WO2006035673A1 - 虚血性心臓傷害の新保護法 - Google Patents

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cftr
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Yasunobu Okada
Hiromi Uramoto
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Japan Science And Technology Agency
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Definitions

  • the present invention relates to a method for protecting myocardial cell necrosis that occurs during ischemia or reperfusion after ischemia due to blood flow disorders, and a method for evaluating the necrosis in vitro and / or in vivo. It is about. Furthermore, the present invention provides a pharmaceutical composition for suppressing cell death of ventricular muscle, a pharmaceutical composition for protecting myocardium, and preventing diseases caused by necrosis It is related with the pharmaceutical composition for doing.
  • Cardiomyocyte death caused by ischemia or post-ischemic reperfusion is a mixture of necrosis and apoptosis. Necrosis results from 45 minutes or more of ischemia that remains irreversible. The longer the ischemic time, the wider the range of necrosis, and the worse the injury site. To prevent exacerbation of the injury associated with necrosis, reperfusion must be done as soon as possible. However, it is known that even when reperfusion is performed within 20 minutes after ischemia where recovery of myocardial function is possible, myocardial cells are rapidly swollen by reperfusion and cause myocardial injury. (For example, see Non-Patent Document 1).
  • ischemic injury eg, cell death, myocardial infarction, and decreased systolic force.
  • nel nel openers
  • Na + / H + exchangers Na / H exchanger: NHE blockers
  • K channel opener should be administered during ischemia or post-ischemic reperfusion
  • Na + ZH + exchanger is one of the factors involved in ischemic injury. Ischemic injury involving NHE is induced as a result of NH E being activated due to abnormalities in the intracellular ionic environment caused by ischemia. NHE blockers can achieve their effects by administration during and before reperfusion after ischemia. But NHE block Cariporide, a car, has no effect on injury caused by reperfusion after ischemia over a long period (45 minutes) (see, for example, Non-Patent Document 8).
  • milrinone, a phosphodiesterases III (PDE III) inhibitor, and its homologous amrinone are also administered before ischemia to produce ischemic myocardium (ie, myocardium that caused ischemia).
  • ischemic myocardium ie, myocardium that caused ischemia.
  • PDE III phosphodiesterases III
  • the present inventors have shown that the recovery of cells after reperfusion is improved by administering both protein kinase A (PKA) activator and PKC activator during ischemia.
  • PKA protein kinase A
  • PKC protein kinase A
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
  • Non-Patent Document 12 It was speculated that the effect of activation of A and PKC was due to activation of the CFTR channel (for example, see Non-Patent Document 12).
  • Non-Patent Document 8
  • ischemic preconditioning is an effective means for reducing ischemic injury.
  • ischemic preconditioning is not practical because it requires repeated brief ischemia and reperfusion after ischemia in advance for the myocardium.
  • Experimental drug preconditioning (nicorandil) is performed, but the effect is obtained by intraoperative administration following preoperative administration, but not by intraoperative and post-reperfusion administration.
  • the applied patients are often taken on a daily basis for prevention.
  • preconditioning is based on preoperative administration in principle, and is useful as a treatment for patients who have suffered ischemia. Therefore, it is highly desirable to identify factors that are effective in protecting against ischemic injury in patients who are unpredictable and suffer from ischemia.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and its object is to provide a method for protecting and / or relieving cell death of cardiomyocytes that occurs during ischemia or reperfusion after ischemia, In particular, it is to realize a method for improving myocardial protection against ischemic injury in current open-heart surgery and to develop an ischemic injury inhibitor.
  • the present invention relates to a method for protecting myocardial cell death due to ischemic injury by application after ischemia initiation (seizure) in angina pectoris, etc., and a therapeutic agent as a myocardial protective agent for treatment in the medical field
  • the purpose is to provide Another object of the present invention is to provide a method for protecting the myocardium against ischemia and post-ischemic reperfusion injury that are inevitably involved in cardiac surgery and transplantation.
  • a system for screening a CFTR activator according to the present invention in vivo is characterized by comprising a heat retaining device for maintaining body temperature, a ligation retainer, and a continuous drug infusion device.
  • the heat retaining device is a heat operating table using a thermostatic bath.
  • the ligation holder may be a mantle portion of the indwelling needle, and a portion contacting the ligation portion of the holder may be a material having an appropriate flexibility. It is preferable to fix with a small cloth of 0.5mm thickness between the part
  • the continuous drug injection device is preferably a transvenous injection device.
  • the system according to the present invention further includes a device for perfusing warmed physiological saline in the thoracic cavity for maintaining the external environment of the heart, maintaining the temperature, and preventing dryness. Good.
  • the screening method according to the present invention is a candidate factor as a CFTR activator at the start of reperfusion, immediately before or after the start of reperfusion, in order to screen a CFTR activator in vivo using the above system. (I.e., allowing the candidate factor concentration in the affected area to reach the effective concentration at the start of reperfusion); and measuring the infarct size generated in the subject. It is said.
  • the administration step is carried out transvenously.
  • the PKA activator and the PKC activator are administered simultaneously in place of the candidate factor, in contrast to the infarct size generated in the subject and the step of administering. It is preferable to include a step of comparing the resulting infarct size.
  • the PKA activator is preferably milrinone.
  • the screening method according to the present invention comprises a step of comparing the infarct size measured using a wild-type mouse as the subject and the infarct size measured using a CFTR knockout mouse as the subject. Is preferably included.
  • the system for screening the CFTR activator according to the present invention in vivo may be the above-described system for in vivo ischemia and post-ischemic reperfusion.
  • It has a means for administering a candidate factor as a TR activator to a subject at the start of reperfusion or immediately before or after the start of reperfusion.
  • the means is preferably a continuous drug infusion device.
  • the system for screening a CFTR activator according to the present invention in vivo preferably further comprises a means for measuring the size of an infarct produced in a subject.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes a CFTR channel activator in order to suppress cell death of ventricular muscle.
  • the cell death is preferably necrosis.
  • the cell death is preferably cell death caused by ischemia or reperfusion after ischemia.
  • the CFTR channel activator is preferably a mixture of a PKA activator and a PKC activator.
  • the PKA activator is preferably dibutyryl cyclic AMP.
  • the PKC activator is preferably phorbol 12-myristate 13 acetate.
  • the CFTR channel activator is preferably a mixture of a phosphoesterase III inhibitor and a PKC activator.
  • the phosphodiesterase III inhibitor is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • the cell death is preferably induced by an abnormality occurring during ischemia in a myocardial tissue.
  • the cell death is preferably accompanied by a decrease in mitochondrial dehydrogenase activity.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is preferably used for suppressing cell death of primary cultured cells of ventricular muscle.
  • the cell death is preferably necrosis.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention preferably reduces the ventricular myocardial infarction region.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is characterized by comprising a CFTR channel activator in order to protect the myocardium in cardiac surgery and cardiac transplantation.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is preferably used for cardiac surgery and transplantation that causes necrosis.
  • the CFTR channel activator is preferably a mixture of a PKA activator and a PKC activator.
  • the PKA activator is preferably dibutyryl cyclic AMP.
  • the PKC activator is preferably phorbol 12-myristate 13 acetate.
  • the CFTR channel activator is preferably a mixture of a phosphoesterase III inhibitor and a PKC activator.
  • the phosphodiesterase III inhibitor is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • the pharmaceutical composition according to the present invention provides C for preventing a disease caused by necrosis.
  • the CFTR channel activator is preferably a mixture of a PKA activator and a PKC activator.
  • the PKA activator power is preferably dibutyryl cytalic AMP.
  • the PKC activator is preferably phorbol 12-myristate 13 acetate.
  • the CFTR channel activator is preferably a mixture of a phosphoesterase III inhibitor and a PKC activator.
  • the phosphodiesterase III inhibitor is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • the method for inhibiting cell death of ventricular muscle according to the present invention includes the step of administering a CFTR channel activator.
  • the method for protecting the myocardium in cardiac surgery is characterized by including a step of administering a CFTR channel activator.
  • the method for preventing a disease caused by necrosis includes a step of administering a CFTR channel activator.
  • a system for in vivo ischemia and post-ischemic reperfusion according to the present invention is characterized by including a heat retaining device for maintaining body temperature.
  • the system for in vivo ischemia and post-ischemic reperfusion preferably further comprises a ligation holder and a continuous drug infusion device.
  • the heat-insulating device is a heat-insulated operating table using a thermostat.
  • the system for in vivo ischemia and post-ischemic reperfusion perfuses warmed saline in the thoracic cavity for maintaining the external environment of the heart, maintaining temperature, and preventing dryness. It is preferable to further comprise an instrument.
  • the ligation holder is preferably a mantle portion of an indwelling needle.
  • the method for evaluating cell death according to the present invention is for evaluating cell death caused by ischemia and post-ischemic reperfusion in an in vitro cultured cell system.
  • An ischemia treatment step in which the cells are cultured in an anaerobic condition in a medium not containing gnolecose
  • the cells to be evaluated are preferably cardiac muscle cells, brain neurons, or brain glial cells.
  • the step of evaluating cell death preferably uses morphological changes of the nucleus as an index.
  • the screening method according to the present invention is for screening in vitro for a factor that suppresses cell death caused by ischemia and reperfusion after ischemia.
  • the cells are preferably cardiomyocytes, brain neurons, or brain glial cells.
  • the step of measuring cell death includes the activity of mitochondrial dehydrogenase, fragmentation of nuclear DNA, caspase activity, cytochrome from mitochondria to cytoplasm. It is preferable to use c release or nuclear shape change as an index.
  • FIG. 1 shows rat cultured ventricular muscle when C1—Cyanenoreblocker 5—nitro—2-2— (3—phenylpropylamino) —benzoate (NPPB) is added to the medium during ischemia treatment. It is a graph which shows the survival rate of a cell.
  • (B) is a graph showing the survival rate of cultured rat ventricular myocytes when NPPB is added to the medium during ischemic treatment, 1 hour before ischemic treatment, and 18 hours after the start of reperfusion.
  • FIG.2 CFTR channel activator (N6,2'-0-dibutyriladenosine-3 ': 5'-cyclic monophosphate (dbcAMP) or PMA or both (DP)) and / or CFTR channel during ischemia treatment
  • dbcAMP 5'-cyclic monophosphate
  • DP both
  • FIG.3 When CFTR channel activation simultaneous lJ (milrinone, isoproterenol, combined with PMA (MIP)) and Z or CFTR channel blocker (NPPB, glibenclamide, gemfibrozil or 9AC) are added to the medium during ischemia treatment 3 is a graph showing the survival rate of cultured rat ventricular myocytes.
  • FIG. 4 is a photograph of rat cultured ventricular myocytes with CFTR channel blocker (NPPB) added to the medium during ischemia treatment stained with Hoechst 33342 and Z or Propidium Iodide (PI). .
  • (B) is a graph showing the PI staining rate in the cells of (A)
  • FIG. 5 shows ischemia in cultured rat ventricular myocytes with CFTR channel activator (dbcAMP and PMA combined) or CFTR channel blocker (NPPB) added to the medium during ischemia treatment. It is a graph which shows the nuclear DNA fragmentation rate immediately after completion
  • (A) is a photograph showing a complete view of the thermal insulation system for mice during surgery.
  • (B) is a photograph showing a state in which warmed physiological saline is supplied / aspirated into the thoracic cavity.
  • (A) is a photograph showing a mouse during surgery using the ligature holder to ligate the left anterior descending branch of the left coronary artery.
  • (B) is a photograph showing a heart image before ischemia due to ligation.
  • (C) is a photograph showing a heart image after ischemia due to ligation.
  • (A) is a photograph showing a state in which a microfil for continuous administration of a drug to a mouse is inserted into a right vein and fixed.
  • (B) is an enlarged photograph of the part (A).
  • FIG. 9 (A) is a schematic diagram showing the time when a CFTR channel activator (milrinone and / or PM A or both) is administered to C57BL / 6J mice.
  • FIG. 10 is a photograph showing a cell survival site (2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloreide (TTC) staining) in a mouse heart section.
  • FIG. 10 (A) Schematic diagram showing the timing of administration of CFTR channel activator (milrinone + PMA) to C57BL / 6J mice (A and B in the figure are continuous administration following the one-shot administration, C and D Is one shot).
  • (B) is a graph showing the ratio of the infarct area to the ischemic area.
  • One shot administration was performed at a dose of milrinone 50 xg / kg + PMA 4.8 x gZkg, and continuous administration was performed at a dose of milrinone 17 ⁇ g / kg / h + PMA 1.6 g / kgZh.
  • FIG. 11 (A) is a schematic diagram showing ischemia 'reperfusion time in an experiment using CFTR knockout mice (+ Z— or + / +). (B) is a graph showing the ratio of the infarct area to the ischemic area in an experiment using CFTR knockout mice (+/ ⁇ or + / +).
  • the present inventors have intensively studied to solve the above problems. Specifically, the present inventors obtained the results obtained so far in the primary culture system (in vitro experimental system) of ventricular myocytes of neonatal rats, that is, the PKA activator and the PKC activator were ischemic. In addition to the in vitro experimental system, an in vivo experimental system using C57BLZ6J mice was used.
  • CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance re gulator: cystic fibrosis (Membrane conductance regulator) is one of the C1 channels and is known as the causative gene of cystic fibrosis CFTR is an ABC transporter with two ATP binding sites (ATP _ binding cassette transporter (ATP binding cassette transport protein), which functions as a C1-channel that is controlled in a cAMP-dependent manner and also as a regulator that regulates multiple other channels.
  • ATP _ binding cassette transporter ATP binding cassette transport protein
  • CFTR is expressed in systemic exocrine glands such as the gastrointestinal tract, trachea, and sweat glands, and the abnormal function is detected as an increase in C1-concentration of sweat.
  • the CFTR gene has been found to be a hereditary causative factor such as chronic knee inflammation, chronic lower bronchitis, sinusitis, and congenital male infertility that can be achieved only with cystic fibrosis. Best Pract (Naruse,., Kitagawa, M., Ismguro, H., Fujiki, K. & Hayakawa, T .: Cystic fibrosis and related dis-eases of the pancreas. Res. Clin. Gastroen terol., 16: 511-526, 2002).
  • CFTR is also expressed in the myocardium outside the epithelium. Therefore, CFTR may be involved in the mechanism of cardiomyocyte death (particularly necrosis) caused by ischemia or reperfusion. However, the development of a method for the prevention of ischemic injury cardiomyocyte death targeting CFTR has not yet been developed.
  • PMA is known to exhibit a preconditioning-like effect by itself. Substances with a preconditioning effect can be used for a brief period of ischemia and The ability to confer ischemic tolerance to the myocardium by repeated reperfusion after blood When applied to the myocardium of a patient suffering from ischemia, it has no effect. There are several known substances that can impart ischemic tolerance to the myocardium due to the preconditioning effect, but substances that are effective after ischemia are still known.
  • CFTR channel activator When the present inventors apply a CFTR channel activator to ischemic cardiomyocytes in vitro and activate the CFTR channel, the ability of ischemic injury (eg, cell death) is suppressed. I found. This change in cell viability was consistent with the dead cell rate, but it was judged that necrosis was not involved in apoptosis. Furthermore, by applying it to an in vivo ischemia 'reperfusion experiment system, it was found that the infarct area markedly increased when administered continuously from before ischemia to the end of ischemia and when administered at the start of reperfusion. A decrease was seen. This is because CFTR channel activator is supplied to the affected area via the blood flow immediately after reperfusion by continuous administration from before ischemia to the end of ischemia, or administration at the start of reperfusion, It has been shown to suppress ischemic injury.
  • ischemic injury eg, cell death
  • the present inventors have developed a method for preventing ischemic necrosis of cardiomyocytes by administration of a CFTR channel activator, and have completed the present invention.
  • cardiomyocytes are cardiomyocytes in vivo, or commercially available cultured cells derived from the myocardium. It may be cultured cardiomyocytes.
  • ischemia / reperfusion experimental system is used to refer to an ischemic culture cell or mouse in an in vitro system using cultured cells or an in vivo system using mice.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting necrotic cell death. Since necrotic cell death occurs in various parts of the body and causes various diseases, if a means for suppressing such cell death can be developed, the species caused by the cell death can be developed. It is possible to obtain effective therapeutic or preventive drugs for various diseases, which is very useful.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention comprises a CFTR channel activator.
  • the CFTR channel activator is preferably a protein kinase A (PKA) activator and a Z or protein kinase C (PKC) activator PKA activator and PKC activator Is more preferable.
  • PKA activator is dbcAMP
  • PKC activator is PMA.
  • a phosphodiesterase III inhibitor may be used in place of the PKA activator.
  • a preferred phosphodiesterase III inhibitor includes milrinone.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be used to suppress ventricular muscle cell death caused by ischemia or post-ischemic reperfusion.
  • ventricular myocyte death caused by ischemia or post-ischemic reperfusion include myocardial cell death during cardiac transplantation and myocardial infarction due to myocardial infarction.
  • Cell death due to necrosis (necrosis) (As used herein, interchangeably used with “necrosis” or “necrotic cell death”) or cell death by apoptosis (as used herein, “apoptosis” or “ It is known to be used interchangeably with “apoptotic cell death”.
  • the pharmaceutical composition according to this embodiment is preferably used to suppress ventricular muscle necrosis caused by reperfusion after ischemia or ischemia. More preferably, the pharmaceutical composition according to this embodiment can be used to suppress necrosis induced by abnormalities occurring during ischemia in myocardial tissue. Abnormalities that occur during ischemia include, but are not limited to, cell swelling, tissue edema, and tissue destruction.
  • ischemia is intended for local anemia. When ischemia occurs, the surrounding tissues undergo various changes (eg, necrosis) depending on the duration of ischemia, the sensitivity of the tissue to ischemia, or the presence or absence of vascular anastomoses at the site. .
  • ischemic injury intends an injury induced by an abnormality that occurs in myocardial tissue due to ischemia. "Abnormalities that occur during ischemia” or " Examples of “various abnormalities in myocardial tissue due to ischemia” include cell swelling, tissue edema, and tissue destruction.
  • Ischemia usually causes various abnormalities in myocardial tissue, but ischemic injury includes myocardial cell death and diminished cardiac contractility. Damage caused by reperfusion after ischemia is also included in ischemic injury .
  • the therapeutic target (disorder) of the pharmaceutical composition according to the present invention may be one of the above ischemic disorders or a combination of a plurality of ischemic disorders, or a combination with another disease But it's okay.
  • the activity of mitochondrial dehydrogenase can be used as an index. Since it is known that the activity of mitochondrial dehydrogenase decreases when the cell to be evaluated is killed, it can be determined that the cell death rate is high if the enzyme activity decreases.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for protecting the myocardium in cardiac surgery.
  • the term “protecting the myocardium” or “protecting the myocardium” refers to myocardial protection in the area of cardiac surgery, that is, myocardial protection by myocardial protection fluid during open heart surgery or heart transplantation. Intended.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is preferably used in cardiac surgery and transplantation which may be accompanied by necrosis.
  • the present invention further provides a pharmaceutical composition for preventing a disease caused by necrosis.
  • Diseases caused by necrosis include, but are not limited to, myocardial infarction.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be applied to mammals (human, mouse, rat, usagi, inu, cat, ushi, horse, pig, monkey, etc.).
  • a CFTR channel activator (preferably, a combination of a PKA activator and a PKC activator) may be used as it is, but a pharmaceutically acceptable carrier. May be included.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be produced according to a known method as a method for producing a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be a pharmaceutical composition.
  • Doctor The pharmaceutically acceptable carrier used in the pharmaceutical composition can be selected according to the dosage form and dosage form of the pharmaceutical composition.
  • pharmacologically acceptable carriers include various organic or inorganic carrier substances that can be used as pharmaceutical materials, and can be used for shaping in solid preparations. It is formulated as an agent, lubricant, binder, or disintegrant, or a solvent, a solubilizing agent, a suspending agent, a tonicity agent, a buffering agent, or a soothing agent in a liquid preparation.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, xylitol, sorbitol, erythritol, starch, and crystalline cellulose.
  • lubricant examples include magnesium stearate, calcium stearate, talc, and the like. And colloidal silica.
  • binder examples include pregelatinized starch, methylcellulose, crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, trehalose, dextrin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, and the like.
  • disintegrant examples include starch, carboxymethylcellulose, low-substituted hydroxypropinoresenorelose, canoleboxymethinorescenellose canolecium, croscanolemellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and the like. It is done.
  • solvent examples include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil, tricaprylin and the like.
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, trehalose, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate. Etc.
  • Examples of the suspension include surfactants such as stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate, or Examples include hydrophilic polymers such as polybulol alcohol, polyvinyl pyrrolidone, canoleboxoxymethenoresenorelose sodium, methinoresenorelose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, hydroxypropinoresenorelose, etc. .
  • surfactants such as stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, and glyceryl monostearate
  • hydrophilic polymers such as polybulol alcohol, polyvinyl pyrrolidone, canolebox
  • Examples of the tonicity agent include sodium chloride salt, glycerin, D-mannitol and the like. It is done.
  • buffers such as phosphates, acetates, carbonates, citrates, and the like.
  • Examples of soothing agents include benzyl alcohol.
  • Examples of the preservative include para-benzoic acid esters, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid and the like.
  • antioxidants examples include sulfite and ascorbic acid.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment can be produced according to a method commonly used in the field of pharmaceutical technology.
  • the content of the CFTR channel activator in the pharmaceutical composition according to the present embodiment is determined in consideration of the administration form, administration method, etc., and the CFTR channel activator is administered within the dosage range described later using the pharmaceutical composition. There is no particular limitation as long as it can be used.
  • Examples of the dosage form of the pharmaceutical composition according to this embodiment include oral preparations such as tablets, capsules (including soft force capsules and microcapsules), chiral IJs, granules, and syrups. Include parenterals such as injections, suppositories, pellets, and drops. Some of the pharmaceutical compositions according to the present invention are toxic, and can be administered orally or parenterally if alternative drugs with low toxicity are developed.
  • parenteral refers to modes of administration including intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intrasternal, subcutaneous, and intraarticular injections and infusions.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to this embodiment varies depending on the administration subject, administration route, symptom, and the like, but those skilled in the art will determine the optimal dose depending on the administration subject, administration route, symptom, etc. Appropriate conditions can be set as appropriate.
  • the pharmaceutical composition according to this embodiment can be administered by an appropriate administration route depending on the preparation form.
  • the administration method is not particularly limited, and can be applied by internal use, external use or injection.
  • the injection can be administered, for example, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, or the like.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present embodiment is appropriately set according to the formulation, administration method, purpose of use, and age, weight, and symptoms of the patient to whom the pharmaceutical is administered. Not sure.
  • the dose of the active ingredient contained in the preparation is preferably 5 to 400 x gZkg per day for an adult.
  • an amount smaller than the above dose may be sufficient or may be necessary beyond the range.
  • Administration may be carried out within a desired dose range, in a single day or in several divided portions.
  • the pharmaceutical composition according to the present embodiment can be administered orally as it is, or can be added daily to any food or drink.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may contain at least a CFTR channel activator.
  • a CFTR channel activator a PKA activator or a phosphodiesterase III inhibitor
  • a PKC activator may be used in combination. That is, it should be noted that pharmaceutical compositions containing a plurality of PKA activators or phosphodiesterase III inhibitors) or PKC activators are also within the scope of the present invention.
  • the present invention relates to reperfusion after ischemia and post-ischemia in a cultured cell system in vitro. Methods are provided for assessing the resulting cell death.
  • the method for evaluating cell death in vitro comprises the steps of preparing cultured cells to be evaluated, and culturing the cells in a buffer solution (medium) not containing glucose under anoxic conditions.
  • An ischemic treatment step a reperfusion treatment step of culturing cells subjected to the ischemic treatment under aerobic conditions in a medium containing glucose, and a step of detecting cell death.
  • the method for evaluating cell death at the in vitro port according to the present invention the cell to be evaluated experiences reperfusion after ischemia. Therefore, if the in vitro cell death evaluation method according to the present invention is used, cell death such as cell viability is evaluated before and after ischemia treatment or before and after reperfusion treatment after ischemia. Comparing these By this, reperfusion cell death can be easily evaluated.
  • the cells to be evaluated are not particularly limited, and cardiomyocytes, cranial nerve cells, and brain glial cells can be suitably used.
  • cardiomyocytes cell death caused by reperfusion after ischemia or ischemia caused by myocardial infarction or the like can be evaluated.
  • cranial nerve cells or brain glial cells it can be said that cell death caused by ischemia or reperfusion after ischemia caused by cerebral infarction or the like can be evaluated.
  • commercially available cultured cells or primary cultured cells may be used as the above cells.
  • the buffer solution used in the above ischemia treatment step is not particularly limited as long as it is a glucose-free buffer solution.
  • a glucose-free buffer solution for example, 108 mM NaCl, 0.5 mM MgCl, 5.4 mM KC1, ImM CaCl, 5 mM HEPES was added with NaHCO.
  • ischemic treatment step cells are cultured under anoxic conditions.
  • anoxic conditions means that the atmosphere has an oxygen concentration of 1% or less. It is intended to be low and preferably contains little to no oxygen (0.01% or less). Accordingly, those skilled in the art will understand that the “anoxic conditions” described herein are cell cultures performed under carbon dioxide, nitrogen, or argon gas, for example, 95% argon gas + 5% carbon dioxide gas. It is easily understood that the above conditions are also anoxic conditions. It will be apparent to those skilled in the art that the equipment used for cell culture, the Z or the culture method may be appropriately selected from those known in the art.
  • the culture temperature in the above ischemic treatment step is preferably 28 to 40 ° C, most preferably 37 ° C if a temperature condition suitable for normal cell culture is employed.
  • the culture time (treatment time) in the above ischemia treatment step may be carried out until the cells are in an ischemic state. For example, 6 hours to 10 hours are preferred, and 8 hours is most preferred.
  • the medium (buffer) used in the reperfusion treatment step is not particularly limited as long as it contains gnolecose, and a medium known in the art may be appropriately selected.
  • preferable medium include M199 medium supplemented with 10% FBS, DMEM medium, RPMI medium, MEM medium, and EM medium.
  • the aerobic condition in the reperfusion treatment step refers to an atmosphere in which oxygen is 5% or more, preferably 10% or more, and more preferably 15% or more.
  • the aerobic condition in the reperfusion treatment step the conventional condition of 95% air (approximately 20% oxygen) + 5% carbon dioxide gas is most preferable.
  • the culture time in the reperfusion treatment step is 72 hours to 120 hours, preferably at least as long as the cells are cultured for at least the time necessary for the ischemic force to become perfused. 84 hours ⁇ 108 hours more preferred 96 hours most preferred.
  • the culture temperature in the reperfusion treatment step may be the same as that in the ischemia treatment step. A preferred culture temperature and culture time is 96 hours at 37 ° C.
  • the step of detecting cell death is not particularly limited.
  • the activity of mitochondrial dehydrogenase is used as an index.
  • Method MTS method or MTS method
  • DNA fragmentation as an index
  • DNA ladder test etc.
  • caspase method using the activity of intracellular proteolytic enzyme causing cell death as an index
  • examples thereof include a method using as an index the release of cytochrome c from the mitochondria to the cytoplasm, and a method using as an index the change in the morphology of the nucleus (eg, nuclear enrichment or fragmentation).
  • caspase is activated (the activity is increased) when cells are killed by apoptosis
  • the enzyme activity is increased using caspase activity as an index. If it rises, it can be judged that the apoptotic cell death rate is high.
  • cytochrome c when cells are killed by apoptosis due to mitochondrial stimulation, cytochrome c is released from mitochondria into the cytoplasm. Therefore, the amount of cytochrome c released is measured using the release of cytochrome c into the cytoplasm as an index. If it is measured, it can be easily determined whether or not it is apoptotic cell death.
  • nuclear morphological changes such as nuclear enrichment and fragmentation occur. Therefore, observe nuclear morphological changes with an electron microscope or the like using the nuclear morphological changes as an index. For example, it is possible to easily determine whether or not the cell death is apoptotic.
  • an agent for suppressing cell death caused by reperfusion after ischemia or ischemia particularly reperfusion after ischemia or ischemia. It is effective in screening for drugs to suppress necrosis caused by That is, the evaluation results of cell death when a test substance is added during the above treatment process (at the time of the ischemia treatment process or the reperfusion treatment process, or before and after these) and the above treatment process (at the ischemia process) Re-perfusion after ischemia or post-ischemia of the test object by adding the test object at the treatment step or reperfusion process step and comparing the results with the evaluation results of cell death As a result, a substance having an inhibitory effect on cell death caused by ischemia or reperfusion after ischemia can be obtained.
  • the present invention relates to ischemia and post-ischemic reperfusion in an in vivo animal system. Methods are provided for assessing the resulting cell death.
  • Ischemia using mice and post-ischemic reperfusion is performed by procedures routine in the art. Specifically, the mouse is anesthetized with ether and then fixed on the operating table and placed in the trachea. Anesthesia gas is inhaled by the ventilator to maintain respiratory management and anesthesia. The left anterior descending coronary artery of the left coronary artery is ligated with a suture, and the mouse is subjected to ischemia treatment. Mice that are closed after ischemia and reperfusion and awakened from intoxication are bred as usual.
  • mice When mice are subjected to ischemia and post-ischemic reperfusion according to these conventional procedures, the intrathoracic and rectal temperatures decrease, and body water evaporates during thoracotomy. Vivo experiments are often unsuccessful. Accordingly, the present inventors constructed a system for successfully performing ischemia of mice and reperfusion after ischemia.
  • a system for successfully performing ischemia of mice and post-ischemia reperfusion includes a heat retaining device for maintaining body temperature.
  • the system according to the present invention includes an operating table having a structure in which water heated to 40 ° C. is circulated by a thermostatic bath, and physiological saline heated by using a pump and a heater. It is equipped with a device for maintaining the temperature of the heart and preventing it from drying, characterized in that it is fed in and on the other hand aspirated and collected.
  • the system according to the present invention preferably includes a ligation holder for ligating the left anterior descending branch of the left coronary artery.
  • a ligation holder for ligating the left anterior descending branch of the left coronary artery.
  • the ligation holder it is preferable to use the mantle portion of the indwelling needle.
  • the portion of the ligation holder that comes into contact with the ligature is made of a material having an appropriate flexibility, and the tissue is crushed by fixing a small cloth with a thickness of 0.5 mm between the ligature. Therefore, reperfusion was performed more reliably.
  • the system according to the present invention preferably includes a transvenous drug infusion device.
  • a dollar of 70 mm in length, 0.164 mm in outer diameter and 0.1 mm in inner diameter is preferable.
  • the in vivo cell death evaluation method according to the present invention may use the above-described system for successful ischemia of mice and post-ischemic reperfusion.
  • a system for successfully performing ischemia and post-ischemic reperfusion in a mouse according to the present invention comprises a ligation holder and a ligature holder and a heat retention device for maintaining body temperature. It can be said that it is more preferable to further include a bivenous intravenous drug injection device.
  • sodium henoline 150 Unit Zkg body weight, 100 units Zkg (body weight) before starting reperfusion diluted to a dose volume of 100 ⁇ L
  • protamine sulfate 2 minutes after reperfusion starts
  • heparin 1000 units 10 mg is preferably used by diluting so that the dose volume is within 100 x L).
  • a CFTR activator can be screened in vivo. That is, the system according to the present invention can also be a system for screening a CFTR activator in vivo.
  • the system according to the present invention comprises a warming device for maintaining body temperature, a ligature holder and a continuous drug infusion device.
  • the heat retaining device is a heat retaining operating table using a thermostatic bath.
  • the ligation holder may be a mantle portion of the indwelling needle.
  • the continuous drug injection device is preferably a transjugular injection device.
  • the system according to an embodiment preferably further includes a device for perfusing warmed saline in the thoracic cavity in order to maintain the outside environment of the heart, maintain the temperature, and prevent drying.
  • the system according to the present invention administers a candidate factor as a CFTR activator to a subject at the start of reperfusion, or just before or after the start of reperfusion, in order to screen the CFTR activator in vivo.
  • the means is a continuous drug infusion device.
  • the system according to the present embodiment may further include a means for measuring the infarct size generated in the subject.
  • the present invention further provides a method for screening a CFTR activator in vivo performed using the system according to the present invention.
  • the screening method according to the present invention comprises a step of administering a candidate factor as a CFTR activator to a subject at the start of reperfusion or immediately before or after the start of reperfusion; and measuring the infarct size generated in the subject. Including a process.
  • the administration step is preferably performed transjugally.
  • the screening method according to the present invention includes an infarct size produced in the subject and an infarct produced by simultaneously administering a PKA activator and a PKC activator instead of the candidate factor in the administering step. It is preferable to include a step of comparing the size.
  • the PKA activator can be milrinone.
  • the “candidate factor” may also include a CFTR activator that can bring about the activation of CFTR alone.
  • the screening method according to the present invention comprises a step of comparing the infarct size measured using a wild-type mouse as the subject and the infarct size measured using a CFTR knockout mouse as the subject. May include
  • CFTR is expressed in rat ventricular myocytes, and that CFTR expression is transiently enhanced on the plasma membrane of the cells by inducing ischemia.
  • I H. Uramoto, N. Takahashi, AK Dutta, RZ babirov, Y. Ando-Akatsuka, S. Morishima & Y. Okada.Ischemia-induced enhancement of CFTR expression on the plasma membrane in neonatal rat ventricular myocytes. J Physiol 53, 357-365 2 003).
  • the CFTR channel is an ischemic injury of rat cardiomyocytes.
  • Ischemic treatment removal of glucose and anoxia
  • the medium was mixed with a solution containing no genolecose (108 mM NaCl, 0.5 mM MgCl, 5.4 mM KC1, ImM CaCl, 5 mM HEPE
  • Gon gas + 5% carbon dioxide gas was cultured at 37 ° C for 8 hours. After that, immediately replace with normal medium containing glucose (M199 solution + 10% FBS) and CO incubate containing oxygen (about 20%). Beta (95% air + 5/0 carbon dioxide, 37 ° C) and cultured 96 h in (reperfusion: Glucose readministration Z reoxygenation).
  • C1-channel blocker administered to rat primary cultured ventricular myocytes 1 hour before or after ischemia treatment, or after 8 hours from the start of reperfusion after ischemia The cells were administered for 18 hours and the cell viability was measured using the MTT method. To ascertain the number of surviving cells as accurately as possible, cell viability was measured using cells 96 hours after reperfusion after ischemia ( Figure 1).
  • Rat primary cultured ventricular myocytes were prepared and cultured as in Example 1. As in Example 1, ischemic treatment (removal of glucose and anoxia) and reperfusion after ischemia were performed on primary cultured rat cardiomyocytes.
  • CFTR channel activator PKA activator dbcAMP (ImM) or PKC activator PMA (lOOnM) or both (DP)
  • CFTR channel activator + CFTR channel blocker NPPB (50 ⁇ )
  • glibenclamide 500 ⁇
  • g emfibrozil 2 mM
  • 9AC 9AC
  • the survival rate was significantly increased by simultaneously administering the PKA activator dbcAMP and the PKC activator PMA. This effect was achieved by simultaneously administering the CFTR channel blocker. Was completely erased.
  • ischemia releases catecholamines into the cell gap, resulting in an endogenous increase in cAMP.
  • Phosphodiesterase III is an enzyme that inhibits cAMP degradation and is known to be distributed in the heart.
  • Milrinone is an inhibitor of this enzyme (RM Wallis, JD Corbin, SH Francis & P. Ellis.Tissue distribution of phosph odiesterase families and the effects of sildenafil on tissue cyclic nucleotides, platelet function, and the contractile responses of trabeculae carneae and aortic rings in vitro. Am J Cardiol 83, 3C-12C, 1999). Milrinone has also been shown to activate CFTR channels ( ⁇ ⁇ R. Cobb, L.
  • milrinone has a half-life of 2 hours, and approximately 70% of the blood circulates in association with proteins and is excreted in the urine without being metabolized (LA Lehtonen S. Antila & PJ Pentikainen. Pharmacokinetics and pharmacodynamics or intravenous inotropic agents. Lin Pharmacokinet 43, 187-203, 2004). It is used in the treatment of acute heart failure in clinical practice and is expected to have vasodilatory and cardiotonic effects (Y. Ohizumi. Novel types of cardiotonic drugs. Folia Pharmacol Japon 100, 259-269, 1992).
  • the present inventors investigated whether milrinone, a phosphodiesterase III inhibitor, exhibited an ischemic injury inhibitory effect as a CFTR channel activator, similar to dbcAMP, a PKA activator.
  • Example 1 As in Example 1, rat primary cultured ventricular myocytes were prepared and cultured. As in Example 1, ischemic treatment (removal of glucose and anoxia) and reperfusion after ischemia were performed on primary cultured rat cardiomyocytes.
  • CFTR channel activator mimilrinone (0.73 ⁇ g, lml), isoproterenol ( ⁇ ) and PMA (lOOnM) in combination (MIP)
  • CFTR channel activator + CFTR Channel blockers NPPB (50 ⁇ ), glibenclamide (500 ⁇ ), gemfibrozil (2 mM) or 9AC (2 mM)
  • NPPB 50 ⁇
  • glibenclamide 500 ⁇
  • gemfibrozil gemfibrozil
  • 9AC 9AC
  • Rat primary cultured ventricular myocytes were prepared and cultured as in Example 1.
  • ischemic treatment removal of glucose and anoxia was performed on primary cultured rat cardiomyocytes.
  • CFTR channel blocker (NPPB (50 ⁇ M) was added to the rat primary cultured ventricle during ischemic treatment in order to confirm that the cell death occurring at the ischemic site was due to ischemic injury. Ischemic for 8 hours after administration to myocytes, necrotic death by double staining of cells immediately after ischemia using Hoechst 33342 and propidium iodide (PI) according to methods known in the art. The cell rate was examined. Hoechst 33342 stains the nuclei of all cells, and propidium iodide (PI) stains only necrotic dead cells that have caused membrane damage.
  • NPPB 50 ⁇ M
  • Rat primary cultured ventricular myocytes were prepared and cultured in the same manner as in Example 1. As in Example 1, ischemic treatment (removal of glucose and anoxia) and reperfusion after ischemia were performed on primary cultured rat cardiomyocytes. [0163] CFTR channel activator (PKA activator dbcAMP (ImM) + PKC activator PMA (lOOnM)) or CFTR channel blocker (NPPB (50 ⁇ M)) After administration to rat primary cultured ventricular myocytes, ischemia was performed for 8 hours, and the nuclear DNA fragmentation rate in cells immediately after the end of ischemia or 96 hours after reperfusion after ischemia was examined (Fig. 5).
  • PKA activator dbcAMP ImM + PKC activator PMA (lOOnM)
  • NPPB CFTR channel blocker
  • DNA fragmentation detection method cell death detection ELISA kit PUJS , Roche Diagnostic
  • nuclear DNA fragmentation rate absorbance of sample (dead cells) / absorbance of control (untreated cells).
  • mice Nine-week-old male mice (C57BLZ6J, Claire) were used for in vivo experiments. Anesthesia was introduced using ether. After being fixed to the operating table and inserted into the trachea, the mouse was inhaled with a ventilator using a mixture of oxygen and nitrous oxide (oxygen 20%) and 1% sevofuran for respiratory management and anesthesia. Maintained. Mice were subjected to ischemia by ligating the left anterior descending coronary artery with a suture. 30 minutes after ischemia treatment, ligation was released and reperfusion was performed. The drug was administered transvenously. Suture used for ligation after ischemia and reperfusion The chest was closed with the mouse left in the thoracic cavity.
  • mice were awakened from anesthesia and then bred as usual. Two days after the start of breeding, the chest was opened under ether anesthesia, and then ligated again. After evans blue was injected into the left ventricle from the apex, the heart was immediately removed and sliced to a thickness of 1 mm. Cell survival sites in the sections were stained with triphenyl tetrazolium chloride (TTC) solution. The degree of ischemic myocardial injury was determined as the ratio of the infarcted area (TTC non-stained area) to the ischemic area.
  • TTC triphenyl tetrazolium chloride
  • Transvenous intravenous drug infusion system As shown in Fig. 8, use Microfil (MicroFil TM, World Precision Instruments, INC: Needle 70mm in length, 0.164mm in outer diameter, 0.1mm in inner diameter) This makes it possible to place the microfil in the vein and to safely inject the drug for a long time without damaging the vein with the micro-mouth fill in place.
  • Microfil MicroFil TM, World Precision Instruments, INC: Needle 70mm in length, 0.164mm in outer diameter, 0.1mm in inner diameter
  • dbcAMP dibutyryl cyclic AMP
  • isoproterenol and the like are used as an activator of PKA in in vitro experiments.
  • Milrinone is considered to be a suitable PKA activator for in vivo experiments because it activates the CFTR channel and is actually used in clinical practice.
  • In vivo experiments using mice were performed according to Example 6. As shown in Fig. 9A, C5 7BL / 6J mice were given a saline solution containing both milrinone and PMA at the concentration shown in Fig. 9B in one shot 10 minutes before the onset of ischemia, Three doses were administered continuously until the end of ischemia at the rate of administration in 1 hour.
  • the present invention relates to the activity of CFTR channels at the time of ischemia and at the start of reperfusion under ischemic conditions for a relatively short time before falling into irreversible injury or immediately before or after reperfusion. It is demonstrated for the first time that it is effective in protecting various ischemic cardiomyocyte injuries caused by cardiomyocyte necrosis.
  • ⁇ -Adrenergic stimulation of CFTR channels is reported to result in regulatory volume decrease (RVD) in osmotically expanded cardiomyocytes (Z. Wang, T. Mituiye, SA Rees & A. Noma. Regulatory volume de crease of cardiac myocytes induced by ⁇ -adrenrgic activation of the CI channel in guinea pig. J Gen Physiol 10, 73-82, 1997). Therefore, the necrosis prevention mechanism according to the present invention is based on the fact that CFTR functions in an inhibitory manner against the abnormal cell swelling that is the cause of necrosis caused by ischemic injury and restores the volume to the original level. it is conceivable that.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can suppress ventricular muscle cell death. Further, the pharmaceutical composition according to the present invention can protect the myocardium in cardiac surgery. Furthermore, the pharmaceutical composition according to the present invention can be used as a treatment for preventing a disease caused by necrosis.
  • the system for in vivo ischemia and post-ischemic reperfusion adopts the above-described configuration to control the intrathoracic temperature and rectal temperature of a mouse subjected to an experiment from 35.8 to While maintaining at 36.4 ° C, it prevents evaporation of body water during thoracotomy, so that the experiment can be carried out successfully.
  • the present invention is a novel protective measure against ischemic myocardial injury targeting CFTR, which has not been considered as a protective factor against ischemic injury.
  • extracardiac It can be improved by applying it to myocardial protection in surgical cases where ischemic injury is a problem in departmental surgery and heart transplantation.
  • the present invention since the present invention is effective even when administered at the time of reperfusion, it can also be applied to administration after an ischemic attack, that is, medical treatment.

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Abstract

　本発明は、血流障害に起因する虚血時または虚血後の再灌流時に生じる心筋細胞のネクローシスを防御する方法、ならびに当該ネクローシスをインビトロおよび／またはインビボで評価する方法に関するものである。さらに本発明は、心室筋の細胞死を抑制するための薬学的組成物、心臓の外科手術および移植手術において心筋を保護するための薬学的組成物およびネクローシスに起因する疾患を予防するための薬学的組成物に関するものである。                                                                             

Description

明 細 書
虚血性心臓傷害の新保護法
技術分野
[0001] 本発明は、血流障害に起因する虚血時または虚血後の再灌流時に生じる心筋細 胞のネクローシスを防御する方法、ならびに当該ネクローシスをインビトロおよび/ま たはインビボで評価する方法に関するものである。さらに本発明は、心室筋の細胞死 を抑制するための薬学的組成物、心臓の外科手術および移植手術にぉレ、て心筋を 保護するための薬学的組成物およびネクローシスに起因する疾患を予防するための 薬学的組成物に関するものである。
背景技術
[0002] 虚血または虚血後の再灌流によって惹起される心筋細胞死には、ネクローシスおよ びアポトーシスが混在する。ネクローシスは、不可逆的な傷害が残る 45分間以上の 虚血によって生じる。虚血状態の時間が長いほどネクローシスの範囲が広がり、その 結果、傷害部位が悪化する。ネクローシスを伴う傷害の悪化を防ぐためには、できる だけ早急に再灌流しなければならなレ、。しかし、心筋機能の回復が可能とされる虚血 後 20分間以内に再灌流した場合であつても、心筋細胞は再灌流によって急激に膨 潤して心筋傷害が引き起こされるということが知られている（例えば、非特許文献 1を 参照のこと）。
[0003] 虚血後の再灌流によって生じる上記傷害は、心筋細胞におけるイオン環境が虚血 によって異常をきたすことに起因すると考えられているが、その機序については十分 には理解されていなレ、。以下、虚血に起因して心筋組織において生じる異常 (例え ば、細胞腫脹、組織浮腫および組織破壊）によって誘発される傷害を「虚血傷害 (例 えば、細胞死、心筋梗塞および心収縮力低下）」と称する。
[0004] 虚血傷害を防ぐために、主に心臓外科の領域において心筋保護液の開発および 心筋保護法の工夫に関する研究が進んでいる。とりわけ、術中の心停止下または心 臓移植時における心筋保護の方法は、基本的には以下の 3つにより確立されている ： (1)急速心停止；（2)心筋表面および局所冷却；ならびに（3) St. Thomas液を代 表とする心筋保護液の利用（例えば、非特許文献 2を参照のこと)。
[0005] St. Thomasの No. 2液の心筋保護効果には、タンパク質キナーゼ C (PKC)およ びチロシンキナーゼ (TK)が関与すると考えられている。しかし、 TKが保護的に機能 するであろうという考えに反して、非特許文献 3において、 TK阻害剤である genistei nおよび PKC活性化斉 Ijphorbol 12 -myristate 13 _ acetate (PMA)の両方を St. Thomasの No. 2液に加えることによって、梗塞巣の大きさが著しく減少する結 果が示されたが、その理由については明らかにされていない。また、心筋保護液の効 果を改善して虚血傷害をより軽減するために、 ATP感受性 K+チャネル (K chan
ATP
nel)オープナー（例えば、非特許文献 4および 5を参照のこと）、または Na+/H+交換 体（Na/H exchanger : NHE)ブロッカー（例えば、非特許文献 6を参照のこと）な どが心筋保護液に付加されている。
[0006] さらに、 K channelオープナーおよび NHEブロッカーを組み合わせた虚血心
ATP
筋保護薬剤の開発もまた行われている。
[0007] 虚血プレコンディショニング（ischemic preconditioning)と呼ばれる処置によつ て、短時間の心筋の虚血および虚血後の再灌流を繰り返すことによって心筋が虚血 耐性を獲得することが知られている。 K channelオープナーは、虚血傷害に対し
ATP
て防御的に機能する因子の 1つであり、虚血プレコンディショニングに効果的である。 し力し、 K channelオープナーは、虚血時または虚血後の再灌流時に投与して
ATP
も効果がなぐすなわち、生じてしまった虚血部位に対する傷害防御効果を有さない 。近年、 K channelオープナーの代表的な薬剤である nicorandilについて、急
ATP
性心筋梗塞後の心機能の改善 (例えば、細胞死を生じていない部位またはその周囲 の部位の回復）を目的とした心筋保護剤として適用するための大規模な試験が行わ れつつある（例えば、非特許文献 7を参照のこと）。しかし、その作用部位および Zま たは作用機序は未だに不明である。
[0008] Na+ZH+交換体（NHE)は、虚血傷害に関与する因子の 1つである。 NHEが関与 する虚血傷害は、虚血によって細胞内イオン環境が異常をきたすことに起因して NH Eが作動し、その結果として誘発される。 NHEブロッカーは、虚血後の再灌流時およ び再灌流前に投与することによってその効果を得ることができる。しかし、 NHEブロッ カーである cariporideは、長時間（45分間）に及ぶ虚血の後の再灌流によって生じ る傷害には効果を示さない (例えば、非特許文献 8を参照のこと)。
[0009] また、ホスホジエステラーゼ III (phosphodiesterases III : PDE III)阻害剤であ る milrinoneおよびその同族体の amrinoneもまた、虚血前に投与することによって 虚血心筋 (すなわち、虚血を生じた心筋）の梗塞巣の大きさを低減させ、心筋保護効 果を有することが報告されている（例えば、非特許文献 9、 10および 11を参照のこと） 。しかし、これらの報告にはこの心筋保護効果の原因については全く言及されていな レ、。し力も、虚血心発作に対してこれらの物質を虚血後に投与しても何ら効果を奏す ることはなぐ発生を予測することができない虚血心発作に対して事前投与でしか効 果を得られないこれらの物質はその適用が大きく限定されるという問題点を有する。
[0010] このように虚血傷害を防御するための因子がいくつか知られているものの、虚血傷 害の根本的な機序は未だ不明であり、その結果、決定的な虚血傷害防御法を得るに は至っていない。
[0011] 本発明者らは、タンパク質キナーゼ A (PKA)の活性化剤および PKCの活性化剤 の両方を虚血中に投与していることにより再灌流後の細胞の回復が改善されることを インビト口にて示し、その一方で、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR) クロライドチャネルブロッカーの投与が細胞の回復を著しく悪化させることにより、 ρκ
Aと PKCの活性化による効果は CFTRチャネルの活性化によるものであると推測した (例えば、非特許文献 12を参照のこと)。
[0012] 〔非特許文献 1〕
J. L. Park & B. R. Lucchesi. Mechanisms of myocardial reperfusion injury. Ann i orac Surg 68， 1905—1912, 1999
〔非特許文献 2〕
H. Furukawa, . Hachida & K. Yasumoto. Myocardial preservation and reperfusio n injury: Current trends and future perspectives. Low Temp Med 26, 93-98， 2000 〔非特許文献 3〕
N. Hedayati, S. J. Schomisch, J. L. Carino, J. T. Sherwood, E. J. Lesnefsky & B. L . Cmolik. Cardioprotection by St. Thomas' solution is mediated by protein kinase C and tyrosine kinase. J Surg Bes 113， 121—127, 2003
〔非特許文献 4〕
T. Steensrud, D. Nordhaug,〇. P. Elvenes, C. Korvald & D. G. Sorlie. Superior m yocardial protection with nicorandil cardioplegia. Eur J Cardjothorac Surg 23， 670 - 6 77, 2003
〔非特許文献 5〕
. Steensrua, D. Nordhaug, K. V. Husnes, E. Aghajani & D. . Sorlie. Replacing p otassium with nicorandil in coid St. Thomas' Hospital cardioplegia improves preserva tion of energetics and function in pig hearts. Ann Thorac Surg, 1391-1397， 2004
〔非特許文献 6〕
W. J. Linz & A. E. Busch. NHE—l inhibition: from protection during acute ischaemi a/reperfusion to prevention/ reversal of myocardial remodelling. Naunyn Schmiedehe rgs Arch Pharmacol 368， 239-246， 2003
〔非特許文献 7〕
T. Minamino, Κ. Jiyoong, Μ. Asakura, Υ. Snintani, Η. Asanuma & M Kitakaze. Ra tionale and design of a large-scale trial using nicorandil as an adjunct to percutaneo us coronary intervention for ST-segment elevation acute myocardial infarction. Japa n— working groups of acute myocardial infarction for the reduction of acute myocardi al infarction for the reduction of necrotic damage by a K-ATP channel opener (J-WI ND-KATP) Circ J 68， 101—106 2004
〔非特許文献 8〕
N. N. Aye, S. Komori & K. Hashimoto. Effects and interaction, of cariporide and p reconditioning on cardiac arrhythmias and infarction in rat in vivo. Br J Phalmacol 1 27， 1048-1055, 1999
〔非特許文献 9〕
S. Sanada, . Kitakaze, P. J. Papst, H. Asanuma, K. Node, S. Takashima, M. Asa kura, H. Ogita, Y. Liao, Y. Sakata, A. Ogai, . ukushima, J. Yamada, Y. Shinozaki ， T. Kuzuya, H. Mori, N. Terada & M Hori. Cardioprotective effect afforded by tran sient exposure to phosphodiesterase III inhibitors. Circulation 104, 705—710 2001 〔非特許文献 10〕
. P. Rechtman, A. Van der Zypp & H. ajewski. Amrinone reduces ischaemia-re perfusion injury in rat heart. Eur J Pharmacol 402， 255-262, 2000
〔非特許文献 11〕
A. F. Rump, D. Acar, W. Klaus. A quantitative comparison of functional and anti-i schaemic effects of the phosphodiesterase-inhibitors, amrinone, milrinone and levosi mendan in rabbit isolated hearts. Br J Pharmacol 112， 757-762， 1994
〔非特許文献 12〕
H. Uramoto, S. Morishima, Y. Ando-Akatsuka, Y. Nagasaki, N. Hagiwara and Y. Okada. A role of CFTR CI channel in the protection from ischemic injury in neonat al rat ventricular myocytes. Jpn. J. Physiol. 52， S35, 2002。
[0013] 上述した虚血プレコンディショニングは、虚血傷害を低減させるために有効な手段 である。しかし、心筋に対して予め短時間の虚血および虚血後の再灌流を繰り返す 必要があるので、虚血プレコンディショニングは、現実的であるとはいえない。実験的 に薬物プレコンディショニング（ニコランジル）が行われてレ、るが、その効果は術前投 与に引き続く術中の投与によって得られ、術中以後および再灌流後での投与では得 られなレ、。しかも、適用患者は、予防のために日常的に内服している場合が多い。こ のように、プレコンディショニングは、術前投与を原則としており、虚血に陥ってしまつ た患者に対する処置法としては何ら役に立たなレ、。従って、予測することができずに 虚血に陥った患者に対する虚血傷害防御に有効な因子を同定することが非常に望 まれている。
[0014] 心疾患は日本国内の死因の上位に位置するので、心筋梗塞等を引き起こす虚血 または虚血後の再灌流による心筋細胞の細胞死の防御法および/または救済法を 開発することは、きわめて重要かつ緊急な課題である。また、臨床上の具体的な心筋 保護として、心臓外科領域における心筋保護、すなわち、開心術中の心筋保護液に よる心筋保護は重要である。心筋保護液の投与方法はいくつかあるが、特に「常温 血液併用心筋保護液を用いた心停止法」 (warm blood cardioplegia)は、低体 温法の欠点を防止し、心筋を生理的、機能的に早期に回復させることを可能にする 方法として注目されている。しかし、常温であるために心筋の灌流不均等により浮腫 が生じ心筋傷害が重大となる可能性があることから、この方法は短時間で終了できる 手術症例に限り適用されている。従って、この開心術における虚血中の傷害を防止 する方法の開発はこの心筋保護法に更なる進歩をもたらすものと考えられる。
[0015] 本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、虚血時または 虚血後の再灌流時に生じる心筋細胞の細胞死の防御法および/または救済法、特 に、現行の開心術における虚血傷害に対する心筋保護法を改善する方法、ならびに 虚血傷害抑制剤を開発することを実現することにある。本発明は、内科領域での治 療に対して、狭心症等における虚血開始 (発作)後の適用で虚血傷害による心筋細 胞死を防御する方法、および心筋保護剤としての治療薬剤を提供することを目的と する。また、本発明は、心臓の外科手術および移植手術において必然的に伴われる 虚血および虚血後の再灌流による傷害に対して心筋を保護する方法を提供すること を目的とする。
発明の開示
[0016] 本発明に係る CFTR活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムは、 体温維持のための保温器具、結紮保持具および持続的薬剤注入器具を備えてレ、る ことを特徴としている。
[0017] 本発明に係るシステムにおレ、て、上記保温器具は恒温槽を利用した保温手術台で あることが好ましい。
[0018] 本発明に係るシステムにおいて、上記結紮保持具は留置針の外套部分であっても よぐ当該保持具の結紮部分に接触する部分が適度な柔軟性を持つ素材であること 、ならびに結紮部分との間に 0. 5mm厚の小さな布を挟んで固定することが好ましい
[0019] 本発明に係るシステムにおいて、上記持続的薬剤注入器具は経類静脈的注入器 具であることが好ましい。
[0020] 本発明に係るシステムにおレ、て、心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止の ために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具がさらに備えられていることが好 ましい。
[0021] 本発明に係るスクリーニング方法は、上記システムを使用して CFTR活性化剤をィ ンビボでスクリーニングするために、再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直 後に CFTR活性化剤としての候補因子を被験体に投与する工程 (すなわち、再灌流 開始時での患部における候補因子濃度を効用濃度に到達させる工程）；ならびに、 被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する工程を包含することを特徴としている。
[0022] 本発明に係るスクリーニング方法は、上記投与する工程が経類静脈的に行われる ことが好ましい。
[0023] 本発明に係るスクリーニング方法は、上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投 与する工程にぉレ、て上記候補因子の代わりに PKA活性化剤および PKC活性化剤 を同時に投与して生じた梗塞巣サイズとを比較する工程を包含することが好ましい。
[0024] 本発明に係るスクリーニング方法は、上記 PKA活性化剤が milrinoneであることが 好ましい。
[0025] 本発明に係るスクリーニング方法は、上記被験体として野生型マウスを用いて測定 された梗塞巣サイズと、上記被験体として CFTRノックアウトマウスを用いて測定され た梗塞巣サイズとを比較する工程を包含することが好ましい。
[0026] 本発明に係る CFTR活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムは、 上述したインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムであってもよぐ CF
TR活性化剤としての候補因子を再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後 に被験体に投与する手段を有してレ、ることを特徴としてレ、る。
[0027] 本発明に係る CFTR活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムにお いて、上記手段は、持続的薬剤注入器具であることが好ましい。
[0028] 本発明に係る CFTR活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステムは、 被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する手段をさらに有していることが好ましい。
[0029] 本発明に係る薬学的組成物は、心室筋の細胞死を抑制するために、 CFTRチヤネ ル活性化剤を含むことを特徴としている。
[0030] 本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死がネクローシスであることが好ま しい。 [0031] 本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死が、虚血または虚血後の再灌 流によって生じる細胞死であることが好ましい。
[0032] 本発明に係る薬学的組成物にぉレ、て、上記 CFTRチャネル活性化剤が PKA活性 化剤と PKC活性化剤との混合物であることが好ましい。
[0033] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 PKA活性化剤が、ジブチリルサイタリ ック AMPであることが好ましレ、。
[0034] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 PKC活性化剤が、ホルボール 12—ミリ スチン酸エステル 13酢酸塩であることが好ましレ、。
[0035] 本発明に係る薬学的組成物にぉレ、て、上記 CFTRチャネル活性化剤がホスホジェ ステラーゼ IIIインヒビターと PKC活性化剤との混合物であることが好ましい。
[0036] 本発明に係る薬学的組成物において、上記ホスホジエステラーゼ IIIインヒビターが
、 1, り一 dinydxo— 2— metnyl— 6— oxo [3, 4 ― bipyridme]— 5— carbonitnle であることが好ましい。
[0037] 本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死が、心筋組織において虚血中 に生じる異常によって誘発されることが好ましレ、。
[0038] 本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の 活性低下を伴うことが好ましレ、。
[0039] 本発明に係る薬学的組成物は、心室筋初代培養細胞の細胞死を抑制するために 使用されることが好ましい。
[0040] 本発明に係る薬学的組成物において、上記細胞死がネクローシスであることが好ま しい。
[0041] 本発明に係る薬学的組成物は、心室筋梗塞域を低減することが好ましい。
[0042] 本発明に係る薬学的組成物は、心臓外科手術および心臓移植手術にぉレ、て心筋 を保護するために、 CFTRチャネル活性化剤を含むことを特徴としてレ、る。
[0043] 本発明に係る薬学的組成物は、ネクローシスを生じてレ、る心臓の外科手術および 移植手術にぉレ、て用いられることが好ましレ、。
[0044] 本発明に係る薬学的組成物にぉレ、て、上記 CFTRチャネル活性化剤が PKA活性 化剤と PKC活性化剤との混合物であることが好ましい。 [0045] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 PKA活性化剤が、ジブチリルサイタリ ック AMPであることが好ましレ、。
[0046] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 PKC活性化剤が、ホルボール 12—ミリ スチン酸エステル 13酢酸塩であることが好ましレ、。
[0047] 本発明に係る薬学的組成物にぉレ、て、上記 CFTRチャネル活性化剤がホスホジェ ステラーゼ IIIインヒビターと PKC活性化剤との混合物であることが好ましい。
[0048] 本発明に係る薬学的組成物において、上記ホスホジエステラーゼ IIIインヒビターが
、 1, り一 dinydxo— 2— metnyl— 6— oxo [3, 4 —bipyridine]— 5— carbonitrile であることが好ましい。
[0049] 本発明に係る薬学的組成物は、ネクローシスに起因する疾患を予防するために、 C
FTRチャネル活性化剤を含むことを特徴としている。
[0050] 本発明に係る薬学的組成物にぉレ、て、上記 CFTRチャネル活性化剤が PKA活性 化剤と PKC活性化剤との混合物であることが好ましい。
[0051] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 PKA活性化剤力 ジブチリルサイタリ ック AMPであることが好ましレ、。
[0052] 本発明に係る薬学的組成物において、上記 PKC活性化剤が、ホルボール 12—ミリ スチン酸エステル 13酢酸塩であることが好ましレ、。
[0053] 本発明に係る薬学的組成物にぉレ、て、上記 CFTRチャネル活性化剤がホスホジェ ステラーゼ IIIインヒビターと PKC活性化剤との混合物であることが好ましい。
[0054] 本発明に係る薬学的組成物において、上記ホスホジエステラーゼ IIIインヒビターが
、 1， 6― dinyd.ro— 2— metnyl— 6— oxo [ 3 , 4 ― bipyridine]— 5— carbonitrile であることが好ましい。
[0055] 本発明に係る心室筋の細胞死を抑制する方法は、 CFTRチャネル活性化剤を投 与する工程を包含することを特徴としてレヽる。
[0056] 本発明に係る心臓外科手術にぉレ、て心筋を保護する方法は、 CFTRチャネル活 性化剤を投与する工程を包含することを特徴としている。
[0057] 本発明に係るネクローシスに起因する疾患を予防する方法は、 CFTRチャネル活 性化剤を投与する工程を包含することを特徴としている。 [0058] 本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、体温維 持のための保温器具を備えることを特徴としている。
[0059] 本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、結紮保 持具および持続的薬剤注入器具をさらに備えることが好ましい。
[0060] 本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、上記保 温器具が恒温槽を利用した保温手術台であることが好ましい。
[0061] 本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、心臓の 外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流さ せる器具をさらに備えることが好ましい。
[0062] 本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、上記結 紮保持具が、留置針の外套部分であることが好ましレ、。
[0063] 本発明に係る細胞死を評価する方法は、虚血および虚血後の再灌流によって生じ る細胞死をインビトロでの培養細胞系において評価するために、
評価対象となる細胞を調製する工程、
グノレコースを含まない培地中にて当該細胞を無酸素条件下で培養する虚血処理 工程、
グノレコースを含む培地中にて有酸素条件下で当該虚血処理に供した細胞を培養 する再灌流処理工程、および、
細胞死を検出する工程
を包含することを特徴としてレ、る。
[0064] 本発明に係る細胞死を評価する方法にぉレ、て、上記評価の対象となる細胞は、心 筋細胞、脳神経細胞、または脳グリア細胞であることが好ましい。
[0065] 本発明に係る細胞死を評価する方法にぉレ、て、上記細胞死を評価する工程は、核 の形態変化を指標とすることが好ましレ、。
[0066] 本発明に係るスクリーニング方法は、虚血および虚血後の再灌流によって生じる細 胞死を抑制する因子をインビトロでスクリーニングするために、
細胞を調製する工程、
グノレコースを含まない培地中にて当該細胞を無酸素条件下で培養する虚血処理 工程、
グノレコースを含む培地中にて有酸素条件下で当該虚血処理に供した細胞を培養 する再灌流処理工程、および、
細胞死を検出して細胞死の評価結果を得る工程
を包含し、
当該虚血処理工程時もしくは当該再灌流処理工程時またはこれらの前後に候補 因子を培地中に添加することにより得られた細胞死の評価結果を、当該候補因子を 添加することなく得られた細胞死の評価結果と比較する工程
をさらに包含することを特徴としてレ、る。
[0067] 本発明に係るスクリーニング方法にぉレ、て、上記細胞は、心筋細胞、脳神経細胞、 または脳グリア細胞であることが好ましい。
[0068] 本発明に係るスクリーニング方法にぉレ、て、上記細胞死を測定する工程は、ミトコン ドリア脱水素酵素の活性、核内 DNAの断片化、カスパーゼ活性、ミトコンドリアから細 胞質へのチトクローム cの放出、または核の形態変化を指標とすることが好ましい。
[0069] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十 分わかるであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白にな るであろう。
図面の簡単な説明
[0070] [図 1] (A)は、 C1—チヤネノレブロッカー 5— nitro— 2— 2(3— phenylpropylamino)— benzoate ( NPPB)を虚血処理時に培地に添加した場合のラット培養心室筋細胞の生存率を示 すグラフである。 （B)は、 NPPBを虚血処理時、虚血処理前 1時間、再灌流開始後よ り 18時間にわたって培地に添加した場合のラット培養心室筋細胞の生存率を示すグ ラフである。
[図 2]虚血処理時に CFTRチャネル活性化剤（N6,2'-0-dibutyriladenosine-3':5'-cy clic monophosphate (dbcAMP)もしくは PMAまたはその両者（DP) )および/また は CFTRチヤネノレブロッカー（NPPB、 glibenclamide、 gemfibrozilまたは Anthrace ne-9-carboxylate (9AC) )を培地に添加した場合のラット培養心室筋細胞の生存率 を示すグラフである。 [図 3]虚血処理時に CFTRチャネル活性化斉 lJ (milrinone、 isoproterenol, PMAを 併用（MIP) )および Zまたは CFTRチャネルブロッカー（NPPB、 glibenclamide, g emfibrozilまたは 9AC)を培地に添カ卩した場合のラット培養心室筋細胞の生存率を 示すグラフである。
[図 4] (A)は、虚血処理時に CFTRチャネルブロッカー（NPPB)を培地に添加したラ ット培養心室筋細胞を Hoechst 33342および Zまたは Propidium Iodide (PI)によ つて染色した写真である。 （B)は、（A)の細胞における PI染色率を示すグラフである
[図 5] (A)は、虚血処理時に CFTRチャネル活性化剤（dbcAMPと PMAとを併用）ま たは CFTRチャネルブロッカー（NPPB)を培地に添加したラット培養心室筋細胞に おける、虚血終了直後の核 DNA断片化率を示すグラフである。 （B)は、虚血処理時 に CFTRチャネル活性化剤（dbcAMPと PMAとを併用）または CFTRチャネルブロ ッカー（NPPB)を培地に添加したラット培養心室筋細胞における、虚血後の再灌流 96時間後の核 DNA断片化率を示すグラフである。
園 6] (A)は、手術中のマウスに対する保温システムの全景を示す写真である。 (B) は、温めた生理的食塩水を胸腔内に供給/吸引している様子を示す写真である。 園 7] (A)は、手術中のマウスにおいて結紮保持具を使い左冠状動脈左前下行枝を 結紮している様子を示す写真である。 （B)は、結紮による虚血前の心臓像を示す写 真である。 （C)は、結紮による虚血後の心臓像を示す写真である。
園 8] (A)は、マウスに薬剤を持続投与するためのマイクロフィルが右類静脈に刺し込 まれて固定された状態を示す写真である。 （B)は、（A)の部分の拡大写真である。
[図 9] (A)は、 C57BL/6Jマウスに CFTRチャネル活性化剤（milrinoneもしくは PM Aまたはその両者）を投与する時期を示す模式図である。 （B)は、 CFTRチャネル活 性化剤を虚血処理開始 10分前に 1ショット投与（milrinone 50 x g/kg + PMA 4 . 8 x g/kg)した後、さらに虚血処理時から虚血終了時まで持続投与 (milrinone 17 M g/kg/h + PMA 1. 6 z g/kgZh)した場合の、虚血領域に対する梗塞巣 領域の割合を示すグラフである。 （C)は、マウス心臓切片における細胞生存部位（2， 3 , 5-triphenyltetrazoliumchloreide (TTC)染色）を示す写真である。 [図 10] (A)は、 C57BL/6Jマウスに CFTRチャネル活性化剤（milrinone + PMA) を投与する時期を示す模式図（図中 A、 Bは 1ショット投与に引き続く持続投与、 C， D は 1ショット投与）である。 (B)は、虚血領域に対する梗塞巣領域の割合を示すグラフ である。 1ショット投与は、 milrinone 50 x g/kg + PMA 4. 8 x gZkgの用量で 行レヽ、持続投与は、 milrinone 17 μ g/kg/h+PMA 1. 6 g/kgZhの用量 で行った。
[図 11] (A)は、 CFTRノックアウトマウス（ + Z—または + / + )を用レ、た実験におけ る虚血'再灌流時間を示す模式図である。 （B)は、 CFTRノックアウトマウス（+ /— または + / + )を用レ、た実験における虚血領域に対する梗塞巣領域の割合を示す グラフである。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行なった。具体的には、本発明 者らは、新生仔ラットの心室筋細胞の初代培養系（インビトロ実験系）でこれまでに得 ている結果、すなわち、 PKA活性化剤および PKC活性化剤を虚血中に投与してい ることによって再灌流後の細胞の回復が改善されることに基づき、同インビトロ実験系 に加え C57BLZ6Jマウスによるインビボ実験系を用いて、
(i)インビトロでの PKAおよび PKCの同時活性化により得られた心筋細胞の虚血傷 害に対する保護メカニズムが CFTRの機能によるものなのか；
(ii)心筋細胞の虚血傷害を防御するメカニズムにおける CFTRの機能はネクローシ スとアポトーシスのいずれの細胞死の防御に関与するの力
(iii)インビボで CFTRチャネル活性化剤をマウスに投与することによって、虚血また は再灌流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制する ことができるのカ
(iv)インビボで CFTRチャネル活性化剤を虚血開始後に投与しても虚血または再灌 流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制することがで きるの力 および
(V)インビボで CFTRの発現レベルが心筋の虚血傷害の程度に影響を与えるのか、 について検討を行なった。 [0072] 多くの上皮組織において、 C1—を含む液の分泌（汗腺の場合は再吸収）に関与する こと力 S夭口りれ " レヽる CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance re gulator :嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）は、 C1チャネルの 1つであり、嚢 胞性線維症（cystic fibrosis)の原因遺伝子として知られてレ、る。 CFTRは、 ATP 結合部位を 2箇所有する ABC輸送体（ATP _ binding cassette transporter： A TP結合カセット輸送タンパク質）の 1つであり、 cAMP依存的に制御される C1—チヤネ ルとして機能するとともに、他の複数のチャネルを調節するレギュレーターとしても機 能する。
[0073] CFTRは、消化管、気管、および汗腺など全身の外分泌腺に発現しており、その機 能異常は、汗の C1—濃度の上昇として検出される。最近、 CFTR遺伝子は嚢胞性線 維症だけでなぐ慢性膝炎、慢性下部気管支炎、副鼻腔炎、先天性男性不妊症など の遺伝性の原因因子であることがわかってきており、広範な疾患に関与していると考 えられ飞いる (Naruse, . , Kitagawa, M. , Ismguro, H.， Fujiki, K. & Hayakawa, T.： C ystic fibrosis and related dis-eases of the pancreas. Best Pract. Res. Clin. Gastroen terol. , 16： 511-526， 2002)。
[0074] CFTRはまた、上皮以外では心筋に発現している。従って、虚血または再灌流によ つて惹起される心筋細胞死（特に、ネクローシス）の発生機序には、 CFTRが関与し ている可能性がある。しかし、 CFTRを標的とした虚血傷害性の心筋細胞死の防御 法の開発は未だ行われてレ、なレ、。
[0075] 上述した検討の結果、本発明者らは、これまでにインビト口での虚血 '再灌流実験 系で得られている PKA活性化剤および PKC活性化剤の同時投与（ジブチリルサイ クリック AMP (dbcAMP)およびホルボール 12 _ミリスチン酸エステル 13酢酸塩（P MA)の併用）による細胞生存率の改善が CFTRチャネルの活性化によるものである ことを薬理学的検討力 見出し、この効果は虚血前あるいは虚血後だけの投与では 効果は得られず、インビトロ実験系では虚血中の CFTRチャネル活性化剤の投与が 重要であることを見出した。
[0076] PMAは、単独でプレコンディショニング様効果を示すことが知られている。プレコン ディショユング効果を有する物質は、虚血を生じる前に予め短時間の虚血および虚 血後の再灌流を繰り返しておくことによって虚血耐性を心筋に付与することができる 力 虚血に陥っている患者の心筋に適用しても何ら効果をもたらさない。プレコンディ ショユング効果によって心筋に虚血耐性を付与し得る物質はレ、くつか知られているが 、虚血後の投与が効果的である物質は未だ知られてレ、なレ、。
[0077] 本発明者らは、 CFTRチャネル活性化剤を虚血中の心筋細胞にインビトロで適用し 、 CFTRチャネルを活性化した場合に、虚血傷害（例えば、細胞死）力抑制されること を見出した。このような細胞生存率の変化は死細胞率と一致したが、アポトーシスの 関与はなぐネクローシスであると判断された。さらに、インビボでの虚血'再灌流実験 系に適用することによつても、虚血前から虚血終了時まで持続投与した場合、および 再灌流開始時に投与した場合において、梗塞巣領域の著しい減少が見られた。これ らのことは、虚血前から虚血終了時までの持続投与、または再灌流開始時の投与に よって、 CFTRチャネル活性化剤が再灌流直後の血流を介して患部に供給されて、 虚血傷害を抑制することを示してレ、る。
[0078] 以上の知見に基いて、本発明者らは、 CFTRチャネル活性化剤の投与による心筋 細胞の虚血性ネクローシスの防御法を開発し、本発明を完成するに至った。
[0079] 本明細書中で使用される場合、「じ 丁!」は「じ？丁1チャネル」または「じ？丁1^クロラ イドチャネル」と交換可能に使用される。
[0080] 本明細書中で使用される場合、「心筋細胞」は、生体内における心筋細胞であって も、心筋由来の市販の培養細胞であっても、生体力も取り出した心臓由来の初代培 養心筋細胞であってもよい。
[0081] 本明細書中で使用される場合、用語「虚血 ·再灌流実験系」は、培養細胞を用いる インビトロ系またはマウスを用いるインビボ系において、培養細胞またはマウスを虚血
(または酸素除去およびグルコース除去）処理した後に再灌流ほたは再酸素化およ びグルコース再投与）処理することを可能にした実験系が意図される。
[0082] (1)薬学的組成物
本発明は、ネクローシス性細胞死を抑制するための薬学的組成物を提供する。ネク ローシス性細胞死は生体内の各所で起こり、種々の疾患の原因となるため、このよう な細胞死を抑制する手段を開発することができれば、当該細胞死が原因で生じる種 々の疾患に対する有効な治療薬剤または予防薬剤を得ることができ、非常に有益で あるといえる。
[0083] 本発明に係る薬学的組成物は、 CFTRチャネル活性化剤を含むことを特徴とする。
一実施形態において、 CFTRチャネル活性化剤は、タンパク質キナーゼ A (PKA)の 活性化剤および Zまたはタンパク質キナーゼ C (PKC)の活性化剤が好まし PKA の活性化剤と PKCの活性化剤との併用がより好ましい。好ましい PKA活性化剤とし ては、 dbcAMPが挙げられ、好ましい PKC活性化剤としては、 PMAが挙げられる。 また、 PKA活性化剤の代わりに、ホスホジエスェテラーゼ IIIインヒビターを用いてもよ レ、。好ましいホスホジエスェテラーゼ IIIインヒビターとしては、 milrinoneが挙げられ る。
[0084] 好ましレ、実施形態にぉレ、て、本発明に係る薬学的組成物は、虚血または虚血後の 再灌流によって生じる心室筋の細胞死を抑制するために使用され得る。虚血または 虚血後の再灌流によって生じる心室筋の細胞死としては、心移植の際に起こる心筋 細胞死、心筋梗塞が原因で生じる心筋細胞死などが挙げられ、ネクローシス (壊死） による細胞死 (本明細書中で使用される場合、「ネクローシス」または「ネクローシス性 細胞死」と交換可能に使用される）またはアポトーシスによる細胞死 (本明細書中で 使用される場合、「アポトーシス」または「アポトーシス性細胞死」と交換可能に使用さ れる）であることが知られている。本実施形態に係る薬学的組成物は、虚血または虚 血後の再灌流によって生じる心室筋のネクローシスを抑制するために使用されること が好ましい。より好ましくは、本実施形態に係る薬学的組成物は、心筋組織において 虚血中に生じる異常によって誘発されるネクローシスを抑制するために使用され得る 。虚血中に生じる異常としては、細胞腫脹、組織浮腫および組織破壊が挙げられる 力 Sこれらに限定されない。
[0085] 本明細書中で使用される場合、用語「虚血」は、局所性の乏血が意図される。虚血 が生じると、その周辺組織は、虚血の持続時間、虚血に対する組織の感受性、また はその部位での血管吻合の有無に応じて、種々の変化（例えば、ネクローシス）を生 じる。本明細書中で使用される場合、用語「虚血傷害」は、虚血に起因して心筋組織 において生じる異常が誘発する傷害が意図される。 「虚血中に生じる異常」または「 虚血によって心筋組織では種々の異常」とは、例えば、細胞腫脹、組織浮腫および 組織破壊が意図される。通常、虚血によって心筋組織では種々の異常が生じるが、 虚血傷害としては、心筋細胞死および心収縮能減退が挙げられ、虚血後の再灌流 によって生じる傷害もまた虚血傷害に含まれる。本発明に係る薬学的組成物の処置 標的となる疾患（障害）は、上記虚血障害のうち 1種であっても、複数が併発したもの であつても、さらに別の疾患と合併したものであってもよレ、。
[0086] 細胞死を評価する場合、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標にすることができる 。評価細胞が死滅するとミトコンドリア脱水素酵素の活性が低下することが知られてい るので、当該酵素活性が低下すれば細胞の死滅率が高いと判断できる。
[0087] なお、本明細書を読んだ当業者は、 CFTRチャネル活性化剤力 虚血または虚血 後の再灌流によって生じる細胞死に対してのみ有効であるのではなぐ他の原因によ るネクローシス性の細胞死にも有効であることを、容易に理解する。
[0088] 本発明はまた、心臓外科手術において心筋を保護するための薬学的組成物を提 供する。本明細書中で使用される場合、用語「心筋を保護する」こと、または「心筋の 保護」は、心臓外科領域における心筋保護、すなわち、開心術中または心移植中の 心筋保護液による心筋保護が意図される。本発明に係る薬学的組成物は、ネクロー シスの発生が伴われる可能性のある心臓の外科手術および移植手術において用い ること力 S好ましレ、。
[0089] 本発明はさらに、ネクローシスに起因する疾患を予防するための薬学的組成物を 提供する。 「ネクローシスに起因する疾患」としては、心筋梗塞が挙げられるがこれら に限定されない。
[0090] 本発明に係る薬学的組成物は、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、ネコ、 ゥシ、ゥマ、ブタ、およびサルなど）に対して適用することができる。
[0091] 本発明に係る薬学的組成物は、 CFTRチャネル活性化剤（好ましくは、 PKA活性 化剤および PKC活性化剤との併用）をそのまま用いてもよいが、薬学的に受容可能 なキャリアを含んでもよい。本発明に係る薬学的組成物は、医薬組成物の製造法とし て公知の手段に従って製造することができる。
[0092] 一実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、医薬組成物であり得る。医 薬組成物中に使用される薬学的に受容可能なキャリアは、医薬組成物の投与形態 および剤型に応じて選択することができる。
[0093] 本明細書中で使用される場合、薬理学的に受容可能なキャリアとしては、製剤素材 として使用可能な各種有機または無機のキャリア物質が用レ、られ、固形製剤におけ る賦形剤、滑沢剤、結合剤、または崩壊剤、あるいは、液状製剤における溶剤、溶解 補助剤、懸濁剤、等張化剤、緩衝剤、または無痛化剤などとして配合される。
[0094] 賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、 D -マンニトール、キシリトール、ソルビトール 、エリスリトール、デンプン、結晶セルロースなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えば 、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙 げられる。
[0095] 結合剤としては、例えば、 α化デンプン、メチルセルロース、結晶セルロース、白糖 、 D-マンニトール、トレハロース、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキ シプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
[0096] 崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、低置換度ヒドロ キシプロピノレセノレロース、カノレボキシメチノレセノレロースカノレシゥム、クロスカノレメロース ナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウムなどが挙げられる。
[0097] 溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール 、ゴマ油、トウモロコシ油、トリカプリリンなどが挙げられる。
[0098] 溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、 D-マ ンニトール、トレハロース、安息香酸べンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレステ ロール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウムなどが挙げられる。
[0099] 懸濁剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラ ゥリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニゥム、塩化べンゼトニゥム、モ ノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤、あるいは、ポリビュルアルコール、ポリビ 二ノレピロリドン、カノレボキシメチノレセノレロースナトリウム、メチノレセノレロース、ヒドロキシ メチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロースなどの 親水性高分子が挙げられる。
[0100] 等張化剤としては、例えば、塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、 D-マンニトールなどが挙げ られる。
[0101] 緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの緩衝液など が挙げられる。
[0102] 無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。
[0103] 防腐剤としては、例えば、パラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベン ジルアルコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる
[0104] 抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、ァスコルビン酸などが挙げられる。
[0105] 本実施形態に係る医薬組成物は、製剤技術分野において慣用的な方法に従って 製造することができる。本実施形態に係る医薬組成物における CFTRチャネル活性 化剤の含有量は、投与形態、投与方法などを考慮し、当該医薬組成物を用いて後 述の投与量範囲で CFTRチャネル活性化剤を投与できるような量であれば特に限定 されない。
[0106] 本実施形態に係る医薬組成物の剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤（ソフト力 プセル、マイクロカプセルを含む）、散斉 IJ、顆粒剤、シロップ剤などの経口剤、あるい は、注射剤、坐剤、ペレット、点滴剤などの非経口剤が挙げられる。本発明に係る薬 学的組成物は、毒性を有するものもあるので、それらに対する毒性の低い代替薬剤 が開発されれば経口的または非経口的に投与することができる。用語「非経口」は、 本明細書中で使用される場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下、および関 節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
[0107] 本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、投与対象、投与経路、症状などによつ ても異なるが、当業者は、これら投与対象、投与経路、症状などに応じて、最適な条 件を適宜設定することができる。
[0108] 本実施形態に係る医薬組成物は、製剤形態に応じた適当な投与経路で投与でき る。投与方法も特に限定はなぐ内用、外用および注射によって適用することができ る。注射剤は、例えば静脈内、筋肉内、皮下、皮内等に投与することができる。
[0109] 本実施形態に係る医薬組成物の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的 および当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一 定ではない。一般には、製剤中に含有される有効成分の投与量で、好ましくは成人 1 日当り 5〜400 x gZkgである。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するの で、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場 合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、 1日内において単回で、または数 回に分けて行ってもよい。また、本実施形態に係る医薬組成物はそのまま経口投与 するほか、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。
[0110] このように、本発明に係る薬学的組成物は、少なくとも、 CFTRチャネル活性化剤を 含めばよいといえる。そして、 CFTRチャネル活性化剤は、 PKA活性化剤ほたはホ スホジエステラーゼ IIIインヒビター）と PKC活性化剤を併せて用いればよいとレ、える。 すなわち、複数の PKA活性化剤ほたはホスホジエステラーゼ IIIインヒビター）または PKC活性化剤を含有する薬学的組成物もまた、本発明の技術的範囲に含まれる点 に留意すべきである。
[0111] 本発明に係る薬学的組成物を投与することによって、心室筋の細胞死を抑制する こと力 Sできる。また、本発明に係る薬学的組成物を投与することによって、心臓外科 手術および心臓移植手術において心筋を保護することができる。さらに、本発明に係 る薬学的組成物を投与することによって、ネクローシスに起因する疾患を処置するこ とがでさる。
[0112] (2)虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死の評価方法 (インビトロ系） 本発明は、インビトロでの培養細胞系において虚血および虚血後の再灌流によつ て生じる細胞死を評価するための方法を提供する。
[0113] 本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法は、評価対象となる培養細胞を調 製する工程、グルコースを含まない緩衝液 (培地）中にて当該細胞を無酸素条件下 で培養する虚血処理工程、グルコースを含む培地中にて有酸素条件下で当該虚血 処理に供した細胞を培養する再灌流処理工程、および、細胞死を検出する工程を包 含する。本発明に係るインビト口での細胞死の評価方法を用いることによって、評価 対象となる細胞は虚血後の再灌流を経験する。従って、本発明に係るインビトロでの 細胞死の評価方法を用いれば、虚血処理前後、または虚血後に再灌流処理を行な う前後において、細胞の生存率などの細胞死の評価を行ない、これらを比較すること によって、再灌流性細胞死の評価を簡便に行なうことができる。
[0114] 本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法において、評価の対象となる細胞と しては、特に限定されず、心筋細胞、脳神経細胞、脳グリア細胞を好適に用いること 力 Sできる。心筋細胞を用いることによって、心筋梗塞などが原因となる虚血または虚 血後の再灌流によって生じる細胞死を評価することができる。脳神経細胞または脳グ リア細胞を用いることによって、脳梗塞などに原因となる虚血または虚血後の再灌流 によって生じる細胞死を評価することができるものといえる。また、上記の細胞は、巿 販の培養細胞が用いられても、初代培養細胞が用いられてもよい。
[0115] 上記の虚血処理工程にぉレ、て使用する緩衝液は、グルコースを含まなレ、緩衝液で あれば特に限定されない。上記緩衝液の組成としては、例えば、 108mM NaCl、 0 . 5mM MgCl、 5. 4mM KC1、 ImM CaCl 、 5mM HEPESに NaHCOを加
2 2 3 えて pH7. 4に調整したものが好適である。
[0116] また、上記虚血処理工程において細胞を無酸素条件下で培養を行なうが、本明細 書中で使用される場合、用語「無酸素条件下」は、酸素濃度が 1 %以下の雰囲気下 であることが意図され、酸素がほとんど〜全く含まれていないこと（0.01 %以下）が好 ましい。従って、当業者は、本明細書中に記載される「無酸素条件下」が、炭酸ガス、 窒素ガス、アルゴンガス下にて行なう細胞培養であり、例えば、 95%アルゴンガス + 5%炭酸ガスの条件下もまた無酸素条件下であることを容易に理解する。なお、細胞 培養に用レ、る器具および Zまたは培養方法は、当該分野において公知のものを適 宜選択すればよいことも、当業者には明白である。
[0117] 上記虚血処理工程における培養温度については、通常の細胞培養に好適な温度 条件を採用すればよ 28〜40°Cが好まし 37°Cが最も好ましい。
[0118] 上記虚血処理工程における培養時間（処理時間）については、細胞が虚血状態に なるまで行なえばよ 例えば、 6時間〜 10時間が好まし 8時間が最も好ましい。
[0119] 再灌流処理工程において使用される培地 (緩衝液）は、グノレコースを含むものであ れば特に限定されるものではなぐ当該分野において公知の培地を適宜選択すれば よレ、。好ましい培地としては、例えば、 10% FBSを添加した M199培地、 DMEM 培地、 RPMI培地、 MEM培地、 EM培地などが挙げられる。 [0120] 再灌流処理工程における上記有酸素条件とは、酸素が 5%以上の雰囲気下をいい 、 10%以上がより好ましぐ 15%以上がさらに好ましい。再灌流処理工程における上 記有酸素条件としては、 95%空気（酸素約 20%) + 5%炭酸ガスという慣用的な条 件が最も好ましい。
[0121] また、上記再灌流処理工程における培養時間については、少なくとも細胞が虚血 状態力も灌流状態になるために必要な時間以上培養すればよぐ 72時間〜 120時 間が好ましぐ 84時間〜 108時間がさらに好ましぐ 96時間が最も好ましい。なお、 再灌流処理工程における培養温度は、上記虚血処理工程と同様でよい。好ましい培 養温度および培養時間は、 37°Cでの 96時間培養である。
[0122] 本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法にぉレ、て、細胞死を検出する工程と しては、特に限定されないが、例えば、ミトコンドリア脱水素酵素の活性を指標に行な う方法 (MTT法または MTS法）、核内 DNAの断片化を指標に行なう方法 (DNAラ ダー試験など）、細胞死を引き起こす細胞内タンパク質分解酵素 (カスパーゼ）の活 性を指標とする方法、ミトコンドリアから細胞質へのシトクローム cの放出を指標とする 方法、および核の形態変化 (例えば、核の濃縮または細片化）を指標とする方法など が挙げられる。
[0123] 細胞が死滅するとミトコンドリア脱水素酵素の活性が低下するので、ミトコンドリア脱 水素酵素の活性を指標にして当該酵素活性が低下すれば細胞の死滅率が高いと判 断すること力 Sできる。
[0124] ネクローシスによって細胞が死滅する際には、当該細胞は膜傷害を生じるので、 pr opidium iodide (PI)によって染色される。この際、 Hoechst 33342を用レ、て全て の細胞の核を染色すれば、ネクローシス性の細胞死を生じた細胞の割合を算出する こと力 Sできる。
[0125] また、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、核内 DNAが断片化するので、 電気泳動などでラダー上の核内 DNAの状態を観察すれば簡便にアポトーシス性の 細胞死であるか否力を判定することができる。
[0126] さらに、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、カスパーゼが活性化（活性が 上昇)することがわかっているので、カスパーゼ活性を指標にして当該酵素活性が上 昇すればアポトーシス性の細胞死滅率が高いと判断することができる。
[0127] また、ミトコンドリア刺激によるアポトーシスによって細胞が死滅する際には、ミトコン ドリアから細胞質へのシトクローム cが放出するので、ミトコンドリア力 細胞質へのシト クローム cの放出を指標としてシトクローム cの放出量を測定すれば簡便にアポトーシ ス性の細胞死であるか否かを判定することができる。
[0128] また、アポトーシスによって細胞が死滅する際には、核の濃縮や細片化といった核 の形態変化が起こるので、核の形態変化を指標にして電子顕微鏡などで核の形態 変化を観察すれば簡便にアポトーシス性の細胞死であるか否力を判定することがで きる。
[0129] 本発明に係るインビトロでの細胞死の評価方法を用いれば、虚血または虚血後の 再灌流によって生じる細胞死を抑制するための薬剤、特に、虚血または虚血後の再 灌流によって生じるネクローシスを抑制するための薬剤をスクリーニングするのに有 効である。すなわち、上記の処理工程時 (虚血処理工程時または再灌流処理工程時 、あるいはこれらの前後）に被検物を添加した場合の細胞死の評価結果と、上記の処 理工程時 (虚血処理工程または再灌流処理工程時）に被検物を添加してレ、なレ、場 合の細胞死の評価結果とを比較することによって被検物の虚血または虚血後の再灌 流によって生じる細胞死に対する抑制効果を評価することができ、その結果、虚血ま たは虚血後の再灌流によって生じる細胞死に対する抑制効果を有する物質を得るこ とがでさる。
[0130] (3)虚血および虚血後の再灌流によって生じる細胞死の評価方法 (インビボ系） 本発明は、インビボでの動物を用いる系において虚血および虚血後の再灌流によ つて生じる細胞死を評価するための方法を提供する。
[0131] マウスを用いる虚血および虚血後の再灌流を、当該分野において慣用的な手順で 行なう。具体的には、マウスをエーテルで麻酔導入した後手術台に固定して気管揷 入し、麻酔ガスを人工呼吸器にてマウスに吸入させて、呼吸管理および麻酔を維持 する。左冠状動脈左前下行枝を縫合糸で結紮して、マウスの虚血処理を行い、虚血 処理の一定時間後に結紮を解いて再灌流を行う。虚血および再灌流後に閉胸し、麻 酔から覚醒させたマウスを通常通り飼育する。 [0132] このような従来の手順に従ってマウスの虚血および虚血後の再灌流を行なうと、胸 腔内温および直腸温の低下、ならびに開胸中の体水分の蒸発が生じるために、イン ビボでの実験が首尾よくいかない場合が多い。そこで、本発明者らは、マウスの虚血 および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムを構築した。
[0133] 本発明に係るマウスの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステム は、体温維持のための保温器具を備える。具体的には、本発明に係るシステムは、 恒温槽によって 40°Cに温められた水が循環する構造を有する手術台、および、ボン プとヒーターを用いることによって温められた生理食塩水を胸腔内に送りかつ一方で 吸引して回収することを特徴とする心臓の温度を維持しかつ乾燥を防止するための 装置を備える。これらを備えることによって、実験に供するマウスの胸腔内温および直 腸温を 35. 8〜36.4°Cに維持すると同時に開胸中の体水分の蒸発を防ぐことができ た。
[0134] さらに本発明に係るシステムは、左冠状動脈左前下行枝を結紮するための結紮保 持具を備えることが好ましい。結紮保持具としては、留置針の外套部分を用いること が好ましい。このような結紮保持具を用いることによって、縫合糸を誤って切ることなく 、実験の成功率が数段向上した。また、上記結紮保持具の結紮部に接触する部分が 適度な柔軟性をもつ素材であること、および結紮部との間に 0. 5mm厚の小さな布を 挟んで固定することにより組織を押し潰して血管を損傷することを防ぎ、再灌流をより 確実に実施した。
[0135] さらに本発明に係るシステムは、経類静脈薬剤注入器具を備えることが好ましい。
経類静脈薬剤注入器具としては、長さ 70mm、外径 0. 164mm,内径 0. 1mmの二 一ドルが好ましい。このような静脈薬剤注入器具を用いることによって、類静脈に留 置することが可能になり、当該器具を留置した状態で類静脈を傷つけることなく長時 間安全に薬剤を注入することが可能になった。
[0136] このように、本発明に係るインビボでの細胞死の評価方法は、上述した本発明に係 るマウスの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムを用いればよ レ、といえる。そして、本発明に係るマウスの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行 なうためのシステムは、体温維持のための保温器具を備えればよぐ結紮保持具およ び経類静脈薬剤注入器具をさらに備えればより好ましいといえる。さらに、本発明に 係るインビボでの虚血および虚血後の再灌流を首尾よく行なうためのシステムにおい て、再灌流をより確実に実現するために、へノ リンナトリウム (虚血開始前に 150単位 Zkg体重、再灌流開始前に 100単位 Zkg (体重）を投与容量が 100 μ L以内になる ように希釈して用いる）と硫酸プロタミン (再灌流開始 2分後にへパリン 1000単位に対 して 10mgを投与容量が 100 x L以内になるように希釈して用いる）を類静脈から投 与することが好ましい。
[0137] 本発明に係るシステムを用いれば、 CFTR活性化剤をインビボでスクリーニングす ることができる。すなわち、本発明に係るシステムは、 CFTR活性化剤をインビボでス クリーニングするためのシステムでもあり得る。好ましい実施形態において、本発明に 係るシステムは、体温維持のための保温器具、結紮保持具および持続的薬剤注入 器具を備えている。一実施形態に係るシステムにおいて、上記保温器具は恒温槽を 利用した保温手術台であることが好ましい。また、一実施形態に係るシステムにおい て、上記結紮保持具は留置針の外套部分であってもよい。一実施形態に係るシステ ムにおいて、上記持続的薬剤注入器具は経頸静脈的注入器具であることが好ましい 。また、一実施形態に係るシステムにおいて、心臓の外環境維持、温度維持および 乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内で灌流させる器具がさらに備えられて レ、ることが好ましい。別の実施形態において、本発明に係るシステムは、 CFTR活性 化剤をインビボでスクリーニングするために、 CFTR活性化剤としての候補因子を再 灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後に被験体に投与する手段を有して いる。上記手段は、持続的薬剤注入器具であることが好ましい。本実施形態に係るシ ステムは、被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する手段をさらに有し得る。
[0138] 本発明はさらに、本発明に係るシステムを使用して実施される、 CFTR活性化剤を インビボでスクリーニングするための方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方 法は、再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後に CFTR活性化剤としての 候補因子を被験体に投与する工程;ならびに、被験体に生じた梗塞巣サイズを測定 する工程、を包含することを特徴としている。本発明に係るスクリーニング方法は、上 記投与する工程が経頸静脈的に行われることが好ましい。 [0139] 上述したように、 PKA活性化剤および PKC活性化剤の同時投与は、 CFTR活性 化剤として好ましい効果を奏する。よって、本発明に係るスクリーニング方法は、上記 被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の代わり に PKA活性化剤および PKC活性化剤を同時に投与して生じた梗塞巣サイズとを比 較する工程を包含することが好ましい。好ましくは、上記 PKA活性化剤が milrinone であり得る。なお、上記「候補因子」は、単独で CFTRの活性化をもたらし得る CFTR 活性化剤もまた含み得る。
[0140] CFTRノックアウトマウスを用いれば、候補因子の効果が CFTR依存的であるか否 力を判定することができる。よって、本発明に係るスクリーニング方法は、上記被験体 として野生型マウスを用いて測定された梗塞巣サイズと、上記被験体として CFTRノ ックアウトマウスを用いて測定された梗塞巣サイズとを比較する工程を包含してもよい
[0141] 本発明は上述した実施形態に限定されるものではなぐ請求の範囲に示した範囲 で種々の変更が可能である。すなわち、請求の範囲に示した範囲で適宜変更した技 術的手段を組合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれ る。また、本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明される力 これに限定さ れるべきではない。
[0142] 〔実施例〕
本実施例では、新生仔ラットの心室筋細胞の初代培養系をインビトロ実験として用 レ、、インビボ実験としてマウスを用いた。これらのインビトロおよび Zまたはインビボで の実験において、本発明者らは以下の事項を検討した：
(i)インビトロで PKAおよび PKCを同時活性化することにより得られた心筋細胞の虚 血傷害に対する保護メカニズムが CFTRの機能に起因するものなのか；
(ii)心筋細胞の虚血傷害を防御するメカニズムにおける CFTRの機能はネクローシ スとアポトーシスのいずれの細胞死の防御に関与するの力
(iii) CFTRチャネル活性化剤をインビボでマウスに投与することによって、虚血また は再灌流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制する ことができるのカ (iv) CFTRチャネル活性化剤をインビボで虚血開始後に投与しても虚血または再灌 流によって惹起される心筋傷害、特にネクローシス性心筋細胞死を抑制することがで きるの力 ；および
(v) CFTRの発現レベルがインビボで心筋の虚血傷害の程度に影響を与えるのか。
[0143] [実施例 1]
本発明者らは、 CFTRがラット心室筋細胞に発現しており、虚血を誘導することによ つて CFTRの発現が当該細胞の形質膜上で一過性に亢進することを既に報告して レ、る (H. Uramoto, N. Takahashi, A. K. Dutta, R. Z. babirov, Y. Ando-Akatsuka, S. Morishima & Y. Okada. Ischemia-induced enhancement of CFTR expression on the plasma membrane in neonatal rat ventricular myocytes. Jpn J Physiol 53, 357-365 2 003)。また、 CFTRチャネルブロッカー、または PKA活性化剤と PKC活性化剤とを 虚血中に投与していることにより、再灌流後の細胞の回復が前者では悪化し、後者 では改善されることを既に報告している（H. Uramoto, S. Morishima, Y. Ando-Akatsu ka, Y. Nagasaki, N. Hagiwara and Y. Okada. A role of し TRし 1 channel in the prot ection from ischemic injury in neonatal rat ventricular myocytes. Jpn. J. Physiol. 52, S35, 2002)。そこで、 CFTRチャネル活性化剤による虚血傷害の改善効果が CFTR チャネルの活性化によるものなのか、そして上記改善効果が CFTRチャネルの活性 化によるのであれば、 CFTRチャネルがラット心筋細胞の虚血傷害に対してどのよう に関与しているかを調べた。
[0144] 新生仔ラットの心臓から酵素処理により初代培養心室筋細胞を調製した。培地には 、 M199液 + 10%FBSを用いた。培養中、心筋細胞以外の増殖性細胞の増殖を防 ぐために ΙΟΟ μ Μ BrdUを培地に添加した。
[0145] 初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理 (グルコースの除去かつ無酸素）および 虚血後の再灌流を、以下のように行なった。培地を、グノレコースを含有しない溶液（1 08mM NaCl、 0. 5mM MgCl 、 5. 4mM KC1、 ImM CaCl 、 5mM HEPE
2 2
Sに NaHCOをカ卩えて pH7. 4に調整した溶液）に置換し、外気を無酸素（95%アル
3
ゴンガス + 5%炭酸ガス）として、 37°Cで 8時間培養した。その後、直ちにグルコース 含有正常培地（M199液 + 10%FBS)に置換し、酸素（約 20%)を含む COインキュ ベータ（95%空気 + 5。/0炭酸ガス、 37°C)中で 96時間培養した（再灌流：グルコース 再投与 Z再酸素供給)。
[0146] C1—チャネルブロッカー（NPPB)を虚血処理 1時間前または虚血処理時にラット初 代培養心室筋細胞に投与した後 8時間にわたって虚血させる力 あるいは虚血後の 再灌流開始後より 18時間にわたって投与し、 MTT法を用いて細胞生存率を測定し た。生存している細胞の数をできるだけ正確に把握するために、細胞生存率の測定 を、虚血後の再灌流 96時間後の細胞を用いて行った（図 1)。
[0147] これまでに確認しているように、 CFTRチャネルブロッカーによる細胞の生存率の有 意な減少は、虚血処理時に CFTRチャネルブロッカー（50 μ M NPPB)を投与した 場合にのみ観察され、虚血 1時間前、または虚血後の再灌流開始後より 18時間にわ たって投与した場合には観察されなかった。これらの結果は、 CFTRの虚血に対する 耐性が虚血中に発揮されてレ、ることを示す。
[0148] [実施例 2]
実施例 1と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例 1と同 様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理 (グルコースの除去かつ無酸素）およ び虚血後の再灌流を行なつた。
[0149] CFTRチャネル活性化剤（PKA活性化剤である dbcAMP (ImM)もしくは PKC活 性化剤である PMA (lOOnM)またはこれら両方（DP) )、または CFTRチャネル活性 ィ匕剤 + CFTRチャネルブロッカー（NPPB (50 μ Μ)、 glibenclamide (500 μ Μ)、 g emfibrozil (2mM)または 9AC (2mM) )を、虚血処理時にラット初代培養心室筋細 胞に投与した後 8時間にわたって虚血させ、 96時間の再灌流を行った後に、 MTT 法を用いて細胞生存率を測定した（図 2)。
[0150] 図 2に示すように、 PKA活性化剤である dbcAMPと PKC活性化剤である PMAを 同時に投与することで生存率は有意に上昇した力 この効果は CFTRチャネルブロ ッカーを同時に投与することによって完全に消去された。
[0151] この結果は、 dbcAMPおよび PMAの同時投与によって観察された効果が CFTR チャネルの活性化によるものであること、および、 CFTRチャネルが心筋細胞の虚血 傷害に対して救済することを示す。 [0152] また、 dbcAMPおよび PMAの同時投与による効果は、 dbcAMPまたは PMAの単 独投与では有意には生じなかった。このことは、プレコンディショニング様効果を示す ことが知られている PMAの単独効果によるものではないことを示す。
[0153] [実施例 3]
心筋において、虚血によってカテコールアミンが細胞間隙に放出され、その結果、 内因性に cAMPが増加する。ホスホジエステラーゼ IIIは cAMPの分解を阻害する酵 素であり、心臓に分布することが知られている。 milrinoneは、この酵素の阻害剤であ る (R. M. Wallis, J. D. Corbin, S. H. Francis & P. Ellis. Tissue distribution of phosph odiesterase families and the effects of sildenafil on tissue cyclic nucleotides, platelet function, and the contractile responses of trabeculae carneae and aortic rings in vitr o. Am J Cardiol 83， 3C-12C, 1999)。 milrinoneは、 CFTRチャネルを活性化するこ とも示されている（Β· R. Cobb, L. Fan, T. E. Kovacs, E. J. Sorscher & J. P. Clancy. Adenosine receptors and phosphodiesterase inhibitors stimulate CI secretion in Cal u-3 cells. Am J Respir Cell Mol Biol 29, 410-418， 2003)。また、 milrinoneは、その 半減期が 2時間であり、血中では約 70%がタンパクと結合して循環しており、代謝さ れることなくそのまま尿中に排泄される（L. A. Lehtonen S. Antila & P. J. Pentikainen . Pharmacokinetics and pharmacodynamics or intravenous inotropic agents. し lin Pha rmacokinet 43, 187-203， 2004)。臨床では、急性心不全の治療に用いられており、 血管拡張作用、および強心作用が期待されている（Y. Ohizumi. Novel types of cardi otonic drugs. Folia Pharmacol Japon 100， 259-269, 1992)。
[0154] 本発明者らは、ホスホジエステラーゼ IIIインヒビターである milrinoneが、 PKA活性 化剤である dbcAMPと同様に、 CFTRチャネル活性化剤として虚血傷害抑制効果を 示すのかどうかを調べた。
[0155] 実施例 1と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例 1と同 様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理 (グルコースの除去かつ無酸素）およ び虚血後の再灌流を行なつた。
[0156] CFTRチャネル活性化剤（milrinone (0. 73 μ g、 lml)、 isoproterenol (ΙΟηΜ) 、および PMA (lOOnM)を併用（MIP) )、または CFTRチャネル活性化剤 + CFTR チャネルブロッカー（NPPB (50 μ Μ)、 glibenclamide (500 μ Μ)、 gemfibrozil (2 mM)または 9AC (2mM) )を、虚血処理時にラット初代培養心室筋細胞に投与した 後 8時間にわたって虚血させ、 96時間の再灌流を行った後に、 MTT法を用いて細 胞生存率を測定した（図 3)。
[0157] 図 3に示すように、 dbcAMPと同様に、 milrinoneと PMAとを同時投与した細胞に おいて生存率が改善され、この効果はいずれの CFTRチャネルブロッカーによっても 抑制された。また、 milrinoneは CFTRチャネルの活性化を介して心筋の虚血傷害 に対して防御効果を示すことが明らかになった。
[0158] [実施例 4]
実施例 1と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例 1と同 様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理 (グルコースの除去かつ無酸素）を 行なった。
[0159] 虚血部位において生じる細胞死が虚血傷害に起因する細胞死であることを確認す るために、 CFTRチャネルブロッカー（NPPB (50 μ M) )を、虚血処理時にラット初代 培養心室筋細胞に投与した後 8時間にわたって虚血させ、当該分野において公知 の方法に従って Hoechst 33342と propidium iodide (PI)とを用いて虚血終了直 後の細胞を二重染色して、ネクローシス性の死細胞率を調べた。 Hoechst 33342 は、全ての細胞の核を染色し、 propidium iodide (PI)は、膜傷害を生じたネクロー シス性の死細胞のみを染色する。
[0160] 8時間にわたる虚血によって、何も投与しない場合は 44. 4%の細胞が PIで染色さ れたが、 NPPBを投与することによって 90. 3%の細胞が PI染色された（図 4)。この 結果は、再灌流の 96時間後に MTT法を用いて観察した細胞生存率低下がネクロ 一シスに起因することを示す。
[0161] [実施例 5]
CFTRチャネルが関与する虚血傷害に、アポトーシスが関与しているかを調べた。
[0162] 実施例 1と同様にラット初代培養心室筋細胞を調製した後培養した。実施例 1と同 様に初代培養ラット心筋細胞に対する虚血処理 (グルコースの除去かつ無酸素）およ び虚血後の再灌流を行なつた。 [0163] CFTRチャネル活性化剤（PKA活性化剤である dbcAMP (ImM) +PKC活性化 剤である PMA (lOOnM) )、または CFTRチャネルブロッカー（NPPB (50 μ M) )を 、虚血処理時にラット初代培養心室筋細胞に投与した後 8時間にわたって虚血させ、 虚血終了直後または虚血後の再灌流 96時間後の細胞における核 DNA断片化率を 調べた（図 5)。具体的には、アポトーシスに陥った細胞で特徴的に見られるモノヌク レオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドを特異的に検出する方法（DNA断片化検 出法（細胞死検出 ELISAキット PUJS、ロシュ'ダイァグノスティックス社））を用いて、 DN A断片化を測定し、その結果を、 enrichment factorとして、以下の式を用いて求 めた：
enrichment factor (核 DNA断片化率） =試料（死んだ細胞）の吸光度/コント口 ール (未処理細胞）の吸光度。
[0164] 図 5に示すように、虚血直後では、未投与群、 CFTRチャネルブロッカー投与群、ま たは CFTRチャネル活性化剤投与群のいずれの細胞においても、 DNA断片化の発 生程度（非虚血細胞の値を 1とした）は、非虚血細胞と同レベルを示した。この結果は 、 NPPB投与によって観察された虚血直後の細胞死はアポトーシスとは関係なぐす なわち、 CFTRはアポトーシスではなくネクローシスの防御に機能していることを示す
[0165] また、再灌流 96時間後においても、 DNA断片化の発生程度は 3倍に増加した力 未投与群、 CFTRチャネルブロッカー投与群、または CFTRチャネル活性化剤投与 群の間で有意差はなかった。この結果は、 CFTRチャネルが再灌流後のアポトーシ スに関与しないことを示す。
[0166] [実施例 6]
9週齢雄マウス（C57BLZ6J、クレア社)を、インビボ実験に用いた。麻酔導入をェ 一テルを用いて行った。手術台に固定して気管挿入した後、酸素と亜酸化窒素の混 合ガス（酸素 20%)に 1 %セボフランを混合したガスを人工呼吸器にてマウスに吸入 させて、呼吸管理および麻酔を維持した。左冠状動脈左前下行枝を縫合糸で結紮し て、マウスの虚血処理を行った。虚血処理 30分後に、結紮を解いて再灌流を行った 。薬剤の投与を、経類静脈的に行った。虚血および再灌流後、結紮に用いた縫合糸 をマウス胸腔内に残したまま閉胸した。マウスを麻酔から覚醒させた後、通常通り飼 育した。飼育開始 2日後にエーテル麻酔下で開胸した後、再び結紮して evans blu eを心尖部より左心室に注入した後、直ちに心臓を摘出し、 1mmの厚さにスライスし た。切片中の細胞生存部位を、 triphenyl tetrazolium chloride (TTC)溶液によ つて染色した。虚血心筋傷害の程度の判定を、虚血域に対する梗塞域 (TTC非染色 域）の割合として求めた。
[0167] なお、インビボ実験を実行する際に、以下のシステムを用いた。
(a)体温維持のための保温システム（図 6)
(i)手術台：恒温槽によって 40°Cに温められた水が循環する構造
(ii)心臓の温度維持と乾燥防止システム：ポンプとヒーターを用いることによって 温められた生理食塩水を胸腔内に送り、かつ一方で吸引して回収する
(i)および (ii)によって、胸腔内温および直腸温を 35· 8〜36.4°Cに維持すると同 時に開胸中の体水分の蒸発を防ぎ、実験を可能にした。
(b)結紮保持具:図 7に示すように、留置針の外套部分を用いて、左冠状動脈左前 下行枝を結紮する。この道具を用いることによって、縫合糸を誤って切ることなぐ実 験の成功率を高めた。また、 0. 5mm厚の小さな布を併用することにより結紮部組織 の損傷を抑えて再灌流をより確実に実施した。
(c)経類静脈薬剤注入システム：図 8に示すようにマイクロフィル（MicroFil™, Worl d Precision Instruments, INC社：長さ 70mm、外径 0. 164mm,内径 0. lmm のニードル）を用いることによって、マイクロフィルを類静脈に留置すること、およびマ イク口フィルを留置した状態で類静脈を傷つけることなく長時間安全に薬剤を注入す ることが可能になった。
[0168] [実施例 7]
一般に、インビトロ実験において、 PKAの活性化剤として、ジブチリルサイクリック A MP (dbcAMP)、ホルスコリン（forskolin)、イソプロテレノール（isoproterenol)等 が用いられる。しかし、インビボ実験でこれら薬剤を用いることによる悪影響が懸念さ れる。 milrinoneは、 CFTRチャネルを活性化すること、および、実際に臨床で用いら れてレ、ることから、インビボでの実験に適した PKA活性化剤と考えられる。 [0169] マウスを用いるインビボ実験を実施例 6に従って行なった。図 9Aに示すように、 C5 7BL/6Jマウスに、図 9Bに示す濃度で milrinoneと PMAの両方を含む生理食塩水 を虚血開始 10分前に 1ショットで投与した後、 1ショットの 1/3量が 1時間で投与され る速度で虚血終了まで持続投与した。
[0170] 上記の投与プロトコルによって、著しい梗塞巣サイズの減少が観察された。このこと は、 CFTR活性化剤が心筋における虚血傷害をインビボにおいても抑制することを 示す。
[0171] さらに、薬剤の投与時期を検討した。マウスを用レ、るインビボ実験を実施例 6に従つ て行なった。図 10Aに示す時期に薬剤を投与した後、虚血領域に対する梗塞巣領 域の割合を調べた（図 10B)。 30分間の虚血では再灌流開始時 1ショット投与でも虚 血前から再灌流直前までの持続投与の場合と同程度に梗塞巣サイズを減少させる 効果が見られた。
[0172] また、 CFTR活性化剤投与による虚血傷害の抑制効果が CFTRの機能に起因する 力否かを、 CFTRノックアウトマウス (Cftrtmlu，を用いて検討した。ただし、—/—マ ウスは生存率が極めて低かったので実験に供することができな力 た。実験には、 + /- (ヘテロ）マウスまたは + /+ (WT)マウスを供した。マウスを用いるインビボ実験 を、実施例 6に従って行った。虚血 ·再灌流を図 11Aに示すように行った後、生じた 梗塞巣サイズを調べた。 CFTR発現量の少ないヘテロマウスにおいて、虚血 '再灌流 によって生じた梗塞巣サイズは WTマウスと比較して大きくなり、虚血傷害が悪化して いた。
[0173] 本発明は、虚血時、および不可逆性の傷害に陥る前の比較的短時間の虚血条件 下での再灌流開始時または再灌流直前もしくは直後における CFTRチャネルの活性 ィ匕が、心筋細胞のネクローシスに起因する様々な虚血性心筋細胞傷害の保護に効 果的であることを初めて示す。
[0174] 培養心室筋細胞にグルコース除去'無酸素処理後にグルコース再投与'再酸素化 処理を行うという虚血'再灌流モデル実験を行い、 MTT法による細胞生存率の測定 、 DNA断片化の ELISA検出法によるアポトーシス判定法、そして Hoechst 3334 2とヨウ化プロビジゥム（propidium iodide (PI) )との二重染色によるネクローシスの 判定を行うことで虚血傷害による心筋細胞死に対する治療'防御薬剤の効果判定法 をインビトロで確立し、更にインビボ虚血'再灌流システム（薬剤の持続投与システム を含む）を確立した。これらを用い、虚血傷害による細胞死を虚血前〜虚血中または 再灌流開始時に CFTRチャネル活性化剤を投与することによって抑制できることが 明らかとなった。
[0175] β—アドレナリン刺激による CFTRチャネルの活性化が浸透圧的に膨張した心筋 細胞の調節性容積減少（regulatory volume decrease (RVD) )をもたらすことが 幸告されてレヽる（Z. Wang, T. Mituiye, S. A. Rees & A. Noma. Regulatory volume de crease of cardiac myocytes induced by β -adrenrgic activation of the CI channel in guinea pig. J Gen Physiol 10, 73-82， 1997)。従って、本発明によるネクローシス防 御のメカニズムは、虚血傷害で生じるネクローシスの原因である異常な細胞膨潤に対 して CFTRが抑制的に機能して、容積を元のレベルに回復させることによるものと考 えられる。
[0176] 尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様また は実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような 具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記 載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用の可能性
[0177] 上記構成を採ることによって、本発明に係る薬学的組成物は、心室筋の細胞死を 抑制することができる。また、本発明に係る薬学的組成物は、心臓外科手術において 心筋を保護することができる。さらに、本発明に係る薬学的組成物は、ネクローシスに 起因する疾患を予防する処置として用いることができる。
[0178] また、本発明に係るインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステムは、上 記構成を採ることによって、実験に供するマウスの胸腔内温および直腸温を 35. 8〜 36.4°Cに維持すると同時に開胸中の体水分の蒸発を防ぎ、その結果、実験を首尾 よく行なうことができる。
[0179] 本発明は、これまで虚血傷害の防御因子として考えられていなかった CFTRを標 的とする虚血性心筋傷害に対する新規の防御策である。本発明を用いれば、心臓外 科手術および心臓移植手術で虚血傷害が問題となっている外科手術症例における 心筋保護法に適用することで改善効果を得ることができる。また、本発明を用いれば 、再灌流時での投与においても効果が見られるので、虚血発作を生じた後の投与、 すなわち内科的治療においても適用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 体温維持のための保温器具、結紮保持具および持続的薬剤注入器具を備えてレ、 ることを特徴とする CFTR活性化剤をインビボでスクリーニングするためのシステム。
[2] 上記保温器具が、恒温槽を利用した保温手術台であることを特徴とする請求の範 囲 1に記載のシステム。
[3] 上記結紮保持具が留置針の外套部分であることを特徴とする請求の範囲 1に記載 のシステム。
[4] 上記持続的薬剤注入器具が経頸静脈的注入器具であることを特徴とする請求の 範囲 1に記載のシステム。
[5] 心臓の外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸腔内 で灌流させる器具がさらに備えられていることを特徴とする請求の範囲 1に記載のシ ステム。
[6] 請求の範囲 1〜5に記載のシステムを使用して CFTR活性化剤をインビボでスクリ 一ユングするための方法であって、
再灌流開始時または再灌流開始直前もしくは直後に CFTR活性化剤としての候補 因子を被験体に投与する工程;ならびに
被験体に生じた梗塞巣サイズを測定する工程
を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
[7] 上記投与する工程が経頸静脈的に行われることを特徴とする請求の範囲 6に記載 のスクリーニング方法。
[8] 上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の 代わりに PKA活性化剤および PKC活性化剤を同時に投与して生じた梗塞巣サイズ とを比較する工程を包含する請求の範囲 6に記載のスクリーニング方法。
[9] 上記 PKA活性化剤が milrinoneであることを特徴とする請求項 8に記載のスクリー ニング方法。
[10] 上記被験体に生じた梗塞巣サイズと、上記投与する工程において上記候補因子の 代わりに単独で CFTR活性化剤を投与して生じた梗塞サイズとを比較する工程を包 含することを特徴とする請求の範囲 6に記載のスクリーニング方法。
[11] 上記被験体として野生型マウスを用いて測定された梗塞巣サイズと、上記被験体と して CFTRノックアウトマウスを用いて測定された梗塞巣サイズとを比較する工程を包 含する請求の範囲 6に記載のスクリーニング方法。
[12] CFTRチャネル活性化剤を含むことを特徴とする心室筋の細胞死を抑制するため の薬学的組成物。
[13] 上記細胞死が、ネクローシスであることを特徴とする請求の範囲 12に記載の薬学 的組成物。
[14] 上記細胞死が、虚血または虚血後の再灌流によって生じる細胞死であることを特徴 とする請求の範囲 12に記載の薬学的組成物。
[15] 上記 CFTRチャネル活性化剤が PKA活性化剤と PKC活性化剤との混合物である ことを特徴とする請求の範囲 12に記載の薬学的組成物。
[16] 上記 PKA活性化剤力 ジブチリルサイクリック AMPであることを特徴とする請求の 範囲 15に記載の薬学的組成物。
[17] 上記 PKC活性化剤力 ホルボール 12—ミリスチン酸エステル 13酢酸塩であること を特徴とする請求の範囲 15に記載の薬学的組成物。
[18] 上記 CFTRチャネル活性化剤としてホスホジエステラーゼ IIIインヒビターおよび PK
C活性化剤を含むことを特徴とする請求の範囲 12に記載の薬学的組成物。
[19] 上記ホスホジエステラーゼ IIIインヒビター力 1 , 6 - dihydro - 2 - methyl - 6 - o xo [3, 4，一bipyridine] _ 5 _carbonitrileであることを特徴とする請求の範囲 18に 記載の薬学的組成物。
[20] 上記細胞死が、心筋組織において虚血中に生じる異常によって誘発されることを特 徴とする請求の範囲 12に記載の薬学的組成物。
[21] 上記細胞死が、ミトコンドリア脱水素酵素の活性低下を伴うことを特徴とする請求の 範囲 12に記載の薬学的組成物。
[22] 心室筋初代培養細胞のネクローシス性細胞死を抑制するための請求の範囲 12に 記載の薬学的組成物。
[23] 心室筋梗塞域を低減することを特徴とする請求の範囲 12に記載の薬学的組成物。
[24] CFTRチャネル活性化剤を含むことを特徴とする心臓外科手術および心臓移植手 術において心筋を保護するための薬学的組成物。
[25] ネクローシスを生じる心臓の外科手術および移植手術において用いられることを特 徴とする請求の範囲 24に記載の薬学的組成物。
[26] 上記 CFTRチャネル活性化剤が PKA活性化剤と PKC活性化剤との混合物である ことを特徴とする請求の範囲 24に記載の薬学的組成物。
[27] 上記 PKA活性化剤力 ジブチリルサイクリック AMPであることを特徴とする請求の 範囲 26に記載の薬学的組成物。
[28] 上記 PKC活性化剤力 ホルボール 12—ミリスチン酸エステル 13酢酸塩であること を特徴とする請求の範囲 26に記載の薬学的組成物。
[29] 上記 CFTRチャネル活性化剤としてホスホジエステラーゼ IIIインヒビターおよび PK
C活性化剤を含むことを特徴とする請求の範囲 24に記載の薬学的組成物。
[30] 上記ホスホジエステラーゼ IIIインヒビター力 1 , 6 - dihydro - 2 - methyl - 6 - o xo [3, 4，一 bipyridine]— 5— carbonitrileであることを特徴とする請求の範囲 29に 記載の薬学的組成物。
[31] CFTRチャネル活性化剤を含むことを特徴とするネクローシスに起因する疾患を予 防するための薬学的組成物。
[32] 上記 CFTRチャネル活性化剤が PKA活性化剤と PKC活性化剤との混合物である ことを特徴とする請求の範囲 31に記載の薬学的組成物。
[33] 上記 PKA活性化剤力 ジブチリルサイクリック AMPであることを特徴とする請求の 範囲 32に記載の薬学的組成物。
[34] 上記 PKC活性化剤力 ホルボール 12_ミリスチン酸エステル 13酢酸塩であること を特徴とする請求の範囲 32に記載の薬学的組成物。
[35] 上記 CFTRチャネル活性化剤としてホスホジエステラーゼ IIIインヒビターおよび PK
C活性化剤を含むことを特徴とする請求の範囲 31に記載の薬学的組成物。
[36] 上記ホスホジエステラーゼ IIIインヒビター力 1 , 6 - dihydro - 2 - methyl - 6 - o xo [3, 4，一bipyridine] _ 5 _carbonitrileであることを特徴とする請求の範囲 35に 記載の薬学的組成物。
[37] CFTRチャネル活性化剤を投与する工程を包含する心室筋の細胞死を抑制する 方法。
[38] CFTRチャネル活性化剤を投与する工程を包含する心臓外科手術および心臓移 植手術において心筋を保護する方法。
[39] CFTRチャネル活性化剤を投与する工程を包含するネクローシスに起因する疾患 を予防する方法。
[40] 体温維持のための保温器具を備えることを特徴とするインビボでの虚血および虚血 後再灌流のためのシステム。
[41] 結紮保持具および持続的薬剤注入器具をさらに備えることを特徴とする請求の範 囲 40に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
[42] 上記保温器具が恒温槽を利用した保温手術台であることを特徴とする請求の範囲
40に記載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
[43] 心臓の細胞外環境維持、温度維持および乾燥防止のために加温生理食塩水を胸 腔内で灌流させる器具をさらに備えることを特徴とする請求の範囲 40に記載のインビ ボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
[44] 上記結紮保持具が、留置針の外套部分であることを特徴とする請求の範囲 40に記 載のインビボでの虚血および虚血後再灌流のためのシステム。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006836A1 (en) * 1986-05-15 1987-11-19 Emory University Fibrinolytic composition
WO2001016137A1 (en) * 1999-09-01 2001-03-08 Guilford Pharmaceuticals Inc. Compounds, methods and pharmaceutical compositions for treating cellular damage, such as neural or cardiovascular tissue damage
EP1240906A1 (en) * 1999-10-22 2002-09-18 Shionogi & Co., Ltd. Preventives or remedies for arrhythmia
EP1449539A2 (en) * 1996-10-31 2004-08-25 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Prophylactic or therapeutic use of a Fas antagonist to inhibit Fas-mediated apoptosis

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006836A1 (en) * 1986-05-15 1987-11-19 Emory University Fibrinolytic composition
EP1449539A2 (en) * 1996-10-31 2004-08-25 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Prophylactic or therapeutic use of a Fas antagonist to inhibit Fas-mediated apoptosis
WO2001016137A1 (en) * 1999-09-01 2001-03-08 Guilford Pharmaceuticals Inc. Compounds, methods and pharmaceutical compositions for treating cellular damage, such as neural or cardiovascular tissue damage
EP1240906A1 (en) * 1999-10-22 2002-09-18 Shionogi & Co., Ltd. Preventives or remedies for arrhythmia

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN H. ET AL: "Targeted inactivation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator chloride channel gene prevents ischemic preconditioning in isolated mouse heart", CIRCULATION, vol. 110, no. 6, August 2004 (2004-08-01), pages 700 - 704, XP002993782 *
CHEN M. ET AL: "Resistance to hydrogen peroxide induced injury in cardiomyocytes from PARP-1 deficient mice", FASEB JOURNAL, vol. 18, no. 5 P.AB, April 2004 (2004-04-01), pages 790 - 795, XP002993779 *
COLLIER M.L. ET AL: "Unitary chloride channels activated by protein kinase C in guinea pig ventricular myocytes", CIRC RES, vol. 76, no. 2, 1995, pages 317 - 324, XP002993780 *
DE TASSIGNY A. ET AL: "Hypo-osmotic stress inhibits doxorubicin-induced apoptosis via a protein kinase A-dependent mechanism in cardiomyocytes", CLINICAL AND EXPERIMENTAL PHARMACOLOGY AND PHYSIOLOGY, vol. 31, no. 7, July 2004 (2004-07-01), pages 438 - 443, XP002993772 *
DUAN D. ET AL: "Loss of Early and Late Cardiac Ischemic Preconditioning in Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Deficient Mice", FASEB JOURNAL, vol. 18, no. 4-5, 2004, pages 429.6, XP002993781 *
ENDOH M.: "Changes in intracellular Ca2+ mobilization and Ca2+ sensitization as mechanisms of action of physiological interventions and inotropic agents in intact myocardial cells", JPN HEART J., vol. 39, no. 1, 1998, pages 1 - 44, XP002993774 *
GREEN P.S. ET AL: "Mitochondrial dysfunction is an early indicator of doxorubicin-induced apoptosis", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1588, no. 1, 2002, pages 94 - 101, XP004388050, DOI: doi:10.1016/S0925-4439(02)00144-8 *
JUNG Y.-S. ET AL: "Essential role of PKC-epsilon in the oritective effect of high glucose against hypoxic injury in cardiac myoblast", FASEB JOURNAL, vol. 15, no. 4, 7 March 2001 (2001-03-07), pages A84 *
KELLEY T.J. ET AL: "CFTR-mediated chloride permeability is regulated by type III phosphodiesterases in airway epithelial cells", AM J RESPIR CELL MOL BIOL, vol. 13, no. 6, 1995, pages 657 - 664, XP002993783 *
MOLLHOFF T. ET AL: "Myocardial ischaemia in patients with impaired left ventricular function undergoing coronary artery bypass grafting--milrinone versus nifedipin", EUR J ANAESTHESIOL, vol. 19, no. 11, 2002, pages 796 - 802, XP002993777 *
RAFIEE P. ET AL: "Activation of protein kinase in chronically hypoxic infant and rabbit haerts: role in cardioprotection", CIRCULATION, vol. 106, no. 2, 2002, pages 239 - 245, XP002993776 *
SANADA S. ET AL: "Cardioprotective effect afforded by transient exposure to phosphodiesterase III inhibitors: the role of protein kinase A and p38 mitogen-activated protein kinase", CIRCULATION, vol. 104, no. 6, 2001, pages 705 - 710, XP002993775 *
YAO Z. ET AL: "Signal transduction of flumazenil-induced preconditioning in myocytes", AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY, vol. 280, no. 3 PT 2, 2001, pages H1249 - H1255, XP002993773 *
YOSHIOKA Y. ET AL: "Coactivation of protein kinase A and protein kinase C prevents H2O2-induced necrosis through ERK and p38 MAP kinase activation in PC12 cells", JOURNAL OF PHARMACOLOGICAL SCIENCES, vol. 94, no. 1, 2004, pages 134P, XP002993778 *

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