンを含む MEM培地（GIBCO社製）で、 37°C、 5%CO下で 14日

2 間培養した。培養後の細胞に対して on-red染色を行って観察したところ、 on-red陽性の脂肪細胞の存在が確認された（図 9の D参照)。

[0076] (8— 4)グリア細胞への分化

2 間培養した。培養後の細胞の形態的特徴を観察したところ、グリア細胞の存在が確認された（図 9の E参照)。

[0077] (8— 5)上皮細胞への分ィ匕

2 間培養した。培養後の細胞の形態的特徴を観察したところ、上皮細胞の存在が確認された（図 9の F参照)。

[0078] (9) ¾

以上に示す実施例 1の結果から、得られたスフエアー形成細胞は、自己複製能と共に、各種細胞に分化する特性を備えており、多能性幹細胞であることが明らかとなつた。

[0079] 実施例 2

マウス由来心筋幹細胞の移植

上記実施例 1で得られた GFP発現マウス由来のスフエアー形成細胞（多能性幹細胞）を、 mouse expansion medium [DMEM/F12Ham (GIBCO社製)、 2重量⁰ /₀B27サプリメン KGIBCO社製)、丄谷量％ penicillin— streptomycin、 40ng/ ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び 20ng/ml mouse EGF (SIGMA社製)含有]で培養して増殖させた。次、で、増殖させた幹細胞 (約 1 X 10⁶cells)を、 15 μ 1の PBS(-)(GIBCO 社製)に懸濁し、これを、 BD Ultra Fine IIランセット (Becton Dickinson社製)を用いて、 10〜12週齢の NOD/SCIDマウス（Jackson Laboratoryより購入）に作成した梗塞心筋に移植した。幹細胞の移植 21日後に、マウス力も心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋につ \ヽて、緑色蛍光 (GFP)発色する幹細胞のホスト心筋への生着を確認した（図 10の A図参照）。また、図 10の A図と同一視野において、 cTnT染色（赤色として認識される）を行った（図 10の B図参照）。図 10の A及び B図を重ね合わせると、幹細胞の存在（緑色）と、 cTnl発現の存在（赤色）が重なっており（図 10の C及び D図参照）、移植した心臓組織由来の幹細胞が心筋細胞に分ィ匕し、心臓の修復に寄与していることが確認された。

[0080] 実施例 3

ヒト由来多能性幹細胞の取得及び該幹細胞の各種細胞への分化誘導

ヒトから採取した心臓組織片を用いて、上記実施例 1に記載の「（1)細胞懸濁液の調製」及び「（2)パーコールの密度勾配遠心法による心臓組織由来細胞群の分離」の方法に従って、ヒト心臓組織由来の細胞群を分離した。

[0081] 次いで、得られた細胞群を用いて、上記実施例 1に記載の「（3)スフエアーの形成

1」の方法に従って培養を行、、スフエアーを形成させた。培養 1日後及び 7日後に培養液中に浮遊してヽるスフエアーを撮影した顕微鏡写真を図 11に示す。培養後、スフエアーを回収することにより、ヒト心臓組織由来のスフエアー形成細胞（多能性幹細胞)を取得した。

[0082] 回収したスフエアー形成細胞を、上記実施例 1に記載の「（5)スフエアー形成細胞の増殖」の方法に従って培養を行、増殖させた。培養後のスフエアー形成細胞について、各種マーカー（Rex 1、 TERT、 Oct 4、 Nanog、 Brachyury, Sox 2)の発現を、 PC Rにより分析した。得られた結果を図 12に示す。この結果から、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞は、外胚葉系幹細胞や胚性幹細胞と同様の分化特性を備えてヽることが確認された。

[0083] また、増殖させたスフエアー形成細胞にっ、て各種細胞表面抗原（c-kit、 CD34、 C D90及び CD105)について分析した。分析結果を図 13に示す。この結果から、ヒト由来のスフエアー形成細胞は、 C- kit陰性、 CD34陰性、 CD90陽性及び CD 105陽性であることが確認された。 [0084] 心筋細胞への分化

増殖させたスフア一形成細胞を、上記実施例 1に記載の「（7)心筋細胞への分化の確認」の方法に従って、心筋細胞への分化誘導を行った。これによつて、ヒト心臓組織由来のスフエアー形成細胞が、拍動する心筋細胞に分化することが確認された。なお、心筋細胞への分ィ匕は、下記の分析結果からも確認された。

くヒト心筋特異的トロポニン— T染色による分析〉

分ィ匕誘導後の細胞をヒト心筋特異的トロポニン— Tで染色して観察したところ、心筋細胞の存在が確認された（図 14図参照)。

< PCRによる分析 >

分化誘導開始 21日後の細胞について、各種マーカー（Nkx-2.5、 GATA4、 ANP、 — ca— actinゝ TnTゝ MLC2v、 MLC2aゝ — MHC( -myosin heavy chain), β— MHC( β -myosin heavy chain), β actin)の発現を、 PCRにより分析した。得られた結果を図 15 に示す。図 15から分かるように、デキサメサゾンの存在下で培養することによって、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフエアー形成細胞が心筋細胞に分ィ匕したことが確認された。

[0085] 率滑筋細胞への分化

増殖させたスフア一形成細胞を、上記実施例 1に記載の「（8— 2)血管内皮細胞への分化」の方法に従って、分化誘導を行った。これによつて、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞力平滑筋細胞に分化することが確認された。なお、心筋細胞への分ィ匕は、下記の分析結果からも確認された。

く顕微鏡による分析〉

分ィ匕誘導後の細胞について、 α -SMAを染色して観察したところ、平滑筋細胞の存在が確認された（図 16図参照)。

< PCRによる分析 >

分化誘導開始 21日後の細胞について、各種マーカー（SM- 22 α及び calponin)の発現を、 PCRにより分析した。得られた結果を図 17に示す。図 17から分力るように、分ィ匕誘導後には、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフエアー形成細胞が平滑筋細胞に分化したことが確認された。 [0086] 血管内皮細胞への分化

増殖させたスフエアー形成細胞を、上記実施例 1に記載の「 (4)他の細胞への分化の確認」の方法に従って、内皮細胞への分化誘導を行った。これによつて、ヒト心臓組織由来のスフエアー形成細胞が、血管内皮細胞に分化することが確認された。なお、血管内皮細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。

く顕微鏡による分析〉

分ィ匕誘導後の細胞について、 CD31を染色して観察したところ、内皮細胞の存在が確認された（図 18図参照)。

< PCRによる分析 >

分化誘導後の細胞について、各種マーカー（CD31及び VEGF-R2)の発現を、 PCR により分析した。得られた結果を図 19に示す。図 19から分かるように、分化誘導後には、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフエアー形成細胞が血管内皮細胞に分ィ匕したことが確認された。

[0087]

以上に示す実施例 3の結果から、得られたヒト由来スフエアー形成細胞は、自己複製能と共に、各種細胞に分化する特性を備えており、多能性幹細胞であることが確 f*i¾ れ。

[0088] 実施例 4

ヒト由来心筋幹細胞の移植

上記実施例 3で得られたヒト心臓組織由来スフエアー形成細胞（多能性幹細胞）を、 human expansion medium[DMEM/F12Ham(tjIBC〇社製)、 1谷量％ penicillin— strept omycin、 40ng/ ml recombinant human basic FGF(Promega社製)、及び 20ng/ml huma n EGF(SIGMA社製)含有]で培養して増殖させた。次いで、増殖させたヒト心臓組織由来多能性幹細胞 (約 1 X 10⁶cells)を、上記実施例 2と同様の方法で虚血心筋マウスに移植した。心筋幹細胞の移植 21日後に、マウスから心臓を摘出した。摘出した心臓の心筋にっ、て、細胞内の核を DAPI (4'6-diamino-2-phenylindole)を用いて青色に染色し、更にスフエアー形成細胞力分ィ匕した心筋細胞をヒト心筋特異的トポロニン— Tを用いて赤色に染色した。この結果、菲薄化した梗塞巣内に移植したヒト心臓組織由来細胞が遊走し生着しており、主に心内膜側に新たな心筋細胞が再生されていることが確認された（図 20の A—E参照)。また、摘出した心臓について、併せて、 CD31の染色を行ったところ、ヒト心臓組織由来細胞が血管内皮細胞にも分ィ匕して生着してヽることが確認された（図 20の F参照）。

Claims

請求の範囲

[I] 下記工程を経て調製される、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞を調製する方法：

[2] 多能性幹細胞が、 c-kit陰性、 CD31陰性及び CD34陰性である、請求項 1に記載の調製方法。

[3] 多能性幹細胞が、更に CD105陽性である、請求項 2に記載の調製方法。

[4] 多能性幹細胞がヒト由来である、請求項 1に記載の調製方法。

[5] 多能性幹細胞が、少なくとも心筋細胞に分ィ匕する能力を有するものである、請求項 1に記載の調製方法。

[6] 多能性幹細胞が、心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞

、及び上皮細胞よりなる群力選択される 1種又は 2種以上の細胞に分ィ匕する能力を有するものである、請求項 1に記載の調製方法。

[7] 請求項 1乃至 6のいずれかに記載の調製方法によって得られる、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。

[8] c-kit陰性、 CD31陰性及び CD34陰性である、ほ乳動物の心臓組織由来の多能性幹細胞。

[9] CD105陽性である、請求項 8に記載の幹細胞。

[10] ほ乳動物がヒトである、請求項 8に記載の幹細胞。

[II] 少なくとも心筋細胞に分ィ匕する能力を有する多能性幹細胞である、請求項 8に記載の幹細胞。

[12] 心筋細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞、グリア細胞、及び上皮細胞よりなる群から選択される 1種又は 2種以上の細胞に分化する能力を有する多能性幹細胞である、請求項 8に記載の幹細胞。

[13] 請求項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞の治療有効量を、患者の組織又は臓器に移植することを特徴とする、組織又は臓器の疾患の治療方法。

[14] 心疾患の治療方法である、請求項 13に記載の治療方法。

[15] 心疾患の治療方法であって下記工程を含有する、請求項 13に記載の治療方法： (0ヒトから採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程

(iv)上記工程 (iii)で分離した細胞を増殖させる工程、及び

[16] 請求項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、組織又は臓器の疾患の治療用組成物。

[17] 請求項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞、及び薬学的に許容される担体を含有する、心疾患の治療用組成物。

[18] 請求項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞の、心疾患の治療用組成物を調製するための使用。

[19] 請求項 8乃至 12のいずれかに記載の幹細胞の、組織又は臓器の疾患の治療用組成物を調製するための使用。