WO2006072335A1 - Verfahren zum einfrieren und lagern von zellen - Google Patents

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WO2006072335A1
WO2006072335A1 PCT/EP2005/013170 EP2005013170W WO2006072335A1 WO 2006072335 A1 WO2006072335 A1 WO 2006072335A1 EP 2005013170 W EP2005013170 W EP 2005013170W WO 2006072335 A1 WO2006072335 A1 WO 2006072335A1
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vessel
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freezing
frozen
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Alexander Loa
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Ccs Cell Culture Service Gmbh
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    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
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    • A01N1/02—Preservation of living parts

Definitions

  • the invention relates to a method for freezing and storing cells in a vessel.
  • the invention relates to frozen cells in a freezing medium in a vessel.
  • cryoprotective substances such as glycerol or DMSO are usually added to the freezing medium
  • cryotubes e.g. B. through a polystyrene box with a suitable wall thickness achieved. So frozen cells are only for a short period of approx. 2 to 4 months.
  • the invention has for its object to provide a method which makes it possible to provide cells for use in cell-based assays in the appropriate vessels in sufficient numbers and consistent quality available and long-term.
  • the invention achieves this object by providing a method according to claim 1, comprising the following steps: a) freezing the cells to a storage temperature b) storing at this storage temperature,
  • the storage taking place under gas-tight closure and / or under partial pressure of oxygen reduced relative to the atmospheric pressure.
  • the term "cell” may refer to a eukaryotic cell, that is to say a cell with a genuine cell nucleus, as well as a number of characteristic differentiations of the cytoplasm, Such a eukaryotic cell may be of animal or human origin in the context of the invention.
  • a vessel may be a "well” (cavity) of a multiwell plate, or may also mean the entirety of the plate.
  • the term "storage temperature” means according to the invention the temperature at which the cells are stored, preferably in a freezer. The cells can be stored at this storage temperature for at least one month to more than 12 months.
  • gas-tight closure is understood to mean a closure of the vessel in which the cells are frozen, which have an oxygen partial pressure which is reduced in relation to the atmospheric pressure in the vessel. can hold upright, or can hold inert gas in the vessel.
  • atmospheric pressure is understood to mean the total air pressure of the surrounding atmosphere consisting of air, which is 1 bar.
  • the "oxygen partial pressure” is the partial pressure of the oxygen in gaseous form at a total pressure of an atmosphere consisting of air. In an atmosphere of air having a pressure of 1 bar, the oxygen partial pressure is 0.21 bar.
  • multiwell plate is understood according to the invention to mean a plate made of a suitable material, for example polystyrene, which may have a plurality of "wells” (cavities) for accommodating the cells in culture medium.
  • a plate may have 6, 12, 24, 48, 96, 384 or even 1,536 such wells.
  • a measure of the thermal conductivity of a substance is the coefficient of thermal conductivity.Metals have a high thermal conductivity compared to, for example, glass. The heat conduction always runs from regions of higher temperature to those of lower temperature.
  • high throughput screening means testing a variety of substances, cells or the like in a relatively short period of time.
  • a cell-based assay the effect of substances, cells or the like on cells in the wells of a suitable vessel, preferably a multiwell plate, can be tested. This can be preferred wise happen with a variety of substances or cells or the like with a high throughput.
  • freeze drying medium includes solutions suitable for protecting living cells from freezing damage during the freezing process Such solutions may include culture medium and cryoprotective substances
  • Cell-based assay in the context of the invention means an assay ("assay") in which living cells can be used. These cells, after thawing in the wells of the appropriate vessel, can be used directly in this experiment, allowing the cell-based assay to be performed in the wells of this vessel.
  • the term "vitality” means the percentage of living cells of a vessel to be tested, for example a multiwell plate, in comparison to cells of a vessel which has not been frozen, the "control vessel", for example a multiwell plate, as a reference.
  • the determination of the proportion of living cells can be carried out either by staining the cell nucleus (color exclusion test, Thumm W., Z. Krebsforsch., 60 (1): 91-93, 1954), or by a test for metabolic activity (Glass R. H., S. A. Ericsson et al., Fertil. Sterile. 56 (4): 743-746, 1991).
  • the invention has shown that a method of the type mentioned at the outset is particularly suitable for providing cells for use in cell-based assays in the corresponding vessels in a sufficient number and with consistent quality and for long-term availability.
  • the invention relates to a method for freezing and storing cells in a vessel with the steps:
  • the storage takes place under gas-tight closure and / or under reduced relative to atmospheric pressure oxygen partial pressure.
  • cells from a cell culture in exponential growth phase are used. Before harvesting, preferably just enough cells are in the vessel that the bottom of the vessel is uniformly covered. For a well of a 96-well plate, these are preferably 80 to 200 .mu.l, preferably 85 to 190 .mu.l, particularly preferably 93 to 188 .mu.l culture medium with cells per cm 2 surface.
  • the cells can be resuspended at a cell density of preferably 0.055 ⁇ 10 6 cells, particularly preferably 0.1 ⁇ 10 6 cells per ml, in freezing medium.
  • the freezing medium may contain culture medium, as well as a cryoprotectant.
  • the cryoprotectant may be glycerol or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the final concentration of the cryoprotectant can be 1 to 20 vol. %, preferably 2 to 15 vol. %, more preferably 4 to 10 vol. %.
  • suitable freezing media are a mixture of 95% DMEM (Dulbecco's Modified Eagels Medium) complete medium, 5% glycerol, and 95% DMEM complete medium, 5% DMSO, using complete medium of DMEM, 4 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate and 10% fetal calf serum (FCS).
  • the culture medium used in the freezing medium may also be a different medium than DMEM. Any other medium common in cell culture can be used, such as RPMI or neurobasal medium.
  • a salt solution may also be used in the freezing medium, such as HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) or other common salt solutions.
  • the cells resuspended in freezing medium can be frozen for at most 60 minutes, preferably at most 45 minutes, more preferably at most 30 minutes after resuspension.
  • the reduction of the oxygen partial pressure can by
  • the reduction of the oxygen partial pressure may preferably take place before freezing.
  • the oxygen partial pressure in the vessel can be reduced to 52.5 mbar to 0.21 mbar, preferably to 26 mbar to 0.21 mbar, particularly preferably to 13 mbar to 0.21 mbar.
  • a suitable vessel can be closed with a lid and vacuum-sealed in a tubular film, preferably made of polyethylene.
  • the vessel can be carefully pushed into the tube, which can then be closed on one side.
  • a commercially available welding device the remaining air-acid substance can now be sucked out of the foil packaging as far as possible and the film to be welded.
  • a welding device can be, for example, a Folio vacuum welding device.
  • suitable vessels may be frozen under the same conditions, but without oxygen partial pressure reduced from atmospheric pressure.
  • a residual volume of air relative to atmospheric pressure remain in the vessel, which particularly preferably up to 17, 5-fold, preferably up to 15-fold, further preferably up to 7-fold, further preferably equal the volume of the cell suspension in the vessel may be.
  • a vessel may be a multiwell plate, preferably a 96-well plate.
  • a 96-well plate can remain at a volume of 25 .mu.l cell suspension per well after gas-tight completion of a residual volume of air relative to the atmospheric pressure in the 96-well plate, which particularly preferably up to the 17, 5 times the volume of Cell suspension can be.
  • the protective gas used can be selected from the group consisting of nitrogen, helium and argon.
  • the cells that are frozen by the method of the invention may be eukaryotic cells.
  • the cells which are frozen by the method may be of animal or human origin.
  • these cells could be murine cells, hamster cells, monkey cells or pig cells.
  • the cells that are frozen by the method can still be established cell lines, but also primary or secondary cells.
  • the cells that are frozen by the method may still be adherent cells, or cells that grow in suspension.
  • the cells with frozen in the process may further include a variety of cell types. These cell types can be selected from the group consisting of cells of ectodermal origin, mesodermal origin, endodermal origin and germ cells.
  • These cell types may be further selected from the group consisting of fibroblasts, epithelial cells, hematopoietic and neuronal cells.
  • these cells may be L-292 mouse fibroblasts, He-La cells or HCT-116 cells.
  • the cells can be frozen at the storage temperature with a cooling rate of at least 20 0 C per minute, preferably at least 40 ° C per minute, more preferably at least 64 5 ° C per minute, more preferably at least 80 0 C per minute amount may ,
  • the cooling rate according to the invention allows a rapid cooling and falling below the freezing point of the cell suspension in the vessels compared to the prior art.
  • a particularly preferred cooling rate may be 64.5 ° C per minute.
  • the storage temperature can not lower than - 85 ° C, particularly preferably not lower than - 65 ° C, further preferably not lower than - 60 0 C, further preferably not lower than - 50 0 C to be.
  • the storage temperature can be maintained in a freezer.
  • a particularly preferred storage temperature can not be lower than -65 ° C.
  • the freezing can be accomplished by contacting at least one surface of the vessel with a material of suitable (high) thermal conductivity which has been precooled to an appropriate temperature.
  • the material of suitable thermal conductivity may be a metal.
  • the suitable temperature may be between -90 ° C and -50 ° C, preferably between -85 ° C and -65 ° C.
  • the storage of the cells can take place without the use of liquid nitrogen.
  • the storage can take place in a freezer.
  • the vessel may be selected from the group consisting of multiwell plate, cell culture dish and cell culture flask.
  • the multiwell plate can be selected from the group consisting of 6-well, 12-well, 24-well, 48-well, 96-well, 384-well and 1 536-well plate.
  • the invention furthermore relates to frozen cells in freezing medium in a vessel under gas-tight closure and / or under reduced partial pressure of oxygen relative to the atmospheric pressure.
  • the oxygen partial pressure in the vessel may be 52.5 mbar to 0.21 mbar, preferably 26 mbar to 0.21 mbar, particularly preferably 13 mbar to 0.21 mbar.
  • the frozen cells can be used directly after thawing in freezing medium in the vessel without passengers for a cell-based assay. This can be done without washing, culturing or passing the cells to another culture vessel. About 1 to 8 hours after thawing at 37 ° C, preferably in a suitably tempered cell incubator with appropriate C0 2 atmosphere, culture medium may be added to the cells in the wells of the vessel. In the process, the freezing medium surrounding the cells is diluted. Preferably this may be a 1: 1 dilution. After the addition of culture medium, the cells can be used directly in the vessel for a cell-based assay. This can be done without washing, culturing or passing the cells into another vessel. In the subsequent cell-based assay, controls with and without the solvent used as cryoprotective may be performed in the appropriate percentage to detect any effect of the solvent on the assay.
  • the cell-based assay can be carried out in the form of a high-throughput screening (HTS).
  • HTS high-throughput screening
  • the effect of substances, cells or the like on cells in the wells of a vessel, preferably a multi-well plate, can be tested. This is preferably done with a variety of substances or cells with a preferably high throughput rate.
  • the substances tested may preferably be pharmacologically active substances.
  • the tested substances may furthermore preferably be ligands for cellular receptors.
  • the substances tested can particularly preferably influence the gene expression of the cells in the wells.
  • the cells tested can have an effect on the cells in the wells.
  • One or more substances or cells per well can be tested.
  • the frozen cells can at a storage temperature lower or equal to -65 ° C for at least 1 month, preferably more than 2 months, more preferably more than 4 months, more preferably more than 12 months a vitality of over 70%, preferably over 80%, more preferably over 95% of the vitality of cells of a non-frozen have a control vessel.
  • Vitality can be determined in a large vessel from which the cells can be readily completely removed by a color exclusion test known in the art (Thumm W., Z. Krebsforsch., 60 (1): 91-93, 1954). In small vessels, from which the frozen cells can not be taken reliably for the determination, the vitality test can be carried out indirectly by measuring the metabolic activity of the cells.
  • a substrate, e.g. B. Resazurin is added to the cells and reduced by metabolically active cells.
  • DMEM Culture Medium (Dulbecco's Modified Eagels Medium)
  • FCS Fetal Calf Serum
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • L-292 mouse fibroblasts were cultured according to the ATCC standard protocol in DMEM complete medium (DMEM, 4 ml of L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate, 10% FCS until sufficient cell count was available to freeze the cells The culture supernatant was poured off and the cell lawn was washed once with PBS.On 25 cm 2 surface, 1 ml trypsin / EDTA was applied to the DMEM complete medium (DMEM, 4 ml of L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate, 10% FCS until sufficient cell count was available to freeze the cells The culture supernatant was poured off and the cell lawn was washed once with PBS.On 25 cm 2 surface, 1 ml trypsin / EDTA was applied to the
  • the cells could be stored under these conditions for 1, 5 years and thawed in the 96-well plates with a quality of over 90%. When the cells were frozen without vacuum, their shelf life was limited to 2 to 4 months. Vitality determination was carried out directly in the 96-well plate by means of the reduction of resazurin (Glass R.H., S.A. Ericsson et al., Feril. Sterile. 56 (4): 743-746, 1991).
  • the cells could be stored under these conditions for 12 months and thawed in the 96-well plates with a vitality of over 90% of a non-frozen plate. In contrast, the vitality of the non-treated control plate was just over 20%.
  • FIG. 1 shows the result of the experiment of Example 1.
  • Example 2
  • the cell line HCT-116 was frozen by the method according to the invention.
  • HCT-116 cells were frozen in freezing medium with DMSO (95% DMEM complete medium, 5% DMSO) and with glycerol (95% DMEM complete medium, 5% glycerol) in 96-well plates.
  • the frozen cells were thawed again after 12 months and their cell activity was determined by reduction of the dye resazurin. Cell activity is reported as relative signal strength in [U].
  • the Z-factor is used in the prior art.
  • the z-factor is a statistical quantity calculated from the means and standard deviations of the measured values.
  • An ideal assay has a Z factor that is around 1. Between 1 and 0.5, assays are well feasible. If the Z-factor drops below 0, 5, the separation range between control and sample becomes too small, so that a clear distinction of cell activity is no longer possible.
  • FIG. 2 shows graphically the result of Example 2.
  • FIG. 3 shows the raw data of Example 2.
  • HeLa cells were in 96-well plates according to the invention Frozen method, thawed again after 13 months and then the IC 50 value of Na 2 SeO 3 determined.
  • Na 2 SeO 3 was added to the cells in twelve dilution stages. The dilutions were chosen such that the concentration of Na 2 SeO 3 that kills 50% of the cells is in the middle of the concentration range tested.
  • the plotted values are the means of a quadruple determination. After incubation of the test substance of 48 hours at cell culture conditions (37 0 C, 5% CO 2 and high humidity), the viable cell count was determined by the metabolic activity of living cells.
  • Resazurin has been used in this process, which is reduced in the mitochondria of metabolically active, living cells and thereby transforms into the fluorescein-active resofurin.
  • concentration at which only 50% of the cell activity can be detected indicates the IC 5 o value.
  • FIG. 4 shows the result of Example 3.
  • the examples show that the method according to the invention is particularly well suited to provide cells for use in cell-based assays in the corresponding vessels in sufficient numbers and consistent quality and to provide them over the long term.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in einem Gefäß mit den Schritten a) Einfrieren der Zellen auf eine Lagertemperatur und b) Lagern bei dieser Lagertemperatur, dadurch gekennzeichnet, dass das Lagern unter gasdichtem Abschluss und / oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck erfolgt. Die Erfindung betrifft weiterhin eingefrorene Zellen in Einfriermedium in einem Gefäß unter gasdichtem Abschluss und / oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck vermindertem Sauerstoffpartialdruck.

Description

Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in einem Gefäß .
Ferner betrifft die Erfindung eingefrorene Zellen in' Einfriermedium in einem Gefäß .
Das Einfrieren von Zellen ist ein gängiges Verfahren in zellbiologisch arbeitenden Laboratorien ( Parkes A. S . ,
Proc . R. Soc . Lond. B . Biol . Sci . 147 ( 929) : 424-426, 1957 ) . Um die schädlichen Einflüsse des Einfrierens, die vorwiegend durch die Bildung von Eiskristallen hervorgerufen werden, zu verhindern, werden üblicherweise dem Einfriermedium kry- oprotektive Substanzen wie Glyzerin oder DMSO zugesetzt
(Pomerat C M. und P . S . Moorhead, Tex . Rep . Biol . Med. 14 (2 ) : 237-253 , 1956; Bouroncle B . A. , Proc . Soc . Exp . Biol . Med. 119 ( 4 ) : 958-961 , 1965 ; Murthy S . S . , Cryobiology 36 (2 ) : 84-96, 1998 ) . Die in Einfriermedium suspendierten Zellen werden in Kryoröhrchen langsam mit einer Abkühlrate von ca . 1°C pro
Minute bis auf - 80°C eingefroren . Das langsame Abkühlen wird durch eine individuelle Isolierung der Kryoröhrchen, z . B . durch eine Polystyrolbox mit geeigneter Wandstärke, erreicht . So eingefrorene Zellen sind nur für einen kurzen Zeitraum von ca . 2 bis 4 Monaten haltbar .
Für eine Langzeitkonservierung bei Tiefsttemperaturen muß die Überführung der Proben in flüssigen Stickstoff (- 196°C) oder in dessen Gasphase ( - 1500C bis - 1600C) erfolgen, wo theoretisch eine unbegrenzte Haltbarkeit der eingefrorenen Zellen gegeben ist (Lindl T . , Zell- und Gewebekultur, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, 4 : 110-113 , 2000 ) .
Tierische und menschliche Zellen finden in zeilbasierten Assays im Hochdurchsatzscreening ( „high throughput Screening" , HTS ) Anwendung . Hierfür ist nach dem Stand der Technik eine kontinuierliche Anzucht der Zellen erforderlich, so dass regelmäßig ausreichend Zellen in gleichbleibender Qualität zur Verfügung stehen und in die für die Assays verwendeten Gefäße, in der Regel Multiwellplatten, ausgesät werden können . Es ist j edoch bisher nicht möglich, Zellen in den Gefäßen vorzubereiten, in dieser Form bei -800C langfristig zu lagern und so in beliebiger Menge für den Assay vorzuhalten . Die Haltbarkeit von Zellen, die bei
-800C eingefroren sind, ist auf 2 bis 4 Monate beschränkt . Auch ist die Lagerung von Multiwellplatten und anderen Gefäßen in flüssigem Stickstoff technisch nur schwierig und mit hohem Platzbedarf zu realisieren . Darüber hinaus erschwert die Notwendigkeit, ein wie oben beschriebenes langsames Einfrieren der Zellen herbeizuführen, die Verarbeitung einer großen Anzahl von Gefäßen .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, das es ermöglicht, Zellen für den Einsatz in zeilbasierten Assays in den entsprechenden Gefäßen in ausreichender Anzahl und gleichbleibender Qualität zur Verfügung zu stellen und langfristig vorzuhalten .
Die Erfindung löst diese Aufgabe dadurch, dass sie ein Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Verfügung stellt, das folgende Schritte aufweist : a) Einfrieren der Zellen auf eine Lagertemperatur b) Lagern bei dieser Lagertemperatur,
wobei das Lagern unter gasdichtem Abschluss und / oder un- ter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoff- partialdruck erfolgt .
Zunächst seien einige der im Rahmen der Erfindung verwendeten Begriffe erläutert .
Der Begriff „Zelle" kann erfindungsgemäß eine eukaryotische Zelle bezeichnen, also eine Zelle mit echtem Zellkern, sowie einer Reihe charakteristischer Differenzierungen des Zytoplasmas . Eine solche eukaryotische Zelle kann im Rahmen der Erfindung tierischen oder menschlichen Ursprungs sein .
Wenn im Rahmen der Erfindung der Begriff „Gefäß" verwendet wird, dann kann ein solches Gefäß ein „Well" (Kavität ) einer Multiwellplatte sein, oder auch die Gesamtheit der Platte meinen . Ebenso werden unter dem Begriff „Gefäß" aber auch andere in der Zellkultur üblichen Gefäße, wie beispielsweise Zellkulturschalen oder Zellkulturflaschen einer Reihe von Größen verstanden, die für die Kultivierung von Zellen geeignet sind .
Der Begriff „Lagertemperatur" meint erfindungsgemäß die Temperatur, bei der die Zellen, vorzugsweise in einem Tiefkühlschrank, gelagert werden . Die Zellen können bei dieser Lagertemperatur für mindestens einen Monat bis mehr als 12 Monate gelagert werden .
Unter dem Begriff „gasdichter Abschluss" wird im Rahmen der Erfindung ein Verschluß des Gefäßes verstanden, in dem die Zellen eingefroren werden, der einen gegenüber dem Atmo- Sphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck in dem Ge- fäß aufrecht erhalten kann, oder Schutzgas in dem Gefäß halten kann .
Unter dem Begriff „Atmosphärendruck" wird im Rahmen der Er- findung der Gesamtluftdruck der umgebenden Atmosphäre bestehend aus Luft verstanden, der 1 bar beträgt .
Der „Sauerstoffpartialdruck" ist erfindungsgemäß der Teildruck des Sauerstoffs in gasförmiger Form an einem Gesamt- druck einer Atmosphäre bestehend aus Luft . In einer Atmosphäre aus Luft , die einen Druck von 1 bar aufweist, beträgt der Sauerstoffpartialdruck 0 , 21 bar .
Unter dem Begriff „Multiwellplatte" wird erfindungsgemäß eine Platte aus einem geeigneten Material verstanden, etwa Polystyren, die mehrere „Wells" (Kavitäten) zur Aufnahme der Zellen in Kulturmedium aufweisen kann . Eine solche Platte kann 6, 12 , 24 , 48 , 96, 384 oder auch 1 536 solcher Wells aufweisen .
Im Rahmen der Erfindung wird der Begriff
„Wärmeleitfähigkeit" gemäß seiner bekannten physikalischen Definition verstanden . Ein Maß für die Wärmeleitfähigkeit eines Stoffes ist die Wärmeleitzahl . Metalle haben eine ho- he Wärmeleitfähigkeit verglichen mit z . B . Glas . Die Wärmeleitung verläuft immer von Bereichen höherer Temperatur zu denen niedrigerer Temperatur .
Der Begriff „Hochdurchsatzscreening" ( „high throughput Screening" , HTS ) meint ein Testen einer Vielzahl von Stoffen, Zellen oder dergleichen in einem relativ kurzen Zeitraum. Dabei kann beispielsweise in einem zellbasierten As- say der Effekt von Stoffen, Zellen oder dergleichen auf Zellen in den Wells eines geeigneten Gefäßes , vorzugsweise einer Multiwellplatte, getestet werden . Dies kann Vorzugs- weise mit einer Vielzahl von Stoffen oder Zellen oder dergleichen mit einer hohen Durchsatzrate geschehen .
Der Begriff „Einfriermedium" umfasst Lösungen, die geeignet sind, lebende Zellen während des Einfriervorgangs vor Gefrierschaden zu schützen . Solche Lösungen können Kulturmedium und kryoprotektive Substanzen
( „Kryoprotektiva" ) enthalten, die Lösungsmittel wie Di- methylsulfoxid ( DMSO) oder Glyzerin sein können . Unter dem Begriff „zeilbasierter Assay" wird im Rahmen der Erfindung ein Versuch ( „Assay" ) verstanden, in dem lebende Zellen eingesetzt werden können . Diese Zellen können nach dem Auftauen in den Wells des geeigneten Gefäßes direkt in diesem Versuch verwendet werden . Damit kann der zellbasier- te Assay in den Wells dieses Gefäßes durchgeführt werden .
Der Begriff „Vitalität" meint erfindungsgemäß den prozentualen Anteil an lebenden Zellen eines zu testenden Gefäßes , beispielsweise einer Multiwellplatte, im Vergleich zu ZeI- len eines nicht eingefrorenen Gefäßes , dem „Kontrollgefäß" , beispielsweise eine Multiwellplatte, als Referenz . Hierbei kann die Bestimmung des Anteils an lebenden Zellen entweder durch eine Färbung des Zellkerns erfolgen ( Farbausschlusstest , Thumm W . , Z . Krebsforsch . 60 ( 1 ) : 91-93 , 1954 ) , oder durch einen Test auf metabolische Aktivität (Glass R. H . , S .A. Ericsson et al . , Fertil . Steril . 56 ( 4 ) : 743-746, 1991 ) .
Die Erfindung hat gezeigt, dass ein Verfahren der eingangs genannten Art ganz besonders dazu geeignet ist, Zellen für den Einsatz in zeilbasierten Assays in den entsprechenden Gefäßen in ausreichender Anzahl und gleichbleibender Qualität zur Verfügung zu stellen und langfristig vorzuhalten .
Im folgenden sei die Erfindung genauer beschrieben . Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in einem Gefäß mit den Schritten :
a) Einfrieren der Zellen auf eine Lagertemperatur b) Lagern bei dieser Lagertemperatur,
dadurch gekennzeichnet, dass das Lagern unter gasdichtem Abschluss und / oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck erfolgt .
Zum Einfrieren der Zellen werden vorzugsweise Zellen aus einer Zellkultur in exponentieller Wachstumsphase verwendet . Vor dem Ernten sind vorzugsweise gerade soviel Zellen in dem Gefäß , dass der Boden des Gefäßes gleichmäßig bedeckt ist . Bei einem Well einer 96-well Platte sind dies vorzugsweise 80 bis 200 μl, bevorzugt 85 bis 190 μl , besonders bevorzugt 93 bis 188 μl Kulturmedium mit Zellen pro cm2 Oberfläche .
Nach dem Ernten können die Zellen mit einer Zelldichte von vorzugsweise 0 , 05 - 10 x 106 Zellen, besonders bevorzugt 0 , 1-5 x 106 Zellen pro ml in Einfriermedium resuspendiert werden . Das Einfriermedium kann Kulturmedium, sowie ein Kryoprotektivum enthalten . Das Kryoprotektivum kann Glyzerin oder Dimethylsulfoxid ( DMSO) sein . Die Endkonzentration des Kryoprotektivums kann 1 bis 20 Vol . % , bevorzugt 2 bis 15 Vol . % , besonders bevorzugt 4 bis 10 Vol . % betragen . Beispiele für geeignete Einfriermedien sind eine Mischung aus 95 % DMEM ( Dulbecco' s Modified Eagels Medium) Komplettmedium, 5 % Glyzerin, sowie aus 95 % DMEM Komplettmedium, 5 % DMSO, wobei Komplettmedium aus DMEM, 4 mM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat und 10 % fötalem Kälberserum ( FCS ) bestehen kann . Das im Einfriermedium verwendete Kulturmedium kann auch ein anderes Medium als DMEM sein . Es kann auch j edes andere in der Zellkultur übliche Medium verwendet werden, wie beispielsweise RPMI oder auch Neurobasalmedium. Anstelle eines Zellkulturmediums kann in dem Einfriermedium auch eine Salzlösung verwendet werden, wie beispielsweise HBSS (Hank' s Balanced Salt Solution) oder andere übliche Salzlösungen .
Die in Einfriermedium resuspendierten Zellen können höchstens 60 min, bevorzugt höchstens 45 min, besonders bevorzugt höchstens 30 min nach dem Resuspendieren eingefroren werden .
Die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks kann durch
Verminderung des Drucks und / oder durch Begasung mit einem Schutzgas erfolgen .
Die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks kann bevorzugt vor dem Einfrieren erfolgen .
Der Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß kann auf 52 , 5 mbar bis 0 , 21 mbar, bevorzugt auf 26 mbar bis 0 , 21 mbar, besonders bevorzugt auf 13 mbar bis 0 , 21 mbar vermindert werden .
Erfindungsgemäß kann der gasdichte Abschluss des Gefäßes durch Einschweißen in einem gasdichten Folienschlauch oder durch Aufbringen einer gasdichten Klebefolie erfolgen . Dabei kann ein geeignetes Gefäß mit einem Deckel verschlos- sen werden und in einer Schlauchfolie, vorzugsweise aus Po- lyethylen, vakuumverschweißt werden . Hierfür kann das Gefäß vorsichtig in den Schlauch geschoben werden, der dann an einer Seite verschlossen werden kann . Mit einem handelsüblichen Einschweißgerät kann nun der verbleibende Luftsauer- Stoff aus der Folienverpackung weitestgehend abgesogen und die Folie verschweißt werden . Ein solches Einschweißgerät kann beispielsweise ein Folio Vakuum-Einschweißgerät sein . Zum Vergleich können geeignete Gefäße unter denselben Bedingungen eingefroren werden, j edoch ohne unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck.
Nach gasdichtem Abschluss des Gefäßes kann ein Restvolumen an Luft bezogen auf Atmosphärendruck in dem Gefäß verbleiben, welches besonders bevorzugt bis zu dem 17 , 5-fachen, bevorzugt bis zu dem 15-fachen, weiterhin bevorzugt bis zu dem 7-fachen, weiterhin bevorzugt gleich dem Volumen der Zellsuspension in dem Gefäß sein kann . Beispielsweise kann ein solches Gefäß eine Multiwellplatte sein, bevorzugt eine 96-well Platte . In einer solchen 96-well Platte kann bei einem Volumen von 25 μl Zellsuspension pro Well nach gasdichtem Abschluss ein Restvolumen an Luft bezogen auf den Atmosphärendruck in der 96-well Platte verbleiben, welches besonders bevorzugt bis zu dem 17 , 5-fachen des Volumens der Zellsuspension sein kann .
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das verwendete Schutzgas ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Helium und Argon .
Die Zellen, die mit dem Verfahren der Erfindung eingefroren werden, können eukaryotische Zellen sein . Erfindungsgemäß können die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, tierischen oder menschlichen Ursprungs sein . Beispielsweise könne diese Zellen murine Zellen, Hamsterzel- len, Affenzellen oder auch Schweinezellen sein . Die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, können weiterhin etablierte Zellinien, aber auch primäre oder sekundäre Zellen sein . Die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, können weiterhin adhärente Zellen sein, oder auch Zellen sein, die in Suspension wachsen . Die Zellen, die mit dem Verfahren eingefroren werden, können weiterhin eine Vielzahl von Zelltypen beinhalten . Diese Zelltypen können ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Zellen ekto- dermalen Ursprungs , mesodermalen Ursprungs , endodermalen Ursprungs und Keimzellen . Diese Zelltypen können weiterhin ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Fibroblasten, Epithelzellen, hämatopoetischen und neuronalen Zellen . Beispielsweise können diese Zellen L-292 Mausfibroblasten, He- La Zellen oder HCT-116 Zellen sein .
Erfindungsgemäß können die Zellen mit einer Abkühlrate auf die Lagertemperatur eingefroren werden, die mindestens 200C pro Minute, bevorzugt mindestens 40°C pro Minute, besonders bevorzugt mindestens 64 , 5°C pro Minute, weiterhin bevorzugt mindestens 800C pro Minute betragen kann . Die Abkühlrate gemäß der Erfindung erlaubt ein im Vergleich zum Stand der Technik schnelles Abkühlen und Unterschreiten des Gefrierpunktes der in den Gefäßen befindlichen Zellsuspension . In Verbindung mit dem Medium kann es so gelingen, die Kris- tallbildung im System zu unterdrücken und die Lösung in dem glasartigen Zustand zu halten, der für die zerstörungsfreie Tieftemperaturlagerung von Zellen notwendig ist . Erfindungsgemäß kann eine besonders bevorzugte Abkühlrate 64 , 5°C pro Minute sein .
Im Rahmen der Erfindung kann die Lagertemperatur nicht niedriger als - 85°C, besonders bevorzugt nicht niedriger als - 65°C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als - 600C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als - 500C sein . Erfin- dungsgemäß kann die Lagertemperatur in einem Tiefkühlschrank aufrecht erhalten werden . Im Rahmen der Erfindung kann eine besonders bevorzugte Lagertemperatur nicht niedriger als - 65°C sein . Das Einfrieren kann durch Kontakt wenigstens einer Fläche des Gefäßes mit einem Material geeigneter (hoher) Wärmeleitfähigkeit erreicht werden, das auf eine geeignete Temperatur vorgekühlt wurde . Das Material geeigneter Wärme- leitfähigkeit kann ein Metall sein . Die geeignete Temperatur kann zwischen - 90°C und -50°C, bevorzugt zwischen -85°C und - 65°C liegen .
Erfindungsgemäß kann das Lagern der Zellen ohne die Verwen- düng von flüssigem Stickstoff erfolgen . Vorzugsweise kann das Lagern in einem Tiefkühlschrank erfolgen .
Das Gefäß kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Multiwellplatte, Zellkulturschale und Zellkulturflasche .
Die Multiwellplatte kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus 6-well, 12-well , 24-well, 48-well, 96-well, 384-well und 1 536-well Platte .
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin eingefrorene Zellen in Einfriermedium in einem Gefäß unter gasdichtem Abschluss und / oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck vermindertem Sauerstoffpartialdruck.
Der Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß kann 52 , 5 mbar bis 0, 21 mbar, bevorzugt 26 mbar bis 0, 21 mbar, besonders bevorzugt 13 mbar bis 0 , 21 mbar betragen .
Erfindungsgemäß können die eingefrorenen Zellen direkt nach Auftauen in Einfriermedium in dem Gefäß ohne Passagieren für einen zellbasierten Assay verwendet werden . Dies kann geschehen, ohne, dass ein Waschen, Kultivieren oder Passagieren der Zellen in ein anderes Kulturgefäß durchgeführt wird . Etwa 1 bis 8 Stunden nach dem Auftauen bei 37°C, vor- zugsweise in einem entsprechend temperierten Zellinkubator mit geeigneter C02-Atmosphäre, kann Kulturmedium zu den Zellen in den Wells des Gefäßes hinzugegeben werden . Dabei wird das die Zellen umgebende Einfriermedium verdünnt . Vorzugsweise kann dies eine 1 : 1 Verdünnung sein . Nach der Zu- gäbe von Kulturmedium können die Zellen direkt in dem Gefäß für einen zeilbasierten Assay verwendet werden . Dies kann geschehen, ohne, dass ein Waschen, Kultivieren oder Passagieren der Zellen in ein anderes Gefäß durchgeführt wird. In dem anschließenden zeilbasierten Assay können Kontrollen mit und ohne des als Kryprotektivum verwendeten Lösungsmittels in dem entsprechenden prozentualen Anteil durchgeführt werden, um einen etwaigen Einfluß des Lösungsmittels auf den Assay zu erkennen .
Der zellbasierte Assay kann in Form eines Hochdurchsatzsc- reenings (HTS) durchgeführt werden . Dabei kann beispielsweise der Effekt von Stoffen, Zellen oder dergleichen auf Zellen in den Wells eines Gefäßes , vorzugsweise Multiwell- platte, getestet werden . Dies geschieht vorzugsweise mit einer Vielzahl von Stoffen oder Zellen mit einer vorzugsweise hohen Durchsatzrate . Die getesteten Stoffe können vorzugsweise pharmakologisch aktive Stoffe sein . Die getesteten Stoffe können weiterhin bevorzugt Liganden für zelluläre Rezeptoren sein . Die getesteten Stoffe können beson- ders bevorzugt die Genexpression der Zellen in den Wells beeinflussen . Die getesteten Zellen können einen Effekt auf die Zellen in den Wells bewirken . Es können ein oder mehrere Stoffe oder Zellen pro Well getestet werden .
Die eingefrorenen Zellen können bei einer Lagertemperatur niedriger oder gleich -65°C für mindestens 1 Monat, bevorzugt mehr als 2 Monate, weiterhin bevorzugt mehr als 4 Monate, besonders bevorzugt mehr als 12 Monate eine Vitalität von über 70% , bevorzugt über 80% , besonders bevorzugt von über 95 % der Vitalität von Zellen eines nicht eingefrore- nen Kontrollgefäßes aufweisen . Die Vitalität kann bei großen Gefäßen, aus denen die Zellen leicht wieder vollständig entfernt werden können, über einen im Stand der Technik bekannten Farbausschlusstest (Thumm W. , Z . Krebsforsch . 60 ( 1 ) : 91-93, 1954 ) bestimmt werden . In kleinen Gefäßen, aus denen die eingefrorenen Zellen nicht zuverlässig zur Bestimmung entnommen werden können, kann der Vitalitätstest indirekt über die Messung der metabolischen Aktivität der Zellen erfolgen. Ein Substrat, z . B . Resazurin, wird den Zellen zuge- setzt und von metabolisch aktiven Zellen reduziert . Das
Substrat erfährt durch die Reduktion eine leicht quantifizierbare Änderung in seinem Absorptions- oder Fluoreszenzspektrum (Glass R. H . , S .A. Ericsson et al . r Fertil . Steril . 56 (4 ) : 743-746, 1991) . Nach vorheriger Eichung der gemesse- nen Absorption oder Fluoreszenz anhand von Zellsuspensionen mit bekannter Zellzahl kann eine Quantifizierung der Vitalität vorgenommen werden . Die Messung der metabolischen Aktivität der Zellen kann aber außer mit Resazurin auch mit anderen im Stand der Technik üblichen Farbstoffen durchge- führt werden, wie beispielsweise MTT, XTT oder Neutralrot .
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert .
Beispiel 1
Material und Geräte :
1. L-929 murine Fibroblasten Zellinie der ATCC (American Ty- pe Culture Collection) , Nr . : CCL-I
2. DMEM Kulturmedium ( Dulbecco' s Modified Eagels Medium)
3. L-Glutamin
4. Natrium-Pyruvat
5. Fötales Kälberserum ( FCS) 6. Glyzerin
7. PBS ( Phosphate Buffered Saline)
Trypsin / EDTA (Ethylene-diamine-tetraacetic acid) , 0 , 5 g/l und 0 , 25 g/l 8. Resazurin
9.96-well Platten
10. Polyethylenschlauchfolie
11. Folio Vakuum-Einschweißgerät 12. Sterilarbeitsbank 13. CO2 Zellkulturinkubator 14. -80°C Tiefkühlschrank
L-292 Mausfibroblasten wurden nach dem Standardprotokoll der ATCC in DMEM Komplettmedium ( DMEM, 4 rtiM L-Glutamin, 2 mM Natriumpyruvat , 10 % FCS kultiviert bis eine ausreichende Zellzahl zum Einfrieren der Zellen zur Verfügung stand. Zur Zellernte sollten die Oberflächen der Gefäße etwa 80 bis 90 % konfluent bewachsen sein . Der Kulturüberstand wurde abgegossen und der Zellrasen einmal mit PBS gewaschen . Je 25 cm2 Oberfläche wurde 1 ml Trypsin / EDTA auf den
Zellrasen gegeben, gleichmäßig verteilt und bei Raumtemperatur (RT) etwa 5 Minuten (min) inkubiert . Die Zahl und Vitalität der abgelösten Zellen wurde bestimmt und diese bei 180 x g für 4 min bei RT pelletiert . Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet mit einer Zelldichte von 6 x 105 Zellen / ml in Einfriermedium resuspendiert ( 95 % DMEM Komplettmedium, 5 % Glyzerin) . Je 50 μl der Zellsuspension wurden in j edes Well einer 96-well Platte pipettiert, wobei darauf geachtet wurde, dass die Zellsuspension den Boden des Wells bedeckte . Die 96-well Platten wurden mit dem Deckel verschlossen und einzeln in einer Schlauchfolie aus Polyethylen vakuumverschweißt . Hierfür wurden die Platten vorsichtig in den Schlauch geschoben und dieser an einer Seite verschlossen . Mit einem handelsüblichen Einschweißge- rät wurde nun die verbleibende Luft aus dem Folienschlauch weitestgehend abgesogen und die Folie verschweißt . Zum Vergleich wurden 96-well Platten unter denselben Bedingungen eingefroren, j edoch ohne ein Absaugen der Luft . Die einge- schweißten Multiwellplatten wurden direkt auf die metallenen Einlegeböden in einen - 80 °C Tiefkühlschrank gestellt und in diesem eingefroren und gelagert . Die Platten wurden hierbei nicht gestapelt, und der gesamte Einfriervorgang erfolgte zügig . Von der Zugabe des Einfriermediums bis zum Einleiten des Einfriervorgangs vergingen in diesem Beispiel nicht mehr als 45 min .
Die Zellen konnten unter diesen Bedingungen für 1 , 5 Jahre gelagert werden und in den 96-well Platten mit einer Vita- lität von über 90 % wieder aufgetaut werden . Wurden die Zellen ohne Vakuum eingefroren, so beschränkte sich ihre Haltbarkeit auf 2 bis 4 Monate . Die Vitaltätsbestimmung erfolgte direkt in der 96-well Platte mit Hilfe der Reduktion von Resazurin (Glass R. H . , S .A. Ericsson et al . , Fer- til . Steril . 56 ( 4 ) : 743-746, 1991 ) .
Die Zellen konnten unter diesen Bedingungen für 12 Monate gelagert werden und in den 96-well Platten mit einer Vitalität von über 90 % einer nicht eingefrorenen Platte aufge- taut werden . Im Gegensatz dazu betrug die Vitalität der nicht mit dem Verfahren behandelten Kontrollplatte nur etwas über 20 % .
Figur 1 zeigt das Ergebnis des Versuches des Beispiels 1. Beispiel 2
Die Zellinie HCT-116 wurde nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefroren . Zum Vergleich wurden HCT-116 Zellen in Einfriermedium mit DMSO ( 95% DMEM Komplettmedium, 5% DMSO) und mit Glyzerin ( 95% DMEM Komplettmedium, 5% Glyzerin) in 96-well Platten eingefroren . Die eingefrorenen Zellen wur- den nach 12 Monaten wieder aufgetaut und ihre Zellaktivität durch Reduktion des Farbstoffs Resazurin bestimmt . Die Zellaktivität ist als relative Signalstärke in [U] angegeben .
Zur Beurteilung eines HTS-Assays wird im Stand der Technik der Z-Faktor verwendet . Der Z-Faktor ist eine statistische Größe, die sich aus den Mittelwerten und Standardabweichungen der Meßwerte berechnet . Ein idealer Assay hat einen Z- Faktor, der um 1 liegt . Zwischen 1 und 0 , 5 sind Assays gut durchführbar . Sinkt der Z-Faktor unter 0 , 5 ab, so wird der Trennbereich zwischen Kontrolle und Probe zu klein, so dass eine klare Unterscheidung der Zellaktivität nicht mehr möglich ist .
Figur 2 zeigt graphisch das Ergebnis des Beispiels 2.
Figur 3 zeigt die Rohdaten des Beispiels 2.
Beispiel 3
Um die Funktionalität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefrorenen Zellen zu zeigen, wurden Zellen nach dem Auftauen in einem Zytotoxizitäts-Assay verwendet . HeLa- Zellen wurden in 96-well Platten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingefroren, nach 13 Monaten wieder aufgetaut und dann der IC50-Wert von Na2SeO3 bestimmt . Hierzu wurde Na2SeO3 in zwölf Verdünnungsstufen zu den Zellen gegeben . Die Verdünnungen wurden so gewählt, dass die Konzentration an Na2SeO3, die 50% der Zellen abtötet , sich in der Mitte des untersuchten Konzentrationsbereichs befindet . Die aufgetragenen Werte sind die Mittelwerte einer Vierfachbestimmung . Nach einer Inkubation der Testsubstanz von 48 Stunden bei Zellkulturbedingungen ( 370C, 5% CO2 und hoher Luftfeuchtig- keit ) wurde die Lebendzellzahl über die metabolische Aktivität der lebenden Zellen bestimmt . Hierfür wurde Resazurin eingesetzt, dass in den Mitochondrien metabolisch aktiver, lebender Zellen reduziert wird und sich dabei in das fluo- reszensaktive Resofurin umwandelt . Die Konzentration, bei der nur noch 50% der Zellaktivität nachgewiesen werden kann gibt den IC5o-Wert an .
Figur 4 zeigt das Ergebnis des Beispiels 3.
Die Beispiele zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut dazu geeignet ist, Zellen für den Einsatz in zeilbasierten Assays in den entsprechenden Gefäßen in aus- reichender Anzahl und gleichbleibender Qualität zur Verfügung zu stellen und langfristig vorzuhalten .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Einfrieren und Lagern von Zellen in ei- nem Gefäß mit den Schritten :
a ) Einfrieren der Zellen auf eine Lagertemperatur,
b) Lagern bei dieser Lagertemperatur,
dadurch gekennzeichnet , dass das Lagern unter gasdichtem Abschluss und / oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck verminderten Sauerstoffpartialdruck erfolgt .
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , dass die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks durch Verminderung des Drucks und / oder durch Begasung mit einem Schutzgas erfolgt .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet , dass die Verminderung des Sauerstoffpartialdrucks vor dem Einfrieren erfolgt .
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet , dass der Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß auf 52 , 5 mbar bis 0 , 21 mbar, bevorzugt auf 26 mbar bis 0 , 21 mbar, besonders bevorzugt auf 13 mbar bis 0 , 21 mbar vermindert wird .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet , dass der gasdichte Abschluss des Gefäßes durch Einschweißen in einem gasdichten Folienschlauch oder durch Aufbringen einer gasdichten Klebefolie erfolgt .
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet, dass nach gasdichtem Abschluss des Gefäßes ein Restvolumen an Luft in dem Gefäß verbleibt , welches besonders bevorzugt bis zu dem 17 , 5-fachen, bevorzugt bis zu dem 15-fachen, weiterhin bevorzugt bis zu dem 7-fachen, weiterhin bevorzugt gleich dem Volumen der Zellsuspension in dem Gefäß ist .
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Schutzgas ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Helium und Argon .
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen tierischen oder menschlichen Ursprungs sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet , dass die Zellen mit einer Abkühlrate auf die Lagertemperatur eingefroren werden, die min- destens 20°C pro Minute, bevorzugt mindestens 40°C pro Minute, besonders bevorzugt mindestens 64 , 5°C pro Minute, weiterhin bevorzugt mindestens 800C pro Minute beträgt .
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lagertemperatur nicht niedriger als - 85°C, besonders bevorzugt nicht niedriger als - 65°C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als - 60°C, weiterhin bevorzugt nicht niedriger als - 500C ist .
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 , dadurch gekennzeichnet, dass das Einfrieren durch Kontakt wenigstens einer Fläche des Gefäßes mit einem Material geeigneter Wärmeleitfähigkeit erreicht wird, das auf eine geeignete Temperatur vorgekühlt wurde .
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Material ein Metall ist .
13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12 , dadurch gekennzeichnet , dass die Temperatur zwischen - 90°C und - 500C, bevorzugt zwischen -85°C und - 65°C liegt .
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 , dadurch gekennzeichnet, dass das Lagern der Zellen ohne Verwendung von flüssigem Stickstoff erfolgt .
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 , dadurch gekennzeichnet , dass das Gefäß ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Multiwellplatte, Zellkulturschale und Zellkulturflasche .
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Multiwellplatte ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 6-well, 12-well, 24-well, 48-well, 96- well , 384-well und 1 536-well Platten .
17. Eingefrorene Zellen in Einfriermedium in einem Gefäß unter gasdichtem Abschluss und / oder unter gegenüber dem Atmosphärendruck vermindertem Sauerstoffpartial- druck.
18. Eingefrorene Zellen nach Anspruch 17 , bei denen der
Sauerstoffpartialdruck in dem Gefäß 52 , 5 mbar bis 0 , 21 mbar, bevorzugt 26 mbar bis 0, 21 mbar, besonders bevorzugt 13 mbar bis 0 , 21 mbar beträgt .
19. Eingefrorene Zellen nach Anspruch 17 oder 18 , die direkt nach Auftauen in Einfriermedium in dem Gefäß ohne Passagieren für einen zeilbasierten Assay verwendet werden können .
20. Eingefrorene Zellen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der zellbasierte Assay in Form eines Hochdurchsatzscreenings (HTS) durchgeführt werden kann .
21. Eingefrorene Zellen nach einem der Ansprüche 17 bis 20 , dadurch gekennzeichnet, dass die eingefrorenen Zellen bei einer Lagertemperatur niedriger oder gleich
-65°C für mindestens 1 Monat, bevorzugt mehr als 2 Mo- nate, weiterhin bevorzugt mehr als 4 Monate, besonders bevorzugt mehr als 12 Monate eine Vitalität von über 70% , bevorzugt über 80% , besonders bevorzugt von über 95 % der Vitalität von Zellen eines nicht eingefrorenen Kontrollgefäßes aufweisen .
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