CN115851772A - 丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法 - Google Patents
丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法，所述球囊霉素基因glomalin CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该方法将含有将球囊霉素的DNA片段的宿主细胞经IPTG诱导表达；收集细菌，破碎，离心，获得融合蛋白；融合蛋白经Ni‑亲和层析柱进行纯化，获得目的蛋白，即为球囊霉素。本发明可以便捷高效的获取高纯度的球囊霉素，并具有高表达低成本等优点。为球囊霉素复合物的结构解析奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法。
背景技术
随着工业日益发展，我国CO2排放逐渐增多和土壤退化，土壤有机质(SOC)含量减少等因素都不同程度导致土壤质量下降。球囊霉素是1996年在球囊霉属丛枝菌根真菌Glomus intraradices(现命名为Rhizophagus irregularis)菌丝表面发现的一类糖蛋白。它具有多年或更长的周转时间，因此在土壤中大量积累，并因此成为土壤有机质(SOM)的重要组成部分，对土壤聚集、碳储存和土壤质量改善至关重要。据报道，球囊霉素是最重要的土壤有机碳(SOC)来源，碳含量丰富(5-13％)，因此，它可以作为生物固碳的“得力干将”。通过将碳元素固定在土壤中可以很大程度上降低大气中的碳含量(CO2)，有助于维持“碳平衡”。此外，它作为一种“超级胶”，可以将土壤小颗粒与直径小于0.25mm的微团聚体结合，促进土壤团聚体的形成，土壤团聚体的稳定性可以改善土壤结构，极大地提高土壤水分的渗透性、土壤稳定性以及防止自然侵蚀的能力，同时其合理的多孔结构为植物根系生长提供了必要的空间和较好的气体交换通道。
传统上，球囊霉素在柠檬酸钠缓冲液中单独或重复高压灭菌土壤样品进行提取，以分别获得易提取球囊霉素和总球囊霉素。此方法提取的球囊霉素可通过使用非特异性Bradford蛋白测定法或特异性的单克隆抗体MAb32B11免疫反应物质对蛋白含量进行评估。然而，上述提取方法仍然有以下几点问题：
1)传统提取方法获得的提取物虽然在一定程度上对球囊霉素进行了提纯，但仍是含有各种蛋白质和其他化合物的混合物，如非AMF分泌的蛋白质、脂类和腐殖质物质等，因此，2006年重新命名为球囊霉素相关土壤蛋白(简称GRSP)；
2)现有的两种蛋白测定法均不能完全排除其他化合物的影响，这制约了人们对球囊霉素在土壤中的分布及其环境功能的深入了解；
3)由于不能得到高纯度的球囊霉素组分用于分析其分子结构和功能，严重限制了其相关的分子生物学及生物化学方面的研究。
因此，提取高纯度球囊霉素的方法亟待发明，但到目前为止，仍未发现获得高纯度球囊霉素的提取方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因及其球囊霉素的制备方法，本发明通过基因工程离体表达纯化球囊霉素，该方法安全有效，低风险，生产效率高，适宜于工业化生产。
为实现上述目的，本发明所设计一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因glomalin，所述球囊霉素基因glomalin CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种上述的球囊霉素基因编码的球囊霉素，所述球囊霉素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体为含有上述的球囊霉素基因的表达载体，其中，所述表达载体为pET21b。
本发明还提供了一种含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态。
本发明还提供了一种上述宿主细胞的构建方法，包括以下步骤：
1)提取丛枝菌根真菌的基因组；
2)设计引物对：
引物对1：
5’-ATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTCAATAAA-3’，
5’-TTACATCATACCCATATCACCCATTCCACC-3’；
引物对2：
5’-TTTCTCCTTCCCTATCTATGGTATCT-3’，
5’-CGGCTCCCTTATTTTCCTCTA-3’；
引物对3：
5’-gtacttccaatccaatgctATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTC-3’，
5’-CGTCTTgaaccaaccttgCACCAAGGTTTTCAAATTTGTC-3’；
引物对4：
5’-TGcaaggttggttcAAGACGTTGCCAACAAAACTAATGAAGTGG-3’，
5’-TGGCTGAGATTgtagcaacctgaGCTATTTCTTCACTTGTAG-3’；
引物对5：
5’-ggttgctacAATCTCAGCCAATGGTGATACGCATGTTGG-3’，
5’-TATTTTCCTctggagCTTCGGTAATTGTGCATTCTGTCGTTG-3’；
引物对6：
5’-CGAAGctccagaggaaaAGGAAAATAAGGGAGCCG-3’，
5’-gagctcgaattcggatccTTACATCATACCCATATCACCCATTCC-3’；
3)以丛枝菌根真菌的基因组为模板，进行PCR；得到球囊霉素的DNA片段；
4)将球囊霉素的DNA片段克隆到大肠杆菌表达载体pET21b中，构建融合重组表达载体pET21b-glomalin；
5)将重组表达载体转入大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态中，得到宿主细胞。
本发明还提供了一种离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，包括以下步骤：
1)将权利要求4所述的宿主细胞经IPTG诱导表达；
2)收集细菌，破碎，离心，获得融合蛋白；
3)融合蛋白经Ni-亲和层析柱进行纯化，获得目的蛋白，即为球囊霉素。
进一步地，所述步骤2)中，收集细菌细胞后，重悬在Binding buffer中，用高压破碎仪进行破碎，其中，所述Binding buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imidazole。
再进一步地，所述步骤2)中，离心条件为12000r/min、4℃离心1h。
再进一步地，所述步骤3)中，Ni-亲和层析柱先用Binding buffer平衡，然后将离心后蛋白上清液倒入层析柱中，再用Wash Buffer洗杂蛋白，最后用Elution Buffer洗脱目的蛋白。
再进一步地，所述Binding buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imidazole；
所述Wash Buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，40mM Imidazole；
所述Elution Buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，1M Imidazole。
本发明的有益效果：
本发明可以便捷高效的获取高纯度的球囊霉素，并具有高表达低成本等优点。为球囊霉素复合物的结构解析奠定基础。
附图说明
图1为HSP60蛋白表达、纯化技术路线图；
图2为蛋白纯化表达实验PCR扩增图；
图3为菌落PCR扩增图；
图4为亲和层析纯化表达图；
图中，B代表诱导前表达菌；A代表诱导后表达菌；P代表沉淀；S代表上清；F表示Fllow through；B代表Binding；W代表Wash；E代表Elution；
图5为纯化后蛋白图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1丛枝菌根真菌的球囊霉素基因获得
1.通过PCR方法扩增获得丛枝菌根真菌Rhizophagus irregularis BGC BJ09的球囊霉素基因序列，该菌株的球囊霉素基因序列在此首次获得，与Uniprot中公布的Rhizophagus irregularis DAOM197198的球囊霉素基因序列同源性高达95％；
2.采用的方法是PCR扩增获得全序列后，通过内含子预测网站预测到内含子后，再次通过PCR方法将外显子序列拼接起来。根据UniProt中公布的球囊霉素蛋白的基因序列设计引物，
正向引物：5’-ATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTCAATAAA-3’；
反向引物：5’-TTACATCATACCCATATCACCCATTCCACC-3’；
内部巢式引物对：5’-TTTCTCCTTCCCTATCTATGGTATCT-3’，
5’-CGGCTCCCTTATTTTCCTCTA-3’，
确定球囊霉素的全基因序列；
3.通过内含子预测网站预测内含子后，分别对4段外显子序列设计引：
引物对1：
5’-gtacttccaatccaatgctATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTC-3’，
5’-CGTCTTgaaccaaccttgCACCAAGGTTTTCAAATTTGTC-3’；
引物对2：
5’-TGcaaggttggttcAAGACGTTGCCAACAAAACTAATGAAGTGG-3’，
5’-TGGCTGAGATTgtagcaacctgaGCTATTTCTTCACTTGTAG-3’；
引物对3：
5’-ggttgctacAATCTCAGCCAATGGTGATACGCATGTTGG-3’，
5’-TATTTTCCTctggagCTTCGGTAATTGTGCATTCTGTCGTTG-3’；
引物对4：
5’-CGAAGctccagaggaaaAGGAAAATAAGGGAGCCG-3’，
5’-gagctcgaattcggatccTTACATCATACCCATATCACCCATTCC-3’，
PCR反应体系(50μL)：
模板2μl
引物各2.5μl
高保真酶25μl
H2O 18μl
PCR反应程序：
PCR反应在PTC-100热循环仪上进行，使用反应程序I：94度预变性5分钟，94度变性30秒，65度(Tm若为55度)退火30秒，72度延伸1min30s。以后每个循环依次降低1度，直到55度，共10个循环。94度变性30秒，55度退火30秒，72度延伸1min30s，共20个循环。72度延伸10分钟。
扩增获得4段外显子后，通过重叠延伸PCR合成丛枝菌根真菌的球囊霉素基因glomalin CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
ATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTCAATAAAGCTCCTCATATAACTATTCCTCCTTCCCTGTCTATGGTATCTAGAAATTCTAAAAGACCGTTTCTATCGCGATTTTATGCTACTCATAAAGAACTTAAATTTGGAGTTGAAGGACGTGCTTCACTATTAAAAGGTGTTGATATTTTAGCTAAGGCAGTAGCTGTTACACTTGGTCCTAAGGGACGTAATGTGTTAATTGAACAACCATATGGTAGCCCTAAGATCACAAAGGACGGCGTCACTGTAGCTAAAAGTATATCACTTAAAGACAAATTTGAAAACCTTGGTGCAAGGTTGGTTCAAGACGTTGCCAACAAAACTAATGAAGTGGCGGGCGATGGTACCACTACCGCCACTATTCTTACAAGAGCAATTTTTGCAGAAGGTGTAAAAAATGTTGCCGCTGGCTGTAATCCGATGGATCTACGTCGTGGAGTTCAAATGGCAGTTGATTCCATTGTCAAATTTCTACGAGAGAAAAGTCGTGTTATTACTACAAGTGAAGAAATAGCTCAGGTTGCTACAATCTCAGCCAATGGTGATACGCATGTTGGTAAATTAATAGCTAATGCTATGGAAAAAGTCGGTAAGGAAGGCGTCATCACAGTAAAAGAAGGAAAGACAATCGAAGATGAGTTAGAAATAACCGAAGGAATGCGTTTTGATCGTGGATATATATCACCATATTTTATCACTGATGCTAAAACTCAAAAAGTTGAATTTGAAAAGCCTTTAATTCTGCTCACAGAGAAAAAAATTTCAATTTTGCAAGATATTTTACCAGCATTAGAAACTTCATCTACACAACGTAGACCGCTTTTAATTATTGCTGAAGATATTGATGGTGAGGCTTTGGCCGCCTGTATCTTGAATAAATTACGTGGCAATCTTCAAGTGGCCGCTGTCAAAGCTCCCGGCTTTGGTGATAATAGAAAATCCATCTTAGGTGATTTAGCTATATTAACAGGTGGAACAGTTTTTTCAGATGAGTTAGATATCAAGCTTGAGCGTGCTACTCCTGATCTTTTCGGTTCAACTGGTTCCGTCACTATTACCAAGGAAGACACAATCCTTCTTAACGGTGAAGGTTCCAAAGATATGATAAATCAACGTTGTGAACAAATCCGTGCTGCAATTAATGATTCGTCTGTTTCTGATTATGAAAGAGAAAAATTACAAGAACGCCTTGCTAAATTGTCAGGTGGCGTAGCTGTTATCAAAGTAGGTGGATCTTCTGAGCTCGAAGTTGGCGAAAAGAAGGATCGTTTTGTTGATGCCTTAAATGCTACACGAGCTGCGGTTGAGGAAGGCACCGTGCCAGGTGGAGGCGTCGCTCTTTTGAAATCTACTAAATGCCTCGATAAATTGACACCCGGCAATTTTGATCAACAATTAGGTATAAATATAATTAAATCAGCACTTCAAAAGCCCGCAAAAATTATTGCGGATAATGCTGGCGAAGAAGGTGCCGTTATTGTTGGCAAAATCCTAGATAATCATACGGATGATTTTAATTATGGATATGATGCTGCTAAGAGCGAGTATGGTGATCTTGTTTCACGTGGTATTGTAGATCCATTGAAAGTTGTAAGAACTGCACTTGTTGATGCTTCAGGTGTCGCCAGTTTATTAACAACGACAGAATGCACAATTACCGAAGCTCCAGAGGAAAATAAGACCGCTGGCGGAATGGGACGTATGGGTGGAATGGGTGGAATGGGTGATATGGGTATGATGTAA
完整的球囊霉素蛋白glomalin编码序列如SEQ ID NO:2所示：
MQRVSQFFNKAPHITIPPSLSMVSRNSKRPFLSRFYATHKELKFGVEGRASLLKGVDILAKAVAVTLGPKGRNVLIEQPYGSPKITKDGVTVAKSISLKDKFENLGARLVQDVANKTNEVAGDGTTTATILTRAIFAEGVKNVAAGCNPMDLRRGVQMAVDSIVKFLREKSRVITTSEEIAQVATISANGDTHVGKLIANAMEKVGKEGVITVKEGKTIEDELEITEGMRFDRGYISPYFITDAKTQKVEFEKPLILLTEKKISILQDILPALETSSTQRRPLLIIAEDIDGEALAACILNKLRGNLQVAAVKAPGFGDNRKSILGDLAILTGGTVFSDELDIKLERATPDLFGSTGSVTITKEDTILLNGEGSKDMINQRCEQIRAAINDSSVSDYEREKLQERLAKLSGGVAVIKVGGSSELEVGEKKDRFVDALNATRAAVEEGTVPGGGVALLKSTKCLDKLTPGNFDQQLGINIIKSALQKPAKIIADNAGEEGAVIVGKILDNHTDDFNYGYDAAKSEYGDLVSRGIVDPLKVVRTALVDASGVASLLTTTECTITEAPEENKTAGGMGRMGGMGGMGDMGMM
实施例2宿主细胞的构建
利用同源重组技术将球囊霉素基因序列重组到载体pET21b上，得到重组表达载体pET21b-glomalin，最后将重组表达载体pET21b-glomalin转入DH5α感受态，在含有氨苄抗性的平板上筛选并鉴定阳性单克隆，进行菌落PCR和测序鉴定正确的重组质粒，保存含有正确重组质粒的DH5α菌株，提取质粒保存-20℃备用。
重组体系(10μL)：
目的片段3μl
质粒2μl
重组酶5μl
50℃重组50min。
实施例3离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法
1.将验证正确的重组质粒转入到大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态中，复苏后转至5ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，200r/min下摇培过夜，次日将菌液按照1:100的比例扩大培养1L，待OD600值达到0.6-0.8左右，将菌液转至16℃，加入终浓度为1mMIPTG，200r/min诱导过夜；
2.诱导后的细胞经5000rpm，25℃，离心10min，弃上清，用30ml Binding buffer重悬细胞，用高压破碎仪破碎细胞，12000r/min、4℃离心1h，收集蛋白上清液。
3.分别取20μl诱导前后细胞和破碎前后溶液，命名为Before/After induction(B/A)，Broken supernatant/precipitation(S/P)，用于检测目的蛋白是否成功诱导以及诱导条件是否合适；Ni-亲和层析柱经Binding buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mMImidazole)平衡后，将蛋白上清液倒入层析柱中，然后分别用Binding buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，20mM Imidazole)和Washing buffer(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，40mMImidazole)洗脱非特异性杂蛋白，一次洗10ml，共洗2次，取20μl穿过层析柱的Bindingbuffer液和Wash Buffer液，分别命名为B(Binding)和W(Wash)，用于检测非特异性结合的杂蛋白洗脱情况；最后用Elution buffer洗脱目的蛋白，1ml/次进行洗脱，直至检测不到目的蛋白停止洗脱，取20μl穿过层析柱的Elution Buffer液，命名为E(Elution)，用于检测目的蛋白洗脱情况，对每一步收集的样品进行SDS-PAGE检测，评估目的蛋白是否表达，表达大小是否正确以及条带是否单一。亲和纯化后的球囊霉素可放入透析袋透析8h，收集透析后的蛋白用于生化实验，4℃保存备用。
目的蛋白纯化表达PCR扩增结果见图2，菌落PCR结果见图3，亲和层析纯化结果见图4，1L培养基可获得10mg左右纯化后的蛋白。经质谱鉴定纯化的蛋白为球囊霉素(图5)。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种丛枝菌根真菌的球囊霉素基因glomalin，其特征在于：所述球囊霉素基因glomalin CDS的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种权利要求1所述的球囊霉素基因编码的球囊霉素glomalin，其特征在于：所述球囊霉素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为含有权利要求1所述的球囊霉素基因的表达载体，其中，所述表达载体为pET21b。
4.含有权利要求3所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态。
5.一种权利要求4所述宿主细胞的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取丛枝菌根真菌的基因组；
2)设计引物对：
引物对1：
5’-ATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTCAATAAA-3’，
5’-TTACATCATACCCATATCACCCATTCCACC-3’；
引物对2：
5’-TTTCTCCTTCCCTATCTATGGTATCT-3’，
5’-CGGCTCCCTTATTTTCCTCTA-3’；
引物对3：
5’-gtacttccaatccaatgctATGCAGCGCGTCTCACAATTTTTC-3’，
5’-CGTCTTgaaccaaccttgCACCAAGGTTTTCAAATTTGTC-3’；
引物对4：
5’-TGcaaggttggttcAAGACGTTGCCAACAAAACTAATGAAGTGG-3’，
5’-TGGCTGAGATTgtagcaacctgaGCTATTTCTTCACTTGTAG-3’；
引物对5：
5’-ggttgctacAATCTCAGCCAATGGTGATACGCATGTTGG-3’，
5’-TATTTTCCTctggagCTTCGGTAATTGTGCATTCTGTCGTTG-3’；
引物对6：
5’-CGAAGctccagaggaaaAGGAAAATAAGGGAGCCG-3’，
5’-gagctcgaattcggatccTTACATCATACCCATATCACCCATTCC-3’；
3)以丛枝菌根真菌的基因组为模板，进行PCR；得到球囊霉素的DNA片段；
4)将球囊霉素的DNA片段克隆到大肠杆菌表达载体pET21b中，构建融合重组表达载体pET21b-glomalin；
5)将重组表达载体转入大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态中，得到宿主细胞。
6.离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将权利要求4所述的宿主细胞经IPTG诱导表达；
2)收集细菌，破碎，离心，获得融合蛋白；
3)融合蛋白经Ni-亲和层析柱进行纯化，获得目的蛋白，即为球囊霉素。
7.根据权利要求6所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，收集细菌细胞后，重悬在Binding buffer中，用高压破碎仪进行破碎，其中，所述Binding buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imidazole。
8.根据权利要求6所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，离心条件为12000r/min、4℃离心1h。
9.根据权利要求6所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，Ni-亲和层析柱先用Binding buffer平衡，然后将离心后蛋白上清液倒入层析柱中，再用Wash Buffer洗杂蛋白，最后用Elution Buffer洗脱目的蛋白。
10.根据权利要求9所述离体表达纯化获得高纯度球囊霉素的制备方法，其特征在于：所述Binding buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，20mM Imidazole；
所述Wash Buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，40mM Imidazole；
所述Elution Buffer包括20mM Tris，300mM NaCl，1M Imidazole。
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