WO2006045598A1 - Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen - Google Patents

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propanol
dehydrogenase
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oxidoreductase
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Antje Gupta
Maria Bobkova
Anke Zimmer
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Iep Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a process for preparing enantiomerically pure alcohols of the general formula Ia or Ib
  • R 1, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 each represent hydrogen, halogen, a C 1 -C 6 -alkyl or C 1 -C 6 -alkoxy group, with the proviso that at least one of the radicals Ri , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is different from the other five, and the proviso that at least one of Ri, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is a halogen ,
  • the invention relates to a process for the preparation of enantiomerically pure alcohols of the general formula HIa or IHb
  • R 7 , R 8 and R 9 represent a Ci-C 6 alkyl group.
  • Enantiomerically pure alcohols of the general formulas Ia or Ib and IHa or IHb are valuable chiral building blocks for the synthesis of a variety of chiral compounds, which are of interest for the preparation of pharmaceutically active substances.
  • many of these enantiomerically pure alcohols are chemically not or only very expensive representable and are therefore not available in larger quantities.
  • the invention therefore has as its object to provide a process which enables the economical preparation of enantiomerically pure alcohols of general formula Ia or Ib and IHa or IHb in high yield and high enantiomeric purity.
  • This object is achieved in relation to the alcohols of the general formula Ia or Ib according to the invention characterized in that a ketone of the general formula II
  • Ri, R 2, R 3, R 4, R 5 and R 6 are each hydrogen, halogen, a Ci-C 6 alkyl or Ci-C 6 - represent alkoxy group, with the proviso that at least one of the radicals Ri, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are different from the other five, and with the proviso that at least one of Ri, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is a halogen, in the presence of an S- or R-specific dehydrogenase / oxidoreductase using NADH or NADPH as cofactor is enzymatically reduced.
  • R 9 wherein R 7 , R 8 and R 9 represent a Ci-C 6 alkyl group, is enzymatically reduced in the presence of an S- or R-specific dehydrogenase / oxidoreductase using NADH or NADPH as a cofactor.
  • NADH is understood to mean reduced jSficotinarmd-adenine dmucleotide and by the term “NAD” nicotinamide adenine dinucleotide.
  • NADPH reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and by the term “NADP” nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
  • ketones of the general formula II or IV which are used according to the invention as starting material are generally available in a simple and inexpensive manner.
  • the dehydrogenase used for the enzymatic reduction is obtained according to a preferred embodiment of microbial starting material. Which configuration of the products is formed predominantly or exclusively depends on the type of dehydrogenase / oxidoreductase as well as the type of cofactor.
  • a secondary alcohol dehydrogenase from Lactobacilli of the genus Lactobacilliales, in particular Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis or Lactobacillus minor, or from Pseudomonas used ,
  • Such R-specific secondary alcohol dehydrogenases are described, for example, in US Pat. No. 5,200,335, DE 196 10 984 A1, DE 101 19 274 or US Pat. No. 5,385,833.
  • S-specific dehydrogenase is preferably a secondary alcohol dehydrogenase from the genus Pichia or Candida, in particular Candida boidinii ADH, Candida parapsilosis or Pichia capsulata.
  • S-specific dehydrogenases are described, for example, in US Pat. No. 5,523,223 or DE 103 27 454.
  • the enzyme does not have to be used in pure form. Likewise, it is also possible to use enzyme-containing microorganisms or more or less purified lysates thereof. If the reaction is to be carried out continuously, immobilized enzymes can also be used.
  • the immobilization can be carried out, for example, by including the enzymes - in particular in polymeric networks or in semipermeable membranes - or by binding to a support, for example by absorption or by ionic or covalent bonds.
  • the dehydrogenases are used in free form.
  • the enzymatic reduction itself proceeds under mild conditions, so that the alcohols produced do not continue to react.
  • the inventive method have a long service life, an enantiomeric purity of more than 95% of the prepared chiral alcohols of formulas Ia and Ib and purple or Erb and a high yield based on the amount of keto compounds of formula II or IV.
  • the oxidoreductases can either be completely purified or partially purified in the inventive process, used in the form of cell lysates or in the form of whole cells.
  • the cells used may be native or permeabilized.
  • Cloned and overexpressed oxidoreductases are preferably used.
  • the volume activity of the oxidoreductase used is 10 U / ml to 5000 U / ml, preferably 100 U / ml to 1000 U / ml.
  • the enzyme unit 1 U corresponds to the amount of enzyme required to react 1 ⁇ mol of the keto compound of the formula II or IV per minute.
  • a preferred embodiment of the invention is further characterized in that the NAD or NADP formed during the reduction is continuously reduced with a cosubstrate to NADH or NADPH.
  • Preferred cosubstrates are primary and secondary alcohols, such as ethanol, 2-propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-octanol or cyclohexanol.
  • cosubstrates are converted by means of an oxidoreductase and NAD or NADP to the corresponding aldehydes or ketones and NADH or NADPH. This leads to the regeneration of NADH or NADPH.
  • the proportion of the cosubstrate for the regeneration is from 5 to 95% by volume, based on the total volume.
  • an alcohol dehydrogenase may additionally be added.
  • Suitable NADH-dependent alcohol hydro genases are obtainable, for example, from baker's yeast, from Candida boidinii, Candida parapsilosis or Pichia capsulata.
  • Suitable NADPH-dependent alcohol dehydrogenases are also found in Lactobacillus brevis (DE 196 10 984 A1), Lactobacillus minor (DE 101 19 274), Pseudomonas (US 5,385,833) or in Thermoanaerobium brockii.
  • Suitable cosubstrates for these alcohol dehydrogenases are the abovementioned secondary alcohols, such as ethanol, 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-octanol or cyclohexanol.
  • cofactor regeneration may also be performed, for example, with NAD- or NADP-dependent formate dehydrogenase (Tishkov et al., J. Biotechnol., Bioeng., 1999, 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formats dehydrogenase) are performed.
  • Suitable cosubstrates of formate dehydrogenase are, for example, salts of formic acid, such as ammonium formate, sodium formate or calcium formate.
  • the processes according to the invention are carried out without such an additional dehydrogenase, i. a substrate-coupled coenzyme regeneration takes place.
  • the aqueous portion of the reaction mixture in which the enzymatic reduction takes place preferably contains a buffer, for example potassium phosphate, tris / HCl or triethanolamine buffer, having a pH of from 5 to 10, preferably a pH of from 6 to 9.
  • the buffer may additionally contain ions for stabilizing or activating the enzymes, for example zinc ions or magnesium ions.
  • the temperature during the execution of the inventive method expediently from about 10 ° C to 7O 0 C, preferably from 20 ° C to 40 ° C.
  • the enzymatic reaction is carried out in the presence of an organic solvent which is immiscible or only slightly miscible with water.
  • This solvent is, for example, a symmetrical or unsymmetrical di (C 1 -C 6 ) alkyl ether, a straight-chain or branched alkane or cycloalkane or a water-insoluble secondary alcohol which simultaneously represents the cosubstrate.
  • the preferred organic solvents are, for example, diethyl ether, tert-butyl methyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, butyl acetate, heptane, hexane, 2-octanol, 2-heptanol, 4-methyl-2-pentanol or cyclohexane.
  • the reaction mixture consists of the use of water-insoluble solvents or cosubstrates of an aqueous and an organic phase.
  • the substrate is distributed according to its solubility between organic and aqueous phase.
  • the organic phase generally has a content of from 5 to 95%, preferably from 20 to 90%, based on the total reaction volume.
  • the two liquid phases are preferably mechanically mixed so that a large surface is created between them.
  • the NAD or NADP formed during the enzymatic reduction can be reduced again to NADH or NADPH with a cosubstrate as described.
  • the concentration of the cofactor NADH or NADPH in the aqueous phase is generally 0.001 mM to ImM, in particular 0.01 mM to 0.1 mM.
  • a stabilizer of the oxidoreductase / dehydrogenase is also possible.
  • Suitable stabilizers are, for example, glycerol, sorbitol, 1,4-DL-dithiothreitol (DTT) or dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • the process according to the invention is carried out, for example, in a closed reaction vessel made of glass or metal.
  • the components are transferred individually into the reaction vessel and stirred under an atmosphere of, for example, nitrogen or air.
  • the reaction time is from 1 hour to 48 hours, especially from 2
  • the reaction mixture is worked up.
  • the aqueous phase is separated, the organic phase is filtered. If appropriate, the aqueous phase can be extracted once more and, like the organic phase, worked up further. Thereafter, if necessary, the solvent is evaporated from the filtered organic phase.
  • POL-S2 measured at a layer thickness of 1 dm.

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Abstract

Bei einem Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen Alkohols der allgemeinen Formel (Ia) bzw. (Ib), wobei R1, R2, R.3, R4, R5 und R6 jeweils Wasserstoff, Halogen, eine C1-C6-Alkyl- oder C1-C6-Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R1, R2, R3, R4, R5 und R6 von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste R1, R2, R3, R4, R5 und R6 ein Halogen ist, wird ein Keton der allgemeinen Formel (II), wobei R1, R2, R3, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.

Description

Verfahren zur Herstellung von chiralen Alkoholen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner Alkohole der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib
Figure imgf000003_0001
wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 jeweils Wasserstoff, Halogen, eine C]-C6-Alkyl- oder Ci-C6- Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 ein Halogen ist.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung enantiomerenreiner Alkohole der allgemeinen Formel HIa bzw. IHb
Figure imgf000003_0002
wobei R7, R8 und R9 eine Ci-C6-Alkylgruppe repräsentieren.
Enantiomerenreine Alkohole der allgemeinen Formeln Ia bzw. Ib und IHa bzw. IHb stellen wertvolle chirale Bausteine für die Synthese einer Vielzahl von chiralen Verbindungen dar, welche für die Herstellung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen von Interesse sind. Viele dieser enantiomerenreinen Alkohole sind jedoch auf chemischem Weg nicht oder nur sehr aufwendig darstellbar und stehen daher auch nicht in größeren Mengen zur Verfügung.
Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren bereitzustellen, das die wirtschaftliche Herstellung enantiomerenreiner Alkohole der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib und IHa bzw. IHb in hoher Ausbeute und hoher Enantiomerenreinheit ermöglicht. Diese Aufgabe wird in bezug auf die Alkohole der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass ein Keton der allgemeinen Formel II
Figure imgf000004_0001
wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Ci-C6-Alkyl- oder Ci-C6- Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 ein Halogen ist, in Gegenwart einer S- bzw. R- spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2= Cl und R3=R4=R5=R6= H.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2=R4= Cl und R3= R5=R6= H.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass Ri= CH3, R2= Cl und R3=R4=R5=R6= H.
Noch eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass
Figure imgf000004_0002
Cl und R2=R3=R4=R5=R6= H.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe in bezug auf die Alkohole der allgemeinen Formel IHa bzw. HIb wird dadurch gelöst, dass ein Keton der allgemeinen Formel IV
O O (IV)
R9 wobei R7, R8 und R9 eine Ci-C6-Alkylgruppe repräsentieren, in Gegenwart einer S- bzw. R- spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
Unter dem Begriff „NADH" wird reduziertes jSficotinarmd-adenin-dmucleotid und unter dem Begriff „NAD" Nicotinamid-adenin-dinucleotid verstanden. Unter dem Begriff „NADPH" wird reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat und unter dem Begriff „NADP" Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat verstanden.
Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass R7=R8=R9= CH3.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist dadurch gekennzeichnet, dass R7= CH3 und R8=R9= C2H5.
Die erfindungsgemäß als Ausgangsmaterial dienenden Ketone der allgemeinen Formel II bzw. IV sind im Allgemeinen leicht und preiswert erhältlich.
Die für die enzymatische Reduktion eingesetzte Dehydrogenase wird nach einer bevorzugten Ausführungsform aus mikrobiellem Ausgangsmaterial gewonnen. Welche Konfiguration der Produkte überwiegend oder ausschließlich gebildet wird, hängt von der Art der Dehydrogenase/Oxidoreduktase wie auch von der Art des Cofaktors ab.
Vorzugsweise wird bei den Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen Alkoholen der allgemeinen Formeln Ia bzw. Ib und IHa bzw. HIb als R-spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus Lactobazillen der Gattung Lactobacilliales, insbesondere Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis oder Lactobacillus minor, oder aus Pseudomonas eingesetzt.
Unter R-spezifischen sekundären Alkoholdehydrogenasen werden dabei solche verstanden, die die Ketogruppe in einer Gruppierung H3C-C(C=O)-CH2-C zu dem entsprechenden (R)- konfigurierten Alkohol reduzieren. Derartige R-spezifische sekundäre Alkoholdehydrogenasen sind z.B. in der US 5,200,335, der DE 196 10 984 Al, der DE 101 19 274 oder der US 5,385,833 beschrieben.
Als S-spezifische Dehydrogenase wird bevorzugt eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus der Gattung Pichia oder Candida, insbesondere Candida boidinii ADH, Candida parapsilosis oder Pichia capsulata, eingesetzt. Derartige S-spezifische Dehydrogenasen sind z.B. in der US 5,523,223 oder der DE 103 27 454 beschrieben.
Das Enzym muss nicht in reiner Form eingesetzt werden. Ebenso gut können auch enzymhaltige Mikroorganismen oder mehr oder weniger gereinigte Lysate davon verwendet werden. Soll die Reaktion kontinuierlich durchgeführt werden, so können auch immobilisierte Enzyme verwendet werden. Die Immobilisierung kann beispielsweise durch Einschließen der Enzyme - insbesondere in polymere Netzwerke oder in semipermeable Membranen- oder durch Binden an einen Träger, beispielsweise durch Absorption oder durch ionische oder kovalente Bindungen, erfolgen. Bevorzugt werden die Dehydrogenasen aber in freier Form eingesetzt.
Die enzymatische Reduktion selbst läuft unter milden Bedingungen ab, so dass die erzeugten Alkohole nicht weiterreagieren. Die erfmdungsgemäßen Verfahren weisen eine hohe Standzeit, eine Enantiomerenreinheit von mehr als 95 % der hergestellten chiralen Alkohole der Formeln Ia bzw. Ib und lila bzw. Erb und eine hohe Ausbeute bezogen auf die eingesetzte Menge an Ketoverbindungen der Formel II bzw. IV auf.
Die Oxidoreduktasen können in den erfmdungsgemäßen Verfahren entweder vollständig gereinigt oder teilweise gereinigt, in Form von Zelllysaten oder in Form ganzer Zellen eingesetzt werden. Die eingesetzten Zellen können dabei nativ oder permeabilisiert vorliegen. Bevorzugt werden klonierte und überexprimierte Oxidoreduktasen (beispielsweise bekannt aus der US 5,523,223, der DE 103 27 454 oder der DE 101 19 274) eingesetzt.
Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Verfahren beträgt die Volumenaktivität der eingesetzten Oxidoreduktase 10 U/ml bis 5000 U/ml, vorzugsweise 100 U/ml bis 1000 U/ml.
Je kg zu reduzierendem Keton werden im Verfahren 5000 bis 10.000.000 U, vorzugsweise 10.000 bis 1.000.000 U, Oxidoreduktase eingesetzt. Der Enzymeinheit 1 U entspricht dabei der Enzymmenge, die benötigt wird um 1 μmol der Ketoverbindung der Formel II bzw. IV pro Minute umzusetzen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist weiters dadurch gekennzeichnet, dass das bei der Reduktion gebildete NAD oder NADP kontinuierlich mit einem Cosubstrat zu NADH bzw. NADPH reduziert wird. Als Cosubstrat werden dabei bevorzugt primäre und sekundäre Alkohole, wie Ethanol, 2- Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol, eingesetzt.
Diese Cosubstrate werden mit Hilfe einer Oxidoreduktase und NAD bzw. NADP zu den entsprechenden Aldehyden oder Ketonen und NADH bzw. NADPH umgesetzt. Dadurch kommt es zur Regenerierung des NADH bzw. NADPH. Der Anteil des Cosubstrates für die Regenerierung beträgt dabei von 5 bis 95 VoI %, bezogen auf das Gesamtvolumen.
Zur Regenerierung des Cofactors kann zusätzlich eine Alkoho Dehydrogenase zugesetzt werden. Geeignete NADH-abhängige Alkoholdehydro genasen sind beispielsweise erhältlich aus Bäckerhefe, aus Candida boidinii, Candida parapsilosis oder Pichia capsulata. Geeignete NADPH-abhängige Alkoho Dehydrogenasen kommen ferner vor in Lactobacillus brevis (DE 196 10 984 Al), Lactobacillus minor (DE 101 19 274), Pseudomonas (US 5,385,833) oder in Thermoanaerobium brockii. Geeignete Cosubstrate für diese Alkoholdehydrogenasen sind die bereits genannten sekundären Alkohole wie Ethanol, 2-Propanol (Isopropanol), 2- Butanol, 2-Pentanol , 4-Methyl-2-pentanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol.
Ferner kann die Cofactorregenerierung beispielsweise auch mit mittels NAD- oder NADP- abhängiger Formiat-Dehydrogenase (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187- 193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase) durchgeführt werden. Geeignete Cosubstrate der Formiat-Dehydrogenase sind beispielsweise Salze der Ameisensäure wie Ammoniumformiat, Natriumformiat oder Calciumformiat. Bevorzugt werden die erfindungs gemäßen Verfahren jedoch ohne eine solche zusätzliche Dehydrogenase durchgeführt, d.h. es findet eine substratgekoppelte Coenzymregenerierung statt.
Der wässrige Anteil des Reaktionsgemisches, in dem die enzymatische Reduktion abläuft enthält bevorzugt einen Puffer, beispielsweise Kaliumphosphat-, Tris/HCl- oder Triethanolamin-Puffer, mit einem pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise ein pH-Wert von 6 bis 9. Der Puffer kann zusätzlich noch Ionen zur Stabilisierung oder Aktivierung der Enzyme enthalten, beispielsweise Zinkionen oder Magnesiumionen.
Die Temperatur beträgt während der Durchführung der erfmdungsgemäßen Verfahren zweckmäßig von etwa 10°C bis 7O0C, bevorzugt von 20°C bis 40°C. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsforrn der erfindungsgemäßen Verfahren wird die enzymatische Umsetzung in Anwesenheit eines mit Wasser nicht oder nur beschränkt mischbaren organischen Lösungsmittels durchgeführt. Dieses Lösungsmittel ist beispielsweise ein symmetrischer oder unsymmetrischer Di(Ci -C6)alkylether, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkan oder Cycloalkan oder ein wasserunlöslicher sekundärer Alkohol, der zugleich das Cosubstrat darstellt. Die bevorzugten organischen Lösungsmittel sind beispielsweise Diethylether, tertiär-Butylmethylether, Diisopropylether, Dibutylether, Butylacetat, Heptan, Hexan, 2-Oktanol, 2-Heptanol, 4-Methyl-2-pentanol oder Cyclohexan.
Der Reaktionsansatz besteht beim Einsatz wasserunlöslicher Lösungsmittel bzw. Cosubstrate aus einer wässrigen und einer organischen Phase. Das Substrat verteilt sich entsprechend seiner Löslichkeit zwischen organischer und wässriger Phase. Die organische Phase hat allgemein einen Anteil von 5 bis 95 %, bevorzugt von 20 bis90 % bezogen auf das gesamte Reaktionsvolumen. Die zwei flüssigen Phasen werden bevorzugt mechanisch gemischt, so dass eine große Oberfläche zwischen ihnen erzeugt wird. Auch in dieser Ausfuhrungsform kann das bei der enzymatischen Reduktion gebildete NAD bzw. NADP mit einem Cosubstrat, wie beschrieben, wieder zu NADH bzw. NADPH reduziert werden.
Die Konzentration des Cofaktors NADH bzw. NADPH in der wässrigen Phase beträgt allgemein 0,001 mM bis ImM, insbesondere 0,01 mM bis 0,1 mM.
In den erfmdungsgemäßen Verfahren kann noch ein Stabilisator der Oxidoreduktase/Dehydrogenase eingesetzt werden. Geeignete Stabilisatoren sind beispielsweise Glycerin, Sorbitol, 1,4 -DL-Dithiothreit (DTT) oder Dimethylsulfoxid (DMSO).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird beispielsweise in einem geschlossen Reaktionsgefäß aus Glas oder Metall durchgeführt. Dazu werden die Komponenten einzeln in das Reaktionsgefäß überführt und unter einer Atmosphäre von beispielsweise Stickstoff oder Luft gerührt. Die Reaktionszeit beträgt von 1 Stunde bis 48 Stunden, insbesondere von 2
Stunden bis 24 Stunden.
Anschließend wird das Reaktionsgemisch aufgearbeitet. Dazu wird die wässrige Phase abgetrennt, die organische Phase wird filtriert. Die wässrige Phase kann gegebenenfalls noch einmal extrahiert werden und wie die organische Phase weiter aufgearbeitet werden. Danach wird gegebenenfalls das Lösungsmittel aus der filtrierten organischen Phase verdampft. Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen näher erläutert.
Beispiele:
Analytik:
a) Ami de:
Die Bestimmung des ee (enantiomeric excess) erfolgte mittels chiraler Gaschromatographie.
Dazu wurde ein Gaschromatograph GC-17 A von Shimadzu mit einer chiralen Trennsäule
CP-Chirasil-DEX CB (Varian Chrompack, Darmstadt, Deutschland), Flammen-Ionisations-
Detektor und Helium als Trägergas benutzt.
Die Trennung von N,N-Dimethyl-3-hydroxybutanamid erfolgte bei 0,86 bar und 10 min bei
120°C, 2°C/min-> 125°C.
Die Retentionszeiten waren: (3R) 10,42 min und (3S) 10,09 min.
Die Trennung von N,N-Diethyl-3-hydroxybutanamid erfolgte bei 0,75 bar und 10 min bei
130°C, 2°C/min-^ 135°C.
Die Retentionszeiten waren: (3R) 11,6 min und (3S) 11,3 min.
b) Chlor-Verbindungen:
Die Bestimmung des ee (enantiomeric excess) erfolgte mittels chiraler Gaschromatographie.
Dazu wurde ein Gaschromatograph GC-17 A von Shimadzu mit einer chiralen Trennsäule
FS-Hydrodex ß-6-TBDM (Machery-Nagel, Düren, Deutschland), Flammen-Ionisations-
Detektor und Helium als Trägergas benutzt.
Die Trennung von l-Chloropropan-2-ol erfolgte bei 0,94 bar und 15 min bei 400C, l°C/min→> 50°C.
Die Retentionszeiten waren: (2R) 20,3 min und (2S) 20,9 min.
Die Trennung von l,l-Dichloropropan-2-ol erfolgte bei 0,69 bar und 15 min bei 800C,
2°C/min-^ 95°C.
Die Retentionszeiten waren: (2R) 20,8 min und (2S) 21,4 min.
Die Trennung von l,l,3-Trichloropropan-2-ol erfolgte bei 0,69 bar und 30 min bei 1200C isotherm.
Die Retentionszeiten waren: (2R) 25,0 min und (2S) 24,5 min.
Die Trennung von 3-Chlorobutan-2-ol erfolgte bei 0,98 bar und 25 min bei 50°C isotherm.
Die Retentionszeiten waren:
(3R)-3-Chlorobutan-2-on: 6,0 min
(3S)-3-Chlorobutan-2-on: 6,2 min
(3R,2R)-3-Chlorobutan-2-ol: 17,5 min (3R,2S)-3-Chlorobutan-2-ol: 18,1 min (3S,2R)-3-Chlorobutan-2-ol: 20,7 min (3S,2S)-3-Chlorobutan-2-ol: 22,1 min
1. Synthese von (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid aus N,N- Diethylacetoacetamid
Zur Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 172 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 0,5 mM DTT, 20% Glycerin), 18 ml 2-Propanol (0,23 mol), 10 ml N,N-Diethylecetoacetamid (63 mmol), 200 mg NAD und 30000 Units rekombinante Alkoholdehydro genäse aus Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 97 % des eingesetzten N,N- Diethylacetoacetamid zu (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 2,5 g (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,9% gewonnen werden.
Analysenergebnisse :
Elementaranalyse % gef.(ber): C8Hi7NO2 C: 59,8 (60,4) H: 10,7 (10,8) N: 8,9 (8,8)
1H-NMR m CDCl3:
Figure imgf000010_0001
13C-NMR m CDCl3
Figure imgf000011_0001
Spezifische Drehwerte:
Der spezifische Drehwert [OC]D 20 der Enantiomere wurde mit einem Präzisionspolarimeter
POL-S2 bei einer Schichtdicke von 1 dm gemessen. Für die Untersuchung wurden 0,5 g
Probe in 25 ml EtOH gelöst.
(S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid (100%) [α]D 20 = +19,92 +1 ° x 1/g.dm
2. Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid aus N5N- Diethy laceto acetamid
Zur Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 290 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin), 100 ml 2-Propanol (1,3 mol), 10 ml N,N-Diethylecetoacetamid (63 mmol), 20 mg NADP und 60000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 60 % des eingesetzten N,N-Diethylacetoacetamid zu (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 2,5 g (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid mit einer Reinheit >9δ% und einem Enantiomerenüberschuss von >99% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse % gef.(ber): C8Hi7NO2 C: 59,8 (60,4) H: 10,7 (10,8) N: 8,9 (8,8)
1H-NMR in CDCl3: Ergebnisse analog zu Beispiel 1
13C-NMR in CDCl3: Ergebnisse analog zu Beispiel 1
Spezifische Drehwerte:
(R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid (100%) [α]D 20 = -19,7 ±1 ° x 1/g.dm
Mittels 1H- NMR, 13 C-NMR und Elementaranalyse konnte die Struktur der Alkohole (S)- und (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid bestätigt werden. Die genaue Bestimmung des Enantiomerenüberschusses erfolgte mittels chiraler GC und über Bestimmung des Drehwertes [αjα20'
3. Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid aus N,N-Dimethylaceto- acetamid
Zur Synthese von (R)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 525 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin), 90 ml 2-Propanol (1,18 mol), 15 ml N,N-Dimethylacetoacetamid (120 mmol), 30 mg NADP und 50000 Units rekombinante Alkoholdehydro genäse aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 95 % des eingesetzten N,N-Dimethylacetoacetamid zu (R)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanarnid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten o 2,3 g (R)-3-Hydroxy-N,N- dimethylbutanamid mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,0% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse % gef.(ber): C6Hi3NO2 C: 54,2 (54,9) H: 9,7 (10,0) N: 10,4 (10,7) 1H-NMR in CDCl3:
Figure imgf000013_0001
Spezifische Drehwerte:
(R)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid (100%) [α]D 20 = - 29,1 +1 ° x 1/g.dm
4. Synthese von (S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid aus N,N-Dimethylaceto- acetamid
Zur Synthese von (S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid wurde ein Gemisch aus 89 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM ZnCl2, 10% Glycerin), 9 ml 2-Propanol (0,12 mol), 2,5 ml N,N-Dimethylacetoacetamid (19 mmol), 10 mg NAD und 16000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 95 % des eingesetzten N5N- Dimethylacetoacetamid zu (S)-3-Hydroxy-N,N-diethylbutanamid reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten so (S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,0% gewonnen werden. Spezifische Drehwerte:
(S)-3-Hydroxy-N,N-dimethylbutanamid (100%) [α]D 20 = + 29,1 ±1 ° x 1/g.dm
5. Synthese von (S)-I, l-Dichlor-2-propanol aus 1,1 -Dichlor aceton
Zur Synthese von (S)-l,l-Dichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 640 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM ZnCl2, 20% Glycerin), 80 ml 2-Propanol (1,05 mol), 20 ml 1,1-Dichloraceton (0,2 mol), 40 mg NAD und 13000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100 % des eingesetzten 1,1-Dichloraceton zu (S)-l,l-Dichlor-2-propanol reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 6,5 g (S)-I, l-Dichlor-2-propanol mit einer Reinheit >99% und einem Enantiomerenüberschuss von >99,9% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse und Chlorbestimmung % gef.(ber): C3H6Cl2O C: 26,7 (27,9) H: 4,7 (4,7) O: 14,8 (12,4) Cl: 53,4 (55)
1H-NMR in CDCl
Figure imgf000014_0002
13 C-NMR in CDCl3
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
Spezifische Drehwerte:
(S)-I, l-Dichlor-2-propanol (100%) [α]D 20 = - 19,1 +1 ° x 1/g.dm
6. Synthese von (R)-I, l-Dichlor-2-propanol aus 1,1-Dichloraceton
Zur Synthese von (R)-I, l-Dichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 320 ml Puffer (100 inM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin), 60 ml 2-Proρanol (0,78 mol), 20 ml 1,1-Dichloraceton (0,2 mol) gelöst in 40 ml Ethylacetat, 40 mg NADP und 8000 Units rekombinante Alkoho Dehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100 % des eingesetzten 1,1-Dichloraceton zu (R)-I, l-Dichlor-2-propanol reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 4,8 g (R)-I, l-Dichlor-2-propanol mit einer Reinheit >98% und einem Enantiomerenüberschuss von >95% gewonnen werden.
Analysenergebnisse:
Elementaranalyse und Chlorbestimmung % gef.(ber): C3H6Cl2O C: 26,7 (27,9) H: 4,7 (4,7) O: 14,8 (12,4) Cl: 53,4 (55)
1H-NMR in CDCl3: analog Beispiel 5
13C-NMR in CDCl3: analog Beispiel 5
Spezifische Drehwerte:
(R)-I, l-Dichlor-2-propanol (100%) [α]D 20 = + 19,56 ±1 ° x 1/g.dm
7. Synthese von (R)-I, l,3-Trich!or-2-propanol aus 1,1,3-Tπchϊoraceton
Zur Synthese von (R)-I, l,3-Trichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 110 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH - 7, 1 mM MgCl2, 10% Glycerin), 40 ml 2-Propanol (0,52 mol), 10 ml 1,1,3-Trichloraceton (93 mmol) gelöst in 40 ml Ethylacetat, 20 mg NADP und 12000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100 % des eingesetzten 1,1,3-Trichloraceton zu (R)-I , l,3-Trichlor-2-propanol reduziert. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Ethylacetat extrahiert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Das so gewonnene Rohprodukt wurde mittels Vakuumdestillation aufgereinigt. Es konnten 8,9 g (R)-I, l,3-Trichlor-2-propanol mit einer Reinheit >99% und einem Enantiomerenüberschuss von >97% gewonnen werden.
Analysenergebnisse :
Elementaranalyse und Chlorbestimmung % gef.(ber): C3H5Cl3O C: 22,1 (22,1) H: 2,8 (3,1) O: 11,1 (9,8) Cl: 63,9 (65,1)
1H-NMR m CDCl3
Figure imgf000016_0001
Spezifische Drehwerte:
(R)-1 ,1 ,3-Trichlor-2-propanol (100%) [α]D 2° = + 10,1 ±1 ° x 1/g.dm
8. Synthese von (S)-l,l?3-TrichIor-2-propanol aus 1,1,3-Trichloraceton Zur Synthese von (S)- l,l,3-Trichlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 9 ml Puffer (100 raM Triethanolamin, pH = 7, 1 mM ZnCl2, 20% Glycerin), 0,8 ml 2-Propanol (10 mmol), 0,25 ml 1,1,3-Trichloraceton (0,2 mol), 10 mg NAD und 2000 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 97 % des eingesetzten 1,1,3-Trichloraceton zu (S)-l,l,3-Trichlor-2-propanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >60% reduziert.
Spezifische Drehwerte:
(S)-I, l,3-Trichlor-2-proρanol (100%) [α]D 20 = - 10,1 ±1 ° x 1/g.dm
9. Synthese von S-Chlor-2-propanol aus Chloraceton
Zur Synthese von S-Chlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 0,6 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 10% Glycerin, 1 mM ZnCl2), 400 μl 4-Methyl-2-propanol, 100 μl Chloraceton, lmg NAD und 60 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) bzw. Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100% des eingesetzten Chloraceton zu S-Chlor-2-propanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >97% reduziert.
10. Synthese von R-Chlor-2-propanol aus Chloraceton
Zur Synthese von R-Chlor-2-propanol wurde ein Gemisch aus 0,4 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 10% Glycerin), 300 μl 2-Propanol, 100 μl Chloraceton gelöst in 200 μl Ethylacetat, 1 mg NADP und 30 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100% des eingesetzten Chloraceton zu R-Chlor- 2-propanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >95% reduziert.
11. Synthese von (2S)-3-chlor-2-butanol aus 3-Chlor-2-butanon
Zur Synthese von (2S)-3-chlor-2-butanol wurde ein Gemisch aus 0,45 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 10% Glycerin, 1 mM ZnCl2), 450 μl 4-Methyl-2-propanol, 100 μl 3-Chlor-2-butanon (1 mmol), 0,1mg NAD (0,15 μmol) und 60 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Pichia capsulata (DE-A 103 27 454) bzw. Candida parapsilosis für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100% des eingesetzten 3-Chlor-2-butanon zu (2S)-3-chlor-2-butanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >98% reduziert.
12. Synthese von (2R)-3-chlor-2-butanol aus 3-Chlor-2-butanon
Zur Synthese von (2R)-3-chlor-2-butanol wurde ein Gemisch aus 0,45 ml Puffer (100 mM Triethanolamin, pH = 7, 10% Glycerin, 1 mM MgCl2), 450 μl 4-Methyl-2-propanol, 100 μl 3-Chlor-2-butanon (1 mmol), 0,1mg NADP (0,13 μmol) und 60 Units rekombinante Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus minor (DE-A 101 19 274) für 24 h bei Raumtemperatur unter ständiger Durchmischung inkubiert. Nach 24 h waren 100% des eingesetzten 3-Chlor-2-butanon zu (2R)-3-chlor-2-butanol mit einem Enantiomerenüberschuss von >98% reduziert.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen Alkohols der allgemeinen Formel Ia bzw. Ib
Figure imgf000019_0001
wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 jeweils Wasserstoff, Halogen, eine Ci-C6-Alkyl- oder Ci-C6- Alkoxygruppe repräsentieren, mit der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 von den übrigen fünf verschieden ist, sowie der Maßgabe, dass mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 ein Halogen ist, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton der allgemeinen Formel II
Figure imgf000019_0002
wobei Ri, R2, R3, R4, R5 und R6 die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass Ri=R2= Cl und R3=R4=R5=R6= H.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
Figure imgf000019_0003
Cl und R3= R5=R6= H.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri= CH3, R2= Cl und R3=R4=R5=R6= H.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri= Cl und R2=R3=R4=R5=R6= H.
6. Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen Alkohols der allgemeinen Formel IHa bzw. IHb
Figure imgf000020_0001
wobei R7, R8 und Rg eine Ci-C6-Alkylgruppe repräsentieren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Keton der allgemeinen Formel IV
Figure imgf000020_0002
wobei R7, R8 und R9 die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart einer S- bzw. R-spezifischen Dehydrogenase/Oxidoreduktase unter Verwendung von NADH oder NADPH als Cofaktor enzymatisch reduziert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R7=R8=R9= CH3.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass R7= CH3 und R8=R9= C2H5.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als R- spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus Lactobazillen der Gattung Lactobacilliales, insbesondere Lactobacillus kefir, Lactobacillus brevis oder Lactobacillus minor, oder aus Pseudomonas eingesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als S- spezifische Dehydrogenase eine sekundäre Alkoholdehydrogenase aus der Gattung Pichia oder Candida, insbesondere Candida boidinii ADH, Candida parapsilosis oder Pichia capsulata, eingesetzt wird.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Volumenaktivität der eingesetzten Oxidoreduktase 10 U/ml bis 5000 U/ml, vorzugsweise 100 U/ml bis 1000 U/ml, beträgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass je kg zu reduzierendem Keton 5000 bis 10.000.000 U, vorzugsweise 10.000 bis 1.000.000 U, Oxidoreduktase eingesetzt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das bei der Reduktion gebildete NAD oder NADP kontinuierlich mit einem Cosubstrat zu NADH bzw. NADPH reduziert wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass als Cosubstrat primäre und sekundäre Alkohole, wie Ethanol, 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 4-Methyl-2- pentanol, 2-Octanol oder Cyclohexanol, eingesetzt werden.
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