WO2006054641A1 - Ｇｐｒ７に選択的なリガンド及びその用途 - Google Patents

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acceptable salt
pharmaceutically acceptable
gpr7
substituent
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Masao Matsuda
Shigeru Tokita
Akio Kanatani
Maki Kanesaka
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Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2800/303—Eating disorders, e.g. anorexia, bulimia

Definitions

  • the present invention relates to a ligand selective for GPR7 and use thereof.
  • Neuropeptides W and -europeptide B (NPB) have been reported as endogenous ligands for the orphan receptors GPR7 and GPR8. These peptides are used for feeding, energy metabolism and endocrine regulation. It is suggested to be involved (Patent Document 1 and Non-Patent Documents 1 to 4).
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-49003
  • Non-patent literature l Mondal MS. Et al., Endcrinology, 144 ⁇ , 4729-4733 (2003)
  • Non-patent literature 2 Tanaka H. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America ⁇ 100 ⁇ , 6251-6256 (2003)
  • Non-Patent Document 3 Fujii R. et al., The Journal of Biological Chemistry, 277 ⁇ , 34010-34016 (2002)
  • Non-Patent Document 4 Shimomura Y. et al., The Journal of Biological Chemistry, 277 ⁇ , 35826-35832 (2002)
  • Non-Patent Document 5 Winsky-Sommerer R. et al., SLEEP, 26 ⁇ , Abstract Supplement, 0118.A (2003)
  • GPR7 and GPR7 ligands are known to be associated with various diseases and symptoms! For example, (1) relation to obesity, diabetes, eating disorders, etc., relation to pituitary hormone dysfunction (Patent Document D; (2) Effects on sleep and arousal (Non-Patent Document 5); (4) Impact on stress (Non-patent document 2), etc. Therefore, GPR7 ligand can be a prophylactic / therapeutic agent for these diseases.
  • a ligand having high selectivity for GPR7 can be applied to screening of drug candidate compounds such as the above-mentioned preventive and therapeutic agents for diseases.
  • an object of the present invention is to provide a ligand selective for GPR7 and use thereof.
  • the present invention relates to a compound represented by Trp—Tyr—Lys— (X) Gly—Arg—Ala—Ala—Gly—Leu Leu—Ser—Gly Leu NH or a pharmaceutically acceptable product thereof.
  • n an integer of 2 to 10
  • It may have a substituent selected from the substituent group A.
  • Substituent group A consists of halogen, methyl, ethyl, hydroxyl, methoxy and -tro groups.
  • X is preferably a group represented by NH— (CH 2) —CO—
  • N is preferably an integer of 2 to 5, particularly 3.
  • n 3
  • two of X are groups represented by —NH— (CH 2) — CO—,
  • It may have a substituent selected from the substituent group A.
  • n 3
  • two of X are groups represented by NH— (CH 3) CO 2, and the remaining
  • X may have a substituent selected from the group consisting of halogen, methyl group, ethyl group, hydroxyl group, methoxy group, and -toro group.
  • 1 is preferably a group represented by 0 or 1.
  • n 3
  • two of X are groups represented by NH— (CH 2) —CO 2.
  • the compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a ligand selective for GPR7,
  • the present invention also provides a medicine comprising the above compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to the prevention of 'obesity, diabetes or bulimia' therapeutic agent, appetite enhancer, prevention of pituitary hormone secretion deficiency 'therapeutic agent, prevention of sleep disorders' therapeutic agent, analgesic, stress Prophylactic and therapeutic agents are provided.
  • the present invention is also a method of screening for a compound that binds to GPR7,
  • a method comprising:
  • the compound of the present invention has very high selectivity for GPR7, it is a useful tool for elucidating the function of GPR7.
  • the compounds of the present invention can be used for the prevention / treatment of various diseases including eating disorders, and also for the screening of drug candidate compounds that can be used for the prevention / treatment of various diseases. It is also possible to do.
  • the compound of the present invention is represented by n 2 by Trp-Tyr-Lys — (X) -Glv-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-NH.
  • This compound contains amino acids in residues 4 to 13 of desBr—hNPB (l-23).
  • Leu-NH represents that the carboxyl group of the C-terminal leucine residue is amidated.
  • Lys— (X) — Gly consists of a lysine residue (corresponding to the third residue of hNPB) and the first (counted from the N-terminal tryptophan; the same shall apply hereinafter) X amino group.
  • X amino group a lysine residue (corresponding to the third residue of hNPB) and the first (counted from the N-terminal tryptophan; the same shall apply hereinafter) X amino group.
  • the i-th X amino group and the (i + 1) -th X carboxyl group combine to form an amide bond, and the n-th carboxyl group and the glycine residue (hNPB It represents that an amide bond is formed by binding to an amino group (corresponding to the 14th residue).
  • n an integer of 2 to 10.
  • X independently represents the following groups (1) to (5):
  • substituent group A means a ring (benzene ring, pyridine ring, azetidine, pyrrolidine ring, piperidine ring and cyclohexane ring). ) Any one or more hydrogen atoms above may be substituted with a substituent group A (halogen, methyl group, ethyl group, hydroxyl group, methoxy group and -tro group) force selected substituents, That's right.
  • substituent group A halogen, methyl group, ethyl group, hydroxyl group, methoxy group and -tro group
  • the compound of the present invention can be synthesized, for example, by applying a known peptide synthesis method.
  • Known peptide synthesis methods include the solid phase synthesis method by the Fmoc method or the Boc method, or the liquid phase synthesis method.
  • the solid-phase synthesis method by the Fmoc method has excellent viewpoints such as yield.
  • the amino acid or X protected with the Fmoc group used in the solid phase synthesis method by the Fmoc method commercially available ones can be used, and if necessary, they can be synthesized by known methods.
  • X is preferably a group represented by one NH— (CH 2) —CO—.
  • n is particularly preferably an integer of 2 to 5. Most preferably, n is 3.
  • X is Ava
  • the compound of the present invention is considered to fit GPR7 with moderate flexibility and chain length.
  • n is an integer of 2 to 5
  • the compound of the present invention has high specificity for GPR7.
  • the compound of the present invention in which n is 3 has a selectivity of GPR7 of about 2900 times that of GPR8.
  • n 3
  • two of X are —NH— (CH 2) —CO—.
  • the remaining X may have a substituent selected from the substituent group A.
  • It may have a substituent selected from the substituent group A.
  • the compound of the present invention has moderate flexibility and chain length, and has one benzene ring, pyridine ring, azetidin, pyrrolidine ring, piperidine ring or cyclohexane ring, so that the compound of the present invention is moderate It is considered to be fit to GPR7.
  • X is preferably a benzene ring or a pyridine ring, and particularly preferably a benzene ring. That is, X may have a substituent selected from the group consisting of halogen, methyl group, ethyl group, hydroxyl group, methoxy group, and -tro group.
  • 1 is preferably a group represented by 0 or 1.
  • X is the formula [Chemical 28]
  • GPR7 corresponds to 2-abz, 3-abz and 4-abz, respectively. Since isomerism is high, X is preferably these groups. In particular, when X is 2-Abz, the selectivity of GPR7 is about 1700 times that of GPR8.
  • Pharmaceutically acceptable salts of the compounds of the present invention are also included in the scope of the present invention.
  • the pharmaceutically acceptable acid include acid addition salts and base addition salts.
  • Acid addition salts include, for example, halogen hydrohydrogen salts such as hydrochloride, hydrofluoride, hydrobromide, hydroiodide; nitrate, perchlorate, sulfate, phosphate, carbonate
  • Inorganic acid salts such as salts; lower alkyl sulfonates such as methane sulfonate, trifluoromethane sulfonate, and ethane sulfonate; aryl sulfonates such as benzene sulfonate and p-toluene sulfonate; and
  • Examples include organic acid salts such as fumarate, succinate, citrate, tartrate, oxalate, and maleate.
  • Base addition salts include, for example, alkali metal salts such as sodium and rhodium; alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium; and organic bases such as ammonium salt, guanidine, triethylamine, and dicyclohexylamine. And salts thereof.
  • alkali metal salts such as sodium and rhodium
  • alkaline earth metal salts such as calcium and magnesium
  • organic bases such as ammonium salt, guanidine, triethylamine, and dicyclohexylamine. And salts thereof.
  • the compounds of the present invention can be converted into pharmaceutically acceptable salts according to conventional methods.
  • the GPR7 selective ligands and GPR selective agonists of the present invention are also compounds of the present invention or pharmaceutically acceptable salting power thereof.
  • Ligand and agonist are selective for GPR7 when GPR7 binds to GPR7 more strongly than GPR8 (binding constant is large V) and EC (50% effective concentration of ligand for GPR7 than GPR8) ) Is low, ⁇
  • the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof has high selectivity for GPR7.
  • the results of binding inhibition experiments (comparison of IC (50% inhibitory concentration))
  • the measurement power of 50 is also about 4 to 165 times selective (Table 1). Therefore, the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof functions as a GPR7 selective ligand and a GPR7 selective agonist. [0034] (Pharmaceutical)
  • the medicament of the present invention contains the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the medicine of the present invention can be applied to diseases and symptoms involving GPR7 and GPR7 ligand, but specific drugs include prevention-treatment agent, appetite enhancer, pituitary gland for obesity, diabetes or bulimia These include prevention of hormonal secretion deficiencies, therapeutic agents, prevention of sleep disorders (insomnia, etc.), therapeutic agents, analgesics, and prevention of stress (stress overeating, insomnia etc.).
  • the medicament of the present invention can be formulated into various preparations by adding a pharmaceutically acceptable additive to the compound of the present invention in accordance with its administration form.
  • a pharmaceutically acceptable additive such as gelatin, lactose, sucrose, acid titanium, starch, crystalline cellulose, hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, corn starch, Microcrystalline wax, white petrolatum, magnesium aluminate metasilicate, anhydrous calcium phosphate, citrate, trisodium citrate, hydroxypropylcellulose, sorbitol, sorbitan fatty acid ester, polysorbate, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene, hydrogenated castor oil , Polyvinyl pyrrolidone, magnesium stearate, light anhydrous key acid, talc, vegetable oil, benzyl alcohol, gum arabic, propylene glycol, polyalkylene glycol Le, Shikurodeki string and hydroxypropionic buildings cyclod
  • Examples of dosage forms formulated as a mixture with these additives include solid preparations such as tablets, capsules, granules, powders or suppositories; syrups, elixirs or injections, etc.
  • Examples include liquid preparations. These can be prepared according to the usual methods in the pharmaceutical field. In the case of a liquid preparation, it may be dissolved or suspended in water or other appropriate medium at the time of use. In particular, in the case of injections, they may be dissolved or suspended in physiological saline or glucose solution as necessary, and supplemented with buffers and preservatives.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the sex, age, weight, degree of symptoms, and the type and range of the intended treatment effect.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the sex, age, weight, degree of symptoms, and the type and range of the intended treatment effect.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the sex, age, weight, degree of symptoms, and the type and range of the intended treatment effect.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the sex, age, weight, degree of symptoms, and the type and range of the intended treatment effect.
  • the dose and frequency of administration vary depending on the sex, age, weight, degree of symptoms, and the type and range of the intended treatment effect.
  • 0.001 to lOmgZkg in the case of parenteral administration, 0.001 to lOmgZkg, preferably 0.001 to 0.001 mg / kg, more preferably 0.01 to 0.
  • the medicament of the present invention may contain the compound of the present invention in a ratio of 1.0% to LOO% by weight of all drugs, preferably 1.0 to 60% by weight. These formulations may also contain other therapeutically effective compounds.
  • the method of the present invention for screening for compounds that bind to GPR7 comprises the following steps:
  • GPR7 is related to various diseases and symptoms
  • compounds that bind to GPR7 can be used as prophylactic / therapeutic agents for diseases involving GPR7.
  • diseases involving GPR7 Specifically, obesity, diabetes or bulimia prevention 'therapeutic agent, appetite enhancer, prevention of pituitary hormone secretion insufficiency' therapeutic agent, sleep disorder (such as insomnia) prevention 'therapeutic agent, analgesic, stress (Prevention of 'stressful overeating' insomnia etc. ')
  • candidate compounds of these drugs can be selected.
  • GPR7 used in the screening method of the present invention can utilize the membrane fraction of GPR7-expressing cells.
  • GPR7 is preferably GPR7 derived from a mammal, particularly a human.
  • the membrane fraction of GPR7-expressing cells can be prepared according to the method described in JP-A-2004-49003. A specific preparation method is as follows. Based on the known sequence information, GPR7 cDNA is amplified by PCR or the like, and the amplified cDNA is cloned into an appropriate expression vector. Transfer expression vector with GPR7 inserted into host cell Thus, GPR7 expressing cells are obtained.
  • GPR7-expressing cells are disrupted, and the membrane fraction is prepared from the cell lysate by differential centrifugation or density gradient centrifugation.
  • the membrane fraction is rich in expressed GPR7 and membrane components such as phospholipids and membrane proteins.
  • Such a membrane fraction of GPR7-expressing cells can be easily prepared by those skilled in the art using known methods.
  • GPR7 used in the screening method of the present invention may be a GPR7-expressing cell itself, not a membrane fraction of GPR7-expressing cells! /.
  • the compound of the present invention used in the screening method of the present invention is preferably labeled in order to measure the amount of binding to GPR7.
  • the label and labeling method are not particularly limited, and labels and labeling methods known to those skilled in the art can be used. Specifically, radiolabels such as [ 3 H], [ 125 I], [ 14 C], and [ 35 S] can be used for IJ, and the radiolabel according to [ 125 1] is particularly preferable.
  • Step (a) is a step of contacting GPR7 with the compound of the present invention under the conditions in which the candidate compound is present and in the absence, and measuring the binding amount.
  • the contact between GPR7 and the compound of the present invention is carried out in a suitable buffer.
  • the type of buffer is not particularly limited as long as it does not inhibit the binding of GPR7, the compound of the present invention and the candidate compound.
  • a surfactant or the like may be added to the buffer for the purpose of reducing non-specific binding between GPR7, the compound of the present invention and the candidate compound.
  • a protease inhibitor may be added to the buffer for the purpose of suppressing degradation of GPR7, the compound of the present invention and the candidate compound.
  • a certain amount of a labeled compound of the present invention eg, in the range of 5000 cpm to 500000 cpm
  • the candidate compound eg, in the concentration range of 10_1C M to 10_7M
  • incubation temperature is preferably 4 ° C to 37 ° C.
  • the incubation time is preferably 30 minutes to 3 hours.
  • step (b) a candidate compound that changes the amount of binding between GPR7 and the compound of the present invention is selected. It is a process to do.
  • the binding amount measured in step (a) is examined to see if there is no change in the binding amount in the presence or absence of the candidate compound. For example, when the value (B-NSB) obtained by subtracting the nonspecific binding amount (NSB) from the binding amount in the absence of the candidate compound (B) is 100%,
  • Candidate compounds whose specific binding amount (B—NSB) is 50% or less can be selected as compounds that bind to GPR7. Or, IC is below a predetermined value (for example, 1 ⁇ : LOOnM)
  • candidate compounds may be selected as compounds that bind to GPR7.
  • Fmoc— Trp (Boc) NovaSyn TM TGA resin (Novabiochem) as a starting material, using a peptide synthesizer Pioneer TM model 9010, HATU (0— (7—azabenzotriazole 1— The peptide was synthesized by the Fmoc method using N, N, ⁇ ', ⁇ , monotetramethyl-mu-hexafluorophosphoric acid) as a condensation reagent.
  • This crude peptide was purified by reversed-phase preparative HPLC using YMC-Pack ODS-AQ, S-5, 120A column (20 X 250mm), and the fraction containing the target product was collected and freeze-dried. The desired product was obtained.
  • HPLC conditions are as follows.
  • Liquid A 0.1% TFA-containing water
  • Liquid B 0.1% acetonitrile containing 1% TFA
  • DesBr-hNPB was synthesized by the same method as in Synthesis Example 1 using Fmoc-Ala-NovaSyn (trademark) TGA resin as a starting material.
  • AZB 80Z20-60Z40 (linear one) was performed under the condition of eluting for 15 minutes.
  • HPLC conditions are as follows.
  • Liquid A 0.1% TFA-containing water
  • Liquid B 0.1% acetonitrile containing 1% TFA
  • Membrane preparations prepared from cells expressing GPR7 or GPR8 were combined with test compound and 28, 000 cpm [ 125 1]-[Phe2] -hNPW (1-23) with Atsey buffer (25 mM Tris buffer) The solution was incubated in room temperature, 150 mM NaCl, pH 7.4) at room temperature for 1 hour, and then filtered through a glass filter GF / C. After washing with 25 mM Tris buffer (pH 7.4), the radioactivity on the glass filter was measured. Nonspecific binding was measured in the presence of 1 ⁇ M hNPW (prepared in Synthesis Example 1) and tested for [Phe2] hNPW (l-23) specific binding. Calculated 50% inhibitory concentration (IC value) of compound [Molecular Pharmacology
  • Test Example 2 Measurement of GPR7 and GPR8 activation ability of various synthetic peptides
  • HEK293ZCRE—BLA cells expressing GPR7 or GPR8 were washed twice with PBS ( ⁇ ) buffer (GIBCO—BRL), and then cell-dissociation buffer (GIBCO— BRL) and incubate at 37 ° C for 3 minutes in a CO incubator.
  • Opti-MEM medium GEBCO-BRL
  • BSA 0.1% BSA
  • the cell count is 8 x 10 5 cells ZmL.
  • Opti-MEM medium containing 1% BSA 50 ⁇ L was added to prepare a reaction solution. To this reaction solution, add 50 L of the above cell suspension to start the reaction, and
  • a dye introduction buffer mixed at a ratio of 2 was prepared, 20 L of the dye introduction buffer was added to the cell reaction solution, and j8 lactamase substrate (CCF2-AM) was introduced into the cells. After leaving at room temperature for 1 hour, the fluorescence intensity of the sample was measured at an excitation wavelength of 409 nm, a fluorescence wavelength of 460 nm (CCF ⁇ -lactamase hydrolyzate), and 530 nm (CCF). Using ⁇ -lactamase activity (fluorescence intensity at 460 nm and fluorescence intensity at Z530 nm) as an index, the activity of various peptides against GPR7 or GPR8 was measured, and the 50% effective concentration (EC) of the test compound was calculated.
  • ⁇ -lactamase activity fluorescence intensity at 460 nm and fluorescence intensity at Z530 nm
  • Table 1 shows the IC and EC when the peptides obtained in Synthesis Examples 4 to 9 are used.
  • Table 2 shows the IC when the peptides obtained in 0 to 18 and 1 were used.
  • the compounds of the present invention are selective ligands for GPR7, and are effective in the treatment and prevention of diseases associated with feeding, energy metabolism and endocrine regulation.

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Abstract

　Ｔｒｐ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－（Ｘ）ｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－Ｌｅｕ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－ＮＨ２で表される化合物又はその薬学的に許容される塩は、ＧＰＲ７に選択的なリガンドである。 ［式中、ｎは２～１０の整数を表し、Ｘは独立して、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｍ－ＣＯ－（ここで、ｍは２～６の整数を表す。）で表される基や置換基を有していてもよい式(1) （ここで、ｌは０又は１を表す。）で表される基などを表す。］

Description

明 細 書
GPR7に選択的なリガンド及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、 GPR7に選択的なリガンド及びその用途に関する。
背景技術
[0002] ォーファン受容体である GPR7及び GPR8の内在性リガンドとして、ニューロぺプチ ド W(NPW)及び-ユーロペプチド B (NPB)が報告され、これらのペプチドが摂食、 エネルギー代謝及び内分泌調節に関与して 、ることが示唆されて 、る（特許文献 1 及び非特許文献 1〜4)。
[0003] GPR7及び GPR8の生体内における局在は異なり、各々独自の生理学的機能を有 していると推察される。したがって、各受容体の機能を検討する上で、各受容体に対 する選択性が高いリガンドは非常に有用である。
[0004] 特許文献 1 :特開 2004— 49003号公報
非特許文献 l : Mondal MS.ら、 Endcrinology、 144卷、 4729- 4733頁（2003年） 非特干文献 2： Tanaka H.ら、 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Americaゝ 100卷、 6251— 6256頁（2003年）
非特許文献 3 : Fujii R.ら、 The Journal of Biological Chemistry, 277卷、 34010-34016 頁（2002年）
非特許文献 4 : Shimomura Y.ら、 The Journal of Biological Chemistry, 277卷、 35826- 35832頁（2002年）
非特許文献 5 :Winsky- Sommerer R.ら、 SLEEP、 26卷、 Abstract Supplement, 0118.A (2003年）
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] しかしながら、内在性リガンドである NPW及び NPBは、 GPR7に対する選択性は 高くない。 GPR7に対する選択性の高いリガンドは、 GPR7の機能を解明する上で有 用なツールであると考えられる。 [0006] また、 GPR7及び GPR7のリガンドは、様々な疾患や症状と関連して!/、ることが知ら れている。例えば、（1)肥満、糖尿病、摂食障害等への関連、下垂体ホルモンの分 泌不全への関連 (特許文献 D； (2)睡眠及び覚醒への影響 (非特許文献 5)； (3)痛 覚への影響 (非特許文献 2)；及び (4)ストレスへの影響 (非特許文献 2)などが挙げら れる。したがって、 GPR7のリガンドはこれらの疾患の予防 ·治療薬となり得る。
[0007] さらに、 GPR7に対する選択性の高いリガンドは、上記疾患の予防'治療薬などの 医薬品候補ィ匕合物のスクリーニングに応用することも可能である。
[0008] したがって、本発明の目的は、 GPR7に選択的なリガンド及びその用途を提供する ことにある。
課題を解決するための手段
[0009] 上記目的を達成するために、本発明者らは NPBのアナログを種々合成したところ、
GPR7に対する選択性が非常に高い化合物を見出し、本発明を完成するに至った。
[0010] すなわち、本発明は、 Trp— Tyr— Lys— (X) Gly— Arg— Ala— Ala— Gly— L eu Leu— Ser— Gly Leu NHで表される化合物又はその薬学的に許容される
2
塩を提供する。
[式中、 nは 2〜10の整数を表し、
Xは独立して、
-NH- (CH ) -CO- (ここで、 mは 2〜6の整数を表す。）で表される基、
2 m
置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 1]
Figure imgf000003_0001
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して 1ヽてもよ ヽ式
[化 2]
Figure imgf000003_0002
で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して 、てもよ 、式
[化 3]
Figure imgf000004_0001
(ここで、 pは 0〜2の整数を表し、 qは 0又は 1を表す。）で表される基、又は 置換基群 Aから選択される置換基を有して 、てもよ 、式
[化 4]
Figure imgf000004_0002
(ここで、 rは 0又は 1を表す。）で表される基
を表し、
置換基群 Aは、ハロゲン、メチル基、ェチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及び-トロ 基からなる。 ]
[0011] ここで、 Xは一 NH— (CH ) —CO—で表される基であることが好ましぐその場合
2 4
、 nは 2〜5の整数、特に 3であることが好ましい。
[0012] また、 nが 3であり、 Xのうち 2つが—NH—(CH ) — CO—で表される基であり、
2 4
残りの Xが、
置換基群 Aから選択される置換基を有して 1ヽてもよ ヽ式
[化 5]
Figure imgf000004_0003
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 6]
Figure imgf000005_0001
で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して 、てもよ 、式
[化 7]
Figure imgf000005_0002
(ここで、 pは 0〜2の整数を表し、 qは 0又は 1を表す。）で表される基、又は 置換基群 Aから選択される置換基を有して 、てもよ 、式
[化 8]
Figure imgf000005_0003
(ここで、 rは 0又は 1を表す。）で表される基
であることが好ましい。
[0013] 特に、 nが 3であり、 Xのうち 2つが NH— (CH ) CO で表される基であり、残
2 4
りの Xが、ハロゲン、メチル基、ェチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及び-トロ基から なる群から選択される置換基を有して!/ヽてもよ ヽ式
[化 9]
Figure imgf000005_0004
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基であることが好ましい。
[0014] さらには、 nが 3であり、 Xのうち 2つが NH— (CH ) —CO で表される基であり
2 4
、残りの Xが式
[化 10]
Figure imgf000006_0001
で表される基であることが好まし 、。
[0015] 上記化合物又はその薬学的に許容される塩は、 GPR7に選択的なリガンドであり、
GPR7に選択的なァゴ-ストである。
[0016] 本発明は、また、上記化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする医 薬を提供する。より具体的には、本発明は、肥満、糖尿病又は過食症の予防'治療 剤、食欲増進剤、下垂体ホルモンの分泌不全の予防'治療剤、睡眠障害の予防'治 療剤、鎮痛剤、ストレスの予防'治療剤を提供する。
[0017] 本発明は、また、 GPR7に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)候補化合物が存在する条件及び存在しな！ヽ条件の下で、 GPR7と本発明の化合 物又はその薬学的に許容される塩とを接触させ、 GPR7と本発明の化合物又はその 薬学的に許容される塩との結合量を測定する工程と、
(b) GPR7と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を変化させ る候補化合物を選択する工程と、
を備える方法を提供する。
発明の効果
[0018] 本発明の化合物は、 GPR7に対する選択性が非常に高いため、 GPR7の機能を解 明する上で有用なツールとなる。また、本発明の化合物は摂食障害をはじめとする様 々な疾患の予防 ·治療剤となり、さらに、様々な疾患に対する予防 ·治療剤となる医薬 品候補ィ匕合物のスクリ一ユングに応用することも可能である。
発明を実施するための最良の形態
[0019] (化合物）
以下、本発明の化合物について説明する。本発明の化合物は、 Trp-Tyr-Lys — (X) -Glv-Arg-Ala-Ala-Gly-Leu-Leu-Ser-Gly-Leu-NHで n 2 表される。この化合物は、 desBr— hNPB (l— 23)の 4〜13残基目のアミノ酸を、アミ ノ基及びカルボキシル基を有する n個の基 (Xに相当）に置換した、 hNPB (ヒト ニュ 一口ペプチド B)のアナログである。 Leu-NHは、 C末端であるロイシン残基のカル ボキシル基がアミド化されていることを表す。また、 Lys— (X) — Glyは、リジン残基（ hNPBの 3残基目に相当）のカルボキシル基と 1番目（N末端であるトリプトファンから 数える。以下同様。）の Xのアミノ基とが結合してアミド結合を形成し、 i番目の Xのアミ ノ基と i+ 1番目の Xのカルボキシル基とが結合してアミド結合を形成し、 n番目の の カルボキシル基とグリシン残基 (hNPBの 14残基目に相当）のァミノ基とが結合してァ ミド結合を形成して 、ることを表す。
[0020] ここで、 nは 2〜 10の整数を表す。
[0021] また、 Xは独立して、以下の（1)〜（5)の基を表す：
(1) -NH- (CH ) -CO- (ここで、 mは 2〜6の整数を表す。）で表される基、
2 m
(2)置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 11]
Figure imgf000007_0001
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基、
(3)置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 12]
Figure imgf000007_0002
で表される基、
(4)置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 13]
Figure imgf000007_0003
(ここで、 pは 0〜2の整数を表し、 qは 0又は 1を表す。）で表される基、又は (5)置換基群 Aから選択される置換基を有して 、てもよ ヽ式
[化 14]
Figure imgf000008_0001
(ここで、 rは 0又は 1を表す。）で表される基。
[0022] 「置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ」とは、環 (ベンゼン環、ピリ ジン環、ァゼチジン、ピロリジン環、ピぺリジン環及びシクロへキサン環）上の任意の 1 又は複数の水素原子が置換基群 A (ハロゲン、メチル基、ェチル基、ヒドロキシル基、 メトキシ基及び-トロ基)力 選択される置換基に置換されて 、てもよ 、ことを 、う。
[0023] 式
[化 15]
Figure imgf000008_0002
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基とは、ベンゼン環の任意の水素原子が NH— (CH )—及び— CO—に置換された 2価の基を表し、具体的には、以下の式
2 1
で表される基を表す。
[化 16]
Figure imgf000008_0003
[0024] また、式
Figure imgf000009_0001
で表される基とは、ピリジン環の任意の水素原子が NH 及び CO に置換され た 2価の基を表し、具体的には、以下の式で表される基を表す。
[化 18]
Figure imgf000009_0002
また、式
[化 19]
Figure imgf000009_0003
(ここで、 pは 0〜2の整数を表し、 qは 0又は 1を表す。）で表される基とは、ァゼチジン 1ーィル基、ピロリジン 1 ィル基及びピぺリジン 1ーィル基の任意の水素原子 が—（CH ) —CO—に置換された 2価の基を表し、具体的には以下の式で表される
2 q
基を表す。
[化 20]
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000010_0002
(ここで、 rは 0又は 1を表す。）で表される基とは、シクロへキサン環の任意の水素原 子が— NH—及び—（CH ) —CO—に置換された 2価の基を表し、具体的には以下
2 r
の式で表される基を表す。
[化 22]
Figure imgf000010_0003
[0027] 本発明の化合物は、例えば、公知のペプチド合成法を応用して合成することが可 能である。公知のペプチド合成法としては、 Fmoc法又は Boc法による固相合成法又 は液相合成法などがある。特に、 Fmoc法による固相合成法が収率等の観点力も優 れている。 Fmoc法による固相合成法で使用する Fmoc基で保護されたアミノ酸又は Xは、市販されているものを利用することができ、また、必要に応じて公知の方法で合 成することもできる。 N末端（トリブトファン)まで伸長した後、トリフルォロ酢酸などで処 理することにより脱保護を行い、本発明の化合物を固相 (榭脂)力 切断し、必要に 応じて精製 (例えば、 ODSカラムなどを用いた逆相 HPLC等）を行う。
[0028] 本発明の化合物は、 Xが一 NH— (CH ) —CO—で表される基であることが好まし
2 4
く（5—アミノ吉草酸 (Avaと略す）に相当する）、その場合、 nは 2〜5の整数であること が特に好ましぐ nが 3であることが最も好ましい。 Xが Avaの場合、本発明の化合物 は適度な柔軟性と鎖長を備え、 GPR7にフィットすると考えられる。また、 nが 2〜5の 整数の場合、本発明の化合物は GPR7に対する特異性が高ぐ特に nが 3である本 発明の化合物は、 GPR7の選択性は GPR8の約 2900倍である。
[0029] また、本発明の化合物は、 nが 3であり、 Xのうち 2つが— NH— (CH ) —CO—で
2 4
表される基であり、残りの Xが、置換基群 Aから選択される置換基を有していてもよい 式
[化 23]
Figure imgf000011_0001
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 24]
Figure imgf000011_0002
で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式 [化 25]
Figure imgf000012_0001
(ここで、 pは 0〜2の整数を表し、 qは 0又は 1を表す。）で表される基、又は 置換基群 Aから選択される置換基を有して 、てもよ 、式
[化 26]
Figure imgf000012_0002
(ここで、 rは 0又は 1を表す。）で表される基
であることが好ましい。 -NH- (CH ) —CO—で表される基を 2つ有することにより
2 4
、本発明の化合物は適度な柔軟性と鎖長を備え、ベンゼン環、ピリジン環、ァゼチジ ン、ピロリジン環、ピぺリジン環又はシクロへキサン環を 1つ有することにより、本発明 の化合物は適度な剛直性を備え、 GPR7にフィットすると考えられる。
適度な剛直性という観点から、 Xはベンゼン環又はピリジン環であることが好ましぐ 特にベンゼン環であることが好ましい。すなわち、 Xは、ハロゲン、メチル基、ェチル 基、ヒドロキシル基、メトキシ基及び-トロ基からなる群から選択される置換基を有して いてもよい式
[化 27]
Figure imgf000012_0003
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基であることが好ましい。中でも、 Xが式 [化 28]
Figure imgf000012_0004
で表される基（2—、 3 及び 4ーァミノ安息香酸 (それぞれ、 2— Abz、 3— Abz及び 4— Abzと略す）に相当する）である場合には、本発明の化合物は GPR7に対する特 異性が高いため、 Xはこれらの基であることが好ましい。特に、 Xが 2— Abzである場 合には、 GPR7の選択性は GPR8の約 1700倍である。
[0031] 本発明の化合物の薬学的に許容される塩も本発明の範囲に包含される。薬学的に 許容される酸としては、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、 例えば、塩酸塩、フッ化水素酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩等のハロゲンィ匕 水素酸塩;硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、炭酸塩等の無機酸塩;メタンスル ホン酸塩、トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩等の低級アルキルス ルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、 p トルエンスルホン酸塩等のァリ ルスルホン 酸塩;及びフマル酸塩、コハク酸塩、クェン酸塩、酒石酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸 塩等の有機酸塩を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えばナトリウム、力リウ ム等のアルカリ金属塩;カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属塩;及びアン モ -ゥム塩、グァ-ジン、トリェチルァミン、ジシクロへキシルァミン等の有機塩基によ る塩が挙げられる。本発明の化合物は、常法に従って薬学的に許容される塩に変換 され得る。
[0032] (GPR7選択的リガンド及び GPR7選択的ァゴ-スト）
本発明の GPR7選択的リガンド及び GPR選択的ァゴニストは、本発明の化合物又 はその薬学的に許容される塩力もなる。リガンド及びァゴニストが GPR7選択的である とは、 GPR8よりも GPR7に対してリガンド等がより強く結合すること (結合定数が大き V、）や GPR8よりも GPR7に対するリガンド等の EC (50%有効濃度）が低 、ことを ヽ
50
[0033] 本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩は GPR7に対する選択性が高い 。例えば、実施例に示したように、結合阻害実験 (IC (50%阻害濃度）の比較)の結
50
果カも約 15〜2900倍選択的であることが分かっている（表 1及び表 2)。また、 EC
50 の測定結果力も約 4〜165倍選択的であることが分力つている（表 1)。したがって、本 発明の化合物又はその薬学的に許容される塩は、 GPR7選択的なリガンド及び GPR 7選択的なァゴニストとして機能する。 [0034] (医薬）
本発明の医薬は、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分とし て含有する。 GPR7及び GPR7リガンドが関与する疾患や症状に対して本発明の医 薬は適用可能であるが、具体的な医薬としては、肥満、糖尿病又は過食症の予防- 治療剤、食欲増進剤、下垂体ホルモンの分泌不全の予防'治療剤、睡眠障害 (不眠 等)の予防'治療剤、鎮痛剤、ストレス (ストレス性の過食'不眠等)の予防'治療剤な どである。
[0035] 本発明の医薬は、その投与形態に合わせ、本発明の化合物に薬剤学的に許容さ れる添加剤を加えて各種製剤化することができる。添加剤としては、製剤分野におい て通常用いられる各種の添加剤が使用可能であり、例えばゼラチン、乳糖、白糖、酸 ィ匕チタン、デンプン、結晶セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキ シメチルセルロース、トウモロコシデンプン、マイクロクリスタリンワックス、 白色ワセリン 、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、無水リン酸カルシウム、クェン酸、クェン酸三ナ トリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ソルビトール、ソルビタン脂肪酸エステル、ポ リソルベート、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、硬化ヒマシ油、ポリビニル ピロリドン、ステアリン酸マグネシウム、軽質無水ケィ酸、タルク、植物油、ベンジルァ ルコール、アラビアゴム、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、シクロデキ ストリン及びヒドロキシプロビルシクロデキストリン等が挙げられる。
[0036] これらの添加剤との混合物として製剤化される剤形としては、例えば錠剤、カプセ ル剤、顆粒剤、散剤若しくは坐剤等の固形製剤;シロップ剤、エリキシル剤若しくは注 射剤等の液体製剤等が挙げられる。これらは、製剤分野における通常の方法に従つ て調製することができる。なお、液体製剤にあっては、用時に水又は他の適当な媒体 に溶解又は懸濁させる様式であってもよい。また、特に注射剤の場合、必要に応じて 生理食塩水又はブドウ糖液に溶解又は懸濁させてもよく、更に緩衝剤や保存剤を添 カロしてちょい。
[0037] 本発明の化合物を例えば臨床の場で使用する場合、その投与量及び投与回数は 、患者の性別、年齢、体重、症状の程度及び目的とする処置効果の種類と範囲等に より異なるが、一般に経口投与の場合、成人 1日あたり、 0. 01〜： LOOmgZkg、好ま しくは 0. 03〜lmgZkgを 1〜数回に分けて、また非経口投与の場合は、 0. 001〜 lOmgZkg、好ましくは 0. 001〜0. lmg/kg,より好ましくは 0. 01〜0. lmg/kg を 1〜数回に分けて投与するのが好ましい。通常の内科医、獣医又は臨床医は病状 進行を阻止し、抑制し又は停止させるに必要な効果的薬物量を容易に決定し処理 することができる。
[0038] 本発明の医薬は、本発明の化合物を全薬剤 1. 0〜： LOO重量％、好ましくは 1. 0〜 60重量％の割合で含有することができる。これらの製剤は、また、治療上有効な他の 化合物を含んでいてもよい。
[0039] (スクリーニング方法）
GPR7に結合する化合物をスクリーニングする本発明の方法は以下の工程を備え る：
(a)候補化合物が存在する条件及び存在しな！ヽ条件の下で、 GPR7と本発明の化合 物又はその薬学的に許容される塩とを接触させ、 GPR7と本発明の化合物又はその 薬学的に許容される塩との結合量を測定する工程及び
(b) GPR7と本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩との結合量を変化させ る候補化合物を選択する工程。
[0040] GPR7は様々な疾患や症状に関連することから、 GPR7に結合する化合物（ァゴ二 スト及びアンタゴ-スト）は、 GPR7が関与する疾患等の予防 ·治療薬となり得る。具 体的には、肥満、糖尿病又は過食症の予防'治療剤、食欲増進剤、下垂体ホルモン の分泌不全の予防'治療剤、睡眠障害 (不眠等)の予防'治療剤、鎮痛剤、ストレス（ ストレス性の過食'不眠等)の予防'治療剤などである。本発明のスクリーニング方法 によれば、これらの医薬の候補ィ匕合物を選別することが可能である。
[0041] 本発明のスクリーニング方法に用いる GPR7は、 GPR7発現細胞の膜画分を利用 することができる。 GPR7は哺乳動物、特にヒト由来の GPR7であることが好ましい。 G PR7発現細胞の膜画分は特開 2004— 49003号公報に記載の方法に従って調製 することができる。具体的な調製方法は次の通りである。公知の配列情報に基づいて 、 GPR7の cDNAを PCR法等により増幅し、増幅した cDNAを適切な発現ベクター にクロー-ングする。 GPR7が挿入された発現ベクターを宿主細胞にトランスフエタト して、 GPR7発現細胞を得る。 GPR7発現細胞を破砕し、細胞破砕液から分画遠心 分離法や密度勾配遠心分離法などによって膜画分を調製する。膜画分には、発現し た GPR7及びリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。このような GPR7 発現細胞の膜画分の調製は、公知の方法を用いて当業者は容易に行うことができる 。なお、本発明のスクリーニング方法に用いる GPR7は、 GPR7発現細胞の膜画分で はなく GPR7発現細胞そのものであってもよ!/、。
[0042] 本発明のスクリーニング方法に用いる本発明の化合物は、 GPR7との結合量を測 定するために、標識されていることが好ましい。標識及び標識方法は特に制限されず 、当業者にとって公知の標識及び標識方法を利用することができる。具体的には、 [3 H]、 [125I]、 [14C]及び [35S]などで放射標識を禾 IJ用することができ、特に [1251]によ る放射標識が好ましい。
[0043] 工程 (a)は、候補化合物が存在する条件及び存在しな!ヽ条件の下で、 GPR7と本 発明の化合物とを接触させ、その結合量を測定する工程である。ここで、 GPR7と本 発明の化合物との接触は、適切なバッファ一中で行う。好ましくは pH6〜8のリン酸バ ッファー、トリス—塩酸バッファーなどを使用する力 GPR7、本発明の化合物及び候 補ィ匕合物の結合を阻害しない限りバッファーの種類は特に限定されない。必要に応 じて、 GPR7、本発明の化合物及び候補ィ匕合物間の非特異的結合を低減させる目 的のために、界面活性剤などをバッファーに加えてもよい。また、必要に応じて、 GP R7、本発明の化合物及び候補化合物の分解を抑制する目的のために、プロテア一 ゼ阻害剤をバッファーに加えてもょ ヽ。候補化合物が存在しな ヽ条件下又は存在す る条件下 (例えば、 10_1C)M〜10_7Mの濃度範囲で）、一定量の標識された本発明 の化合物（例えば、 5000cpm〜500000cpmの範囲内で設定する）と GPR7とを含 んだバッファーをインキュベートする。インキュベーション温度は 4°C〜37°Cが好まし ぐインキュベーション時間は 30分〜 3時間が好ましい。インキュベーション後、グラス フィルタ一等で濾過し、適量のバッファーで洗浄し、グラスフィルター上の標識の量を 測定して (液体シンチレーシヨンカウンターや y—カウンターで放射活性を測定する） 、 GPR7と本発明の化合物との結合量を測定する。
[0044] 工程 (b)は、 GPR7と本発明の化合物との結合量を変化させる候補ィ匕合物を選択 する工程である。工程 (a)で測定した結合量が、候補化合物の存在下及び非存在下 で結合量に変化がないかどうかを調べる。例えば、候補化合物の非存在下の結合量 (B )から非特異的な結合量 (NSB)を引いた数値 (B—NSB)を 100%としたとき、
0 0
特異的結合量 (B— NSB)が 50%以下になる候補ィ匕合物を GPR7に結合する化合 物として選択することができる。あるいは、 IC が所定値 (例えば、 1〜： LOOnM)以下
50
の候補ィ匕合物を GPR7に結合する化合物として選択してもよい。
実施例
[0045] 以下、実施例を挙げて本発明について更に詳しく説明する力 本発明はこれらの 実施例に限定されるものではな 、。
[0046] (合成例 1) hNPW： Trp - Tyr - Lys - His - Val - Ala - Ser - Pro - Arg - Ty r His— Thr— Val— Gly— Arg— Ala— Ala— Gly— Leu— Leu— Met— Gly— L eu― Arg― Arg— ¾er— Pro― Tyr― Leu― Trpの合成
Fmoc— Trp (Boc)— NovaSyn (商標） TGA resin (Novabiochem社）を出発 原料とし、ペプチド合成機 Pioneer (商標）モデル 9010を用いて、 HATU (0— (7— ァザべンゾトリアゾール 1—ィル） N, N, Ν' , Ν，一テトラメチルゥ口-ゥム へキ サフルォロリン酸)を縮合試薬とした Fmoc法で、ペプチド合成を行った。具体的には 、 Fmoc— Leu, Fmoc— Tyr (tBu Fmoc— Pro, Fmoc― Ser (tBu) , Fmoc— A rg (Pbf) , Fmoc— Arg (Pbf) , Fmoc— Leu, Fmoc— Gly, Fmoc— Met, Fmoc — Leu, Fmoc— Leu, Fmoc― Gly, Fmoc— Ala, Fmoc— Ala, Fmoc— Arg (Pb f) , Fmoc— Gly, Fmoc— Val, Fmoc— Thr (tBu) , Fmoc— His (Trt) , Fmoc— Tyr (tBu) , Fmoc— Arg (Pbf) , Fmoc— Pro, Fmoc― Ser (tBu) , Fmoc— Ala, Fmoc— Val, Fmoc— His (Trt) , Fmoc― Lys (Boc) , Fmoc— Tyr (tBu) , Fmoc —Trp (Boc)の順で縮合を行 ヽ、 Trp (Boc)—Tyr (tBu)—Lys (Boc)—His (Trt) -Val -Ala -Ser (tBu) -Pro -Arg (Pbf) -Tyr (tBu)—His (Trt) -Thr (tBu) - Val - Gly - Arg (Pbf)— Ala - Ala - Gly - Leu— Leu— Met— Gly— Leu— Ar g (Pbf) - Arg (Pbf) - Ser - Pro - Tyr (tBu) -Leu -Trp (Boc)—NovaSyn (商 標） TGA resinを得た。この樹脂に TFAZチオア-ノール Zエタンジチオール Z m タレゾール（95Z2. 5/1. 5ZDを加え室温で 1時間 30分振盪した後、榭脂を ろ去した。このろ液に冷却したエーテルをカ卩え、粗 Trp— Tyr— Lys— His— Val— A la— Ser— Pro— Arg— Tyr— His— Thr— Val— Gly— Arg— Ala— Ala— Gly— L eu— Leu— Met— Gly— Leu— Arg— Arg— S er— Pro— Tyr— Leu— Trpを沈殿 として得た。この粗ペプチドを YMC— Pack ODS-AQ, S— 5, 120Aカラム（20 X 250mm)を用いた逆相分取 HPLCで精製し、目的物を含む分画を回収、凍結乾 燥すること〖こより目的物を得た。
[0047] HPLCの条件は以下の通りである。
A液： 0. 1%TFAを含む水
B液： 0. 1%TFAを含むァセトニトリル
グラジェント： AZB = 95Z5で 1分間溶出した後、 AZB=75Z25〜60Z40 (リニ ァー)で 15分間溶出
流速： lOmLZ分
[0048] (合成例 2) desBr - hNPB： Trp - Tyr - Lys - Pro - Ala - Ala - Gly - His - ¾er— Ser— Tyr— Ser— Val— Giy— Arg— Ala— Ala— Gly— Leu— Leu— ¾er— Gly - Leu - Arg - Arg -Ser -Pro- Tyr - Alaの合成
出発原料に Fmoc— Ala— NovaSyn (商標） TGA resinを用いて、合成例 1と同 様の方法により、 desBr— hNPBを合成した。 HPLCのグラジェントは、 A/B = 95 Z5で 1分間溶出した後、 AZB = 80Z20〜65Z35 (リニア一）で 15分間溶出する という条件で行った。
[0049] (合成例 3) [Phe2, 28]— hNPW:Trp— Phe— Lys— His— Val— Ala— Ser— Pro - Arg - Tyr -His- Thr - Val - Gly - Arg - Ala - Ala - Gly -Leu- Leu
— Met— Gly— Leu— Arg— Arg— Ser— Pro— Phe— Leu— Trpの合成
合成例 1と同様の方法により、 [Phe2, 28]— NPWを合成した。逆相分取 HPLCの グラジェントは、 AZB= 95Z5で 1分間溶出した後、 AZB = 70Z30〜55Z45で 1 5分間溶出するという条件で行った。
[0050] (合成例 4) desBr— hNPB (1— 23)— NH： Trp— Tvr— Lys— Pro— Ala— Ala
2
— Gly— His— Ser— Ser— Tyr— Ser— Val— Gly— Arg— Ala— Ala— Gly— Leu - Leu - Ser -Gly- Leu -NHの合成 出発原料に NovaSyn (商標） TGR resinを用いて、合成例 1と同様の方法により 、 desBr— hNPB (l 23)— NHを合成した。逆相分取 HPLCのグラジェントは、 A
2
ZB = 95Z5で 1分間溶出した後、 AZB = 78Z22〜58Z42(リニア一）で 10分間 溶出するという条件で行った。
[0051] (合成例 5) [des4— 13, Aval]— desBr—hNPB (1— 23)— NH :Trp—Tvr—
2
Lvs— Ava— Gly— Arg— Ala— Ala— Gly— Leu— Leu— Ser— Gly— Leu— NH
2 の合成
合成例 4と同様の方法により、 [des4— 13, Aval]—desBr—hNPB (1— 23)—N Hを合成した。逆相分取 HPLCのグラジェントは、 AZB = 95Z5で 2分間溶出した
2
後、 AZB = 80Z20〜60Z40 (リニア一）で 15分間溶出するという条件で行った。
[0052] (合成例 6) [des4— 13, Ava2]— desBr— hNPB (l 23)— NH :Trp— Tvr—
2
Lys― Ava― Ava― Gly― Arg― Ala― Ala― Gly—Leu— Leu— ¾er— Gly— Leu -NHの合成
2
合成例 5と同様の方法により、 [des4— 13, Ava2]—desBr—hNPB (l 23)—N Hを合成した。
2
[0053] (合成例 7) [des4— 13, Ava3]— desBr— hNPB (l 23)— NH :Trp— Tvr—
2
Lys― Ava― Ava― Ava― Gly― Arg― Ala― Ala― Gly— Leu— Leu— ¾er— Gly Leu— NHの合成
2
合成例 5と同様の方法により、 [des4— 13, Ava3]—desBr—hNPB (l 23)—N Hを合成した。
2
[0054] (合成例 8) [des4— 13, Ava4]— desBr— hNPB (l 23)— NH :Trp— Tvr—
2
Lys― Ava― Ava― Ava― Ava― Gly― Arg― Ala― Ala― Gly—Leu— Leu— ¾er — Gly— Leu— NHの合成
2
合成例 5と同様の方法により、 [des4— 13, Ava4] - desBr - hNPB ( 1 - 23) - N Hを合成した。
2
[0055] (合成例 9) [des4— 13, Ava5]—desBr— hNPB (1— 23)— NH :Trp— Tvr—
2
Lys― Ava― Ava― Ava― Ava― Ava― Gly― Arg― Ala― Ala― Gly— Leu— Le u— Ser— Gly— Leu— NHの合成 合成例 5と同様の方法により、 [des4— 13, Ava5]—desBr—hNPB (l— 23)—N Hを合成した。
2
[0056] (合成例 10) [des4— 13, Ava— Ava— 2Abz]— desBr— hNPB (l— 23)— N H ： Trp - Tvr - Lys - Ava - Ava - 2Abz - Gly - Arg - Ala - Ala - Gly - Leu
2
-Leu-Ser-Gly-Leu-NHの合成
2
合成例 5と同様の方法により、 [des4— 13, Ava— Ava— 2Abz]— desBr— hNPB (l— 23)—NHを合成した。粗ペプチドの精製は、 Combi HT SB— C18, S— 5
2
, 120Aカラム（21. I X 150mm)を用いた逆相分取 HPLCで行った。
[0057] HPLCの条件は以下の通りである。
A液： 0. 1%TFAを含む水
B液： 0. 1%TFAを含むァセトニトリル
グラジェント： AZB = 95Z5で 1分間溶出した後、 AZB= 95Z5〜40Z60(リニア 一)で 8分間溶出
流速： 20mLZ分
[0058] (合成例 11) [des4— 13, Ava— Ava— 3Abz] — desBr— hNPB (1— 23)— N H ： Trp— Tvr— Lys— Ava— Ava— 3 Abz— Gly - - Arg― Ala― Ala― Gly—Leu
2
-Leu-Ser-Gly-Leu-NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4- 13, Ava -Ava - 3 Abz]— desBr— hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0059] (合成例 12) [des4— 13, Ava— Ava— 4Abz] — desBr— hNPB (1— 23)— N H ： Trp— Tvr— Lys— Ava— Ava— 4Abz— Gly - - Arg― Ala― Ala― Gly—Leu
2
— Leu— Ser— Gly— Leu— NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4- 13, Ava — Ava— 4Abz]— desBr— hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0060] (合成例 13) [des4— 13, Ava— 2Abz— Ava] — desBr— hNPB (1— 23)— N H ： Trp— Tvr— Lys— Ava— 2Abz— Ava— Gly - - Arg― Ala― Ala― Gly—Leu
2
- Leu - Ser -Gly- Leu -NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4- 13, Ava - 2Abz-Ava]— desBr— hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0061] (合成例 14) [des4— 13, Ava— 3Abz— Ava] — desBr— hNPB (l— 23)— N H ： Trp - Tvr - Ly s - Ava - 3 Abz - Ava - Gly - - Arg― Ala― Ala― Gly—Leu
2
— Leu— Ser— Gly— Leu— NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4- 13, Ava - 3 Abz -Ava]— desBr— hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0062] (合成例 15) [des4— 13, Ava— 4Abz— Ava] — desBr— hNPB (l— 23)— N H ： Trp - Tvr - Ly s - Ava - 4Abz - Ava - Gly - - Arg― Ala― Ala― Gly—Leu
2
- Leu - Ser -Gly- Leu -NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4- 13, Ava — 4Abz— Ava]— desBr— hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0063] (合成例 16) [des4- 13, 2Abz— Ava— Ava] — desBr— hNPB (l— 23)— N H ： Trp - Tvr - Ly s - 2Abz - Ava - Ava - Gly - - Arg― Ala― Ala― Gly—Leu
2
- Leu - Ser -Gly- Leu -NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4— 13, 2Abz—Ava—Ava]—desBr—hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0064] (合成例 17) [des4— 13, 3Abz— Ava— Ava]— desBr— hNPB (l— 23)— N H ： Trp - Tvr - Lys - 3 Abz - Ava - Ava - Gly - Arg - Ala - Ala - Gly - Leu
2
- Leu - Ser -Gly- Leu -NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4— 13, 3Abz—Ava—Ava]—desBr—hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0065] (合成例 18) [des4— 13, 4Abz— Ava— Ava]— desBr— hNPB (l— 23)— N H ： Trp― Tyr― Lvs― 4Abz― Ava― Ava― Gly― Arg― Ala― Ala― Gly― Leu
2
- Leu - Ser -Gly- Leu -NHの合成
2
合成例 10と同様の方法により、 [des4— 13, 4Abz—Ava—Ava]—desBr—hNP B (l— 23)— NHを合成した。
2
[0066] (合成例 19) [Phe2] - hNPW ( 1 - 23)： Trp - Phe - Lys - His - Val - Ala - Ser— Pro— Arg— Tyr— His— Thr—Val— Glv— Arg— Ala— Ala— Gly— Leu— Leu -Met- Gly -： Leuの合成
出発原料に Fmoc— Leu— NovaSyn (商標) TGA resin (novabuochem社)を 用いて、合成例 1と同様の方法により、 [Phe2]— NPW(1— 23)を合成した。 HPLC のグラジェントは、 AZB = 95Z5で 2分間溶出した後、 AZB=80Z20〜60Z40 ( リニア一)で 15分間溶出するという条件で行った。
[0067] 試験例 1
(1) ラクトペルキシダ一ゼ法を用いた放射ョード標識 hNPW ( [12¾ - [Phe2]— h NPW(1— 23) )の作製
[0068] lnmolの [Phe2]— hNPW (1— 23) (合成例 19で調製）を 5 μ Lの無水 DMSOに 溶力し、 の 0. 1M塩化ニッケルと混合した。続いて、 10 の0. 001%過酸ィ匕 水素水、 10 Lの酵素液（0. 1M HEPES緩衝液で 10 /z g/mLに調整したラタトパ 一ォキシダーゼ（シグマ社） )および Iodine— 125 (アマシャム） 37Mbq/10 μ Lと混 合した後、室温で 60分間反応させた。 10 Lの 1%アジィ匕ナトリウムを加えて反応を 停止した後、 PD— 10ゲルろ過カラム (アマシャム社）により、放射標識ペプチド画分 を分取し、 [1251] [Phe2]— hNPW (1— 23)を得た。
[0069] (2) 結合阻害試験
ヒト GPR7又は GPR8をコードする cDNA配列 [Genomicsゝ 28卷、 84頁（1995年 )参照]を PCR法にて増幅し、発現ベクター pIRES— hygro (クロンテック社）にクロー ユングした。得られた発現ベクターをカチオン性脂質法 [Proceedings of the na tional academy of sciences oi the united states of America ^ 84卷、 7413頁（ 1987年）参照]を用 、て HEK293ZCRE - BLA細胞（AURORA社）に トランスフエタトし、 GPR7又は GPR8発現細胞を得た。
[0070] GPR7又は GPR8を発現する細胞から調製した膜標品を被検化合物及び 28、 000 cpmの [1251] - [Phe2] -hNPW (1 - 23)とともに、アツセィ緩衝液（25mM Tris 緩衝液、 150mM NaCl、 pH7. 4)中で室温にて 1時間インキュベーションした後 、グラスフィルター GF/Cにて濾過した。 25mM Tris緩衝液 (pH7. 4)にて洗浄後 、グラスフィルター上の放射活性を測定した。非特異的結合は 1 μ M hNPW (合成 例 1で調製)存在下で測定し、 [Phe2] hNPW(l— 23)特異的結合に対する被験 化合物の 50%阻害濃度（IC 値）を算出した [Molecular Pharmacology
50 、 55卷、
1101頁（1999年)参照]。
[0071] 試験例 2 各種合成ペプチドの GPR7及び GPR8の活性化能の測定
Zlakarmikの方法（Science, 1998年， 279卷， 84頁参照）に従い、各種合成べ プチドの GPR7又は GPR8に対する活性を測定した。 GPR7又は GPR8を発現させ た HEK293ZCRE— BLA細胞（試験例 1の（2)において調製）を、 PBS (―)緩衝 液（GIBCO— BRL社）で 2回洗浄した後、 Cell— dissociation buffer (GIBCO— BRL社）を添カ卩し、 COインキュベーター内にて 37°Cで 3分間保温し、培養フラスコ
2
を軽くたたいて細胞をフラスコから遊離させた。遠心操作により細胞を回収後、 0. 1 %BSA (シグマ社）を含む Opti— MEM培地（GIBCO— BRL社）に懸濁して細胞数 を計測し、 8 X 105細胞 ZmLの細胞懸濁液を調製した。終濃度の 50倍濃度の各被 検化合物を含む DMSO溶液 2 Lに、終濃度 1 μ Μになるようにフォルスコリン (シグ マ社）を加えた 0. 1%BSAを含む Opti— MEM培地 50 μ Lを添カ卩し、反応溶液とし た。この反応溶液に、上記細胞懸濁液 50 Lを添加して反応を開始し、 COインキュ
2 ベータ一内にて 37°Cで 3時間保温した。
[0072] 次に、 BLAアツセィキット（AURORA社）を用いて、 A液 [ImM CCF2-AM/ 無水 DMSO溶液 ] 12 Ι^、： B液 [lOOmgZmL Pluronicl27, 0. 1%酢酸 ZDM SO溶液] 120 μ C液 [24% (w/w) PEG— 400, 18% TR40/H O] 2mLの
2 割合で混ぜた色素導入緩衝液を調製し、色素導入緩衝液 20 Lを上記細胞反応液 に添加し、細胞内に j8ラクタマーゼ基質 (CCF2— AM)を導入した。室温で 1時間放 置した後、励起波長 409nm、蛍光波長 460nm (CCFの βラクタマーゼ水解産物） 及び 530nm (CCF)におけるサンプルの蛍光強度を測定した。 βラクタマーゼ活性（ 460nmでの蛍光強度 Z530nmでの蛍光強度）を指標に、各種ペプチドの GPR7又 は GPR8に対する活性を測り、被験化合物の 50%有効濃度 (EC )を算出した。
50
[0073] 合成例 4〜9で得られたペプチドを用いた場合の IC 及び EC を表 1に、合成例 1
50 50
0〜18及び 1で得られたペプチドを用いた場合の IC を表 2に示す。
50
[0074] [表 1] 合成例 GPR7 (nM) GPR8 (nM)
IC50 EC50 I C50 EC50
4 0, 23 0.24 24 0.86
5 0.55 1.7 310 280
6 0.47 2.2 300 94
7 0, 09 0.48 260 77
8 1.1 1.2 360 51
9 >100 not tested 2600 not tested
[0075] [表 2]
Figure imgf000024_0001
産業上の利用可能性
[0076] 本発明の化合物は、 GPR7に選択的なリガンドであり、摂食、エネルギー代謝及び 内分泌調節に関連した疾患の治療，予防に有効である。

Claims

請求の範囲 Trp - Tyr - Lys - (X) - Gly - Arg - Ala - Ala - Gly - Leu - Leu— Ser y-Leu- NHで表される化合物又はその薬学的に許容される塩。 2 [式中、 nは 2〜10の整数を表し、 Xは独立して、 -NH- (CH ) -CO- (ここで、 mは 2〜6の整数を表す。）で表される基、 2 m 置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 1]
Figure imgf000025_0001
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して 1ヽてもよ ヽ式
[化 2]
Figure imgf000025_0002
で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 3]
Figure imgf000025_0003
(ここで、 pは 0〜2の整数を表し、 qは 0又は 1を表す。）で表される基、又は 置換基群 Aから選択される置換基を有して 1ヽてもよ ヽ式
[化 4]
Figure imgf000025_0004
(ここで、 rは 0又は 1を表す。）で表される基
を表し、
置換基群 Aは、ハロゲン、メチル基、ェチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及び-トロ 基からなる。 ]
[2] Xがー NH— (CH ) CO で表される基である、請求項 1に記載の化合物又は
2 4
その薬学的に許容される塩。
[3] nが 2〜5の整数である、請求項 2に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩
[4] nが 3である、請求項 2に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
[5] nが 3であり、 Xのうち 2つが NH—（CH ) — CO で表される基であり、
2 4
残りの Xが、
置換基群 Aから選択される置換基を有して 1ヽてもよ ヽ式
[化 5]
Figure imgf000026_0001
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 6]
Figure imgf000026_0002
で表される基、
置換基群 Aから選択される置換基を有して ヽてもよ ヽ式
[化 7]
Figure imgf000026_0003
(ここで、 pは 0〜2の整数を表し、 qは 0又は 1を表す。）で表される基、又は 置換基群 Aから選択される置換基を有して 、てもよ 、式
[化 8]
Figure imgf000027_0001
(ここで、 rは 0又は 1を表す。）で表される基
であり、
置換基群 Aが、ハロゲン、メチル基、ェチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及び-トロ 基力 なる、
請求項 1に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
nが 3であり、 Xのうち 2つが— NH— (CH ) —CO で表される基であり、
2 4
残りの X力 ハロゲン、メチル基、ェチル基、ヒドロキシル基、メトキシ基及びニトロ基力 らなる群力 選択される置換基を有して 、てもよ 、式
[化 9]
Figure imgf000027_0002
(ここで、 1は 0又は 1を表す。）で表される基である、
請求項 1に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
[7] nが 3であり、 Xのうち 2つが NH—（CH ) — CO で表される基であり、
2 4
残りの Xが式
[化 10]
Figure imgf000027_0003
で表される基である、請求項 1に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。 請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩から なる GPR7選択的リガンド。 請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩から なる GPR7選択的ァゴニスト。
請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有 効成分とする医薬。
請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有 効成分とする、肥満、糖尿病又は過食症の予防'治療剤。
請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有 効成分とする、食欲増進剤。
請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有 効成分とする、下垂体ホルモンの分泌不全の予防 ·治療剤。
請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有 効成分とする、睡眠障害の予防'治療剤。
請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有 効成分とする、鎮痛剤。
請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩を有 効成分とする、ストレスの予防 '治療剤。
GPR7に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)候補化合物が存在する条件及び存在しな！ヽ条件の下で、 GPR7と請求項 1〜7 のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩とを接触させ、 GP R7と請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容される塩 との結合量を測定する工程と、
(b) GPR7と請求項 1〜7のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容さ れる塩との結合量を変化させる候補化合物を選択する工程と、
を備える方法。
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