WO2006056466A2 - Verfahren zur ortsspezifischen synthese von biopolymeren auf festen trägern - Google Patents

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Torsten Schulz
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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to methods for the site-specific synthesis of biopolymers such as nucleic acids or peptides with a defined sequence on predetermined areas of a solid support. Furthermore, the invention relates to methods for the site-specific synthesis of biopolymers and their respective derivatives on solid supports, wherein the local discrimination of the synthesis is carried out by using masks, the aqueous activating reagents for the deprotection lead to predetermined areas on the support.
  • the novel processes are particularly suitable for producing microarrays with molecular probes immobilized on predetermined regions in the form of biopolymers.
  • EP 0 619 321, EP 0 946 286 and US 5,143,854 describe methods for producing microarrays in which predetermined areas of the support are activated by exposure.
  • VLSIPS very large scale immobilized polymer synthesis
  • expensive photolabile protective groups or photoactivatable catalysts and a high expenditure on apparatus are required.
  • the masks are screwed onto the surface of the carrier. In each case a complete synthesis cycle per channel is carried out.
  • WO 98/36827 a method for generating substance libraries on a solid support using masks is described.
  • a microstructured silicone membrane can be used as the mask.
  • the mask serves to cover defined areas of a carrier.
  • the openings in the membrane or mask allow the implementation of synthesis or immobilization steps on the uncovered areas of the carrier.
  • US 5,658,734 discloses a process for synthesizing a plurality of chemical compounds of different structure on a support using a photoresist layer to cover certain areas on the labile-protecting support.
  • the photoresist layer is exposed and developed.
  • the labile protecting groups are removed from the areas not covered by the photoresist layer, and a conventional synthesis cycle for the production of oligomers from amino acids, nucleotides, and the like.
  • a similar method for the immobilization of oligonucleotides is also described in US 5,688,642.
  • No. 5,599,695 describes a process in which customary processes for the preparation of molecular libraries are used in printing technology. This selectively applies a barrier layer in liquid form or as a vapor to the surface of a support to create a pattern for the selective attachment of molecules to the support.
  • a barrier layer in liquid form or as a vapor to the surface of a support to create a pattern for the selective attachment of molecules to the support.
  • e.g. Silicone oil serve as a boundary layer.
  • the deprotection is carried out by means of gaseous deprotection reagents. Such a procedure has the disadvantage that the liquid
  • Boundary layer material can be penetrated by gaseous deprotection reagent. Furthermore, the precision of the process is limited by the possibility of smearing or flowing of the reagents used.
  • the object of the present invention is to overcome the above-mentioned problems of the prior art.
  • biopolymer libraries in the form of microarrays can be applied to a multiplicity of carrier materials.
  • a particular object is to provide a method in which masks can be used to ensure the site-specific synthesis of biopolymers, which can be mounted in a simple manner positionally accurate on the substrate of a microarray.
  • a further object of the present invention is to provide a method for the site-specific synthesis of a plurality of biopolymers each having a defined sequence, in which masks are used, which can be removed from the support surface, without affecting monomer components already attached to the support surface.
  • a process for the site-specific synthesis of biopolymers of a defined sequence on a solid support by stepwise coupling of monomer and / or oligomer units is provided, wherein in each case before a coupling step temporary protecting groups for reactive groups on the support and / or Intermediates of the biopolymers to be synthesized are removed by adding an aqueous solution of an activating reagent.
  • Another object of the present invention is a method for the site-specific synthesis of biopolymers of a defined sequence on predetermined areas of a solid support by stepwise coupling of
  • Monomeric and / or Oligomerbausteinen wherein in each case prior to a coupling step to at least one predetermined area temporary protective groups for reactive groups on the support and / or intermediates of the biopolymers to be synthesized are removed by adding an aqueous solution of an activating reagent.
  • Another object of the present invention is a process for the site-specific synthesis of biopolymers of a defined sequence on vor ⁇ certain areas of a solid support, comprising the following steps:
  • a further subject of the present invention is a process for the site-specific synthesis of biopolymers of a defined sequence on predetermined regions of a solid support, comprising the following steps:
  • a further subject of the present invention is a process for the site-specific synthesis of biopolymers of a defined sequence on predetermined regions of a solid support, comprising the following steps: a) arranging an elastomeric mask on the support, wherein on the support for the coupling of monomer and / or oligomer building blocks of the biopolymer to be synthesized available reactive groups are provided with protective groups; b) Activating reactive groups by removing temporary ones
  • Protecting groups on the areas defined by the mask by adding an activating reagent; c) coupling of a monomer and / or oligomer component to reactive groups activated in step b); and d) repeating steps a) through c) until the desired biopolymers are synthesized on predetermined regions of the support.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the inventive method for producing a microarray with immobilized on predetermined areas of a carrier biopolymer probes.
  • Another object of the present invention is the use of deprotection reagents in aqueous solution to cleave temporary protecting groups in the synthesis of biopolymers.
  • biopolymers having an identical sequence of monomers and an identical sequence length
  • Biopolymers at different predetermined ranges may differ in their sequence from monomers.
  • the number of different biopolymer species on the support can be arbitrarily set by suitable selection and arrangement of masks, for example, and is limited only by the number of predetermined ranges. In an extreme case, the number of predetermined regions on the carrier after completion of the method according to the invention corresponds to the number of different biopolymer species on the carrier.
  • a prerequisite for ensuring a high degree of purity of a biopolymer species synthesized on a predetermined region of the support is that the mask can be attached so tightly to the support, only to those through the mask predetermined, ie Protective groups not covered by the mask areas are removed.
  • the use of aqueous activating or deprotecting reagents has the significant advantage of allowing the use of masks of elastomers and thus avoiding a change in the geometric shape resulting from the use of organic solvents or a swelling of such a masking material. Such swelling of a mask consisting of elastomers would lead to a reduction of the adhesion forces between the mask and the support, to the detachment of the mask from the support, and thus, inter alia, to contaminations in covered areas of the support.
  • masks made of elastomers are advantageous because no external force, such as screws or staples, is required to seal the mask to align on the surface of the carrier.
  • the mask is preferably sealed to the support surface solely by adhesion between the support and mask material. As a rule, the mask is thereby aligned on markings applied to the carrier surface.
  • the processes according to the invention can be carried out with a large number of support materials and in particular with all conventional support materials.
  • suitable support materials are glass and silica.
  • such combinations of masking and support materials are suitable for the methods according to the invention, which ensure sufficient adhesion between the support and the mask such that the mask can be arranged sealingly on the support without the action of an external force.
  • the methods according to the invention for the synthesis of a multiplicity of biopolymer species on respectively predetermined regions of a solid support furthermore have the advantage that essentially the reagents customarily used in the solid-phase synthesis of biopolymers can be used.
  • the disadvantages associated with the UV exposure of the VLSIPS process for producing microarrays described in the prior art can thus be avoided.
  • the methods of the invention also allow for a high degree of parallelizability so that a variety of biopolymer species of different sequence can be synthesized in parallel and site-specifically on predetermined regions of a solid support.
  • a probe or a probe molecule or a molecular probe is understood as meaning a molecule, in particular a biopolymer, which is used for the detection of other molecules by a specific, characteristic binding behavior or a specific reactivity.
  • a probe or a probe molecule or a molecular probe is understood as meaning a molecule, in particular a biopolymer, which is used for the detection of other molecules by a specific, characteristic binding behavior or a specific reactivity.
  • the probes arranged on the carrier in particular in the form of an array, it is possible to use any type of molecules which can be coupled to solid surfaces and have a specific affinity.
  • the biopolymer probes are, in particular, biopolymers from the classes of the peptides, proteins, antigens, antibodies, carbohydrates, nucleic acids and / or their analogs and / or mixed polymers of the abovementioned biopolymers.
  • the probes are particularly preferably nucleic acids and / or nucleic acid analogs.
  • nucleic acid molecules of defined and known sequence are used as probes which are used to detect target molecules, such as nucleic acids or nucleic acid-binding agents of other substance classes, in hybridization methods.
  • target molecules such as nucleic acids or nucleic acid-binding agents of other substance classes
  • both DNA and RNA molecules can be used.
  • the nucleic acid probes or oligonucleotide probes may be oligonucleotides having a length of 10 to 100 bases, preferably 15 to 50 bases and more preferably 20 to 30 bases in length.
  • the probes are single-stranded nucleic acid molecules or molecules of nucleic acid analogs, preferably single-stranded DNA molecules or RNA molecules, which have at least one sequence region which is complementary to a sequence region of the target molecules.
  • the probes or biopolymers can be immobilized on a solid carrier substrate, for example in the form of a microarray. Furthermore they may be labeled depending on the detection method, so that they can be detected by a conventional detection reaction in the art.
  • a target or a target molecule is understood to be the molecule to be detected by a molecular probe.
  • the targets to be detected are nucleic acids.
  • a microarray produced according to the invention can also be used analogously for the detection of peptide / probe interactions, protein / probe interactions, carbohydrate / probe interactions, antibody / probe interactions, etc.
  • the targets are nucleic acids or nucleic acid molecules which are detected by hybridization against biopolymer probes arranged on a probe array
  • these target molecules generally comprise sequences with a length of 10 to 10,000 bases , preferably from 15 to 2000 bases, also preferably from 15 to 1000 bases, more preferably from 15 to 500 bases, and most preferably from 15 to 200 bases. Further examples of preferred sequence lengths are 20, 30 or 60 bases.
  • Their sequence optionally includes the sequences of primers as well as template regions defined by the primers.
  • the target molecules may in particular be single-stranded or double-stranded nucleic acid molecules of which one strand or both strands are labeled, so that they can be detected in one of the detection methods customary in the prior art.
  • the target sequence according to the invention is the sequence region of the target, which is detected by hybridization with the probe. According to the invention, it is also said that this area is addressed by the probe.
  • a substance library is understood to mean a multiplicity of different probe molecules, preferably at least two to 1,000,000 different molecules, more preferably at least 10 to 10,000 different molecules, and most preferably 100 to 1,000 different molecules.
  • a substance library can also comprise only at least 50 or fewer or at least 30,000 different molecules.
  • the substance library is preferably arranged as an array on a support.
  • a probe array or biopolymer array is understood as meaning an arrangement of molecular probes or biopolymers or a substance library on a support, the position of each probe species being determined separately.
  • the array comprises defined locations or predetermined areas, so-called array elements, which are particularly preferably arranged in a specific pattern, wherein each array element usually contains essentially only one species of probes.
  • the arrangement of the molecules or probes on the support can be generated by covalent or non-covalent interactions.
  • the probes are arranged on the reaction chamber facing side of the carrier. A position within the array, i. of the array is commonly referred to as a spot.
  • an area intended for the deposition of a species of molecular probes is defined as an area under an array element or a predetermined area or a spot or an array spot Surface of a carrier understood.
  • One species of molecular probes are in particular biopolymers with the same sequence of monomers. The sum of all occupied array elements is the probe array.
  • the spot has a square shape. The edge length of such a square spot is preferably about 2 ⁇ m to about 128 ⁇ m, more preferably about 32 ⁇ m.
  • substrate is understood to mean a solid on which the biopolymers, preferably in the form of a probe array or biopolymer array, can be synthesized.
  • the carrier which is commonly referred to as a matrix, slide or wafer, may be e.g. to act silicon, silicon dioxide, glass, plastics, ceramics, glass-ceramic, quartz.
  • Carrier e.g. of the aforementioned materials and / or other conceivable materials, may be coated, e.g. with polymers.
  • the layer may e.g. be generated from a gaseous, liquid, dissolved, solid starting state of the material to be applied. If the carrier has such a layer, e.g. a polymer layer, it is referred to in the context of the present invention as a substrate.
  • arrays or microarrays in the context of the present invention comprise about 2 to 10,000, preferably 10 to 2,000 and particularly preferably at least 50 or at least 150 spots on a preferably square area of, for example, 1 mm to 5 mm ⁇ 1 mm to 5 mm, preferably 2mm x 2mm or 3mm x 3mm or 4.5mm x 4.5mm or about 17.64mm 2 .
  • the spots each have a defined species of probe molecules or biopolymers. In general, the spots of an array each have different species of probe molecules or biopolymers. Usually, however, an array also includes redundant spots, ie spots with the same species of probe molecules.
  • microarrays in the present invention include from about 50 to about 80,000, preferably from about 100 to about 65,000, more preferably from about 1,000 to about 10,000 spots, preferably different species, of probe molecules in an area of several mm to several cm 2 , preferably about 1 mm to 10 cm 2 , more preferably about 2 mm to about 1 cm, and most preferably about 4 mm to about 25 mm.
  • a conventional microarray has from 2 to 65,000 spots or, preferably, different, species of probe molecules in an area of about 4.2 mm x about 4.2 mm.
  • exemplary sizes of the surfaces of the microarray or the surfaces for the synthesis of the biopolymers are about 1 to 10 mm x about 1 to 10 mm, preferably about 2 to 5 mm x about 2 to 5 mm and particularly preferably about 3.5 to 4 , 5 mm x about 3.5 to 4.5 mm.
  • surface area and / or density data normally relate to the base area of the microarray.
  • the base area of a microarray results from the side lengths or edge lengths of the microarray.
  • a microarray with an area of, for example, 4.2 mm ⁇ 4.2 mm thus has a square base area of 17.64 mm 2 and a side length of 4.2 mm.
  • a marker or a marker in the context of the present invention denotes a detectable entity, for example a fluorophore or an anchor group, to which a detectable entity can be coupled.
  • the sample or sample solution or analyte is the liquid to be analyzed with the target molecules to be detected and optionally amplified.
  • a molecular interaction or an interaction is understood in particular to mean a specific, covalent or non-covalent bond between a target molecule and an immobilized probe molecule.
  • the interaction between probe and target molecules is a hybridization.
  • Hybridization is the formation of double-stranded nucleic acid molecules or duplex molecules from complementary single-stranded nucleic acid molecules.
  • the association preferably always takes place in pairs of A and T or G and C.
  • An association can preferably also take place via non-cationic base pairings. This is understood to mean base pairings with noncanonical bases or nucleotides whose nucleobase is derived from the pyrimidine or purine skeleton but has a different pattern of hydrogen bond donors or acceptors.
  • nucleobases such as xanthine or hypoxanthine are able to form stable base pairings, so-called wobble-base pairings, with different canonical bases.
  • adenosine or thymidine are known for hypoxanthine or its nucleoside inosine stable mating complexes with the nucleosides cytidine.
  • the individual base pairs show a graded stability in this system.
  • the installation of non-canonical bases, which allow wobble base pairings with the target sequences to be analyzed, into probe sequences at the sites of a possible point mutation of a target sequence to be analyzed allows the detection of alleles of this target sequence with a probe species, if their detection is independent of the presence of the Point mutation should take place.
  • the incorporation of non-canonical nucleotides into a probe sequence is particularly advantageous in regions of spacer regions between highly conserved regions of the probe sequence which are responsible for addressing a target.
  • duplexes can also be formed with nucleic acid analogs, e.g. DNA PNA duplexes, RNA PNA duplexes, DNA LNA duplexes and RNA LNA duplexes.
  • nucleic acid analogs e.g. DNA PNA duplexes, RNA PNA duplexes, DNA LNA duplexes and RNA LNA duplexes.
  • biopolymers are understood as meaning synthetically produced polymers which are formed via polymerization reactions and contain identical or similar building blocks or monomer building blocks, such as naturally occurring macromolecules, such as, for example, Nucleic acids, polysaccharides or peptides or proteins.
  • the biopolymers are peptides, proteins, antigens, antibodies, carbohydrates, nucleic acids and / or their analogs and / or copolymers of the abovementioned biopolymers.
  • biopolymers with identical sequence ie with identical sequence
  • a species of biopolymers Monomers ie with identical sequence
  • the complete desired length ie number of monomers understood.
  • biopolymers Essentially only one species of biopolymers is understood in the context of the present invention to mean a certain degree of purity of biopolymers having an identical or identical sequence, ie also a complete length, over a predetermined range. Thus, for example, at a polymer length of 10 to 30, preferably 15 to 25, and most preferably about 20, with substantially only one species of biopolymers, a purity of biopolymers of identical or equal sequence on a predetermined range of at least about 10% or at least about 30%, preferably at least about 50% and more preferably at least about 75% understood.
  • the degree of purity or purity P or percentage P determined by the formula P S M , where S is the average step yield in the coupling of a monomer and / or oligomer component, wherein the average step yield S at least 90%, preferably at least 97%, more preferably at least 98% and most preferably at least 99%.
  • Monomers or monomer units in the context of the present invention are all compounds from which biopolymers can be synthesized via polymerization reactions.
  • a monomer is understood in particular to mean a building block which can form one or more constitutional units whose (multiple) repetition yields a biopolymer as constitutional repeating units.
  • Constitutional units or monomers in biopolymers are, for example, nucleotides and amino acids.
  • an oligomer or oligomer component is understood to mean a sequence of monomers which is preferably a partial sequence of the biopolymers to be synthesized.
  • the oligomers used in the process according to the invention can be provided in particular by classical solid-phase synthesis, as described, for example, for peptides and oligonucleotides.
  • a reactive group or functionality is understood as meaning a functional group of the carrier or of a monomer or oligomer component which has a coupling reaction, in particular a condensation reaction, with the corresponding reactive group of a further monomer or oligomer component or the carrier allows.
  • Reactive groups of amino acid building blocks are in particular amino and carboxyl groups.
  • Reactive groups of nucleotide units are, in particular, hydroxyl and phosphate or phosphoric ester or activated phosphoric ester groups, such as phosphotriester and / or phosphoramidite groups.
  • a monomer or oligomer component used in the process according to the invention has at least two reactive groups, one of which serves for coupling to free reactive groups present on the carrier surface or to intermediates of the biopolymers to be synthesized with free reactive groups and the other for the coupling Another monomer or Oligomer ⁇ building block in the next coupling step is used.
  • monomeric or oligomer building blocks are used in a coupling step in the inventive method, in which the reactive group serving for coupling to the support surface or to intermediates of the biopolymers to be synthesized is free, ie not with a protective group is provided, while serving for the coupling of another monomer or Oligomerbausteins in the next coupling step reactive group is protected by a protecting group, in particular a temporary protecting group.
  • Reactive groups available on the support for the coupling of monomer and / or oligomer building blocks of the biopolymer to be synthesized are reactive groups or functionalities with which the support is provided and those for the coupling of the first monomer or oligomer serve building blocks. If the synthesis has already advanced, reactive groups available on the support for the coupling of monomer and / or oligomer building blocks of the biopolymer to be synthesized are understood as functionalities or reactive groups of the intermediate of the biopolymer to be synthesized which are suitable for the coupling of further monomer and / or Oligomerbausteinen serve.
  • an intermediate or intermediate product of the biopolymer to be synthesized is understood to mean, in particular, a polymer chain of monomer units which is already immobilized or synthesized on the support and corresponds to a partial sequence of the desired biopolymer.
  • An intermediate is present after performing at least one coupling step, i. the coupling of at least one monomer or Oligomerbausteins to the carrier.
  • a coupling step in the context of the present invention comprises in particular the activation or deprotection of a reactive group for the coupling of a monomer or oligomer component, the actual coupling reaction between reactive group and monomer or oligomer component and optionally the subsequent capping of the coupled monomer or oligomer component.
  • step yield S is understood in the context of the present invention, the yield of a coupling step.
  • Temporary protective groups in the context of the present invention are those radicals with which certain functional groups of a molecule containing one or more reactive centers, e.g. a monomer, and / or functional groups on the support surface can be temporarily protected against the attack of reagents so that reactions such as condensations of monomer or oligomer building blocks take place only at the desired (unprotected) sites.
  • numerous protecting groups have been developed for amino and carboxy groups of amino acids, which are intended to react with each other with the highest possible yields exclusively with their unprotected functional groups to peptides or proteins.
  • Analogous protecting groups are also used in polynucleotide synthesis.
  • Examples of temporary protecting groups in the peptide synthesis are the acid-labile Boc (tert-butyloxycarbonate) and the base-labile Fmoc (fluorenyl-9-methoxycarbonyl) group.
  • Examples of temporary protecting groups in polynucleotide synthesis are the acid labile DMT (dimethoxytrityl) group and photolabile protecting groups as described, inter alia. in US Pat. No. 5,744,305.
  • pennantent protecting groups are radicals which can protect certain functional groups of the monomer building blocks against the attack of reagents during the entire synthesis of the biopolymers, so that reactions such as condensations of monomer or oligomer building blocks can only take place at the desired (unprotected ) Jobs take place.
  • Such permanent protecting groups serve in particular for the protection of functional groups in the side chains of amino acid residues or Nucleobases and are preferably cleaved only after completion of Biopolymersynthese.
  • Examples of permanent protecting groups in peptide synthesis are the Z- (benzyloxycarbonyl) and the Bzl (benzyl) groups.
  • Examples of permanent protecting groups in the polynucleotide synthesis are the Bz (benzoyl), the iBu (isobutyryl) and the TBDMS (t-butyldimethylsilyl) group.
  • an activating reagent is understood as meaning a reagent which comprises functional groups of a molecule, e.g. a monomer or Oligomerbausteins, released or generated, so that reactions such as condensation with other monomer or Oligomerbausteinen can take place on the liberated or generated functional groups.
  • Activation reagents in the context of the present invention are, in particular, deprotection reagents.
  • a deprotection reagent is understood as meaning a reagent which is suitable for the specific removal of protective groups of reactive groups, so that reactions such as condensations of monomer or oligomer units on the desired (unprotected) reactive groups can take place.
  • deprotection reagents in particular for the removal of acid-labile protective groups, are methanesulfonic acid, oxalic acid, trifluoromethanesulfonic acid and / or mineral acids such as hydrochloric acid.
  • the activation or deprotection reagents are preferably used in aqueous solution in the context of the present invention. For example, about 2% to about 40% aqueous solutions, preferably about 5% to about 35% aqueous solutions and more preferably about 10% aqueous solutions of activation or
  • Deprotection reagents such as methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, oxalic acid and / or mineral acids are used in the process according to the invention. It will be readily appreciated by those skilled in the art how the concentration of deprotection reagent is correlated with the duration of the deprotection reaction. Thus, for example, 10% aqueous solutions of oxalic acid or methanesulfonic acid are particularly preferably used for activating DMT-protected nucleic acids in the processes according to the invention. Furthermore, the use of stronger acids is possible, for example, in the synthesis of polypeptides than in the synthesis of nucleic acids, since unlike the synthesis of nucleic acids, no side reactions such as depurination occur here.
  • a mask is understood as meaning a solid material which is provided with cavities, recesses or islands and / or channels, so that, when the mask is arranged on the carrier surface, areas of the support which pass through the cavities, recesses and / or channels or channels are given, are accessible to the Biopolymersynthese or the addition of reagents such as activating reagents, while the covered by the mask areas of the carrier due to the sealing arrangement of the mask on the support are not accessible to reagents.
  • the regions predetermined by the mask ie the regions not covered by the mask, are identical to predetermined regions of the support selected in each case for the synthesis of a species of biopolymers.
  • the through the mask covered areas have a different geometry than the spots.
  • the areas covered by the mask may, for example, have rectangular geometries, while the geometries of the spots on the carrier are, for example, circular.
  • the masks used in the inventive method at least one opening for filling and emptying with reagents.
  • a mask used in the context of the present invention does not react with the biopolymers or biopolymer intermediates synthesized on the support surface.
  • Such a mask is further adapted to be mounted on the support surface such that the mask material rests sealingly on the support surface.
  • the masks have one, preferably a plurality of inlet and outlet channels having a width of about 2 ⁇ m to about 2 mm or about 2048 ⁇ m, more preferably from about 10 ⁇ m to about 512 ⁇ m, and most preferably about 32 ⁇ m to about 128 ⁇ m.
  • the channels are usually linear, with the length of a linear channel at least equal to the length of an array.
  • Such a channel may have one or more islands, in which case the channel widths are preferably larger than the widths of the respective islands.
  • Particularly preferred in this case are channels whose width correspond to the active area of the respective chip and, for example, have a width of approximately 2048 ⁇ m.
  • the islands have a length and / or width of from about 2 ⁇ m to about 2 mm, more preferably from about 10 ⁇ m to about 512 ⁇ m, and most preferably from about 32 ⁇ m to about 128 ⁇ m.
  • elastomers are polymers having rubber-elastic behavior which can be repeatedly stretched at room temperature to at least two times their length and, after cancellation of the constraint required for the elongation, immediately return approximately to their initial length (see, for example, DIN 7724).
  • elastomers are silicone elastomers such as PDMS (polydimethylsiloxane) and rubber derivatives.
  • an elastomer mask or a mask comprising elastomers or a mask comprising elastomers is understood to mean a mask in which at least the side of the mask which contacts the wearer is provided with a layer of one or more elastomers.
  • a dense or sealing connection between the mask and the support is understood to mean a support of the mask on the support such that the regions of the support which are not covered by the mask, for example through the channels of the mask, preferably in solution, are supplied Do not allow reagents to enter areas of the support covered by the mask.
  • a derivatization of the support is understood to mean that the support surface is provided with functional groups which ensure the attachment of spacers or linkers and / or monomer building blocks.
  • the derivatization of a carrier is carried out by applying a polymer to the carrier, wherein the polymer is provided with functional groups which ensure the attachment of linkers and / or Monomer ⁇ building blocks.
  • the arrangement of carriers with a polymer layer applied thereto is also referred to below as the substrate.
  • the support or the substrate is preferably derivatized with an epoxide group-bearing compound.
  • linkers or spacers are understood as meaning molecular groups which link functional groups on the support surface with monomer building blocks of the biopolymer to be synthesized.
  • the linkers or spacers used in the context of the present invention can be straight-chain or branched.
  • Preferred linkers or spacers are in particular selected from polyethylene glycol and polymers functionalized with epoxy groups, such as e.g. epoxy-functionalized silanes. Branches can be generated, for example, by polymer spacers or linkers comprising glycerol building blocks.
  • linkers or spacers in particular for the coupling of DNA to the support or the substrate, are polyethers (ROR ') such as mixed polymers of bisepoxide and polyethylene glycol, polyurethanes (RNHC (O) OR'), such as mixed polymers Alkoxy and diisocyanates and copolymers of aryloxy, alkoxy and diisocyanates, polythiocarbamates (RNHC (O) SR ') such as copolymers of alkoxy and diisothiocyanates and copolymers of bismercaptans and diisocyanates, and polydithiocarbamates (RNHC (S) SR') such as copolymers of dithiol and diisothiocyanates.
  • ROR ' such as mixed polymers of bisepoxide and polyethylene glycol
  • polyurethanes RNHC (O) OR'
  • RNHC (O) OR') such as mixed polymers Alkoxy and diisocyanates and copo
  • RSH Mercapto functions
  • epoxy-functionalized silanes and dithiols can be used.
  • substrates with aminated surfaces (RNH 2 ) for example, amino-functionalized silanes are used as linkers or spacers.
  • An object of the present invention is thus a process for the site-specific synthesis of biopolymers of a defined sequence on predetermined areas of a solid support by stepwise coupling of monomer and / or oligomer building blocks, wherein in each case before a coupling step on at least one predetermined region of the support for the coupling a monomeric and / or oligomer component available reactive groups are activated by removing temporary protecting groups on these reactive groups by adding an activating reagent in aqueous solution.
  • An essential feature of the inventive method is that the site-specific synthesis of a variety of biopolymer species each having a defined sequence on predetermined areas of a solid support using aqueous reagents for the activation of reactive groups takes place.
  • the activation of the reactive groups takes place in particular by removal of temporary radicals located on these reactive groups
  • Protecting groups by deprotection reagents in aqueous solution are removed from those predetermined areas of the carrier which are predetermined by a mask arranged on the carrier.
  • inventive methods allow the use of conventional reagents for the synthesis of biopolymers and allow the synthesis of biopolymer substance libraries on miniaturized carriers in array format. Thus, it is possible to synthesize in situ by means of the process according to the invention
  • Biopolymers can be used in particular as molecular probes in detection methods in array format.
  • the biopolymers synthesized on predetermined regions of the carrier together with the carrier form the microarray or biochip.
  • the biopolymers to be synthesized are preferably selected from nucleic acids, peptides and peptide nucleic acids.
  • the selection of biopolymers is e.g. depending on the use of a microarray which can be produced by the method according to the invention, in which the synthesized biopolymers correspond to probe molecules for the detection of target molecules in a sample to be analyzed.
  • the local discrimination of the synthesis such that essentially only one species of biopolymers having the same sequence is present on a predetermined region of the support is ensured, in particular by using masks, the aqueous reagents for the removal of protective groups in a targeted manner to the areas predetermined by the mask to lead.
  • the site specificity of the synthesis is thus achieved by a masking strategy in which the deprotecting reagents, ie the activating or deprotecting reagents, through the use of mechanical masks, can only wet the areas not covered by the mask on the surface of the support.
  • the masks used in the invention not only allow the Provision of continuous channels, but possibly also the coverage of individual predetermined areas or spots of the array.
  • the density of the spots on the carrier surface is predetermined by the positioning and miniaturization of channels or cavities of the masks.
  • a density of predetermined areas on the microarray of, for example, at least 1,500 spots per cm 2 , preferably at least 2,500 spots per cm, more preferably at least 10,000 spots per cm 2, and most preferably at least 25,000 to one million Reach spots per cm 2 .
  • the details of the density of spots are generally based on the base area of the microarray, which in turn results from the side or edge lengths of the microarray.
  • the support surface is at most 1 cm 2 , at most 25 mm 2 , at most 17.64 mm 2 , at most 4 mm, at most 1 mm or at most 100 microns.
  • a method according to the invention thus comprises in particular the following steps:
  • the activating or deprotecting reagents are preferably selected from oxalic acid, methanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, hydrochloric acid and / or sodium hydroxide and preferably used in aqueous solution.
  • aqueous solutions of the aforementioned activating reagents it is possible in particular to use preferred protective groups, e.g. Remove dimethoxytrityl in polynucleotide synthesis and t-butyloxycarbonyl in peptide synthesis.
  • only the deprotection is carried out using the mask so that the remainder of the synthesis cycle can be open to attach a monomer, ie without a mask, for example, in a conventional synthesis chamber.
  • masking and supporting material are selected such that the mask arranged on the carrier is tightly connected to the latter, for example by the mask adhering to the carrier by adhesion.
  • the support is preferably selected from silicon such as silicon dioxide, glasses such as soda-lime glasses, borosilicate glasses, Borofloat glasses, eg BF 33 glass (Schott, Mainz, Germany), quartz glass, quartz, monocrystalline CaF 2 , sapphire disks, topaz and / or plastics such as PMMA and / or polycarbonate, ceramics, Ta 2 O 5 , TiO 2 , Si 3 N 4 and / or Al 2 O 3 .
  • the support is particularly preferably made of silicon or borofloat glass.
  • the masks used are preferably made of inert, not participating in the Biopolymersynthese materials.
  • the masks used according to the invention have the significant advantage that they can be detached from the carrier material without impairing their functionality. Thus, they differ from the photoresist layers described in the prior art as mask material, which can only be removed from the support by dissolving the layer.
  • the application of the mask on the support leads to the formation of islands possibly provided with channels or of free spaces between the places where no mask material rests.
  • the activation or deprotection reagents can then flow into the free spaces, i. the mask serves for the selective activation, in particular the selective deprotection.
  • the free spaces or cavities formed by such channels can be any basic shapes such as square, rectangular, circular u. Like. Accept. Such a cavity can make several spots, for example two to ten spots, but also only one spot or all spots available for reagents.
  • the mask and the support are preferably positioned to each other with an accuracy of a few microns, more preferably about 1.5 microns to about 3 microns, and most preferably about 1 micron to about 2 microns.
  • the distance between the predetermined areas is thus substantially less than that in the spotting method, since in the latter method, the limiting factor is the drop size and their distance from one another.
  • the methods of the invention enable a much higher density of predetermined regions on the support to be provided.
  • the positioning of the mask on the carrier is preferably carried out by mounted on the carrier markings.
  • microarrays can be formed with any combination of biopolymer probes.
  • masks made of elastomers are used. Particularly preferred are masks of polydimethylsiloxane.
  • the use of elastomers ensures adhesion between the backing and the mask without the need for an external force to seal the mask to the backing.
  • Such a layer of elastomers is usually applied in this embodiment of the mask on a solid body such as glass or plastic.
  • the mask when using a polydimethylsiloxane mask, the mask is positioned on the support with the highest possible accuracy and adhesively and sealingly connected by contact of the polydimethylsiloxane mask with the synthesis surface of the support.
  • the composite of carriers or wafers with the masks which have geometric structures such as channels with punches or islands, generates corresponding cavities through which the deprotection reagent can flow and thus activate the surface of the wafer for the subsequent synthesis step.
  • a carrier which has a surface roughness.
  • Such carriers with a rough carrier surface have a number of advantages, in particular when the biopolymers produced according to the invention are used as probes in array experiments.
  • Providing a rough surface on the support increases the number of potential immobilization sites for the biopolymers to be synthesized. This leads to an increased dynamic measuring range as well as an improved signal-to-noise ratio when carrying out detection methods by means of the microarrays produced according to the invention.
  • the use of rough surface carriers thus allows for improved analysis of small sample volumes.
  • the accessibility of the synthesized biopolymers on a rough surface for molecules to be analyzed is improved, whereby a faster and more complete interaction between target and the probes, namely the synthesized biopolymers.
  • kinetic processes that occur in the microarray analysis such as the supply of reagents, rinsing steps and the like. Significantly accelerated.
  • predetermined areas it is preferred that only the surface within the predetermined areas has a roughness and thus webs are formed around the predetermined areas with a smooth surface. Such webs around the predetermined areas increase the adhesive properties of the mask and thus ensure a close contact of the mask on the substrate surface.
  • the carriers used in the process according to the invention are usually purified before starting the synthesis.
  • the cleaning is preferably carried out by means of the respective carrier material usual protocols.
  • the cleaning can be carried out with Caro's acid or tetramethylammonium hydroxide solution.
  • the carriers used in the processes according to the invention are usually pretreated before the synthesis is carried out.
  • Such pretreatment of the carrier can be carried out in particular by derivatization of the carrier.
  • the derivatization of the carriers can be carried out in particular by providing the surface side of the carrier which is available for the synthesis with a polymer layer.
  • the polymer layer is formed from silanes, gelatin and / or polyurethane.
  • the layer thickness of such a supported polymer layer is preferably about 1 nm to about 5 nm, more preferably about 2 nm to about 4 nm, and most preferably about 3 nm.
  • the contact angle of such a polymer layer is preferably about 40 ° to about 60 on average ° and more preferably about 50 °. to If a silanized support is used, the support, for example a glass wafer, can be provided, for example, with glycidoxypropyltrimethoxysilane.
  • this polymer layer is modified in a further preferred embodiment prior to the beginning of biopolymer synthesis, in particular a high number of functional groups, for example hydroxyl groups, for the attachment of monomer to synthesizing biopolymer.
  • a modification can be carried out, for example, by adding acid, by adding hydroxyl group-carrying linkers, such as polyalkylene glycols, by modifying with a three-dimensional polymer layer and / or by treatment with a lacquer layer.
  • Polymer layer is particularly advantageous when the polymer layer of the carrier carries epoxy groups, for example, when the carrier is provided with a layer of glycidoxypropyltrimethoxysilane.
  • the acid for example a strong acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid, leads to the opening of epoxides.
  • diols are provided which can be reacted with suitable functionalities of the monomer building block to be linked, e.g. Phosphorus esters or activated phosphoric ester groups in Polynukleotidsynthese, can react.
  • the polymers attached to the support may be modified by reaction with hydroxyl group-bearing linkers.
  • Preferred linkers are, in particular, polyalkylene glycols, such as polyethylene glycol, for example PEG200, polyethers (ROR ') such as mixed polymers of bisepoxide and polyethylene glycol, polyurethanes (RNHC (O) OR'), such as copolymers of alkoxy and diisocyanates and Mixed polymers of aryloxy, alkoxy and diisocyanates, polythiocarbamates (RNHC (S) OR ') such as copolymers of alkoxy and diisothiocyanates and copolymers of bismercaptans and diisocyanates, polydithiourethanes (RNHR (S) SR') such as copolymers of dithiol and diisothiocyanates and epoxy-functionalized silanes and Dithiols, the substrate surfaces with
  • a carrier coated with glycidoxypropyltrimethoxysilane is modified by reaction with polyethylene glycol.
  • a carrier provided with a polymer layer is modified with a three-dimensional polymer layer.
  • a three-dimensional polymer layer can be prepared, for example, by in situ polymerization of a polyalkylene glycol such as polyethylene glycol with a crosslinking agent on the already coated with a polymer layer, e.g. a silane layer, provided carrier.
  • Preferred crosslinkers are bisepoxides, e.g. Bisglycidyloxypropylmethan.
  • Such a three-dimensional polymer layer preferably has a thickness of about 1 nm to 100 ⁇ m, preferably from about 2 nm to about 10 ⁇ m, and particularly preferably from about 3 nm to about 100 nm.
  • a three-dimensional polymer layer preferably has a thickness of about 1 nm to 100 ⁇ m, preferably from about 2 nm to about 10 ⁇ m, and particularly preferably from about 3 nm to about 100 nm.
  • Polymer layer is also preferably porous.
  • the attachment or coupling of the monomer or oligomer building blocks usually takes place on functional groups, in particular hydroxyl groups, of the three-dimensional polymer layer.
  • the optionally already modified polymer layer is provided on the carrier surface with a lacquer layer.
  • the paint is preferably selected from photoresists such as a positive-resist varnish and phenolic resins such as novolaks.
  • the paint layer is then usually again completely removed.
  • a polymer layer modified as described above with polyethylene glycol linkers is provided with a photosensitive lacquer which is subsequently substantially completely removed again by exposure and development.
  • the predetermined regions of the support are separated from one another by inert regions for the synthesis of biopolymers. In these inert areas, preferably no synthesis of biopolymers can take place. This pre-structuring of the carriers improves the spatial resolution and thus the local specificity of the biopolymer synthesis. These inert regions provide an accurate measure of the background signal when using the biopolymers synthesized according to the invention on predetermined regions of a support or substrate.
  • the spots may be separated from each other by metallic regions on the support that are inert to the attachment of monomers.
  • the inert region materials are preferably selected from metals such as titanium, gold, nickel, chromium and alloys of the above metals such as nickel-chromium.
  • a metal layer can be applied by sputtering to the carrier surface and then patterned according to a predetermined pattern. The structuring can be carried out, for example, by photolithography and subsequent etching according to a predetermined pattern.
  • the metal layer or the metallic inert regions on the carrier preferably have a thickness of about 50 nm to 150 nm and particularly preferably about 100 nm.
  • Inert regions for separating the regions predetermined for the synthesis of the respective biopolymer species on the support can also be provided in another embodiment of the present invention by removing the functional groups intended for attachment of the monomer building blocks on the support surface or on the support-attached polymer layer become.
  • a selective removal, for example, of the polymer layer possibly applied to the support and optionally modified leads to regions on the support on which substantially no functional groups or no reactive groups are present and thus no biopolymer synthesis is possible.
  • functional groups or linkers or polymer layers located on the carrier surface are preferably removed by etching, eg plasma etching.
  • the support which is derivatized with a polymer layer as described above, be coated with a photoresist and / or resist.
  • a mask in particular a lithographic mask
  • the exposed areas of the resist in a subsequent development process detached.
  • the polymer layer is removed in defined regions which are to form the inert regions, for example by using argon or O 2 plasma, while the areas of the functional polymer layer previously covered by the mask are protected by undeveloped photoresist or resist.
  • the undeveloped paint protective layer is detached from the functional polymer layer by further exposure and subsequent development.
  • a homogeneous structure over the support with functional polymer pads having a layer thickness of preferably about 1 nm to about 10 nm, more preferably about 2 nm to 7 nm and most preferably 3 to 5 nm, for example about 4 nm are generated.
  • the polymer pads correspond to the predetermined ranges and have functional groups for the attachment of the monomer units of the biopolymers.
  • the method according to the invention for the site-specific synthesis of biopolymers of a defined sequence on predetermined regions of a solid support usually comprises a cyclical sequence of process steps per incorporation of a monomer or oligomer, namely:
  • one monomer or oligomer is applied to the predetermined regions of the carrier predetermined by the mask per synthesis cycle.
  • the temporary protecting groups of the last coupled building blocks are removed on the areas defined by the mask by adding an aqueous solution of a deprotection reagent.
  • the aqueous deprotection reagent flows through the channels or cavities between the mask and the carrier so that the protective groups can be removed at the areas not covered by the mask.
  • the cavities or channels are usually rinsed and dried.
  • the mask is preferably detached or separated from the carrier or substrate.
  • a cutting disc e.g. in the form of a scalpel, which is moved in the plane between the carrier or the substrate and the mask in the direction of the center of the carrier or substrate. Due to the force exerted by such discs, the mask and the carrier or substrate can be separated from each other.
  • Other embodiments for the process of detaching the mask from the carrier will be readily apparent to those skilled in the art.
  • the carrier or the substrate is contacted with a solution of a monomer or Oligomerbausteins.
  • a solution of a monomer or Oligomerbausteins This results in the predetermined areas on which the protective groups have been removed by the previous deprotection, for the coupling of monomer units or monomers to the released by the deprotection reaction functional groups of the support surface or the intermediate of the biopolymer chain.
  • the carrier for example, in a synthesis chamber or reaction chamber or cartridge with openings through which the cartridge can be filled with the synthesis reagents to be used transferred.
  • Such, optionally pressure-tight, reaction chamber is preferably connected to a conventional automatic synthesizer, so that a customary for the respective Biopolymersynthese synthesis protocol for the coupling of a monomer can be run through.
  • a conventional automatic synthesizer for the synthesis of DNA by means of the method according to the invention, for example, the synthesizer ⁇ KTA of Amersham Bioscience (Freiburg, Germany) can be used.
  • the above-described steps of arranging the mask, deprotection, optionally detaching the mask and synthesizing further monomer units to the existing biopolymer chain can be repeated except for predetermined areas of the carrier in each case the complete biopolymer is synthesized with the desired sequence.
  • the permanent protective groups attached to the monomer units are usually cleaved off.
  • the standard conditions described in the prior art for the respective protective groups are preferably used (see, inter alia, TW Greene, PGM Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis” John Wiley & Sons INC, New York, H.-J. Jakubke, see above).
  • the permanent protecting groups attached to the nucleobases can be removed with an aqueous ammonia solution.
  • the optionally automated standard DNA synthesis usually involves the steps of (i) cleavage of the temporary protective groups, (ii) coupling of the monomer or oligomer component in the presence of an activator, (iii) capping of unreacted hydroxyl functionalities of the substrate or of the biopolymer chains - Intermediate and (iv) oxidation of the phosphite to Phosphotriester go through.
  • the implementation of these steps will be described below by way of example.
  • the synthesis is usually opposite to the biosynthesis from the 3'-end to the 5'-end.
  • oxalic acid or methanesulfonic acid is used as a reagent for the cleavage of the conventionally used dimethyltrityl (DMT) protecting group.
  • DMT dimethyltrityl
  • the coupling of the monomer or oligomer component e.g. is present as phosphoramidite (N, N-diisopropylaminophosphite), to the substrate after activation with a weak acid such. Tetrazole. It should be noted that addition of the acid does not cleave the temporary protecting group DMT.
  • a capping step takes place in which, with the aid of reagents such as pyridine, N-methylimidazole and acetic anhydride, the unreacted hydroxyl groups are converted into corresponding ethyl acetate derivatives. Finally, it is again rinsed with solvents.
  • reagents such as pyridine, N-methylimidazole and acetic anhydride
  • the resulting phosphite compound is e.g. transferred by means of an aqueous iodine solution with the addition of pyridine in the more stable phosphorus triester or oxidized.
  • a new synthesis cycle begins with the deprotection of, for example, the DMT protecting groups. After complete construction of the desired nucleic acid, the permanent protecting groups are usually removed.
  • the yield per synthesis step is preferably more than 98%.
  • the first step in peptide synthesis is usually the cleavage of the temporary protecting group.
  • the base-labile Fmoc protective group is preferably used, since it can be read out by means of UV sensors due to its absorption spectrum and less aggressive deprotection reagents must be used.
  • the use of an acid-labile Boc protective group is conceivable.
  • the corresponding amino acid building block or the amino acid derivative as well as a coupling reagent, e.g. Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), O-benzotriazole-N, N, N, N-tetramethyluronium hexane fluorophosphate (HBTU), hydroxybenzotrizole (HOBt) and a base such as e.g. l, 8-diazabicyclo [5.4.0] undec-7-ene (DBU) each in the
  • reaction chamber is usually rinsed.
  • the method according to the invention is used in particular to produce microarrays as described above, in which the biopolymers synthesized in situ on predetermined regions according to the invention serve as molecular probes.
  • the microarrays of the invention preferably have a density at predetermined ranges of at least 2,500 spots per cm 2 , more preferably at least 10,000 spots per cm 2, and most preferably at least 25,000 to one million spots per cm 2 .
  • the carrier area which is calculated from the edge lengths of the carrier and to which the density of spots is related, is in preferred embodiments not more than 1 cm 2 , not more than 25 mm 2 , not more than 17,64 mm 2 , not more than 4 mm 2 , not more than 1 mm or not more than 100 ⁇ m.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of aqueous solutions of deprotecting reagents in the synthesis of biopolymers.
  • Deprotection reactions in the synthesis of biopolymers can also be carried out with deprotection reagents in aqueous solution.
  • Example 1 Deprotection with a 10% aqueous solution of oxalic acid
  • the wafer is cleaned with a JTB-100 solution (tetramethylammonium hydroxide solution) according to the following protocol:
  • the wafer is pre-cleaned for 30 min in an ultrasonic bath in 10% Deconex, then rinsed several times with deionized water (DI water) and then incubated for 30 min at 70 ° C in JTB 100 solution.
  • DI water deionized water
  • the wafer is rinsed 6 times with demineralized water and once with DI water and then dried on a wafer centrifuge at 3000 min -1 for 1 min.
  • a titanium layer of about 100 nm thickness is applied by sputtering.
  • the titanium layer is structured by means of positive resist AZ 1514 H and exposure through a mask. After structuring by means of a titanium etching bath (0.8% HF, 1.3% nitric acid), the active area of each array (approximately 2 mm) is surrounded by an interrupted chain of square titanium structures with a 32 ⁇ m edge length. From the remaining wafer surface, the titanium is completely removed.
  • the photoresist is removed by ALEG 625 and PRS 3000 (Mallinckrodt Baker, Griesheim, Germany). The wafer is briefly wetted with DI water and then etched in a pre-tempered water bath (55 0 C) with sodium hydroxide solution at 5O 0 C for 30 s.
  • the wafer is spun dry and baked in a convection drying oven.
  • the wafers are placed vertically in the PFA holder on the PTFE ring in a Rettberg jar and the jar is purged with argon. Successively 1.8 l of toluene (anhydrous) and 79 ml of glycidoxypropyltrimethoxysilane are then added under inert conditions.
  • Reaction mixture is heated to 80 ° C. in an oil bath.
  • the mixture is mixed by passing argon through two titanium frits. After reaching the target temperature, this is held for 3 h.
  • the batch After removal of the oil bath, the batch is allowed to cool in about 40 minutes to below 60 0 C, being further mixed with argon.
  • the wafer After opening the vessel, the wafer is rinsed with 1 ⁇ toluene, 3 ⁇ methanol, 4 ⁇ acetone and 1 ⁇ DI water. Subsequently, the wafer is dried on a wafer centrifuge.
  • the DNA synthesis is carried out on an automatic synthesizer Oligopilot OPII (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany).
  • Oligopilot OPII Oligopilot OPII
  • a stainless steel circular reaction cartridge is used, into which the wafer is screwed so that the synthesis side faces the reaction space while the opposite side of the wafer is outside the reaction cartridge.
  • a total of 397 array areas are arranged in 21 rows and 21 rows.
  • the synthesis starts with a series of coupling steps in which the same base is coupled over the entire wafer.
  • the building blocks used are DMT-protected phosphoamidites.
  • the following bases are successively coupled: C, C, C, T, A, T, T, C, G.
  • DMT protecting groups are removed site-specifically.
  • a mask is used for this purpose.
  • the mask has 21 identical channel bundles with four parallel channels each with a width of 128 ⁇ m and a distance (channel center to channel center) of 512 ⁇ m.
  • the mask is initially aligned horizontally without displacement.
  • the site-specific removal of the DMT protecting groups is carried out by pulling a 10% aqueous solution of oxalic acid through the channels by means of vacuum.
  • the deprotection time is varied in the individual channel bundles as follows:
  • Variant 1 2 min Variant 2: 5 min Variant 3: 10 min Variant 4: 20 min Variant 5: 30 min
  • the channels are then rinsed with water, the mask is lifted off and the chip wafer is installed in the synthesis cartridge.
  • the cartridge is processed at the automatic synthesizer. It follows the coupling of a G without deprotection in the cartridge, so that the coupling of the G takes place only on the previously deprotected areas with oxalic acid.
  • the wafer is removed from the cartridge.
  • the wafer is incubated in a water-bath PFA vial for 35 minutes in 30-33% ammonia at 55 ° C, then removed from the solution and rinsed as follows:
  • the mixture is then spun dry in a wafer centrifuge for 60 s at 3000 min -1 .
  • the hybridization target is an asymmetric PCR amplification DNA fragment from the 16s rRNA gene of Corynebacterium glutamicum. This is made according to the following protocol:
  • a PCR mixture with the following composition is prepared:
  • Oligonucleotide integrated into the molecule (3'-amino modifier C7, Glen Research
  • the PCR fragment is taken up in a final concentration of about 5 nM in a hybridization buffer (6 x SSPE / 0.2% SDS). The solution is divided into aliquots with a volume of 65 ⁇ l each on Eppendorf reaction vessels (1.5 ml, Eppendorf, Hamburg, Germany). Each of these reaction vessels is given an array. In total, four arrays of each deprotection variant are hybridized to the target in parallel runs.
  • the hybridization batches with the array are first incubated for 5 min at 95 ° C and then immediately incubated for 1 h at 50 0 C.
  • the chips are then in each case 1 x for 5 min in 500 .mu.l 2 x SSC / 0.2% SDS, 2xSSC öWeils at 3O 0 C) and 0.2x SSC (at 2O 0 C) in a thermo shaker (Eppendorf, Hamburg, Germany) at 500 rpm. After removing the last rinse solution, the arrays are dried in vacuo.
  • Hybridization Signals The detection of the hybridization signals is carried out under a Zeiss fluorescence microscope (Zeiss, Jena, Germany). Excitation occurs in reflected light with a white light source and a filter set suitable for Cyanine 3. The signals are recorded with a CCD camera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Germany). The exposure time is 5000 ms.
  • Figure 2 shows the images for deprotection times of 2 min, 10 min and 30 min.
  • the image analysis is carried out with the image analysis software Iconoclust (Clondiag, Jena, Germany). To determine the position and orientation of the arrays, the previously applied square 32 ⁇ m mark structures made of titanium are used.
  • the wafer substrate used in this example and the protocols for the purification, structuring, silanization and preparation of the synthesis layer correspond to those of Example 1.
  • the DNA synthesis is carried out on an automatic synthesizer Oligopilot OPII.
  • Oligopilot OPII As building blocks DMT-protected Phosphoamida be used s e.
  • a circular stainless steel reaction cartridge is used, into which the wafer is screwed so that the synthesis side faces into the reaction chamber while the opposite side of the wafer is outside the reaction cartridge. This cartridge is fluidly connected to the automatic synthesizer.
  • the synthesis starts with a coupling step in which the same base (T) is coupled over the entire wafer.
  • the reactive groups on the surface are blocked site-specifically to varying degrees.
  • the surface is first de-protected site-specifically using a mask, i. the DMT protecting groups are removed.
  • a defined mixture of fluoroprimer amidite and a base amidite is coupled.
  • the fluoroprime amidite blocks further synthesis because it has no functional groups to which additional bases can be coupled.
  • the fluidic mask used for the deprotection has 21 identical channel bundles of four parallel channels with a width of 128 ⁇ m and one Distance (channel center to channel center) of 512 ⁇ m.
  • the mask is initially aligned horizontally without displacement.
  • the site-specific removal of the DMT protecting groups is then carried out by vacuum drawing a solution of 10% oxalic acid in water through the channels.
  • the deprotection time is 20 min.
  • the channels are then rinsed with water, the mask is lifted off and the chip wafer is mounted in the synthesis cartridge and the cartridge is connected to the automatic synthesizer.
  • the coupling of a mixture of 50% T-amidite and 50% fluoroprene amidite takes place.
  • the total amidite concentration is 0.1M.
  • step 2 seven further synthesis steps (steps 2-8) are carried out with changed parameters.
  • the mask used, the total amidite concentration, the deprotection time and the coupling protocol are identical.
  • the following table gives an overview of the parameters varied in the coupling steps:
  • the wafer is mounted in the reaction cartridge and connected to the automatic synthesizer ( ⁇ kta, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany).
  • the following bases are coupled over the entire area of the wafer pointing into the reaction cartridge: T, C, C, C, T, A, T, T, C, G 5 G.
  • DMT protecting groups are removed site-specifically.
  • a fluidic mask is used covering one half of each array element and exposing the other half to the deprotection reagent.
  • the deprotection is carried out with 10% strength oxalic acid in water for 20 min.
  • the channels are then rinsed with water, the mask is lifted off and the chip wafer is mounted in the synthesis cartridge and the cartridge is connected to the automatic synthesizer.
  • the coupling of an A occurs in the deprotected areas.
  • a sequence which is perfectly complementary to the hybridization target used later is generated in these regions, while a sequence with a 1-base deletion is produced in the remaining regions.
  • the further synthesis takes place in the reaction cartridge as described above over the entire region of the wafer pointing into the reaction cartridge.
  • the following bases are successively coupled: C, C, C, T, T, T, G.
  • the wafer is removed from the cartridge.
  • the wafer is incubated in a water-bath PFA vial for 35 min in 30-33% ammonia at 55 ° C, then removed from the solution and rinsed as follows:
  • the wafer is spun dry in a wafer centrifuge for 60 s at 3000 min -1 and on a wafer saw in 397 individual chips of 3.4 x 3.4 mm
  • the hybridization target is an 18-base oligonucleotide labeled with the dye Cy3, with the following sequence: 5'Cy3GGGATAAGCCTGGGAAAC-3 '.
  • the oligonucleotide is taken up in a final concentration of 10 nM in the hybridization buffer (6 ⁇ SSPE / 0.2% SDS). The solution is divided into aliquots with a volume of 65 ⁇ l each on Eppendorf reaction vessels (1.5 ml, Eppendorf, Hamburg, Germany). Each of these reaction vessels is given an array. In total, ten arrays are hybridized in parallel batches with the target.
  • the hybridization batches with the array were first incubated for 5 min at 95 ° C and then immediately incubated for 1 h at 50 ° C.
  • the chips are then each 1 x for 5 min in 500 .mu.l 2xSSC / 0.2% SDS, 2xSSC (each at 3O 0 C) and 0.2x SSC (at 20 ° C) in a thermo shaker (Eppendorf, Hamburg, Germany ) at 500 rpm. After removing the last rinse solution, the arrays are dried in vacuo.
  • the detection of the hybridization signals is carried out under a Zeiss fluorescence microscope (Zeiss, Jena, Germany). Excitation occurs in reflected light with a white light source and a filter set suitable for Cyanine 3. The signals are recorded with a CCD camera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Germany). The exposure time is 5000 ms.
  • the image analysis is carried out with the image analysis software Iconoclust (Clondiag, Jena, Germany). To determine the position and orientation of the arrays, the previously applied square 32 ⁇ m mark structures made of titanium are used.
  • the wafer substrate used in this example and the protocols for the purification, structuring, silanization and preparation of the synthesis layer correspond to those of Example 1.
  • the DNA synthesis is carried out on an automatic synthesizer Oligopilot OPII.
  • the building blocks used are DMT-protected phosphoamidase.
  • a circular stainless steel reaction cartridge is used, into which the wafer is screwed so that the synthesis side faces into the reaction chamber while the opposite side of the wafer is outside the reaction cartridge. This cartridge is fluidly connected to the automatic synthesizer.
  • the synthesis starts with a coupling step in which the same base (T) is coupled over the entire wafer.
  • the following coupling steps are site-specific.
  • the surface is first de-protected site-specifically using a mask, i. the DMT protecting groups are removed.
  • the fluidic mask used for the deprotection comprises 21 identical channels with a width of 1024 ⁇ m.
  • the spacing of the channels from one another corresponds to the grid dimension of the wafer (chip center to chip center).
  • the mask is initially aligned horizontally without displacement.
  • the site-specific removal of the DMT protecting groups is then carried out by vacuum drawing a solution of 10% oxalic acid in water through the channels.
  • the deprotection time is 20 min.
  • the channels are then rinsed with water, the mask is lifted off and the chip wafer is mounted in the synthesis cartridge and the cartridge is connected to the automatic synthesizer. There is the coupling of a T-amidite.
  • the amidite concentration is 0.1 M.
  • the described coupling steps produce arrays in which the various array elements have been subjected to a different number of coupling steps, thereby producing T-oligomers of different chain lengths.
  • the wafer is mounted in the reaction cartridge and connected to the automatic synthesizer ( ⁇ kta, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany).
  • the automatic synthesizer ⁇ kta, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany.
  • DMT protecting groups are removed site-specifically.
  • a fluidic mask which comprises 21 identical channel bundles of eight parallel channels with a width of 128 ⁇ m and a distance (channel center to channel center) of 256 ⁇ m.
  • the mask is oriented vertically (rotation through 90 °) with a displacement of 64 ⁇ m.
  • Deprotection reagent exposed The deprotection is carried out with 10% strength oxalic acid in water for 20 min.
  • the channels are then rinsed with water, the mask lifted off, the chip wafer mounted in the synthesis cartridge and the cartridge with the
  • the further synthesis takes place in the reaction cartridge as described above over the entire region of the wafer pointing into the reaction cartridge.
  • the following bases are successively coupled: C, C, C, T, T, T, G.
  • the wafer is removed from the cartridge.
  • the wafer is placed in a PFA Incubated in a water bath for 35 min in 30-33% ammonia at 55 ° C, then removed from the solution and rinsed as follows:
  • the wafer is spun dry in a wafer centrifuge for 60 s at 3000 min -1 and split on a wafer saw into 397 individual chips of 3.4 x 3.4 mm edge length.
  • the hybridization target used is either an oligonucleotide of 18 bases in length labeled with the dye Cy3 and having the following sequence: 5 'Cy3GGGAT AAGCCTGGGAA AC-3' or the PCR fragment described in Example 1.
  • the oligonucleotide is taken up in a final concentration of 10 nM and the PCR product in a final concentration of about 5 nM in the hybridization buffer (6x SSPE / 0.2% SDS).
  • the solution is divided into aliquots with a volume of 65 ⁇ l each on Eppendorf reaction vessels (1.5 ml, Eppendorf, Hamburg, Germany). Each of these reaction vessels is given an array.
  • ten arrays are hybridized in parallel batches with the target. The hybridization batches with the array were first incubated for 5 min at 95 ° C and then immediately incubated for 1 h at 50 ° C.
  • the chips are then each 1 x for 5 min in 500 .mu.l 2xSSC / 0.2% SDS, 2xSSC Qeweils at 30 ° C) and 0.2x SSC (at 20 ° C) in a thermo shaker
  • the detection of the hybridization signals takes place in a confocal slider reader (Scanarray 4000, Packard Biochip Technologies, Billerica, MA, USA).
  • the arrays are placed in an adapter with the dimensions of a slide on the outside.
  • the excitation is carried out by the laser provided for the detection of the dye Cy3 in the device.
  • the settings of laser power and photomultiplier are chosen so that the signals do not reach the saturation level.
  • the image analysis is carried out with the image analysis software Iconoclust (Clondiag, Jena, Germany). To determine the position and orientation of the arrays, the previously applied square 32 ⁇ m mark structures made of titanium are used.
  • Figures 16 to 19 show the recording of an array after hybridization with the described oligonucleotide (FIG. 16) or PCR fragment (FIG. 17).
  • the summarized results of hybridization experiments with the oligonucleotide or PCR fragment as a target are summarized in the bar graphs in Figures 18 (oligonucleotide) and 19 (PCR fragment).
  • the results of the oligohybridization show that the observed hybridization signal is essentially unaffected by the number of T-couplings that preceded the synthesis of the target-complementary sequence.
  • the hybridization signal increases continuously with the number of T-couplings that occur prior to the synthesis of the target-complementary region of the probe.
  • the cleaning of the wafer is analogous to the protocol of the embodiment 1.
  • a NiCr layer of about 100 nm thickness is applied by sputtering.
  • the NiCr layer is structured by means of positive resist AZ 1514 H and exposure through a corresponding mask.
  • NiCr etching bath After patterning by NiCr etching bath, a mixture of ammonium cerium IV nitrate and perchlorate in water, the active area of each array (approximately 2 mm) is surrounded by an interrupted chain of square NiCr structures with 32 ⁇ m edge length. From the remaining wafer surface, the NiCr alloy is completely removed.
  • the photoresist is removed by ALEG 625 (Mallinckrodt Baker, Griesheim, Germany).
  • the wafer is briefly wetted with di-water and then etched in a pre-tempered water bath (55 ° C) with 5 M sodium hydroxide solution at 50 ° C for 30 s. Then rinse in the following order: - 6 x deionised water (1 min each, move wafer into holder) - 2 x 5 min di-water Finally, the wafer is spun dry and tempered at 150 ° C for 1 h in a circulating air dryer.
  • the silanized wafer and 150 mL H 2 O are placed in a PE beaker. Then 1.044 mL conc. Sulfuric acid added with stirring and this mixture heated to 35 ° C for 35 min. Subsequently, the wafer is removed from this solution and rinsed several times with demineralized water. Finally, the wafer is rinsed with ethanol and dried in a centrifuge at 3000 rpm for 60 s.
  • the DNA synthesis is carried out on an automated synthesizer ⁇ kta (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany). In contrast to Embodiment 1, a reaction cartridge made of PEEK is used.
  • the synthesis starts with a coupling step in which the nucleotide cytidine has been coupled on the entire wafer. After five further coupling steps with the amidite units C, C, T, A and T on the entire wafer, the following is then the temporary DMT protecting group site-specifically cleaved by means of a mask and a 10% aqueous solution of methanesulfonic acid.
  • the fluidic mask to be used for deprotection has 21 channels with a width of 2048 ⁇ m, which are characterized by a different pattern of islands, i. Areas covered by the mask differ. After a reaction time of 5 minutes, the channels are rinsed with water, the mask is lifted and the chip wafer is mounted in the synthesis cartridge and the cartridge is connected to the automatic synthesizer. Three synthesis steps are carried out with the blocks T, C and G without moving the mask in each case.
  • amidites G, A, C, C, C, T, T, T and G are each coupled to the entire wafer.
  • the wafer is removed from the cartridge and transferred to a 30-33% ammonia filled stainless steel cartridge. After a 35 minute incubation at 55 ° C, the wafer is removed and rinsed with the following solutions:
  • the wafer is spun dry in a wafer centrifuge for 60 s at 3000 min -1 and split on a wafer saw into 397 individual chips of 3.4 x 3.4 mm edge length.
  • Hybridization target is an oligonucleotide of 18 bases in length labeled with the dye Cy3 and having the sequence 5 'Cy3GGGATAAGCCTGGGAAAC-3'.
  • the protocol of the hybridization and the detection of the Hybridisanssignale is carried out analogously to Embodiment 1.
  • the exposure time of the chips is 6000 ms.
  • the corresponding deletion sequence is located at the locations covered by the mask stamps, which are seen as dark areas.
  • the match sequence is on the remaining area of the chip.
  • a DNA with the sequence 3'-TCAAAGGGTCCGAATAGGG-S ' is constructed by means of solid-phase synthesis on CPG support material.
  • an Expedite 8905 -Syntheszier the company PerSeptive Biosystems is used.
  • the synthesis yield is determined by the method of UV-metrical measurement of the dimethoxytrityl cations known to the person skilled in the art.
  • the above-mentioned sequence is built up on the scale of 0.2 ⁇ mol by means of a standard protocol using trichloroacetic acid (TCA) in acetonitrile and, secondly, the same Sequence is synthesized in parallel to the standard protocol using the deprotection reagent 10% aqueous methanesulfonic acid (MSA).
  • MSA aqueous methanesulfonic acid
  • the synthesis cartridge is removed from the synthesizer after each successful synthesis step, rinsed with 0.5 mL 10% MSA solution and then reacted with another 0.5 mL 10% MSA for 5 minutes. The synthesis cartridge is then rinsed with 6 x 1 mL H 2 O and blown through with air.
  • the support material After rinsing three times with 1 mL each of acetonitrile, the support material is dried for 10 minutes using dry argon. After reinstallation in the DNA synthesizer, before continuing the synthesis cycle, the cartridge is rinsed 3 times with 1 mL acetonitrile.
  • the deprotection is carried out in each case after the 2nd and 11th synthesis step in both cartridges with 1 mL of a 0.1 M p-toluenesulfonic acid solution in acetonitrile.
  • Synthesis step yields in the standard synthesis to 98.4% and in the case of the modified synthesis to 98.3% determined.
  • the following provides a work instruction for peptide synthesis on a glass wafer.
  • a chip wafer On a chip wafer, a total of 397 array areas are arranged in 21 rows and 21 rows.
  • the glass wafers are subjected to the standard process of glass cleaning and structuring in analogy to Exemplary Embodiment 1.
  • the subsequent silanization is carried out under the same reaction conditions as in Example 1 with a 5.3% (v / v) solution of 3-aminopropyloxysilane in toluene.
  • the silanized wafers have a contact angle of about 50 °.
  • the pH is adjusted to 8.5 by addition of the base N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) and the reaction cartridge is shaken gently. After 60 minutes, the wafer is removed from the synthesis cartridge and rinsed with 10 mL each of 2 ⁇ DMF and 2 ⁇ DMFiDichloromethane (DCM) 1: 1.
  • DIPEA N-diisopropylethylamine
  • a channel mask according to the invention is oriented on the wafer and 10% aqueous methanesulfonic acid is drawn through the channels of the composite of wafer and channel mask. After 10 minutes, the channels are rinsed with H 2 O and the mask is lifted off the wafer.
  • the wafer is rinsed with acetonitrile and dried. After incorporation of the wafer into the synthesis cartridge, it is covered with the next amino acid coupling solution (see above) and reacted. After complete synthesis, the temporary and permanent protecting groups are removed. The protocols for this are known to the person skilled in the art.
  • Figure 1 Representation of the array used in Example 1.
  • Figure 2 Recording of the hybridization signals according to Example 1 for deprotection times of 2 min, 10 min and 30 min.
  • Figure 3 Depiction of the dependency of the hybridization signal on the deprotection time.
  • Figure 4 Representation of the dependence of the hybridization signal on the occupancy density of the array.
  • Figure 5 Schematic representation of the synthesis cycle.
  • Figure 6 Illustration of an embodiment of the mask.
  • Figure 7 Enlargement of a section of a mask.
  • Figure 8 Representation of a composite of mask and carrier.
  • Figure 9 Schematic representation of the composite of mask and support (a: empty, b: afflicted).
  • Figure 10 Schematic representation of the principle of selective deprotection.
  • Figure 11 Reaction scheme for applying a silane layer to the support.
  • Figure 12 Reaction scheme for modifying a supported on the carrier l-hydroxypropyl (2'-hydroxy) -oxypropylsilan layer by adding acid.
  • Figure 13a Schematic representation of a metallically structured surface. The white spots symbolize the polymer layer or synthesis layer.
  • Figure 13b Schematic representation of a surface patterned with oxygen plasma.
  • the gray fields symbolize the polymer layer or synthesis layer.
  • Figure 14 Schematic representation of the generation of a mask.
  • Figure 15 Photo of the reaction chamber.
  • Figure 17 Hybridization with about 5 nM PCR target according to Example 3.
  • the light bars (match) correspond to the signal measured on probes whose specific area has complete complementarity to the hybridization target.
  • the dark bars (mismatch) show the signal measured on probes whose specific area had one base deletion.
  • Figure 19 Signal of hybridization with the PCR target as a function of the number of T-coupling steps that took place before the synthesis of the oligonucleotide-complementary sequence (see Example 3).
  • the light bars (match) correspond to the signal measured on probes, the specific region of which has complete complementarity with the target region in the hybridization target.
  • the dark bars (mismatch) show the signal measured on probes whose specific area had one base deletion.
  • Figure 20 Different mask geometries in comparison.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren wie Nukleinsäuren oder Peptiden und deren jeweiligen Derivaten auf festen Trägern, wobei die örtliche Diskriminierung der Synthese insbesondere durch Verwendung von Masken erfolgt, die wässrige Aktivierungsreagenzien für die Abspaltung von Schutzgruppen zu vorbestimmten Bereichen auf dem Träger führen.

Description

Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren auf festen Trägern
Die Erfindung betrifft Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren wie Nukleinsäuren oder Peptiden mit definierter Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren und deren jeweiligen Derivaten auf festen Trägern, wobei die örtliche Diskriminierung der Synthese durch Verwendung von Masken erfolgt, die wässrige Aktivierungsreagenzien für die Abspaltung von Schutzgruppen zu vorbestimmten Bereichen auf dem Träger führen. Die erfindungs¬ gemäßen Verfahren sind insbesondere zur Herstellung von Mikroarrays mit auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten molekularen Sonden in Form von Biopolymeren geeignet.
Es sind zahlreiche Verfahren zur Synthese von Biomolekülen auf festen Trägern in Form von Mikroarrays bekannt.
So sind u.a. in EP 0 619 321, EP 0 946 286 und US 5,143,854 Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays beschrieben, bei denen vorbestimmte Bereiche des Trägers durch Belichtung aktiviert werden. Für die Durchführung dieser auch als VLSIPS (very large scale immobilized polymer synthesis) bezeichneten Verfahren sind teure photolabile Schutzgruppen bzw. photoaktivierbare Katalysatoren sowie ein hoher apparativer Aufwand erforderlich.
Verfahren zur Herstellung von Arrays unter Verwendung herkömmlicher Synthesechemie sind in den folgenden Druckschriften beschrieben:
In US 5,384,261 ist ein Verfahren zur Synthese von Peptiden beschrieben, bei dem harte Kanalmasken eingesetzt werden, die auf den Träger aufgesetzt werden, um bestimmte für die Synthese vorgesehene Bereiche voneinander abzutrennen. Um eine - ? -
dichte Abtrennung zwischen diesen Bereichen zu gewährleisten, werden die Masken auf die Oberfläche des Trägers geschraubt. Es wird jeweils ein kompletter Synthesezyklus pro Kanal durchgeführt.
U. Maskos und E.M. Southern beschreiben in Nucleic Acid Res. 1992, 20, 1679- 1684 ein Verfahren zur Herstellung eines Biopolymer- Arrays unter Verwendung flexibler Masken. Als Maskenmaterial werden Silikonschläuche eingesetzt, die gegen die Oberfläche des Trägers gedrückt werden. Im Anschluss daran werden Synthesezyklen zum Aufbau der Biomoleküle auf dem Array durchgeführt. Die dort verwendeten Silikonschläuche erlauben jedoch keine Miniaturisierung.
In DE 195 43 232 und P.F. Xiao et al., Nanotechnology 2002, 13, 756-762 ist das ortsspezifische Ablegen von aktivierten Phosphoramiditnucleosiden auf der Oberfläche eines Trägers mittels eines Polydimethylsiloxan-Stempels beschrieben. Ein derartiges Verfahren ist jedoch insbesondere für eine effiziente Synthese auf rauen oder porösen Polymeroberflächen nicht geeignet. Ferner können bei diesem Verfahren während des Spülens der Reagenzien nach Abschluss eines Druckvorgangs Bereiche der Trägeroberfläche kontaminiert werden, die nicht durch den Stempel kontaktiert wurden.
In US 5,512,131 ist ebenfalls die Derivatisierung von Oberflächen unter Verwendung von Polydimethylsiloxan-Stempeln beschrieben.
Der Einsatz von Stempeln zur Immobilisierung von Testsubstanzen sowie die nachfolgende Prozessierung von serologischen Tests ist u.a. auch beschrieben in E. Delamarche et al., Science 1997, 276, 779-781; E. Delamarche et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3, 500-508 und A. Bernard et al., Langmuir 1998, 14, 9, 2225-2229. Die internationale Patentanmeldung WO 97/33737 beschreibt die positionsgenaue Deposition von chemischen oder biochemischen Substanzen mittels Kapillarkräften unter Verwendung eines Gegenstands mit einer konturierten Oberfläche.
In WO 98/36827 ist ein Verfahren zur Erzeugung von Substanzbibliotheken auf einem festen Träger unter Verwendung von Masken beschrieben. Als Maske kann insbesondere eine mikrostrukturierte Silikonmembran eingesetzt werden. Die Maske dient zur Abdeckung definierter Bereiche eines Trägers. Die Öffnungen in der Membran bzw. Maske gestatten die Durchführung von Synthese- bzw. Immobilisierungsschritten auf den nicht abgedeckten Bereichen des Trägers .
In US 5,658,734 ist ein Verfahren zur Synthese einer Vielzahl von chemischen Verbindungen unterschiedlicher Struktur auf einem Träger offenbart, bei dem eine Photoresistschicht zur Abdeckung bestimmter Bereiche auf dem mit labilen Schutzgruppen versehenen Träger genutzt werden. Die Photoresistschicht wird belichtet und entwickelt. Anschließend werden die labilen Schutzgruppen von den nicht von der Photoresistschicht bedeckten Bereichen entfernt und ein herkömm¬ licher Synthesezyklus zur Erzeugung von Oligomeren aus Aminosäuren, Nukleotiden u. dgl. durchgeführt. Ein ähnliches Verfahren zur Immobilisierung von Oligonukleotiden ist auch in US 5,688,642 beschrieben.
Derartige Photoresist-basierte Verfahren liefern jedoch nur mangelhafte Ausbeuten und sind nur in geringem Maß reproduzierbar. So steht die Notwendigkeit, den Photoresist so dichtend wie möglich auf dem Träger anzubringen, dem Bestreben entgegen, den Photoresist nach Abschluss des Synthesezyklus auf einfache Weise ablösen zu können. Ein weiteres Problem besteht darin, dass der auf der Oberfläche aufgebrachte Photoresist bei der Belichtung und Entwicklung chemische Reaktionen durchläufl, die die bereits auf der Oberfläche befindlichen Synthese-Intermediate beeinträchtigen können.
In US 5,599,695 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem in der Drucktechnik übliche Verfahren zur Herstellung von Molekülbibliotheken genutzt werden. Dabei wird selektiv eine Grenzschicht in flüssiger Form oder als Dampf auf die Oberfläche eines Trägers aufgebracht und so ein Muster für die selektive Anbringung von Molekülen auf dem Träger erzeugt. Dabei kann z.B. Silikonöl als Grenzschicht dienen. Die Abspaltung von Schutzgruppen erfolgt mittels gasförmiger Entschützungsreagenzien. Eine derartige Vorgehensweise weist den Nachteil auf, dass auch das flüssige
Grenzschichtmaterial von gasförmigem Entschützungsreagenz durchdrungen werden kann. Ferner ist die Präzision des Verfahrens durch die Möglichkeit des Verwischens bzw. Verfließens der eingesetzten Reagenzien begrenzt.
Es besteht folglich ein Bedarf an Verfahren für die ortsspezifϊsche Synthese von Biopolymeren unterschiedlicher Sequenzen auf einem festen Träger, die kostengünstig sind, den Einsatz von für die Synthese von Biopolymeren üblichen Reagenzien erlauben und eine effiziente und fehlerfreie Synthese der Biopolymere gewährleisten. Insbesondere besteht ein Bedarf an Verfahren für eine ortsspezifische Synthese von Biopolymeren mit einer Ortsauflösung im μm-Maßstab.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die vorstehend genannten Probleme des Standes der Technik zu überwinden.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur orts¬ spezifischen Synthese einer Vielzahl von Biopolymer-Spezies mit jeweils einer für einen vorbestimmten Bereich definierten Sequenz, z.B. einer kombinatorischen Biopolymerbibliothek, bereitzustellen, bei dem im Wesentlichen für die Festphasensynthese von Biopolymeren übliche Reagenzien eingesetzt werden können.
Femer ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein kostengünstiges und einfaches Verfahren zur ortsspezifischen Synthese einer Vielzahl von unterschiedlichen Biopolymeren mit definierter Sequenz bereitzustellen.
Des Weiteren ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Biopolymerbibliotheken in Form von Mikroarrays auf eine Vielzahl von Trägermaterialien aufgebracht werden kann.
Eine besondere Aufgabe besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens, in dem Masken zur Gewährleistung der ortsspezifischen Synthese der Biopolymere eingesetzt werden können, die auf einfache Weise positionsgenau auf dem Trägermaterial eines Mikroarrays angebracht werden können.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur ortsspezifischen Synthese einer Vielzahl von Biopolymeren mit jeweils definierter Sequenz, bei dem Masken eingesetzt werden, die von der Trägeroberfläche entfernt werden können, ohne bereits auf der Trägeroberfläche angebrachte Monomerbausteine zu beeinträchtigen.
Schließlich ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Synthese von einer Vielzahl von Biopolymeren mit definierter Sequenz bereitzustellen, bei dem Reagenzien verwendet werden, die mit einem
Maskenmaterial kompatibel sind, welches die vorstehenden Anforderungen erfüllt und eine ortsspezifische Synthese gewährleistet. Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Insbesondere wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf einem festen Träger durch schrittweise Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen bereitgestellt, wobei jeweils vor einem Kupplungsschritt temporäre Schutzgruppen für reaktive Gruppen auf dem Träger und/oder an Intermediaten der zu synthetisierenden Biopolymere durch Zugabe einer wässrigen Lösung eines Aktivierungsreagenzes entfernt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers durch schrittweise Kupplung von
Monomer- und/oder Oligomerbausteinen, wobei jeweils vor einem Kupplungsschritt auf mindestens einem vorbestimmten Bereich temporäre Schutzgruppen für reaktive Gruppen auf dem Träger und/oder an Intermedialen der zu synthetisierenden Biopolymere durch Zugabe einer wässrigen Lösung eines Aktivierungsreagenzes entfernt werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur orts¬ spezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vor¬ bestimmten Bereichen eines festen Trägers, das folgende Schritte umfasst:
a) Anordnen einer Maske auf dem Träger, wobei auf dem Träger für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers zur Verfügung stehende reaktive Gruppen mit Schutzgruppen versehen sind; b) Aktivieren von reaktiven Gruppen durch Entfernen von temporären Schutzgruppen an den durch die Maske vorgegebenen Bereichen mittels Zugabe eines Aktivierungsreagenzes; c) Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins an in Schritt b) aktivierte reaktive Gruppen; und d) Wiederholen der Schritte a) bis c), bis die gewünschten Biopolymere auf vorbestimmten Bereichen des Trägers synthetisiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers, das die folgenden Schritte umfasst:
a) Anordnen einer Maske auf dem Träger, wobei auf dem Träger für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers zur Verfügung stehende reaktive Gruppen mit Schutzgruppen versehen sind; b) Aktivieren von reaktiven Gruppen durch Entfernen von temporären Schutzgruppen an den durch die Maske vorgegebenen Bereichen mittels Zugabe einer wässrigen Lösung eines Aktivierungsreagenzes; c) Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins an in Schritt b) aktivierte reaktive Gruppen; und d) Wiederholen der Schritte a) bis c), bis die gewünschten Biopolymere auf vorbestimmten Bereichen des Trägers synthetisiert sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers, das die folgenden Schritte umfasst: a) Anordnen einer Elastomer-Maske auf dem Träger, wobei auf dem Träger für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers zur Verfügung stehende reaktive Gruppen mit Schutzgruppen versehen sind; b) Aktivieren von reaktiven Gruppen durch Entfernen von temporären
Schutzgruppen an den durch die Maske vorgegebenen Bereichen mittels Zugabe eines Aktivierungsreagenzes; c) Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins an in Schritt b) aktivierte reaktive Gruppen; und d) Wiederholen der Schritte a) bis c), bis die gewünschten Biopolymere auf vorbestimmten Bereichen des Trägers synthetisiert sind.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroarray mit auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Biopolymer-Sonden bereitgestellt, bei dem der prozentuale Anteil P an Biopolymeren, die die gewünschte Zahl M an Monomeren aufweisen, durch die Formel P = SM gekennzeichnet ist, wobei S die durchschnittliche Schrittausbeute für die Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins ist, und wobei die Dichte an vorbestimmten Bereichen beispielsweise mindestens 1.500 Spots pro cm2 beträgt und die durchschnittliche Schrittausbeute S mehr als 94%, z.B. mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 97%, besonders bevorzugt mindestens 98% und am meisten bevorzugt mindestens 98,6% beträgt. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines Mikroarrays mit auf vorbestimmten Bereichen eines Trägers immobilisierten Biopolymer-Sonden.
Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Entschützungsreagenzien in wässriger Lösung zur Abspaltung temporärer Schutzgruppen bei der Synthese von Biopolymeren.
Bislang werden bei der Durchführung von Aktivierungs- bzw. Entschützungs- reaktionen in Biopolymersynthesen nicht- wässrige, aprotische Lösungsmittel verwendet, da diese nicht zur Schrumpfung von gequollenen, polymeren Trägermaterialien, wie sie z.B. bei der Peptidsynthese verwendet werden, führen und zum anderen bei Verwendung von porösen bzw. rauen Trägern schnell trocknen. Sowohl bei der Polynukleotid- als auch bei der Peptidsynthese werden die Kupplungsschritte bislang unter Wasserausschluss durchgeführt. Bei der Synthese von Nukleinsäuren wurde dies u.a. dadurch begründet, dass Wasser als stärkeres Nukleophil die bei der Nukleinsäuresynthese eingesetzten aktivierten Amidite hydrolisieren würde. Bei der Synthese von Peptiden wird die Hydrolyse der eingesetzten Aminosäureaktivester unter Wasserausschluss verlangsamt. Allgemein wurde bislang bei der Durchführung von Kondensationsreaktionen wie
Polynukleotid- oder Peptidsynthesen, die unter Abspaltung von Wasser verlaufen, angenommen, dass eine Vermeidung von Wasser als Edukt zu bevorzugen ist.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Biopolymeren auf festen Trägern unter Verwendung wässriger Aktivierungs- bzw. Entschützungsreagenzien durchgeführt können, ohne dass dies die Syntheseeffizienz wesentlich beeinträchtigt. Bei den erfmdungsgemäßen Verfahren werden auf einem vorbestimmten Bereich eines Trägers im Wesentlichen nur eine Spezies an Biopolymeren, d.h. Biopolymere mit einer identischen Sequenz von Monomeren und einer identischen Sequenzlänge erzeugt. Biopolymere auf unterschiedlichen vorbestimmten Bereichen können sich in ihrer Sequenz von Monomeren unterscheiden. Die Anzahl an unterschiedlichen Biopolymer-Spezies auf dem Träger kann z.B. durch geeignete Auswahl und Anordnung von Masken beliebig eingestellt werden und ist lediglich durch die Anzahl an vorbestimmten Bereichen limitiert. Im Extremfall entspricht die Anzahl der vorbestimmten Bereiche auf dem Träger nach Abschluss des erfindungsgemäßen Verfahrens der Anzahl an unterschiedlichen Biopolymer-Spezies auf dem Träger.
Erfolgt die örtliche Diskriminierung der Synthese durch Verwendung von Masken, ist Voraussetzung für die Gewährleistung eines hohen Reinheitsgrads einer auf einem vorbestimmten Bereich des Trägers synthetisierten Biopolymer-Spezies, dass die Maske derart dicht auf dem Träger angebracht werden kann, dass nur an den durch die Maske vorgegebenen, d.h. nicht durch die Maske abgedeckten Bereichen Schutzgruppen entfernt werden. Die Verwendung von wässrigen Aktivierungs- bzw. Entschützungsreagenzien weist den wesentlichen Vorteil auf, dass dies den Einsatz von Masken aus Elastomeren ermöglicht und so eine aus der Verwendung organischer Lösungsmittel resultierende Veränderung der geometrischen Form bzw. ein Quellen eines derartigen Maskenmaterials vermieden wird. Ein derartiges Quellen einer aus Elastomeren bestehenden Maske würde zu einer Verringerung der Adhäsionskräfte zwischen Maske und Träger bis hin zum Ablösen der Maske von dem Träger führen und somit unter anderem in Kontaminationen in abgedeckten Bereichen des Trägers resultieren.
Die Verwendung von Masken aus Elastomeren ist vorteilhaft, da keine externe Kraft wie z.B. durch Schrauben oder Klammern erforderlich ist, um die Maske dichtend auf der Oberfläche des Trägers auszurichten. Die Maske wird somit vorzugsweise allein durch Adhäsion zwischen dem Träger- und Maskenmaterial dichtend auf der Trägeroberfläche angebracht. In der Regel wird die Maske dabei an auf der Träger¬ oberfläche angebrachten Markierungen ausgerichtet.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können mit einer Vielzahl von Trägermaterialien und insbesondere mit allen herkömmlichen Trägermaterialien durchgeführt werden. Beispiele für geeignete Trägermaterialien sind Glas und Siliziumdioxid. Insbesondere sind solche Kombinationen aus Masken- und Trägermaterialien für die erfmdungs gemäßen Verfahren geeignet, die eine ausreichende Adhäsion zwischen Träger und Maske derart gewährleisten, dass die Maske ohne Einwirkung einer externen Kraft dichtend auf dem Träger angeordnet werden kann.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese einer Vielzahl von Biopolymer- Spezies auf jeweils vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers weisen ferner den Vorteil auf, dass im Wesentlichen die üblicherweise bei der Festphasensynthese von Biopolymeren verwendeten Reagenzien eingesetzt werden können. Die mit der UV- Belichtung verbundenen Nachteile der im Stand der Technik beschriebenen VLSIPS- Verfahren zur Herstellung von Mikroarrays können somit vermieden werden.
Die erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen ferner einen hohen Grad an Parallelisierbarkeit, so dass auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers eine Vielzahl von Biopolymer-Spezies mit unterschiedlicher Sequenz parallel und ortsspezifisch synthetisiert werden können.
Zur Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden u.a. folgende Definitionen verwendet: Unter einer Sonde bzw. einem Sondenmolekül bzw. einer molekularen Sonde wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Molekül, insbesondere ein Biopolymer verstanden, das zum Nachweis anderer Moleküle durch ein bestimmtes, charakteristisches Bindungsverhalten bzw. eine bestimmte Reaktivität verwendet wird. Für die auf dem Träger insbesondere in Form eines Arrays angeordneten Sonden kommt jede Art von Molekülen in Frage, die sich an feste Oberflächen koppeln lassen und eine spezifische Affinität aufweisen. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich bei den Biopolymer-Sonden insbesondere um Biopolymere aus den Klassen der Peptide, Proteine, Antigene, Antikörper, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder deren Analoga und/oder Mischpolymere der vorstehend genannten Biopolymere. Besonders bevorzugt sind die Sonden Nukleinsäuren und/oder Nukleinsäureanaloga.
Als Sonden werden insbesondere Nukleinsäuremoleküle definierter und bekannter Sequenz bezeichnet, die benutzt werden, um in Hybridisierungsverfahren Target- Moleküle, wie Nukleinsäuren oder an Nukleinsäuren bindende Vertreter anderer Substanzklassen, nachzuweisen. Als Nukleinsäuren können sowohl DNA- als auch RNA-Moleküle verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei den Nukleinsäurensonden bzw. Oligonukleotidsonden um Oligonukleotide mit einer Länge von 10 bis 100 Basen, vorzugsweise 15 bis 50 Basen und besonders bevorzugt von 20 bis 30 Basen Länge handeln. Typischerweise handelt es sich erfindungsgemäß bei den Sonden um einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle oder Moleküle von Nukleinsäureanaloga, bevorzugt einzelsträngige DNA-Moleküle oder RNA-Moleküle, die mindestens über einen Sequenzbereich verfugen, der zu einem Sequenzbereich der Target-Moleküle komplementär ist. Je nach Nachweisverfahren und Anwendung können die Sonden bzw. Biopolymere auf einem festen Trägersubstrat, z.B. in Form eines Mikroarrays, immobilisiert sein. Darüber hinaus können sie je nach Nachweisverfahren markiert sein, so dass sie über eine im Stand der Technik übliche Nachweisreaktion nachgewiesen werden können.
Unter einem Target bzw. einem Targetmolekül wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung das mit einer molekularen Sonde nachzuweisende Molekül verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den zu detektierenden Targets um Nukleinsäuren. Ein erfmdungsgemäß hergestelltes Mikroarray kann jedoch analog auch zum Nachweis von Peptid/Sonden- Wechselwirkungen, Protein/Sonden- Wechselwirkungen, Kohlenhydrat/Sonden- Wechselwirkungen, Antikörper/Sonden- Wechselwirkungen, usw. eingesetzt werden.
Falls es sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bei den Targets um Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuremoleküle handelt, die durch eine Hybridisierung gegen auf einem Sondenarray angeordnete Biopolymer-Sonden nachgewiesen werden, umfassen diese Target-Moleküle in der Regel Sequenzen mit einer Länge von 10 bis 10.000 Basen, bevorzugt von 15 bis 2.000 Basen, ebenfalls bevorzugt von 15 bis 1.000 Basen, insbesondere bevorzugt von 15 bis 500 Basen und am meisten bevorzugt von 15 bis 200 Basen. Weitere Beispiele für bevorzugte Sequenzlängen sind 20, 30 oder 60 Basen. Ihre Sequenz beinhaltet gegebenenfalls die Sequenzen von Primern sowie durch die Primer definierten Sequenzbereiche des Templates. Bei den Target-Molekülen kann es sich insbesondere um einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle handeln, von denen ein Strang oder beide Stränge markiert sind, so dass sie in einem der im Stand der Technik üblichen Nachweisverfahren nachgewiesen werden können.
Als Target-Sequenz wird erfindungsgemäß der Sequenzbereich des Targets bezeichnet, der durch Hybridisierung mit der Sonde nachgewiesen wird. Erfmdungsgemäß wird auch davon gesprochen, dass dieser Bereich durch die Sonde adressiert wird.
Unter einer Substanzbibliothek wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Vielzahl von unterschiedlichen Sondenmolekülen verstanden, vorzugsweise mindestens zwei bis 1.000.000 unterschiedliche Moleküle, besonders bevorzugt mindestens 10 bis 10.000 unterschiedliche Moleküle und am meisten bevorzugt 100 bis 1.000 unterschiedliche Molekülen. Bei speziellen Ausgestaltungen kann eine Substanzbibliothek auch nur mindestens 50 oder weniger oder mindestens 30.000 unterschiedliche Moleküle umfassen. Die Substanzbibliothek ist vorzugsweise als Array auf einem Träger angeordnet.
Unter einem Sonden- Array bzw. Biopolymer- Array wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Anordnung von molekularen Sonden bzw. von Biopolymeren bzw. einer Substanzbibliothek auf einem Träger verstanden, wobei die Position einer jeden Sondenspezies separat bestimmt ist. Vorzugsweise umfasst der Array definierte Stellen bzw. vorbestimmte Bereiche, sog. Array-Elemente, die besonders bevorzugt in einem bestimmten Muster angeordnet sind, wobei jedes Array-Element üblicherweise im Wesentlichen nur eine Spezies an Sonden beinhaltet. Die Anordnung der Moleküle bzw. Sonden auf dem Träger kann dabei durch kovalente oder nicht kovalente Wechselwirkungen erzeugt werden. Die Sonden sind dabei auf der dem Reaktionsraum zugewandten Seite des Trägers angeordnet. Eine Position innerhalb der Anordnung, d.h. des Arrays, wird üblicherweise als Spot bezeichnet.
Unter einem Array-Element bzw. einem vorbestimmten Bereich bzw. einem Spot bzw. einem Array-Spot wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein für die Deposition einer Spezies von molekularen Sonden bestimmtes Areal auf einer Oberfläche eines Trägers verstanden. Eine Spezies von molekularen Sonden sind insbesondere Biopolymere mit derselben Sequenz von Monomeren. Die Summe aller belegten Array-Elemente ist das Sonden- Array. Auf einem vorbestimmten Bereich des Trägers liegt somit nach abgeschlossener Synthese gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren im Wesentlichen nur eine Spezies an Biopolymeren vor. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist der Spot eine quadratische Form auf. Die Kantenlänge eines derartigen quadratischen Spots beträgt vorzugsweise etwa 2 μm bis etwa 128 μm, besonders bevorzugt etwa 32 μm.
Unter einem Trägerelement bzw. Träger bzw. Substanzbibliothekenträger bzw.
Substrat wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Festkörper verstanden, auf dem die Biopolymere, vorzugsweise in Form eines Sonden-Arrays bzw. Biopolymer- Arrays, synthetisiert werden können. Bei dem Träger, der üblicherweise auch als Matrix, Objektträger oder Wafer bezeichnet wird, kann es sich z.B. um Silizium, Siliziumdioxid, Glas, Kunststoffe, Keramik, Glaskeramik, Quarz handeln. Der
Träger, z.B. aus den vorstehend genannten Materialien und/oder weiteren denkbaren Materialien, kann beschichtet sein, z.B. mit Polymeren. Die Schicht kann z.B. aus einem gasförmigen, flüssigen, gelösten, festen Ausgangszustand des aufzubringenden Materials erzeugt werden. Weist der Träger eine derartige Schicht, z.B. eine Polymerschicht auf, wird er im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch als Substrat bezeichnet.
Die Gesamtheit aus in Array- Anordnung auf dem Träger bzw. Substrat abgelegten bzw. synthetisierten Molekülen bzw. Biopolymeren bzw. der in Array- Anordnung auf dem Substrat bzw. der Detektionsfläche abgelegten bzw. synthetisierten Substanzbibliothek und dem Träger bzw. Substrat wird häufig auch als "Chip", "Biochip", "Mikroarray", "Microarray", "DNA-Chip", Sondenarray" etc. bezeichnet. Herkömmliche Arrays bzw. Mikroarrays im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfassen etwa 2 bis 10.000, vorzugsweise 10 bis 2.000 und besonders bevorzugt mindestens 50 oder mindestens 150 Spots auf einer, vorzugsweise quadratischen, Fläche von z.B. 1 mm bis 5 mm x 1 mm bis 5 mm, vorzugsweise von 2 mm x 2 mm oder 3 mm x 3 mm oder 4,5 mm x 4,5 mm oder etwa 17,64 mm2. Die Spots weisen jeweils eine definierte Spezies von Sondenmolekülen bzw. Biopolymeren auf. In der Regel weisen die Spots eines Arrays jeweils unterschiedliche Spezies von Sonden¬ molekülen bzw. Biopolymeren auf. Üblicherweise umfasst allerdings ein Array auch redundante Spots, d.h. Spots mit derselben Spezies von Sondenmolekülen.
In weiteren Ausgestaltungen umfassen Mikroarrays im Rahmen der vorliegenden Erfindung etwa 50 bis etwa 80.000, vorzugsweise etwa 100 bis etwa 65.000, besonders bevorzugt etwa 1.000 bis etwa 10.000 Spots bzw. Spezies, vorzugsweise unterschiedliche Spezies, von Sondenmolekülen auf einer Fläche von mehreren mm bis mehreren cm2, vorzugsweise etwa 1 mm bis 10 cm2, besonders bevorzugt etwa 2 mm bis etwa 1 cm und am meisten bevorzugt etwa 4 mm bis etwa 25 mm . Beispielsweise weist ein herkömmliches Mikroarray von 2 bis 65.000 Spots bzw., vorzugsweise unterschiedliche, Spezies von Sondenmolekülen auf einer Fläche von etwa 4,2 mm x etwa 4,2 mm auf. Weitere beispielhafte Größen der Flächen des Mikroarrays bzw. der Flächen für die Synthese der Biopolymere sind etwa 1 bis 10 mm x etwa 1 bis 10 mm, vorzugsweise etwa 2 bis 5 mm x etwa 2 bis 5 mm und besonders bevorzugt etwa 3,5 bis 4,5 mm x etwa 3,5 bis 4,5 mm. Üblicherweise beziehen sich Flächen- und/oder Dichteangaben im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf die Grundfläche des Mikroarrays. Die Grundfläche eines Mikroarrays ergibt sich aus den Seitenlängen bzw. Kantenlängen des Mikroarrays. Ein Mikroarray mit einer Fläche von z.B. 4,2 mm x 4,2 mm weist somit eine quadratische Grundfläche von 17,64 mm 2 und eine Seitenlänge von 4,2 mm auf. Eine Markierung oder ein Marker bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine detektierbare Einheit, beispielsweise ein Fluorophor oder eine Ankergruppe, an die eine detektierbare Einheit gekoppelt werden kann.
Als Probe bzw. Probenlösung bzw. Analyt wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die zu analysierende Flüssigkeit mit den nachzuweisenden und ggf. zu amplifizierenden Targetmolekülen bezeichnet.
Unter einer molekularen Wechselwirkung bzw. einer Wechselwirkung wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere eine spezifische, kovalente oder nicht-kovalente Bindung zwischen einem Targetmolekül und einem immobilisierten Sondenmolekül verstanden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Wechselwirkung zwischen Sonden- und Targetmolekülen eine Hybridisierung.
Als Hybridisierung wird die Bildung von doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen oder Duplexmolekülen aus komplementären einzelsträngigen Nukleinsäure¬ molekülen bezeichnet. Dabei findet die Assoziation vorzugsweise immer zu Paaren von A und T bzw. G und C statt. Eine Assoziation kann vorzugsweise auch über nicht kanonische Basenpaarungen erfolgen. Hierunter werden Basenpaarungen mit nicht kanonischen Basen bzw. Nukleotiden verstanden, deren Nukleobase sich von dem Pyrimidin- bzw. Puringrundgerüst ableitet, aber ein anderes Muster von Wasserstoffbrücken-Donoren bzw. -Akzeptoren aufweist. Dadurch sind Nukleobasen wie zum Beispiel Xanthin oder Hypoxanthin befähigt, stabile Basenpaarungen, sog. Wobbelbasenpaarungen, mit verschiedenen kanonischen Basen auszubilden. Für Hypoxanthin bzw. dessen Nukleosid Inosin sind stabile Paarungskomplexe mit den Nukleosiden Cytidin, Adenosin oder Thymidin bekannt. Die einzelnen Basenpaarungen zeigen bei diesem System eine abgestufte Stabilität. Der Einbau von nicht kanonischen Basen, die Wobblebasenpaarungen mit den zu analysierenden Target-Sequenzen ermöglichen, in Sondensequenzen an den Stellen einer möglichen Punktmutation einer zu analysierenden Targetsequenz ermöglicht den Nachweis von Allelen dieser Target-Sequenz mit einer Sonden-Spezies, falls deren Nachweis unabhängig von dem Vorliegen der Punktmutation erfolgen soll. Darüber hinaus ist der Einbau von nicht kanonischen Nukleotiden in eine Sondensequenz vor allem vorteilhaft in Bereichen von Spacerregionen zwischen hoch konservierten Bereichen der Sondensequenz, die für die Adressierung eines Targets verantwortlich sind.
Im Rahmen einer Hybridisierung können z.B. DNA-DNA-Duplexes, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Duplexes gebildet werden. Durch eine Hybridisierung können auch Duplexes mit Nukleinsäureanaloga gebildet werden, wie z.B. DNA-PNA-Duplexes, RNA-PNA-Duplexes, DNA-LNA-Duplexes und RNA-LNA-Duplexes. Hybridisierungsexperimente werden üblicherweise benutzt, um die Sequenzkomplementarität und damit die Identität zwischen zwei verschiedenen Nukleinsäuremolekülen nachzuweisen.
Unter Biopolymeren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung synthetisch erzeugte Polymere verstanden, die über Polymersiationsreaktionen gebildet werden und gleiche oder ähnliche Bausteine bzw. Monomerbausteine enthalten wie natürlich vorkommende Makromoleküle wie z.B. Nukleinsäuren, Polysaccharide oder Peptide bzw. Proteine. Vorzugsweise handelt es sich bei den Biopolymeren um Peptide, Proteine, Antigene, Antikörper, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder deren Analoga und/oder Mischpolymere der vorstehend genannten Biopolymere.
Unter einer Spezies an Biopolymeren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Biopolymere mit identischer Sequenz, d.h. mit identischer Sequenz von Monomeren, und der vollständigen gewünschten Länge, d.h. Anzahl an Monomeren, verstanden.
Unter im Wesentlichen nur einer Spezies an Biopolymeren wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein bestimmter Reinheitsgrad an Biopolymeren mit identischer bzw. gleicher Sequenz, d.h. auch vollständiger Länge, auf einem vorbestimmten Bereich verstanden. So wird beispielsweise bei einer Polymerlänge von 10 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25 und besonders bevorzugt etwa 20, unter im Wesentlichen nur einer Spezies an Biopolymeren ein Reinheitsgrad an Biopolymeren mit identischer bzw. gleicher Sequenz auf einem vorbestimmten Bereich von mindestens etwa 10% oder mindestens etwa 30%, vorzugsweise von mindestens etwa 50% und besonders bevorzugt von mindestens etwa 75% verstanden. Insbesondere bestimmt sich der Reinheitsgrad bzw. Reinheitsgrad P bzw. prozentuale Anteil P durch die Formel P = SM, wobei S die durchschnittliche Schrittausbeute bei der Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins ist, wobei die durchschnittliche Schrittausbeute S mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 97%, besonders bevorzugt mindestens 98% und am meisten bevorzugt mindestens 99% beträgt.
Monomere bzw. Monomerbausteine sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Verbindungen, aus denen über Polymerisationsreaktionen Biopolymere aufgebaut werden können. Unter einem Monomer wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere ein Baustein verstanden, der eine oder mehrere konstitutionelle Einheiten bilden kann, deren (vielfache) Wiederholung als konstitutionelle Repetiereinheiten ein Biopolymer ergibt. Konstitutionelle Einheiten bzw. Monomere bei Biopolymeren sind z.B. Nukleotide und Aminosäuren. Unter einem Oligomer bzw. Oligomerbaustein wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Sequenz aus Monomeren verstanden, die vorzugsweise eine Teilsequenz der zu synthetisierenden Biopolymere darstellt. Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Oligomere können insbesondere durch klassische Festphasensynthese, wie sie z.B. für Peptide und Oligonukleotide beschrieben ist, bereitgestellt werden.
Unter einer reaktiven Gruppe bzw. Funktionalität wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine funktionelle Gruppe des Trägers oder eines Monomer- bzw. Oligomerbausteins verstanden, die eine Kupplungsreaktion, insbesondere eine Kondensationsreaktion, mit der entsprechenden reaktiven Gruppe eines weiteren Monomer- oder Oligomerbausteins bzw. dem Träger ermöglicht. Reaktive Gruppen von Aminosäurebausteinen sind insbesondere Amino- und Carboxylgruppen. Reaktive Gruppen von Nukleotidbausteinen sind insbesondere Hydroxyl- und Phosphat- bzw. Phosphorester- bzw. aktivierte Phosphorestergruppen wie Phosphotriester- und/oder Phosphoramiditgruppen.
Ein bei den erfmdungsgemäßen Verfahren eingesetzter Monomer- oder Oligomerbaustein weist mindestens zwei reaktive Gruppen auf, von denen die eine zur Kupplung an auf der Trägeroberfläche vorliegende freie reaktive Gruppen bzw. an Intermediate der zu synthetisierenden Biopolymere mit freien reaktiven Gruppen dient und die andere für die Kupplung eines weiteren Monomer- oder Oligomer¬ bausteins im nächsten Kupplungsschritt dient.
Üblicherweise werden bei einem Kupplungsschritt in den erfmdungsgemäßen Verfahren Monomer- bzw. Oligomerbausteine eingesetzt, bei denen die zur Kupplung an die Trägeroberfläche bzw. an Intermediate der zu synthetisierenden Biopolymere dienende reaktive Gruppe frei ist, d.h. nicht mit einer Schutzgruppe versehen ist, während die für die Kupplung eines weiteren Monomer- oder Oligomerbausteins im nächsten Kupplungsschritt dienende reaktive Gruppe durch eine Schutzgruppe, insbesondere eine temporäre Schutzgruppe, geschützt ist.
Unter auf dem Träger für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomer- bausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers zur Verfügung stehende reaktive Gruppen werden reaktive Gruppen bzw. Funktionalitäten verstanden, mit denen der Träger versehen ist und die zur Kopplung des ersten Monomer- oder Oligomer¬ bausteins dienen. Falls die Synthese bereits fortgeschritten ist, werden unter auf dem Träger für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers zur Verfügung stehende reaktive Gruppen Funktionalitäten bzw. reaktive Gruppen des Intermediats des zu synthetisierenden Biopolymers verstanden, die zur Kupplung von weiteren Monomer- und/oder Oligomerbausteinen dienen.
Unter einem Intermediat bzw. Zwischenprodukt des zu synthetisierenden Biopolymers wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere eine bereits auf dem Träger immobilisierte bzw. synthetisierte Polymerkette aus Monomerbausteinen verstanden, die einer Teilsequenz des gewünschten Biopolymers entspricht. Ein Intermediat liegt nach Durchführung mindestens eines Kupplungsschritts, d.h. der Kupplung mindestens eines Monomer- oder Oligomerbausteins an den Träger vor.
Ein Kupplungsschritt im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst insbesondere die Aktivierung bzw. Entschützung einer reaktiven Gruppe für die Kupplung eines Monomer- oder Oligomerbausteins, die eigentliche Kupplungsreaktion zwischen reaktiver Gruppe und Monomer- oder Oligomerbaustein sowie ggf. das anschließende Capping des gekuppelten Monomer- oder Oligomerbausteins. Unter der Schrittausbeute S wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Ausbeute eines Kupplungsschritts verstanden.
Unter temporären Schutzgruppen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Reste bezeichnet, mit denen bestimmte funktionelle Gruppen eines ein oder mehrere reaktive Zentren enthaltenen Moleküls, z.B. eines Monomers, und/oder funktionelle Gruppen auf der Trägeroberfläche vorübergehend gegen den Angriff von Reagenzien geschützt werden können, so dass Reaktionen wie Kondensationen von Monomer- bzw. Oligomerbausteinen nur an den gewünschten (ungeschützten) Stellen stattfinden. Insbesondere sind zahlreiche Schutzgruppen für Amino- und Carboxy-Gruppen von Aminosäuren entwickelt worden, die mit möglichst großen Ausbeuten ausschließlich mit ihren ungeschützten funktionellen Gruppen miteinander zu Peptiden bzw. Proteinen reagieren sollen. Analoge Schutzgruppen sind auch bei der Polynukleotid-Synthese gebräuchlich.
Beispiele für temporäre Schutzgruppen in der Peptidsynthese sind die säurelabile Boc- (tert.-Butyloxycarbonat) und die basenlabile Fmoc- (Fluorenyl-9- methoxycarbonyl) Gruppe. Beispiele für temporäre Schutzgruppen in der Polynukleotid-Synthese sind die säurelabile DMT- (Dimethoxytrityl) Gruppe und photolabile Schutzgruppen wie sie u.a. in US 5,744,305 beschrieben sind.
Unter pennanenten Schutzgruppen werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Reste bezeichnet, die während der gesamten Synthese der Biopolymere bestimmte funktionelle Gruppen der Monomerbausteine gegen den Angriff von Reagenzien schützen können, so dass Reaktionen wie Kondensationen von Monomer- bzw. Oligomerbausteinen nur an den gewünschten (ungeschützten) Stellen stattfinden. Derartige permanente Schutzgruppen dienen insbesondere zum Schutz von funktionellen Gruppen in den Seitenketten von Aminosäureresten oder Nukleobasen und werden vorzugsweise erst nach Abschluss der Biopolymersynthese abgespalten.
Beispiele für permanente Schutzgruppen in der Peptidsynthese sind die Z- (Benzyloxycarbonyl) und die BzI- (Benzyl) Gruppe. Beispiele für permanente Schutzgruppen in der Polynukleotid-Synthese sind die Bz- (Benzoyl), die iBu- (Isobutyryl) und die TBDMS- (t-Butyldimethylsilyl) Gruppe.
Weitere temporäre und permanente Schutzgruppen sind in H.-D. Jakubke, Peptide - Chemie und Biologie, Spektrum Verlag, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1996 beschrieben.
Unter einem Aktivierungsreagenz wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Reagenz verstanden, dass funktionelle Gruppen eines Moleküls, z.B. eines Monomer- oder Oligomerbausteins, freisetzt bzw. erzeugt, so dass Reaktionen wie Kondensationen mit weiteren Monomer- oder Oligomerbausteinen an den freigesetzten bzw. erzeugten funktionellen Gruppen stattfinden können. Aktivierungsreagenzien im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind insbesondere Entschützungsreagenzien.
Unter einem Entschützungsreagenz wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein Reagenz verstanden, das sich zur spezifischen Entfernung von Schutzgruppen von reaktiven Gruppen eignet, so dass Reaktionen wie Kondensationen von Monomer¬ bzw. Oligomerbausteinen an den gewünschten (ungeschützten) reaktiven Gruppen stattfinden können.
Beispielhafte Entschützungsreagenzien insbesondere für die Abspaltung säurelabiler Schutzgruppen sind Methansulfonsäure, Oxalsäure, Trifluormethansulfonsäure und/oder Mineralsäuren wie Salzsäure. Vorzugsweise werden die Aktivierungs- bzw. Entschützungsreagenzien im Rahmen der vorliegenden Erfindung in wässriger Lösung eingesetzt. So können z.B. etwa 2%ige bis etwa 40%ige wässrige Lösungen, vorzugsweise etwa 5%ige bis etwa 35%ige wässrige Lösungen und besonders bevorzugt etwa 10%ige wässrige Lösungen von Aktivierungs- bzw.
Entschützungsreagenzien wie Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure, Oxalsäure und/oder Mineralsäuren in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Dem Fachmann ist es ohne weiteres möglich zu bestimmen, wie die Konzentration des Entschützungsreagenzes mit der Dauer der Entschützungsreaktion korreliert ist. So werden beispielsweise besonders bevorzugt 10%ige wässrige Lösungen von Oxalsäure oder Methansulfonsäure zur Aktivierung von mit DMT geschützten Nukleinsäuren in den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt. Ferner ist beispielsweise bei der Synthese von Polypeptiden der Einsatz stärkerer Säuren möglich als bei der Synthese von Nukleinsäuren, da hier anders als bei der Synthese von Nukleinsäuren keine Nebenreaktionen wie Depurinierung auftreten.
Unter einer Maske wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein festes Material verstanden, das mit Hohlräumen, Aussparungen bzw. Inseln und/oder Kanälen versehen ist, so dass bei Anordnung der Maske auf der Trägeroberfläche Bereiche des Trägers, die durch die Hohlräume, Aussparungen und/oder Kanäle vorgegeben sind, für die Biopolymersynthese bzw. die Zugabe von Reagenzien wie Aktivierungsreagenzien zugänglich sind, während die durch die Maske abgedeckten Bereiche des Trägers aufgrund der dichtenden Anordnung der Maske auf dem Träger nicht für Reagenzien zugänglich sind. Insbesondere sind die durch die Maske vorgegebenen Bereiche, also die durch die Maske nicht abgedeckten Bereiche, identisch mit jeweils für die Synthese einer Spezies von Biopolymeren ausgewählten vorbestimmten Bereichen des Trägers. Alternativ, falls z.B. zwischen den Spots inerte Bereiche bzw. inerte Stege angeordnet sind, können die durch die Maske abgedeckten Bereiche eine andere Geometrie aufweisen als die Spots. So können in diesen Fall die durch die Maske abgedeckten Bereiche z.B. rechteckige Geometrien aufweisen, während die Geometrien der Spots auf dem Träger z.B. kreisförmig sind. Üblicherweise weisen die bei den erfmdungsgemäßen Verfahren eingesetzten Masken mindestens eine Öffnung für die Befüllung und Entleerung mit Reagenzien auf.
Eine im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Maske tritt insbesondere nicht mit den auf der Trägeroberfläche synthetisierten Biopolymeren bzw. Biopolymer-Intermediaten in Reaktion. Eine derartige Maske ist ferner dazu geeignet, auf der Trägeroberfiäche derart angebracht zu werden, dass das Maskenmaterial dichtend auf der Trägeroberfläche aufliegt.
Vorzugsweise weisen die Masken einen, vorzugsweise mehrere mit einem Zu- und Ablauf versehene Kanäle mit einer Breite von etwa 2 μm bis etwa 2 mm bzw. etwa 2048 μm, besonders bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 512 μm und am meisten bevorzugt von etwa 32 μm bis etwa 128 μm auf. Die Kanäle sind üblicherweise linear, wobei die Länge eines linearen Kanals mindestens der Länge eines Arrays entspricht.
Ein derartiger Kanal kann eine oder mehrere Inseln aufweisen, wobei hierbei die Kanalbreiten vorzugsweise größer sind als die Breiten der jeweiligen Inseln. Besonders bevorzugt sind in diesem Falle Kanäle, deren Breite der aktiven Fläche des jeweiligen Chips entsprechen und beispielsweise eine Breite von etwa 2048 μm aufweisen. Die Inseln weisen insbesondere eine Länge und/oder Breite von etwa 2 μm bis etwa 2 mm, besonders bevorzugt von etwa 10 μm bis etwa 512 μm und am meisten bevorzugt von etwa 32 μm bis etwa 128 μm auf. Unter Elastomeren werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Polymere mit gummielastischem Verhalten verstanden, die bei Raumtemperatur wiederholt mindestens auf das zweifache ihrer Länge gedehnt werden können und nach Aufhebung des für die Dehnung erforderlichen Zwanges sofort wieder annähernd ihrer Ausgangslänge einnehmen (siehe z.B. DIN 7724). Beispiele für Elastomere sind Silikon-Elastomere, wie z.B. PDMS (Polydimethylsiloxan) und Kautschuk- Derivate.
Unter einer Elastomer-Maske bzw. einer Maske aus Elastomeren bzw. einer Elastomere umfassenden Maske wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Maske verstanden, bei der zumindest die den Träger kontaktierende Seite der Maske mit einer Schicht aus einem oder mehreren Elastomeren versehen ist.
Unter einer dichten bzw. dichtenden Verbindung zwischen Maske und Träger wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Auflage der Maske auf dem Träger derart verstanden, dass die beispielsweise durch die Kanäle der Maske, vorzugsweise in Lösung, zu nicht durch die Maske abgedeckte Bereiche des Trägers zugeführten Reagenzien nicht in durch die Maske abgedeckte Bereiche des Trägers gelangen.
Unter einer Derivatisierung des Trägers wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die Trägeroberfläche mit funktionellen Gruppen versehen wird, die die Anknüpfung von Spacern bzw. Linkern und/oder Monomerbausteinen gewährleisten. Vorzugsweise erfolgt die Derivatisierung eines Trägers durch Aufbringen eines Polymers auf den Träger, wobei das Polymer mit funktionellen Gruppen versehen ist, die die Anknüpfung von Linkern und/oder Monomer¬ bausteinen gewährleisten. Die Anordnung aus Träger mit einer darauf aufgebrachten Polymerschicht wird im Folgenden auch als Substrat bezeichnet. Im Falle einer kovalenten Anbindung der zu synthetisierenden Biopolymere bzw. Linker bzw. Spacer finden Träger und/oder ggf. auf diesen Trägern aufgebrachte Polymere, z.B. Silane, Verwendung, die mit reaktiven Funktionalitäten wie Alkoxy, Epoxid, Halogenid, Hydroxyl, Amino, Carboxyl, Thiol, Aldehyd u.dgl. funktionalisiert bzw. modifiziert sind. Des Weiteren ist dem Fachmann auch die Aktivierung einer Oberfläche durch Isothiocyanat, Succinimidester und Imidoester bekannt. Hierfür können aminofunktionalisierte Oberflächen entsprechend derivatisiert werden. Ferner können durch die Zugabe von Kupplungsreagenzien, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid, entsprechende Immobilisierungen der zu synthetisierenden Biopolymere gewährleistet werden. Weisen die auf dem Träger bzw. Substrat anzubringenden Monomerbausteine Aminogruppen auf, die für die Anknüpfung an den Träger bzw. das Substrat bestimmt sind, so wird der Träger bzw. das Substrat vorzugsweise mit einer Epoxidgruppen-tragenden Verbindung derivatisiert.
Unter Linkern bzw. Spacern werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung molekulare Gruppen verstanden, die funktionelle Gruppen auf der Trägeroberfläche mit Monomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers verknüpfen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Linker bzw. Spacer können geradkettig oder verzweigt sein. Bevorzugte Linker bzw. Spacer werden insbesondere ausgewählt aus Polyethylenglykol und mit Epoxidgruppen funktionalisierten Polymeren wie z.B. epoxyfunktionalisierten Silanen. Verzweigungen können beispielsweise durch Polymer-Spacer bzw. -Linker erzeugt werden, die Glycerol-Bausteine umfassen.
Beispiele für Linker bzw. Spacer insbesondere für die Kupplung von DNA an den Träger bzw. das Substrat sind Polyether (ROR') wie Mischpolymere aus Bisepoxid und Polyethylenglykol, Polyurethane (RNHC(O)OR') wie Mischpolymere aus Alkoxy- und Diisocyanaten und Mischpolymere aus Aryloxy, Alkoxy und Diisocyanaten, Polythiocarbamate (RNHC(O)SR') wie Mischpolymere aus Alkoxy- und Diisothiocyanaten und Mischpolymere aus Bismercaptanen und Diisocyanaten, und Polydithiocarbamate (RNHC(S)SR') wie Mischpolymere aus Dithiol und Diisothiocyanate. Ist die Bereitstellung einer Substratoberfläche mit
Mercaptofunktionen (RSH) gewünscht, können epoxyfunktionalisierte Silane und Dithiole eingesetzt werden. Für Substrate mit aminierter Oberflächen (RNH2) finden beispielsweise aminofunktionalisierte Silane als Linker bzw. Spacer Verwendung.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur ortspezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers durch schrittweise Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen, bei dem jeweils vor einem Kupplungsschritt auf mindestens einem vorbestimmten Bereich des Trägers für die Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins zur Verfügung stehende reaktive Gruppen dadurch aktiviert werden, dass temporäre Schutzgruppen an diesen reaktiven Gruppen durch Zugabe eines Aktivierungsreagenzes in wässriger Lösung entfernt werden.
Wesentliches Merkmal der erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die ortsspezifische Synthese einer Vielzahl von Biopolymer-Spezies mit jeweils definierter Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers unter Verwendung wässriger Reagenzien für die Aktivierung von reaktiven Gruppen erfolgt. Die Aktivierung der reaktiven Gruppen erfolgt insbesondere durch Abspaltung von an diesen reaktiven Gruppen befindlichen temporären
Schutzgruppen durch Entschützungsreagenzien in wässriger Lösung. Vorzugsweise werden die temporären Schutzgruppen von solchen vorbestimmten Bereichen des Trägers entfernt, die durch eine auf dem Träger angeordnete Maske vorgegeben sind. 48
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Die erfmdungsgemäßen Verfahren erlauben die Verwendung herkömmlicher Reagenzien für die Synthese von Biopolymeren und ermöglichen die Synthese von Biopolymer-Substanzbibliotheken auf miniaturisierten Trägern im Array-Format. Somit können mittels der erfindungsgemäßen Verfahren in situ synthetisierten
Biopolymere insbesondere als molekulare Sonden bei Nachweisverfahren im Array- Format eingesetzt werden. Dabei bilden die auf vorbestimmten Bereichen des Trägers synthetisierten Biopolymere zusammen mit dem Träger den Mikroarray bzw. Biochip.
Die zu synthetisierenden Biopolymere werden vorzugsweise ausgewählt aus Nukleinsäuren, Peptiden und Peptidnukleinsäuren. Die Auswahl der Biopolymere erfolgt z.B. in Abhängigkeit von der Verwendung eines mittels den erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren Mikroarrays, bei dem die synthetisierten Biopolymere Sondenmoleküle für den Nachweis von Targetmolekülen in einer zu analysierenden Probe entsprechen.
Die örtliche Diskriminierung der Synthese derart, dass auf einem vorbestimmten Bereich des Trägers im Wesentlichen nur eine Spezies von Biopolymeren mit gleicher Sequenz vorliegt, wird insbesondere durch Verwendung von Masken gewährleistet, die wässrige Reagenzien für die Abspaltung von Schutzgruppen gezielt zu den durch die Maske vorgegebenen Bereichen führen. Die Ortsspezifität der Synthese wird somit durch eine Maskierungssstrategie erreicht, bei der die Reagenzien zur Abspaltung der Schutzgruppen, d.h. die Aktivierungs- oder Entschützungsreagenzien, durch die Verwendung von mechanischen Masken nur die von der Maske nicht abgedeckten Bereiche auf der Oberfläche des Trägers benetzen können. Die erfindungsgemäß verwendeten Masken erlauben nicht nur die Bereitstellung durchgehender Kanäle, sondern ggf. auch die Abdeckung einzelner vorbestimmter Bereiche bzw. Spots des Arrays.
Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von Masken zur Herstellung eines Mikroarrays wird die Dichte der Spots auf der Trägerober¬ fläche durch die Positionierung und Miniaturisierung von Kanälen bzw. Hohlräumen der Masken vorgegeben. Auf diese Weise lässt sich eine Dichte an vorbestimmten Bereichen auf dem Mikroarray von beispielsweise mindestens 1.500 Spots pro cm2, vorzugsweise von mindestens 2.500 Spots pro cm , besonders bevorzugt von mindestens 10.000 Spots pro cm2 und am meisten bevorzugt von mindestens 25.000 bis zu einer Million Spots pro cm2 erreichen. Die Angaben der Dichte an Spots sind in der Regel auf die Grundfläche des Mikroarrays bezogen, die sich wiederum aus den Seiten- bzw. Kantenlängen des Mikroarrays ergibt.
Diese hohen Dichten an vorbestimmten Bereichen erlauben die Bereitstellung äußerst kleiner Mikroarrays mit einer hohen Anzahl an Spots. So können quadratische Chips mit einer Kantenlänge von 1 cm oder 1 mm aber auch von nur noch 0.1 mm hergestellt werden. Bei bevorzugten Ausführungsformen beträgt die Trägerfläche höchstens 1 cm2, höchstens 25 mm2, höchstens 17,64 mm2, höchstens 4 mm , höchstens 1 mm oder höchstens 100 μm .
Ein erfindungsgemäßes Verfahren umfasst somit insbesondere die folgenden Schritte:
a) Anordnen einer Maske auf dem Träger, wobei auf dem Träger für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers zur Verfügung stehende reaktive Gruppen mit Schutzgruppen versehen sind; b) Aktivieren von reaktiven Gruppen durch Entfernen von temporären Schutzgruppen an den durch die Maske vorgegebenen Bereichen mittels Zugabe eines Aktivierungsreagenzes in wässriger Lösung;
c) Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins an in Schritt b) aktivierte reaktive Gruppen; und
d) Wiederholen der Schritte a) bis c), bis die gewünschten Biopolymere auf vorbestimmten Bereichen des Trägers synthetisiert sind.
Die Aktivierungs- bzw. Entschützungsreagenzien werden vorzugsweise ausgewählt aus Oxalsäure, Methansulfonsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure und/oder Natriumhydroxid und vorzugsweise in wässriger Lösung eingesetzt. Mit wässrigen Lösungen der vorgenannten Aktivierungsreagenzien lassen sich insbesondere bevorzugte Schutzgruppen wie z.B. Dimethoxytrityl bei der Polynukleotidsynthese und t-Butyloxycarbonyl bei der Peptidsynthese entfernen.
Dem Fachmann ist ersichtlich, welche Zeitdauer in Abhängigkeit von der Konzentration des jeweiligen für den Entschützungsschritt verwendeten Reagenzes zu wählen ist. So beträgt beispielsweise eine bevorzugte Dauer der
Entschützungsreaktion bei Verwendung von 10%iger Oxalsäure etwa zwanzig Minuten und bei Verwendung von 10%iger Methansulfonsäure etwa fünf Minuten.
Vorzugsweise wird lediglich die Abspaltung der Schutzgruppen unter Verwendung der Maske durchgeführt, so dass der restliche Synthesezyklus zur Anknüpfung eines Monomers offen, d.h. ohne Maske, beispielsweise in einer herkömmlichen Synthesekammer ablaufen kann. Vorzugsweise werden Masken- und Trägermaterial derart ausgewählt, dass die auf dem Träger angeordnete Maske mit diesem dicht verbunden ist, indem die Maske beispielsweise durch Adhäsion auf dem Träger haftet.
So wird der Träger vorzugsweise ausgewählt aus Silizium wie z.B. Siliziumdioxid, Gläsern wie Natronkalk-Gläsern, Borosilicat-Gläsern, Borofloat-Gläsern, z.B. BF 33 Glas (Schott, Mainz, Deutschland), Quarzglas, Quarz, einkristallinem CaF2, Saphirscheiben, Topas und/oder Kunststoffen wie PMMA und/oder Polycarbonat, Keramik, Ta2O5, TiO2, Si3N4 und/oder Al2O3. Besonders bevorzugt ist der Träger aus Silizium oder Borofloat-Glas.
Die eingesetzten Masken bestehen vorzugsweise aus inerten, nicht an der Biopolymersynthese teilnehmenden Materialien. Die erfindungsgemäß eingesetzten Masken weisen den wesentlichen Vorteil auf, dass sie ohne Beeinträchtigung ihrer Funktionalität vom Trägermaterial abgelöst werden können. Somit unterscheiden sie sich von den im Stand der Technik als Maskenmaterial beschriebenen Photoresist- schichten, die nur durch Auflösen der Schicht vom Träger entfernt werden können.
Das Aufbringen der Maske auf dem Träger fuhrt zur Bildung von ggf. mit Inseln versehenen Kanälen bzw. von Freiräumen zwischen den Stellen, auf denen kein Maskenmaterial aufliegt. Die Aktivierungs- bzw. Entschützungsreagenzien können dann in die Freiräume fließen, d.h. die Maske dient der selektiven Aktivierung, insbesondere der selektiven Entschützung.
Die Frei- bzw. Hohlräume, die durch derartige Kanäle ausgebildet werden, können beliebige Grundformen wie z.B. quadratisch, rechteckig, kreisförmig u. dgl. annehmen. Ein derartiger Hohlraum kann mehrere Spots, z.B. zwei bis zehn Spots, aber auch nur einen Spot oder sämtliche Spots für Reagenzien zugänglich machen. Bei der Anordnung der Maske auf dem Träger werden die Maske und der Träger zueinander vorzugsweise mit einer Genauigkeit von wenigen μm, besonders bevorzugt etwa 1,5 μm bis etwa 3 μm und am meisten bevorzugt etwa 1 μm bis etwa 2 μm positioniert. Der Abstand zwischen den vorbestimmten Bereichen ist somit wesentlich geringer als jener beim Spotting-Verfahren, da bei letzteren Verfahren der begrenzende Faktor die Tropfengröße und deren Abstand zueinander ist. Somit ermöglichen die erfindungsgemäßen Verfahren die Bereitstellung einer wesentlich höheren Dichte an vorbestimmten Bereichen auf dem Träger.
Die Positionierung der Maske auf den Träger erfolgt dabei vorzugsweise durch auf dem Träger angebrachte Markierungen.
Durch Verschiebung einer Maske in x,y-Richtung und/oder Drehung der Maske um einen beliebigen Winkel zwischen 0 und 360° können mit einer geringen Anzahl von Masken eine Vielzahl von Mustern auf der Trägeroberfläche erzeugt werden. Auf diese Weise können Mikroarrays mit beliebigen Kombinationen von Biopolymer- Sonden gebildet werden.
Vorzugsweise werden Masken aus Elastomeren eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Masken aus Polydimethylsiloxan. Der Einsatz von Elastomeren gewährleistet eine Adhäsion zwischen Träger und Maske, ohne dass eine externe Kraft erforderlich ist, um die Maske mit dem Träger in dichtender Weise zu verbinden. Dabei kann es ferner bevorzugt sein, dass lediglich die dem Träger bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zugewandte Schicht der Maske aus Elastomeren gebildet ist. Eine derartige Schicht aus Elastomeren ist bei dieser Ausgestaltung der Maske üblicherweise auf einem festen Grundkörper z.B. aus Glas oder Kunststoff aufgebracht. So wird beispielsweise bei Verwendung einer Polydimethylsiloxan-Maske die Maske auf dem Träger mit der höchst möglichen Genauigkeit positioniert und durch Kontakt der Polydimethylsiloxan-Maske mit der Synthese-Oberfläche des Trägers adhäsiv und dichtend verbunden. Durch den Verbund aus Träger bzw. Wafer mit den Masken, die über geometrische Strukturen wie beispielsweise Kanäle mit Stempeln bzw. Inseln verfügen, werden entsprechende Hohlräume erzeugt, durch die das Entschützungsreagenz fließen und somit die Oberfläche des Wafers für den nachfolgenden Syntheseschritt aktivieren kann.
Ferner wird einer bevorzugten Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung ein Träger eingesetzt, der eine Oberflächenrauigkeit aufweist.
Derartige Träger mit einer rauen Trägeroberfläche weisen eine Reihe von Vorteilen auf, insbesondere wenn die erfindungsgemäß hergestellten Biopolymere in Array- Experimenten als Sonden eingesetzt werden.
Durch Bereitstellung einer rauen Oberfläche auf dem Träger wird die Anzahl an potentiellen Immobilisierungsstellen für die zu synthetisierenden Biopolymere erhöht. Dies führt zu einem erhöhten dynamischen Messbereich sowie einem verbesserten Signal-zu-Rausch- Verhältnis bei der Durchführung von Nachweisverfahren mittels der erfindungsgemäß hergestellten Mikroarrays. Die Verwendung von Trägern mit rauen Oberflächen ermöglicht somit eine verbesserte Analyse von geringen Probenmengen.
Ferner wird die Zugänglichkeit der synthetisierten Biopolymere auf einer rauen Oberfläche für zu analysierende Molekülen verbessert, wodurch eine schnellere und vollständigere Wechselwirkung zwischen Target und den Sonden, nämlich den synthetisierten Biopolymeren, gewährleistet wird. Des Weiteren werden kinetische Prozesse, die in der Mikroarray- Analyse ablaufen, wie z.B. die Zuführung von Reagenzien, Spülschritte und dgl. deutlich beschleunigt.
Dabei ist es bevorzugt, dass lediglich die Oberfläche innerhalb der vorbestimmten Bereiche eine Rauigkeit aufweist und somit Stege um die vorbestimmten Bereiche mit glatter Oberfläche gebildet werden. Derartige Stege um die vorbestimmten Bereiche erhöhen die Hafteigenschaften der Maske und gewährleisten somit ein dichtes Aufliegen der Maske auf der Substratoberoberfläche.
Die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Träger werden üblicherweise vor Beginn der Synthese gereinigt. Die Reinigung erfolgt vorzugsweise mittels für das jeweilige Trägermaterial üblicher Protokolle. Beispielsweise kann die Reinigung mit Caroscher Säure oder Tetramethylammoniumhydroxid-Lösung erfolgen.
Die bei den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Träger werden ferner üblicherweise vor der Durchführung der Synthese vorbehandelt. Eine derartige Vorbehandlung des Trägers kann insbesondere durch Derivatisierung des Trägers erfolgen. Die Derivatisierung der Träger kann insbesondere dadurch erfolgen, dass die Oberflächenseite des Trägers, die für die Synthese zur Verfügung steht, mit einer Polymerschicht versehen wird. Vorzugsweise wird die Polymerschicht aus Silanen, Gelatine und/oder Polyurethan gebildet. Die Schichtdicke einer derartigen auf dem Träger angebrachten Polymerschicht beträgt vorzugsweise etwa 1 nm bis etwa 5 nm, besonders bevorzugt etwa 2 nm bis etwa 4 nm und am meisten bevorzugt etwa 3 nm. Der Randwinkel einer derartigen Polymerschicht beträgt vorzugsweise durchschnittlich etwa 40° bis etwa 60° und besonders bevorzugt etwa 50°. Zur Herstellυng eines silanisierten Trägers kann der Träger, z.B. ein Glaswafer, beispielsweise mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan versehen werden.
Falls bei den erfindungsgemäßen Verfahren Träger eingesetzt werden, die mit einer Polymerschicht versehen sind, so wird diese Polymerschicht bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform vor Beginn der Biopolymersynthese modifiziert, insbesondere um eine hohe Anzahl an funktionellen Gruppen, beispielsweise Hydroxylgruppen, für die Anknüpfung von Monomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers bereitzustellen. Eine derartige Modifizierung kann beispielsweise durch Zugabe von Säure, durch Zugabe von Hydroxylgruppen¬ tragenden Linkern wie Polyalkylenglykolen, Modifizierung mit einer dreidimensionalen Polymerschicht und/oder durch Behandlung mit einer Lackschicht erfolgen.
Die Zugabe von Säure zur Modifizierung einer auf dem Träger aufgebrachten
Polymerschicht ist insbesondere vorteilhaft, wenn die Polymerschicht des Trägers Epoxidgruppen trägt, beispielsweise wenn der Träger mit einer Schicht aus Glycidoxypropyltrimethoxysilan versehen ist. Die Säure, beispielsweise eine starke Säure wie Schwefelsäure oder Salzsäure, fuhrt zur Öffnung von Epoxiden. Auf diese Weise werden Diole bereitgestellt, die mit geeigneten Funktionalitäten des anzuknüpfenden Monomerbausteins, wie z.B. Phosphorestern bzw. aktivierten Phosphorestergruppen bei der Polynukleotidsynthese, reagieren können.
Alternativ können die auf dem Träger angebrachten Polymere durch Umsetzung mit Hydroxylgruppen-tragenden Linkern modifiziert werden. Bevorzugte Linker sind insbesondere Polyalkylenglykole wie Polyethylenglykol z.B. PEG200, Polyether (ROR') wie Mischpolymere aus Bisepoxid und Polyethylenglykol, Polyurethane (RNHC(O)OR') wie Mischpolymere aus Alkoxy- und Diisocyanaten und Mischpolymere aus Aryloxy, Alkoxy und Diisocyanaten, Polythiocarbamate (RNHC(S)OR') wie Mischpolymere aus Alkoxy- und Diisothiocyanaten und Mischpolymere aus Bismercaptanen und Diisocyanaten, Polydithiourethane (RNHR(S)SR') wie Mischpolymere aus Dithiol und Diisothiocyanaten sowie epoxyfunktionalisierte Silane und Dithiole, die Substratoberflächen mit
Mercaptofunktionen (RSH) bereitstellen. So wird bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein mit Glycidoxypropyltrimethoxysilan beschichteter Träger durch Umsetzung mit Polyethylenglykol modifiziert.
In einer weiteren Ausgestaltung der Modifizierung wird ein mit einer Polymerschicht versehener Träger mit einer dreidimensionalen Polymerschicht modifiziert. Eine derartige dreidimensionale Polymerschicht kann beispielsweise durch in situ- Polymerisation eines Polyalkylenglykols wie Polyethylenglykol mit einem Quervernetzer auf dem bereits mit einer Polymerschicht, z.B. einer Silanschicht, versehenen Träger erzeugt werden. Bevorzugte Quervernetzer sind Bisepoxide wie z.B. Bisglycidyloxypropylmethan.
Eine derartige dreidimensionale Polymerschicht weist vorzugsweise eine Dicke von etwa 1 nm bis 100 μm, vorzugsweise von etwa 2 nm bis etwa 10 μm und besonders bevorzugt von etwa 3 nm bis etwa 100 nm auf. Eine derartige dreidimensionale
Polymerschicht ist ferner vorzugsweise porös. Die Anknüpfung bzw. Kupplung der Monomer- bzw. Oligomerbausteine erfolgt üblicherweise an funktionelle Gruppen, insbesondere Hydroxylgruppen, der dreidimensionalen Polymerschicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung wird die gegebenenfalls bereits modifizierte Polymerschicht auf der Trägeroberfläche mit einer Lackschicht versehen. Der Lack wird vorzugsweise ausgewählt aus Photolacken wie z.B. einem Positiv-Resist-Lack und Phenolharzen wie z.B. Novolaken. Die Lackschicht wird anschließend üblicherweise wieder im Wesentlichen vollständig entfernt. So wird beispielsweise eine wie vorstehend beschrieben mit Polyethylenglykol-Linkern modifizierte Polymerschicht mit einem photosensitiven Lack versehen, der anschließend durch Belichtung und Entwicklung wieder im Wesentlichen komplett entfernt wird. Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Eigenschaften der auf dem Träger verbliebenen Polymerschicht durch eine derartige Lackbehandlung vorteilhaft verändert sind, insbesondere wenn die auf einem derartig modifizierten Substrat synthetisierten Biopolymere als Sondenmoleküle in Array-Experimenten dienen. So hat sich gezeigt, dass die Signalintensität erhöht und die Diskriminierung zwischen Match- und Mismatchsonden verbessert wird.
Ferner ist es bevorzugt, dass die vorbestimmten Bereiche des Trägers durch für die Synthese von Biopolymeren durch inerte Bereiche voneinander abgetrennt sind. Auf diesen inerten Bereichen kann vorzugsweise keine Synthese von Biopolymeren erfolgen. Durch diese Vorstrukturierung der Träger wird die räumliche Auflösung und somit die örtliche Spezifität der Biopolymersynthese verbessert. Diese inerten Bereiche liefern bei Verwendung der erfindungsgemäß auf vorbestimmten Bereichen eines Trägers bzw. Substrats synthetisierten Biopolymere ein genaues Maß für das Hintergrundsignal.
Die Abtrennung der für die ortsspezifische Synthese der jeweiligen Biopolymer- Spezies vorgesehenen vorbestimmten Bereiche bzw. Spots auf dem Träger durch inerte Bereiche wird vorzugsweise durch folgende Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verfahren erreicht.
So können beispielsweise die Spots durch metallische Bereiche auf dem Träger voneinander abgetrennt werden, die für die Anbringung von Monomeren inert sind. Grundsätzlich können sämtliche Nebengruppenmetalle und deren Legierungen als Material für derartige inerte Bereiche Verwendung finden. Die Materialien für inerte Bereiche werden vorzugsweise ausgewählt aus Metallen wie Titan, Gold, Nickel, Chrom und Legierungen aus den vorstehenden Metallen wie Nickel-Chrom. Zur Erzeugung der metallischen Begrenzungen zwischen den vorbestimmten Bereichen kann beispielsweise eine Metallschicht durch Sputtern auf die Trägeroberfläche aufgebracht und anschließend nach einem vorgegebenen Muster strukturiert werden. Die Strukturierung kann beispielsweise durch Photolithographie und anschließendes Ätzen nach einem vorgegebenen Muster erfolgen. Die Metallschicht bzw. die metallischen inerten Bereiche auf dem Träger weisen vorzugsweise eine Dicke von etwa 50 nm bis 150 nm und besonders bevorzugt von etwa 100 nm auf.
Inerte Bereiche zur Abtrennung der für die Synthese der jeweiligen Biopolymer- Spezies vorbestimmten Bereiche auf dem Träger können ferner bei einer weiteren Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung durch Entfernen der für die Anknüpfung der Monomerbausteine vorgesehenen funktionellen Gruppen auf der Trägeroberfläche bzw. der auf dem Träger angebrachten Polymerschicht bereitgestellt werden. Eine selektive Entfernung beispielsweise der ggf. auf dem Träger angebrachten und ggf. modifizierten Polymerschicht führt zu Bereichen auf dem Träger, auf denen im Wesentlichen keine funktionellen Gruppen bzw. keine reaktiven Gruppen vorliegen und somit keine Biopolymersynthese möglich ist.
Bei dieser Ausführungsform werden auf der Trägeroberfläche befindliche funktionelle Gruppen bzw. Linker bzw. Polymerschichten vorzugsweise durch Ätzen, wie z.B. Plasma-Ätzen, entfernt. Hierzu kann beispielsweise der Träger, der wie vorstehend beschrieben mit einer Polymerschicht derivatisiert ist, mit einem Photolack und/oder Resist beschichtet werden. Durch Anordnung einer Maske, insbesondere einer Lithographiemaske, auf dem Träger und anschließende Belichtung werden, bei Verwendung eines Positiv-Resists, die belichteten Bereiche des Resists in einem nachfolgenden Entwicklungsprozess abgelöst. Auf diese Weise wird die Polymerschicht in definierten Bereichen, die die inerten Bereiche bilden sollen, z.B. durch Verwendung von Argon oder O2-Plasma abgetragen, während die vorher durch die Maske abgedeckten Bereiche der funktionellen Polymerschicht durch unentwickelten Photolack oder Resist geschützt sind. Anschließend wird die unentwickelte Lackschutzschicht von der funktionellen Polymerschicht durch weitere Belichtung und nachfolgende Entwicklung abgelöst. So kann eine über den Träger homogene Struktur mit funktionellen Polymer-Pads mit einer Schichtdicke von vorzugsweise etwa 1 nm bis etwa 10 nm, besonders bevorzugt etwa 2 nm bis 7 nm und am meisten bevorzugt 3 bis 5 nm, z.B. etwa 4 nm erzeugt werden. Die Polymer-Pads entsprechen den vorbestimmten Bereichen und weisen funktionelle Gruppen für die Anknüpfung der Monomerbausteine der Biopolymere auf.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur ortsspezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers umfasst üblicherweise eine zyklische Abfolge von Prozessschritten pro Einbau eines Monomers bzw. Oligomers, nämlich:
a) Alignment, d.h. Anordnung einer Maske auf dem Träger bzw. Substrat, b) Aktivierung bzw. Entschützung, c) Separation bzw. Ablösen der Maske von dem Träger bzw. Substrat, und d) Kupplung eines Monomer- bzw. Oligomerbausteins mit funktionellen Gruppen der Träger- bzw. Substratoberfläche bzw. mit dem bereits auf dem jeweiligen vorbestimmten Bereich synthetisierten Intermediat der Biopolymer-Kette.
Pro Synthesezyklus wird somit jeweils ein Monomer oder Oligomer auf den durch die Maske vorgegebenen vorbestimmten Bereichen des Trägers aufgebracht. In einem nächsten Schritt werden die temporären Schutzgruppen der zuletzt gekuppelten Bausteine an den durch die Maske vorgegebenen Bereichen durch Zugabe einer wässrigen Lösung eines Entschützungsreagenzes entfernt. Das wässrige Entschützungsreagenz durchströmt die Kanäle bzw. Hohlräume zwischen Maske und Träger, so dass die Schutzgruppen an den durch die Maske nicht abgedeckten Bereichen entfernt werden können.
Im Anschluss an die Entschützungsreaktion werden die Hohlräume bzw. Kanäle üblicherweise gespült und getrocknet.
Im Anschluss an die Entschützungsreaktion wird die Maske vorzugsweise von dem Träger bzw. Substrat abgelöst bzw. getrennt. Dies kann insbesondere durch eine Trennscheibe z.B. in Form eines Skalpells erfolgen, die in der Ebene zwischen dem Träger bzw. dem Substrat und der Maske in Richtung der Mitte des Trägers bzw. Substrats bewegt wird. Aufgrund der durch derartige Scheiben ausgeübten Kraft können Maske und Träger bzw. Substrat voneinander getrennt werden. Weitere Ausgestaltungen für den Vorgang des Ablösens der Maske von dem Träger sind dem Fachmann ohne weiteres ersichtlich.
In einem nächsten Schritt des erfmdungsgemäßen Verfahrens wird der Träger bzw. das Substrat mit einer Lösung eines Monomer- oder Oligomerbausteins kontaktiert. Dadurch kommt es auf den vorbestimmten Bereichen, auf denen die Schutzgruppen durch die vorangegangene Entschützung entfernt worden sind, zur Kupplung von Monomerbausteinen bzw. Monomeren an die durch die Entschützungsreaktion freigesetzten funktionellen Gruppen der Trägeroberfläche bzw. des Intermediats der Biopolymerkette. Dazu wird der Träger beispielsweise in eine Synthesekammer bzw. Reaktionskammer bzw. Kartusche mit Öffnungen, durch die die Kartusche mit den zu verwendenden Synthesereagenzien befüllt werden kann, überführt. Eine derartige, ggf. druckdichte, Reaktionskammer wird vorzugsweise mit einem herkömmlichen Syntheseautomaten verbunden, so dass ein für die jeweilige Biopolymersynthese übliches Syntheseprotokoll für die Kupplung eines Monomers durchlaufen werden kann. Zur Synthese von DNA mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise der Syntheseautomat ÄKTA von Amersham Bioscience (Freiburg, Deutschland) eingesetzt werden.
Nach erfolgter Anknüpfung eines Monomers oder Oligomers an funktionelle Gruppen auf dem Träger bzw. an dem Intermediat der Biopolymerkette können die vorstehend beschriebenen Schritte Anordnen der Maske, Entschützung, ggf. Ablösen der Maske und Synthese weiterer Monomerbausteine an die bestehende Biopolymerkette wiederholt werden, bis auf den vorbestimmten Bereichen des Trägers jeweils das vollständige Biopolymer mit der gewünschten Sequenz synthetisiert ist.
Nach Abschluss der Synthese werden üblicherweise die an den Monomerbausteinen angebrachten permanenten Schutzgruppen abgespalten. Dabei werden vorzugsweise die im Stand der Technik für die jeweiligen Schutzgruppen beschriebenen Standardbedingungen eingesetzt (siehe u.a. T. W. Greene, P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis" John Wiley & Sons INC, New York; H.-D. Jakubke, siehe oben). So können beispielsweise bei der Synthese von DNA mit den erfindungsgemäßen Verfahren die an den Nucleobasen angebrachten permanenten Schutzgruppen mit einer wässrigen Ammoniak-Lösung entfernt werden.
Nach Beendigung des Syntheseprotokolls wird der Träger mit den darauf synthetisierten Biopolymeren aus der Kartusche ausgebaut, gespült und anschließend getrocknet. Bei der ggf. automatisierten Standard-DNA-Synthese werden üblicherweise die Schritte (i) Abspaltung der temporären Schutzgruppen, (ii) Kupplung des Monomer- oder Oligomerbausteins in Anwesenheit eines Aktivators, (iii) Cappings von nicht abreagierten Hydroxyltunktionalitäten des Substrates bzw. der Biopolymerketten- Intermediats sowie (iv) Oxidation des Phosphits zu Phosphotriester durchlaufen. Die Durchführung dieser Schritte wird im Folgenden beispielhaft beschrieben.
Die Synthese erfolgt üblicherweise entgegengesetzt zur Biosynthese vom 3'-Ende zum 5 '-Ende. Dabei werden beispielsweise Oxalsäure oder Methansulfonsäure als Reagenz für die Abspaltung der herkömmlicherweise verwendeten Dimethyltrityl- (DMT) Schutzgruppe eingesetzt.
Die Kupplung des Monomer- bzw. Oligomerbausteins, das z.B. als Phosphoramidit (N,N-Diisopropylaminophosphit) vorliegt, an das Substrat erfolgt nach Aktivierung mit einer schwachen Säure wie z.B. Tetrazol. Hierbei ist zu beachten, dass durch Zugabe der Säure nicht die temporäre Schutzgruppe DMT abgespalten wird.
Nach Spülen des Substrates erfolgt ein Cappingschritt, bei denen mit Hilfe von Reagenzien wie Pyridin, N-Methylimidazol und Acetanhydrid die nicht abreagierten Hydroxylgruppen in entsprechende Essigester-Derivate überführen. Abschließend wird wiederum mit Lösungsmitteln gespült.
Im vierten Schritt wird die resultierende Phosphit-Verbindung z.B. mittels einer wässrigen Iod-Lösung unter Zusatz von Pyridin in den stabileren Phosphortriester überführt bzw. oxidiert.
Nach dem Spülen beginnt ein neuer Synthesezyklus mit der Abspaltung der Schutzgruppen, z.B. der DMT-Schutzgruppen. Nach vollständigem Aufbau der gewünschten Nukleinsäure werden üblicherweise die permanenten Schutzgruppen entfernt. Die Ausbeute je Syntheseschritt liegt vorzugsweise bei über 98%.
Ferner wird im Folgenden beispielhaft die Durchführung einer ggf. automatisierten Peptidsynthese im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschrieben.
Analog zum Synthesezyklus von DNA besteht der erste Schritt bei der Peptidsynthese üblicherweise in der Abspaltung der temporären Schutzgruppe. In der Standard-Festphasensynthese (SPPS, solid phase peptide synthesis) wird vorzugsweise die basenlabile Fmoc-Schutzgruppe verwendet, da diese aufgrund ihres Absorptionsspektrum mittels UV-Sensoren ausgelesen werden kann und weniger aggressive Entschützungsreagenzien verwendet werden müssen. Alternativ ist auch der Einsatz einer säurelabilen Boc-Schutzgruppe denkbar.
Nach Spülen des Trägers mit Lösungsmittel werden der entsprechende Aminosäurebaustein bzw. das Aminosäurederivat sowie ein Kupplungsreagenz wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), O-Benzotriazol-N,N,N,N- tetramethyluroniumhexanfluorophosphat (HBTU), Hydroxybenzotrizol (HOBt) sowie eine Base wie z.B. l,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en (DBU) jeweils im
Überschuss mit dem Träger zur Reaktion gebracht. Nach vollständiger Reaktion wird die Reaktionskammer in der Regel gespült.
Abschließend wird analog zur der Synthese von Nukleinsäuren in einem Cappingschritt die nicht abreagierten Aminofunktionalitäten durch Zugabe von Acetanhydrid und Base blockiert.
Nach Spülen des Substrates mit Lösungsmittel erfolgt ein neuer Reaktionszyklus. Durch Wahl von geeigneten, dem Fachmann bekannten Reaktionsbedingungen können bei der Synthese von Peptiden häufig alle permanenten Schutzgruppen gleichzeitig entfernt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird insbesondere verwendet, um wie vorstehend beschriebene Mikroarrays herzustellen, bei denen die erfindungsgemäß auf vorbestimmten Bereichen in situ synthetisierten Biopolymere als molekulare Sonden dienen.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Mikroarray mit auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Biopolymer-Sonden bereitgestellt, bei dem der prozentuale Anteil P an Biopolymeren, die die gewünschte Zahl M an Monomeren aufweisen, durch die Formel P = SM gekennzeichnet ist, wobei S die durchschnittliche Ausbeute eines Kupplungsschritts, d.h. die Ausbeute bei der Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins ist, und wobei die Dichte an vorbestimmten Bereichen beispielsweise mindestens 1.500 Spots pro cm2 beträgt und die durchschnittliche Schrittausbeute S mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 96%, besonders bevorzugt mindestens 98% und am meisten bevorzugt mindestens 99% beträgt.
Die erfindungsgemäßen Mikroarrays weisen vorzugsweise eine Dichte an vorbestimmten Bereichen von mindestens 2.500 Spots pro cm2, besonders bevorzugt von mindestens 10.000 Spots pro cm2 und am meisten bevorzugt von mindestens 25.000 bis zu einer Million Spots pro cm2 auf.
Die Trägerfläche, die sich aus den Kantenlängen des Trägers berechnet und auf die die Dichte an Spots bezogen ist, beträgt bei bevorzugten Ausführungsformen höchstens 1 cm2, höchstens 25 mm2, höchstens 17,64 mm2, höchstens 4 mm2, höchstens 1 mm oder höchstens 100 μm .
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von wässrigen Lösungen von Entschützungsreagenzien in der Synthese von Biopolymeren.
Bei der Durchführung von Entschützungsreaktionen spielt die Protonierung der Schutzgruppen bei säurelabilen Schutzgruppen bzw. die Deprotonierung bei basenlabilen Schutzgruppen eine wesentliche Rolle. Bei der Verwendung von Säuren bzw. Basen in Lösungsmitteln ist zu beachten, dass der jeweilige pKs bzw. pKß-Wert von Lösungsmittel zu Lösungsmittel deutlich variieren kann. Insbesondere unterscheiden sich die pKs bzw. pKß-Werte in organischen Lösungsmitteln wesentlich von jenen in wässrigen Systemen. Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass derartige
Entschützungsreaktionen bei der Synthese von Biopolymeren auch mit Entschützungsreagenzien in wässriger Lösung durchgeführt werden können.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung und sollen nicht in einschränkender Weise ausgelegt werden.
Beispiele
Beispiel 1: Entschützung mit einer 10%igen wässrigen Lösung von Oxalsäure
a) Wafersubstrat
Es findet ein Glaswafer (BF 33 Glas, Schott) mit 0,7 mm Dicke Verwendung.
b) Reinigung und Strukturierung
Die Reinigung des Wafers erfolgt mit einer JTB-100 Lösung (Tetramethylammonium-hydroxid-Lösung) nach folgendem Protokoll:
Der Wafer wird für 30 min in einem Ultraschallbad in 10% Deconex vorgereinigt, anschließend mehrfach mit entionisierem Wasser (DI- Wasser) gespült und dann für 30 min bei 70°C in JTB 100-Lösung inkubiert. Der Wafer wird 6 x mit VE-Wasser und 1 x mit DI- Wasser gespült und anschließend auf einer Waferzentrifuge bei 3000 min"1 für 1 min getrocknet.
Auf den gereinigten Wafer wird durch Sputtern eine Titanschicht von ca. 100 nm Dicke aufgebracht. Die Titanschicht wird mittels Positivlack AZ 1514 H und Belichtung durch eine entsprechende Maske strukturiert. Nach der Strukturierung mittels Titanätzbad (0,8% HF, 1,3% Salpetersäure) ist die aktive Fläche jedes Arrays (ca. 2 mm) von einer unterbrochenen Kette von quadratischen Titan-Strukturen mit 32 μm Kantenlänge umgeben. Von der übrigen Waferfläche wird das Titan vollständig entfernt. Der Photoresist wird mittels ALEG 625 und PRS 3000 (Mallinckrodt Baker, Griesheim, Deutschland) entfernt. Der Wafer wird kurz mit Di-Wasser benetzt und dann im vortemperierten Wasserbad (550C) mit Natronlauge bei 5O0C für 30 s angeätzt.
Anschließend wird in folgender Reihenfolge gespült: 6x VE-Wasser (je 1 min, Wafer in Halterung bewegen); 2 x 5 min DI- Wasser.
Zum Abschluss wird der Wafer trocken geschleudert und im Umluft-Trockenschrank ausgeheizt.
c) Silanisierung
Die Wafer werden in der PFA-Halterung auf dem PTFE-Ring in einem Rettberggefäß senkrecht angeordnet und das Gefäß mit Argon gespült. Nacheinander werden dann 1,8 1 Toluol (wasserfrei) und 79 ml Glycidoxypropyltrimethoxysilan unter inerten Bedingungen zugegeben. Das
Reaktionsgemisch wird im Ölbad auf 800C erwärmt. Dabei wird der Ansatz durch Einleiten von Argon über zwei Titanfritten durchmischt. Nach Erreichen der Zieltemperatur wird diese für 3 h gehalten.
Nach Entfernen des Ölbads lässt man den Ansatz in etwa 40 min bis auf unter 600C abkühlen, wobei weiter mit Argon durchmischt wird.
Nach Öffnen des Gefäßes wird der Wafer mit Ix Toluol, 3 x Methanol, 4 x Aceton und 1 x mit DI- Wasser gespült. Anschließend wird der Wafer auf einer Waferzentrifuge getrocknet.
d) Modifizierung der Silanschichten In einer Glasflasche werden 150 ml ACN vorgelegt und unter kräftigem Rühren 7,8 ml PEG200 und 5,1 ml Bisglycidyloxypropylmethan darin gelöst. Dann werden 1,044 ml konz. Schwefelsäure unter Rühren zugegeben und dieses Gemisch sofort weiterverwendet. Der epoxidierte Wafer wird in dieser Lösung für 35 min im Wasserbad bei 60°C inkubiert (ebenfalls unter Rühren). Danach wird er aus der Lösung genommen, 3 x mit Dimethylformamid, 2 x mit Aceton und Ix mit Ethanol gespült und in einer Zentrifuge getrocknet.
e) DNA-Synthese auf der Waferoberfläche
Die DNA-Synthese wird an einem Syntheseautomaten Oligopilot OPII (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Es findet eine aus Edelstahl gefertigte, kreisrunde Reaktionskartusche Verwendung, in die der Wafer eingeschraubt wird, so dass die Syntheseseite in den Reaktionsraum zeigt, während die entgegengesetzte Seite des Wafers außerhalb der Reaktionskartusche liegt.
Auf dem Chipwafer sind insgesamt 397 Array-Flächen in 21 Zeilen und 21 Reihen angeordnet. Die Synthese startet mit einer Reihe von Kupplungsschritten, bei denen die gleiche Base über den gesamten Wafer gekuppelt wird. Als Bausteine werden DMT-geschützte Phosphoamidite verwendet. Es werden nacheinander folgende Basen gekoppelt: C, C, C, T, A, T, T, C, G.
Nach Kupplung des letzen G werden DMT-Schutzgruppen ortsspezifisch entfernt. Zu diesem Zweck wird eine Maske verwendet. Die Maske verfügt über 21 identische Kanalbündel zu je vier parallelen Kanälen mit einer Breite von 128 μm und einem Abstand (Kanalmitte zu Kanalmitte) von 512 μm. Die Maske wird zunächst waagerecht ohne Verschiebung ausgerichtet. Anschließend erfolgt das ortsspezifische Entfernen der DMT-Schutzgruppen, indem 10%ige wässrige Lösung von Oxalsäure mittels Vakuum durch die Kanäle gezogen wird. Die Entschützungszeit wird in den einzelnen Kanalbündeln folgendermaßen variiert:
Variante 1 : 2 min Variante 2: 5 min Variante 3: 10 min Variante 4: 20 min Variante 5: 30 min
Anschließend werden die Kanäle mit Wasser gespült, die Maske abgehoben und der Chipwafer in die Synthesekartusche eingebaut. Die Kartusche wird am Syntheseautomaten prozessiert. Es folgt die Kupplung eines G ohne Entschützung in der Kartusche, so dass die Kupplung des G nur an den zuvor mit Oxalsäure entschützten Bereichen erfolgt.
Der Chipwafer wird wiederum aus der Kartusche ausgebaut. Es erfolgt eine erneute ortsspezifische Entschützung und die Kupplung eines weiteren G analog zum vorangegangenen Schritt, mit dem Unterschied, dass die Maske um 90° im
Uhrzeigersinn gedreht ausgerichtet wird. Auch bei dieser Entschützung werden die Oxalsäure-Inkubationszeiten wie oben variiert.
Im Anschluss an diese Kupplung verbleibt der Chipwafer in der Kartusche. Es folgen weitere Kupplungsschritte über die gesamte Waferfläche in der folgenden
Reihenfolge: A C C C T T T G. Nach dem letzten Kupplungsschritt wird der Wafer aus der Kartusche ausgebaut. Zum Entfernen der permanenten Schutzgruppen von den Basen wird der Wafer in einem PFA-Schraubgefäß im Wasserbad für 35 min in 30-33% Ammoniak bei 55°C inkubiert, danach aus der Lösung genommen und wie folgt gespült:
1 x mit Ammoniak (28-30%)
1 x mit DI- Wasser
1 x mit VE- Wasser (fließend)
1 x mit DI- Wasser
1 x mit Ethanol
Anschließend wird in einer Waferzentrifuge für 60 s bei 3000 min"1 trocken geschleudert.
Dann wird der Wafer auf einer Wafersäge in 397 Einzelchips von 3,4 x 3,4 mm
Kantenlänge zerteilt.
Unter der Annahme, dass die Entschützungs- und Kupplungsschritte vollständig verlaufen, entstehen bei der beschriebenen Verfahrensweise aus drei unterschiedlichen Sequenzen aufgebaute Arrays. Diese Sequenzen werden auf dem
Array in jeweils definierten Regionen redundant nach dem in Abbildung 1 gezeigten Muster erzeugt.
Bei den Sequenzen handelt es sich um:
Matchsequenz (18mer): 3 'CCCTATTCGGACCCTTTG 5' (helle Bereiche in Abbildung 1)
G-Deletion (17mer): 3'CCCTATTCGACCCTTTG5' (dunkle Bereiche in Abbildung 1) G-Insertion (19mer): 3' CCCTATTCGGGACCCTTTG 5! (graue Bereiche in Abbildung 1)
f) Hybridisierung
Das Hybridisierungstarget ist ein durch asymmetrische PCR-Amplifkation entstandenes DNA-Fragment aus dem 16s rRNA-Gen von Corynebacterium glutamicum. Dieses wird nach folgendem Protokoll hergestellt:
Es wird ein PCR- Ansatz mit folgender Zusammensetzung hergestellt:
1 x PCR-Reaktionspuffer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
200 nM forward-Primer 16sfDl Cy3, am 5 '-Ende mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy 3 (Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) 66 nM reverse Primer 16s Ra (Sequenz: 5'
TACCGTCACCATAAGGCTTCGTCCCTA 3')
133 nM Kompetitor 16s Ra 3' NH2
(Sequenz: 5'TACCGTCACCATAAGGCTTCGTCCCTA-NH2 3')
Die Aminomodifaktion am 3' Ende wird während der chemischen Synthese des
Oligonukleotides in das Molekül integriert (3'-Amino-Modifϊer C7, Glen Research
Corp., Sterling, VA, USA).
Sequenz: 5 ' AGAGTTTGATCCTGGCTC AG3 ')
200 μM dNTPs 0,05 unit/μl Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
2 ng/μl chromosomale DNA Corynebacterium glutamicum Das Gesamtvolumen jeder Reaktion beträgt 25 μl.
Die Reaktionen werden nach folgendem Temperaturregime durchgeführt:
Initiale Denaturierung für 2 min bei 950C danach 25 Zyklen: 30 sec 95°C 30 sec 600C 30 sec 72°C
Terminale Elongation für 7 min bei 72°C
Das PCR-Fragment wird in einer Endkonzentration von etwa 5 nM in einem Hybridisierungspuffer (6 x SSPE/0,2% SDS) aufgenommen. Die Lösung wird in Aliquots mit einem Volumen von je 65 μl auf Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) aufgeteilt. In jedes dieser Reaktionsgefäße wird ein Array gegeben. Insgesamt werden vier Arrays jeder Entschützungsvariante in parallelen Ansätzen mit dem Target hybridisiert.
Die Hybridisierungsansätze mit dem Array werden zunächst für 5 min bei 95 °C inkubiert und danach sofort für 1 h bei 500C inkubiert.
Im Anschluss werden die Chips jeweils 1 x für 5 min in 500 μl 2 x SSC/0,2%SDS, 2xSSC öeweils bei 3O0C) und 0,2x SSC (bei 2O0C) in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 500 rpm gewaschen. Nach dem Entfernen der letzten Spüllösung werden die Arrays im Vakuum getrocknet.
g) Detektion und Analyse der Hybridisierungssignale: Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgt unter einem Zeiss- Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Anregung erfolgt im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale werden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit beträgt 5000 ms.
In Abbildung 2 sind die Aufnahmen für Entschützungszeiten von 2 min, 10 min und 30 min gezeigt.
Die Bildanalyse erfolgt mit der Bildauswertungssoftware Iconoclust (Clondiag, Jena, Deutschland). Zur Bestimmung der Lage und Orientierung der Arrays finden die zuvor aufgebrachten quadratischen 32 μm-Markenstrukturen aus Titan Verwendung.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 in Form eines Balkendiagramms dargestellt. Es zeigt sich, dass das Hybridisierungssignal in den Bereichen, in denen bei vollständiger Kupplung die Matchsequenz erzeugt wird, mit der Verlängerung der Entschützungszeit von 2 auf 20 min steigt. Eine 30 minütige Entschützung bringt gegenüber einer 20 minütigen Entschützung keine weitere Verbesserung. In den Bereichen, in denen bei vollständiger Kupplung die G-Insertion erzeugt wird, wird zunächst ein Anstieg des Hybridisierungssignals bei Verlängerung der Entschützungszeit von 2 auf 5 min beobachtet. Danach fällt das Signal kontinuierlich ab. Eine optimale Diskriminierung zwischen Match und beiden Mutationen wird bei einer Entschützungszeit von mindestens 20 min erreicht. Beispiel 2: Einfluß der Belegungsdichte auf das Hybridisierunassignal
Das in diesem Beispiel eingesetzte Wafersubstrat sowie die Protokolle zur Reinigung, Strukturierung, Silanisierung und Herstellung der Syntheseschicht entsprechen denen von Beispiel 1.
a) DNA-Synthese auf der Waferoberfläche:
Die DNA-Synthese wird an einem Syntheseautomaten Oligopilot OPII durchgeführt. Als Bausteine werden DMT-geschützte Phosphoamidase verwendet. Es findet eine kreisrunde, aus Edelstahl gefertigte Reaktionskartusche Verwendung, in die der Wafer eingeschraubt wird, so dass die Syntheseseite in den Reaktionsraum zeigt, während die entgegengesetzte Seite des Wafers außerhalb der Reaktionskartusche liegt. Diese Kartusche wird fluidisch mit dem Syntheseautomaten verbunden.
Die Synthese startet mit einem Kupplungsschritt, bei dem die gleiche Base (T) über den gesamten Wafer gekoppelt wird.
Anschließend werden die reaktiven Gruppen auf der Oberfläche ortsspezifisch in unterschiedlichem Maße geblockt. Zu diesem Zweck wird die Oberfläche zunächst unter Verwendung einer Maske ortsspezifisch entschützt, d.h. es werden die DMT- Schutzgruppen entfernt. Anschliessend wird ein definiertes Gemisch aus Fluorprime- Amidit und einem Basen- Amidit gekoppelt. Das Fluorprime-Amidit blockiert die weitere Synthese, da es keine funktionellen Gruppen aufweist, an die weitere Basen gekoppelt werden können.
Die für die Entschützung verwendeten fluidische Maske verfügt über 21 identische Kanalbündel zu je vier parallelen Kanälen mit einer Breite von 128 μm und einem Abstand (Kanalmitte zu Kanalmitte) von 512 μm. Die Maske wird zunächst waagerecht ohne Verschiebung ausgerichtet. Anschließend erfolgt das ortsspezifische Entfernen der DMT-Schutzgruppen, indem eine Lösung von 10% Oxalsäure in Wasser mittels Vakuum durch die Kanäle gezogen wird. Die Entschützungszeit beträgt 20 min.
Anschließend werden die Kanäle mit Wasser gespült, die Maske abgehoben und der Chipwafer in die Synthesekartusche montiert und die Kartusche mit dem Syntheseautomaten verbunden. Es erfolgt die Kupplung eines Gemisches aus 50% T- Amidit und 50% Fluorprinie-Amidit. Die Gesamt-Amiditkonzentration beträt 0,1 M.
Nach dem gleichen Prinzip werden sieben weitere Syntheseschritte (Schritte 2-8) mit geänderten Parametern durchgeführt. Die verwendete Maske, die Gesamt- Amiditkonzentration, die Entschützungszeit und das Kupplungsprotokoll sind identisch. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die in den Kupplungsschritten variierten Parameter:
Tabelle 1
Schritt Drehung Verschiebung % T-Amidit %
Fluorprime
1 0° 0 μm 50 50
2 0° 128 μm 10 90
3 0° 256 μm 100 0
4 0° 384 μm 0 100
5 90° 0 μm 50 50
6 90° 128 μm 10 90
7 90° 256 μm 100 0
8 90° 384 μm 0 100 Durch die beschriebenen Kupplungsschritte wird die Zahl der für die weitere Synthese zur Verfügung stehenden aktiven Gruppen auf der Oberfläche in den verschiedenen Array-Elementen in unterschiedlichem Maße reduziert. Unter der Annahme, dass die Kupplungen quantitativ ablaufen, werden Array-Elemente mit 100%, 50%, 25%, 10%, 5% und 0% der ursprünglichen Dichte an funktionellen Gruppen, die für die weitere Synthese zur Verfügung stehen, erzeugt.
Im weiteren Verlauf der Synthese wird der Wafer in die Reaktionskartusche montiert und diese mit dem Syntheseautomaten (Äkta, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) verbunden. Es werden folgende Basen über die gesamte in die Reaktionskartusche weisende Fläche des Wafers gekoppelt: T,C, C, C, T, A, T, T, C, G5G.
Nach Kupplung des letzten G werden DMT-Schutzgruppen ortsspezifisch entfernt. Zu diesem Zweck wird wie oben beschrieben eine fluidische Maske verwendet, die eine Hälfte jedes Array-Elementes abdeckt und die andere Hälfte dem Entschützungsreagenz aussetzt. Die Entschützung erfolgt mit 10%iger Oxalsäure in Wasser für 20 min.
Anschließend werden die Kanäle mit Wasser gespült, die Maske abgehoben und der Chipwafer in die Synthesekartusche montiert und die Kartusche mit dem Syntheseautomaten verbunden. Es erfolgt die Kupplung eines A in den entschützten Bereichen. Dadurch entsteht in diesen Bereichen im weiteren Verlauf der Synthese eine zum später verwendeten Hybridisierungstarget perfekt komplementäre Sequenz, während in den übrigen Bereichen eine Sequenz mit einer 1-Basen-Deletion erzeugt wird. Die weitere Synthese erfolgt in der Reaktionskartusche wie oben beschrieben über den gesamten in die Reaktionskartusche weisenden Bereich des Wafers. Es werden nacheinander folgende Basen gekoppelt: C, C, C, T, T, T, G.
Nach dem letzten Kupplungsschritt wird der Wafer aus der Kartusche ausgebaut. Zum Entfernen der permanenten Schutzgruppen wird der Wafer in einem PFA- Schraubgefäß im Wasserbad für 35 min in 30-33% Ammoniak bei 55°C inkubiert, danach aus der Lösung genommen und wie folgt gespült:
Ix mit Ammoniak (28-30%)
Ix mit DI- Wasser
Ix mit VE- Wasser (fließend)
Ix mit DI- Wasser
Ix mit-Ethanol
Abschließend wird der Wafer in einer Waferzentrifuge für 60 s bei 3000 min"1 trocken geschleudert und auf einer Wafersäge in 397 Einzelchips von 3,4 x 3,4 mm
Kantenlänge zerteilt.
b) Hybridisierung
Das Hybridisierungstarget ist ein mit dem Farbstoff Cy3 markiertes Oligonukleotid von 18 Basen Länge mit der folgenden Sequenz: 5' Cy3- GGGATAAGCCTGGGAAAC-3'.
Das Oligonukleotid wird in einer Endkonzentration von 10 nM im Hybridisierungspuffer (6 x SSPE/0,2% SDS) aufgenommen. Die Lösung wird in Aliquote mit einem Volumen von je 65 μl auf Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) aufgeteilt. In jedes dieser Reaktionsgefäße wird ein Array gegeben. Insgesamt werden zehn Arrays in parallelen Ansätzen mit dem Target hybridisiert.
Die Hybridisierungsansätze mit dem Array wurden zunächst für 5 min bei 95°C inkubiert und danach sofort für 1 h bei 50°C inkubiert.
Im Anschluss werden die Chips jeweils 1 x für 5 min in 500 μl 2xSSC/0,2%SDS, 2xSSC (jeweils bei 3O0C) und 0,2x SSC (bei 20°C) in einem Thermoschüttler (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 500 rpm gewaschen. Nach dem Entfernen der letzten Spüllösung werden die Arrays im Vakuum getrocknet.
c) Detektion und Analyse der Hybridisierungssignale
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgt unter einem Zeiss- Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Jena, Deutschland). Die Anregung erfolgt im Auflicht mit einer Weißlichtquelle und einem für Cyanine 3 geeigneten Filtersatz. Die Signale werden mit einer CCD-Kamera (PCO-Sensicam, Kehlheim, Deutschland) aufgezeichnet. Die Belichtungszeit beträgt 5000 ms. Die Bildanalyse erfolgt mit der Bildauswertungssoftware Iconoclust (Clondiag, Jena, Deutschland). Zur Bestimmung der Lage und Orientierung der Arrays finden die zuvor aufgebrachten quadratischen 32 μm-Markenstrukturen aus Titan Verwendung.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 4 in Form eines Balkendiagramms dargestellt. In den Bereichen mit einer theoretischen Belegungsdichte von 100, 50 und 25% der maximalen Belegung wird das gleiche Hybridisierungssignal gemessen. Offensichtlich wird die Hybridisierung in diesem Dichtebereich nicht durch die Menge der Sonden auf der Oberfläche limitiert. Unterhalb 25% Belegungsdichte nimmt das Hybridisierungssignal kontinuierlich ab.
Beispiel 3: Einfluss der Kettenlänge auf das Hybridisierungssignal
Das in diesem Beispiel eingesetzte Wafersubstrat sowie die Protokolle zur Reinigung, Strukturierung, Silanisierung und Herstellung der Syntheseschicht entsprechen denen von Beispiel 1.
a) DNA- Synthese auf der Waferoberfläche:
Die DNA-Synthese wird an einem Syntheseautomaten Oligopilot OPII durchgeführt. Als Bausteine werden DMT-geschützte Phosphoamidase verwendet. Es findet eine kreisrunde, aus Edelstahl gefertigte Reaktionskartusche Verwendung, in die der Wafer eingeschraubt wird, so dass die Syntheseseite in den Reaktionsraum zeigt, während die entgegengesetzte Seite des Wafers außerhalb der Reaktionskartusche liegt. Diese Kartusche wird fluidisch mit dem Syntheseautomaten verbunden. Die Synthese startet mit einem Kupplungsschritt, bei dem die gleiche Base (T) über den gesamten Wafer gekoppelt wird.
Die folgenden Kupplungsschritte erfolgen ortsspezifisch. Zu diesem Zweck wird die Oberfläche zunächst unter Verwendung einer Maske ortsspezifisch entschützt, d.h. es werden die DMT-Schutzgruppen entfernt. Die für die Entschützung verwendete fluidische Maske umfasst 21 identische Kanäle mit einer Breite von 1024 μm, Der Abstand der Kanäle zueinander (Kanalmitte zu Kanalmitte) entspricht dem Rastermaß des Wafers (Chipmitte zu Chipmitte).
Die Maske wird zunächst waagerecht ohne Verschiebung ausgerichtet. Anschließend erfolgt das ortsspezifische Entfernen der DMT-Schutzgruppen, indem eine Lösung von 10% Oxalsäure in Wasser mittels Vakuum durch die Kanäle gezogen wird. Die Entschützungszeit beträgt 20 min.
Anschließend werden die Kanäle mit Wasser gespült, die Maske abgehoben und der Chipwafer in die Synthesekartusche montiert und die Kartusche mit dem Syntheseautomaten verbunden. Es erfolgt die Kupplung eines T-Amidits. Die Amiditkonzentration beträt 0,1 M.
Nach dem gleichen Prinzip werden sieben weitere Syntheseschritte (Schritte 2-16) mit geänderten Parametern durchgeführt. Die verwendete Maske, die Gesamt- Amiditkonzentration, die Entschützungszeit und das Kupplungsprotokoll sind identisch. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über die in den Kupplungsschritten variierten Parameter: Tabelle 2
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Durch die beschriebenen Kupplungsschritte werden Arrays erzeugt, bei denen die verschiedenen Array-Elemente einer unterschiedlichen Anzahl an Kupplungsschritten unterzogen wurden, wodurch T-Oligomere mit unterschiedlichen Kettenlängen erzeugt wurden.
Im weiteren Verlauf der Synthese wird der Wafer in die Reaktionskartusche montiert und diese mit dem Syntheseautomaten (Äkta, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Deutschland) verbunden. Es werden folgende Basen über die gesamte in die Reaktionskartusche weisende Fläche des Wafers gekuppelt: T, C, C, C, T, A, T, T, C5 G5G.
Nach Kupplung des letzten G werden DMT-Schutzgruppen ortsspezifisch entfernt. Zu diesem Zweck wird wie oben beschrieben eine fluidische Maske verwendet, die 21 identische Kanalbündel zu je acht parallelen Kanälen mit einer Breite von 128 μm und einem Abstand (Kanalmitte zu Kanalmitte) von 256 μm umfasst. Die Maske wird senkrecht (Drehung um 90°) mit einer Verschiebung von 64 μm ausgerichtet. Dadurch wird je eine Hälfte jedes mit T-Oligomeren einer bestimmten Kettenlänge belegten Array-Elementes abgedeckt und die andere Hälfte dem
Entschützungsreagenz ausgesetzt. Die Entschützung erfolgt mit 10%iger Oxalsäure in Wasser für 20 min.
Anschließend werden die Kanäle mit Wasser gespült, die Maske abgehoben, der Chipwafer in die Synthesekartusche montiert und die Kartusche mit dem
Syntheseautomaten verbunden. Es erfolgt die Kupplung eines A in den entschützten Bereichen. Dadurch entsteht in diesen Bereichen im weiteren Verlauf der Synthese eine zum später verwendeten Hybridisierungstarget perfekt komplementäre Sequenz, während in den übrigen Bereichen eine Sequenz mit einer 1-Basen-Deletion erzeugt wird.
Die weitere Synthese erfolgt in der Reaktionskartusche wie oben beschrieben über den gesamten in die Reaktionskartusche weisenden Bereich des Wafers. Es werden nacheinander folgende Basen gekoppelt: C, C, C, T, T, T, G.
Nach dem letzten Kupplungsschritt wird der Wafer aus der Kartusche ausgebaut. Zum Entfernen der permanenten Schutzgruppen wird der Wafer in einem PFA- Schxaubgefäß im Wasserbad für 35 min in 30-33% Ammoniak bei 55°C inkubiert, danach aus der Lösung genommen und wie folgt gespült:
1 x mit Ammoniak (28-30%) I x mit DI- Wasser
1 x mit VE-Wasser (fließend) 1 x mit DI- Wasser 1 x mit Ethanol
Abschließend wird der Wafer in einer Waferzentrifuge für 60 s bei 3000 min"1 trocken geschleudert und auf einer Wafersäge in 397 Einzelchips von 3,4 x 3,4 mm Kantenlänge zerteilt.
b) Hybridisierung
Als Hybridisierungstarget wird entweder ein mit dem Farbstoff Cy3 markiertes Oligonukleotid von 18 Basen Länge mit der folgenden Sequenz: 5' Cy3- GGGAT AAGCCTGGGAA AC-3 'oder das im Ausführungsbeispiel 1 beschriebene PCR-Fragment verwendet.
Das Oligonukleotid wird in einer Endkonzentration von 10 nM und das PCR-Produkt in einer Endkonzentration von ca. 5 nM im Hybridisierungspuffer (6x SSPE/0,2% SDS) aufgenommen. Die Lösung wird in Aliquote mit einem Volumen von je 65 μl auf Eppendorf-Reaktionsgefäße (1,5 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) aufgeteilt. In jedes dieser Reaktionsgefäße wird ein Array gegeben. Insgesamt werden zehn Arrays in parallelen Ansätzen mit dem Target hybridisiert. Die Hybridisierungsansätze mit dem Array wurden zunächst für 5 min bei 95°C inkubiert und danach sofort für 1 h bei 50°C inkubiert.
Im Anschluss werden die Chips jeweils 1 x für 5 min in 500 μl 2xSSC/0,2%SDS, 2xSSC Qeweils bei 30°C) und 0,2x SSC (bei 20°C) in einem Thermoschüttler
(Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bei 500 rpm gewaschen. Nach dem Entfernen der letzten Spüllösung werden die Arrays im Vakuum getrocknet.
c) Detektion und Analyse der Hybridisierungssignale
Die Detektion der Hybridisierungssignale erfolgt in einem konfokalen Slidereader (Scanarray 4000, Packard Biochip Technologies, Billerica, MA, USA) ausgelesen. Die Arrays werden in einen Adapter eingelegt, der außen die Abmaße eines Slides aufwies. Die Anregung erfolgt durch den für die Detektion des Farbstoffes Cy3 im Gerät vorgesehenen Laser. Die Einstellungen von Laserleistung und Photomultiplier werden so gewählt, dass die Signale nicht das Sättigungsniveau erreichen.
Die Bildanalyse erfolgt mit der Bildauswertungssoftware Iconoclust (Clondiag, Jena, Deutschland). Zur Bestimmung der Lage und Orientierung der Arrays finden die zuvor aufgebrachten quadratischen 32 μm-Markenstrukturen aus Titan Verwendung.
Die Ergebnisse sind in den Abbildungen 16 bis 19 dargestellt. Abbildung 16 und 17 zeigen die Aufnahme eines Arrays nach Hybridisierung mit dem beschriebenen Oligonukleotid (Abb. 16) bzw. PCR-Fragment (Abb. 17). Die zusammengefassten Ergebnisse von Hybridisierungsexperimenten mit dem Oligonukleotid bzw. PCR- Fragment als Target sind in den Balkendiagrammen in Abbildungen 18 (Oligonukleotid) bzw. 19 (PCR-Fragment) zusammengefasst. Die Ergebnisse der Oligohybridisierung zeigen, dass das beobachtete Hybridisierungssignal durch die Anzahl der T-Kopplungen, die vor der Synthese der zum Target komplementären Sequenz erfolgten, im Wesentlichen nicht beeinflusst wird.
Bei der Hybridisierung mit dem PCR-Produkt, welches eine größere Kettenlänge aufweist als das Oligonukleotid, steigt das Hybridisierungssignal kontinuierlich mit der Anzahl der T-Kopplungen, die vor der Synthese des zum Target komplementären Bereiches der Sonde erfolgen.
Beispiel 4: Modifizierung eines Glaswafers für die DNA Synthese
a) Wafersubstrat
Es findet ein Glaswafer (BF 33 Glas, Schott) mit 0,7 mm Dicke Verwendung.
b) Reinigung und Strukturierung
Die Reinigung des Wafers erfolgt analog des Protokolls des Ausführungsbeispiels 1. Auf den gereinigten Wafer wird durch Sputtern eine NiCr-Schicht von ca. 100 nm Dicke aufgebracht. Die NiCr-Schicht wird mittels Positivlack AZ 1514 H und Belichtung durch eine entsprechende Maske strukturiert. Nach der Strukturierung mittels NiCr-Ätzbad, einer Mischung aus Ammoniumcer-IV-nitrat und Perchlorat in Wasser ist die aktive Fläche jedes Arrays (ca. 2 mm) von einer unterbrochenen Kette von quadratischen NiCr-Strukturen mit 32 μm Kantenlänge umgeben. Von der übrigen Waferfläche wird die NiCr Legierung vollständig entfernt. Der Photoresist wird mittels ALEG 625 (Mallinckrodt Baker, Griesheim, Deutschland) entfernt. Der Wafer wird kurz mit Di- Wasser benetzt und dann im vortemperierten Wasserbad (55°C) mit 5 M Natronlauge bei 50 °C für 30 s angeätzt. Anschließend wird in folgender Reihenfolge gespült: - 6 x VE- Wasser (je 1 min, Wafer in Halterung bewegen) - 2 x 5 min Di- Wasser Zum Abschluss wird der Wafer trocken geschleudert und bei 150 °C für Ih im Umlufttrockenschrank temperiert.
c) Silanisierung
Die Silanisierung des Wafers erfolgt analog zum Ausführungsbeispiel 1.
d) Herstellung der Syntheseschicht durch Modifizierung der Silanschichten
In einem PE Becher wird der silanisierte Wafer sowie 150 mL H2O vorgelegt. Dann werden 1,044 mL konz. Schwefelsäure unter Rühren zugegeben und dieses Gemisch 35 min lang auf 35 °C temperiert. Anschließend wird der Wafer aus dieser Lösung entnommen und mit vollentsalztem Wasser mehrmals abgespült. Abschließend wird der Wafer mit Ethanol gespült und in einer Zentrifuge bei 3000 rpm 60 s getrocknet.
e) DNA-Synthese auf der Waferoberfläche
Die DNA-Synthese wird an einem Syntheseautomaten Äkta (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland) durchgeführt. Im Unterschied zu dem Ausführungsbeispiels 1 wird eine aus PEEK gefertigte Reaktionskartusche verwendet.
Die Synthese startet mit einem Kopplungsschritt, bei dem das Nucleotid Cytidin auf dem gesamten Wafer gekoppelt wurde. Nach fünf weiteren Kuppungsschritten mit den Amiditbausteinen C, C, T, A und T auf dem gesamten Wafer wird anschließend die temporäre DMT-Schutzgruppe mittels einer Maske und einer 10%igen wässrigen Lösung von Methansulfonsäure ortsspezifisch abgespaltet.
Die für die Entschützung zu verwendende fluidische Maske verfugt über 21 Kanäle mit einer Breite von 2048 μm, die sich durch ein verschiedenartiges Muster von Inseln, d.h. Bereiche die durch die Maske abgedeckt werden, unterscheiden. Nach einer Reaktionszeit von 5 min werden die Kanäle mit Wasser gespült, die Maske abgehoben und der Chipwafer in die Synthesekartusche montiert und die Kartusche mit dem Syntheseautomaten verbunden. Es werden 3 Syntheseschritte mit den Bausteinen T, C und G durchgeführt, ohne die Maske jeweils zu verschieben.
Abschließend werden die Amidite G, A, C, C, C, T, T, T und G jeweils auf dem ganzen Wafer gekoppelt. Nach dem letzten Kopplungsschritt wird der Wafer aus der Kartusche ausgebaut und in eine mit 30-33% Ammoniak gefüllte Edelstahlkartusche überführt. Nach einer 35 minütigen Inkubation bei 55°C wird der Wafer entnommen und mit folgenden Lösungen gespült:
1 x mit Spülammoniak (28-30%) 1 x mit DI- Wasser 1 x mit VE-Wasser (fließend) 1 x mit DI- Wasser 1 x mit Ethanol
Abschließend wird der Wafer in einer Waferzentrifuge für 60 s bei 3000 min"1 trocken geschleudert und auf einer Wafersäge in 397 Einzelchips von 3,4 x 3,4 mm Kantenlänge zerteilt.
f) Hybridisierung Target: Hybridisierungstarget ist ein mit dem Farbstoff Cy3 markiertes Oligonukleotid von 18 Basen Länge mit der Sequenz 5' Cy3- GGGATAAGCCTGGGAAAC-3' .
Das Protokoll der Hybridisierung sowie die Detektion der Hybridiserungssignale wird analog dem Ausführungsbeispiel 1 durchgeführt. Die Belichtungszeit der Chips beträgt 6000 ms.
Auf den Chips werden zwei verschiedene DNA-Oligomere mit den Sequenzen
3' CCCTATTCGGACCCTTT 5' (18 mer) und 3' CCCTATGACCCTTT 5' (15 mer) aufgebaut. Die entsprechende Deletionssequenz befindet sich an den Orten, die durch die Maskenstempel abgedeckt worden sind und die als dunkle Flächen zu sehen sind. Die Matchsequenz befindet sich auf der restlichen Fläche des Chips.
Beispiel 5: Bestimmung der Syntheseschrittausbeute unter Verwendung von wäßrigen Entschützungsreagenzien
In diesem Beispiel wird mittels Festphasensynthese an CPG-Trägermaterial eine DNA mit der Sequenz 3'-TCAAAGGGTCCGAATAGGG-S' aufgebaut. Hierfür wird ein Expedite 8905 -Syntheszier der Firma PerSeptive Biosystems verwendet. Die Ermittlung der Syntheseausbeute erfolgt durch die dem Fachmann bekannte Methode der UV-metrischen Messung der Dimethoxytritylkationen.
Zum Vergleich der Synthesemethoden wird zum Einen die oben genannte Sequenz im Maßstab von 0,2 μmol mittels Standardprotokoll unter Verwendung von Trichloressigsäure (TCA) in Acetonitril aufgebaut und zum Anderen die gleiche Sequenz parallel in Abwandlung zum Standardprotokoll mit Hilfe des Entschützungsreagenzes 10% wässrige Methansulfonsäure (MSA) synthetisiert. Hierfür wird nach jedem erfolgten Syntheseschritt die Synthesekartusche aus dem Synthesizer entnommen, mit 0,5 mL 10% MSA-Lösung gespült und dann mit weiteren 0,5 mL 10% MSA für 5 Minuten zur Reaktion gebracht. Im Anschluss wird die Synthesekartusche mit 6 x 1 mL H2O gespült und mit Luft durchgeblasen. Nach 3 x Spülen mit je 1 mL Acetonitril wird das Trägermaterial unter Verwendung von trockenem Argon 10 Minuten getrocknet. Nachdem erneuten Einbau in den DNA- Syntheszier wird vor dem Fortsetzen des Synthesezyklus die Kartusche 3 x mit 1 mL Acetonitril gespült.
Um eine Aussage zur Kupplungseffizienz zu machen, wird jeweils nach dem 2. und 11. Syntheseschritt bei beiden Kartuschen die Entschützung mit je 1 mL einer 0,1 M p-Toluolsulfonsäure Lösung in Acetonitril durchgeführt. Nach der Entschützung wird die Entschützungsreagenzlösung mit 0,1 M p-Toluolsulfonsäure in Acetonitril im Verhältnis 1 :40 verdünnt und photometrisch in einem UV-Gerät (Perkin Eimer Lambda 40) in einer Küvette mit 1,0 cm Strahlengang bei einer Wellenlänge von 498 nm (ε498 = 70 000) vermessen.
Aus den gemessenen UV- Absorptionen werden die durchschnittlichen
Syntheseschritt-Ausbeuten bei der Standardsynthese zu 98,4 % und im Falle der modifizierten Synthese zu 98,3 % bestimmt.
Beispiel 6: Peptidsynthese auf Glaswafer
Im Folgenden wird eine Arbeitsanweisung zur Peptidsynthese auf einem Glaswafer bereitgestellt. Auf einem Chipwafer sind insgesamt 397 Array-Flächen in 21 Zeilen und 21 Reihen angeordnet. Die Glaswafer werden in Analogie zum Ausfuhrungsbeispiel 1 dem Standardprozess der Glasreinigung und Strukturierung unterworfen. Die nachfolgende Silanisierung wird bei gleichen Reaktionsbedingungen wie im Beispiel 1 mit einer 5.3 % (v/v) Lösung von 3-Aminopropyloxysilan in Toluol durchgeführt. Die silanisierten Wafer weisen einen Randwinkel von ca. 50° auf.
Die Wafer werden anschließend einzeln in einer aus PEEK gefertigten Synthesekartusche zur Reaktion gebracht. Zu erst wird als Linker-Molekül Boc-
Glycin-OH auf dem Wafer gekuppelt. Hierfür wird eine Lösung aus 0,1 M Boc-Gly- OH in Dimethylformamid (DMF) und 0,1 M O-Benzotriazolyl-N,N,N\N'~ tetramethyluroniumtetrafluoroborat (TBTU) sowie 0,12 M Hydroxybezotriazol (HOBt) gemäß der HOBt/TBTU Methode nach Knorr et al. (R. Knorr, A. Trzeciak, W. Bannwarth, D. Gillesen, Tetrahedron Lett. 1989, 30, 2340-2349) verwendet.
Anschließend wird durch Zugabe der Base N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) der pH- Wert auf 8,5 eingestellt und die Reaktionskartusche leicht geschüttelt. Nach 60 min wird der Wafer aus der Synthesekartusche entnommen und mit je 10 mL 2 x DMF und 2 x DMFiDichlormethan (DCM) 1:1 gespült.
Basierend auf dieser Syntheseschicht erfolgen die weiteren Synthesezyklen zum Aufbau der Peptide. Generell werden analog zur etablierten Festphasensynthese von Peptiden Seitenketten geschützte Aminosäuren verwendet. Hierbei werden die Schutzgruppen so gewählt, dass diese möglichst mild und möglichst ohne Metall- vermittelte Katalyse am Ende der Synthese abgespalten werden können. Als temporäre Schutzgruppe dient tert.-Butyloxycarbonylgruppe. In einem ersten Schritt wird eine erfindungsgemäße Kanalmaske auf dem Wafer orientiert und 10 %ige wässrige Methansulfonsäure durch die Kanäle des Verbundes aus Wafer und Kanalmaske gezogen. Nach 10 min werden die Kanäle mit H2O gespült und die Maske vom Wafer abgehoben. Der Wafer wird mit Acetonitril gespült und getrocknet. Nach dem Einbau des Wafers in die Synthesekartusche wird dieser mit der nächsten Aminosäurekupplungs-lösung (siehe oben) bedeckt und zur Reaktion gebracht. Nach vollständiger Synthese werden die temporären sowie permanenten Schutzgruppen entfernt. Die Protokolle hierfür sind dem Fachmann bekannt.
Abbildungen
Abbildung 1 : Darstellung des in Beispiel 1 verwendeten Arrays.
Matchsequenz (18mer): 3' CCCTATTCGGACCCTTTG 5' (helle Bereiche in
Abbildung 1)
G-Deletion (17mer): 3' CCCTATTCGACCCTTTG5' (dunkle Bereiche in
Abbildung 1) G-Insertion (19mer): 3' CCCTATTCGGGACCCTTTG 5' (graue Bereiche in
Abbildung 1)
Abbildung 2: Aufnahme der Hybridisierungssignale gemäß Beispiel 1 für Entschützungszeiten von 2 min, 10 min und 30 min.
Abbildung 3: Darstellung der Abhängigkeit des Hybridisierungssignals von der Entschützungszeit. Abbildung 4: Darstellung der Abhängigkeit des Hybridisierungssignals von der Belegungsdichte des Arrays.
Abbildung 5: Schematische Darstellung des Synthesezyklus.
Abbildung 6: Darstellung einer Ausgestaltung der Maske.
Abbildung 7: Vergrößerung eines Ausschnitts einer Maske.
Abbildung 8: Darstellung eines Verbunds aus Maske und Träger.
Abbildung 9: Schematische Darstellung des Verbundes aus Maske und Träger (a: leer, b: befällt).
Abbildung 10: Schematische Darstellung des Prinzips der selektiven Entschützung.
Abbildung 11 : Reaktions Schema zur Aufbringung einer Silanschicht auf dem Träger.
Abbildung 12: Reaktionsschema zur Modifizierung einer auf dem Träger angebrachten l-Hydroxypropyl-(2'-hydroxy)-oxypropylsilan-Schicht durch Zugabe von Säure.
Abbildung 13a: Schematische Darstellung einer metallisch strukturierten Oberfläche. Die weißen Spots symbolisieren die Polymerschicht bzw. Syntheseschicht.
Abbildung 13b: Schematische Darstellung einer mit Sauerstoffplasma strukturierten Oberfläche. Die grauen Felder symbolisieren die Polymerschicht bzw. Syntheseschicht. Abbildung 14: Schematische Darstellung der Erzeugung einer Maske.
Abbildung 15: Photo der Reaktionskammer.
Abbildung 16: Hybridisierung mit 10 nM Oligotarget gemäß Beispiel 3.
Abbildung 17: Hybridisierung mit ca. 5 nM PCR-Target gemäß Beispiel 3.
Abbildung 18: Signal der Hybridisierung mit dem Oligonukleotid-Target in
Abhängigkeit von der Anzahl der T-Kopplungsschritte, die vor der Synthese der zum Oligonukleotid komplementären Sequenz erfolgten (siehe Beispiel 3).
Die hellen Balken (Match) entsprechen dem an Sonden gemessenen Signal, deren spezifischer Bereich vollständige Komplementarität zum Hybridisierungstarget aufweist. Die dunklen Balken (Mismatch) zeigen das Signal, welches an Sonden gemessen wurde, deren spezifischer Bereich eine Deletion von einer Base aufwies.
Abbildung 19: Signal der Hybridisierung mit dem PCR-Target in Abhängigkeit von der Anzahl der T-Kopplungsschritte, die vor der Synthese der zum Oligonukleotid komplementären Sequenz erfolgten (siehe Beispiel 3).
Die hellen Balken (Match) entsprechen dem an Sonden gemessenen Signal, deren spezifischer Bereich vollständige Komplementarität zur Zielregion im Hybridisierungstarget aufweist. Die dunklen Balken (Mismatch) zeigen das Signal, welches an Sonden gemessen wurde, deren spezifischer Bereich eine Deletion von einer Base aufwies. Abbildung 20: Verschiedene Maskengeometrien im Vergleich.

Claims

A n s p r ü c h e
1. Verfahren zur ortspezifischen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers durch schrittweise Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen, bei dem jeweils vor einem Kupplungsschritt auf mindestens einem vorbestimmten Bereich des Trägers für die Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins zur Verfügung stehende reaktive Gruppen dadurch aktiviert werden, dass temporäre Schutzgruppen an diesen reaktiven Gruppen durch Zugabe eines Aktivierungsreagenzes in wässriger Lösung entfernt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die temporären Schutzgruppen von solchen vorbestimmten Bereichen des Trägers entfernt werden, die durch eine auf dem Träger angeordnete Maske vorgegeben sind.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger reaktive Gruppen für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen aufweist.
4. Verfahren zur ortspezifϊschen Synthese von Biopolymeren einer definierten Sequenz auf vorbestimmten Bereichen eines festen Trägers, umfassend die folgenden Schritte: a) Anordnen einer Maske auf dem Träger, wobei auf dem Träger für die Kupplung von Monomer- und/oder Oligomerbausteinen des zu synthetisierenden Biopolymers zur Verfügung stehende reaktive Gruppen mit Schutzgruppen versehen sind; b) Aktivieren von reaktiven Gruppen durch Entfernen von temporären Schutzgruppen an den durch die Maske vorgegebenen Bereichen mittels Zugabe eines Aktivierungsreagenzes in wässriger Lösung; c) Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins an in Schritt b) aktivierte reaktive Gruppen; und d) Wiederholen der Schritte a) bis c), bis die gewünschten Biopolymere auf vorbestimmten Bereichen des Trägers synthetisiert sind.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Maske vor Durchführung eines Kupplungsschritts von dem Träger getrennt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Biopolymere ausgewählt werden aus Nukleinsäuren, Peptiden und Peptidnukleinsäuren.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die temporären Schutzgruppen ausgewählt werden aus Dimethyloxytrityl, tert.-Butyloxycarbonyl und/oder Fluorenyl-9-methoxycarbonyl.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Aktivierungsreagenz ein Entschützungsreagenz ist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Entschützungsreagenz ausgewählt wird aus Oxalsäure,
Methansulfonsäure, Trifluoressigsäure, Salzsäure und/oder Natriumhydroxid.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger ausgewählt wird aus Silizium, Siliziumdioxid, Glas und/oder Keramik.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei eine auf dem Träger angeordnete Maske durch Adhäsion auf dem Träger haftet.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11 , wobei die Maske zumindest auf der den Träger kontaktierenden Seite Elastomere umfasst.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Elastomer Polydimethylsiloxan ist.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger eine raue Oberfläche aufweist.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die vorbestimmten Bereiche durch für die Synthese von Biopolymeren inerte Bereiche voneinander abgetrennt sind.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger Markierungen für die Anordnung einer Maske auf dem Träger aufweist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Träger 50 bis 65.000 vorbestimmte Bereiche umfasst.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei sich auf unterschiedlichen vorbestimmten Bereichen synthetisierte
Biopolymere in ihrer Sequenz unterscheiden.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fläche des Trägers 100 μm2 bis lern2 und vorzugsweise 3 mm2 bis 25 mm2 beträgt.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Sequenzen der Biopolymere entsprechend ihrer Eignung als molekulare Sonden in Mikroarray-Experimenten ausgewählt werden.
21. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Herstellung eines Mikroarrays mit auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Biopolymer-Sonden.
22. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Herstellung eines Mikroarrays mit auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Biopolymer-Sonden, wobei die vorbestimmten Bereiche durch inerte Bereiche voneinander getrennt sind.
23. Mikroarray mit auf vorbestimmten Bereichen immobilisierten Biopolymer- Sonden, bei dem der prozentuale Anteil P an Biopolymeren, die die gewünschte Zahl M an Monomeren aufweisen, durch die Formel P = SM gekennzeichnet ist, wobei S die durchschnittliche Schrittausbeute bei der Kupplung eines Monomer- und/oder Oligomerbausteins ist, und wobei die Dichte an vorbestimmten Bereichen mindestens 1.500 vorbestimmte Bereiche pro cm2 beträgt und die durchschnittliche Schrittausbeute S mindestens 95%, vorzugsweise mindestens 96%, besonders bevorzugt mindestens 97% und am meisten bevorzugt mindestens 98% beträgt.
24. Mikroarray nach Anspruch 22, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20.
25. Verwendung von Entschützungsreagenzien in wässriger Lösung in der Synthese von Biopolymeren zur Abspaltung von temporären Schutzgruppen.
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7236999B2 (ja) * 2016-12-22 2023-03-10 イラミーナ インコーポレーテッド フローセルパッケージおよびその製造方法

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744101A (en) * 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US5384261A (en) * 1991-11-22 1995-01-24 Affymax Technologies N.V. Very large scale immobilized polymer synthesis using mechanically directed flow paths
ATE241426T1 (de) * 1991-11-22 2003-06-15 Affymetrix Inc A Delaware Corp Verfahren zur herstellung von polymerarrays
US5512131A (en) 1993-10-04 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Formation of microstamped patterns on surfaces and derivative articles
US5605809A (en) * 1994-10-28 1997-02-25 Oncoimmunin, Inc. Compositions for the detection of proteases in biological samples and methods of use thereof
US5688642A (en) 1994-12-01 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Selective attachment of nucleic acid molecules to patterned self-assembled surfaces
US5599695A (en) * 1995-02-27 1997-02-04 Affymetrix, Inc. Printing molecular library arrays using deprotection agents solely in the vapor phase
US5658734A (en) 1995-10-17 1997-08-19 International Business Machines Corporation Process for synthesizing chemical compounds
DE19543232A1 (de) 1995-11-07 1997-05-15 Knoell Hans Forschung Ev Herstellung einer Matrix-gebundenen miniaturisierten kombinatorischen Poly- und Oligomerbibliothek
DE69707853T2 (de) * 1996-03-15 2002-06-27 President And Fellows Of Harvard College, Cambridge Verfahren zum formen von gegenständen und zum mikrostrukturieren von oberflächen durch giessformen mit kapillarwirkung
WO1998020967A1 (en) * 1996-11-14 1998-05-22 Affymetrix, Inc. Chemical amplification for the synthesis of patterned arrays
DE19706570C1 (de) * 1997-02-19 1998-02-26 Inst Physikalische Hochtech Ev Verfahren zur Herstellung von strukturierten, selbstorganisierten molekularen Monolagen einzelner molekularer Spezies, insbesondere von Substanzbibliotheken
US6093302A (en) * 1998-01-05 2000-07-25 Combimatrix Corporation Electrochemical solid phase synthesis
EP1054726B1 (de) * 1998-02-11 2003-07-30 University of Houston, Office of Technology Transfer Vorrichtung zur durchführung chemischer und biochemischer reaktionen unter anwendung von photoerzeugten reagenzien
US6222030B1 (en) * 1998-08-03 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Solid phase synthesis of oligonucleotides using carbonate protecting groups and alpha-effect nucleophile deprotection
US7439056B2 (en) * 2000-11-08 2008-10-21 Surface Logix Inc. Peelable and resealable devices for arraying materials

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None

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Publication number Publication date
ATE494063T1 (de) 2011-01-15
DE502005010814D1 (de) 2011-02-17
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EP2260936B1 (de) 2017-12-27
EP1814656B1 (de) 2011-01-05
EP2260936A3 (de) 2012-05-09
US20080108512A1 (en) 2008-05-08
EP2260936A2 (de) 2010-12-15

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