WO2006053910A1 - Composes bisphosphoniques pour empecher ou limiter la fixation de macromolecules, de microorganismes et d'un biofilm sur des surfaces solides, notamment metalliques ou minerales - Google Patents

Composes bisphosphoniques pour empecher ou limiter la fixation de macromolecules, de microorganismes et d'un biofilm sur des surfaces solides, notamment metalliques ou minerales Download PDF

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WO2006053910A1
WO2006053910A1 PCT/EP2005/056120 EP2005056120W WO2006053910A1 WO 2006053910 A1 WO2006053910 A1 WO 2006053910A1 EP 2005056120 W EP2005056120 W EP 2005056120W WO 2006053910 A1 WO2006053910 A1 WO 2006053910A1
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WO
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formula
composition
compounds
branched
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Application number
PCT/EP2005/056120
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Benoît DENIZOT
François HINDRE
David Portet
Original Assignee
Surfactis Technologies
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
Universite D'angers
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
    • C07F9/3839—Polyphosphonic acids
    • C07F9/3873—Polyphosphonic acids containing nitrogen substituent, e.g. N.....H or N-hydrocarbon group which can be substituted by halogen or nitro(so), N.....O, N.....S, N.....C(=X)- (X =O, S), N.....N, N...C(=X)...N (X =O, S)

Definitions

  • the invention relates to the field of the protection of solid surfaces, such as metal or mineral surfaces, against macromolecular and microbiological contamination, in particular bacterial contamination.
  • Microbiological contamination means contamination by microorganisms.
  • the invention particularly relates to novel bisphosphonic compounds, the anti-contamination compositions containing them, and their use for limiting the attachment of macromolecules and microorganisms, in particular bacteria, to surfaces, such as metal or mineral surfaces.
  • the polymeric layer formed may itself be potentially pathogenic, as in the case of adsorbed and partially denatured prions whose complete removal of the surface is difficult to obtain.
  • Microorganisms, and especially bacteria, are able to colonize various surfaces and form true communities. These surface colonization phenomena are at the origin of the formation of the biofilm which constitutes an important source of microbiological contamination.
  • the precursor phenomenon is the fixation or the adsorption of macromolecules by their denaturation and their spreading in contact with the surface.
  • macromolecules Polymers are of the protein or polysaccharide or even polyphenolic type. In general, they are of biological origin, in particular of bacterial origin. By binding to the surface, macromolecules form a potentially pathogenic polymeric layer, as in the case of adsorbed prions. Many microorganisms such as protozoa, bacteria, fungi or even algae, will then be able to develop in this polymeric layer by the presence of hydrophobic zones, amino groups or sulfides or mono or polysidic sites.
  • biofilm a film-like matrix
  • This film is known, for example, to be an essential factor in the contamination of air-conditioning installations by Legionella, allowing these germs to spread in high concentration.
  • this microbiological film will serve as a support for multicellular plant or animal organisms leading to thick films.
  • An example is the contamination of boat hulls, leading to a significant increase in their resistance to progress.
  • fouling or biofouling
  • biofouling all the successive processes leading to the colonization of surfaces by microorganisms or even multicellular organisms .
  • a close phenomenon is that of implanted prostheses, which quickly overlap macromolecules present in the media in contact, subsequently serving as a support for the invasion of migrating cells.
  • the structure of the biofilm is generally porous and allows the circulation of water and nutrients that allow the renewal and development of colonies of microorganisms.
  • This macromolecular layer also protects the microorganisms against external aggressions (biocides, antibiotics, antiseptics) by slowing the access of biologically active products to the cells.
  • different forces of attraction come into play depending on the type of surface. Those which generally intervene in this process are of electrostatic, ionic, Van Der Waals, hydrogen bonds or hydrophobic interactions.
  • the adsorption thus depends on the attraction or repulsion forces existing between the macromolecules and the surface.
  • the actual fixation of the microorganism depends on its type, the size of its population in the medium, the duration of its growth phase, and cell deformation. The latter also depends on the dispersion medium: solution temperature, pH, electrolyte concentration and nutrient availability.
  • the attachment force also depends on the load of the surface and the duration of the contact.
  • the best-known biofilm is probably the dental biofilm, commonly known as dental plaque, the complex ecosystem of the human oral cavity that causes dental caries, caries recurrence, periodontal disease and peri-implantitis. which jeopardize the longevity of the biomaterial.
  • Biocidal chemicals such as chlorine or anti-biotics
  • the use of chlorine to remove biofilm is only effective if it is removed manually from the surface.
  • Antibiotics are not satisfactory either because they are likely to cause the spread of resistance genes in microorganisms, including bacteria, thus making them gradually inactive. It is common to see active biocidal products in vitro against isolated bacteria becoming completely inactive against sessile bacteria.
  • repellent molecules are only effective for advanced multicellular organisms.
  • the approach chosen consists in rendering the physico-chemical properties of the solid surfaces, in particular the attraction forces of these surfaces, detrimental to adhesion or macromolecular adsorption, and thus to limiting or even preventing fixation. microorganisms, in particular bacteria, on these surfaces.
  • the difficulty of this approach lies in the identification of a compound which is capable of both binding or adsorbing rapidly, effectively and durably on the surface to be protected, and which prevents or limits the attachment of microorganisms on this surface. surface, through the creation of an interface between the surface and the external environment, unfavorable to the adhesion and development of microorganisms.
  • the aim of the invention is to overcome the drawbacks of the prior art by proposing particularly effective compounds and compositions adapted to the reduction of biofouling (in the broad sense of the term), according to various possible applications, in particular pastes and gels, aqueous solutions, alcoholic or organic, suspensions, foams, powders, aerosols ....
  • the aim of the invention is to define the most suitable manufacturing protocol for molecules that are effective in these applications.
  • the invention also aims to provide compositions using an effective amount of active compound, capable of combating microbiological contaminations of metal or mineral surfaces.
  • the invention aims in particular to obtain a composition comprising a compound capable of both being a good competitive inhibitor of protein binding and to attach effectively and sustainably to the metal or mineral surfaces to be protected.
  • the invention thus provides novel compounds capable of binding to metal or mineral surfaces and limiting the attachment of microorganisms, in particular bacteria, and the development thereof on these surfaces.
  • the invention is particularly directed to compositions containing these novel compounds and their use against microbiological contamination of metal or mineral surfaces, in the odontological field (limitation of the formation of dental plaque, fight against the formation of caries and periodontal diseases) and the fields of hospital hygiene and agri-food.
  • the invention firstly relates to the compounds of formula (I):
  • R 6 represents a hydrogen atom, a halogen atom, a linear or branched C 1 -C 12 alkyl group, an -OH group or an amine optionally substituted with one or two C 1 -C alkyl groups; 4, linear or branched, or a -A'- group N + R 5 R 2 R 5 3 ', X 1 -,
  • R 1 , R 1 ', R 2 , R 2 ', R 3 and R 3 ' represent independently of one another:
  • m is an integer between 0 and 12,
  • * p is an integer between 0 and 12,
  • Z represents an oxygen atom, a sulfur atom, a group - CR 7 R 8 R 8 -, a group -COO-, a group -CONR 7 - or a group -NR 7 R 8 - in which R 7 , R 8 and R 9 have the same meanings as R 6 , or a group - N + R 4 R 5 -, X 3 " in which R 4 and R 5 represent, independently of one another, an alkyl group in C 1 -C 12 , linear or branched,
  • pharmaceutically acceptable means acceptable from a toxicity point of view.
  • halogen atom means a fluorine, chlorine, bromine or iodine atom.
  • C 1 to C 4 alkyl and “C 1 to C 12 alkyl” respectively mean an alkyl of 1 to 4 carbon atoms and an alkyl of 1 to 12 carbon atoms.
  • a linear or branched C 1 to C 4 alkyl group especially includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl and tert-butyl groups.
  • R 7 , R 8 and R 9 have the same meanings as R 6 " means that R 6 ,
  • R 7 , R 8 and R 9 represent, independently of one another, a hydrogen atom, a halogen atom, a linear or branched C 1 -C 12 alkyl group, an -OH group or an amine group; optionally substituted by one or two linear or branched C 1 -C 4 alkyl groups, or a group -A 1 N + R 1 5 R 2 5 R 3 ', X 1 " as defined above.
  • metal surfaces such as stainless or Tacier I 5 aluminum
  • inorganic such as the tooth surface
  • the compounds of formula (I) comprise two phosphonic groups bonded to the same carbon atom (bisphosphonic or gem-diphosphonic groups) which make it possible to bind to the solid surfaces to be protected, and one or two optionally branched chains, also linked to this same atom. of carbon and comprising at least two quaternary ammonium functions, located one after the other on the chain or on branched chains.
  • the quaternary ammonium functions have two important roles in combating the phenomenon of microbiological contamination:
  • R 6 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an -OH group or an amine -NH 2 .
  • Z represents an oxygen atom, a sulfur atom, a group -
  • R 8 and R 9 are as defined above. Even more preferably, Z represents a group -N + R 4 R 5 -, X 3 " in which R 4 and R 5 represent, independently of one another, a C 1 -C 12 alkyl group, linear or branched.
  • R 1 , R 2 , R 31, R 4 and R 5 represent, independently of one another, a C 1 to C 4 alkyl group, which is preferably linear, such as ethyl or methyl.
  • R 1 , R 2 , and R 3 are identical and each represents a methyl or ethyl group and R 4 and R 5 are identical and each represents a methyl or ethyl group.
  • X, X 1 , X 2 and X 3 are chosen from iodide, chloride, bromide, fluoride, sulphonate, phosphate, phosphonate or any pharmacologically active ion.
  • the compounds according to the present invention are chosen from those corresponding to the following formula (Ia):
  • R 6 represents -OH or -NH 2 , m is an integer from 1 to 12, p is an integer from 1 to 12,
  • n + p is an integer between 2 and 12,
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 represent, independently of one another, a linear or branched C 1 -C 4 alkyl group, and
  • X " represents a pharmaceutically acceptable counterion.
  • m is preferably between 3 and 7 and p is preferably between 1 and 4.
  • R 1 , R 2 , R 31, R 4 and R 5 represent, independently of one another, a C 1 to C 4 alkyl group, which is preferably linear, such as ethyl or methyl.
  • R 1 , R 2 and R 3 are preferably identical and each represents a methyl or ethyl group
  • R 4 and R 5 are preferably identical and each represents a methyl or ethyl group.
  • X is chosen from iodide, chloride, bromide, fluoride, sulphonate, phosphate, phosphonate or any pharmacologically active ion.
  • the subject of the invention is a composition for topical oral hygiene, comprising at least one compound of formula (I) as described above, preferably a compound of formula (Ia), preferably in combination with one or more pharmaceutically acceptable excipients.
  • the composition advantageously comprises between 0.001% and 10% by weight of the compound of formula (I), preferably between 0.005% and 5% by weight, and even more preferably between 0.01% and 1% by weight.
  • the composition is typically in the form of a mouthwash, a spraying liquid, a toothpaste, a toothpaste gel, a paste to be applied, a powder, a chewing gum or to apply or foam.
  • composition may be applied to the teeth by various suitable techniques including brushing, dyeing, spraying, mouthwashing, chewing gum, or by means of a dental accessory such as a dental floss impregnated with said composition, a optionally disposable wipe impregnated with said composition or a sponge impregnated with said composition.
  • a dental accessory such as a dental floss impregnated with said composition, a optionally disposable wipe impregnated with said composition or a sponge impregnated with said composition.
  • Other possible means of application are known to those skilled in the art.
  • compositions such as prophylactic agents, polishing agents, other surfactants, flavorings, thickening agents, or suitable moistening agents. It must however be ensured that these agents do not prevent the desired fixation of the polyphosphonates on the dental surfaces.
  • prophylactic agents include caries limiting compounds such as sodium fluoride, potassium fluoride, hexylamine hydrofluoride, but also all antiseptics and antibiotics known for their activity in the mouth.
  • these prophylactic agents are caries limiting compounds such as sodium fluoride, potassium fluoride, hexylamine hydrofluoride, but also all antiseptics and antibiotics known for their activity in the mouth.
  • these prophylactic agents are caries limiting compounds such as sodium fluoride, potassium fluoride, hexylamine hydrofluoride, but also all antiseptics and antibiotics known for their activity in the mouth.
  • these prophylactic agents are caries limiting compounds such as sodium fluoride, potassium fluoride, hexylamine hydrofluoride, but also all antiseptics and antibiotics known for their activity in the mouth.
  • these prophylactic agents are caries limiting compounds such as sodium fluoride, potassium fluoride, hexylamine hydrofluoride, but also all antis
  • polishing agents there may be mentioned resins (condensation product of urea and formaldehyde), particles of resins polymerized by heating
  • silica xerogels US 3,538,230
  • precipitated silica particles calcium pyrophosphate, insoluble sodium metaphosphate, hydrated alumina, dicalcium orthophosphate, these agents being sufficiently not abrasive so as not to undesirably affect the surface of the tooth or dentine.
  • These agents may represent for example 5 to 95% by weight of the composition.
  • gelling or thickening agents examples include natural gums, such as gum arabic, sodium carboxyl cellulose and hydroxyethyl cellulose, generally representing 0.5 to 10% of the composition by weight.
  • composition When the composition is in the form of an oral liquid, it typically contains an alcohol, a solubilizer, a non-abrasive cleaning agent, and when in the form of a gel it typically comprises a thickening agent.
  • humectants include glycerin, sorbitol, polyethylene glycol and other polyhydric alcohols, these humectants can represent up to about 35% of the weight of the composition.
  • the composition may comprise a liquid phase representing 10 to 99% by weight and comprising water and a humectant in variable proportion.
  • mint oils menthol, eugenol, orange, lemon, anise, vanillin and thymol, these agents generally representing less than 5% by weight of the composition.
  • composition may furthermore comprise, for example, sweeteners
  • the pH of the composition is typically between 5 and 10.
  • the pH will preferably be between 5 and 7.
  • composition for a dough or toothpaste gel (% by weight):
  • thickening agent 0.1% to 5%
  • non-abrasive gel composition such as a subgingival gel (% by weight):
  • thickening agent 0.1% to 20%
  • Example of mouthwash composition (% by weight):
  • - humectant agent 0 to 50% - flavoring agent: 0.04% to 2%
  • a dental solution will typically comprise 90 to 99% water.
  • a chewing gum composition will typically comprise a base gum (about 80% to 99%), an aroma agent (about 0.4% to 2%), a sweetening agent (about 0.01% to about
  • humectants such as glycerol, propylene glycol
  • glycerol glycerol
  • propylene glycol a humectant
  • a pigment, a pH adjuster, if necessary, an anti-caries agent is then added.
  • These ingredients are mixed until a homogeneous phase, which is then mixed with a polishing agent.
  • the mixture is then transferred to a high speed mixer, in which a thickening agent, a flavor, and the compound of formula (I) are mixed under a reduced pressure of 20 to 100 mmHg.
  • the product obtained is a semi-pulp. -Solid and extrudable.
  • the dentifrice composition is typically applied regularly, every day or every two or three days, one to three times daily, at a pH of about 5 to 9 or 10, usually between 5.5 and 8.
  • the present invention also relates to a cosmetic method for preventing the appearance of dental plaque or limiting the development of dental plaque on the teeth, comprising the application of an effective amount of the oral hygiene composition as described above. , on the teeth.
  • An "effective amount” means an amount to limit or prevent the onset or development of plaque.
  • the present invention also relates to a medicament comprising at least one compound of formula (I), preferably (Ia), or the oral composition described above, in particular to prevent the formation of caries or to prevent parondotal diseases.
  • the present invention relates to an anti-contamination composition intended to prevent or limit the attachment of macromolecules to solid surfaces, such as metal or mineral surfaces, comprising at least one compound of formula (I) such that described above, preferably at least one compound of formula (Ia).
  • macromolecule an organic molecule having a relatively high molecular weight (molecular weight greater than 1000 Da) and can be used as a substrate for the fixation and development of microorganisms on solid surfaces.
  • macromolecules are in particular of the peptide, protein, polysaccharide, polyphenolic, lipid or nucleic acid type.
  • the anti-contamination composition according to the invention limits or prevents the attachment of microorganisms, in particular bacteria, and thus limits or prevents the formation and development of a biofilm on solid surfaces, especially metallic or mineral surfaces.
  • microorganism refers in particular to bacteria, viruses and prions.
  • the anti-contamination composition advantageously comprises between 0.001% and 10% by weight of the compound of formula (I), preferably the compound of formula (Ia), preferably between 0.005% and 5% by weight, even more preferably between 0, 01% and 1% by weight.
  • the pH of the composition is typically between 5 and 10. The pH will preferably be between 5 and 7. This product may be used as a mixture as an additive in detergent or disinfectant formulations used in industry.
  • surfactants ionic, nonionic or amphoteric
  • chelating agents alkalis and solvents.
  • alkalis alkalis and solvents.
  • active ingredients of the antiseptic, biocidal, antibiotic type.
  • the compound of formula (I) may be incorporated in a formulation of the following composition:
  • Disinfectants such as glutaraldehyde, peracetic acid, sodium hypochlorite, etc. representing, for example, 0.01% to 30% by weight of the composition
  • Surfactants such as ethanol, propoxylated fatty alcohols, amine oxides, condensates of ethylene oxide and propylene oxide, quaternary ammonium salts, sulphates, sulphonates and sulphosuccinates by 0.01% to 30% by weight of the composition,
  • Chelating agents for example EDTA, sodium iminodisuccianate, sodium carbonates, ortho phosphates and silicates, condensed phosphates representing for example 0.1% to 5% by weight of the composition,
  • Alkalis carbonates, phosphates and silicates representing for example 0.1% to 40% by weight of the composition
  • solvents miscible with water (alcohols, glycol) or immiscible with water (terebentine derivatives, petroleum derivatives), optionally ionic, representing for example 0.1% to 80% by weight of the composition.
  • the surfaces that can be protected by the anti-contamination composition according to the invention are, for example, metal surfaces such as iron, stainless steel, chromium, aluminum, zinc, titanium, tungsten, lead or copper, as well as alloys or composites containing at least one of these metals, or mineral surfaces, such as silicon and its derivatives, siliceous materials, calcium, ceramic or dental surfaces.
  • metal surfaces such as iron, stainless steel, chromium, aluminum, zinc, titanium, tungsten, lead or copper, as well as alloys or composites containing at least one of these metals, or mineral surfaces, such as silicon and its derivatives, siliceous materials, calcium, ceramic or dental surfaces.
  • the application of the anti-contamination composition to the surfaces to be treated can be done by dipping or immersing this surface in the composition, or by spraying the composition on the surface to be treated. It can also be done by means of accessories, such as by the use of possibly disposable wipes impregnated with the composition.
  • the subject of the present invention is therefore the use of the compounds of formula (I) as previously described or microbiological anti-contamination compositions as previously described, for limiting or preventing the fixation of macromolecules, microorganisms and biofilm on surfaces. solid, especially metallic or mineral.
  • These surfaces are for example the surface of industrial, agri-food or hospital equipment, buildings, constructions or land, air or sea vehicles, air conditioning or refrigeration equipment, or on the surface of surgical instruments, prostheses, dentistry or biological and medical sensors.
  • Example of a liquid microbiological anti-contamination composition applied by dipping, rinsing, deposition by wet cloth or by spraying (% by weight):
  • the presence of alcohol facilitates the wetting of the surface and the homogeneity of the coating.
  • the evaporation of the alcohol makes it possible to obtain very high concentrations on the surface, facilitating rapid adsorption.
  • Ethanol may advantageously be replaced by volatile compounds which are miscible with water (C1 to C6 alcohols, in particular isopropyl alcohol, aldehydes, ketones including acetone, ethers, etc.) or which are not very miscible with water (C4 alkanes). at C8 in particular).
  • Such a composition leaves little solid residue after evaporation of the liquids and is therefore particularly suitable when the surface is to be used directly after application, in particular for the apparatus and instruments to be in contact with the food or the human organism.
  • the presence of humectants, odoriferous or even coloring agents is provided to make the application easier but also to improve the aesthetic pleasure (for example, brightener color).
  • composition for a paste or gel (% by weight):
  • thickening agent 0.1% to 5%
  • This composition is especially intended for scrubbing heavily fouled surfaces, in particular on vertical or even inverted surfaces.
  • Example of composition of foam type (% by weight):
  • the propellant may be a liquefied gas such as alkanes (propane or butane), fluorocarbons (F14, F26, etc.), gases under pressure (CO2, N2,. volatile liquids.
  • alkanes propane or butane
  • fluorocarbons F14, F26, etc.
  • CO2, N2 gases under pressure
  • This formulation is particularly advantageous when the parts are difficult to reach (interior of fine pipes, heat exchangers, air conditioners, ...) • It is also interesting for the uses with large surfaces (fermenters in biotechnology, rooms of preparation or of cutting in agribusiness, ).
  • Example of composition of powder type (% by weight):
  • - humectant agent 1% to 5%
  • the overall composition may be that of a washing powder already known to those skilled in the art, to which is added the bisphosphonic compound of formula (I).
  • This formulation is particularly advantageous as a washing agent for dishwashing machines, washing machines.
  • the bisphosphonic compounds of formula (I) may be used either alone or in combination.
  • composition for covering prostheses (% by weight): bisphosphonic compound of formula (I): 0.02 to 5%
  • the addition of complexing agents and pH control is intended to ensure optimum fixation of the bisphosphonic compound of formula (I).
  • the use of a bisphosphonic compound of formula (I) linked to one or more biologically active molecules, of the peptide, protein, lipid, carbohydrate or nucleic acid type may allow a better biocompatibility, or an orientation of the reaction of the organization.
  • the prostheses concerned are in particular the metal systems (stainless steel, nitinol, titanium, nickel-chromium, etc.) or to be in contact with the tissues while remaining external to the body (such as dental or auditory prostheses) or implantable, at vascular, bone, dental implant levels ...
  • Example of composition for sensor coverage (% by weight):
  • a bisphosphonic compound of formula (I) linked to one or more biologically active molecules of the peptide, protein, lipid, carbohydrate, nucleic acid or other type makes it possible to detect a molecular, particulate, cellular, viral ... whose concentration can be measured.
  • the microbiological anti-contamination compositions according to the invention are typically applied after each use (as for example with the surgical equipment), after each cycle of use (as for example with industrial meat cutting equipment ), regularly during the general maintenance (aesthetic surfaces) or even in a unique way.
  • FIG. 1 represents the activity (in Becquerel) of the model bisphosphonic molecules fixed on the support as a function of the contact time.
  • m pH 5
  • Step 1 one can also use a diaminetétraméthylée of formula (CH 3) 2 N-CH2- (CH2) a - N (CH 3) 2 in place of the 2 ⁇ diaminediméthylée In this case, use less alkyl halide equivalents in Example 3.
  • A-2) Step 2
  • the starting material 2 is dispersed in chlorobenzene.
  • the mixture is refluxed for two hours.
  • the reaction is stopped by adding an excess of water.
  • the product 4 thus formed is refluxed (100 ° C.) for two hours.
  • the molecule 4 is purified by crystallization in ethanol.
  • the molecule 4 is taken up in an excess of CH 3 I to which three equivalents of anhydrous sodium hydroxide are added. The mixture is stirred in the absence of air and light at reflux for 24 to 72 hours. The product formed is condensed under vacuum.
  • Step 3 can also be carried out by reacting another alkyl halide in place of methyl iodide, such as for example methyl bromide.
  • the molecules whose number of quaternary ammonium functions is greater than two can easily be obtained by adding stoichiometric amounts of bromoalkyl-trialkylammonium bromide on a aminoalkyldiphosphonate. This step is followed or not by an iodomethane methylation according to the degree of saturation of the substituted amine.
  • molecules having three or four ammonium functions can be synthesized as follows:
  • Aqueous solutions of 125 I-radiolabeled bisphosphonic acids were prepared at concentrations of 0.1 mMIL -1 and 0.01 mM l -1 .
  • the pH of these solutions was adjusted to 5, 7, 9 and 11 by means of molar solutions of HCl and NaOH.
  • Each solution received a quantity of radiolabeled molecules corresponding to 5. 10 8 Bq / ml.
  • CHT hydroxyapatite powder
  • Ca 5 (PO 4) 3 OH calcium phosphate
  • the molecules used to cover the surfaces are synthetic bisphosphonic compounds whose structure is as follows:
  • a volume of 200 ⁇ L of coating solution is added to each tube containing the surfaces.
  • a control is carried out using 200 ⁇ l of sterile distilled water (pH 6.8 ⁇ 0.2).
  • the incubation times used for fixing the bisphosphonic compound molecules are 30 seconds, 5 minutes or 1 hour.
  • the supernatant is then removed taking care not to suck up the surface particles, and then two cycles of rinsing / decantation / removal of the supernatant are carried out using 3 ml of distilled water.
  • the gamma radioactivity emitted upon disintegration of the 125 I present on the bisphosphonic compounds attached to the surfaces of the hydroxyapatite beads is counted by means of a Cobra 2 autogamma counting System (Packard Bioscience Company, France).
  • the results are expressed as a function of pH.
  • the activity in Becquerel is measured as a function of the time of contacting, and this for a concentration of bisphosphonic compound of 0.1 mol / L.
  • the results are shown in Figure 1.
  • hydroxyapatite powder CHT ® Ceramic hydroxyapatite, calcium phosphate (Ca 5 (PO 4) 3 OH) 2, Biorad, France.
  • the particle size of the hydroxyapatite powder (PAH) is 80 ⁇ 8 ⁇ m and the developed surface is 72 cmlg -1 . This surface is packed in tubes with hemolysis at a rate of 14 mg per tube. per tube is 5000. Before use, they are sterilized by dry heat (oven Tau, Italy) at 180 ° C for 2 hours.
  • the molecules used to cover the surfaces are synthetic bisphosphonic acids.
  • the molecule used is molecule A, synthesized in Example A and of the following formula:
  • the artificial saliva is adjusted to isotonic pH (pH 7) and sterilized by filtration on a 0.2 ⁇ m filter (Minisart, Sartorius, France).
  • Streptococcus mutons ATCC 25175D LGC Promochem, Molscheim, France.
  • Streptococcus mutans is a constituent of dental plaque and a major etiological agent of tooth decay.
  • the strain is stored in aliquots at -80 ° C. It is cultured by transfer from a 2 mL pipette tip to a 10 mL tube of Schaedler broth (Bio Mérieux, France) and incubated at 37 ° C for 24 hours. The absorbance of a dilution of l / 20th of the mother solution obtained was measured at 600 nm and is then diluted in artificial saliva (prepared as in Cl-3.) To obtain 3 ml of suspension adjusted (SA ) at approximately 5.10 6 colony-forming units (cfu) in 100 ⁇ L.
  • SA suspension adjusted
  • a volume of 200 ⁇ L of overlay solution (C-1-2) is added to each tube containing the surfaces (CII).
  • a control is carried out using 200 ⁇ l of sterile distilled water (pH 6.8 ⁇ 0.2).
  • the incubation time used for the fixation of the bisphosphonic molecules is 3 minutes at 37 ° C.
  • the supernatant is then removed, taking care not to suck up the surface particles, and then two cycles of rinsing / decantation / removal of the supernatant are carried out using 3 ml of sterile distilled water.
  • a volume of 3 mL of artificial saliva (C-1-3) is added to the tubes containing the coated surfaces (controls and tests). Immediately thereafter, a volume of 100 ⁇ l of the adjusted bacterial suspension (C-1-4) is inoculated into the tubes. The tubes are incubated for 4 to 24 hours at 37 ° C.
  • the colonized particles are washed to remove non-adherent bacteria by performing three cycles of rinsing / decantation / removal of the supernatant (taking care not to suck the surface particles) with 3 mL of physiological saline.
  • the surface particles are resuspended in 1 mL of physiological saline and sonicated to remove adhering bacteria (Branson 1200, 47 KHz, 95 W, 5 minutes, Bransonic, USA).
  • the bacterial suspension obtained is counted by decimal dilutions in physiological saline and spread of 100 ⁇ l of dilutions -1 and -2 on blood agar. The count is performed after 48 to 72 hours of incubation at 37 ° C.
  • the number of bacteria is expressed in cfu for 14 mg of hydroxyapatite.
  • the recovery of PAH surfaces is carried out for 3 minutes with the test solution.
  • the PAH surfaces are then incubated for 4 to 24 hours with a bacterial solution.
  • Table 1 summarizes the results obtained showing bacterial colonization as a function of time for hydroxyapatite surfaces covered or not by bisphosphonic compounds (respectively test and control). For statistical analysis the numbers of cfu were transformed into 10 log to obtain a normal distribution of the results. The Student's test was used to evaluate the significance of the values in both experiments (Table I). Table I. Mean counts of Streptococcus mutans adhering to hydroxyapatite
  • the bactericidal activity of the molecule A is evaluated according to the protocol of the standard NF EN 1040 modified so as to take into account the practical conditions of use.
  • the conditions selected are the following: target strain Streptococcus mutans, physiological saline medium, temperature 37 ° C., contact time 5 minutes.
  • a stock solution at 2.10 "1 mol.L-1 (pH adjusted to 6.0 ⁇ 0.1) is prepared and sterilized by filtration on a 0.2 ⁇ m filter (Minisart, Sartorius, France). carried out by dilutions in sterile distilled water, that is, 10 -1 , 2 ⁇ 10 -2 and 10 -2 mol / l . D-2-2) Bacterial strain
  • the strain is stored in aliquots at -80 ° C. It is replanted by transferring a 2 mL pipette tip to a 13 mL tube of Schaedler Broth (Bio
  • SA adjusted suspension
  • the number of bacteria present in the tubes is determined by decimal dilutions in physiological saline (Bio Mérieux, France) and spreading of 100 ⁇ l of dilutions -2, -3 and -4 on blood agar (Columbia + 5% of blood). mutton, Bio Mérieux, France). The count is performed after 48 hours of incubation at 37 ° C. The number of bacteria is expressed in cfu per ml.
  • Table II summarizes the results obtained for the physiological saline medium. Table II. Results of measurement tests for the bactericidal activity of the molecule A on S. mutans ATCC 25175D in physiological saline

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Abstract

L'invention a pour objet des composés bisphosphoniques de formule (I) : Les compositions anti-contamination microbiologique les contenant, ainsi que leur utilisation pour empêcher ou limiter la fixation de macromolécules, de microorganismes et d'un biofilm sur des surfaces solides, telles que des surfaces métalliques ou minérales.

Description

« Composés bisphosphoniques pour empêcher ou limiter la fixation de macromolécules, de microorganismes et d'un biofilm sur des surfaces solides, notamment métalliques ou minérales ».
L'invention concerne le domaine de la protection de surfaces solides, telles que des surfaces métalliques ou minérales, contre la contamination macromoléculaire et microbiologique, en particulier la contamination bactérienne.
On entend par contamination microbiologique, la contamination par des microorganismes.
L'invention concerne en particulier des nouveaux composés bisphosphoniques, les compositions anti-contamination les contenant, ainsi que leur utilisation pour limiter la fixation de macromolécules et de microorganismes, en particulier de bactéries, sur des surfaces, telles que des surfaces métalliques ou minérales.
Dans l'industrie alimentaire ou médicale, les surfaces représentent une source importante de contamination bactériologique.
Par exemple, dans les industries utilisant des fermentations ou des réacteurs comme en biotechnologie, l'adsorption de macromolécules sur les parois des conteneurs peut conduire à la dénaturation de ces composés, ce qui a un effet délétère dans le cas de productions de protéines de haute valeur (comme des cytokines par exemple) au moyen de fermenteurs.
Dans d'autres situations, la couche polymérique formée peut être elle-même potentiellement pathogène, comme dans le cas de prions adsorbés et partiellement dénaturés dont l'enlèvement complet de la surface est difficile à obtenir.
Les microorganismes, et en particulier les bactéries, sont susceptibles de coloniser des surfaces variées et de former de véritables communautés. Ces phénomènes de colonisation de surface sont à l'origine de la formation du biofilm qui constitue une source importante de contamination microbiologique.
La formation des biofïlms sur une surface implique différents phénomènes successifs.
Le phénomène précurseur est la fixation ou encore l'adsorption de macromolécules par leur dénaturation et leur étalement au contact de la surface. Ces macromolécules polymériques sont de type protéique ou polyosidique, voire polyphénolique. De manière générale, elles sont d'origine biologique, en particulier d'origine bactérienne. En se fixant sur la surface, les macromolécules forment une couche polymérique potentiellement pathogène, comme dans le cas de prions adsorbés. De nombreux micro-organismes tels que les protozoaires, les bactéries, les champignons ou encore les algues, vont alors pouvoir se développer dans cette couche polymérique par la présence de zones hydrophobes, de groupements aminés ou sulfures ou de sites mono ou polyosidiques. Une fois fixés, en conditions favorables, ces micro-organismes vont non seulement se multiplier mais également sécréter d'autres polymères, construisant ainsi une matrice de type film, que l'on appelle biofilm. Ce film est connu par exemple pour être un facteur essentiel de la contamination des installations de climatisation par des légionelles, permettant une dissémination de ces germes en haute concentration.
En conditions particulières, comme en milieux marin ou fluvial, ce film microbiologique va servir de support à des organismes pluricellulaires végétaux ou animaux conduisant à des films épais. Un exemple est celui de la contamination des coques de bateaux, conduisant à une augmentation importante de leur résistance à l'avancement.
De manière générale, l'ensemble de ces phénomènes est souvent connu sous le terme « fouling » ou « biofouling », ce qui peut se définir ainsi : ensemble des processus successifs conduisant à la colonisation de surfaces par des micro¬ organismes voire des organismes pluricellulaires.
Un phénomène proche est celui des prothèses implantées, qui se recouvrent rapidement des macromolécules présentes dans les milieux en contact, en servant ultérieurement de support à l'envahissement des cellules migrantes. La structure du biofilm est en général poreuse et permet la circulation de l'eau et de nutriments qui permettent le renouvellement et le développement des colonies de microorganismes. Cette couche macromoléculaire permet également de protéger les microorganismes contres les agressions extérieures (biocides, antibiotiques, antiseptiques) en ralentissant l'accès de produits biologiquement actifs vis à vis des cellules. Lors de l'étape d'adsorption macromoléculaire, différentes forces d'attraction entrent en jeu selon le type de surface. Celles qui interviennent généralement dans ce processus sont de type électrostatiques, ioniques, Van Der Waals, liaisons hydrogènes ou interactions hydrophobes. L'adsorption dépend ainsi des forces d'attraction ou de répulsion existant entre les macromolécules et la surface. En outre, il faut tenir compte de nombreux facteurs comme la tension de surface du support (modulée par la présence ou l'absence de tensio-actifs), ou encore la répartition non uniforme des charges électriques sur la surface. Après cette phase d'adsorption, la fixation proprement dite du microorganisme dépend de son type, de l'importance de sa population dans le milieu, de la durée de sa phase de croissance, et de la déformation cellulaire. Cette dernière dépend également du milieu de dispersion : température de la solution, pH, concentration en électrolyte et disponibilité des nutriments. Enfin, la force d'attachement dépend aussi de la charge de la surface et de la durée du contact.
Après fixation, les microcolonies se forment sur la surface. Leur croissance puis leur confluence aboutissent rapidement à la formation d'un enduit mince et superficiel au départ, qui s'épaissit au fur et à mesure de la croissance microbiologique jusqu'à atteindre quelques millimètres d'épaisseur : c'est le biofilm. L'adhésion macromoléculaire est donc une étape primordiale dans le processus de formation du biofilm.
Le biofilm le plus connu est probablement le biofilm dentaire, communément appelé plaque dentaire, écosystème complexe de la cavité buccale de l'homme, qui est à l'origine des caries dentaires, des récidives de caries, des maladies parodontales et des péri-implantites qui mettent en péril la longévité du biomatériau.
Les agents chimiques biocides, tels que le chlore ou les anti-biotiques, s'avèrent souvent inefficaces ou insuffisants contre la formation du biofilm sur les surfaces. En effet, la chloration d'un biofilm n'atteint que la partie externe du biofilm et laisse intact une couche de bactéries capables de se développer rapidement à nouveau. L'utilisation de chlore pour éliminer le biofilm n'est efficace que si celui- ci est éliminé manuellement de la surface. Les antibiotiques ne sont pas non plus satisfaisants car ils sont susceptibles d'entraîner la dissémination de gênes de résistance chez les microorganismes, notamment les bactéries, les rendant ainsi peu à peu inactifs. Il est fréquent de voir des produits biocides actifs in vitro contre des bactéries isolées devenir complètements inactifs contre des bactéries sessiles.
Par ailleurs, l'utilisation de molécules répulsives ne s'avère efficace que pour les organismes pluricellulaires évolués.
A l'heure actuelle, la recherche est donc orientée vers le développement de produits actifs contre les biofilms et non plus uniquement contre le développement des microorganismes ou des bactéries eux-mêmes. Deux possibilités existent pour lutter contre la contamination des surfaces :
- Une action enzymatique directe permettant une dégradation de la structure du biofilm facilitant ainsi son décrochage.
- Une limitation de l'adhésion des macromolécules sur les surfaces pour empêcher le développement de colonies de microorganismes et iàciliter le nettoyage de ces surfaces.
Dans la présente invention, l'approche choisie consiste à rendre les propriétés physico-chimiques des surfaces solides, notamment les forces d'attraction de ces surfaces, déiàvorables à l'adhésion ou l'adsorption macromoléculaire, et donc à limiter voire empêcher la fixation de microorganismes, en particulier de bactéries, sur ces surfaces.
La difficulté de cette approche réside dans l'identification d'un composé qui est capable à la fois de se fixer ou de s'adsorber rapidement, efficacement et durablement sur la surface à protéger, et qui empêche ou limite la fixation de microorganismes sur cette surface, grâce à la création d'une interface entre la surface et le milieu extérieur, défavorable à l'adhésion et au développement des microorganismes.
Pour limiter l'adsorption des macromolécules, une voie connue est le recouvrement, par adsorption et/ou greffage, de polymères hydrophiles. L'agitation brownienne de leurs chaînes repousse les molécules susceptibles de s'adsorber. Dans cette gamme de molécules, se trouvent des polymères naturels comme certains polyosides (dextrane par exemple) et des protéines (dont l'exemple le plus courant est l'albumine) mais également des polymères synthétiques comme les polyéthylèneglycols (PEG). Malgré ses avantages indéniables et son efficacité prouvée, cet effet de brosse polymérique présente certaines limitations : la densité de surface ne doit être ni trop faible (dans ce cas, il existe des trous dans la couche et donc des possibilités d'adsorption) ni trop forte (les chaînes ne présentent plus la liberté suffisante pour avoir une agitation brownienne permettant de repousser les autres molécules). De plus, les interactions entre les macromolécules immobilisées et les molécules en solution, qu'elles soient de nature spécifique ou non, doivent être faibles. Ce point exclut de fait tous les polymères fortement chargés électrostatiquement qui peuvent contracter des interactions fortes avec des macromolécules de forte charge opposée. D'un point de vue pratique, la réalisation d'un revêtement aux propriétés convenables et durables dans le temps est en général difficile à mettre en œuvre, en particulier pour des surfaces étendues. Des moyens pour arriver à obtenir des couches de propriétés convenables sont proposés dans ce brevet.
Depuis quelques années, il a été montré que des surfaces exprimant des groupements phosphorylcholine en densité suffisante pouvaient limiter considérablement l'adsorption de protéines (Biomaterials, 2002, 23, 3699-3710). Ceci a notamment été montré pour des liposomes à base de phosphatidylcholine et dans la protection de prothèses vasculaires recouvertes de polymères porteurs de groupements phosphorylcholine. De même, il est possible de réduire considérablement l'adsorption de protéines sur des supports métalliques de type « or » en utilisant des molécules, comportant des groupements phosphorylcholine, fixées sur le support par des groupements thiols. Le mécanisme en cause dans ces effets semble être lié à la forte hydrophilie intrinsèque de la phosphorylcholine greffée et à la présence d'un dipôle électrique, en absence de groupements acide- base de Lewis susceptibles de contracter des liaisons hydrogène. Cette hypothèse expliquerait que des molécules zwitterioniques comme des sulfobétaïnes soient également susceptibles d'avoir un effet anti-adsorption. Le brevet US 5,888,405 propose l'utilisation d'aminophosphonates pour modifier les propriétés superficielles et par là altérer le phénomène de biofouling. Cependant, les forces d'adsorption de phosphonates sur des supports métalliques types oxydes de fer sont relativement discrètes (J. Coll. Interface Sci., 238(l):37-42) et laissent entrevoir une action limitée.
Dans la littérature, il n'existe pas de molécule disponible limitant l'adsorption protéique et capable de se fixer fortement sur des supports comme l'acier, l'aluminium, les calcaires ou le verre modifié.
L'invention vise à palier les inconvénients de l'art antérieur en proposant des composés et des compositions particulièrement efficaces et adaptées à la réduction du biofouling (au sens large du terme), selon différentes applications possibles, notamment pâtes et gels, solutions aqueuses, alcooliques ou organiques, suspensions, mousses, poudres, aérosols ....
L'invention vise à définir le protocole de fabrication le plus adapté pour des molécules efficaces dans ces applications.
L'invention vise également à fournir des compositions utilisant une quantité efficace de composé actif, apte à lutter contre les contaminations microbiologiques de surfaces métalliques ou minérales.
L'invention vise en particulier à obtenir une composition comprenant un composé capable à la fois d'être un bon inhibiteur compétitif de la fixation des protéines et de se fixer efficacement et durablement sur les surfaces métalliques ou minérales à protéger.
L'invention propose ainsi de nouveaux composés capables de se fixer sur des surfaces métalliques ou minérales et de limiter la fixation de microorganismes, en particulier de bactéries, et le développement de ceux-ci sur ces surfaces.
L'invention vise en particulier les compositions contenant ces nouveaux composés et leur utilisation contre la contamination microbiologique de surfaces métalliques ou minérales, dans le domaine odontologique (limitation de la formation de la plaque dentaire, lutte contre la formation de caries et les maladies parodontales) et les domaines de l'hygiène hospitalière et de l'agro-alimentaire. L'invention a pour premier objet les composés de formule (I) :
Figure imgf000008_0001
(I) dans laquelle :
- R6 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié, un groupe -OH, une aminé éventuellement substituée par un ou deux groupes alkyle en C1-C4, linéaires ou ramifiés, ou un groupe -A'- N+Ri5R2 5R3', X1-,
- R1, R1', R2, R2', R3 et R3' représentent indépendamment l'un de l'autre :
* un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié, ou
* un groupe alkylammonium -(CH2)J1-N+RR5R", X2 " dans lequel n est un entier compris entre 1 et 12 et R, R', et R" représentent indépendamment l'un de l'autre un alkyle en C1 à C4, linéaire ou ramifié,
- A et A' représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe -(CH2)m-Z- (CH2)P- dans lequel :
* m est un entier compris entre 0 et 12,
* p est un entier compris entre 0 et 12,
* m + p est un entier compris entre 0 et 12, et
* -Z- représente un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe - CR7R8Rg-, un groupe -COO-, un groupe -CONR7- ou un groupe -NR7R8- dans lesquels R7, R8 et R9 ont les mêmes significations que R6, ou bien un groupe - N+R4R5-, X3 " dans lequel R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié,
- avec la condition que la molécule de formule (I) contient au moins deux fonctions ammonium quaternaires, - et X, X1, X2 et X3 sont des contre-ions pharmaceutiquement acceptables.
Le terme « pharmaceutiquement acceptable » signifie acceptable d'un point de vue de la toxicité.
Le terme « atome d'halogène » signifie un atome de fluor, de chlore, de brome ou d'iode.
Les termes « alkyle en C1 à C4 » et « alkyle en C1 à C12 » signifient respectivement un alkyle comprenant 1 à 4 atomes de carbone et un alkyle comprenant 1 à 12 atomes de carbone. Un groupe alkyle en C1 à C4, linéaire ou ramifié, comprend notamment les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, sec-butyle, tert-butyle.
L'expression « R7, R8 et R9 ont les mêmes significations que R6 » signifie que R6,
R7, R8 et R9 représentent indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié, un groupe -OH, une aminé éventuellement substituée par un ou deux groupes alkyle en C1-C4, linéaires ou ramifiés, ou un groupe -A^N+R1 5R2 5R3', X1 " tel que défini précédemment.
Ces composés sont particulièrement appropriés contre la contamination microbiologique de surfaces métalliques ou minérales, pour les raisons suivantes :
- ils sont non toxiques et biodégradables,
- ils ne sont pas nécessairement biocides,
- ils ne sont pas nécessairement bactériostatiques,
- ils présentent une haute affinité pour les surfaces métalliques (tels que Tacier inoxydable ou I5 aluminium) ou minérales (tels que la surface dentaire),
- ils sont capables de se fixer rapidement, efficacement et durablement sur les surfaces à protéger,
- ils forment un film monomoléculaire auto-assemblé au contact de surfaces métalliques ou minérales et créent ainsi une interface entre la surface protégée et le milieu extérieur, qui limite efficacement et durablement le développement de biofilms sur ces surfaces,
- cette interface limite voire évite la dénaturation des macromolécules habituellement à l'origine de la formation de biofilms au contact de la surface. Les composés de formule (I) comprennent deux groupements phosphoniques liés au même atome de carbone (groupements bisphosphoniques ou gem-diphosphoniques) qui permettent la fixation sur les surfaces solides à protéger, et une ou deux chaînes éventuellement ramifiées, liées également à ce même atome de carbone et comprenant au moins deux fonctions ammonium quaternaire, situées l'une à la suite de l'autre sur la chaîne ou bien sur des chaînes ramifiées.
Les fonctions ammonium quaternaire ont deux rôles importants pour lutter contre le phénomène de contamination microbiologique :
- elles permettent de réduire la charge de surface qui est souvent très négative dans le cas de la dent ou de surfaces métalliques. Une faible charge électrique est un facteur important de biocompatibilité,
- elles permettent une hydratation de la surface par une structuration de l'eau à l'interface avec le milieu extérieur. Cette hydratation permet de limiter voire d'éviter la dénaturation des composés macromoléculaires.
Dans la formule (I), si R6 représente le groupe -A^N+R1 5R2 5R3', X1 ", alors, de préférence, A'=A, R1' = R1, R2' = R2 et R3' = R3 et X1 " = X".
De manière préférée, R6 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe -OH ou une aminé -NH2.
De préférence, Z représente un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe -
CR7R8Rg-, un groupe -COO-, un groupe -CONR7- ou un groupe -NR7R8- où R7,
R8 et R9 sont tels que définis précédemment. De manière encore plus préférée, Z représente un groupe -N+R4R5-, X3 " dans lequel R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié.
Avantageusement, R1, R2, R31 R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1 à C4, de préférence linéaire, tel que le groupe éthyle ou méthyle.
Encore plus avantageusement, R1, R2, et R3 sont identiques et représentent chacun un groupe méthyle ou éthyle et R4 et R5 sont identiques et représentent chacun un groupe méthyle ou éthyle. Avantageusement, X, X1, X2 et X3 sont choisis parmi les ions iodure, chlorure, bromure, fluorure, sulfonate, phosphate, phosphonate, ou tout ion pharmacologiquement actif.
De préférence, les composés selon la présente invention sont choisis parmi ceux répondant à la formule (Ia) suivante :
Figure imgf000011_0001
(Ia) dans laquelle :
R6 représente -OH ou -NH2, m est un entier compris entre 1 et 12, p est un entier compris entre 1 et 12,
- m + p est un entier compris entre 2 et 12,
R1, R2, R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4, linéaire ou ramifié, et
- X" représente un contre-ion pharmaceutiquement acceptable.
Chez les composés de formule (Ia), m est de préférence compris entre 3 et 7 et p est de préférence compris entre 1 et 4.
Avantageusement, R1, R2, R31 R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1 à C4, de préférence linéaire, tel que le groupe éthyle ou méthyle. R1, R2, et R3 sont de préférence identiques et représentent chacun un groupe méthyle ou éthyle R4 et R5 sont de préférence identiques et représentent chacun un groupe méthyle ou éthyle.
Avantageusement, X est choisi parmi les ions iodure, chlorure, bromure, fluorure, sulfonate, phosphate, phosphonate, ou tout ion pharmaco logiquement actif.
Selon un second aspect, l'invention a pour objet une composition pour hygiène buccale par voie topique, comprenant au moins un composé de formule (I) tel que décrit ci-dessus, de préférence un composé de formule (Ia), de préférence en association avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables. La composition comprend avantageusement entre 0,001 % et 10 % en poids du composé de formule (I), de préférence entre 0,005 et 5 % en poids, encore plus préférentiellement entre 0,01 % et 1 % en poids. La composition se présente typiquement sous la forme d'un bain de bouche, d'un liquide à pulvériser, d'une pâte à dentifrice, d'un gel dentifrice, d'une pâte à appliquer, d'une poudre, d'une gomme à mâcher ou à appliquer ou d'une mousse.
La composition peut être appliquée sur les dents par diverses techniques appropriées notamment le brossage, la teinture, la pulvérisation, le bain de bouche, la gomme à mâcher, ou au moyen d'un accessoire dentaire comme un fil dentaire imprégné de ladite composition, une lingette éventuellement jetable imprégnée de ladite composition ou une éponge imprégnée de ladite composition. D'autres moyens d'application possibles sont connus de l'homme du métier.
Divers autres ingrédients peuvent être incorporés dans la composition, tels que des agents prophylactiques, des agents de polissage, d'autres surfactants, des arômes, des agents d'épaississement ou d'humectation appropriés. Il faut cependant s'assurer que ces agents n'empêchent pas la fixation souhaitée des polyphosphonates sur les surfaces dentaires.
Parmi les agents prophylactiques, on peut citer des composés limitant les caries tels que du fluorure de sodium, du fluorure de potassium, de rhydrofluorure d'hexylamine, mais également tous les antiseptiques et antibiotiques connus pour leur activité au niveau buccal. Typiquement, ces agents prophylactiques sont
il présents en quantités suffisantes, par exemple pour fournir une concentration en ion fluorure de l'ordre de 0,5 à 2 % en poids de la composition.
Parmi les agents de polissage on peut citer des résines (produit de condensation de l'urée et du formaldéhyde), des particules de résines polymérisées par chauffage
(voir US 3 070 510), des xérogels de silice (US 3 538 230), des particules de silice précipitées, le pyrophosphate de calcium, le métaphosphate insoluble de sodium, l'alumine hydratée, l'orthophosphate dicalcium, ces agents étant suffisamment peu abrasifs pour ne pas altérer de manière non souhaitée la surface de la dent ou de la dentine. Ces agents peuvent représenter par exemple 5 à 95 % en poids de la composition.
Parmi les agents de gélification ou d'épaississement, on peut citer des gommes naturelles, telle que la gomme arabique, le carboxyle cellulose de sodium, l'hydroxyéthyl cellulose, représentant généralement 0,5 à 10 % de la composition en poids.
Lorsque la composition est sous forme d'un liquide buccal, elle contient typiquement un alcool, un solubilisant, un agent de nettoyage non abrasif, et lorsqu'elle est sous forme d'un gel elle comprend typiquement un agent épaississant.
Parmi les humectants, on peut citer la glycérine, le sorbitol, le polyéthylène glycol et d'autres alcools polyhydriques, ces humectants pouvant représenter jusqu'à environ 35 % du poids de la composition. Typiquement la composition peut comprendre une phase liquide représentant 10 à 99% en poids et comprenant de l'eau et un humectant en proportion variable.
Parmi les arômes, on peut utiliser éventuellement associés les huiles de menthe, le menthol, l'eugénol, l'orange, le citron, l'anis, la vanilline, le thymol, ces agents représentant généralement moins de 5 % en poids de la composition.
La composition peut comprendre en outre par exemple des agents sucrants
(saccharinate de sodium), des agents de blanchiment (dioxyde de titane ou oxyde de zinc), des vitamines, d'autres agents anti-plaque ( sels de zinc, dont citrate de zinc, sels de cuivre, sels d'étain, sels de strontium, allantoïne, chlorhexidine), des agents antibactériens (triclosan : 2',4,4'-IO / trichloro-2-hydroxy-diphényl éther), des agents anti-calculs (pyrophosphates de métal di et/ou tétra alcalins), des agents ajusteurs de pH, des agents colorants, des agents anti-caries (caséine, urée, glycérophosphates de calcium, fluorure de sodium, fluorophosphate de monosodium), des composés antitaches (polymères de silicone), des agents anti¬ inflammatoires (salicylanilides substitués), des agents désensibilisants (nitrate de potassium, citrate de potassium). D'autres agents sont cités dans le brevet US 5 258 173.
Le pH de la composition est typiquement compris entre 5 et 10. Le pH sera préférentiellement compris entre 5 et 7.
Exemple de composition pour une pâte ou un gel dentifrice (% en poids) :
- composé bisphosphonique de formule (I): 0,005 à 5 %
- agent abrasif : 10% à 50%
- agent épaississant : 0,1% à 5%
- agent humectant : 10% à 55%
- agent arôme : 0,04% à 2%
- agent sucrant : 0,1 % à 3%
- agent colorant : 0,01% à 0,5%
- eau : 2 à 45%.
Exemple de composition de gel non abrasif tel qu'un gel subgingival (% en poids) :
- composé bisphosphonique de formule (I): 0,005 à 5 %
- agent épaississant : 0,1% à 20%
- agent humectant : 10% à 55%
- agent arôme : 0,04% à 2%
- agent sucrant : 0,1% à 3%
- agent colorant : 0,01% à 0,5%
- eau : 2 à 45%.
Exemple de composition de bain de bouche (% en poids) :
- composé bisphosphonique de formule (I): 0,005 à 5 %
- agent humectant : 0 à 50% - agent arôme : 0,04% à 2%
- agent sucrant : 0,1% à 3%
- agent colorant : 0,01 % à 0,5%
- eau : 45 à 95 %
- ethanol : 0 à 25%
Une solution dentaire comprendra typiquement 90 à 99% d'eau. Une composition de type chewing-gum comprendra typiquement une gomme de base (environ 80% à 99%), un agent arôme (environ 0,4% à 2%), un agent sucrant (environ 0,01% à
'%>.
L'homme du métier incorporera de manière appropriée et sans effort excessif différents agents tels que cela est décrit dans le brevet US 6 132 702. Pour préparer une composition dentifrice, on procède par exemple comme suit : les humectants tels que la glycérine, le propylène glycol, sont dispersés avec l'agent sucrant et l'eau dans un mélangeur, jusqu'à ce que le mélange devienne un gel homogène. On ajoute alors un pigment, un ajusteur de pH le cas échéant, un agent anti-caries. Ces ingrédients sont mélangés jusqu'à obtenir une phase homogène, à laquelle on mélange alors un agent de polissage. Le mélange est alors transféré dans un mélangeur à haute vitesse, dans lequel un agent épaississant, un arôme, et le composé de formule (I) sont mélangés, sous pression réduite de 20 à 100 mm de Hg. Le produit obtenu est une pâte semi-solide et extrudable. La composition dentifrice est typiquement appliquée régulièrement, chaque jour ou tous les deux ou trois jours, d'une à trois fois par jour, à un pH d'environ 5 à 9 ou 10, en général entre 5,5 et 8.
La présente invention a également pour objet un procédé cosmétique pour prévenir l'apparition de la plaque dentaire ou limiter le développement de la plaque dentaire sur les dents, comprenant l'application d'une quantité efficace de la composition pour hygiène buccale telle que précédemment décrite, sur les dents. Une « quantité efficace » signifie une quantité permettant de limiter ou d'empêcher l'apparition ou le développement de la plaque dentaire. La présente invention a également pour objet un médicament comprenant au moins un composé de formule (I), de préférence (Ia), ou bien la composition buccale précédemment décrite, notamment pour prévenir la formation des caries ou pour prévenir les maladies parondotales.
Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une composition anti¬ contamination destinée à empêcher ou limiter la fixation de macromolécules sur les surfaces solides, telles que les surfaces métalliques ou minérales, comprenant au moins un composé de formule (I) tel que décrit ci-dessus, de préférence au moins un composé de formule (Ia).
Dans le cadre de la présente invention, on entend par macromolécule, une molécule organique ayant une masse moléculaire relativement élevée (poids moléculaire supérieur à 1000 Da) et pouvant servir de substrat pour la fixation et le développement de microorganismes sur des surfaces solides. Ces macromolécules sont notamment de type peptidique, protéique, polyosidique, polyphénolique, lipidique ou acide nucléique.
En outre, la composition anti-contamination selon l'invention limite ou empêche la fixation des microorganismes, en particulier des bactéries, et ainsi, limite ou empêche la formation et le développement d'un biofilm sur les surfaces solides, notamment métalliques ou minérales.
Dans le cadre de la présente invention, le terme microorganisme désigne notamment les bactéries, les virus et les prions.
Parmi les bactéries ciblées par ce type de composition, on peut citer notamment, Streptococcus (mutons, sanguis, pyogenes...), Salmonella, Listeria monocytogenes, Legionella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Porphyromonas, Staphylococcus (aureus, epidermidis), Pseudomonas, Escherichia coli, Candida. La composition anti-contamination comprend avantageusement entre 0,001 % et 10 % en poids du composé de formule (I), de préférence le composé de formule (Ia), de préférence entre 0,005 % et 5 % en poids, encore plus préférentiellement entre 0,01 % et 1 % en poids. Le pH de la composition est typiquement compris entre 5 et 10. Le pH sera préférentiellement compris entre 5 et 7. Ce produit pourra être utilisé en mélange en tant qu'additif dans des formulations détergentes ou désinfectantes utilisées dans l'industrie.
Les agents chimiques les plus communément utilisés pour la fabrication de détergents sont les agents tensio-actifs (ioniques, non ioniques ou amphotères), les agents chélatants, les alcalins et les solvants. Ces formulations peuvent également contenir des principes actifs de type antiseptiques, biocides, antibiotiques.
A titre d'exemple, le composé de formule (I) peut être incorporé dans une formulation de composition suivante :
• désinfectants (tels que le glutaraldéhyde, l'acide peracétique, l'hypochlorite de sodium...) représentant par exemple 0,01 % à 30 % en poids de la composition,
• agents tensio-actifs (tels que alcools gras étholés, propoxylés, des oxydes d'aminés, des condensats d'oxyde d'éthylène et de propylène, des sels d'ammoniums quaternaires, des sulfates, des sulfonates et sulfosuccinates) en représentant par exemple 0,01 % à 30 % en poids de la composition,
• agents chélatants (par exemple l'EDTA, iminodisuccianate de sodium, les carbonates de soude, les ortho phosphates et les silicates, les phosphates condensés) représentant par exemple 0,1 % à 5 % en poids de la composition,
• alcalins (carbonates, phosphates et silicates) représentant par exemple 0,1 % à 40 % en poids de la composition,
• solvants, miscibles à l'eau (alcools, glycol) ou non miscibles à l'eau (dérivés de térébentine, dérivés du pétrole), éventuellement ioniques, représentant par exemple 0,1 % à 80 % en poids de la composition.
Les surfaces pouvant être protégées par la composition anti-contamination selon l'invention sont par exemple des surfaces métalliques telles que le fer, l'acier inoxydable, le chrome, l'aluminium, le zinc, le titane, le tungstène, le plomb ou le cuivre, ainsi que les alliages ou composites contenant au moins l'un de ces métaux, ou bien des surfaces minérales, telles que le silicium et ses dérivés, les matériaux silicieux, les surfaces calciques, céramiques ou dentaires.
L'application de la composition anti-contamination sur les surfaces à traiter peut se faire par trempage ou immersion de cette surface dans la composition, ou par pulvérisation de la composition sur la surface à traiter. Elle peut se faire aussi au moyen d'accessoires, comme par l'emploi de lingettes éventuellement jetables imprégnées de la composition.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation des composés de formule (I) tels que précédemment décrits ou des compositions anti-contamination microbiologique telles que précédemment décrites, pour limiter ou empêcher la fixation de macromolécules, de microorganismes et de biofilm sur des surfaces solides, notamment métalliques ou minérales.
Ces surfaces sont par exemple la surface de matériel industriel, agroalimentaire ou hospitalier, de bâtiments, de constructions ou de véhicules terrestres, aériens ou maritimes, de matériel de climatisation ou de réfrigération, ou bien sur la surface d'instruments chirurgicaux, de prothèses, d'instruments de dentisterie ou de capteurs biologiques et médicaux.
Exemple de composition liquide anti-contamination microbiologique appliquée par trempage, rinçage, dépôt par chiffon humide ou par aspersion (% en poids):
- composé de formule (I) : 0,02 à 5 %
- eau : 15 à 99 %
- éthanol : 0 à 85 %
Dans la composition précédente, la présence d'alcool facilite le mouillage de la surface et l'homogénéité du revêtement. De plus, l'évaporation de l'alcool permet d'obtenir à la surface de très hautes concentrations facilitant une adsorption rapide. L'éthanol peut être avantageusement remplacée par des composés volatils miscibles à l'eau (alcools de Cl à C6 en particulier alcool isopropylique, aldéhydes, cétones dont acétone, éthers, ...) ou peu miscibles à l'eau (alcanes de C4 à C8 en particulier). Une telle composition ne laisse que peu de résidus solides après évaporation des liquides et est donc particulièrement indiquée lorsque la surface doit être directement utilisée après application, en particulier pour les appareils et instruments devant être au contact de la nourriture ou de l'organisme humain.
Exemple de composition de liquide de rinçage de surface (% en poids):
- composé bisphosphonique de formule (I) : 0,02 à 5 %
- agent humectant : 0 à 50 %
- agent odoriférant : 0,04 % à 2 %
- agent colorant : 0 à 0,5 %
- eau : 15 à 99 %
- éthanol : 0 à 85 %
Dans cette composition destinée à faciliter l'entretien de surfaces esthétiques, comme les feuilles inox dans les bâtiments publics, la présence d'agents humectants, odoriférants voire colorants est prévue pour rendre l'application plus aisée mais également pour améliorer l'agrément esthétique (par exemple, colorant azurant).
Exemple de composition pour une pâte ou un gel (% en poids) :
- composé bisphosphonique de formule (I) : 0,02 à 5 %
- agent abrasif : 10 % à 50 %
- agent épaississant : 0,1% à 5 %
- agent humectant : 10 % à 55 %
- agent colorant : 0 à 0,5 %
- agent de contrôle du pH : 0 à 3 %
- eau : 2 à 60 %.
Cette composition est spécialement destinée au récurage de surfaces fortement encrassées, en particulier sur des surfaces verticales voire inversées.
Exemple de composition de type mousse (% en poids):
- composé bisphosphonique de formule (I) : 0,02 à 5 % - agent tensioactif : 0 à 20 %
- agent épaississant : 0 à 20 %
- eau : 25 à 50 %
- éthanol : 0 à 25 %
- agent propulseur : 5 à 70 %
Dans cette composition, l'agent propulseur peut être un gaz liquéfié comme des alcanes (propane ou butane), des fluorocarbonés (F 14, F26, ...), des gaz sous pression (CO2, N2, ...) voire des liquides volatils. Cette formulation est particulièrement avantageuse lorsque les pièces sont difficiles à atteindre (intérieur de tuyaux fins, échangeurs de chaleur, climatiseurs, ...)• Elle est également intéressante pour les usages avec de larges surfaces (fermenteurs en biotechnologie, salles de préparation ou de découpe en agro-alimentaire, ...).
Exemple de composition de type poudre (% en poids):
- composé bisphosphonique de formule (I) : 0,02 à 5 %
- agent tensio-actif : 5 % à 95 %
- agent complexant : 1 à 10 %
- agent diluant : 10 à 90 %
- agent humectant : 1 % à 5 %
- agent colorant : 0 à 0,5 %
- agent de contrôle du pH : 0 à 3 %
Dans cette composition, la composition globale peut être celle d'une poudre de lavage déjà connue de l'homme de l'art, à laquelle est rajouté le composé bisphosphonique de formule (I). Cette formulation est particulièrement avantageuse comme agent de lavage pour les machines à laver la vaisselle, les machines à laver le linge.
Dans toutes les compositions précédentes, les composés bisphosphoniques de formule (I) peuvent être utilisés soit seuls soit en association.
Exemple de composition pour recouvrement de prothèses (% en poids): - composé bisphosphonique de formule (I) : 0,02 à 5 %
- agent complexant : 0 à 10 %
- agent de contrôle du pH : 0 à 3 %
Dans cette composition, l'ajout d'agents complexant et de contrôle de pH est destiné à assurer une fixation optimale du composé bisphosphonique de formule (I). De plus, l'utilisation de composé bisphosphonique de formule (I) lié à une ou des molécules biologiquement actives, de type peptide, protéine, lipides, glucides ou acides nucléiques peut permettre une meilleure biocompatibilité, ou une orientation de la réaction de l'organisme. Les prothèses concernées sont en particulier les systèmes métalliques (acier inoxydable, nitinol, titane, nickel- chrome...) soit pour être au contact des tissus tout en restant extérieurs à l'organisme (comme les prothèses dentaires ou auditives) soit implantables, aux niveaux vasculaire, osseux, implants dentaires...
Exemple de composition pour recouvrement de capteurs (% en poids):
- composé bisphosphonique de formule (I) : 0,02 à 5 %
- agent complexant : 0 à 10 %
- agent de contrôle du pH : 0 à 3 %
Dans cette application également, l'utilisation de composé bisphosphonique de formule (I) lié à une ou des molécules biologiquement actives, de type peptide, protéine, lipides, glucides, acides nucléiques ou autres permet de détecter un objet moléculaire, particulaire, cellulaire, viral... dont la concentration peut être dosée.
Suivant les usages retenus, les compositions anti-contamination microbiologique selon l'invention sont typiquement appliquées après chaque utilisation (comme par exemple avec le matériel de chirurgie), après chaque cycle d'utilisation (comme par exemple avec le matériel de découpe industrielle de viande), régulièrement lors de l'entretien général (surfaces esthétiques) voire de manière unique.
La figure 1 représente l'activité (en Becquerel) des molécules bisphosphoniques modèles fixées sur le support en fonction du temps de contact. m pH = 5
+ pH = 7
A pH = 9
X pH = l l
La présente invention est illustrée par les exemples suivants.
A) Synthèse de composés selon la formule
A-I) Etape 1
Figure imgf000022_0001
1
Cinq équivalents de la diamine I sont dissous dans un minimum d'acétonitrile. On ajoute ensuite goutte à goutte le bromoacide 2. Le mélange est agité de 3 à 24 h. Séparation de l'excès de diamine par recristallisation ou par lavage à chaud. Séchage.
Dans l'étape 1, on peut aussi utiliser une diaminetétraméthylée de formule (CH3 )2 N-CH2-(CH2)a- N(CH3)2 à la place de la diaminediméthylée 2^ Dans ce cas, on utilisera moins d'équivalents d'halogénure d'alkyle à l'exemple 3. A-2) Etape 2
Figure imgf000023_0001
Le produit de départ 2 est dispersé dans du chlorobenzène.
A ce mélange, 2.5 équivalents d'H2θ sont ajoutés. Le mélange est chauffé à 40°C.
Par une ampoule à addition on ajoute ensuite le trichlorure de phosphore goutte à goutte.
Le mélange est porté à reflux pendant deux heures.
La réaction est stoppée par ajout d'un excès d'eau. Le produit 4 ainsi formé est porté à reflux (100°C) pendant deux heures.
La molécule 4 est purifiée par cristallisation dans l'éthanol.
Figure imgf000023_0002
A-3) Etape 3
Figure imgf000024_0001
La molécule 4 est reprise dans un excès de CH3I auquel on ajoute trois équivalents d'hydroxyde de sodium anhydre. Le mélange est agité à l'abri de l'air et de la lumière à reflux pendant 24 à 72 heures. Le produit formé est condensé sous vide.
Figure imgf000024_0002
L'étape 3 peut être aussi réalisée en faisant réagir un autre halogénure d'alkyle à la place du iodure de méthyle, comme par exemple du bromure de méthyle.
A-4) Autres synthèses
Par ailleurs, les molécules dont le nombre de fonctions ammonium quaternaires est supérieur à deux peuvent aisément être obtenues en additionnant des quantités stoechiométriques de bromure de bromoalkyl-trialkylammonium sur un aminoalkyldiphosphonate. Cette étape est suivie ou non d'une méthylation au iodométhane suivant le degré de saturation de l'aminé substituée. Par exemple, des molécules comportant trois ou bien quatre fonctions ammonium peuvent être synthétisées de la façon suivante :
Figure imgf000025_0001
Figure imgf000025_0002
D'une façon générale, l'homme du métier saura préparer sans difficulté les composés de formule (I) en faisant à appel à des synthèses classiques et bien connues de celui-ci.
B) Fixation de molécules bisphosphoniqucs sur support d'hydroxyapatitc
Des tests ont été réalisés sur des molécules modèles radiomarquées afin de mettre en évidence la capacité des molécules bisphosphoniques à se fixer rapidement et de façon homogène sur des surfaces minérales. Ces tests réalisés dans des conditions de pH différents ont permis de mettre en évidence une cinétique de fixation rapide des acides bisphosphoniques sur des surfaces minérales (hydroxyapatite).
B-I) Matériel et méthodes
B-I-I) Solutions
Des solutions aqueuses d'acides bisphosphoniques radiomarqués à l'iode 125 ont été préparées à des concentrations de 0,1 moLL"1 et 0,01 moLL"1. Le pH de ces solutions a été ajusté à 5, 7, 9 et 11 grâce à des solutions molaires en HCl et NaOH. Chaque solution a reçu une quantité de molécules radiomarquées correspondant à 5. 108 Bq/mL.
B-l-2) Surface
Les surfaces servant de support aux composés bisphosphoniques consistent en de la poudre d'hydroxyapatite (CHT® Ceramic hydroxyapatite, phosphate de calcium (Ca5(PO4)3OH)2, Biorad, France). Cette surface est conditionnée en tubes à hémolyse à raison de 14 mg par tube.
B-I -3) Recouvrement des surfaces
Les molécules servant au recouvrement des surfaces sont des composés bisphosphoniques de synthèse dont la structure est la suivante :
Figure imgf000026_0001
Ces molécules ont été choisies comme modèle de fixation des acides bisphosphoniques sur des surfaces métalliques et minérales à cause de leur similarité de structure (présence d'un groupe bisphosphonique et d'un atome d'azote), mais aussi pour leur propriété physicochimiques (solubilité dans l'eau importante, adsorption rapide sur les surfaces considérées) similaires à celles des molécules correspondant à la formule générale (I).
Un volume de 200 μL de solution de recouvrement est ajouté à chaque tube contenant les surfaces. Un témoin est réalisé en utilisant 200 μL d'eau distillée stérile (pH 6,8± 0,2). Les temps d'incubation utilisés pour la fixation des molécules de composés bisphosphoniques sont de 30 secondes, 5 minutes ou 1 heure. Le surnageant est ensuite éliminé en prenant soin de ne pas aspirer les particules de surface, puis deux cycles rinçage/décantation/élimination du surnageant sont effectués à l'aide de 3 mL d'eau distillée.
B-I -4) Dénombrement des molécules fixées
Après élimination des eaux de rinçage, la radioactivité gamma émise lors de la désintégration de l'125I présent sur les composés bisphosphoniques fixés à la surfaces des billes d'hydroxyapatite est comptée grâce à un appareil Cobra 2 autogamma counting System (Packard Bioscience Company, France).
B-2) Résultats
Les résultats sont exprimés en fonction du pH. L'activité en Becquerel est mesurée en fonction du temps de mise en contact, et ce pour une concentration en composé bisphosphonique de 0,1 mol/L. Les résultats sont représentés sur la figure 1.
On note une forte influence du pH, à la fois sur la cinétique de fixation et sur la quantité de produit fixé par unité de surface. On note que la cinétique de fixation atteint rapidement une phase de plateau puisque dès les cinq premières minutes de mise en contact on note que la surface disponible est presque intégralement recouverte. Par ailleurs, le pH a une influence importante sur la charge de la molécule et entraîne une répulsion électrostatique importante aux pH élevés, ce qui explique les plus iàibles taux de recouvrement observés à pH 9 et 11. Le pH préférentiel d'utilisation des composés bisphosphoniques pour recouvrir une surface est donc compris entre 5 et 7. C) Prévention de la contamination de surface
C-I) Matériel et méthodes
C-I-I) Surfaces
Les surfaces servant de support au biofilm consistent en de la poudre d'hydroxyapatite (CHT® Ceramic hydroxyapatite, phosphate de calcium (Ca5(PO4)3OH)2, Biorad, France). La granulométrie de la poudre d'hydroxyapatite (HAP) est de 80 ± 8 μm et la surface développée de 72 cmlg"1. Cette surface est conditionnée en tubes à hémolyse à raison de 14 mg par tube. La quantité correspondante de particules de surface par tube est de 5000. Avant utilisation, elles sont stérilisées par chaleur sèche (four Tau, Italie) à 180°C pendant 2 heures.
C-l-2) Molécules de recouvrement
Les molécules servant au recouvrement des surfaces sont des acides bisphosphoniques de synthèse. La molécule utilisée est la molécule A, synthétisée à l'exemple A et de formule suivante :
Figure imgf000028_0001
(A)
Des solutions sont préparées à 0,1 moLL"1 (pH 4,8) et stérilisées par filtration sur filtre 0,2 μm (Minisart, Sartorius, France). C-l-3) Salive artificielle
Afin de reproduire l'environnement buccal, le modèle de salive suivant a été formulé (d'après Hutteau & Mathlouti, 1998) :
Salive artificielle : NaHCO3 5,208 g.L"1 ; KH2PO4, 3H2O 1,369 g.L"1 ; NaCl 0,877 g.L"1 ; NaN3 0,500 g.L"1 ; KCl 0,477 g.L"1 ; CaCl2, 2H2O 0,441 g.L"1, mucine à 2,16 g.L"1 et alpha amylase à 200 000 ULL"1.
La salive artificielle est ajustée à pH isotonique (pH 7) et stérilisée par filtration sur filtre 0,2 μm (Minisart, Sartorius, France).
C-I -4) Souche bactérienne
L'étude est menée sur un modèle de bactéries cariogènes : Streptococcus mutons ATCC 25175D (LGC Promochem, Molscheim, France). Streptococcus mutons est un constituant de la plaque dentaire et un agent étiologique majeur de la carie dentaire.
La souche est conservée en aliquots à -80°C. Elle est remise en culture par transfert d'une pointe de pipette de 2 mL vers un tube de 10 mL de bouillon Schaedler (Bio Mérieux, France) et incubation à 37°C pendant 24 heures. L'absorbance d'une dilution au l/20ème de la solution mère obtenue est mesurée à 600 nm puis elle est diluée en salive artificielle (préparée comme indiqué en C-l-3.) de façon à obtenir 3 mL de suspension ajustée (SA) à environ 5.106 unités formant colonies (ufc) dans 100 μL.
C-l-5) Recouvrement des surfaces
Un volume de 200 μL de solution de recouvrement (C- 1-2) est ajouté à chaque tube contenant les surfaces (C-I-I). Un témoin est réalisé en utilisant 200 μL d'eau distillée stérile (pH 6,8± 0,2). Le temps d'incubation utilisé pour la fixation des molécules bisphosphoniques est de 3 minutes à 37°C. Le surnageant est ensuite éliminé en prenant soin de ne pas aspirer les particules de surface, puis deux cycles rinçage/décantation/élimination du surnageant sont effectués à l'aide de 3 mL d'eau distillée stérile. C-l-6) Formation du biofilm
Un volume de 3 mL de salive artificielle (C- 1-3) est ajouté aux tubes contenant les surfaces recouvertes (témoins et essais). Immédiatement après, un volume de 100 μl de la suspension bactérienne ajustée (C- 1-4) est inoculé dans les tubes. Les tubes sont incubés pendant 4 à 24 heures à 37°C.
C-l-7) Dénombrement des bactéries du biofilm
Les particules colonisées sont lavées afin d'éliminer les bactéries non adhérentes en réalisant trois cycles rinçage/décantation/élimination du surnageant (en prenant soin de ne pas aspirer les particules de surface) à l'aide de 3 mL d'eau physiologique. Les particules de surface sont remises en suspension dans 1 mL d'eau physiologique et traitées par ultra-sons afin de détacher les bactéries adhérentes (Branson 1200, 47 KHz, 95 W, 5 minutes, Bransonic, USA). La suspension bactérienne obtenue est dénombrée par dilutions décimales en eau physiologique et étalement de 100 μl des dilutions -1 et -2 sur gélose au sang. La numération est réalisée après 48 à 72 heures d'incubation à 37°C. Le nombre de bactéries est exprimé en ufc pour 14 mg d'hydroxyapatite.
C-2) Résultats
C-2-1) Prévention de la contamination bactérienne
Le recouvrement des surfaces HAP est réalisé pendant 3 minutes avec la solution à tester. Les surfaces HAP sont ensuite incubées de 4 à 24 heures avec une solution bactérienne.
Le tableau 1 rassemble les résultats obtenus montrant la colonisation bactérienne en fonction du temps pour des surfaces d'hydroxyapatite recouvertes ou non par les composés bisphosphoniques (respectivement essai et témoin). Pour l'analyse statistique les nombres d'ufc ont été transformés en 10Log pour obtenir une distribution normale des résultats. Le test de Student a été utilisé pour évaluer la signification des valeurs dans les deux expérimentations (tableau I). Tableau I. Valeurs moyennes des dénombrements de Streptococcus mutans adhérant à l'hydroxyapatite
Essai : hydroxyapatite (HAP) recouverte par les composes bisphosphoniques. Témoin : HAP non recouverte. Données exprimées en log du nombre d'ufcpour 14 mg de HAP (n = 6).
Dans les deux cas, une croissance du biofilm est observée, mais le profil des courbes de colonisation n'est pas similaire. Le nombre de bactéries colonisant les surfaces d'hydroxyapatite est plus élevé pour le témoin. La différence de colonisation est significative dès 6 heures et après 8, 15 et 24 heures d'incubation (P < 0,05). Ainsi, après 15 heures, le nombre de bactéries recouvrant les surfaces HAP recouvertes par les composés bisphosphoniques diminue d'un iàcteur 100.
D) Evaluation de l'activité bactéricide de la molécule A D-I) Principe
L'activité bactéricide de la molécule A est évaluée selon le protocole de la norme NF EN 1040 modifié de façon à prendre en compte les conditions pratiques d'emploi. Les conditions retenues sont les suivantes : souche cible Streptococcus mutans, milieu eau physiologique, température 37°C, temps de contact 5 minutes.
D-2) Matériel et méthodes
D-2-1) Solutions de la molécule A
Une solution mère à 2.10"1 mol.L-1 (pH ajusté à 6,0 ± 0,1) est préparée et stérilisée par filtration sur filtre 0,2 μm (Minisart, Sartorius, France). Puis une gamme de solutions est réalisée par dilutions en eau distillée stérile, soit, 10"1, 2.10"2 et 10"2 moLI/1. D-2-2) Souche bactérienne
Les essais sont réalisés avec le modèle de bactéries cariogènes choisi pour l'étude sur biofilm : Streptococcus mutans ATCC 25175D (LGC Promochem, Molscheim,
France).
La souche est conservée en aliquots à -80°C. Elle est remise en culture par transfert d'une pointe de pipette de 2 mL vers un tube de 13 mL de bouillon Schaedler (Bio
Mérieux, France) et incubation à 37°C pendant 24 heures.
L'absorbance d'une dilution au l/20ème de la solution mère obtenue est mesurée à
600 nm puis elle est diluée en eau physiologique ou en salive artificielle de façon à obtenir 3 mL de suspension ajustée (SA) à environ 107 unités formant colonies (ufc) dans 100 μL.
D-2-3) Mesure de l'activité bactéricide
Pour chacune des concentrations de molécules testées, 2 tubes sont remplis avec 900 μL d'eau physiologique. Puis 100 μL de SA préparée dans le milieu sont ajoutés immédiatement avant essais. Enfin au temps T0, 1 mL de la concentration de molécules ou d'eau distillée stérile (témoin) est ajouté dans les tubes. Ceux-ci sont incubés à 37°C pendant 5 minutes ± 15 secondes. La gamme de concentration de molécules au contact avec les bactéries est donc la suivante : 10"1, 5.102, 10~2 et 5.10"3 mol.L-1. Après incubation le nombre de bactéries présentes dans les tubes est déterminé par dilutions décimales en eau physiologique (Bio Mérieux, France) et étalement de 100 μl des dilutions -2, -3 et -4 sur gélose au sang (Columbia + 5% de sang de mouton, Bio Mérieux, France). La numération est réalisée après 48 heures d'incubation à 37°C. Le nombre de bactéries est exprimé en ufc par mL.
D-3) Résultats
Le tableau II rassemble les résultats obtenus pour le milieu eau physiologique. Tableau II. Résultats des essais de mesure de mesure de l'activité bactéricide de la molécule A sur S. mutans ATCC 25175D en eau physiologique
Concentratio Concentration ufc par loglO ufc par n en moLL"1 en mg.L"1 mL mL (ppm)
0,1 51900 2,76.10" 6,44
0,05 25950 1,93.10" 6,29
0,01 5190 2,56.10" 6,41
0,005 2595 2,57.10" 6,41
0 (témoin) 0 2,91.10" 6,46
Aucune diminution significative de la population bactérienne n'est observée dans les tubes contenant la molécule comparativement au tube témoin. La molécule ne présente donc pas d'activité bactéricide à la concentration maximale testée soit 10"1 mol. L -1.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composés bisphosphoniques de formule (I) :
Figure imgf000034_0001
(I)
dans laquelle :
- R6 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène, un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié, un groupe -OH, une aminé éventuellement substituée par un ou deux groupes alkyle en C1-C4, linéaires ou ramifiés ou un groupe -A'- N+R1 5R2 5R3N Xf,
- R1, R1 5, R2, R2 5, R3 et R3 5 représentent indépendamment l5un de F autre :
* un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié, ou
* un groupe alkylammonium -(CH2)I1-N+RR5R55, X2 " dans lequel n est un entier compris entre 1 et 12 et R, R5, et R55 représentent indépendamment Fun de Fautre un alkyle en C1 à C4, linéaire ou ramifié,
- A et A5 représentent indépendamment l5un de Fautre un groupe -(CH2)m-Z- (CH2)P- dans lequel :
* m est un entier compris entre 0 et 12,
* p est un entier compris entre 0 et 12,
* m + p est un entier compris entre 0 et 12, et
* -Z- représente un atome d5oxygène, un atome de soufre, un groupe - CR7R8Rg-, un groupe -COO-, un groupe -CONR7-, ou un groupe -NR7R8- dans lesquels R7, R8 et R9 ont les mêmes significations que R6, ou bien un groupe - N+R4R5-, X3 " dans lequel R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié,
- avec la condition que la molécule de formule (I) contient au moins deux fonctions ammonium quaternaire,
- et X, X1, X2 et X3 sont des contre ions pharmaceutiquement acceptables.
2. Composés bisphosphoniques selon la revendication 1, caractérisés en ce que R6 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène,un groupe -OH ou une aminé -NH2.
3. Composés bisphosphoniques selon la revendication 1 ou 2, caractérisées en ce que Z représente un atome d'oxygène, un atome de soufre, un groupe - CR7R8Rg-, un groupe -COO-, un groupe -CONR7- ou un groupe -NR7R8- où R7, R8 et R9 sont tels que définis à la revendication 1.
4. Composés bisphosphoniques selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisés en ce que Z représente un groupe -N+R4R5-, X3 " dans lequel R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C12, linéaire ou ramifié.
5. Composés bisphosphoniques selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisés en ce que R1, R2, R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4, linéaire ou ramifié, de préférence un groupe méthyle ou éthyle.
6. Composés bisphosphoniques selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (Ia) suivante :
Figure imgf000036_0001
(Ia) dans laquelle :
- R6 représente -OH ou -NH2,
.m est un entier compris entre 1 et 12, de préférence entre 3 et 7 -p est un entier compris entre 1 et 12, de préférence entre 1 et 4 . m + p est un entier compris entre 2 et 12,
. R1, R2, R3, R4 et R5 représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle en C1-C4, linéaire ou ramifié, de préférence un groupe méthyle ou éthyle, et . X" représente un contre-ion pharmaceutiquement acceptable tel que les ions iodure, chlorure, bromure, fluorure, sulfonate, phosphate, phosphonate ou tout ion pharmacologiquement actif.
7. Composition pour hygiène buccale par voie topique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 en association avec un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement acceptables.
8. Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que le composé de formule (I) présente une concentration comprise entre 0,001 % et 10 % en poids, plus préférentiellement entre 0,005 % et 5 % en poids, et encore plus préférentiellement entre 0,01 % et 1 % en poids.
9. Composition selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce qu'elle présente sous la forme d'un bain de bouche, d'un liquide à pulvériser, d'une pâte dentifrice, d'un gel dentifrice, d'une pâte à appliquer, d'un liquide à appliquer, d'une poudre, d'une gomme à mâcher ou à appliquer ou d'une mousse.
10. Accessoire dentaire, tel qu'un fil dentaire, une lingette éventuellement jetable ou une éponge, caractérisé en ce qu'il est imprégné de la composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9.
11. Composition anti-contamination microbiologique pour surfaces métalliques ou minérales, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
12. Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'elle comprend entre 0,001 % et 10 % en poids, de préférence entre 0,005 % et 5 % en poids, du composé de formule (I).
13. Lingette éventuellement jetable imprégnée de la composition selon la revendication 11 ou 12.
14. Utilisation des composés de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour empêcher ou limiter la fixation de macromolécules sur des surfaces solides telles que des surfaces métalliques ou minérales.
15. Utilisation des composés de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, pour empêcher ou limiter la fixation de microorganismes, de préférences de bactéries, sur des surfaces solides telles que des surfaces métalliques ou minérales.
16. Utilisation des composés de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, empêcher ou limiter la formation et le développement d'un biofilm sur les surfaces solides, notamment métalliques ou minérales.
17. Utilisation des composés de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce que les surfaces métalliques appartiennent au groupe comprenant le fer, l'acier inoxydable, le chrome, l'aluminium, le zinc, le titane, le tungstène, le plomb ou le cuivre, ainsi que les alliages ou composites contenant au moins l'un de ces métaux et les surfaces minérales appartiennent au groupe comprenant le silicium et ses dérivés, les matériaux silicieux, les surfaces calciques, les surfaces céramiques ou dentaires.
18. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que les surfaces sont la surface de matériel industriel, agroalimentaire ou hospitalier, de bâtiments, de constructions ou de véhicules terrestres, aériens ou maritimes, de matériel de climatisation ou de réfrigération ou bien la surface d'instruments chirurgicaux, de prothèses, d'instruments de dentisterie ou de capteurs biologiques et médicaux.
19. Procédé pour prévenir l'apparition de la plaque dentaire ou limiter le développement de la plaque dentaire sur les dents, comprenant l'application d'une quantité efficace d'une composition selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, sur les dents.
20. Médicament comprenant au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
21. Médicament selon la revendication 20 pour la prévention des caries ou des maladies parodontales.
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