WO2002010448A2 - Photochemische trägerscheibe und verfahren zur durchführung chemischer und biologischer assays - Google Patents

Photochemische trägerscheibe und verfahren zur durchführung chemischer und biologischer assays Download PDF

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    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes

Definitions

  • the invention relates to means and methods for performing chemical and biological assays.
  • DNA DNA, RNA or chemically modified nucleic acids
  • pathogenic bacteria for example, pathogenic bacteria or the presence of mutations (gene diagnostics)
  • mutations gene diagnostics
  • Such substances can be, in particular, biological materials such as tissues and cell cultures of eukaryotic and prokaryotic and archaebacterial cells, but also extracts or homogenates of biological materials, cell organelles, proteins, fats and fatty acids, enzymes, receptors (in particular receptors bound to cell surfaces), messenger substances, nucleic acids and smaller Molecules such as glucose, fructose, lactate, glutamate and the like.
  • biological materials such as tissues and cell cultures of eukaryotic and prokaryotic and archaebacterial cells, but also extracts or homogenates of biological materials, cell organelles, proteins, fats and fatty acids, enzymes, receptors (in particular receptors bound to cell surfaces), messenger substances, nucleic acids and smaller Molecules such as glucose, fructose, lactate, glutamate and the like.
  • a nucleic acid usually the probe
  • a starting molecule as a coupling substance for example a so-called spacer or linker such as, for example, succinic acid or aminopropyl spacer
  • a location-dependent, controlled reaction procedure is necessary.
  • the (protected) linker molecules initially fixed on the support are exposed at the locations at which a synthesis step is to take place, as a result of which the photolabile linker protective groups are removed there and the linkers are deprotected.
  • a solution of hydroxyl-protected (deoxy) nucleosides is then applied. These are covalently bound to the photochemically deprotected linkers.
  • the unbound nucleosides are washed off the support. Then the location-dependent exposure (deprotection of further linkers and / or already attached nucleoside components) and the addition of (Further) nucleoside components (each with predetermined bases) repeated until the synthesis is completed at each coupling site of the support.
  • oligonucleotide is also understood to mean longer, for example 200 base long nucleic acids or polynucleotides, for example whole chromosomes.
  • a carrier disk comprising a functional element and an adapter element adapted for connection to the functional element, the functional element comprising: (a) a substrate element for receiving an arrangement of biological or chemical substances, and / or
  • the carrier disk according to the invention is preferably a flat, essentially circular disk. With such discs, it is very easy to determine the center of gravity for a low-imbalance rotational movement. It is therefore possible to move a carrier disk particularly quickly, with high precision and with little vibration by rotating it and, if necessary, align it for analysis in a reader (more on this below). In the context of this description, such disks are considered flat if the ratio of the height to the diameter of the circumferential circle is less than or equal to 1:10.
  • the carrier disk is not limited to the substantially circular shape, but may have another shape. However, it will preferably be symmetrical so that the advantages just described can be realized.
  • the carrier disk preferably comprises a centrally arranged recess. This makes it particularly easy to align and fix the disc on a turntable for rotation.
  • the central recess will often be circular, but can also have a different configuration. The latter can be particularly advantageous when an exact alignment of the disk on the turntable is desired, for example because of the presence of special disk elements (such as electrical contacts) or to prevent minimal relative displacements of the disk and turntable.
  • the turntable then has a holding device designed to complement the recess for engaging in the recess.
  • the outer diameter of the carrier disc and, if appropriate, the diameter of the central recess preferably correspond to that of a conventional long-playing disc (LP), compact disc (CD), DVD or mini disc. With these dimensions, the drive technology developed for playing conventional LPs or CDs can be used to rotate the disk, which simplifies the manufacture of the rotary drive system for the carrier disk.
  • a substrate element that can be used in the context of the invention is designed to accommodate an arrangement of biological or chemical substances.
  • the arrangement can in particular be a regular arrangement of such a substance (array), but also a regular arrangement of any, in particular different, substances (panel).
  • one or more substances can also be present as individual points, over a large area or distributed in a channel, a concentration gradient of one or more substances being optionally provided in the area or in the channel.
  • any arrangement of biological or chemical substances is referred to, in particular one of the arrangements described above.
  • the carrier disk preferably comprises areas on which data can be stored and / or read out in machine-readable form, preferably digitally. It is particularly advantageous if the carrier disk is set up in such a way that, according to the general principles of CD technology, it is possible to write to the disk with digital data and / or read digital data from the disk using a (laser) light source.
  • the digital data can in particular be a computer program for controlling a reading device for a carrier disk and / or for evaluating a carrier disk equipped with functional elements of type (a) and / or (b); however, they can also be, for example, measured values when reading out the functional elements of type (a) and / or (b) or other data related to a carrier disk.
  • the areas of machine-readable data are preferably located on a data element.
  • Such data elements can be produced easily and in large numbers, for example in the form of minidisks, using conventional methods. To this In this way, the production of adapter elements and the production of the areas of machine-readable data can advantageously be separated, so that the adapter elements can also be produced from materials and with the aid of methods which cannot be used for the production of areas of machine-readable data or only with difficulty. If areas of machine-readable data are spatially separated from the functional elements of types (a) and (b), then these functional elements can also be subjected to treatments which can otherwise endanger or impair the readability or writeability of the areas of machine-readable data.
  • the carrier disk comprises several functional elements in the assembled state.
  • the functional elements do not all have to be of the same type; functional elements of several types can also be combined.
  • the substrate element is a microarray chip (in particular with a plastic, glass or silicon base body), a glass slide, a paper carrier (for example filter paper or a coated paper) or a membrane (film, in particular Blotting membranes such as nitrocellulose, nylon or polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes).
  • a microarray chip in particular with a plastic, glass or silicon base body
  • a glass slide for example filter paper or a coated paper
  • a membrane film, in particular Blotting membranes such as nitrocellulose, nylon or polyvinylidene fluoride (PVDF) membranes.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • a preferred example of such a microarray chip substrate element are rectangular glass slides with a surface that is prepared (activated) for the attachment of biological or chemical substances.
  • the functional element or elements can be (preferably detachably) connected to the adapter element which, in the connected state, forms the carrier disk together with them or them.
  • the type of connection of the adapter element and functional element (s) can be different, each with the aim of making the carrier disc ensemble easy to handle.
  • the functional element or elements can be form-fitting, frictional, be non-positively or cohesively connected to the adapter element.
  • a respective functional element can be fitted, inserted, clamped or glued into a continuous opening in the adapter element or into a recess in the surface of the adapter, or glued or clamped onto the surface of a disk-shaped adapter element.
  • the adapter element and / or one or more further functional elements is expediently used. In this way it is possible to dispense with possibly complex sealing devices and to ensure the sealing of channel structures.
  • a carrier disk which comprises one or more position markings for identification, control and / or evaluation purposes, the position markings being applied to the outer surface and / or the surface of the carrier disk.
  • Adapter elements or functional elements for use in a carrier disk (1) according to one of the types described are also preferred.
  • a method with the following steps is preferred for producing an oligonucleotide arrangement: a) Providing a carrier disk with (at least) one examination side, on which coupling substances that can be photochemically activated at a number of coupling sites for the respective fixing of an oligonucleotide or oligonucleotide component (e.g.
  • a nucleoside provided with protective groups are arranged and a light source for the selective photochemical activation of the coupling substances at individual coupling sites, b) coupling the coupling substance at a first coupling site with an oligonucleotide or oligonucleotide component by placing the oligonucleotide or oligonucleotide component on at least the first Applied coupling location, the light source directed to the first coupling location and the coupling connection at the first coupling location by lighting with the
  • Light source is activated, c) rotating the disk and / or shifting the light source and disk in the radial direction relative to one another in order to direct the light source to a further coupling location.
  • the carrier disk is rotated between two coupling locations (synthesis steps) according to step c).
  • This procedure advantageously not only achieves a technically simple movement of the support, but also opens up the possibility of centrifugal forces mechanically simple and direct to the oligonucleotides or oligonucleotides usually applied in liquid form (as a solution or suspension) -Build components.
  • the carrier disk used in the method according to the invention for producing an arrangement has on one examination side a number of coupling locations at which photochemically activatable coupling substances for the respective fixing of one Oligonucleotide or oligonucleotide component are arranged (cf. process step a).
  • the coupling substances are preferably conventional, photochemically activatable linkers / spacers, as described, for example, by Fodor et al. be used.
  • the photo-reaction mechanisms of these coupling substances and their preparation are known to the person skilled in the art; he can choose from a number of possible substances that best suit his specific needs.
  • extendable nucleosides or oligonucleotides provided with protective groups can also be linked directly to the support material in a manner known to the person skilled in the art and serve as a coupling substance.
  • the coupling locations can be predetermined on the carrier disk by coating only certain, spatially delimited areas of the examination side (microchemotopes) with coupling substance. This is particularly advantageous when special surface structures such as microchannels or reaction recesses (wells, cavities) are provided on the (at least one) examination side (in particular a microfluidic element).
  • the required amount of coupling substance or substances for the production of the carrier disk to be provided according to method step a) can then be very small.
  • the examination side can also have a coherent area which is coated with coupling substance everywhere and of which partial areas are used as coupling locations.
  • the coupling locations are preferably not precisely predetermined during the manufacture of the disk, but are only defined when the method according to the invention is carried out. Since the exact position of the coupling locations does not have to be taken into account when producing the carrier disk, the production of such carriers is particularly simple.
  • the disk preferably has a glass or plastic surface, since numerous solid-phase synthesis reactions and hybridization reactions can be carried out particularly easily on such surfaces.
  • silicon can also form the basis for the coupling locations.
  • At least the coupling substance at the first coupling location, but preferably also each of the coupling substances at the further coupling locations, is provided with a protective group which can be removed by illuminating the light source in such a way that an unprotected one (Activated) coupling substance is formed, which can couple in a defined manner with the oligonucleotide or oligonucleotide component.
  • a protective group which can be removed by illuminating the light source in such a way that an unprotected one (Activated) coupling substance is formed, which can couple in a defined manner with the oligonucleotide or oligonucleotide component.
  • the light source used in the method according to the invention for the selective photochemical activation of the coupling substances is advantageously a laser light source set up for the photochemical activation of the coupling substances (and optionally for the activation of correspondingly activatable oligonucleotides and / or oligonucleotide components).
  • Laser light has the advantage that it only encompasses a narrowly limited wavelength range that is matched to the photoreaction in question, is easy to focus and can be produced inexpensively in a manner known to those skilled in the art.
  • photoactivatable substances for example linkers, oligonucleotides or oligonucleotide components provided with protective groups
  • linkers for example linkers, oligonucleotides or oligonucleotide components provided with protective groups
  • the light source is directed in succession to different coupling locations.
  • the respective alignment can take place, for example, via a light guide system with mirrors or via optically conductive cables such as glass fiber cables.
  • step b) of the process according to the invention the coupling substance present there is coupled to an oligonucleotide or oligonucleotide component at a first coupling site; further components can be coupled in subsequent steps.
  • oligonucleotides or oligonucleotide components - in step b) of the method according to the invention and corresponding subsequent steps - dispensing devices such as (micro) pipettes, which are known to the person skilled in the art for the application of small amounts of liquid, are advantageously used.
  • pipettes have a high measuring accuracy.
  • the special surface structures such as channels, cavities and the like, which may be provided on the disk surface and / or in a microfluidic element, can be designed as application aids such that when the carrier rotates (sufficiently quickly) due to the interaction of centrifugal force and Surface design Liquids can be transported from a starting position to individual coupling locations.
  • a liquid with an oligonucleotide or oligonucleotide building block to be applied can then be in a starting position in some Distance from the corresponding coupling location is applied to the carrier disk and transported to the coupling location by the forces acting during the disk rotation along a path predetermined by the surface structure.
  • the synthesis / coupling reactions can be carried out under a transparent layer in a limited volume, for example in a tubular channel structure or in a covered chamber (e.g. in a microfluidic element). If structural elements of this type are specified, the later reaction volume can already be defined during the manufacture of the carrier disk.
  • the coupling and synthesis reaction can then be carried out with the addition of an excess of the solutions involved, it being possible for the excess to be discharged, for example, into suitable collecting chambers to be provided on the carrier disk. Accordingly, with such a limitation of the reaction volume, the measurement accuracy for the application of the solutions involved only has to be sufficient to ensure the application of a solution excess in each case; the exact dosing is then carried out by the structural elements of the carrier disk.
  • a transparent cover for example made of glass or plastic, reduces the evaporation of liquids at the coupling location.
  • the light source After coupling at the first coupling location, the light source is aligned in accordance with step c) to a further coupling location, by rotating the disc, if necessary, or displacing the light source radially with respect to the carrier disc. Both movements can also take place simultaneously. After the rearrangement of the light source and / or disk, the light source is aligned with the further coupling location, at which another photochemical coupling-synthesis reaction can then be carried out in the manner described.
  • the carrier disk can be set in rapid rotation in order to throw off the liquid droplets on it.
  • a spin off can of course be carried out just as well after each individual coupling step. Washing liquids can be applied to the carrier and, if necessary, distributed by rotating the carrier disk, and these liquids can in turn be spun off by rotation.
  • an activated coupling substance is coupled to one or, in time, activated coupling substances at several coupling sites with a protected nucleoside, which in turn can then be activated by illumination with the light source.
  • the invention also relates to a system for carrying out the described methods for producing an oligonucleotide array, the system comprising: a carrier disk with (at least) one examination side, on which on a
  • Oligonucleotide devices are arranged a light source for selective photochemical activation of the
  • Coupling substances at individual coupling locations an addressing device for rotating the disk and for moving
  • the present invention relates not only to a method and a plant for producing an oligonucleotide array, but also to a method for carrying out a hybridization assay, comprising: a) providing a support provided with an oligonucleotide array in a manner according to the invention Disk and b) the application of nucleic acids (DNA, RNA or their derivatives) at at least one coupling location on the carrier disk and the setting of sufficiently stringent hybridization conditions.
  • nucleic acids DNA, RNA or their derivatives
  • Such a method advantageously enables a large number of. Perform hybridization reactions with a single carrier disc.
  • different probes bound to the carrier disk can be brought into contact with a sample of a nucleic acid of an unknown sequence in order to obtain information about the sequence of the sampled nucleic acid.
  • the person skilled in the art can select suitable hybridization conditions when carrying out the method, which he will determine, if appropriate, using conventional test series.
  • evaluation optics can be provided, which preferably cooperate with an addressing device that is set up in such a way that the disk can be rotated and / or the disk and evaluation optics moved in the radial direction relative to one another, to move the evaluation optics between two coupling locations (evaluation positions). After the evaluation at a first evaluation position, the disk can be rotated and / or the disk and evaluation optics moved in a radial direction relative to one another in order to direct the evaluation optics to a further evaluation position (a further coupling location).
  • the optical evaluation of the hybridization result is thus carried out in a manner analogous to the generation of the oligonucleotide array, in that a detection is carried out at a first coupling location by means of the evaluation optics, then the disk rotates and / or disk and The evaluation optics are displaced in the radial direction relative to one another in order to direct the evaluation optics towards a further coupling location, and a detection is then carried out at this further coupling location. See also the following description of the figures.
  • the invention also relates to multi-part carrier disks comprising an adapter element and one or more substrate elements, the substrate element or the substrate elements being equipped for receiving an array of biological or chemical substances or carrying such an array.
  • the carrier disk can be in one of its useful states, ie in particular in a state provided according to step a) of the method according to the invention for producing an oligonucleotide array, ie with coupling substances already arranged, but before generating an oligonucleotide array, in a ( Raw) state before the arrangement of coupling substances (eg spacers or linkers), whereby coupling locations or regions are already provided on the carrier disk, which are particularly well suited for attaching a coupling substance in comparison with their respective immediate surroundings Carrying out an assay prepared state in which the multi-part carrier disk with an oligonucleotide array or - for other examination tasks - with a protein array, in particular peptide array, or with an array of other biological or chemical substances (cells, carbohydrates etc.
  • the invention also relates generally to a method for attaching an array of biological or chemical substances to a carrier disk, one (or more) substrate element (s) with an adapter element (and possibly further structural or functional elements) being connected to the carrier. Disk connected and an array of biological or chemical substances is previously or subsequently arranged on the substrate element (s). The molecular biological assay is then carried out with the array.
  • multi-part carrier disks which comprise (a) an adapter element and (b) a substrate element with a surface (activated) prepared for the adhesion of coupling substances
  • the method according to the invention for producing an oligonucleotide array e.g. to provide rectangular chips (or other substrate elements such as foils, papers etc.) with a microarray. All coupling locations of the carrier disk are preferably arranged in the area of the substrate element or elements. The latter can then be detached from the adapter element, subjected to an assay and examined using commercially available substrate readers (biochip analysis devices).
  • the adapter element of such a multi-part carrier disk is here, after the substrate element (s) (e.g.
  • microarray chips has been separated off, preferably suitable for a new combination with fresh (structurally identical) substrate elements.
  • the production of an oligonucleotide array according to the invention (which is characterized in particular by the rotation of the carrier disk) can advantageously be combined with the already known techniques for examining non-rotationally symmetrical, in particular rectangular, microarray chips.
  • the invention also relates to multi-part carrier disks composed of adapter element and substrate element (s), the substrate element (s) being in a state prepared for carrying out an assay and with an oligonucleotide array or an array of other biological or chemical substances are provided.
  • the substrate elements can have been provided with an oligonucleotide array using the method according to the invention.
  • they will preferably be commercially available, in particular rectangular, microarray chips (or other substrate elements of the types described above), which in the conventional (not according to the invention) have a Oligonucleotide array were provided.
  • Such multi-part carrier disks for example comprising one or more microarray chips, can then be subjected to the hybridization assay according to the invention, in which nucleic acids are applied to at least one coupling location (on the chip or chips of the carrier disk) and sufficiently stringent hybridization conditions are set.
  • the hybridization assay according to the invention, in which nucleic acids are applied to at least one coupling location (on the chip or chips of the carrier disk) and sufficiently stringent hybridization conditions are set.
  • microchips provided with an oligonucleotide array are thus used and evaluated in assays using the teachings or techniques according to the invention.
  • microarray chips or other substrate elements of the types mentioned
  • the usual (not according to the invention) manner in a hybridization or other assay and only for evaluation with an adapter element to a carrier.
  • an adapter element to a carrier.
  • the evaluation is then carried out in the manner described above.
  • a reader is preferred for evaluating a hybridization assay, comprising
  • Receiving means for a carrier disk which has an examination side on which oligonucleotides are arranged at a number of predetermined coupling locations for carrying out a hybridization assay
  • an addressing device which is set up in such a way that the carrier disk rotates and / or a carrier is moved -Disk and evaluation optics in the radial direction can be carried out relative to each other to move the evaluation optics between two coupling locations
  • a detector for the detection of hybridizations is preferably an optical detector or a magnetic sensor.
  • the reading device can in particular comprise a means different from the detector for reading data stored on the carrier disk.
  • Fig. 1 is a perspective schematic representation of a photochemical activation in a method according to the invention
  • 3a-c is a schematic representation of a hybridization and detection reaction at a coupling site according to Fig. 2a-h
  • 4a is a plan view of a multi-part carrier disk with an adapter element and a rectangular microarray chip
  • 4b is a cross-sectional view of the adapter element and the microarray
  • a disk 10 is shown in FIG.
  • the disk 10 has an essentially circular base area with a centrally arranged, also essentially circular recess 12.
  • the disk is flat, its thickness being considerably smaller (approximately 1: 30-1: 120) than its diameter.
  • Twenty coupling locations 20 are arranged on the upper side of the disk (examination side) 11, each of which comprises light-sensitive (photochemically activatable) coupling substances in its interior (not shown).
  • the coupling locations 20 define two separate, concentric rings 15 and 16 (shown in dashed lines), the outer ring 15 comprising twelve and the inner ring 16 eight coupling locations.
  • you could the coupling locations 20 can also be arranged in a different way, for example on one or more spiral tracks.
  • the number of coupling locations 20 is also not fixed; The person skilled in the art recognizes that with the largest possible number of coupling locations 20, the area available on the examination side 11 can be better utilized, so that more synthesis and hybridization reactions can be carried out per disk used.
  • the coupling locations 20 are circular in the embodiment shown, but the exact shape is not important. Triangular, rectangular or other shapes could be chosen as well.
  • a light source 30 is attached to a carrier 35 running parallel to the surface of the disk 10, which light source is only shown schematically.
  • the light source 30 is preferably a laser that is matched to the light-sensitive coupling substances at the coupling locations 20. 1 shows a light cone 38 emanating from the light source 30 and which is set to a coupling location 20.
  • dispensing devices such as (micro) pipettes or the like can be arranged in order to apply oligonucleotides or oligonucleotide building blocks to the coupling substances at the coupling locations 20.
  • the disk 10 is rotatably arranged on a turntable (not shown) (see arrow 19).
  • the light source 30 can be moved radially to the disk 10 along the carrier 35 in the direction of the arrow 39.
  • the disk 10 could be displaceable radially (in the direction of the arrow 39) relative to the (then stationary) light source 30.
  • the disk 10 and the light source 30 are first provided.
  • a photochemical coupling reaction is then carried out at the first coupling location 20, the coupling location 20 and the light source 30 being initially aligned with one another by rotating the disk 10 in the direction of the arrow 19 and, if appropriate, radially displacing the light source 30 along the carrier 35 in the direction of the arrow 39.
  • the first coupling location 20 is then exposed by means of the light source 30, so that the assigned coupling substance is activated and the coupling reaction between the coupling substance and the oligonucleotide or oligonucleotide component can take place.
  • the oligonucleotide or oligonucleotide component is then applied to the first coupling site 20 (not shown).
  • a coupling reaction is then carried out at a further coupling location 20 '.
  • this lies in the inner ring 16, while the coupling location 20 is arranged in the outer ring 15.
  • the disk 10 is rotated three positions further in the direction of the arrow 19.
  • the light source 30 on the carrier 35 is moved in the direction of the central recess 12. Both movements can be carried out simultaneously or in any order one after the other.
  • the light source 30 is directed at the coupling location 20 ', so that a coupling reaction can now be carried out at this location.
  • the procedure here corresponds to the procedure at coupling location 20.
  • FIGS. 3a-c shows schematically the attachment of nucleosides to individual coupling substances.
  • the reference numerals in the various sub-figures and in FIGS. 3a-c have been omitted to the extent that they correspond to one another.
  • FIG. 2a is. schematically shown in cross section a section of an examination page 11 of a disc 10.
  • Coupling substances 40, 43, 46 are covalently bound on the examination side 11.
  • Each coupling substance 40, 43, 46 is assigned to a separate coupling location 41, 44, 47.
  • spatial boundaries between the coupling locations have not been shown.
  • the coupling substances 40, 43, 46 have light-sensitive protective groups 42, 45, 48 shown as circles at their ends pointing away from the examination side 11.
  • An exposure process of a coupling location 41 is shown schematically in FIG. 2b.
  • Light 50 is radiated onto the photosensitive group 42 of the coupling substance 40 so that it is activated (removed) photochemically (indicated by blackening).
  • the remaining coupling substances 43, 46 remain unexposed, their light-sensitive groups 45, 48 are not activated.
  • the oligonucleotide module 60 After application of an oligonucleotide module 60 provided with a light-sensitive protective group 62 to the coupling site 41, the oligonucleotide module 60 is covalently connected to the coupling substance 40 (cf. FIG. 2c).
  • oligonucleotide building blocks are also attached to the other coupling sites (cf. FIG. 2d).
  • FIGS. 2e-h The specific extension of a nucleotide chain at different coupling sites is shown schematically in FIGS. 2e-h.
  • FIG. 2e shows the exposure of the coupling location 40 with light 51. The remaining coupling locations remain unexposed.
  • the protective group 62 of the oligonucleotide building block 60 at the coupling site 41 is activated by the exposure (cf. FIG. 2f, shown as blackening of the protective group 62).
  • the oligonucleotide module 60 is covalently connected to the further oligonucleotide module 70 (cf. FIG. 2g).
  • the nucleic acids of the other coupling sites 44, 47 are extended, so that, as a result, dinucleotides at all three coupling sites 41, 44, 47 are covalently linked to the respective coupling substances 40, 43, 46. Since each terminal nucleotide bears a photosensitive protecting group, the synthesis can be continued at each of the coupling sites 41, 44, 47. Before carrying out hybridization reactions, it may be necessary to remove the terminal protective groups, for example by exposure.
  • 3a shows schematically (as a serpentine line) any oligonucleotide 100 connected to the coupling substance 40, as can be obtained after carrying out the method according to the invention in accordance with FIGS. 2a-h.
  • a second oligonucleotide 105 hybridized with the oligonucleotide 100 is shown schematically in FIG. 3b.
  • the sample solution containing the oligonucleotide 105 will comprise further oligonucleotides which, with sufficiently stringent hybridization conditions, cannot hybridize stably with the oligonucleotide 100 (not shown).
  • the other (non-hybridizing) oligonucleotides like the oligonucleotide 105, will often comprise a photodetectable group 106 and must therefore be washed out before detection in order to avoid incorrect measurements.
  • the photodetectable group 106 will often be a fluorescent dye, the fluorescence of which can be detected in the usual way.
  • photodetectable groups covalently linked to an oligonucleotide
  • double-strand-recognizing dyes such as DAPI (4 ', 6-diamino-2-phenylind123l) or ethidium bromide could also be used as photodetectable groups.
  • a photodetectable group could also comprise a biomolecule (enzyme, antibody or the like) which, together with a respective substrate, generates, for example, a colored precipitate, a fluorescence or luminescence signal.
  • suitable dyes and photodetectable groups the person skilled in the art can use the "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", available from Molecular Probes Inc., as a guide.
  • a detection process is shown schematically in FIG. 3c.
  • Light 55 is irradiated onto the photodetectable group 106.
  • Fluorescence light 56 is then emitted from the photodetectable group 106. This has a longer wavelength than the incident light 55.
  • the light 56 is optically collected and measured (not shown) and used in the usual way to evaluate the hybridization reaction.
  • the evaluation optics is set up in such a way that, after the evaluation at a first evaluation position (coupling locations), the disk rotates and / or the disk and the evaluation optics move in the radial direction relative to one another can be carried out in order to direct the evaluation optics to a further evaluation position (a further coupling location).
  • the evaluation is then carried out in a manner analogous to the generation of the oligonucleotide array, cf. Fig. 1.
  • FIG. 4a shows a multi-part carrier disk 1 according to the invention, which comprises a microarray chip 2 and an adapter element 3.
  • the microarray chip is positively fitted into a recess (not shown separately in FIG. 4a) in the adapter element and is flush with the surface of the adapter element.
  • a recess not shown separately in FIG. 4a
  • the adapter element 3 there is also a free recess 4 for receiving a further microarray chip with the same dimensions.
  • FIG. 4b shows the adapter element 3 and the microarray chip 2 in cross section along the line A-B from FIG. 4a, the connection between these two components, however, being shown as detached.
  • the microarray chip 2 is a commercially available glass slide (25 x 76 mm) on which a defined microarray (microarray) of oligonucleotides is fixed in the usual way.
  • the microarray chip 2 is of essentially rectangular shape and, as can be seen in particular from FIG. 4b, can be positively inserted into each of the two corresponding recesses 4 of the disk-shaped adapter element 3 (in the direction of the arrow in FIG. 4b).
  • the dimensions of the carrier disk 1 composed of adapter element 3 and microarray chip 2 correspond to those of a commercially available CD.
  • the adapter element 3 is described outside the area of the recess 4 with information that can be read in a manner known from CD or DVD technology. See, for example, L. Boden, Mastering CD-ROM Technology, John Wiley & Sons (1995), ISBN 0-471-12174-6 for an overview of relevant techniques for describing and reading out information in CD format.

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Abstract

Beschrieben werden Mittel und Verfahren zur Durchführung chemischer und biologischer Assays. Insbesondere wird eine Träger-Disk (1) beschrieben, umfassend ein Adapterelement (3) und ein Funktionselement (2). Bei dem Funktionselement (2) kann es sich um ein (a) Substrat-Element zur Aufnahme einer Anordnung biologischer oder chemischer Substanzen, und/oder (b) ein Mikrofluidik-Element mit einer Kanalstruktur zum Transportieren fluider Medien, und/oder (c) ein Daten-Element zum Speichern und/oder Auslesen von Daten in maschinenlesbarer Form handeln. Ferner wird ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonucleotid-Arrays auf einer solchen Träger-Disk (10) beschrieben, wobei auf einer Untersuchungsseite (11) Kupplungsorte vorgesehen sind, an denen die Oligonucleotide seriell mit der Disk verknüpft werden. Der Oligonucleotid-Array kann in Hybridisierungs-Assays verwendet werden. Zum Herstellen des Arrays wird die Disk rotiert und/oder werden Lichtquelle und Disk in radialer Richtung relativ zueinander verschoben. Die Auswertung eines Hybridisierungs-Assays erfolgt auf analoge Weise.

Description

Mittel und Verfahren zur Durchführung chemischer und biologischer Assays
Die Erfindung betrifft Mittel und Verfahren zur Durchführung chemischer und biologischer Assays.
Mit dem Fortschreiten der molekulargenetischen Kenntnisse, beispielsweise im Human Genome Project, ist ein rasches Anwachsen der Zahl bekannter DNA-Sequenzen verbunden. Mit den gewonnenen Sequenz-Informationen lassen sich spezifische Nucleinsäuren (DNA, RNA oder chemisch modifizierte Nucleinsäuren) herstellen, mit denen in Hybridisierungs-Verfahren beispielsweise pathogene Bakterien oder das Vorliegen von Mutationen (Gen-Diagnostik) detektiert und gegebenenfalls identifiziert werden können. Es besteht daher ein Bedarf an technisch einfachen, möglichst preiswerten, standardisierbaren und in ihrer Aussagequalität konstanten Verfahren zum Hybridisieren von Nucleinsäuren und zum qualitativen und vorzugsweise quantitativen Auswerten von Nucleinsäure- Hybridisierungsversuchen. Insbesondere besteht ein Bedarf an Verfahren und Mitteln zum automatisierten Durchführen und Auswerten von high-throughput-Untersuchungen, bei denen parallel mehrere hundert oder tausend Nucleinsäure-Hybridisierungen durchgeführt und qualitativ und/oder quantitativ ausgewertet werden. Parallel hierzu besteht ein Bedarf an technisch einfachen, möglichst preiswerten, standardisierbaren und in ihrer Beschaffenheit konstanten Mitteln zum Vorbereiten und Durchführen solcher Verfahren.
Auch auf anderen Gebieten der Chemie, der Mikro- und der Molekularbiologie wird ein rascher Erkenntnisgewinn angestrebt. Dies betrifft insbesondere die Beschreibung und Quantifizierung von Eigenschaften und Wechselwirkungen biologischer oder chemischer Substanzen. Solche Substanzen können insbesondere biologische Materialien wie Gewebe und Zellkulturen eukaryontischer und prokaryontischer sowie archaebakterieller Zellen sein, aber auch Extrakte oder Homogenate biologischer Materialien, Zellorganellen, Proteine, Fette und Fettsäuren, Enzyme, Rezeptoren (insbesondere zelloberflächen-gebundene Rezeptoren), Botenstoffe, Nucleinsäuren und kleiner Moleküle wie Glucose, Fructose, Lactat, Glutamat und dergleichen mehr.
Beispielsweise werden wegen der hohen Aussagesicherheit von Hybridisierungs- Assays Anstrengungen unternommen, durch Automatisierung und Miniaturisierung eine möglichst hohe Anzahl von Proben und Sonden in möglichst kurzer Zeit untersuchen zu können.
Häufig wird dabei auf einem festen Träger eine Nucleinsäure, zumeist die Sonde, immobilisiert oder gleich an Ort und Stelle synthetisiert. Im letzteren Fall wird zunächst ein Startmolekül als Kupplungssubstanz, beispielsweise ein sogenannter Spacer oder Linker wie beispielsweise Bernsteinsäure oder Aminopropyl-Spacer, auf der Träger-Oberfläche fixiert. Um an unterschiedlichen Orten auf dem Träger unterschiedliche Nucleinsäuren synthetisieren zu können, ist eine ortsabhängige, gesteuerte Reaktionsführung notwendig.
Insbesondere hat sich ein Synthese-Verfahren nach Fodor et ai, Science 251, 767 (1991) etabliert, bei dem die benötigten Synthese-Bauelemente, nämlich Linker und einzelne Nucleoside, jeweils mit photolabilen Schutzgruppen ausgestattet sind. Beispiele für solche Schutzgruppen werden insbesondere von W. Pfleiderer in "Biophosphates and Their Analogues - Synthesis, Structure, Metabolism and Activity", Elsevier (Amsterdam) 1987 angegeben.
Die zunächst auf dem Träger fixierten (geschützten) Linker-Moleküle werden an den Orten, an denen ein Syntheseschritt stattfinden soll, belichtet, wodurch dort die photolabilen Linker-Schutzgruppen entfernt und die Linker entschützt werden. Dann wird eine Lösung hydroxyl-geschützter (Desoxy-)Nucleoside appliziert. Diese werden an den photochemisch entschützten Linkern kovalent gebunden. Die nicht gebundenen Nucleoside werden vom Träger abgewaschen. Anschließend werden die ortsabhängige Belichtung (Entschützung weiterer Linker und/oder bereits angelagerter Nucleosid-Bauelemente) und die Zugabe von (weiteren) Nucleosid-Bauelementen (mit jeweils vorbestimmten Basen) so oft wiederholt, bis an jedem Kupplungsort des Trägers die Synthese abgeschlossen ist. Als Ergebnis liegt dann auf dem Träger ein Nucleinsäure-Array vor. Üblicherweise sind die an den Kupplungsorten erzeugten, fixierten Oligonucleotide zwischen 6 und 30 Basen lang. Im Rahmen dieser Erfindung werden unter dem Begriff "Oligonucleotid" aber auch längere, z.B. 200 Basen lange Nucleinsäuren oder Polynucleotide, beispielsweise ganze Chromosomen, verstanden.
Moderne Geräte, mit denen das Verfahren nach Fodor et al. durchgeführt wird, verwenden Silizium-Chips, auf denen mit Hilfe von Photolithographie-Belichtungstechniken mehrere Zehntausend unterschiedliche Nucleinsäuren pro Chip synthetisiert werden. Diese Geräte sind jedoch, beispielsweise wegen der Reinheits- und Präzisionsanforderungen der Chip-Technik und der Photolithographie, in Anschaffung und Betrieb sehr teuer, so dass sie nur für wenige große Firmen in Frage kommen. Außerdem besteht die Gefahr, dass mit einer einzigen Fehlbelichtung, beispielsweise durch eine im Bezug zum Träger-Chip minimal falsch ausgerichtete photolithographische Maske, alle auf dem Chip hergestellten Nucleinsäuren eine falsche Basenfolge besitzen und der gesamte Chip dadurch unbrauchbar ist.
Dementsprechend gibt es auch auf anderen Gebieten der Chemie, der Mikro- und der Molekularbiologie allgemein einen Bedarf an technisch einfachen, möglichst preiswerten, standardisierbaren und in ihrer Aussagequalität konstanten Analyseverfahren zur Untersuchung biologischer oder chemischer Substanzen und ihrer Wechselwirkungen, insbesondere in Form von automatisierten high-throughput-Analyseverfahren, bei denen mehrere hundert oder tausend Substanzen oder Substanz-Wechselwirkungen parallel untersucht und qualitativ und/oder quantitativ ausgewertet werden. Hierzu werden technisch einfache, möglichst preiswerte, standardisierbare und in ihrer Beschaffenheit konstante Mitteln zum Vorbereiten und Durchführen solcher Verfahren benötigt.
Zum Vorbereiten und Durchführen solcher Analyseverfahren wird erfindungsgemäß eine Träger-Disk angegeben, umfassend ein Funktionselement und ein zum Verbinden mit dem Funktionselement angepasstes Adapterelement, wobei das Funktionselement umfasst: (a) ein Substrat-Element zur Aufnahme einer Anordnung biologischer oder chemischer Substanzen, und/oder
(b) ein Mikrofluidik-Element mit einer Kanalstruktur zum Transportieren fluider Medien, und/oder
(c) ein Daten-Element zum Speichern und/oder Auslesen von Daten in maschinenlesbarer Form.
Durch das Vorsehen eines Adapterelements ist es vorteilhafterweise möglich, die Funktionselemente von der Träger-Disk selbst zu trennen. Dadurch wird es auch möglich, unterschiedliche Funktionselemente zu einer Träger-Disk zu vereinigen, wobei die unterschiedlichen Funktionselemente auch unterschiedlich (vor-)behandelt werden können.
Bei der erfindungsgemäßen Träger-Disk handelt es sich vorzugsweise um eine flache, im wesentlichen kreisförmige Scheibe. Bei solchen Disks ist es sehr einfach, den Schwerpunkt für eine unwuchtarme Rotationsbewegung zu bestimmen. Daher ist es möglich, eine Träger-Disk besonders schnell, mit hoher Präzision und vibrationsarm durch Rotation zu bewegen und gegebenenfalls zur Analyse in einem Lesegerät (dazu unten mehr) auszurichten. Im Rahmen dieser Beschreibung gelten dabei solche Disks als flach, bei denen das Verhältnis von Höhe zu Durchmesser des Umfangskreises kleiner oder gleich 1:10 ist.
Die Träger-Disk ist nicht auf die im wesentlichen kreisförmige Form beschränkt, sondern kann auch eine andere Form haben. Vorzugsweise wird sie jedoch symmetrisch sein, so dass die soeben geschilderten Vorteile verwirklicht werden können.
Vorzugsweise umfaßt die Träger-Disk eine zentral angeordnete Ausnehmung. Dadurch wird es besonders erleichtert, die Disk auf einem Drehteller zur Rotation auszurichten und zu fixieren. Die zentrale Ausnehmung wird häufig kreisförmig sein, kann aber auch eine andere Ausgestaltung haben. Letzteres kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn eine exakte Ausrichtung der Disk auf dem Drehteller, beispielsweise wegen des Vorhandenseins besonderer Disk-Elemente (wie elektrischer Kontakte) oder zur Verhinderung minimaler Relativ-Verschiebungen von Disk und Drehteller, erwünscht ist. Der Drehteller besitzt dann eine komplementär zur Ausnehmung ausgestaltete Halteeinrichtung zum Eingriff in die Ausnehmung. Vorzugsweise entspricht die Träger-Disk in ihrem Außendurchmesser und gegebenenfalls dem Durchmesser der zentralen Ausnehmung einer herkömmlichen Langspielplatte (LP), Compact Disk (CD), DVD oder Minidisk. Bei diesen Abmessungen kann zur Rotation der Disk auf die zum Abspielen herkömmlicher LPs oder CDs entwickelte Antriebstechnik zurückgegriffen werden, was die Fertigung des Rotations-Antriebssystems für die Träger-Disk erleichtert.
Ein im Rahmen der Erfindung einsetzbares Substratelement ist eingerichtet zur Aufnahme einer Anordnung biologischer oder chemischer Substanzen. Die Anordnung kann insbesondere eine regelmäßige Anordnung einer solchen Substanz sein (Array), aber auch eine regelmäßige Anordnung beliebiger, insbesondere voneinander unterschiedlicher, Substanzen (Panel). In der Anordnung können auch eine oder mehrere Substanzen als Einzelpunkte, flächig oder in einem Kanal verteilt vorliegen, wobei gegebenenfalls ein Konzentrationsgradient einer oder mehrerer Substanzen in der Fläche oder in dem Kanal vorgesehen ist. Soweit nachfolgend in der Beschreibung oder den Patentansprüchen von einem Array die Rede ist, wird damit eine beliebige Anordnung biologischer oder chemischer Substanzen bezeichnet, insbesondere eine der zuvor beschriebenen Anordnungen.
Vorzugsweise umfasst die Träger-Disk Bereiche, auf denen Daten in maschinenlesbarer Form, vorzugsweise digital, gespeichert und/oder ausgelesen werden können. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Träger-Disk so eingerichtet ist, dass gemäß den allgemeinen Prinzipien der CD-Technik mittels einer (Laser-)Lichtquelle ein Beschreiben der Disk mit digitalen Daten und/oder ein Auslesen digitaler Daten von der Disk möglich ist. Die digitalen Daten können dabei insbesondere ein Computerprogramm zur Steuerung eines Lesegeräts für eine Träger-Disk und/oder zum Auswerten einer mit Funktionselementen des Typs (a) und/oder (b) bestückten Träger-Disk sein; sie können aber auch beispielsweise Messwerte beim Auslesen der Funktionselemente des Typs (a) und/oder (b) oder sonstige, im Zusammenhang mit einer Träger-Disk stehende Daten sein.
Die Bereiche maschinenlesbarer Daten befinden sich vorzugsweise auf einem Daten-Element. Solche Daten-Elemente können beispielsweise in der Form von Minidisks mit herkömmlichen Verfahren einfach und in großer Stückzahl hergestellt werden. Auf diese Weise kann die Herstellung von Adapterelementen und die Herstellung der Bereiche maschinenlesbarer Daten vorteilhaft getrennt werden, so dass die Adapterelemente auch aus Materialien und mit Hilfe von Verfahren herstellbar sind, die zur Herstellung von Bereichen maschinenlesbarer Daten nicht oder nur mit Schwierigkeiten einsetzbar sind. Werden Bereiche maschinenlesbarer Daten von den Funktionselementen der Typen (a) und (b) räumlich getrennt, so können diese Funktionselemente auch Behandlungen unterzogen werden, die ansonsten die Lesbarkeit oder Beschreibbarkeit der Bereiche maschinenlesbarer Daten gefährden oder beeinträchtigen können.
Besonders bevorzugt ist es, wenn die Träger-Disk im zusammengebauten Zustand mehrere Funktionselemente umfasst. Die Funktionselemente müssen dabei nicht alle vom gleichen Typ sein, es können auch Funktionselemente mehrerer Typen kombiniert werden. Indem mehrere Funktionselemente zu bzw. auf einer Träger-Disk kombiniert werden können ist es möglich, einzelne Funktionselemente zunächst separat vorzubehandeln und anschließend zu einer handhabbaren Einheit zusammenzufassen.
Ebenfalls ist es bevorzugt, wenn das Substrat-Element ein Mikroarray-Chip (insbesondere mit Kunststoff-, Glas- oder Silizium-Grundkörper), ein Glas-Objektträger, ein Papierträger (beispielsweise Filterpapier oder ein beschichtetes Papier) oder eine Membran (Folie, insbesondere Blotting-Membranen wie Nitrocellulose-, Nylon- oder Polyvinylidenfluorid-(PVDF)-Membranen) ist. Solche Materialien finden bereits jetzt bei der Untersuchung biologischer oder chemischer Substanzen und ihrer Wechselwirkungen Verwendung und sind dementsprechend in ihrer Handhabung dem Fachmann vertraut.
Ein bevorzugtes Beispiel für ein solches Substrat-Element des Typs Mikroarray-Chip sind rechteckige Objektträger aus Glas mit für die Anhaftung von biologischen oder chemischen Substanzen vorbereiteter (aktivierter) Oberfläche.
Das oder die Funktionselemente lassen sich (vorzugsweise lösbar) mit dem Adapterelement verbinden, welches im Verbundzustand gemeinsam mit ihm bzw. ihnen die Träger-Disk bildet. Die Art der Verbindung von Adapterelement und Funktionselement(en) kann dabei, jeweils mit dem Ziel einer guten Handhabbarkeit des Trägerdisk-Ensembles, unterschiedlich sein. Das oder die Funktionselemente können formschlüssig, reibschlüssig, kraftschlüssig oder stoffschlüssig mit dem Adapterelement verbunden sein. Beispielsweise kann ein jeweiliges Funktionselement in eine seiner Form angepaßte durchgehende Öffnung im Adapterelement oder in Vertiefung in dessen Oberfläche eingepaßt, eingelegt, eingeklemmt oder eingeklebt werden oder auf die Oberfläche eines scheibenförmigen Adapterelements geklebt oder geklemmt werden.
Zum Abdichten der Kanalstruktur eines Mikrofluidik-Elements im zusammengebauten Zustand der Träger-Disk wird zweckmäßigerweise das Adapterelement und/oder ein oder mehrere weitere Funktionselemente verwendet. Auf diese Weise ist es möglich, auf gegebenenfalls aufwendige Abdichteinrichtungen zu verzichten und das Abdichten von Kanalstrukturen sicherzustellen.
Ferner ist eine Träger-Disk bevorzugt, die eine oder mehrere Positionsmarkierungen zu Identifizierungs-, Steuerungs- und/oder Auswertezwecken umfasst, wobei die Positionsmarkierungen aufgebracht sind auf der Mantelfläche und/oder der Oberfläche der Träger- Disk.
Bevorzugt sind ferner Adapterelement oder Funktionselement zur Verwendung in einer Träger-Disk (1 ) nach einer der beschriebenen Arten.
Zur Erzeugung einer Oligonucleotid-Anordnung wird beispielsweise ein Verfahren mit folgenden Schritten bevorzugt: a) Bereitstellen einer Träger-Disk mit (zumindest) einer Untersuchungsseite, auf der an einer Anzahl von Kupplungsorten photochemisch aktivierbare Kupplungssubstanzen zur jeweiligen Fixierung eines Oligonucleotids oder Oligonucleotid- Bauelements (z.B. ein mit Schutzgruppen versehenes Nucleosid) angeordnet sind und einer Lichtquelle zur selektiven photochemischen Aktivierung der Kupplungssubstanzen an einzelnen Kupplungsorten, b) Verkuppeln der Kupplungssubstanz an einem ersten Kupplungsort mit einem Oligonucleotid oder Oligonucleotid-Bauelement, indem das Oligonucleotid bzw. Oligonucleotid-Bauelement auf zumindest den ersten Kupplungsort appliziert, die Lichtquelle auf den ersten Kupplungsort gerichtet und die Kupplungsverbindung am ersten Kupplungsort durch Beleuchten mit der
Lichtquelle aktiviert wird, c) Rotieren der Disk und/oder Verschieben von Lichtquelle und Disk in radialer Richtung relativ zueinander, um die Lichtquelle auf einen weiteren Kupplungsort zu richten.
Besonders wichtig ist dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Träger-Disk gemäß Schritt c) zwischen zwei Kupplungsorten (Syntheseschritten) rotiert wird. Durch diese Verfahrensführung wird nämlich auf vorteilhafte Weise nicht nur eine technisch einfach zu realisierende Bewegung des Trägers erreicht, sondern zusätzlich auch die Möglichkeit eröffnet, durch Fliehkräfte mechanisch einfach und unmittelbar auf die üblicherweise in flüssiger Darreichungsform (als Lösung oder Suspension) applizierten Oligonucleotide bzw. Oligonucleotid-Bauelemente einzuwirken.
Beispielsweise können unter der Wirkung von Fliehkräften sehr leicht Flüssigkeitstropfen auf der Träger-Disk-Oberfläche und/oder der Oberfläche eines in ein Adapterelement eingepassten Mikrofluidik-Elements radial verschoben oder ganz vom Träger abgeschleudert werden. Letzteres ist bei den in Synthese- und Hybridisierungsverfahren üblicherweise notwendigen Waschschritten von besonderem Vorteil. Durch das Vorsehen besonderer Oberflächenstrukturen, beispielsweise Kanäle oder durch besonders beschichtete, hydrophile bzw. hydrophobe Bereiche der Trägeroberfläche kann bei einer Rotation die aufgrund der Fliehkraft induzierte Radial-Beschleunigung einer Flüssigkeit auf der Träger-Disk (dem Mikrofluidik-Element) in eine Bewegung auf einer Kreis- oder Spiralbahn um die Rotationsachse umgesetzt werden. Insgesamt führen diese Vorteile dazu, dass in dem erfindungsgemäßen Verfahren zumindest weitgehend auf Pipetten oder ähnliche Mittel verzichtet werden kann, mit denen ansonsten Flüssigkeiten von Träger-Oberflächen abgesaugt werden können.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren zum Erzeugen einer Anordnung eingesetzte Träger-Disk besitzt auf einer Untersuchungsseite eine Anzahl von Kupplungsorten, an denen photochemisch aktivierbare Kupplungssubstanzen zur jeweiligen Fixierung eines Oligonucleotids oder Oligonucleotid-Bauelements angeordnet sind (vgl. Verfahrensschritt a). Die Kupplungssubstanzen sind dabei vorzugsweise übliche, photochemisch aktivierbare Linker/Spacer, wie sie beispielsweise auch von Fodor et al. eingesetzt werden. Die Photo- Reaktionsmechanismen dieser Kupplungssubstanzen sowie ihre Herstellung sind dem Fachmann bekannt; er kann aus einer Reihe möglicher Stoffe diejenigen auswählen, die seinen speziellen Bedürfnissen am besten entsprechen. Anstelle üblicher Linker/Spacer können auch mit Schutzgruppen versehene, verlängerbare Nucleoside oder Oligonucleotide auf dem Fachmann bekannte Weise direkt mit dem Trägermaterial verknüpft sein und als Kupplungssubstanz dienen.
Die Kupplungsorte können auf der Träger-Disk vorbestimmt sein, indem nur bestimmte, räumlich gegeneinander abgegrenzte Bereiche der Untersuchungsseite (Mikrochemotope) mit Kupplungssubstanz beschichtet sind. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn auf der (zumindest einen) Untersuchungsseite (insbesondere eines Mikrofluidik-Elements) besondere Oberflächenstrukturen wie Mikrokanäle oder Reaktions- Ausnehmungen (wells, Kavitäten) vorgesehen sind. Die benötigte Menge an Kupplungssubstanz oder -Substanzen zur Herstellung der gemäß Verfahrensschritt a) bereitzustellenden Träger-Disk kann dann sehr gering sein.
Alternativ kann die Untersuchungsseite auch einen zusammenhängenden Bereich besitzen, der überall mit Kupplungssubstanz beschichtet ist, und von dem Teilbereiche als Kupplungsorte verwendet werden. In diesem Falle werden die Kupplungsorte vorzugsweise nicht bereits bei der Herstellung der Disk genau vorbestimmt, sondern werden erst bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens definiert. Da dann bei der Herstellung der Träger-Disk die genaue Lage der Kupplungsorte noch nicht berücksichtigt werden muß, ist die Herstellung solcher Träger besonders einfach.
Zumindest an den Kupplungsorten (als Basis für die photochemisch aktivierbaren Kupplungssubstanzen) besitzt die Disk vorzugsweise eine Glas- oder Kunststoff-Oberfläche, da an solchen Oberflächen zahlreiche Festphasen-Synthesereaktionen und Hybridisierungs- reaktionen besonders einfach durchgeführt werden können. Alternativ kann jedoch auch Silizium die Basis für die Kupplungsorte bilden. Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Erzeugen einer Oligonucleotid-Anordnung ist zumindest die Kupplungssubstanz am ersten Kupplungsort, vorzugsweise aber auch jede der Kupplungssubstanzen an den weiteren Kupplungsorten, mit einer Schutzgruppe versehen, welche durch Beleuchten mit der Lichtquelle so entfernbar ist, dass eine ungeschützte (aktivierte) Kupplungssubstanz entsteht, die in definierter Weise mit dem Oligonucleotid bzw. Oligonucleotid-Bauelement kuppeln kann. Dem Fachmann sind eine Reihe geeigneter Schutzgruppen bekannt, mit denen das erfindungsgemäße Verfahren einfach durchgeführt werden kann.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Lichtquelle zur selektiven photochemischen Aktivierung der Kupplungssubstanzen ist vorteilhafterweise eine zur photochemischen Aktivierungen der Kupplungssubstanzen (und gegebenenfalls zur Aktivierung auf entsprechende Weise aktivierbarer Oligonucleotide und/oder Oligonucleotid- Bauelemente) eingerichtete Laser-Lichtquelle. Laserlicht hat den Vorteil, dass es nur einen eng begrenzten, auf die betreffende Photoreaktion abgestimmten Wellenlängenbereich umfaßt, gut fokussierbar ist und dabei auf dem Fachmann bekannte Weise preiswert erzeugt werden kann.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn im erfindungsgemäßen Verfahren photoaktivierbare Substanzen (z.B. mit Schutzgruppen versehene Linker, Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Bauelemente) verwendet werden, die durch das Licht herkömmlicher, in CD- oder DVD-Lese- und/oder -Schreibgeräten verwendeten Laser-Lichtquellen aktiviert werden können.
Es kann notwendig sein, bei der Synthese mehr als eine Laser-Lichtquelle zu verwenden, beispielsweise wenn für unterschiedliche Photo-Reaktionen jeweils unterschiedliche Wellenlängen benötigt werden.
Die Lichtquelle wird erfindungsgemäß nacheinander auf verschiedene Kupplungsorte gerichtet. Die jeweilige Ausrichtung kann dabei beispielweise über ein Lichtleitsystem mit Spiegeln oder über optisch leitfähige Kabel wie Glasfaserkabel erfolgen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn eine oder mehrere benötigte Lichtquellen zu sperrig oder zu massiv sind, um selbst sowohl schnell als auch exakt radial gegenüber der Träger- Disk verschoben zu werden. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird gemäß Schritt b) an einem ersten Kupplungsort die dort vorliegende Kupplungssubstanz mit einem Oligonucleotid oder Oligonucleotid-Bauelement verkuppelt; in Folgeschritten können weitere Bauelemente angekuppelt werden. Es gibt eine Reihe von Verfahren zur präparativen Synthese von Nucleinsäuren unter Einsatz von Bauelementen mit photochemischen Schutzgruppen, derer sich der Fachmann auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedienen kann. Auf das Synthese-Verfahren nach Fodor et al. wurde bereits hingewiesen. Mit fortschreitender Entwicklung der Oligonucleotid-Synthese-Chemie werden dem Fachmann weitere Methoden zur Verfügung gestellt werden, die dann auch (gegebenenfalls in angepaßter Form) im erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen können.
Zur Applikation der Oligonucleotide oder Oligonucleotid-Bauelemente - in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens und entsprechenden Folgeschritten - werden vorteilhafterweise Dispensiereinrichtungen wie (Mikro-)Pipetten, die dem Fachmann zur Applikation kleiner Flüssigkeitsmengen bekannt sind, verwendet. Solche Pipetten haben eine hohe Abmeßgenauigkeit.
Anstelle herkömmlicher Pipetten können auch Kombinationen aus feinen Düsen und Druckimpuls-Elementen eingesetzt werden, z.B. Piezo-Elemente ähnlich den in Tintenstrahl- Druckerköpfen verwendeten Systemen. Diese Systeme bieten insbesondere den Vorteil, dass auch kleinste Flüssigkeitsmengen im Mikro- und Nanoliter-Bereich mit hoher Genauigkeit unter Verwendung einer geringen Zahl beweglicher Bauteile selektiv auf kleine Zielflächen (beispielsweise mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm) appliziert werden können.
Außerdem oder alternativ dazu können die gegebenenfalls auf der Disk-Oberfläche und/oder in einem Mikrofluidik-Element vorgesehenen besonderen Oberflächenstrukturen wie Kanäle, Kavitäten und dergleichen derart als Appiizierhilfen ausgestaltet sein, dass bei (ausreichend schneller) Rotation des Trägers durch das Zusammenwirken von Fliehkraft und Oberflächengestaltung Flüssigkeiten von einer Startposition aus gezielt zu einzelnen Kupplungsorten hin befördert werden können. Eine Flüssigkeit mit einem zu applizierenden Oligonucleotid oder Oligonucleotid-Baustein kann dann in einer Startposition in einiger Entfernung vom entsprechenden Kupplungsort auf die Träger-Disk aufgetragen und durch die bei der Disk-Rotation wirkenden Kräfte entlang einer von der Oberflächenstruktur vorgegebenen Bahn zum Kupplungsort transportiert werden.
Die Synthese-/Kuppiungsreaktionen können unter einer transparenten Schicht in einem abgegrenzten Volumen, beispielsweise in einer röhrenförmigen Kanalstruktur oder in einer abgedeckten Kammer (z.B. in einem Mikrofluidik-Element), durchgeführt werden. Bei Vorgabe derartiger Strukturelemente kann das spätere Reaktionsvolumen bereits bei der Herstellung der Träger-Disk definiert werden. Die Kupplungs- und Synthesereaktion kann dann mit Zugabe eines Überschusses der beteiligten Lösungen durchgeführt werden, wobei der überschüssige Rest beispielsweise in geeignete, auf der Träger-Disk vorzusehende Auffangkammern abgeführt werden kann. Dementsprechend muß bei einer solchen Begrenzung des Reaktionsvolumens die Abmeßgenauigkeit für die Applikation der beteiligten Lösungen lediglich ausreichend sein, um die Applikation jeweils eines Lösungs- Überschusses zu sichern; die exakte Dosierung wird dann durch die Strukturelemente der Träger-Disk vorgenommen.
Zudem verringert eine transparente Abdeckung, beispielsweise aus Glas oder Kunststoff, die Verdunstung von Flüssigkeiten am Kupplungsort.
Nach dem Verkuppeln am ersten Kupplungsort wird die Lichtquelle gemäß Schritt c) auf einen weiteren Kupplungsort ausgerichtet, indem gegebenenfalls die Disk rotiert bzw. die Lichtquelle radial gegenüber der Träger-Disk verschoben wird. Beide Bewegungen können auch gleichzeitig stattfinden. Nach der Neuanordnung von Lichtquelle und/oder Disk ist die Lichtquelle auf den weiteren Kupplungsort ausgerichtet, an dem dann auf die beschriebene Weise eine weitere photochemische Kupplungs-Synthese-Reaktion durchgeführt werden kann.
Vorteilhaft ist es, wenn mehr als zwei, vorzugsweise mehr als zehn Kupplungssubstanzen an verschiedenen Kupplungsorten zeitlich nacheinander (seriell) photochemisch aktiviert und mit einem jeweiligen Oligonucleotid oder Oligonucleotid-Bau-element verkuppelt werden, wobei zwischen je zwei photochemischen Aktivierungsschritten an verschiedenen Kupplungsorten die Disk rotiert und/oder Lichtquelle und Disk in radialer Richtung relativ zueinander verschoben werden, um die Lichtquelle auf den jeweils nächsten Kupplungsort zu richten. Auf vorteilhafte Weise kann so erreicht werden, dass ein großer Teil der auf dem Träger für Kupplungsreaktionen zur Verfügung stehenden Fläche genutzt wird. So können auf einer Träger-Disk ortsaufgelöst eine Vielzahl von Kupplungs-Synthesen durchgeführt werden.
Nachdem an allen gewünschten Kupplungsorten die jeweiligen Kupplungsreaktionen durchgeführt wurden, kann die Träger-Disk in schnelle Rotation versetzt werden, um die auf ihr befindlichen Flüssigkeitströpfchen abzuschleudern. Ein Abschleudern kann natürlich ebensogut nach jedem einzelnen Kupplungsschritt erfolgen. Waschfiüssigkeiten können auf den Träger appliziert und gegebenenfalls durch Rotation der Träger-Disk verteilt werden, und auch diese Flüssigkeiten können wiederum durch Rotation abgeschleudert werden.
Ferner ist ein Verfahren bevorzugt, bei dem eine aktivierte Kupplungssubstanz an einem oder, zeitlich nacheinander, aktivierte Kupplungssubstanzen an mehreren Kupplungsorten mit einem geschützten Nucleosid verkuppelt werden, welches anschließend seinerseits durch Beleuchten mit der Lichtquelle aktiviert werden kann. Durch die photochemische Aktivierung angekuppelter Nucleoside und ihre Umsetzung mit weiteren, lokal zugeordneten Nucleosiden, ist dann auf einfache Weise eine beliebige Verlängerung der Nucleotid-Kette möglich.
Die Erfindung betrifft auch eine Anlage zur Durchführung der beschriebenen Verfahren zur Herstellung eines Oligonucleotid-Arrays, wobei die Anlage umfaßt: eine Träger-Disk mit (zumindest) einer Untersuchungsseite, auf der an einer
Anzahl von vorbestimmten Kupplungsorten photochemisch aktivierbare
Kupplungssubstanzen zur Fixierung eines Oligonucleotids oder
Oligonucleotid-Bauelements angeordnet sind eine Lichtquelle zur selektiven photochemischen Aktivierung der
Kupplungssubstanzen an einzelnen Kupplungsorten, eine Adressiereinrichtung zum Rotieren der Disk und zum Verschieben von
Lichtquelle und Disk in radialer Richtung relativ zueinander, um die Lichtquelle auf einen vorgegebenen Kupplungsort auf der
Untersuchungsseite der Disk zu richten. Die durch verschiedene Gestaltungsmöglichkeiten der Anlage erzielbaren Vorteile wurden zuvor beschrieben.
Wie eingangs erwähnt betrifft die vorliegende Erfindung nicht ausschließlich ein Verfahren und eine Anlage zur Herstellung eines Oligonucleotid-Arrays, sondern auch ein Verfahren zur Durchführung eines Hybridisierungs-Assays, umfassend: a) das Bereitstellen einer auf erfindungsgemäße Weise mit einem Oligonucleotid-Array versehenen Träger-Disk und b) die Applikation von Nucleinsäuren (DNA, RNA oder deren Derivate) an zumindest einem Kupplungsort auf der Träger-Disk und das Einstellen ausreichend stringenter Hybridisierungsbedingungen.
Ein solches Verfahren ermöglicht vorteilhaft, eine Vielzahl von . Hybridi- sierungsreaktionen mit einer einzelnen Träger-Disk durchzuführen. Auf diese Weise können beispielsweise verschiedene, an der Träger-Disk gebundene Sonden mit einer Probe einer Nucleinsäure unbekannter Sequenz in Kontakt gebracht werden, um Aufschluß über die Sequenz der beprobten Nucleinsäure zu erhalten. Der Fachmann kann bei der Durchführung des Verfahrens geeignete Hybridisierungsbedingungen wählen, die er gegebenenfalls anhand üblicher Versuchsreihen bestimmen wird.
In der Regel wird bei der Durchführung des Assays eine optische Auswertung des Hybridisierungs-Resultats vorgenommen. In einer entsprechenden Anlage zur Auswertung eines Hybridisierungs-Assays kann eine Auswerteoptik vorgesehen sein, die vorzugsweise mit einer Adressiereinrichtung zusammenwirkt, die so eingerichtet ist, dass ein Rotieren der Disk und/oder ein Verschieben von Disk und Auswerteoptik in radialer Richtung relativ zueinander durchführbar ist, um die Auswerteoptik zwischen zwei Kupplungsorten (Auswertepositionen) zu verschieben. Nach der Auswertung an einer ersten Auswerteposition ist also ein Rotieren der Disk und/oder ein Verschieben von Disk und Auswerteoptik in radialer Richtung relativ zueinander durchführbar, um die Auswerteoptik auf eine weitere Auswerteposition (einen weiteren Kupplungsort) zu richten. Die optische Auswertung des Hybridisierungs-Resultats erfolgt somit auf eine dem Erzeugen des Oligonucleotid-Arrays analoge Weise, indem mittels der Auswerteoptik eine Detektion an einem ersten Kupplungsort vorgenommen wird, anschließend die Disk rotiert und/oder Disk und Auswerteoptik in radialer Richtung relativ zueinander verschoben werden, um die Auswerteoptik auf einen weiteren Kupplungsort zu richten, und dann an diesem weiteren Kupplungsort eine Detektion vorgenommen wird. Vgl. auch die nachfolgende Figurenbeschreibung.
Der Fachmann wird sich bei der Ausgestaltung der Anlagen zur Durchführung eines Oligonucleotid-Arrays und zur Auswertung eines Hybridisierungs-Assays insbesondere an der Ausgestaltung von Anlagen zum Beschreiben und Auslesen von optischen Datenträgern (CD, Minidisc, DVD) orientieren. In diesem Bereich der Technik ist in naher Zukunft ein großer Fortschritt zu erwarten, der auch die Ausgestaltung erfindungsgemäßer Anlagen beeinflussen wird.
Die Erfindung betrifft auch mehrteilige, ein Adapterelement und ein oder mehrere Substrat-Elemente umfassende Träger-Disks, wobei das Substrat-Element oder die Substrat-Elemente zur Aufnahme eines Arrays biologischer oder chemischer Substanzen ausgerüstet sind oder ein solches Array tragen. Die Träger-Disk kann dabei in einem ihrer Nutzzustände vorliegen, d.h. insbesondere in einem gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzeugung eines Oligonucleotid-Arrays bereitgestellten Zustand, d.h. mit bereits angeordneten Kupplungssubstanzen, aber vor der Erzeugung eines Oligonucleotid-Arrays, in einem (Roh-)Zustand vor der Anordnung von Kupplungssubstanzen (z.B. Spacer oder Linker), wobei auf der Träger-Disk aber bereits Kupplungsorte oder -regionen vorgesehen sind, die im Vergleich mit ihrer jeweiligen unmittelbaren Umgebung besonders gut zur Anbringung einer Kupplungssubstanz geeignet sind, im zur Durchführung eines Assays vorbereiteten Zustand, in dem die mehrteilige Träger-Disk mit einem Oligonucleotid-Array oder - für andere Untersuchungsaufgaben - mit einem Protein-Array, insbesondere Peptid-Array, oder mit einem Array anderer biologischer oder chemischer Substanzen (Zellen, Kohlenhydraten etc.), versehen ist oder im Zustand nach der Durchführung eines entsprechenden Assays, aber auch in entsprechenden Zwischenzuständen. Dementsprechend betrifft die Erfindung auch allgemein ein Verfahren zum Anbringen eines Arrays biologischer oder chemischer Substanzen auf einer Träger-Disk, wobei ein (oder mehrere) Substrat-Element(e) mit einem Adapterelement (und gegebenenfalls weiteren Bau- oder Funktionselementen) zu der Träger-Disk verbunden und zuvor oder anschließend auf dem (den) Substratelement(en) ein Array biologischer oder chemischer Substanzen angeordnet wird. Mit dem Array wird dann der molekularbiologische Assay durchgeführt.
Bei Verwendung mehrteiliger Träger-Disks, die (a) ein Adapterelement und (b) ein Substrat-Element mit für die Anhaftung von Kupplungssubstanzen vorbereiteter (aktivierter) Oberfläche umfassen, ist es möglich, mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung eines Oligonucleotid-Arrays z.B. rechteckige Chips (oder andere Substrat- Elemente wie Folien, Papiere etc.) mit einem Mikroarray zu versehen. Sämtliche Kupplungsorte der Träger-Disk sind dabei vorzugsweise im Bereich des oder der Substrat- Elemente angeordnet. Letztere können dann vom Adapterelement gelöst, einem Assay unterzogen und unter Einsatz handelsüblicher Substrat-Reader (Biochip-Analysegeräte) untersucht werden. Das Adapterelement einer derartigen mehrteiligen Träger-Disk ist hierbei nach Abtrennung des oder der Substrat-Elemente (z.B. Mikroarray-Chips) vorzugsweise zur neuerlichen Kombination mit frischen (bauartgleichen) Substrat-Elementen geeignet. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung läßt sich also die erfindungsgemäße Herstellung eines Oligonucleotid-Arrays (die sich regelmäßig insbesondere durch die Rotation der Träger-Disk auszeichnet) vorteilhaft mit den bereits bekannten Techniken zur Untersuchung nicht-rotationssymmetrischer, insbesondere rechteckiger Mikroarray-Chips kombinieren.
Wie erwähnt betrifft die Erfindung auch mehrteilige Träger-Disks aus Adapterelement und Substrat-Element(en), wobei das oder die Substrat-Elemente in einem zur Durchführung eines Assays vorbereiteten Zustand vorliegen und mit einem Oligonucleotid- Array oder einem Array anderer biologischer oder chemischer Substanzen versehen sind. Wie im vorstehenden Absatz beschrieben, können die Substrat-Elemente dabei unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Oligonucleotid-Array versehen worden sein. Es wird sich bei ihnen aber vorzugsweise um handelsübliche, insbesondere rechteckige Mikroarray-Chips (oder sonstige Substrat-Elemente der oben beschriebenen Typen) handeln, die auf herkömmliche (nicht-erfindungsgemäße) Weise mit einem Oligonucleotid-Array versehen wurden. Solche mehrteiligen, beispielsweise einen oder mehrere Mikroarray-Chips umfassenden Träger-Disks können dann dem erfindungsgemäßen Hybridisierungs-Assay unterzogen werden, bei dem Nucleinsäuren an zumindest einem Kupplungsort (auf dem oder den Chips der Träger-Disk) appliziert und ausreichend stringente Hybridisierungsbedingungen eingestellt werden. Hinsichtlich der Besonderheiten der Durchführung und insbesondere der Auswertung des Hybridisierungs- Assays wird auf die obigen Ausführungen verwiesen. Im Vergleich zwischen (a) der Auswertung von Hybridisierungs-Assays auf handelsüblichen Mikroarray-Chips unter Verwendung üblicher Chip-Reader und (b) der Auswertung von Hybridisierungs-Assays auf Mikroarray-Chips als Bestandteil einer erfindungsgemäßen mehrteiligen Träger-Disk unter Verwendung moderner CD- oder DVD-Lesetechnik liegen die Vorteile eindeutig auf Seiten der mehrteiligen Träger-Disks, denn mit den modernen Lesetechniken aus dem CD- und DVD-Bereich läßt sich eine sehr viel bessere Ortsauflösung erreichen als selbst mit den modernsten Chip-Readern. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung werden also auf herkömmliche Weise mit einem Oligonucleotid-Array versehene Mikrochips unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lehren bzw. Techniken in Assays eingesetzt und ausgewertet.
Es ist natürlich auch möglich, ein oder mehrere herkömmliche Mikroarray-Chips (oder andere Substrat-Elemente der genannten Typen) auf übliche (nicht-erfindungsgemäße) Weise in einem Hybridisierungs- oder sonstigen Assay einzusetzen und erst zur Auswertung mit einem Adapterelement zu einer Träger-Disk zu verbinden. Die Auswertung erfolgt dann auf die zuvor beschriebene Weise.
Zur Auswertung eines Hybridisierungs-Assays ist ein Lesegerät bevorzugt, umfassend
Aufnahmemittel für eine Träger-Disk, die eine Untersuchungsseite besitzt, auf der an einer Anzahl von vorbestimmten Kupplungsorten Oligonucleotide zur Durchführung eines Hybridisierungsassays angeordnet sind, eine Adressiereinrichtung, die so eingerichtet ist, dass ein Rotieren der Träger-Disk und/oder ein Verschieben von Träger-Disk und Auswerteoptik in radialer Richtung relativ zueinander durchführbar ist, um die Auswerteoptik zwischen zwei Kupplungsorten zu verschieben, und einen Detektor zur Detektion von Hybridisierungen. Vorzugsweise ist der Detektor ein optischer Detektor oder ein Magnetsensor. Das Lesegerät kann dabei insbesondere ein vom Detektor verschiedenes Mittel zum Lesen von auf der Träger-Disk gespeicherten Daten umfassen.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und den anhand der beigefügten Figuren näher erläuterten Ausführungsbeispielen der Erfindung. Es stellen dar:
Fig. 1 eine perspektivische schematische Darstellung einer photochemischen Aktivierung in einem erfindungsgemäßen Verfahren
Fig. 2a-h eine schematische Darstellung der Synthesevorgänge in einem erfindungsgemäßen Verfahren
Fig. 3a-c eine schematische Darstellung einer Hybridisierungs- und Nachweisreaktion an einem Kupplungsort nach Fig. 2a-h
Fig. 4a eine Draufsicht auf eine mehrteilige Träger-Disk mit einem Adapterelement und einem rechteckigen Mikroarray-Chip
Fig. 4b eine Querschnitt-Ansicht des Adapterelements und des Mikroarray-
Chips aus Fig. 4a in nicht verbundener Anordnung.
In Fig. 1 ist eine Disk 10 dargestellt. Die Disk 10 hat eine im wesentlichen kreisförmige Grundfläche mit einer zentral angeordneten, ebenfalls im wesentlichen kreisförmigen Ausnehmung 12. Die Disk ist flach, wobei ihre Dicke erheblich kleiner (etwa 1 :30 - 1 :120) als ihr Durchmesser ist.
Auf der Disk-Oberseite (Untersuchungsseite) 11 sind zwanzig Kupplungsorte 20 angeordnet, die jeweils in ihrem Inneren lichtsensible (photochemisch aktivierbare) Kupplungssubstanzen umfassen (nicht dargestellt). Die Kupplungsorte 20 definieren zwei voneinander getrennte, konzentrische Ringe 15 und 16 (gestrichelt dargestellt), wobei der äußere Ring 15 zwölf und der innere Ring 16 acht Kupplungsorte umfaßt. Alternativ könnten die Kupplungsorte 20 auch auf andere Weise, beispielsweise auf einer oder mehreren Spiralbahnen, angeordnet sein. Die Zahl der Kupplungsorte 20 ist ebenfalls nicht festgelegt; der Fachmann erkennt, dass bei einer möglichst hohen Zahl von Kupplungsorten 20 die auf der Untersuchungsseite 11 zur Verfügung stehende Fläche besser ausgenutzt werden kann, so dass pro eingesetzter Disk mehr Synthese- und Hybridisierungsreaktionen durchgeführt werden können.
Die Kupplungsorte 20 sind in der dargestellten Ausführungsform kreisförmig, wobei es auf die genaue Form aber nicht ankommt. Ebensogut könnten dreieckige, rechteckige oder andere Formen gewählt werden.
Oberhalb der Disk 10 ist an einem parallel zur Oberfläche der Disk 10 verlaufenden Träger 35 eine Lichtquelle 30 angebracht, die nur schematisch wiedergegeben ist. Die Lichtquelle 30 ist vorzugsweise ein auf die lichtsensiblen Kupplungssubstanzen an den Kupplungsorten 20 abgestimmer Laser. In Fig. 1 ist ein von der Lichtquelle 30 ausgehender Lichtkegel 38 dargestellt, der auf einen Kupplungsort 20 eingestellt ist.
Neben der Lichtquelle 30 können Dispensiereinrichtungen (nicht dargestellt) wie (Mikro-)Pipetten oder dergleichen angeordnet sein, um Oligonucleotide oder Oligonucelotid- Bausteine auf die Kupplungssubstanzen an den Kupplungsorte 20 zu applizieren.
Die Disk 10 ist auf einem Drehteller (nicht dargestellt) rotierbar angeordnet (vgl. Pfeil 19). Die Lichtquelle 30 kann am Träger 35 entlang in Richtung des Pfeils 39 radial zur Disk 10 bewegt werden. Alternativ könnte die Disk 10 gegenüber der (dann stationären) Lichtquelle 30 radial (in Richtung des Pfeils 39) verschiebbar sein.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zunächst die Disk 10 und die Lichtquelle 30 bereitgestellt.
Anschließend wird eine photochemische Kupplungsreaktion am ersten Kupplungsort 20 durchgeführt, wobei zunächst Kupplungsort 20 und Lichtquelle 30 durch Rotation der Disk 10 in Richtung des Pfeils 19 und gegebenenfalls radiales Verschieben der Lichtquelle 30 entlang des Trägers 35 in Richtung des Pfeils 39 aufeinander ausgerichtet werden. Der erste Kupplungsort 20 wird hiernach mittels der Lichtquelle 30 belichtet, so dass die zugeordnete Kupplungssubstanz aktiviert wird und die Kupplungsreaktion zwischen Kupplungssubstanz und Oligonucleotid bzw. Oligonucleotid-Bauelement stattfinden kann.
Am ersten Kupplungsort 20 wird dann das Oligonucleotid oder Oligonucleotid- Bauelement appliziert (nicht dargestellt).
Anschließend wird an einem weiteren Kupplungsort 20' eine Kupplungsreaktion durchgeführt. Dieser liegt im dargestellten Beispiel im inneren Ring 16, während Kupplungsort 20 im äußeren Ring 15 angeordnet ist.
Um den weiteren Kupplungsort 20' anzusteuern, wird die Disk 10 in Richtung des Pfeils 19 um drei Positionen weiter gedreht (rotiert). Zusätzlich wird die Lichtquelle 30 am Träger 35 in Richtung auf die zentrale Ausnehmung 12 bewegt. Beide Bewegungen können gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander ausgeführt werden. Am Ende der Bewegungsvorgänge ist die Lichtquelle 30 auf den Kupplungsort 20' gerichtet, so dass nun an diesem Ort eine Kupplungsreaktion durchgeführt werden kann. Die Vorgehensweise hierbei entspricht der Vorgehensweise am Kupplungsort 20.
Fig. 2a-d zeigt schematisch die Anlagerung von Nucleosiden an einzelne Kupplungssubstanzen. Es wurde der Übersichtlichkeit halber darauf verzichtet, die Bezugszeichen in den verschiedenen Teilfiguren sowie in Fig. 3a-c zu wiederholen, soweit sie einander entsprechen.
In Fig. 2a ist. schematisch im Querschnitt ein Abschnitt einer Untersuchungsseite 11 einer Disk 10 dargestellt. Kupplungssubstanzen 40, 43, 46 sind an der Untersuchungsseite 11 kovalent gebunden. Jede Kupplungssubstanz 40, 43, 46 ist einem separaten Kupplungsort 41 , 44, 47 zugeordnet. Auf die Darstellung von räumlichen Abgrenzungen zwischen den Kupplungsorten wurde der Übersichtlichkeit halber verzichtet.
Die Kupplungssubstanzen 40, 43, 46 besitzen als Kreise dargestellte lichtempfindliche Schutzgruppen 42, 45, 48 an ihren von der Untersuchungsseite 11 fortweisenden Enden. In Fig. 2b ist schematisch ein Belichtungsvorgang eines Kupplungsortes 41 dargestellt. Licht 50 wird auf die lichtempfindliche Gruppe 42 der Kupplungssubstanz 40 eingestrahlt, so dass diese photochemisch aktiviert (entfernt) wird (angedeutet durch Schwärzung). Die übrigen Kuppiungssubstanzen 43, 46 bleiben unbelichtet, ihre lichtempfindlichen Gruppen 45, 48 werden nicht aktiviert.
Nach Applikation eines mit einer lichtempfindlichen Schutzgruppe 62 versehenen Oligonucleotid-Bausteins 60 auf den Kupplungsort 41 wird der Oligonucleotid-Baustein 60 kovalent mit der Kupplungssubstanz 40 verbunden (vgl. Fig. 2c).
Auf analoge Weise, nämlich durch Belichten der jeweiligen Kupplungssubstanz und Applikation von Oligonucleotid-Bausteinen, werden auch an den übrigen Kupplungsorten 44, 47 Oligonucleotid-Bausteine angeknüpft (vgl. Fig. 2d).
In den Fig. 2e-h ist schematisch die spezifische Verlängerung einer Nucleotid-Kette an verschiedenen Kupplungsorten dargestellt.
Fig. 2e zeigt die Belichtung des Kupplungsortes 40 mit Licht 51. Die übrigen Kupplungsorte bleiben unbelichtet. Die Schutzgruppe 62 des Oligonucleotid-Bausteins 60 am Kupplungsort 41 wird durch die Belichtung aktiviert (vgl. Fig. 2f, dargestellt als Schwärzung der Schutzgruppe 62). Nach Zugabe eines mit einer lichtempfindlichen Schutzgruppe 72 versehenen Oligonucleotid-Bausteins 70 am Kupplungsort 41 wird der Oligonucleotid- Baustein 60 kovalent mit dem weiteren Oligonucleotid-Baustein 70 verbunden (vgl. Fig. 2g). In analoger Weise werden die Nucleinsäuren der übrigen Kupplungsorte 44, 47 verlängert, so dass im Ergebnis an allen drei Kupplungsorten 41 , 44, 47 Dinucleotide kovalent mit den jeweiligen Kupplungssubstanzen 40, 43, 46 verbunden sind. Die Synthese kann, da jedes endständige Nucleotid eine photosensible Schutzgruppe trägt, an jedem der Kupplungsorte 41 , 44, 47 fortgesetzt werden. Vor der Durchführung von Hybridisierungsreaktionen kann es notwendig sein, die endständigen Schutzgruppen, beispielsweise durch Belichten, zu entfernen. In Fig. 3a ist schematisch (als geschlängelte Linie) ein beliebiges mit der Kupplungssubstanz 40 verbundenes Oligonucleotid 100 dargestellt, wie es nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechend den Fig. 2a-h erhalten werden kann.
In Fig. 3b ist schematisch ein mit dem Oligonucleotid 100 hybridisiertes zweites Oligonucleotid 105 dargestellt. Häufig wird die das Oligonucleotid 105 enthaltende Proben- Lösung weitere Oligonucleotide umfassen, die bei genügend stringenten Hybridisierungsbedingungen nicht stabil mit dem Oligonucleotid 100 hybridisieren können (nicht dargestellt). Die weiteren (nicht hybridisierenden) Oligonucleotide werden häufig, ebenso wie das Oligonucleotid 105, eine photodetektierbare Gruppe 106 umfassen, und müssen daher vor der Detektion ausgewaschen werden, um Fehlmessungen zu vermeiden. Bei der photodetektierbaren Gruppe 106 wird es sich häufig um einen Fluoreszenzfarbstoff handeln, dessen Fluoreszenz auf übliche Weise nachweisbar ist. Des weiteren könnten anstelle von kovalent mit einem Oligonucleotid verknüpften photodetektierbaren Gruppen auch Doppelstrang-erkennende Farbstoffe wie DAPI (4',6-diamino-2-phenylindόl) oder Ethidium- bromid als photodetektierbaren Gruppen verwendet werden. Alternativ könnte eine photodetektierbare Gruppe auch ein Biomolekül (Enzym, Antikörper o. dgl.) umfassen, das zusammen mit einem jeweiligen Substrat beispielsweise einen farbigen Niederschlag, ein Fluoreszenz- oder Lumineszenzsignal erzeugt. Bei der Auswahl geeigneter Farbstoffe und photodetektierbarer Gruppen kann sich der Fachmann insbesondere am "Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals", zu beziehen von Molecular Probes Inc., orientieren.
In Fig. 3c ist schematisch ein Detektionsvorgang dargestellt. Dabei wird Licht 55 auf die photodetektierbare Gruppe 106 eingestrahlt. Von der photodetektierbaren Gruppe 106 wird daraufhin Fluoreszenz-Licht 56 ausgesandt. Dieses hat eine gegenüber dem eingestrahlten Licht 55 längere Wellenlänge. Das Licht 56 wird optisch aufgefangen und gemessen (nicht dargestellt) und auf übliche Weise zur Auswertung der Hybridisierungs- reaktion verwendet. Die Auswerteoptik ist dabei so eingerichtet, dass nach der Auswertung an einer ersten Auswerteposition (Kupplungsorten) ein Rotieren der Disk und/oder ein Verschieben von Disk und Auswerteoptik in radialer Richtung relativ zueinander durchführbar ist, um die Auswerteoptik auf eine weitere Auswerteposition (einen weiteren Kupplungsort) zu richten. Die Auswertung erfolgt dann auf eine dem Erzeugen des Oligonucleotid-Arrays analoge Weise, vgl. Fig. 1.
In Fig. 4a ist eine erfindungsgemäße mehrteilige Träger-Disk 1 dargestellt, welche einen Mikroarray-Chip 2 sowie ein Adapterelement 3 umfaßt. Der Mikroarray-Chip ist formschlüssig in eine Aussparung (in Fig. 4a nicht separat dargestellt) im Adapterelement eingepaßt und schließt zur Oberfläche des Adapterelements bündig mit diesem ab. In dem Adapterelement 3 ist zudem eine freie Aussparung 4 zur Aufnahme eines weiteren Mikroarray-Chips mit gleichen Abmessungen vorgesehen.
In Fig. 4b sind das Adapterelement 3 und der Mikroarray-Chip 2 im Querschnitt entlang der Linie A-B aus Fig. 4a dargestellt, wobei der Verbund zwischen diesen beiden Bauteilen jedoch gelöst dargestellt ist.
Bei dem Mikroarray-Chip 2 handelt es sich um einen handelsüblichen Glasobjektträger (25 x 76 mm), auf dem in üblicher Weise ein definiertes Mikroarray (Mikroanordnung) von Oligonucleotiden fixiert ist. Der Mikroarray-Chip 2 ist von im wesentlichen rechteckiger Gestalt und läßt sich, wie insbesondere aus Fig. 4b hervorgeht, formschlüssig in jede der zwei entsprechenden Aussparungen 4 des scheibenförmigen Adapterelements 3 einlegen (in Richtung des Pfeiles in Fig. 4b).
Die Abmessungen der aus Adapterelement 3 und Mikroarray-Chip 2 zusammengesetzten Träger-Disk 1 entsprechen denen einer handelsüblichen CD.
Das Adapterelement 3 ist außerhalb des Bereichs der Aussparung 4 mit Informationen beschrieben, die auf aus der CD- oder DVD-Technik bekannte Weise ausgelesen werden können. Vgl. beispielsweise L. Boden, Mastering CD-ROM Technology, John Wiley & Sons (1995), ISBN 0-471-12174-6 für einen Überblick über relevante Techniken zum Beschreiben und Auslesen von Informationen im CD-Format.

Claims

Ansprüche
1. Träger-Disk (1 ), umfassend ein Funktionselement und ein zum Verbinden mit dem Funktionselement angepasstes Adapterelement (3), wobei das Funktionselement umfasst:
(a) ein Substrat-Element (2) zur Aufnahme einer Anordnung biologischer oder chemischer Substanzen, und/oder
(b) ein Mikrofluidik-Element mit einer Kanalstruktur zum Transportieren fluider Medien, und/oder
(c) ein Daten-Element zum Speichern und/oder Auslesen von Daten in maschinenlesbarer Form.
2. Träger-Disk nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Träger-Disk (1) im zusammengebauten Zustand mehrere Funktionselemente umfasst.
3. Träger-Disk nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Substrat-Element (2) ein Mikroarray-Chip (2), ein Glas-Objektträger, ein Papierträger oder eine Membran (Folie) ist.
4. Träger-Disk nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Adapterelement (3) und Funktionselement lösbar miteinander verbunden sind.
5. Träger-Disk nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kanalstruktur eines Mikrofluidik-Elements im zusammengebauten Zustand vom Adapterelement (3) und/oder von einem weiteren Funktionselement abgedichtet ist.
6. Träger-Disk, umfassend eine oder mehrere Positionsmarkierungen zu Identifizierungs-, Steuerungs- und/oder Auswertezwecken, aufgebracht auf der Mantelfläche und/oder der Oberfläche der Träger-Disk.
7. Adapterelement oder Funktionselement zur Verwendung in einer Träger-Disk (1 ) nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Verfahren zum Anbringen einer Anordnung biologischer oder chemischer Substanzen auf einer Träger-Disk (1 ), wobei ein Substrat-Element (2) mit einem Adapterelement (3) zu der Träger-Disk verbunden und zuvor oder anschließend auf dem Substratelement (2) eine Anordnung biologischer oder chemischer
Substanzen angeordnet wird.
9. Verfahren zur Erzeugung eines Oligonucleotid-Arrays, umfassend folgende Schritte: . a) Bereitstellen einer Träger-Disk (10) mit einer Untersuchungsseite (11), auf der an einer Anzahl von Kupplungsorten (20) photochemisch aktivierbare Kupplungssubstanzen (40, 43, 46) zur jeweiligen Fixierung eines Oligonucleotids oder Oligonucleotid-Bauelements (60) angeordnet sind und einer Lichtquelle (30) zur selektiven photochemischen Aktivierung der Kupplungssubstanzen (40, 43, 46) an einzelnen Kupplungsorten (20), b) Verkuppeln der Kupplungssubstanz (40, 43, 46) an einem ersten Kupplungsort (20) mit einem Oligonucleotid oder Oligonucleotid-Bauelement (60), indem das Oligonucleotid bzw. Oligonucleotid-Bauelement (60) auf zumindest den ersten Kupplungsort (20) appliziert, die Lichtquelle (30) auf den ersten Kupplungsort (20) gerichtet und die Kupplungssubstanz (40, 43, 46) am ersten Kupplungsort (20) durch Beleuchten mit der Lichtquelle (30) aktiviert wird, c) Rotieren der Träger-Disk (10) und/oder Verschieben von Lichtquelle (30) und Träger-Disk (10) in radialer Richtung relativ zueinander, um die Lichtquelle (30) auf einen weiteren Kupplungsort (20) zu richten.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn7eiπhnet, dass mehr als zwei, vorzugsweise mehr als zehn Kupplungssubstanzen (40, 43, 46) an verschiedenen Kupplungsorten (20) zeitlich nacheinander (seriell) photochemisch aktiviert und mit einem jeweiligen Oligonucleotid oder Oligonucleotid-Bauelement (60) verkuppelt werden, wobei zwischen je zwei photochemischen Aktivierungsschritten an ver- schiedenen Kupplungsorten (20) die Träger-Disk (10) rotiert und/oder Lichtquelle (30) und Träger-Disk (10) in radialer Richtung relativ'zueinander verschoben werden, um die Lichtquelle (30) auf den jeweils nächsten Kupplungsort (20) zu richten.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest die Kupplungssubstanz (40, 43, 46) am ersten Kupplungsort (20), vorzugsweise aber auch jede der Kupplungssubstanzen (40, 43, 46) an den weiteren Kupplungsorten (20), mit einer Schutzgruppe (42, 45, 48) versehen ist, welche durch Beleuchten mit der Lichtquelle (30) so entfernbar ist, dass eine ungeschützte (aktivierte) Kupplungssubstanz (40, 43, 46) entsteht, die in definierter Weise mit dem Oligonucleotid bzw. Oligonucleotid-Bauelement (60) kuppeln kann.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass eine aktivierte Kupplungssubstanz (40, 43, 46) an einem oder, zeitlich nacheinander, aktivierte Kupplungssubstanzen (40, 43, 46) an mehreren Kupplungsorten (20) mit einem geschützten Nucleosid (60) verkuppelt werden, welches durch Beleuchten mit der Lichtquelle (30) aktiviert werden kann.
13. Anlage zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 9 bis 12, umfassend: eine Träger-Disk (10) mit einer Untersuchungsseite (11), auf der an einer
Anzahl von vorbestimmten Kupplungsorten (20) photochemisch aktivierbare
Kupplungssubstanzen (40, 43, 46) zur Fixierung eines Oligonucleotids oder
Oligonucleotid-Bauelements (60) angeordnet sind eine Lichtquelle (30) zur selektiven photochemischen Aktivierung der
Kupplungssubstanzen (40, 43, 46) an einzelnen Kupplungsorten (20), eine Adressiereinrichtung zum Rotieren der Träger-Disk (10) und zum
Verschieben von Lichtquelle (30) und Träger-Disk (10) in radialer Richtung relativ zueinander, um die Lichtquelle (30) auf einen vorgegebenen Kupplungsort (20) auf der
Untersuchungsseite (11) der Träger-Disk (10) zu richten.
14. Verfahren zur Durchführung eines Hybridisierungs-Assays, umfassend: a) das Bereitstellen einer gemäß einem der Ansprüche 9 bis 12 mit einem Oligonucleotid-Array versehenen Träger-Disk (10) und b) die Applikation von Nucleinsäuren (105) an zumindest einem Kupplungsort (20) auf der Träger-Disk (10) und das Einstellen ausreichend stringenter Hybridisierungsbedingungen.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass c) eine optische Auswertung des Hybridisierungs-Resultats vorgenommen wird, indem mittels einer Auswerteoptik eine Detektion an einem ersten Kuppiungsort (20) vorgenommen wird, anschließend die Träger-Disk (10) rotiert und/oder Träger-Disk (10) und Auswerteoptik in radialer Richtung relativ zueinander verschoben werden, um die Auswerteoptik auf einen weiteren Kupplungsort (20) zu richten, und dann an diesem weiteren Kupplungsort (20) eine Detektion vorgenommen wird.
16. Lesegerät zur Auswertung eines Hybridisierungs-Assays nach einem der Ansprüche 14 oder 15, umfassend
Aufnahmemittel für eine Träger-Disk (10), die eine Untersuchungsseite (11 ) besitzt, auf der an einer Anzahl von vorbestimmten Kupplungsorten (20) Oligonucleotide (100) zur Durchführung eines Hybridisierungsassays angeordnet sind, eine Adressiereinrichtung, die so eingerichtet ist, dass ein Rotieren der Träger-Disk (10) und/oder ein Verschieben von Träger-Disk (10) und Auswerteoptik in radialer Richtung relativ zueinander durchführbar ist, um die Auswerteoptik zwischen zwei Kupplungsorten (20) zu verschieben, und zumindest einen Detektor (30) zur Detektion von Hybridisierungen.
17. Lesegerät nach Anspruch 16, wobei der Detektor (30) ein optischer Detektor oder ein Magnetsensor ist.
18. Lesegerät nach einem der Ansprüche 16 oder 17, umfassend ein vom Detektor (30) verschiedenes Mittel zum Lesen von auf der Träger-Disk (10) gespeicherten Daten.
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