WO2006053903A2 - Niedermolekulare inhibitoren von guaninnucleotid-austauschfaktoren der cytohesin-familie - Google Patents

Niedermolekulare inhibitoren von guaninnucleotid-austauschfaktoren der cytohesin-familie Download PDF

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WO2006053903A2
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Waldemar Kolanus
Markus Hafner
Imke GRÜNE
Barbara Tappertzhofen
Mirko Theis
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Rheinische Friedrich-Wilhelms Universität
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    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to pharmaceuticals.
  • the medicine can be used for the treatment of autoimmune diseases, tumor diseases and / or for immunosuppression.
  • These regulatory proteins or exchange factors fulfill the SAM: AL despite a partially very homologous structure Different tasks in the cell context highly specific, with some proteins are selectively involved in the development of certain diseases.
  • Guanine nucleotide exchange factors also referred to as GEFs, activate small G proteins by stimulating GDP / GTP exchange. Guanine nucleotide exchange factors are regulators of activation signals.
  • Guanine nucleotide replacement factors for small GTPases of the family of ADP ribosylation factors (ARFs) include the family of large guanine nucleotide exchange factors, such as Geal, Gea2, BlGl, B1G2, and the small family
  • cytohesins such as cytohesin-1, cytohesin-2, cytohesin-3 and cytohesin-4 (Julie G Donaldson and Catherine L Jackson, Regulators and effectors of the ARF GTPases, Current Opinion in Cell Biology 2000, 12: 475) 182).
  • a common feature of the guanine nucleotide exchange factors for small ADP ribosylation factor GTPases is their central sec7 domain, corresponding to amino acids 62-244 in cytohesin-1 (Ref: Betz et al, Proc Natl Acad Sci USA 1998 JuI 7; 95 (14): 7909-14), cytohesin-2 (Chardin, P. et al., Nature 384, 481-4 (1996) or Gea2 (Peyroche, A. et al., Mol Cell 3, 275- 85 (1999)).
  • the sec7 domain is broadly similar within the guanine nucleotide exchange factors and responsible for the catalysis of guanine nucleotide exchange.
  • Cytohesins have a molecular weight of about 50 kDa and are involved in the regulation of cell proliferation and cell adhesion / migration in cancer cells and immune cells.
  • Brefeldin A as well as RNA aptamers and peptides, which are either highly toxic or not sufficiently cell-tolerated and therefore not medically applicable, are known as inhibitors of GEFs.
  • replacement factors of the cytohesin family have so far not suitable as molecular targets for medical applications.
  • Other compounds that inhibit these proteins are not previously known in the art.
  • the object of the present invention was to provide compounds useful as inhibitors of the cytohesin family of GEFs, pharmaceutical compositions comprising these compounds and their use in the treatment of diseases by means of these inhibitors.
  • a medicament comprising compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R is selected from the group comprising hydrogen, OH, COOH, COO (C 1 -C 10 -alkyl), CONH 2 , CONH (C 1 -C 18 -alkyl), CON (C 1 -C 4 -alkyl) 2 , halogen, preferably selected from among Group comprising Cl, Br, F, amine, Cl-ClO- - A -
  • R 4 is selected from the group comprising hydrogen, OH, COOH, COO (Cl-
  • ClO-alkyl CONH 2 , CONH (Cl-ClO-alkyl), CON (Cl-ClO-alkyl) 2 , halogen, preferably selected from the group comprising Cl, Br, F, amine and / or Cl-ClO-alkoxy.
  • a particular advantage of the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4) is that they can inhibit the proteins at concentrations which are non-toxic.
  • the compounds provided in particular selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4) can be used in medicaments and / or used therapeutically.
  • the compounds are preferably low molecular weight compounds.
  • low molecular weight compounds are compounds which preferably have a molecular weight in the range from 50 daltons to 800 daltons, preferably in the range from 100 daltons to 500 daltons, more preferably in the range from 250 daltons to 475 daltons.
  • the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4) have a molecular weight of less than 500 daltons.
  • the compounds comprising the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4) is realized in that the compounds are cell-like.
  • the compounds are advantageously very good cell-like, whereby a very high availability of the compounds at their site of action, especially in cells can be achieved.
  • the term "cell-like" means that the compounds can pass through the cell membrane and enter cells. In particularly advantageous embodiments, the compounds reach completely or almost completely into the cells and / or are completely or almost completely available in the cell.
  • the medicaments comprising cell-permeable compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4) can thus be administered by conventional methods, for example orally, dermally and / or intravenously, without the compounds having to be introduced into the cell by means of transfection.
  • the drug comprises compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), wherein the structural elements R 1 , R 2 and / or R 3 are preferably selected from the sulfur-containing structural elements (Al), (Bl), (Cl) and / or (Dl).
  • the drug may comprise compounds which have a plurality of identical and / or different structural elements (Al), (Bl), (Cl) and / or (Dl).
  • the compounds preferably have at least one, preferably two, more preferably three identical and / or different structural elements (A1), (B1), (C1) and / or (D1).
  • drugs comprise compounds selected from the group comprising the general formulas (5), (6), (7), (8) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers and their pharmaceutically acceptable salts:
  • Ri is selected from the group comprising R 2 , R 3 and / or a structural element (A2), (B2), (C2), (D2) as indicated below:
  • R 2 is selected from the group comprising R 1 , R 3 and / or a structural element (E2), (F 2 ), (G 2 ), (H 2 ), (12), (J 2 ), (K 2 ) as indicated below:
  • R 3 is selected from the group comprising R 1 , R 2 , and / or selected from the group
  • the drug comprises compounds selected from the group comprising the general formulas (5), (6), (7), (8), wherein the structural elements R 1 , R 2 and / or R 3 are preferably selected from the sulfur-containing
  • the drug may comprise compounds which have a plurality of identical and / or different structural elements (A2), (B2), (C2) and / or (D2).
  • the compounds preferably have at least one, preferably two, more preferably three identical and / or different structural elements (A2), (B2), (C2) and / or (D2).
  • Preferred among the C 1 -C 10 alkoxy groups are methoxy and / or ethoxy groups.
  • Particularly suitable drugs according to the invention include compounds selected from the group comprising the general formulas (5), (6), (7), (8) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • R 1 is selected from the group comprising R 2 , R 3 and / or a structural element
  • R 2 is selected from the group comprising R 1 , R 3 and / or a structural element (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), as indicated below:
  • R 3 is selected from the group comprising R 1 , R 2 , and / or selected from the group comprising hydrogen, OH, COOH, COO (Cl-ClO-alkyl), CONH 2 , CONH (Cl-ClO-alkyl), CON (Cl-ClO-alkyl) 2 , halogen, preferably selected from the group comprising Cl, Br, F, and / or Cl-C10-alkoxy.
  • the drug comprises compounds selected from the group comprising the general formulas (5), (6), (7), (8), wherein the Structural elements R 1 , R 2 and / or R 3 are preferably selected from the sulfur-containing structural elements (A3), (B3), (C3) and / or (D3).
  • the drug may comprise compounds which have a plurality of identical and / or different structural elements (A3), (B3), (C3) and / or (D3).
  • the compounds preferably have at least one, preferably two, more preferably three identical and / or different structural elements (A3), (B3), (C3) and / or (D3).
  • the drug comprises compounds selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13), (14) as indicated below and / or their enantiomers, diastereomers and their pharmaceutically acceptable salts:
  • a preferred enantiomer of the compounds selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or (14) is the compound (19) as indicated below:
  • the drug comprises compounds selected from the group comprising the general formulas (20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof:
  • the drug may comprise the compounds (20) and / or (21) as monomers and / or dimers, trimers and / or oligomers.
  • the compounds selected from the group comprising the general formulas (20) and / or (21) preferably have
  • Dissociation constants in the range of 0.1 uM to 30 uM can have IC 50 values of from 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M, particularly preferably in the range from 0.5 ⁇ M to 20 ⁇ M, very particularly preferably Range from 1 ⁇ M to 15 ⁇ M.
  • the medicament of the invention may comprise the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from of the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or (14), (20) and / or (21) as monomers.
  • the medicament comprises dimers, trimers and / or oligomers which contain at least one or more of the monomers selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5) , (6), (7) and / or (8), preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12) (13) and / or (14), (20) and / or (21).
  • the connecting groups or spacer can connect the individual units and / or monomers rigidly or flexibly.
  • individual moieties and / or monomers can be rigidly attached through alkyne groups, while a moiety via one or more ethylene glycol moiety (s) can provide a flexible compound.
  • a further advantage of the medicament according to the invention can be achieved by the fact that even small therapeutic dosages of the medicament can be used.
  • a high dosage which can often lead to toxic side effects, can be avoided by the very well cell-permeable and widely available compounds.
  • the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or (14), (20) and / or (21) dissociation constants in the range from 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M, especially preferred in Range of 0.5 uM to 10 uM, most preferably in the range of 1 uM to 7 uM on.
  • the dissociation constants are determined by microcalorimetry.
  • the dissociation constant preferably refers to the binding of the compounds to sec-7 domains of the cytohesins.
  • the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) are preferably selected of the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or (14) IC50 values in the range of 0.1 ⁇ M to 30 ⁇ M, particularly preferably in the range of 0.5 ⁇ M to 20 ⁇ M, most preferably in the range of 1 ⁇ M to 15 ⁇ M on.
  • the IC 50 value of the compounds for inhibiting the exchange activity of the sec 7 domains of various guanine nucleotide exchange factors corresponds to the concentration necessary to reduce the activity of the protein by half.
  • a particular advantage of the compounds provided and the pharmaceuticals containing these compounds may be that the compounds preferably leave the Golgi apparatus-dependent cellular functions intact. This means in particular an advantage over Brefeldin A, which destroys the Golgi apparatus of the cells.
  • the drug comprises, based on a daily dose, 10 nM to 100 ⁇ M, preferably 100 nM to 10 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 3 ⁇ M compound (s) selected from the group comprising the general Formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), ( 11), (12), (13) and / or (14) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • 10 nM to 100 ⁇ M preferably 100 nM to 10 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 3 ⁇ M compound (s) selected from the group comprising the general Formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), ( 11), (12), (13) and / or (1
  • the drug comprises, based on a daily dose, 10 nM to 100 ⁇ M, preferably 100 nM to 10 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 3 ⁇ M, even more preferably 500 nM to 3 ⁇ M, more preferably 500 nM to 1 ⁇ M compound (s) selected from the group comprising the general formulas (20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • 10 nM to 100 ⁇ M preferably 100 nM to 10 ⁇ M, preferably 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 3 ⁇ M, even more preferably 500 nM to 3 ⁇ M, more preferably 500 nM to 1 ⁇ M compound (s) selected from the group comprising the general formulas (20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the medicament comprises, based on a daily dose, 500 nM to 3 ⁇ M, preferably 500 nM to 1 ⁇ M compound (s) selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), ( 4), (5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or ( 14), (20) and / or (21).
  • compound (s) selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), ( 4), (5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or ( 14), (20) and / or (21).
  • a daily dose means the amount of the drug administered per day.
  • the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13), (14) and / or (19), (20) and / or (21) may alter the activity of guanine nucleotide exchange factors conferring sec7 Domain, where the modulation is a blockage or inhibition.
  • compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) are preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13), (14) and / or (19), (20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and their pharmaceutically acceptable salts are useful as inhibitors for proteins having at least one sec7 domain.
  • These compounds are useful as inhibitors of sec7 domain-containing proteins, which proteins are preferably selected from the group comprising guanine nucleotide exchange factors, preferably selected from the group comprising guanine nucleotide exchange factors for human ADP ribosylation factors, such as Geal, Gea2, BlGl, B1G2 and / or cytohesins such as cytohesin-1, cytohesin-2, cytohesin-3 and / or cytohesin-4.
  • proteins are preferably selected from the group comprising guanine nucleotide exchange factors, preferably selected from the group comprising guanine nucleotide exchange factors for human ADP ribosylation factors, such as Geal, Gea2, BlGl, B1G2 and / or cytohesins such as cytohesin-1, cytohesin-2, cytohesin-3 and / or cytohesin-4.
  • the compounds selected from the group comprising the compounds (9), (10), (11), (12), (13), (14) and / or (19), (20) and / or (21) are particularly useful for the inhibition of cytohesins.
  • an advantage of the compounds in preferred embodiments is that these compounds can specifically bind to cytohesins.
  • the compounds can bind to cytohesins while the compounds bind to higher molecular weight guanine nucleotide exchange factors such as Geal, Gea2, BlGl, B1G2 at these concentrations do not or only to a lesser extent bind.
  • the binding constant for the binding of the compounds, in particular compound (9), to the sec-7 domain of human cytohesins can be in the range of 100 nM to 1500 nM, preferably in the range of 200 nM to 900 nM, preferably in the range of 200 nM to 500 nM, lie.
  • the compounds may have specificity for certain cytohesins, for example compound (12) may preferentially bind to cytohesin-1 over cytohesin-2.
  • compound (12) may preferentially bind to cytohesin-1 over cytohesin-2.
  • compounds of the invention which preferentially bind to cytohesin-1 to cytohesin-3 and thus specifically inhibit it, may allow the possibility of using the compounds to treat type II diabetes.
  • the inhibition constants (Kj values) of the compounds provided to cytohesins in insulin signaling can be in the range from 7 ⁇ M to 20 ⁇ M.
  • the specificity of the compounds may be affected by the concentration of the compounds, for example, specificity to certain cytohesins may occur at higher or lower concentrations of the compounds. This allows the use of the compounds in certain concentration ranges, in so-called therapeutic windows, for the inhibition of certain cytohesins.
  • blocking is understood to mean binding of the compounds (15), (16), (17), (18) to the sec7 domain of the proteins, which preferably has an inhibition of the sec7 domain Proteins, especially the cytohesins, leads.
  • the structural elements which comprise the compounds may be selected from the group comprising R, R 1 , R 2 R 3 , and / or R 4 , structural elements (Al), (Bl), (Cl), (Dl), ( El), (Fl), (Gl), (HI), (II), (JI), (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) , (H2), (12), (J2), (K2), (A3), (B3), (C3), (D3), (E3), (F3), (G3), (H3), ( 13), (J3), (K3), hydrogen, OH, COOH, COO (Cl-ClO-alkyl), CONH 2 , CONH (Cl-ClO-alkyl), CON (Cl-ClO-alkyl) 2 , halogen, preferably selected from the group comprising Cl, Br, F, amine, C 1 -C 10 -alkoxy, alky
  • Alkyl linear or branched C 1 -C 2 O-alkyl, preferably ethyl, propyl, iso-propyl, tert-butyl, butyl, pentane.
  • Alkenyl C 2 -C 20 -alkenyl.
  • Alkynyl C 2 -C 20 alkynyl.
  • Cycloalkyl C 3 -C 10 -cycloalkyl.
  • Alkoxy C 1 -Q-AIkOXy.
  • Alkylene methylene; 1,1-ethylene; 1,2-ethylene; 1,1-propylidene; 1,2-propylene; 1,3-propylene; 2,2-propylidene; Butan-2-ol-l, 4-diyl; Propan-2-ol-l, 3-diyl; 1,4-butylene; C) clohexan-l, l-diyl; Cyclohexane-l, 2-diyl; Cyclohexane-l, 3-diyl; Cyclohexane-l, 4-diyl; C) clopentan-l, l-diyl; Cyclopentane-l, 2-diyl; and / or cyclopentane-1,3-diyl.
  • Arylene 1,2-phenylene; 1,3-phenylene; 1,4-phenylene; 1,2-naphtalenylene; 1,3-naphtalenylene; 1,4-naphtalenylene; 2,3-naphtalenylene; l-hydroxy-2,3-phenylene; l-hydroxy-2,4-phenylene; 1-hydroxy-2,5-phenylene; and / or 1-hydroxy-2,6-phenylene.
  • Heteroaryl pyridinyl; pyrimidinyl; pyrazinyl; triazolyl; pyridazinyl; 1,3,5-triazinyl;
  • Quinolinyl isoquinolinyl; quinoxalinyl; imidazolyl; pyrazolyl; benzimidazolyl; thiazolyl; oxazolidinyl; pyrrolyl; carbazolyl; indolyl; and / or isoindolyl.
  • Heteroarylene pyridinediyl; Quinolindiyl; Pyrazodiyl; pyrazoldiyl; Triazolediyl; pyrazinediyl; and / or imidazolediyl; in particular pyridine-2,3-diyl; Pyridine-2,4-diyl; Pyridine-2,5-diyl; Pyridine-2,6-diyl; Pyridine-3,4-diyl; Pyridine-3,5-diyl; Quinoline-2,3-diyl; Quinoline-2,4-diyl; Quinoline-2,8-diyl; Isoquinoline-l, 3-diyl; Isoquinoline-l, 4-diyl; Pyrazol-l, 3-diyl; Pyrazole-3,5-diyl; Triazole-3,5-diyl; Triazole-l, 3-diyl;
  • Cl-C6 heterocycloalkyl piperidinyl; piperidines; 1,4-piperazines, tetrahydrothiophenes; tetrahydrofuran; 1,4,7-triazacyclononane; 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane; 1,4,7,10,13-pentaaza-cyclopentadecane; 1, 4-diaza- 7-thiacyclononane; 1, 4-diaza-7-oxa-cyclononane; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane; 1,4-dioxane; 1,4,7-trithiacyclononane; pyrrolidine; and / or tetrahydropyran.
  • Heterocycloalkylene piperidin-1, 2-ylene; Piperidin-2,6-ylene; Piperidin-4,4-ylidene; 1,4-piperazine-1,4-ylene; l, 4-piperazine-2,3-ylene; l, 4-piperazine-2,5-ylene; l, 4-piperazine-2,6-ylene; l, 4-piperazine-l, 2-ylene; l, 4-piperazine-l, 3-ylene; l, 4-piperazine-l, 4-ylene; Tetrahydrothiophene-2,5-ylene; Tetrahydrothiophene 3,4-ylene; Tetrahydrothiophene-2,3-ylene; Tetrahydrofuran-2,5-ylene; Tetrahydrofuran-3,4-ylene; Tetrahydrofuran-2,3-ylene; Pyrrolidin-2,5-ylene; Pyrrolidin-3,4-ylene; Pyrrolidin-2,3-ylene
  • Heterocycloalkyl pyrrolinyl; pyrrolidinyl; morpholinyl; piperidinyl; piperazinyl; hexamethyleneimines; 1,4-piperazinyl; tetrahydrothiophenyl; tetrahydrofuranyl; 1,4,7-triazacyclononanyl; 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecanyl; 1,4,7,10,13-pentaaza-cyclopentadecanyl; l, 4-diaza-7-thiacyclononanyl; l, 4-diaza-7-oxa-cyclononanyl; 1, 4,7,10-tetraazacyclododecanyl; 1, 4-dioxanyl; 1, 4,7-trioxanyl;
  • Amines -N (R) 2 wherein each R is independently selected from the group comprising: H; Cl-C6 alkyl; Cl-C6-alkyl-C6H5; and / or phenyl, where both R can form a - NC3 to -NC5 heterocyclic ring closure.
  • Halogen F; Cl; Br and / or I, more preferably F.
  • Carboxylate derivatives -C (O) OR, wherein R is selected from the group comprising: H; Cl-C20-alkyl; phenyl; Cl-C6-alkyl-C6H5; Li; N / A; K; Cs; mg; and / or Ca.
  • Phosphonate -P (O) (OR) 2, wherein each R is independently selected from the group comprising: H; Cl-C6 alkyl; phenyl; Cl-C6-alkyl-C6H5; Li; N / A; K; Cs; mg; and / or Ca.
  • Phosphate -OP (O) (OR) 2, wherein each R is independently selected from the group comprising: H; Cl-C6 alkyl; phenyl; Cl-C6-alkyl-C6H5; Li; N / A; K; Cs; mg; and / or Ca.
  • Phosphine -P (R) 2, wherein each R is independently selected from the group comprising: H; Cl-C6 alkyl; phenyl; Cl-COE-alkyl-CöHS.
  • compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) and / or (8) are preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or (14), (20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and their pharmaceutically acceptable salts
  • the object of the invention is further achieved by compounds which bind to proteins having at least one sec7 domain, the compounds being selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), ( 5), (6), (7) and / or (8) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13) and / or (14), ( 20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • the object of the invention is also achieved by compounds which are selected from the group comprising the general formulas (20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • These compounds are suitable, for example, for the preparation of medicaments for the treatment of diseases which are influenced by the activity of the guanine nucleotide exchange factors, in particular of the cytohesins, for example autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, diabetes mellitus (Typl), psoriasis, Crohn's disease, allergies, Tumor diseases, such as lung or bronchial cancer, colon or rectal cancer, prostate cancer, lymph or blood cancer, bladder cancer, breast cancer and / or uterine cancer and / or immunosuppression, for example in organ transplantation.
  • autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, diabetes mellitus (Typl), psoriasis,
  • cytohesins are involved in the activation of integrins.
  • compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3), (4), (5), ( 6), (7) and / or (8) are preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12), (13), (14) and / or (19), (20) and / or (21), for example via an interaction of the cytohesins with integrins, the inhibition of the adhesion of leukocytes to cell surfaces and / or an influence of inflammatory processes, a use of these compounds in the field of medicine in a variety of clinical pictures is made possible.
  • an advantage of the compounds provided can be realized by the fact that they can provide a specific inhibitory effect on cytohesin-dependent immune reactions of the cells. Without being bound by theory, it is believed that the compounds provided may provide an inhibitory effect on the adhesion and migration of dendritic cells. Directed migration of dendritic cells is a prerequisite for the development of an adaptive immune response. In preferred embodiments, use of the compounds according to the invention may result in a directed influencing, in particular an inhibition of the adaptive cellular immune response, being able to be provided in cells, tissues and / or organs.
  • the compounds provided can, for example, in in vitro experiments show that the adhesion and / or migration of dendritic cells to ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) can be inhibited even at a lower concentration than needed to have an effect on the Inhibition of insulin-dependent signal transduction cascades.
  • ICAM-1 intercellular adhesion molecule-1
  • the compounds provided have little or no negligible toxicity, in particular cytotoxicity.
  • the compounds provided may have little or no negligible concentration-dependent and / or time-dependent toxicity. This allows the use of the compounds provided for the treatment of human diseases as well as for the production of medicaments.
  • a great advantage of the invention is that the compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3) (4), (5), (6), (7) and / or (8 ) preferably selected from the group comprising compounds (9), (10), (11), (12) (13), (14) and / or (19), (20) and / or (21) for the preparation of medicaments are suitable for the treatment of diseases which are influenced by the activity of the guanine nucleotide exchange factors, in particular of the cytohesins.
  • These diseases include, for example, diseases in which inflammatory processes play a role, cancer or tumor diseases, allergic diseases, autoimmune diseases and / or diseases in which immunosuppression plays a role.
  • Particularly advantageous compounds selected from the group comprising the general formulas (1), (2), (3) (4), (5), (6), (7) and / or (8) are preferably selected from the group comprising Compounds (9), (10), (11), (12) (13), (14) and / or (19), (20) and / or (21) and / or their enantiomers, diastereomers and their pharmaceutically acceptable Salts for the manufacture of a medicament for the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, diabetes mellitus (Typl), diabetes mellitus (type 2), psoriasis, Crohn's disease, allergies, tumors such as lung or bronchial, colon or rectal cancer, prostate cancer, Lymphoid or blood cancer, bladder cancer, breast cancer and / or uterine cancer and / or immunosuppression, for example, in organ transplantation usable.
  • Another object of the invention relates to a method for the identification of compounds which bind to preferably at least one sec7 domain having proteins, the method comprising the following steps: a) producing a fluorescein preferably labeled RNA comprising the steps: aa) optionally Amplification of a DNA sequence bb) optionally purification of the amplified DNA sequence cc) optionally transcription of the DNA sequence into an RNA sequence dd) labeling of the RNA, preferably labeling with fluorescein ee) purification of the labeled RNA b) determination of the polarization of the labeled RNA c) addition of a preferably at least one sec7 domain-containing protein d) determination of the polarization of the complex of protein and labeled RNA e) addition of the compound to be investigated f) determination of the polarization after addition of the compound to be investigated.
  • the method is preferably based on the method of fluorescence polarization, wherein an RNA molecule is preferably labeled with a fluorescent marker such as fluorescein.
  • the DNA molecule corresponding to the RNA sequence can first be amplified.
  • the amplification of a DNA sequence is preferably carried out by PCR reaction.
  • the DNA can be worked up and / or purified in a next step, preferably by phenol / chloroform extraction and / or ethanol precipitation.
  • the DNA sequence can then be transcribed into an RNA sequence.
  • the RNA is tagged with a fluorophore.
  • the RNA is transcribed in vitro in the presence of RNA polymerase from phage T7.
  • this transcription is carried out in the presence of guanosine 5'-monophosphhothioate.
  • Transcription leads to the introduction of a thiophosphate group at the 5 'end of the RNA molecule.
  • This thiol group can then react with an activated fluorophore reagent, for example fluorescein or a fluorescein derivative such as 5-iodoacetyl-fluorescein.
  • fluorescein-labeled RNA molecules show low polarization.
  • polarization is understood to mean in particular a fluorescence polarization.
  • the determination of the polarization of the labeled RNA can be carried out in a fluorescence polarimeter.
  • a preferably a sec7 domain-containing protein is added.
  • Preferred proteins are preferably selected from the group comprising cytohesins such as cytohesin-1, cytohesin-2, cytohesin-3 and / or cytohesin-4, preferably cytohesin-1.
  • the protein may be a native cytohesin protein as well as a protein and / or peptide expressed in vitro and purified on a sec7 domain.
  • the polarization of the formed complex of protein and labeled RNA increases over that of the free RNA.
  • the polarization of the complex of protein and labeled RNA can be determined in a further step of the method. Subsequently, the compound to be examined is added.
  • the polarization after addition of the compound to be tested can be measured.
  • a compound which binds to the protein can be detected by a decrease in the polarization signal, in particular to the value of the polarization of the free RNA.
  • reaction conditions are selected which include RNA in the range from 1 nM to 10 ⁇ M, preferably in the range from 10 nM to 1 ⁇ M, protein in the range from 10 nM to 100 ⁇ M, preferably in the range from 100 nM to 10 ⁇ M, and / or compound to be tested in the range of 1 ⁇ M to 10 mM, preferably in the range of 10 ⁇ M to 1 mM.
  • reaction conditions comprising 100 nM RNA, 1 ⁇ M protein and / or 100 ⁇ M of the compound to be investigated.
  • the method is useful in advantageous embodiments as a high throughput screening assay. This allows the investigation of a high number of compounds.
  • the method has a z-factor, which represents a quality factor for the feasibility of screening methods, of 0.81.
  • the DNA and / or RNA sequence is selected from the group comprising M69 aptamers, K61 aptamers and / or natural DNA and / or RNA.
  • M69 aptamer which binds the sec7 domain of cytohesin-1 and cytohesin-2 is described, for example, in Mayer, G. et al., Proc Natl Acad. USA 98, 4961-5 (2001).
  • K61 aptamer, which specifically binds the sec7 domain of cytohesin-2 is described in Theis, MG et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101, 11221-26 (2004).
  • aptamers means peptides and / or oligonucleotides which interact specifically with cellular proteins.
  • control 2 shows a control experiment with a non-inhibitory compound (control 2) in primary human lymphocytes after stimulation with the monoclonal antibody OKT3
  • Fig. 3 shows the DNA sequence of the M69 aptamer, which can be used as a template, as well as the sequence of primers that can be used for amplification
  • Fig. 4 shows the inhibitory effect of the compound according to the formula (9) on the adhesion of dendritic cells on the substrate ICAM-I
  • Fig. 5 shows the inhibitory effect of the compound according to the formula (9) on the migration of dendritic cells on the substrate ICAM-I
  • IC 50 value was determined for the inhibition of the exchange activity of the sec7 domains of various guanine nucleotide exchange factors of the compounds (9), (10), (11), (12), (14) and (19).
  • the sec7 domains of cytohesin 1, cytohesin 2 and Gea2 and the N ⁇ 17 ARF1, a mutant of the ARF protein were recombinantly expressed in E. coli BL21DE3, purified by standard procedures and used as catalysts for the exchange of GDP to GTP GTPases of the family of ADP ribosylation factors used.
  • the exchange of GDP to GTP induces a conformational change of the ribosylation factor, which increases the fluorescence of a tryptophan residue of the protein.
  • the IC 50 value can be determined.
  • the IC 50 value corresponds to the concentration of compounds at which the activity of the protein is reduced by half. The lower the IC 50 value, the more the compound inhibits the sec 7 domain.
  • Brefeldin A a specific inhibitor of the high molecular weight ADP ribosylation factor Gea2 served as a control.
  • the compounds (9), (10), (11), (12), (14) and (19) in particular (9), (10), (11) and (12) show a specific inhibition of the sec7 domains of the cytohesins against the sec7 domain of Gea2, while the reference compound brefeldin A shows a specific inhibition of the sec7 domain of Gea2.
  • the IC 50 value was compared to the LC 50 value in a luciferase assay
  • HeLa cells according to the experimental conditions described in Theis, M.G. et al., Proc Natl Acad. USA, 101, 11221-26 (2004).
  • the stimulation of receptor tyrosine kinases by growth factors contained in fetal calf serum activates the MAPK pathway via cytohesin 2 and results in activation of the serum response element. This activation is reflected in the amount of luciferase produced in the cells.
  • LC50 values were determined by an MTT assay according to standard procedures.
  • the LC5o value describes the lethal concentration at which 50% of the cells died within 24 hours after a single addition.
  • the IC 5 o-value was determined from the plot of the compound concentration versus the intensity of the luciferase signal.
  • Human peripheral blood cells were stimulated with agonists that activate beta-2 integrin-dependent adhesion.
  • beta-2 integrin-dependent adhesion to its specific ligand ICAM-I can be activated by cytohesins.
  • the agonists used were the monoclonal antibody OKT3 (hybridoma of ATCC, mAb OKT3 purified on protein A, according to standard methods of Current Protocols in Immunology, 5th Ed., Coligan et al., Edts, Wiley 2004) against the CD3 complex, a T- ZeIl receptor, and phorbol ester (PMA), the intracellular signaling cascades in human PBL with the inclusion of integrin-dependent adhesion, bypassing cytohesins unphysio strig activated.
  • OKT3 hybrida of ATCC, mAb OKT3 purified on protein A, according to standard methods of Current Protocols in Immunology, 5th Ed., Coligan et al., Edts, Wiley 2004
  • PMA phorbol ester
  • ICAM-1 coated cell culture dishes were prepared by recombinant ICAM-I-Fc fusion protein (Kolanus, W. et al., Cell 86, 233-42 (1996), Geiger, C. et al., EMBO J., 19, 2525 -2536 (2000)).
  • the DNA sequence of the M69 aptamer shown in FIG. 3 was amplified by using the primers also shown (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) by PCR amplified. 0.01 ⁇ M, DNA template, 1 ⁇ M 3 'and 5' primer, 1.5 mM MgC12, 0.2 mM dNTP mix, and Taq polymerase were used.
  • the PCR program used consisted of the following steps: denaturation 95 0 C 1 min 15 cycles
  • the DNA was subjected to phenol / chloroform extraction according to standard methods and precipitated in ethanol before this monophosphothioate 5 'for 4 hours at 37 0 C in the presence of 20 mM guanosine, T7 RNA polymerase was transcribed. The RNA was then precipitated by ethanol, dissolved in DEPC water and purified on a G25 column (Amersham Biosciences).
  • RNA 10 ⁇ M RNA was heated to 95 ° C. with Ix labeling buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM EDTA), 2 M urea and water for 3 min, then allowed to cool for 10 minutes.
  • Ix labeling buffer 50 mM Tris, pH 8.0, 5 mM EDTA
  • 2 M urea 2 M urea
  • water 3 min
  • 2.5 mg of activated 5-iodoacetyl-fluorescein were dissolved in 500 ⁇ M DMF and added to the batches.
  • the mixture had a concentration of 2 mM 5-iodoacetyl-fluorescein. This mixture was incubated for 2 hours at 37 0 C with gentle shaking under aluminum foil. Subsequently, 3 volumes of 100% ethanol were added, 1/10
  • volume 3M NaOAc, pH 5.4 and 1 ul glycogen was added and incubated for 20 minutes at -80 0 C, before centrifuged for 20 minutes at 14000 rpm at 4 0 C. The pellet was washed with 100 ⁇ l 70% ethanol and dissolved in 20 ⁇ l DEPC water.
  • RNA was separated in an 8% polyacrylamide gel, the RNA from the gel in 500 .mu.l of 0.3M NaOAc solution for 1.5 hours at 65 0 C eluted, filtered through a glass wool filled syringe, precipitated with ethanol and in Dissolved DEPC water.
  • the reaction volume of the fluorescence polarization measurements was 50 ⁇ l of PBS, pH 7.4, 3 mM MgCt.
  • the measurements were determined in 384-well plates (Greiner BioOne) in a Polarimeter Type Ultra, TECAN, excitation: 485 nm, emission: 535 nm.
  • the z-factor was 0.81.
  • the concentrations of the individual measurements were: M69 100 nM
  • Dendritic cells were prepared by differentiation factors (IL-4 and GM-CSF) in vitro from blood monocytes isolated from peripheral mononuclear cells (PBMC) by Ficoll density gradient centrifugation from human blood anonymous donors.
  • IL-4 and GM-CSF differentiation factors
  • PBMC peripheral mononuclear cells
  • the blood was diluted 1: 1 with PBS (KCl 0.2 g / l, KH 2 PO 4 0.2 g / l, NaCl 8 g / l, Na 2 HPO 4 1.15 g / l, PAA, Cölbe ) / 2 mM EDTA and layered on half volume of Ficoll. Centrifugation was carried out at 300xg, 30 minutes without brake. After Centrifugation revealed a medium white band containing the PBMC. This was taken up to 50 ml with PBS / 2 mM EDTA and subjected to several washes at 640 ⁇ g, 500 ⁇ g, 400 ⁇ g, 300 ⁇ g and 200 ⁇ g.
  • the cells were taken up in a titre of 5 ⁇ 10 6 / ml in "VLE-RPMI + / +" medium (Biochrom, Berlin, containing 10% fetal calf serum (FCS), and 1% penicillin / streptomycin) and incubated for 90 minutes in the incubator at 37 0 C and 5% CO 2 incubated. During this time, the monocytes adhere to the bottom of the culture vessel. Peripheral blood lymphocytes remain in suspension and were removed.
  • VLE-RPMI + / + "Biochrom, Berlin, containing 10% fetal calf serum (FCS), and 1% penicillin / streptomycin
  • Adherent monocytes were washed 3-4 times with PBS and taken up in "VLE-RPMI + / +" medium containing 20ng / ml each of the human recombinant cytokines IL-4 and GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor, R & D
  • the quantitative analysis of the cell migration was carried out in modified Boy den chambers consisting of a 24-well plate in which Transwell® filters with a pore size of 5 ⁇ m were used.
  • the modified Boy den- chambers thus contained a chamber above the filter and a chamber below the filter.
  • the filters were coated with supernatants of ICAM-I secreting fibroblasts.
  • Mature dendritic cells were incubated for 96 hours with 1 ⁇ M, 10 ⁇ M or 15 ⁇ M of the compound of formula (9) in "VLE-RPMI + / +" medium. All approaches contained 0.5% DMSO. Controls contained only 0.5% DMSO without the compound of formula (9).
  • adhesion was determined after stimulation with phorbol ester (PMA, 50ng / ml, Sigma, Taufkirchen) or anti-beta-2 integrin antibody MEM-48 (5 ⁇ g / ml, Vaclav Horeijsi, Czech Academy of Sciences Prague).
  • PMA phorbol ester
  • MEM-48 anti-beta-2 integrin antibody
  • control in each case was the migration of cells not treated with the compound of the formula (9) after stimulation with the chemokines CCL19 or CXCL12 or the adhesion of cells not treated with the compound of the formula (9)
  • PI propidium iodide
  • Peripheral blood lymphocytes were incubated at concentrations of 50 nM, 100 nM, 1 ⁇ M, 5 ⁇ M, 20 ⁇ M or 50 ⁇ M of the compound according to formula (9) in "VLE-RPMI + / +" (biochrome) Concentration per batch was 0.5%, one control batch containing 0.5% DMSO After 2 hours, 24 hours and 72 hours cells were removed and incubated with 2 ⁇ g / ml PI for 5 minutes Cells were incubated at 200xg, 8 minutes centrifuged, washed with PBS, centrifuged again and analyzed in a flow cytometer (Beckmann Coulter, Krefeld).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel und deren Verwendung, wobei die Arzneimittel Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen. Diese Arzneimittel sind geeignet zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen und/oder zur Immunsuppression.

Description

Aktenzeichen Unser Zeichen Düsseldorf, Neuanmeldung UD 40010 / SAM 18. November 2005
RHEINISCHE FRIEDRICH- WILHELMS UNIVERSITÄT
RHEINISCHE FRIEDRICH- WILHELMS UNIVERSITÄT Regina-Pacis-Weg 3, 53113 Bonn
Niedermolekulare Inhibitoren von Guaninnucleotid- Austauschfaktoren der Cytohesin- Familie
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneimittel. Das Arzneimittel kann zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Tumorerkrankungen und/oder zur Immunsuppression verwendet werden.
Kleine G- Proteine oder GTPasen und ihre regulatorischen Proteine wie Austauschfaktoren regulieren zentrale zelluläre Prozesse wie Zellproliferation, Zelladhäsion und Zellmigration, programmierter Zelltod oder Antworten auf Zellstress. Diese regulatorischen Proteine oder Austauschfaktoren erfüllen trotz eines teilweise sehr homologen Aufbaus die SAM:AL unterschiedlichen Aufgaben im Zellkontext hochspezifisch, wobei einige Proteine selektiv in die Entstehung bestimmter Krankheiten involviert sind.
Guaninnucleotid- Austauschfaktoren, die im folgenden auch als GEFs bezeichnet werden, aktivieren kleine G- Proteine durch Stimulation des GDP/GTP-Austauschs. Guaninnucleotid- Austauschfaktoren sind Regulatoren von Aktivierungssignalen.
Zu den Guaninnucleotid- Austauschfaktoren für kleine GTPasen der Familie der ADP- Ribosylierungsfaktoren (ARFs) gehören die Familie der großen Guaninnucleotid- Austauschfaktoren, wie Geal, Gea2, BlGl, B1G2, und die Familie der kleinen
Guaninnucleotid- Austauschfaktoren, die Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und Cytohesin-4 (Julie G Donaldson and Catherine L Jackson, Regulators and effectors of the ARF GTPases, Current Opinion in Cell Biology 2000, 12:475^182).
Ein gemeinsames Merkmal der Guaninnucleotid-Austauschfaktoren für kleine GTPasen der Familie der ADP-Ribosylierungsfaktoren ist ihre zentrale sec7-Domäne, entsprechend der Aminosäuren 62-244 in Cytohesin-1 (Ref.: Betz et al, Proc Natl Acad Sei U S A. 1998 JuI 7;95(14):7909-14), Cytohesin-2 (Chardin, P. et al., Nature 384, 481-4 (1996) oder Gea2 (Peyroche, A. et al., Mol Cell 3, 275-85 (1999)). Die sec7-Domäne ist innerhalb der Guaninnucleotid- Austauschfaktoren weitgehend ähnlich und verantwortlich für die Katalyse des Guaninnucleotid-Austausches.
Cytohesine besitzen ein Molekulargewicht von ca. 50 kDa und sind in die Regulation von Zellproliferation und Zelladhäsion/Zellmigration in Krebszellen und Immunzellen involviert.
Als Inhibitoren für GEFs bekannt sind derzeit nur Brefeldin A sowie RNA-Aptamere und Peptide, die entweder hochtoxisch oder nicht ausreichend zellgängig und daher nicht medizinisch anwendbar sind. Somit sind Austauschfaktoren der Cytohesin- Familie bisher nicht als molekulare Zielstrukturen für medizinische Anwendungen verwendbar. Weitere Verbindungen, die diese Proteine inhibieren, sind bisher im Stand der Technik nicht bekannt.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die als Inhibitoren der GEFs der Cytohesin- Familie verwendbar sind, Arzneimittel, die diese Verbindungen umfassen und deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen mittels dieser Inhibitoren.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Arzneimittel, umfassend Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Figure imgf000004_0001
Figure imgf000004_0002
worin:
R ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl- C10-Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin, Cl-ClO- - A -
Alkoxy und/oder ein Strukturelement (Al), (Bl), (Cl), (Dl), (El), (Fl), (Gl), (Hl), (II), (Jl) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000005_0002
Figure imgf000005_0003
Figure imgf000005_0004
Figure imgf000005_0005
worin: R4 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl-
ClO-Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder Cl-ClO- Alkoxy.
Es wurde überraschend gefunden, dass Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) die Aktivität der Guaninnucleotid-
Austauschfaktoren, insbesondere der der Familie der Cytohesine modulieren können, wobei es sich bei der Modulation vorzugsweise um eine Blockierung oder Inhibierung der Funktion handelt. Dies ist insbesondere überraschend, da bislang keine niedermolekularen Inhibitoren für diese Proteinklasse bekannt sind.
Ein besonderer Vorteil der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) besteht darin, dass diese die Proteine bei Konzentrationen inhibieren können, die nicht toxisch sind. Somit sind die zur Verfügung gestellten Verbindungen insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) in Arzneimitteln verwendbar und/oder therapeutisch einsetzbar.
Bevorzugt sind die Verbindungen niedermolekulare Verbindungen. Unter "niedermolekularen Verbindungen" werden im Sinne dieser Erfindung Verbindungen verstanden, die bevorzugt ein Molekulargewicht im Bereich vo n 50 Dalton bis 800 Dalton, vorzugsweise im Bereich von 100 Dalton bis 500 Dalton, besonders bevorzugt im Bereich von 250 Dalton bis 475 Dalton aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) ein Molekulargewicht von weniger als 500 Dalton auf.
Ein weiterer großer Vorteil der die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) umfassenden Arzneimittel wird dadurch verwirklicht, dass die Verbindungen zellgängig sind. Die Verbindungen sind vorteilhafter Weise sehr gut zellgängig, wodurch eine sehr hohe Verfügbarkeit der Verbindungen an ihrem Wirkort, insbesondere in Zellen erzielt werden kann. Unter dem Begriff "zellgängig" wird im Sinne der Erfindung verstanden, dass die Verbindungen durch die Zellmembran hindurchtreten und in Zellen gelangen können. In besonders vorteilhaften Ausführungsformen gelangen die Verbindungen vollständig oder nahezu vollständig in die Zellen und/oder sind vollständig oder nahezu vollständig in der Zelle verfügbar.
Dies ist von besonderem Vorteil, da die Arzneimittel umfassend zellgängige Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) somit nach üblichen Methoden beispielsweise oral, dermal und/oder intravenös verabreichbar sind, ohne dass die Verbindungen mittels einer Transfektion in die Zelle eingebracht werden müssen.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), wobei die Strukturelemente R1, R2 und/oder R3 vorzugsweise ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (Al), (Bl), (Cl) und/oder (Dl) sind. In vorteilhaften Ausführungsformen kann das Arzneimittel Verbindungen aufweisen, die mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (Al), (Bl), (Cl) und/oder (Dl) aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (Al), (Bl), (Cl) und/oder (Dl) auf.
In bevorzugten Ausführungsformen umfassen Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Figure imgf000007_0001
Figure imgf000008_0001
wonn:
Ri ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2) wie nachstehend angegeben:
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Figure imgf000008_0003
R2 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R3 und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2) wie nachstehend angegeben:
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(E2) (F2)
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R3 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R2, und/oder ausgewählt aus der
Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl-ClO- Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder Cl-ClO-
Alkoxy.
In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8), wobei die Strukturelemente R1, R2 und/oder R3 vorzugsweise ausgewählt aus den schwefelhaltigen
Strukturelementen (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) sind. In vorteilhaften Ausführungsformen kann das Arzneimittel Verbindungen aufweisen, die mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A2), (B2), (C2) und/oder (D2) auf. Bevorzugt unter den Cl-C10-Alkoxygruppen sind Methoxy- und/oder Ethoxygruppen.
Erfindungsgemäß besonders geeignete Arzneimittel umfassen Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
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worin:
R1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement
(A3), (B3), (C3), (D3) wie nachstehend angegeben:
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(C3) ° *— * (D3) R2 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R3 und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), wie nachstehend angegeben:
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R3 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R2, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl-ClO- Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, und/oder Cl-C10-Alkoxy.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8), wobei die Strukturelemente R1, R2 und/oder R3 vorzugsweise ausgewählt aus den schwefelhaltigen Strukturelementen (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) sind. In vorteilhaften Ausführungsformen kann das Arzneimittel Verbindungen aufweisen, die mehrere gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) aufweisen. Vorzugsweise weisen die Verbindungen wenigstens eine, vorzugsweise zwei, besonderes bevorzugt drei gleiche und/oder unterschiedliche Strukturelemente (A3), (B3), (C3) und/oder (D3) auf.
In ganz besonders bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
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(10)
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(14).
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Ein bevorzugtes Enantiomer der Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) ist die Verbindung (19) wie nachstehend angegeben:
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In anderen Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
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(20)
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Das Arzneimittel kann die Verbindungen (20) und/oder (21) als Monomere und/oder Dimere, Trimere und/oder Oligomere aufweisen. Die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (20) und/oder (21) weisen vorzugsweise
Dissoziationskonstanten im Bereich von 0,1 μM bis 30 μM, besonders bevorzugt im Bereich von 0,5 μM bis 10 μM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 1 μM bis 7 μM, auf. Die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (20) und/oder (21) können ICso-Werte im von 0,1 μM bis 30 μM, besonders bevorzugt im Bereich von 0,5 μM bis 20 μM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 1 μM bis 15 μM, aufweisen.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) als Monomere aufweisen.
Es kann auch vorgesehen sein, diese Verbindungen über geeignete Gruppen, die auch als spacer bezeichnet werden, zu mehrere solche Monomere umfassenden Einheiten zumindest teilweise miteinander zu verbinden und Dimere, Trimere und/oder Oligomere der Verbindungen zu verwenden. In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen weist das Arzneimittel Dimere, Trimere und/oder Oligomere auf, die wenigstens eines oder mehrere der Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8), vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13) und/oder (14), (20) und/oder (21), aufweisen.
Die verbindenden Gruppen oder spacer können die einzelnen Einheiten und/oder Monomere starr oder flexibel verbinden. Beispielsweise können einzelne Einheiten und/oder Monomere durch Alkin- Gruppen starr verbunden werden, während eine Verbindung über eine oder mehrere Ethylenglycol-Gruppe(n) eine flexible Verbindung zur Verfügung stellen kann.
Bevorzugt sind Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21), zur Bildung von Dimeren, Trimeren und/oder Oligomeren über Ether-, Ester-, Alkin-, Amid-, Alkyl-, Alkenyl- , Cycloalkyl-, Alkoxy-, Alkylen-, Aryl-, Arylen- und/oder Ethylenglycol- Gruppen zumindest teilweise miteinander verbunden.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Arzneimittels kann dadurch verwirklicht werden, dass bereits geringe therapeutische Dosierungen des Arzneimittels verwendbar sind. Eine hohe Dosierung, die häufig zu toxischen Nebenwirkungen führen kann, kann durch die sehr gut zellgängigen und in hohem Ausmaß verfügbaren Verbindungen vermieden werden.
Vorzugsweise weisen die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) Dissoziationskonstanten im Bereich von 0,1 μM bis 30 μM, besonders bevorzugt im Bereich von 0,5 μM bis 10 μM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 1 μM bis 7 μM, auf. Vorzugsweise werden die Dissoziationskonstanten mittels Mikrokalorimetrie bestimmt. Die Dissoziationskonstante bezieht sich vorzugsweise auf die Bindung der Verbindungen an sec- 7- Domänen der Cytohesine. In bevorzugten Ausführungsformen weisen die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) IC50- Werte im von 0,1 μM bis 30 μM, besonders bevorzugt im Bereich von 0,5 μM bis 20 μM, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 1 μM bis 15 μM, auf. Der ICso-Wert der Verbindungen für die Inhibierung der Austauschaktivität der sec7- Domänen verschiedener Guaninnukleotid- Austauschfaktoren entspricht der Konzentration, die nötig ist, die Aktivität des Proteins auf die Hälfte zu reduzieren.
Ein besonderer Vorteil der zur Verfügung gestellten Verbindungen und der diese Verbindungen aufweisenden Arzneimittel kann sich daraus ergeben, dass die Verbindungen die Golgi Apparat- abhängigen zellulären Funktionen vorzugsweise intakt lassen. Dies bedeutet insbesondere eine Vorteil gegenüber Brefeldin A, das den Golgi Apparat der Zellen zerstört.
In bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel, bezogen auf eine Tagesdosis, 10 nM bis 100 μM, vorzugsweise 100 nM bis 10 μM, bevorzugt 1 μM bis 10 μM, besonders bevorzugt 1 μM bis 3 μM Verbindung(en) ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze. In weiteren Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel, bezogen auf eine Tagesdosis, 10 nM bis 100 μM, vorzugsweise 100 nM bis 10 μM, bevorzugt 1 μM bis 10 μM, besonders bevorzugt 1 μM bis 3 μM, auch bevorzugt 500 nM bis 3 μM, weiter bevorzugt 500 nM bis 1 μM Verbindung(en) ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
In weiterhin bevorzugten Ausführungsformen umfasst das Arzneimittel, bezogen auf eine Tagesdosis, 500 nM bis 3 μM, vorzugsweise 500 nM bis 1 μM Verbindung(en) ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21).
Unter einer Tagesdosis wird im Sinne dieser Anmeldung die Menge des Arzneimittels verstanden, die pro Tag verabreicht wird.
Die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19), (20) und/oder (21) können die Aktivität von Guaninnucleotid- Austauschfaktoren, die eine sec7-Domäne aufweisen, modulieren, wobei es sich bei der Modulation um eine Blockierung oder Inhibierung handelt.
Vorteilhafter Weise sind Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze als Inhibitoren für wenigstens eine sec7-Domäne aufweisende Proteine verwendbar. Diese Verbindungen sind als Inhibitoren für eine sec7- Domäne aufweisende Proteine verwendbar, wobei die Proteine bevorzugt ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid- Austauschfaktoren, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid- Austauschfaktoren für humane ADP-Ribosylierungsfaktoren, wie Geal, Gea2, BlGl, B1G2 und/oder Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4.
Überraschender Weise wurde gefunden, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19), (20) und/oder (21) insbesondere für die Inhibition der Cytohesine verwendbar sind.
Ein Vorteil der Verbindungen liegt in bevorzugten Ausführungsformen darin, dass diese Verbindungen spezifisch an Cytohesine binden können. Insbesondere bei niedrigen Konzentrationen der Verbindungen, vorzugsweise im Bereich von 10 nM bis 10 μM, bevorzugt im Bereich von 500 nM bis 1 μM, können die Verbindungen an Cytohesine binden, während die Verbindungen an höhermolekulare Guaninnukleotid-Austauschfaktoren wie Geal, Gea2, BlGl, B1G2 bei diesen Konzentrationen nicht oder nur in geringerem Umfang binden.
Die Bindungskonstante für die Bindung der Verbindungen, insbesondere der Verbindung (9), an die sec-7-Domäne humaner Cytohesine kann im Bereich von 100 nM bis 1500 nM, vorzugsweise im Bereich von 200 nM bis 900 nM, bevorzugt im Bereich von 200 nM bis 500 nM, liegen.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen können die Verbindungen, eine Spezifität für bestimmte Cytohesine aufweisen, beispielsweise kann Verbindung (12) vorteilhafter Weise bevorzugt an Cytohesin-1 gegenüber Cytohesin-2 binden. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass erfindungsgemäße Verbindungen, die bevorzugt an Cytohesin-1 gegenüber Cytohesin-3 binden und dieses somit spezifisch inhibieren können, die Möglichkeit einer Verwendung der Verbindungen zur Behandlung von Diabetes Typ II ermöglichen können.
Insbesondere können die Inhibitionskonstanten (Kj-Werte) der zur Verfügung gestellten Verbindungen gegenüber Cytohesinen im Insulin- signalling im Bereich von 7 μM bis 20 μM liegen.
Die Spezifität der Verbindungen kann beispielsweise von der Konzentration der Verbindungen beeinflusst sein, beispielsweise kann eine Spezifität gegenüber bestimmten Cytohesinen bei höheren oder niedrigeren Konzentrationen der Verbindungen auftreten. Dies ermöglicht die Verwendung der Verbindungen in bestimmten Konzentrationsbereichen, in sog. therapeutischen Fenstern, zur Inhibition bestimmter Cytohesine.
Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (15), (16), (17), (18) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
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(18) sind vorteilhafter Weise zur Herstellung von Inhibitoren, die zur Blockierung von wenigstens eine sec7- Domäne aufweisenden Proteinen geeignet.
Unter dem Begriff "Blockierung" wird in Sinne dieser Erfindung eine Bindung der Verbindungen (15), (16), (17), (18) an die sec7-Domäne der Proteine verstanden, die vorzugsweise zu einer Inhibition der eine sec7- Domäne aufweisenden Proteine, insbesondere der Cytohesine, führt.
Hierbei können die Strukturelemente, die die Verbindungen aufweisen, ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend R, R1, R2 R3, und/oder R4, Strukturelemente (Al), (Bl), (Cl), (Dl), (El), (Fl), (Gl), (Hl), (II), (Jl), (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2), (A3), (B3), (C3), (D3), (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3), Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl-ClO- Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin, Cl-ClO- Alkoxy, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Aryl, Alkylen, Arylen, Amine, Halogen, Carboxylatderivate, Cycloalkyl, Carbonylderivate, Heterocycloalkyl, Heteroaryl, Heteroarylen, Sulphonat, Sulphat, Phosphonat, Phosphat, Phosphin und/oder Phosphinoxid, wobei wenn nicht anders angegeben, für:
Alkyl = lineares oder verzweigtes C1-C2O- Alkyl, vorzugsweise Ethyl, Propyl, iso-Propyl, tert- Butyl, Butyl, Pentan.
Alkenyl = C2-C2O- Alkenyl.
Alkinyl = C2-C20- Alkinyl.
Cycloalkyl = C3 -C10- Cycloalkyl. Alkoxy = C1-Q-AIkOXy.
Alkylen = Methylen; 1,1-Ethylen; 1,2-Ethylen; 1,1-Propyliden; 1,2-Propylen; 1,3-Propylen; 2,2-Propyliden; Butan-2-ol-l,4-diyl; Propan-2-ol-l,3-diyl; 1,4-Butylen; C)clohexan-l,l-diyl; Cyclohexan-l,2-diyl; Cyclohexan-l,3-diyl; Cyclohexan-l,4-diyl; C)clopentan-l,l-diyl; Cyclopentan-l,2-diyl; und/oder Cyclopentan-l,3-diyl.
Aryl = homo- oder hetero - Aromaten mit einem Molekulargewicht von = 300.
Arylen = 1,2-Phenylen; 1,3-Phenylen; 1,4-Phenylen; 1,2-Naphtalenylen; 1,3-Naphtalenylen; 1,4-Naphtalenylen; 2,3-Naphtalenylen; l-Hydroxy-2,3-phenylen; l-Hydroxy-2,4-phenylen; 1- Hydroxy-2,5-phenylen; und/oder/oder l-Hydroxy-2,6-phenylen.
Heteroaryl = Pyridinyl; Pyrimidinyl; Pyrazinyl; Triazolyl; Pyridazinyl; 1,3,5-Triazinyl;
Quinolinyl. Isoquinolinyl; Quinoxalinyl; Imidazolyl; Pyrazolyl; Benzimidazolyl; Thiazolyl; Oxazolidinyl; Pyrrolyl; Carbazolyl; Indolyl; und/oder Isoindolyl.
Heteroarylen = Pyridindiyl; Quinolindiyl; Pyrazodiyl; Pyrazoldiyl; Triazolediyl; Pyrazindiyl; und/oder Imidazolediyl; insbesondere Pyridin-2,3-diyl; Pyridin-2,4-diyl; Pyridin-2,5-diyl; Pyridin-2,6-diyl; Pyridin-3,4-diyl; Pyridin-3,5-diyl; Quinolin-2,3-diyl; Quinolin-2,4-diyl; Quinolin-2,8-diyl; Isoquinolin-l,3-diyl; Isoquinolin-l,4-diyl; Pyrazol-l,3-diyl; Pyrazol-3,5- diyl; Triazole-3,5-diyl; Triazole-l,3-diyl; Pyrazin-2,5-diyl; und/oder Imidazole-2,4-diyl.
Cl-C6-Heterocycloalkyl = Piperidinyl; Piperidine; 1,4-Piperazine, Tetrahydrothiophene; Tetrahydrofuran; 1,4,7-Triazacyclononan; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan; 1,4,7,10,13- Pentaazacyclopentadecan ; 1 ,4- Diaza- 7- thiacyclononan ; 1 ,4- Diaza- 7- oxa- cyclononan ; 1,4,7, 10- Tetraazacyclododecan; 1,4-Dioxane; 1,4,7-Trithiacyclononan; Pyrrolidin; und/oder Tetrahydropyran.
Heterocycloalkylen = Piperidin-l,2-ylen; Piperidin-2,6-ylen; Piperidin-4,4-yliden; 1,4- Piperazin-l,4-ylen; l,4-Piperazin-2,3-ylen; l,4-Piperazin-2,5-ylen; l,4-Piperazin-2,6-ylen; l,4-Piperazin-l,2-ylen; l,4-Piperazin-l,3-ylen; l,4-Piperazin-l,4-ylen; Tetrahydrothiophen- 2,5-ylen; Tetrahydrothiophen-3,4-ylen; Tetrahydrothiophen-2,3-ylen; Tetrahydrofuran-2,5- ylen; Tetrahydrofuran-3,4-ylen; Tetrahydrofuran-2,3-ylen; Pyrrolidin-2,5-ylen; Pyrrolidin- 3,4-ylen; Pyrrolidin-2,3-ylen; Pyrrolidin- 1,2- ylen; Pyrrolidin- 1, 3 -ylen; Pyrrolidin- 2,2- yliden; 1,4,7-Triazacyclonon- 1,4- ylen; 1,4,7- Triazacyclonon-2,3-ylen; l,4,7-Triazacyclonon-2,9- ylen; 1,4,7- Triazacyclonon-3,8-ylen; 1,4,7-Triazacyclonon- 2,2- yliden; 1,4,8,11- Tetraazacyclotetradec- 1 ,4- ylen; 1,4,8,11- Tetraazacyclotetradec- 1,8- ylen ; 1,4,8,11- Tetraazacyclotetradec-2,3-ylen; 1,4,8, ll-Tetraazacyclotetradec-2,5-ylen; 1,4,8,11- Tetraazacyclotetradec- 1,2- ylen; 1,4,8,1 l-Tetraazacyclotetradec-2,2- yliden; 1,4,7,10- Tetraazacyclododec- 1,4- ylen; 1,4,7,10- Tetraazacyclododec-l,7-ylen; 1,4,7,10- Tetraazacyclododec- 1,2- ylen; 1,4,7,10- Tetraazacyclododec-2,3-ylen; 1,4,7,10- Tetraazacyclododec- 2,2- yliden; 1,4,7, 10,13-Pentaazacyclopentadec- 1,4- ylen; 1,4,7,10,13- Pentaazacyclopentadec- 1,7-ylen; 1,4,7, 10,13-Pentaazacyclopentadec-2,3-ylen; 1,4,7,10,13- Pentaazacyclopentadec- 1,2- ylen; 1,4,7, 10,13-Pentaazacyclopentadec-2,2- yliden; l,4-Diaza-7- thia-cyclonon- 1,4- ylen; l,4-Diaza-7-thia-cyclonon-l,2-ylen; l,4-Diaza-7-thia-cyclonon-2,3- ylen; l,4-Diaza-7-thia-cyclonon-6,8-ylen; l,4-Diaza-7-thia-cyclonon-2,2-yliden; l,4-Diaza-7- oxa-cyclonon- 1,4- ylen; 1,4- Diaza-7-oxa-cyclonon- 1,2- ylen; l,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-2,3- ylen; l,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-6,8-ylen; l,4-Diaza-7-oxa-cyclonon-2,2-yliden; 1,4-Dioxan- 2,3-ylen; l,4-Dioxan-2,6-ylen; l,4-Dioxan-2,2-yliden; Tetrahydropyran-2,3-ylen; Tetrahydropyran-2,6-ylen; Tetrahydropyran-2,5-ylen; Tetrahydropyran-2,2-yliden; 1,4,7-
Trithia-cyclonon-2,3-ylen; 1,4,7- Trithia-cyclonon-2,9-ylen; und/oder 1,4,7-Trithia-cyclonon- 2,2-yHden. Heterocycloalkyl = Pyrrolinyl; Pyrrolidinyl; Morpholinyl; Piperidinyl; Piperazinyl; Hexamethylenimine; 1,4- Piperazinyl; Tetrahydrothiophenyl; Tetrahydrofuranyl; 1,4,7- Triazacyclononanyl; 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecanyl; 1,4,7,10,13- Pentaazacyclopentadecanyl; l,4-Diaza-7-thiacyclononanyl; l,4-Diaza-7-oxa-cyclononanyl; 1 ,4,7,10-Tetraazacyclododecanyl; 1 ,4-Dioxanyl; 1 ,4,7-Trithiacyclononanyl; Tetrahydropyranyl; und/oder Oxazolidinyl.
Amine = -N(R)2 worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, wobei beide R einen - NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluß ausbilden können.
Halogen = F; Cl; Br und/oder I, besonders bevorzugt F.
Sulphoπat = -S(O)2OR, worin R = H; Cl-C6-Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca ist.
Sulphat = -OS(O)2OR, worin R = H; Cl-C6-Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca ist.
Sulphon: -S(O)2R, worin R = H; Cl-C6-Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5 und/oder Amine (zur Bildung von Sulphonamid) ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: -NR'2, worin jedes R' unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; Cl- C6-Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, worin wenn beide R' = Cl-C6-Alkyl die R' gemeinsam einen -NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluss ausbilden können.
Carboxylatderivate = -C(O)OR, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl- C20-Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca. Carbonylderivate = -C(O)R, worin R ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; C1-C6- Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5 und/oder Amin (zur Ausbildung von Amid) ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: -NR'2, worin R' unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, worin wenn beide R' = Cl-C6-Alkyl die R gemeinsam einen -NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluss ausbilden können.
Phosphonat = -P(O)(OR)2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca.
Phosphat = -OP(O)(OR)2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5; Li; Na; K; Cs; Mg; und/oder Ca.
Phosphin = -P(R)2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; Phenyl; Cl-Cö-Alkyl-CöHS.
Phosphinoxid = -P(O)R2, worin jedes R unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; Phenyl; Cl-C6-Alkyl-C6H5 und/oder Amin (zur Ausbildung von Phosphonamidat) ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: -NR'2, worin R' unabhängig voneinander ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: H; Cl-C6-Alkyl; C1-C6- Alkyl-C6H5; und/oder Phenyl, worin wenn beide R' = Cl-C6-Alkyl, die R' gemeinsam einen -NC3 bis -NC5 heterocyclischen Ringschluss ausbilden können; steht.
Insbesondere sind Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze vorteilhafter Weise zur Herstellung von Inhibitoren, die zur Blockierung von wenigstens eine sec7- Domäne aufweisenden Proteinen geeignet.
Die Aufgabe der Erfindung wird weiterhin gelöst durch Verbindungen, die an wenigstens eine sec7-Domäne aufweisende Proteine binden, wobei die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
Die Aufgabe der Erfindung wird auch gelöst durch Verbindungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze. Diese Verbindungen sind beispielsweise geeignet zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen, die durch die Aktivität der Guaninnukleotid- Austauschfaktoren insbesondere der Cytohesine beinflußbar sind, beispielsweise Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typl), Psoriasis, Morbus Crohn, Allergien, Tumorerkrankungen, wie Lungen- oder Bronchialkrebs, Dick- oder Mastdarmkrebs, Prostatakrebs, Lymph- oder Blutkrebs, Harnblasenkrebs, Brustkrebs und/oder Gebärmutterkrebs und/oder Immunsuppression, beispielsweise in der Organtransplantation.
Cytohesine sind beispielsweise beteiligt an der Aktivierung von Integrinen. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird angenommen, dass insbesondere durch die Inhibition der Cytohesine durch Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) und/oder (19), (20) und/oder (21), beispielsweise über eine Wechselwirkung der Cytohesine mit Integrinen, der Inhibition der Adhäsion von Leukozyten an Zelloberflächen und/oder einer Beeinflussung inflammatorischer Prozesse eine Verwendung dieser Verbindungen im Bereich der Medizin bei einer Vielzahl an Krankheitsbildern ermöglicht wird.
Ein Vorteil der zur Verfügung gestellten Verbindungen, kann dadurch verwirklicht werden, dass diese eine spezifische inhibitorische Wirkung auf Cytohesin- abhängige Immunreaktionen der Zellen zur Verfügung stellen können. Ohne auf eine bestimmte Theorie festgelegt zu sein, wird vermutet, dass die zur Verfügung gestellten Verbindungen einen hemmenden Effekt auf die Adhäsion und Migration dendritischer Zellen zur Verfügung stellen können. Die gerichtete Wanderung von dendritischen Zellen ist eine Voraussetzung für die Ausbildung einer adaptiven Immunantwort. In bevorzugten Ausführungsformen kann eine Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen dazu führen, dass in Zellen, Geweben und/oder Organen eine gerichtete Beeinflussung insbesondere eine Hemmung der adaptiven zellulären Immunantwort zur Verfügung gestellt werden kann.
Die zur Verfügung gestellten Verbindungen können beispielsweise in in vitro-Experimenten zeigen, dass die Adhäsion und/oder Migration dendritischer Zellen an ICAM- 1 (intercellular adhesion molecule-1) bereits bei geringeren Konzentration inhibiert werden kann als benötigt werden, um einen Effekt auf die Inhibition von Insulinabhängigen Signaltransduktionskaskaden zu bewirken. Dies ermöglicht vorteilhafter Weise eine Verwendung der zur Verfügung gestellten Verbindungen zur Beeinflussung unterschiedlicher Stoffwechselvorgänge, insbesondere unter Beachtung der entsprechenden therapeutischen Fenster kann eine gezielte Behandlung verschiedener Erkrankungen ermöglicht werden.
Vorteilhafter Weise können die zur Verfügung gestellten Verbindungen keine oder eine nur geringe oder vernachlässigbare Toxizität insbesondere Cytotoxizität aufweisen. Insbesondere können die zur Verfügung gestellten Verbindungen keine oder eine lediglich geringe oder vernachlässigbare konzentrationsabhängige und/oder zeitabhängige Toxizität aufweisen. Dies ermöglicht eine Verwendung der zur Verfügung gestellten Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen im Menschen sowie zur Herstellung von Arzneimitteln.
Ein großer Vorteil der Erfindung liegt darin, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13), (14) und/oder (19), (20) und/oder (21) zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung von Erkrankungen geeignet sind, die durch die Aktivität der Guaninnukleotid-Austauschfaktoren insbesondere der Cytohesine beinflußbar sind.
Zu diesen Erkrankungen zählen beispielsweise Krankheiten, bei welchen inflammatorische Prozesse eine Rolle spielen, Krebs- bzw. Tumorerkrankungen, allergische Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und/oder Erkrankungen bei welchen die Immunsuppression eine Rolle spielt.
Besonders vorteilhaft sind Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13), (14) und/oder (19), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typl), Diabetes mellitus (Typ2), Psoriasis, Morbus Crohn, Allergien, Tumorerkrankungen, wie Lungen- oder Bronchialkrebs, Dick- oder Mastdarmkrebs, Prostatakrebs, Lymph- oder Blutkrebs, Harnblasenkrebs, Brustkrebs und/oder Gebärmutterkrebs und/oder Immunsuppression, beispielsweise in der Organtransplantation verwendbar. Weiterhin können die zur Verfügung gestellten Verbindungen und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Diabetes mellitus (Typ2) verwendbar sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an vorzugsweise wenigstens eine sec7- Domäne aufweisende Proteine binden, wobei das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer vorzugsweise mit Fluorescein markierten RNA, umfassend die Schritte: aa) optional Amplifizieren einer DNA- Sequenz bb) optional Reinigung der amplifizierten DNA- Sequenz cc) optional Transkription der DNA- Sequenz in eine RNA- Sequenz dd) Markierung der RNA, vorzugsweise Markierung mit Fluorescein ee) Reinigung der markierten RNA b) Bestimmung der Polarisation der markierten RNA c) Zugabe eines vorzugsweise wenigstens eine sec7-Domäne aufweisenden Proteins d) Bestimmung der Polarisation des Komplexes aus Protein und markierter RNA e) Zugabe der zu untersuchenden Verbindung f) Bestimmung der Polarisation nach Zugabe der zu untersuchenden Verbindung.
Das Verfahren beruht vorzugsweise auf der Methode der Fluoreszenzpolarisation, wobei ein RNA-Molekül bevorzugt mit einem Fluoreszenzmarker wie Fluorescein markiert wird.
Zur Herstellung einer ausreichenden Menge verwendbarer RNA kann zunächst das der RNA- Sequenz entsprechende DNA-Molekül vervielfältigt werden. Das Amplifizieren einer DNA- Sequenz erfolgt vorzugsweise durch PCR- Reaktion. Die DNA kann in einem nächsten Schritt aufgearbeitet und/oder gereinigt werden, bevorzugt durch Phenol/Chloroform- Extraktion und/oder Ethanolfällung. Die DNA- Sequenz kann dann in eine RNA- Sequenz transkribiert werden. In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens erfolgt die Markierung der RNA mit einem Fluorophor.
Bevorzugt wird die RNA in vitro in Anwesenheit der RNA- Polymerase aus Phage T7 transkribiert. In bevorzugten Ausführungsformen wird diese Transkription in Anwesenheit von Guanosin-5'-monophosphothioat, ausgeführt. Die Transkription führt zu einer Einführung einer Thiophosphatgruppe am 5'-Ende des RNA-Moleküls. Diese Thiolgruppe kann dann mit einem aktivierten Fluorophorreagenz, beispielsweise Fluorescein oder einem Fluorescein- Derivat wie 5-Iodoacetyl-Fluorescein reagieren.
In bevorzugten Ausführungsformen zeigen Fluorescein- markierte RNA- Moleküle eine geringe Polarisation. Unter dem Begriff "Polarisation" wird insbesondere eine Fluoreszenzpolarisation verstanden. Die Bestimmung der Polarisation der markierten RNA kann in einem Fluoreszenzpolarimeter erfolgen.
In einem nächsten Schritt wird ein vorzugsweise eine sec7-Domäne aufweisendes Protein zugegeben. Bevorzugte Proteine sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4, bevorzugt Cytohesin-1. Das Protein kann ein natives Cytohesin- Protein sein, wie auch ein in vitro exprimiertes und auf gereinigten eine sec7- Domäne aufweisendes Protein und/oder Peptid.
Bindet das Protein an die markierte RNA steigt die Polarisation des gebildeten Komplexes aus Protein und markierter RNA gegenüber der der freien RNA. Die Polarisation des Komplexes aus Protein und markierter RNA kann in einem weiteren Schritt des Verfahrens bestimmt werden. Anschließend wird die zu untersuchende Verbindung zugegeben. Ein Vorteil des Verfahrens wird dadurch verwirklicht, dass Verbindungen, die mit der RNA/Proteinbindung interferieren, die RNA von dem Protein verdrängen können und somit wieder ein geringeres Polarisationssignal erzeugen können.
Die Polarisation nach Zugabe der zu untersuchenden Verbindung kann gemessen werden. Vorteilhafter Weise kann eine Verbindung, die an das Protein bindet, durch ein Absinken des Polarisationssignals, insbesondere auf den Wert der Polarisation der freien RNA, detektiert werden.
In bevorzugten Ausführungsformen des Verfahrens werden Reaktionsbedingungen gewählt, die RNA im Bereich von 1 nM bis 10 μM, vorzugsweise im Bereich von 10 nM bis 1 μM, Protein im Bereich von 10 nM bis 100 μM, vorzugsweise im Bereich von 100 nM bis 10 μM, und/oder zu untersuchende Verbindung im Bereich von 1 μM bis 10 mM, vorzugsweise im Bereich von 10 μM bis 1 mM, umfassen. Besonders bevorzugt sind Reaktionsbedingungen umfassend 100 nM RNA, 1 μM Protein und/oder 100 μM der zu untersuchenden Verbindung.
Das Verfahren ist in vorteilhaften Ausgestaltungen als Screening Assay mit einem hohen Durchsatz verwendbar. Dies ermöglicht die Untersuchung einer hohen Zahl an Verbindungen In besonders vorteilhaften Ausgestaltungen weist das Verfahren einen z- Faktor, welcher einen Qualitätsfaktor für die Durchführbarkeit von Screening Verfahren darstellt, von 0,81 auf.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die DNA- und/oder RNA-Sequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend M69-Aptamere, K61-Aptamere und/oder natürliche DNA und/oder RNA. Ein besonders bevorzugt verwendbares M69-Aptamer, welches die sec7-Domäne von Cytohesin-1 und Cytohesin-2 bindet ist beispielsweise in Mayer, G. et al., Proc Natl Acad Sei U S A 98, 4961-5 (2001) beschrieben. Ein besonders bevorzugt verwendbares K61-Aptamer, welches spezifisch die sec7-Domäne von Cytohesin-2 bindet ist in Theis, M. G. et al., Proc Natl Acad Sei USA ,101, 11221-26 (2004) beschrieben.
Unter dem Begriff "Aptamere" werden im Sinne der Erfindung Peptide und/oder Oligonukleotide verstanden, die spezifisch mit zellulären Proteinen interagieren.
Beispiele und Figuren, die der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, sind nachstehend angegeben.
In den Figuren zeigt:
Fig. 1 den spezifischen inhibitorischen Effekt der Verbindung (9) auf Cytohesin- abhängige Adhäsionsmechanismen in primären humanen Lymphozyten nach Stimulation mit dem monoklonalen Antikörper OKT3 und Phorbolester (PMA)
Fig. 2 einen Kontroll versuch mit einer nicht inhibitorisch wirkenden Verbindung (Kontrolle 2) in primären humanen Lymphozyten nach Stimulation mit dem monoklonalen Antikörper OKT3
Fig. 3 die DNA- Sequenz des M69-Aptamers, das als Template verwendbar ist, sowie die Sequenz der zur Amplifikation einsetzbaren Primer
Fig. 4 den inhibitorischen Effekt der Verbindung gemäß der Formel (9) auf die Adhäsion dendritischer Zellen auf dem Substrat ICAM-I
Fig. 5 den inhibitorischen Effekt der Verbindung gemäß der Formel (9) auf die Migration dendritischer Zellen auf dem Substrat ICAM-I
Beispiel 1 Ermittelt wurde der ICso-Wert für die Inhibierung der Austauschaktivität der sec7-Domänen verschiedener Guaninnukleotid-Austauschfaktoren der Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19).
Hierzu wurden die sec7- Domänen von Cytohesin 1, Cytohesin 2 und Gea2 und das NΔ 17- ARFl, eine Mutante des ARF-Proteins, rekombinant in E. coli BL21DE3 exprimiert, nach Standardverfahren aufgereinigt und als Katalysatoren für den Austausch von GDP zu GTP bei GTPasen der Familie der ADP-Ribosylierungsfaktoren benutzt. Der Austausch von GDP zu GTP induziert einen Konformationswechsel des Ribosylierungsfaktors, wodurch die Fluoreszenz eines Tryptophan- Restes des Proteins erhöht wird.
In 50 mM HEPES, pH 7,4, 120 mM KCl, 1 mM MgCt, 45 μM GTP S, wurden zu 1 μM NΔ 17- ARFl und jeweils 1 μM der aufgereinigten sec7-Domäne von Cytohesin- 1, Cytohesin-2 und Gea2 die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) jeweils in Konzentrationen von 1 μM bis 30 μM zugegeben und die Fluoreszenz wurde in einem Varioskan, Thermo LifeSciences Inc., bei folgenden Wellenlängen gemessen: Anregung: 275 nm, Emission 340 nm.
Aus der Auftragung der Anfangssteigung des Fluoreszenzsignals gegen die zugebenen Konzentrationen der Verbindungen lässt sich der ICso-Wert ermitteln. Der ICso-Wert entspricht der Konzentration der Verbindungen bei der die Aktivität des Proteins auf die Hälfte reduziert ist. Je niedriger der ICso-Wert ist, je stärker inhibiert die Verbindung die sec7-Domäne. Brefeldin A, ein spezifischer Inhibitor des hochmolekularen ADP- Ribosylierungsfaktors Gea2 diente als Kontrolle.
Tabelle 1
Figure imgf000034_0001
Wie aus der Tabelle 1 hervorgeht, zeigen die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) insbesondere (9), (10), (11) und (12) eine spezifische Inhibition der sec7-Domänen der Cytohesine gegenüber der sec7-Domäne von Gea2, während die Referenzverbindung Brefeldin A eine spezifische Inhibition der sec7- Domäne von Gea2 zeigt.
Beispiel 2
Bestimmt wurde der ICso-Wert gegenüber dem LCso-Wert in einem Luciferase-Assay in
HeLa- Zellen, entsprechend den in Theis, M. G. et al., Proc Natl Acad Sei USA ,101, 11221- 26 (2004) beschriebenen Versuchsbedingungen. Die Stimulation von Rezeptortyrosinkinasen durch in fetalen Kälberserum enthaltenen Wachstumsfaktoren aktiviert den MAPK- Weg über Cytohesin 2 und resultiert in einer Aktivierung des Serum Response Elements. Diese Aktivierung zeigt sich in der Menge der in den Zellen produzierten Luciferase.
Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) wurden jeweils in Konzentrationen von 1 μM bis 50 μM zu 6,5 x 104 HeLa-Zellen gegeben. Die Tabelle 2 zeigt eine Gegenüberstellung der IC50- Werte gegenüber den LCso-Werten nach
24 Stunden. Die LC50- Werte wurden durch einen MTT-Assay nach Standardverfahren bestimmt.
Der LC5o-Wert beschreibt hierbei die letale Konzentration, bei der nach einmaliger Zugabe innerhalb von 24 Stunden 50 % der Zellen starben.
Der IC5o-Wert wurde aus der Auftragung der Konzentration der Verbindung gegen die Intensität des Luciferasesignals bestimmt.
Tabelle 2
Figure imgf000035_0002
Als negative Kontrolle diente die folgende Verbindung (Kontrolle 1):
(Kontrolle 1)
Figure imgf000035_0001
Wie aus der Tabelle 2 hervorgeht, zeigten die Verbindungen (9), (10), (11), (12), (14) und (19) insbesondere (9), (10), (11) und (12) eine sehr gute Inhibition von Cytohesin 2 bei geringen Konzentrationen, während eine Toxizität nach 24 Stunden erst bei sehr hohen Konzentrationen auftrat.
Beispiel 3
Humane periphere Blutzellen (PBL) wurden mit Agonisten stimuliert, die eine beta-2 Integrin- abhängige Adhäsion aktivieren. In diesen primären humanen Lymphozyten kann die beta-2 Integrin- abhängige Adhäsion an seinen spezifischen Liganden ICAM-I durch Cytohesine aktiviert werden.
Als Agonisten dienten der monoklonale Antikörper OKT3 (Hybridom von ATCC, mAb OKT3 gereinigt an Protein A, nach Standardmethoden aus Current Protocols in Immunology, 5th Ed., Coligan et al., Edts, Wiley 2004) gegen den CD3 -Komplex, einen T-ZeIl Rezeptor, und Phorbolester (PMA), der intrazelluläre Signalkaskaden in humanen PBL unter Einbezug von Integrin- abhängiger Adhäsion unter Umgehung von Cytohesinen unphysiologisch aktiviert.
Zellen aus humanem Blut wurden nach Standard- Methoden (Current Protocols in Immunology, 5th Ed., 2004, Coligan et al., Edts, Wiley) isoliert. Mit ICAM- 1 beschichtete Zellkulturschalen wurden mittels rekombinantem ICAM-I-Fc Fusionsprotein hergestellt (Kolanus, W. et al., Cell 86, 233-42 (1996), Geiger, C. et al., EMBO J., 19, 2525-2536 (2000)). 300.000 humane periphere Blutzellen (PBL) wurden für 30 Minuten mit 2 μg/ml OKT3 oder 40 ng/ml Phorbolester (PMA) in Hankvs BSS, (Gibco; Zusammensetzung (g/l): CaCbx2H2θ (0,185), KCl (0,4), KH2PO4 (0,06), MgCkx6H_O (0,1), MgSθ4x7H2θ (0,1), NaCl (8,0), NaHCOs (0,35), Na2HPO4 (0,048), D-Glucose (1,0) ), stimuliert, und für eine Stunde in Hankvs BSS auf die ICAM-I beschichteten Zellkulturschalen gegeben, wobei die Agonist nicht entfernt wurden. Nichtgebundene Zellen wurden durch Waschen mit Hankv s BSS entfernt. Der Prozentanteil gebundener Zellen wurde durch Auszählen unter dem Mikroskop mittels eines Standardzählrasters ermittelt.
Wie aus Fig. 1 zu entnehmen ist, inhibierte die Verbindung (9) die Adhäsion der humanen peripheren Blutzellen (PBL) an ICAM-I in einer konzentrationsabhängigen Weise. Der IC50- Wert lag bei ca. 500 nM bis 1 μM. Wie aus der Figur 1 weiterhin ersichtlich ist, zeigte sich der inhibitorische Effekt nur bei mit OKT3 stimulierten Zellen, während durch Phorbolester (PMA) aktivierte Zellen nicht durch die Verbindung (9) beeinflusst wurden. Dies zeigt die hohe Spezifität der Verbindung (9) gegenüber Cytohesin- abhängigen Adhäsionsmechanismen.
Die Spezifität der Inhibition der OKT3- vermittelten Adhäsion in primären humanen Lymphozyten durch Verbindung (9) zeigt ebenfalls die Fig. 2. Fig. 2 zeigt, dass eine Kontrollverbindung (Kontrolle 2) keinen Effekt auf dieses System ausübte.
Figure imgf000037_0001
Beispiel 4 Fuoreszenzpolarisations-Assay
Die in Fig. 3 gezeigte DNA- Sequenz des M69-Aptamers (SEQ ID NO: 1) wurde unter Verwendung der ebenfalls abgebildeten Primer (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3) mittels PCR amplifiziert. Hierbei wurden 0,01 μM, DNA- Template, jeweils 1 μM 3'- und 5'- Primer, 1,5 mM MgC12, 0,2 mM dNTP-Mix, und Taq- Polymerase verwendet.
Das verwendete PCR- Programm umfasste die folgenden Schritte : Denaturieren 95 0C 1 min 15 Zyklen
Annealen 55 0C 1 min Extension 72 0C 1 min.
Die DNA wurde einer Phenol/Chloroform- Extraktion nach Standardmethoden unterzogen und in Ethanol gefällt, bevor diese für 4 Stunden bei 370C in Anwesenheit von 20 mM Guanosin- 5'-monophosphothioat, T7- RNA- Polymerase transkribiert wurde. Die RNA wurde anschließend mittels Ethanol ausgefällt, in DEPC- Wasser gelöst und über eine G25- Säule (Amersham Biosciences) gereinigt.
10 μM RNA wurde mit Ix labelling- Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 5 mM EDTA), 2 M Urea und Wasser für 3 min auf 95 0C erhitzt, anschließend für 10 Minuten abkühlen gelassen. 2,5 mg aktiviertes 5-Iodoacetyl-Fluorescein wurden in 500 μM DMF gelöst, und zu den Ansätzen gegeben. Die Mischung wies eine Konzentration von 2 mM 5-Jodoacetyl- Fluorescein auf. Diese Mischung wurde 2 Stunden bei 37 0C unter leichtem Schütteln unter Alufolie inkubiert. Anschließend wurden 3 Volumen 100 % Ethanol zugefügt, 1/10
Volumen 3M NaOAc, pH 5,4 und 1 μl Glykogen zugegeben und für 20 Minuten bei -80 0C inkubiert, bevor für 20 Minuten bei 14000 rpm bei 40C zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde mit 100 μl 70 % Ethanol gewaschen und in 20 μl DEPC- Wasser gelöst.
Anschließend wurde die RNA in einem 8%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt, die RNA aus dem Gel in 500 μl 0,3M NaOAc-Lösung für 1,5 Stunden bei 65 0C eluiert, durch eine mit Glaswolle gefüllte Spritze filtriert, mit Ethanol gefällt und in DEPC- Wasser gelöst. Das Reaktionsvolumen der Fluoreszenzpolarisationsmessungen betrug 50 μl PBS, pH 7,4, 3 mM MgCt- Die Messungen wurden in 384- well- Platten (Greiner BioOne) in einem Polarimeter Typ Ultra, TECAN, bestimmt, Anregung: 485 nm, Emission: 535nm. Der z- Faktor betrug 0,81. Bestimmt wurde die Fluoreszenzpolarisation der Fluorescein- markierten RNA, die Fluoreszenzpolarisation nach Zugabe auf gereinigten sec7- Domäne von Cytohesin- 1, Cytohesin l-sec7, (vgl. Beispiel 1), und die Fluoreszenzpolarisation nach Zugabe der jeweiligen zu untersuchenden Verbindung.
Die Konzentrationen der einzelnen Messungen betrugen: M69 100 nM
Cytohesin l-sec7 1 μM Verbindung 100 μM.
Alle Messungen wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Beispiel 5
Bestimmung der Wirkung der Verbindung gemäß der Formel (9) auf Adhäsions- und
Migrationsfähigkeit humaner dendritischer Zellen in vitro
1. Generierung humaner dendritischer Zellen aus Monozyten
Dendritische Zellen wurden durch Differenzierungsfaktoren (IL-4 und GM-CSF) in vitro aus Blut-Monozyten hergestellt, die aus peripheren mononukleäre Zellen (PBMC) über Ficoll- Dichtegradientenzentrifugation aus humanem Blut anonymer Spender isoliert wurden.
Das Blut wurde im Verhältnis 1:1 mit PBS (KCl 0,2 g/l, KH2PO4 0,2 g/l, NaCl 8 g/l, Na2HPO4 1,15 g/l, PAA, Cölbe)/2 mM EDTA gemischt und auf das halbe Volumen Ficoll geschichtet. Zentrifugation erfolgte bei 300xg, 30 Minuten ohne Bremse. Nach der Zentrifugation erschien eine mittlere, weiße Bande, welche die PBMC enthielt. Diese wurde abgenommen mit PBS/2mM EDTA auf 50ml aufgefüllt und mehreren Waschschritten bei 640xg, 500xg, 400xg, 300xg und 200xg unterzogen. Anschließend wurden die Zellen in einem Titer von 5xlO6/ml in "VLE-RPMI +/+"- Medium (Biochrom, Berlin, enthaltend 10% fetales Kälberserum (FCS), und 1% Penicillin/Streptomycin) aufgenommen und 90 Minuten im Brutschrank bei 370C und 5% CO2 inkubiert. In dieser Zeit adhärieren die Monozyten am Boden des Kulturgefäßes. Periphere Blut-Lymphozyten bleiben in Suspension, und wurden abgenommen. Adhärente Monozyten wurden 3-4 mal mit PBS gewaschen und in "VLE- RPMI +/+"- Medium aufgenommen, welches je 20ng/ml der humanen rekombinanten Zytokine IL- 4 und GM-CSF (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor, R&D
Systems, Wiesbaden) enthielt. Diese Zytokine induzieren die Differenzierung der Monozyten zu unreifen dendritischen Zellen innerhalb von 5-7 Tagen. Die Zellen wurden 5-7 Tage kultiviert, wobei an jedem zweiten Tag die Hälfte des Mediums durch frisches Medium zuzüglich der Zyokine ersetzt wurde. Durch Zugabe von lμg/ml Lipopolysaccharid (LPS, Sigma, Taufkirchen) und 50ng/ml des Zytokins TNF-a (Strathmann, Hamburg) wurde an Tag 5-7 der Kultivierung eine Differenzierung der unreifen zu reifen dendritischen Zellen innerhalb von 2 Tagen induziert, wobei die Zellen am zweiten Tag nach der Zugabe für Experimente benutzt wurden.
2. Bestimmung der zellulären Chemotaxis (gerichtete Wanderung) in vitro
Die quantitative Analyse der Zellmigration wurde in modifizierten Boy den- Kammern bestehend aus einer 24-Loch Platte, in die Trans well®- Filter mit 5μm Porengröße eingesetzt wurden, durchgeführt. Die modifizierten Boy den- Kammern enthielten somit eine Kammer oberhalb des Filters und eine Kammer unterhalb des Filters. Die Filter wurden mit Überständen ICAM-I sezernierender Fibroblasten beschichtet. Reife dendritische Zellen wurden 96 Stunden mit lμM, 10 μM oder 15μM der Verbindung gemäß der Formel (9) in "VLE-RPMI +/+"- Medium inkubiert. Alle Ansätze enthielten 0,5 % DMSO. Kontrollen enthielten ausschließlich 0,5% DMSO ohne die Verbindung gemäß der Formel (9). Zur Durchführung des Zellmigrationsversuches wurden pro Ansatz 1,5 x 105 Zellen in 300 μl "Hungermedium" ("-/- VLE-RPMI", enthaltend 0,5% FCS) gelöst und in die obere Kammer einer modifizierten Boyden- Kammer gegeben. In die untere Kammer wurden 700 μl des "Hungermedium" gegeben. Die Zellen wurden 45 Minuten im Brutschrank bei 370C und 5% CO2 inkubiert. In dieser Zeit setzen sich die Zellen auf dem Filter ab. Anschließend wurde das Medium der unteren Kammer gegen Medium mit dem entsprechenden Chemokin CCL19/MIP-3B (Strathmann, Hamburg 100 ng/ml) oder CXCL12/SDF-1 (Strathmann, Hamburg, 200 ng/ml)) ausgetauscht. Für jeden Ansatz wurde eine Kontrolle durchgeführt, in der die untere Kammer "Hungermedium" ohne Chemokine enthielt. Die Zellen wurden 4 Stunden bei 370C und 5% CO2 im Brutschrank inkubiert und anschließend wurde die Zahl der Zellen bestimmt, welche in die untere Kammer in Richtung des Chemokins migriert sind. Es wurden jeweils Doppelansätze durchgeführt.
Unter entsprechenden Bedingen wurde die Adhäsion nach Stimulation mit Phorbolester (PMA, 50ng/ml , Sigma, Taufkirchen) bzw. anti-beta-2 Integrin Antikörper MEM-48 (5μg/ml, Vaclav Horeijsi, Czech Academy of Sciences Prag) bestimmt.
Als Kontrolle wurde jeweils die Migration von nicht mit der Verbindung gemäß der Formel (9) behandelten Zellen nach Stimulation mit den Chemokinen CCL19 oder CXCL12 bzw. die Adhäsion von nicht der Verbindung gemäß der Formel (9) behandelter Zellen nach
Stimulation mit Phorbolester PMA bzw. dem anti-beta-2 Integrin Antikörpers MEM-48, in 0,5 % DMSO, aufgetragen.
Wie aus den Figuren 4 und 5 zu entnehmen ist, inhibierte die Verbindung gemäß der Formel (9) konzentrationsabhängig Adhäsion und Migration dendritischer Zellen auf dem Substrat ICAM-I. Die Adhäsionsfähigkeit ist eine Grundvoraussetzung für die Wanderung der weißen Blutzellen. Es wird daher angenommen, dass die Wanderungsfähigkeit der dendritischen Zellen aufgrund der Inhibition von Cytohesin- 1 durch die Verbindung gemäß der Formel (9) gestört wurde.
Beispiel 6 Bestimmung der Toxizität der Verbindung gemäß der Formel (9)
Die Cytotoxizität der Verbindung gemäß der Formel (9) wurde mittels Propidiumiodid (PI) in der Durchflußzytometrie bestimmt. PI ist ein DNA- Farbstoff, der in lebende Zellen nicht eindringen kann. Die Versuche wurden im Brutschrank bei 370C und 5% CO2 durchgeführt.
Periphere Blut- Lymphozyten wurden mit Konzentrationen von 50 nM, 100 nM, 1 μM, 5 μM, 20 μM oder 50 μM der Verbindung gemäß der Formel (9) in „VLE-RPMI +/+" (Biochrom) inkubiert. Die DMS O- Konzentration pro Ansatz betrug 0,5 %. Ein Kontrollansatz enthielt 0,5 % DMSO. Nach 2 Stunden, 24 Stunden und 72 Stunden wurden Zellen entnommen und mit 2μg/ml PI für 5 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden bei 200xg, 8 Minuten zentrifugiert, mit PBS gewaschen, erneut zentrifugiert und im Durchflußzytometer (Beckmann Coulter, Krefeld) analysiert.
Es konnte festgestellt werden, dass der Prozentsatz PI-positiver, d.h. toter, Zellen weder konzentrations- noch zeitabhängig anstieg. Der prozentuale Anteil toter Zellen zeigte insbesondere nach 24 und 72 Stunden Inkubation lediglich geringe Abweichungen gegenüber den Kontrollen. Somit wird angenommen, dass die Verbindung gemäß der Formel (9) keine, zumindest jedoch keine deutlich erkennbare, Cytotoxizität aufweist.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Arzneimittel umfassend Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
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Figure imgf000043_0002
worin:
R ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl- ClO-Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin, Cl-ClO- Alkoxy und/oder ein Strukturelement (Al), (Bl), (Cl), (Dl), (El), (Fl), (Gl), (Hl), (II), (Jl) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000043_0003
SAM:AL - 2 -
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000044_0003
Figure imgf000044_0004
wonn: R4 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl- ClO-Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder Cl-ClO- Alkoxy.
2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen - 3 -
Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000045_0002
worin:
Ri ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement (A2), (B2), (C2), (D2) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000045_0003
(A2) (B2)
Figure imgf000045_0004
(C2) (D2) - A -
R2 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R3 und/oder ein Strukturelement (E2), (F2), (G2), (H2), (12), (J2), (K2) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
Figure imgf000046_0003
Figure imgf000046_0004
R3 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R2, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl-ClO- Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, Amin und/oder Cl-ClO- Alkoxy. - 5 -
3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3) und/oder (4) vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen der allgemeinen Formeln (5), (6), (7), (8) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000047_0002
worin:
R1 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R2, R3 und/oder ein Strukturelement
(A3), (B3), (C3), (D3) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000047_0003
Figure imgf000047_0004
(C3) ° *— * (D3) - 6 -
R2 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R3 und/oder ein Strukturelement (E3), (F3), (G3), (H3), (13), (J3), (K3) wie nachstehend angegeben:
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000048_0003
Figure imgf000048_0004
R3 ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend R1, R2, und/oder ausgewählt aus der Gruppe umfassend Wasserstoff, OH, COOH, COO(Cl-ClO- Alkyl), CONH2, CONH(Cl-ClO- Alkyl), CON(Cl-ClO- Alkyl)2, Halogen, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Cl, Br, F, und/oder Cl-C10-Alkoxy. - 7 -
4. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13), (14) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000049_0002
(10)
-8-
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000050_0002
(13) - 9 -
Figure imgf000051_0001
5. Arzneimittel umfassend Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Figure imgf000051_0002
(20)
- 10 -
Figure imgf000052_0001
6. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel Dimere, Trimere und/oder Oligomere aufweist, die wenigstens eines oder mehrere der Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) aufweisen.
7. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Monomere ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) zur Bildung von Dimeren, Trimeren und/oder Oligomeren über Ether-, Ester-, Alkin-, Amid-, Alkyl-, Alkenyl-, Cycloalkyl-, Alkoxy-, Alkylen-, Aryl-, Arylen- und/oder Ethylenglycol- Gruppen zumindest teilweise miteinander verbunden sind.
8. Arzneimittel nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Arzneimittel, bezogen auf eine Tagesdosis, 10 nM bis 100 μM, vorzugsweise 100 nM bis 10 μM, bevorzugt 1 μM bis 10 μM, besonders bevorzugt 1 μM bis 3 μM Verbindung(en) ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), - 11 -
(11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze umfasst.
9. Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze als Inhibitoren für wenigstens eine sec7-Domäne aufweisende Proteine.
10. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid- Austauschfaktoren, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Guaninnukleotid- Austauschfaktoren für humane ADP-Ribosylierungsfaktoren, wie Geal, Gea2, BlGl, B1G2 und/oder Cytohesine wie Cytohesin-1, Cytohesin-2, Cytohesin-3 und/oder Cytohesin-4.
11. Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (15), (16), (17), (18) wie nachstehend angegeben und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze:
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000053_0002
(18) - 12 -
zur Herstellung von Inhibitoren, die zur Blockierung von wenigstens eine sec 7- Domäne aufweisenden Proteinen geeignet sind.
12. Verbindungen, die an wenigstens eine sec 7- Domäne aufweisende Proteine binden, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12), (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze.
13. Verwendung von Verbindungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend die allgemeinen Formeln (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7) und/oder (8) vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe umfassend Verbindungen (9), (10), (11), (12) (13) und/oder (14), (20) und/oder (21) und/oder deren Enantiomere, Diastereomere sowie deren pharmazeutisch verträgliche Salze zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie
Rheumatoide Arthritiden, Multiple Sklerose, Diabetes mellitus (Typl), Diabetes mellitus (Typ2), Psoriasis, Morbus Crohn, Allergien, Tumorerkrankungen, wie Lungen- oder Bronchialkrebs, Dick- oder Mastdarmkrebs, Prostatakrebs, Lymph- oder Blutkrebs, Harnblasenkrebs, Brustkrebs und/oder Gebärmutterkrebs und/oder Immunsuppression, beispielsweise in der Organtransplantation.
14. Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die an vorzugsweise wenigstens eine sec 7- Domäne aufweisende Proteine binden, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die nachfolgenden Schritte umfasst: a) Herstellen einer vorzugsweise mit Fluorescin markierten RNA, umfassend die Schritte: aa) optional Amplifizieren einer DNA- Sequenz bb) optional Reinigung der amplifizierten DNA- Sequenz cc) optional Transkription der DNA- Sequenz in eine RNA- Sequenz - 13 -
dd) Markierung der RNA, vorzugsweise Markierung mit Fluorescin ee) Reinigung der markierten RNA b) Bestimmung der Polarisation der markierten RNA c) Zugabe eines vorzugsweise wenigstens eine sec 7- Domäne aufweisenden Proteins d) Bestimmung der Polarisation des Komplexes aus Protein und markierter RNA e) Zugabe der zu untersuchenden Verbindung f) Bestimmung der Polarisation nach Zugabe der zu untersuchenden Verbindung.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA- und/oder RNA- Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend M69-Aptamere, K61-Aptamere und/oder natürliche DNA und/oder RNA ist.
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