WO2006060968A1 - Inoculante micorrizógeno líquido - Google Patents

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José Miguel DELL'AMICO RODRÍGUEZ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor

Definitions

  • the present technical solution is related to the agricultural sciences, in particular with the production of organic biofertilizers, and more specifically, with the obtaining of a liquid mycorrhogen inoculant that can be applied to the soil and plants both directly and through irrigation systems.
  • the mycorrhizal products developed from the aforementioned substrates are applied directly coating the seed with 10% in relation to the total weight of the seed to be sown directly in the field (Fernández, F et al ,.
  • the liquid inoculants reported in the patent information are basically related to ectomycorrhizae (CN1420167, US2004208852) and we have only found a liquid medium reported by the Japanese (JP4141023), based on the use of a stabilizer (citric acid or its form of salt) to protect spores.
  • Glomalina The specific glycoprotein of these fungi, called Glomalina, that accelerates the processes of formation of stable micro aggregates in the soil, thus improving their physical structure, increasing oxygen levels, and facilitating a better colonization of the organism. Since Glomalin is only excreted naturally during the functioning of the symbiosis, or under the action of a certain excretion medium, it does not appear excreted to the solid support in known mycorrhizal inoculants, and the levels at which it is found. the soil depends on the state of the symbiosis with the organism, and cannot rise beyond what that symbiosis allows.
  • the main objective of this invention is to obtain a liquid product that promotes massive handling of mycorrhizal fungi, with greater quality and efficiency, so that it can be used directly in localized irrigation systems, in adequate and cost effective doses.
  • To obtain said inoculant the following steps were developed:
  • the aerial part is eliminated, and a solid substrate consisting of a mixture of mycorrhizal propagules (colonized rootlets, fungal mycelium and resistance spores) and the initial support is obtained.
  • the mycorrhizal propagules are extracted by the method of wet decantation and sieving through various sieves ranging from a rancid of 400 to 40 um, according to the species of mycorrhizal fungus in question, the solid fraction that is collected in the finest sieve is centrifuged and then the liquid fraction is decanted with the fungal propagules.
  • the aqueous solution with the propagules would be composed of the following elements: a) Active components:
  • a product is ready to be applied in the field or in the localized irrigation system, guaranteeing that mycorrhizal propagules, and especially spores, are protected from the effects of surface osmotic pressure and that once applied In water, these are capable of breaking down the dormancy mechanisms of the spores and reach a strong colonizing capacity, developing a positive response in the crops.
  • the proposed invention consists of an inoculant that, due to its manufacturing method, can be highly infective, because very high concentrations can be reached, with no more limitations than the physical limits that allow this aqueous solution, or the convenience for its application, being able to achieve concentrations of the order of 1 or 2 million spores .I “1 and 1 and 2 grams of mycelium .L " 1 .
  • This inoculant proposed in the present invention promotes the direct application of the product in the field, decreasing its volume, increasing its concentration, thus facilitating its handling and transport, and eliminating labor.

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Abstract

La solución técnica propuesta se relaciona con la rama de la agricultura, la biotecnología del suelo y específicamente con la producción y aplicación de los hongos micorrizógenos arbusculares, microorganismo que mejora la eficiencia en la toma de nutrientes por las plantas, nivel hídrico, producción vegetal, protección contra alguna de las enfermedades de la raíz, etc. Consiste en un producto líquido para la aplicación de los hongos micorrizógenos arbusculares, partiendo de la utilización de un medio acuoso que permite lograr una estabilización de los propágulos micorrízicos que posibilita la formación de agregados de suelos y una viabilidad comprobada en medio líquido entre 12 y 18 meses que se puede utilizar en los sistemas de riego y fertirriego, aplicándose en forma directa en campos o invernaderos de cultivo protegido, además de permitir la superación de los mecanismos de dormancia de las esporas y de lograr un elevado nivel de concentración que permite y facilita su anejo y transportación. Con la aplicación de este producto, se pueden manejar los hongos micorrizógenos en cultivos bajo sistemas de riego en gran escala, con una mejora productiva y ambiental.

Description

INOCULANTE MICORRIZÓGENO LÍQUIDO. DESCRIPCIÓN.
La presente solución técnica se relaciona con las ciencias agrícolas, en particular con producción de biofertilizantes orgánicos, y más específicamente, con Ia obtención de un inoculante micorrizógeno líquido que puede aplicarse al suelo y a las plantas tanto directamente como a través de los sistemas de riego.
A las asociaciones micorrízicas se Ie han atribuido múltiples funciones entre las que se destacan el mejoramiento de Ia superficie absorbente del sistema radicular a través de un aumento notable del mismo, incremento de Ia tolerancia a las toxinas del suelo, solubilización de ciertos elementos nutritivos (N, P, K, Ca, Mg, Mn, Cu, Zn, B, etc.), resistencia a condiciones adversas .tales como: sequía, salinidad, etc., selectividad en Ia absorción, mejoramiento de las propiedades físicas de los suelos a partir de Ia formación de agregados estables y cierta protección contra los patógenos radicales. La aplicación de esta asociación a Ia agricultura implica un fuerte impacto ambiental, debido a que propicia un mejor equilibrio entre las diferentes poblaciones de microorganismos presentes en Ia micorrizosfera y rizosfera de Ia asociación hongo micorrizógeno-planta y en general una mayor protección contra los efectos de los estreses bióticos y abióticos
Estado de Ia Técnica. La obtención y posterior aplicación de inoculantes basados en hongos formadores de micorrizas arbusculares en las plantas tiene características peculiares, debido a que éstos no crecen en medios sintéticos artificialmente, sino que completan su ciclo de vida en las raíces de una planta hospedera, de modo que una vez finalizado el ciclo de vida vegetal (para Ia producción de estos inoculantes se utilizan generalmente plantas de ciclo corto con 3 a 4 meses de vida), se extrae el sistema radical colonizado por el hongo, así como los propágulos fúngicos (micelio extramátrico y esporas) desarrollados durante Ia asociación, así como el sustrato en donde se han desarrollado, constituyendo entonces todos estos componentes un inoculante micorrizógeno en base sólida (Fernández, F. Capitulo 3. Bases Científico Técnicas para el manejo de los sistemas micorrizados eficientemente. En: Rivera, Fernández, eds. INCA, La Habana. 2003.)
En Ia producción actual de este tipo de inoculante, se utilizan los siguientes sustratos (Feldmann, F. and Idczak, E. Inoculum production of Vesicular -arbuscular Mycorrhizal Fuήgi for use in tropical nurseries. In: Methods in Microbiology. Volume 24 ISBN 0-12- 521524-x. Eds. Academic Press Limited. 1992; Fernández, F et al,. Certificado de Autor 22641. OCPI. 1999): - Suelo
- Suelo + Materia Orgánica.
- Materia Orgánica
- Arena
- Arcillas - Arcillas + Arena
- Arcillas + Materia Orgánica
- Arena + Materia Orgánica + Suelo.
- Solución Nutritiva en cámara de flujo líquido.
- Vermiculita - Perlita
- Turba de musgos.
- Arcilla montmorillonita expandida.
- Combinaciones de todas estas.
Los productos micorrizógenos desarrollados a partir de los sustratos antes mencionados se aplican directamente recubrimiento Ia semilla con el 10 % en relación al peso total de Ia semilla a sembrar directamente en el campo (Fernández, F et al,.
Certificado de Autor 22641. OCPI. 1999) o Ia aplicación directa de inoculantes a razón de 1 a 2 T. h"1. En el caso de los cultivos de semilleros y viveros, Ia dosis de aplicación no debe exceder de 1 kg. m2, y de 10 g/semilla, colocando el producto siempre por debajo de Ia semilla a sembrar respectivamente (Sieverding, E. Vesicular Arbuscular
Mycorrhiza in Tropical Agrosystem. Deutsche Gesellsschaft fur techniische
Zusammenarbeit (GTZ) GMBH, Federal Republic of Germany.1991. 371 p).
La aplicación de estos inoculantes en los sistemas de riego o fertirriego, debido fundamentalmente a Ia ausencia de un inoculante líquido que reúna las características adecuadas que Ie permitan soportar los bruscos cambios de Ia presión hidrostática que se genera en los conductos de riego, Io que ha imposibilitado su aplicación por ésta vía. La producción de inoculantes micorrizógenos arbusculares se ha desarrollado en base a Ia aplicación en sustratos sólidos, semisólidos a floculantes y en menor escala Ia utilización de estos microorganismos en medios líquidos.
En cuanto a los medios sólidos, existen ejemplos de patentes que han utilizando diversos sustratos de multiplicación son los casos de: US4945059, JP7123979, JP4187081 , DE10161443, DE10221762. Estos inoculantes tienen los inconvenientes que por Io general se manejan volúmenes grandes de sustrato, Ia capacidad germinativa de las esporas está afectada por largos períodos de dormancia, Ia concentración de propágulos en este producto es natural, o sea no se puede concentrar con Ia magnitud deseada. En el caso de los inoculantes semisólidos , se han publicado las siguientes patentes: EP0726305, EP0596217, EP0072213, US5120344, EP0495108, EP0475433, US5436218, US3437625, US3557562, EP0023347, US2856380, US3857991 , GB2381264. Estos productos se basan en Ia utilización de sustratos como geles, copolimeros, arcillas, en medios floculantes. Al igual que el caso anterior, se manejan volúmenes importantes en Ia aplicación agrícola y tampoco logran superar los períodos de dormancia en las esporas de los hongos micorrízicos.
Los inoculantes líquidos reportados en Ia información de patentes, están básicamente relacionados con las ectomicorrizas (CN1420167, US2004208852) y solo hemos encontrado un medio líquido reportado por los japoneses (JP4141023), basado en el uso de un estabilizante (acido cítrico o su forma de sal) para proteger esporas.
En general los productos micorrizógenos conocidos no tienen una germinación de esporas uniforme, no se ha podido aún superar los mecanismos de dormancia de estas especies fúngicas, pues los sustratos en que están presentados estos inoculantes no Ie confieren a los propágulos situaciones estresantes que aceleren los procesos de germinación de las esporas una vez inoculadas las mismas en condiciones de campo
Por otra parte, los inoculantes micorrízicos fabricados hasta el momento tienen un límite natural de propágulos micorrízicos, no han sido reportados y ello se debe a que el procedimiento de obtención no conlleva Ia concentración de mayor cantidad de propágulos específicos. El producto micorrizógeno conocido con mayor concentración en Ia actualidad tiene una relación de esporas: micelio de 50 esporas. g." sustrato: 65 mg. micelio"1 sustrato. (Fernández, F. Capitulo 3. Bases Científico Técnicas para el manejo de los sistemas micorrizados eficientemente. En: Rivera, Fernández, eds. INCA, La Habana. 2003.)
La glicoproteína específica de estos hongos, llamada Glomalina, que acelera los procesos de formación de micro agregados estables en el suelo, mejorando así su estructura física, incrementando los niveles de oxígeno, y facilitando una mejor colonización del organismo. Como Ia Glomalina sólo se excreta de manera natural durante el funcionamiento de Ia simbiosis, o bajo Ia acción de un determinado medio de excreción, Ia misma no aparece excretada al soporte sólido en los inoculantes micorrizógenos conocidos, y los niveles en que se Ie encuentra en el suelo dependen del estado de Ia simbiosis con el organismo, y no pueden elevarse más allá de Io que dicha simbiosis permite.
Descripción detallada de Ia invención..
El objetivo principal de esta invención, consiste en Ia obtención de un producto líquido que propicie un masivo manejo de los hongos micorrizógenos, con mayor calidad y eficiencia, para que pueda ser empleado directamente en sistemas de riego localizado, en dosis adecuadas y rentables. Para Ia obtención de dicho inoculante se desarrollaron los siguientes pasos:
1. Siembra de plantas hospederas Braquiaria deαumbens, Sorghum vulgare u otra especie micótrofa obligatoria y estas se desarrollan sobre un sustrato de reproducción: suelo, arcillas caolinítica o motmorillonítica, perlita, zepeolita, vermiculita y materia orgánica (aplicada de acuerdo a las necesidades de Ia simbiosis).
2. Estas plantas se inoculan directamente colocando por debajo de las semillas, 10 gramos de cepa pura de hongos micorrizógenos, para su producción se han utilizado las siguientes especies de forma individual: Glomus fasciculatum,
Glomus clarum, Glomus spurcum, Glomus mosseae, Glomus intrarradices, Gigaspora margarita, y otras especies de Glomales y Diversisporales, pero pueden ser empleadas otras especies de hongos micorrízicos.
3. Al término del ciclo de vida de Ia planta, se elimina Ia parte aérea, y se obtiene un sustrato sólido consistente en una mezcla de propágulos micorrízicos (raicillas colonizadas, micelio fúngico y esporas de resistencia) y el soporte inicial.
4. Posteriormente se extraen los propágulos micorrízicos por el método de decantado húmedo y tamizado a través de diversos tamices que van desde un rancio de 400 hasta 40 um, de acuerdo a Ia especie de hongo micorrízico en cuestión, Ia fracción sólida que se recoge en el tamiz más fino, se centrifuga y luego se decanta Ia fracción líquida con los propágulos fúngicos.
5. Cuando se han separado todos los componentes micorrízicos, estos son desinfectados superficialmente con una solución de Cloramina T (2%) durante 5 minutos, se lavan tres veces con agua destilada estéril y se colocan en Sulfato de Estreptomicina durante 24 horas, una vez culminado se envasan en una mezcla acuosa a base de Sorbitol (entre 5 y 10 %), Manitol (2 %), Tween 40, (5
%), Tween 80 (2 %) , Polietilenglicol 4000 pudiéndose aplicar entre un rango de 100 y 500 mg.l."1 y agar desde el 0.8 al 0.1 %. En este caso, el producto se puede fabricar hasta los limites físicos permisibles de unidad de propágulos. mi" 1. de medio de cultivo. 6. La solución acuosa con los propágulos quedaría compuesta por los siguientes elementos: a) Componentes activos:
- Propágulos micorrízicos: Esporas de resistencia, micelio extramátrico arbuscular, Glomalina y raicillas menores de 40 um, colonizadas con el hongo en cuestión. b) Otros Componentes:
• Sorbitol, en un rango entre el 5 y 10 %,
• Manitol, en un rango entre el 2 y el 5 %,
• Tween 40, en un rango entre el 5 y el 7 %, • Tween 80 en un rango entre el 2 y el 7 % , • Polietilenglicol se aplica entre un rango de 100 y 500 mg. I."1
• Agar, en un rango entre 0.8 y 0.1 %,
Una vez concluidos estos procedimientos, queda listo un producto para ser aplicado en campo o en los sistema de riego localizado, garantizando que los propágulos micorrízicos, y en especial las esporas, queden protegidas de los efectos de Ia presión osmótica superficial y que una vez aplicadas en agua, estas son capaces de romper los mecanismos de dormancia de las esporas y alcancen una fuerte capacidad colonizadora, desarrollando una respuesta positiva en los cultivos.
La invención propuesta consiste en un inoculante que por su forma de fabricación, puede ser altamente infectivo, debido a que se pueden alcanzar concentraciones muy elevadas, sin más limitaciones que los límites físicos que permiten esta disolución acuosa, o las conveniencias para su aplicación, pudiendo lograrse concentraciones del orden de 1 o 2 millones de esporas .I"1 y de 1 y 2 gramos de micelio .L"1.
Además, por el hecho de encontrarse los propágulos micorrízicos en un medio acuoso, se estimula Ia secreción de Ia Glomalina, que se encuentra presente en altas concentraciones en Ia composición de este inoculante, confiriéndole características especiales, acelerando así, con su aplicación directa, los procesos de formación de microagregados estables en el suelo, mejorando inmediatamente Ia estructura física del mismo, e incrementando los niveles de oxígeno, Io cual facilita una mejor colonización de este microorganismo, garantizando un desarrollo mucho mas eficiente de Ia simbiosis micorrízica.
Este inoculante que se propone en Ia presente invención promueve Ia aplicación directa del producto en campo, disminuyendo su volumen, al aumentar su concentración, facilitando de esta forma su manejo y transporte, y eliminando labores de trabajo.
Está montado en un soporte líquido concentrado, con una viabilidad de 8 meses, que puede ser totalmente aplicado a través de los sistemas de fertiriego, lográndose una distribución homogénea, comprobada por experimentos a distintas escalas. Este hecho ha garantizado una exitosa inoculación en todas las plantas bajo el sistema de riego, Io cuál se traduce en un incremento significativo en los rendimientos (ver informe técnico). Citas:
• Dell Amico. et al, Journal of Agricultural Science.. 2002
• Feldmann, F and Idczak, E. Inoculum production of Vesicular -arbuscular Mycorrhizal Fungi for use in tropical nurseries. In: Methods in Microbiology.
Volume 24 ISBN 0-12-521524-x. Eds. Academic Press Limited. 1992
• Fernández, F. Capitulo 3. Bases Científico Técnicas para el manejo de los sistemas micorrizados eficientemente. En: Rivera, Fernández, eds. INCA, La Habana. 2003. • Fernández, F et al,. Patente 22641. OCPI. 1999
• Sieverding, E. Vesicular Arbuscular Mycorrhiza in Tropical Agrosystem. Deutsche Gesellsschaft fur techniische Zusammenarbeit (GTZ) GMBH, federal Republic of Germany.1991. 371 p

Claims

REIVINDICACIONES INOCULANTE MICORRIZÓGENO LÍQUIDO
1. Inoculante micorrizógeno líquido caracterizado por Ia siguiente composición: a. Propágulos micorrízicos compuestos por esporas de resistencia, micelio extramátrico arbuscular, Glomalina y raicillas menores de 40 um, colonizadas con el hongo en cuestión. b. Sorbitol en un rango entre el 5 y 10 %. c. Manitol en un rango entre el 2 y el 5 %. d. Tween 40 en un rango entre el 5 y el 7 %. e. Tween 80 en un rango entre el 2 y el 7 %. f. Polietilenglicol se aplica entre un rango de 100 y 500 mg.l."1 . g. Agar al O.1 %,
2. Inoculante micorrizógeno líquido, de acuerdo con Ia reivindicación No. 1 , que puede ser aplicado en agua a través de los sistemas de riego y fertirriego.
3. Inoculante micorrizógeno líquido, de acuerdo con Ia reivindicación No. 1 , que permite un nivel de concentración del orden de 1 o 2 millones de esporas .I'1 y de 1 y 2 gramos de micelio .L"1.
4. El Polietilenglicol de acuerdo con Ia reivindicación No 1 , puede utilizarse de diversos pesos moleculares, entre un rango de 4000 y 10000 con una concentración en disolución según el peso molecular en un rango entre 100 y 500 mg.l."1.
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