WO2006032781A2 - Derives peptidiques , compositions et utilisations dans un traitement therapeutique de l’infection par un herpevirus - Google Patents

Derives peptidiques , compositions et utilisations dans un traitement therapeutique de l’infection par un herpevirus Download PDF

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WO2006032781A2
WO2006032781A2 PCT/FR2005/002331 FR2005002331W WO2006032781A2 WO 2006032781 A2 WO2006032781 A2 WO 2006032781A2 FR 2005002331 W FR2005002331 W FR 2005002331W WO 2006032781 A2 WO2006032781 A2 WO 2006032781A2
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herpesvirus
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Nicolas Dupin
Philippe-Alain Grange
Vincent Calvez
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Universite Rene Descartes - Paris 5
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses

Definitions

  • the present invention relates to novel peptides derived from lactoferrin (Lf), antibodies and pharmaceutical compositions comprising them as well as kits and methods for screening active molecules, in particular molecules having activity in the treatment of infections caused by a herpesvirus.
  • the invention also relates to genetic constructs, cells and compositions useful in particular for the implementation of such screening methods, for example cells that are genetically modified to overexpress part of the lactoferrin, as well as processes for the preparation of said cells.
  • the invention can be implemented for the identification of active or usable compounds for the development of drugs intended for the management of pathologies caused by a viral infection, a cancer (for example Kaposi's sarcoma). Primary effusion lymphomas (ELP), Castleman's disease (CDD), etc.
  • the invention is based in particular on the demonstration and the characterization of the role of lactoferrin in the mechanism of infection and in particular of cellular adhesion of herpesviruses and in particular on the capacity of this protein, when overexpressed, of sensitize the cells to the viral infection.
  • the invention is based on the identification of fragments of lactoferrin capable of binding herpesviruses and also on obtaining particular vectors allowing the expression of a part of lactoferrin, preferably all or part of the sequence located in the Ala 606 -Glu 679 portion of the mature form of human lactoferrin (Lfh), as well as on genetically modified cell lines, containing the expression plasmid of part of the peptide sequence of lactoferrin.
  • Lactoferrin (78 kDa protein representing less than 5% of saliva proteins) is an iron binding protein that would facilitate the absorption of iron and regulate cell growth and differentiation. Lf is otherwise known to interact in saliva with microorganisms and would intervene in antimicrobial control. The antimicrobial activity of lactoferrin, derived from lactoferrin, is of great interest. Recently, ani-Helicobacter pylori activity has been demonstrated in humans after ingestion of yoghurt components.
  • lactoferrin which is capable of binding numerous herpesviruses, in particular the HSV-I virus 1, the HSV-II virus, the cytomegalovirus (CMV), the HHV viruses, especially the HHV-8 virus, etc.
  • HHV-8 spread with a low prevalence of 0-5% in Northern Europe, up to 30%, is very unusual in herpesvirus.
  • the Mediterranean where the proportion of Kaposi's sarcoma (SK) is high. The rate of infection can exceed 50% in tropical Africa where we find the endemic forms of a very aggressive SK.
  • the HHV-8 infection is significantly more important and is critical in the development of SK. Indeed, 30-40% of a male homosexual HIV + population is infected with HHV-8 in the USA and Northern Europe where the incidence of HHV-8 infection in the general population is low.
  • Human herpes virus 8 (HHV-8 or KSHV) is a rhadinovirus belonging to the family Herpesviridae and the subfamily gammaherpesvirinae. It has recently been characterized as ⁇ 2-herpes virus 8. HHV-8 is also called KSHV for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus because of the detection of its DNA in all epidemiological forms of SK. It consists of a double-stranded DNA genome whose nucleotide sequence (approximately 140 kb) was determined from biopsies of SK and PEL (Genbank no.
  • HHV-8 is thus commonly detected in all epidemiological forms of SK but also in primary effusion lymphomas (PEL) or serous lymphoma and in some forms of syndromes.
  • PEL primary effusion lymphomas
  • CDM Castleman's disease
  • Human HHV-8 infects lymphoid and endothelial cells. In vivo, it is found in the spindle cells characteristic of SK, derived from endothelial cells and, in the context of MCD, in follicle mantle-like plasmoblastic cells which exhibit a restriction of lambda light chain expression.
  • HHV-8 The mode of transmission of HHV-8 is the subject of many questions and transmission through the blood appears to date, unlikely or weak.
  • the equally high prevalence of SK in children from areas where HHV-8 infection is endemic indicates a possible alternative route of transmission through close contact, mainly saliva.
  • studies of a population with AIDS associated with SK showed that the HH V-8 virus is more commonly found in saliva (especially in the oropharynx) than in genital secretions with viral load.
  • high salivary levels and that exposure to HHV-8-infected saliva may be a risk factor in the transmission of this virus.
  • the inventors have recently demonstrated, in an HIV + and HIV-infected population with or without SK, that there is compartmentalization of oral and blood HHV-8 infection with a different level of infection and viral production between them. .
  • the significant presence of HHV-8 virus in saliva is not correlated with high viral load in blood mononuclear cells (PBMCs) nor even with the progress of SK.
  • PBMCs blood mononuclear cells
  • the viral load found in the tonsillar cells is very close to that found in the PBMCs, suggesting, as indicated above, a possible role of reservoir and release of the virus of the oropharyngeal zone.
  • HIV antiretroviral therapies have transformed the prognosis of Kaposi's sarcoma, their benefit in Castleman's disease remaining, in the majority of cases, low.
  • the viral load HHV-8 remains unchanged and only chemotherapy whose effectiveness remains mediocre is currently possible for the treatment of this disease.
  • HS heparan sulfate
  • Cell surface molecules with the property of binding viral particles are one of the essential determinants in the selection of the host and the tissue target by viruses.
  • Infection of a cell by herpesvirus involves two steps. The first is considered an initial step allowing rapid attachment of the virus to the target cell membrane. It is followed by a second binding step corresponding to stabilization and enhancement of the attachment, leading to the penetration of the virus into the cell.
  • HHV-8 The adhesion of HHV-8 is characterized by an initial interaction involving a first heparin-sensitive receptor while the penetration of the virus into the cell appears to be linked to another non-heparin-inhibited receptor.
  • HHV-8 expresses several envelope glycoproteins (glycoproteins gB, gH, gM, gL and K8.1 are specifically found in HHV-8), encoded from the 137 kb DNA sequence that contains 80 at 90 open reading frames (ORFs). So far, only the involvement of three viral surface glycoproteins in the recognition process has been demonstrated.
  • the inventors have for the first time demonstrated the specific recognition of human lactoferrin by herpesviruses and in particular by HHV-8 and the involvement, in this process, of the non-glycosylated C-terminal part of the glycoprotein Lf, plus precisely an unglycosylated peptide of 8kDa (about 75 amino acids) located in position Ala 606 -Glu 679 of the mature form of Lfh (Accession # AY137470.1).
  • a preliminary screening of 80 individuals also indicates that about 10% of individuals not infected with HHV-8 have a non-virus-recognized Lf suggesting localized changes at the binding site, more likely post-translational modifications.
  • a first subject of the invention therefore relates to a peptide or polypeptide, characterized in that it has a partial sequence of at least 5, preferably at least 10 successive amino acids of the sequence located in the Ala portion 606 - Glu 679 of the mature form of human lactoferrin, still more preferably at least 20, even more preferably at least 30 or at least 40 successive amino acids, and at most 650 amino acids successive, preferably less than about 200 amino acids, preferably less than about 100 amino acids, more preferably less than about 60 amino acids.
  • the peptide or polypeptide comprises less than 45 successive amino acids of the sequence located in the Ala 606 -Glu 679 portion of human lactoferrin.
  • the invention also relates to a nucleic acid for use in the genetic engineering preparation of such a peptide or polypeptide comprising the sequence (SEQ ID NO: 1):
  • the invention also relates to a vector comprising all or part of such a nucleic acid.
  • a particular aspect of the invention also relates to recombinant viruses and bacteria or to viral vectors encoding a part of lactoferrin, preferably all or part of SEQ ID NO: 2, ie, all or part of:
  • Another object of the invention relates to a kit comprising a peptide or polypeptide as described above and for diagnosing, in a human or a mammal, a herpesvirus infection.
  • the invention further relates to a novel therapeutic approach which consists of blocking viral infection at an early stage by inhibiting the adhesion of herpesviruses to their target cells, for example by saturating said viruses with a part of the lactoferrin, preferably with the aid of a peptide or polypeptide as defined above.
  • An object of the invention thus relates to a pharmaceutical composition, for example a composition capable of preventing or treating an infection caused by a herpesvirus, comprising a peptide, a polypeptide, a nucleic acid or a vector according to the invention and an adjuvant acceptable on the pharmaceutical plan.
  • Another subject of the invention relates to the use of a peptide, a polypeptide, a nucleic acid or a vector according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition intended to prevent or treat a disease. infection caused by a herpesvirus, chosen for example from the HSV-I, HSV-II, CMV and HHV viruses, in particular HHV-8.
  • a herpesvirus chosen for example from the HSV-I, HSV-II, CMV and HHV viruses, in particular HHV-8.
  • the invention also relates to a method for the selection, identification or the characterization of compounds mimicking the action of the peptide or polypeptide according to the invention of sequence SEQ ID NO: 2, ie, capable of binding a herpesvirus, for example HHV-8, which comprises: bringing into contact a compound test with said herpesvirus, in the presence of a portion of the lactoferrin, preferably all or part of the lactoferrin fragment corresponding to SEQ ID NO: 2, and determining the displacement of the binding of all or part of the lactoferrin herpesvirus by said test compound.
  • the invention also relates to genetic constructs, cells and compositions useful for the implementation of such screening methods as well as methods for preparing said cells.
  • the invention also relates to the use of a compound identified by a method as described above for the preparation of a composition for preventing or treating an infection caused by a virus, in particular a herpesvirus, or by a bacterium.
  • the inventors are part of the finding that the high antigenic variability of viruses contrasts with the conservation of binding sites thereof on their receptors or analogues of said receptors, which can be used as targets for the development of new treatments.
  • a first subject of the invention therefore relates to a peptide or polypeptide, characterized in that it has a partial sequence of at least 5, preferably at least 10 successive amino acids of the sequence located in the Ala portion 606 - Glu 679 of the mature form of human lactoferrin, still more preferably at least 20, even more preferably at least 30 or at least 40 successive amino acids and at most 650 successive amino acids preferably less than about 200 amino acids, preferably less than about 100 amino acids, more preferably less about 60 amino acids.
  • the peptide or polypeptide comprises less than 45 successive amino acids of the sequence located in the Ala 606 -Glu 679 portion of human lactoferrin.
  • the inventors have found that a peptide or polypeptide as defined above is capable of reacting with a herpesvirus and could be used in the context of the preparation of a pharmaceutical composition capable of preventing or treating an infection caused by a herpesvirus.
  • the invention also relates to a nucleic acid for use in the genetic engineering preparation of such a peptide or polypeptide having the sequence: SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof having at least 4 nucleotides, preferably at least 20 nucleotides, still more preferably at least 100 nucleotides or at least 200 nucleotides.
  • the invention also proposes a new method for screening active molecules, in particular molecules having an anti-retroviral activity (mimicking the action of the peptide or polypeptide according to the invention of sequence SEQ ID NO: 2), based on the use, in the presence of all or part of the lactoferrin, in particular all or part of SEQ ID NO: 2, of a target virus of the latter as a molecular target.
  • Such a method is useful for identifying active compounds in the treatment of pathologies related to an infection caused by a herpesvirus such as a cancer such as SK (HHV-8), primary effusion lymphomas (PEL / HHV-8 ), Castleman's disease (MCD / HHV-8), etc.
  • a herpesvirus such as a cancer such as SK (HHV-8), primary effusion lymphomas (PEL / HHV-8 ), Castleman's disease (MCD / HHV-8), etc.
  • the invention also relates to a method for the selection, identification or characterization of viruses capable of binding a peptide or polypeptide according to the invention, which comprises: bringing a virus into contact with said peptide or polypeptide or with whole lactoferrin, determining the binding of said virus with said peptide or polypeptide or with said whole lactoferrin.
  • the invention also relates to genetic constructs, cells (eg endothelial cells or plasmoblastic-type cells), and compositions useful for carrying out such screening methods as well as methods for preparing said cells.
  • cells eg endothelial cells or plasmoblastic-type cells
  • compositions useful for carrying out such screening methods as well as methods for preparing said cells.
  • the present invention is based in particular on the identification of the role of lactoferrin in the viral infection process, on the characterization of the active regions of lactoferrin and the mechanisms which underlie its role, as well as on the exploitation of lactoferrin. of this molecule for therapeutic purposes.
  • lactoferrin refers to a polypeptide comprising the primary amino acid sequence SEQ ID NO: 3, or a fragment or functional variant thereof.
  • fragment typically refers to a peptide or polypeptide comprising from 5 to 200 consecutive amino acids of SEQ ID NO: 3, preferably from 5 to 150, even more preferably from 5 to 100. Particular examples of fragments are polypeptides of From 5 to 80 amino acids, preferably from 15 to 40 amino acids. Preferably, the fragments comprise a functional domain, i.e., a domain capable of binding a herpesvirus, preferably the sequence SEQ ID NO: 2:
  • the term "functional variant” encompasses natural variants, including those resulting from polymorphism (s), splicing (s), variation (s) between species, etc.
  • This term also includes synthetic variants, in particular polypeptides comprising a sequence derived from the sequence SEQ ID NO: 2 by one or more mutations, deletions, substitutions and / or additions of one or more residues.
  • a synthetic variant comprises 75% primary sequence homology with the sequence SEQ ID NO: 2, more preferably at least 85%.
  • the fragments or variants may further include added heterologous regions or chemical, enzymatic, immunological, etc. modifications. Such modifications may allow, for example, facilitate the production or purification of part of lactoferrin, improve its stability, increase its activity, etc.
  • lactoferrin gene generally refers to any portion of the genome encoding lactoferrin as defined above.
  • gene construct or “recombinant nucleic acid” generally refers to any nucleic acid encoding a polypeptide as defined above. It may be a DNA or an RNA, for example a genomic DNA, a cDNA, an mRNA, a synthetic or semi-synthetic DNA. These can be obtained by cloning from libraries or plasmids, or by synthesis, or by any other technique known to those skilled in the art.
  • the gene construct is a nucleic acid comprising the sequence SEQ ID NO: 1, a fragment thereof or any sequence hybridizing with one of the sequences mentioned above in moderate stringency conditions and coding part of lactoferrin.
  • Moderate stringency conditions are well known to those skilled in the art. These are, by way of example, the following conditions: incubation at 42 ° C. for 12 hours in medium comprising 50% formamide, 5% SSPE, 5% Denhardt's solution, 0.1% SDS.
  • the nucleic acid used for the recombination (recombinant nucleic acid) or the gene construct comprises, in addition to a region encoding a part of lactoferrin, one or more regions of regulation of transcription, typically a transcriptional promoter and / or terminator. .
  • These regulatory regions are generally chosen according to the cellular host considered. Preferentially, they are functional regulatory regions in mammalian cells.
  • constitutive or regulated promoters inducible or noninducible, tissue-selective or ubiquitous, strong or weak, as for example promoters of viral origin (for example: CMV, LTR, SV40) or originating from cellular genes.
  • the gene construct used is a nucleic acid comprising the sequence SEQ ID NO: 1, a fragment thereof or any sequence hybridizing with it under conditions of moderate stringency.
  • the gene construct used is a nucleic acid comprising a sequence encoding a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 2 or a fragment thereof, operably linked to a transcriptional promoter or a fragment thereof.
  • the invention further relates to an antibody directed against all or part of a peptide or polypeptide as described above.
  • the cells may be any cultivable cell, a prokaryotic host cell, a eukaryotic, preferably mammalian, for example human host cell. They may be primary cells or established lines.
  • the host cells are endothelial cells, lymphoid cells, follicle mantle plasmon-like cells, especially those which have a restriction of the expression of lambda light chains, etc.
  • Other mammalian cells that may be used may be embryonic cells or cells such as CHO cells, fibroblasts, Vero, etc.
  • the host cells are prokaryotic cells, in particular bacteria chosen, for example, from E. coli BL21 and DH5 ⁇ , or yeasts. It can also be a plant cell or an insect cell.
  • a particular object of the invention therefore resides in a genetically modified cell, characterized in that it comprises a recombinant nucleic acid encoding a portion of lactoferrin, preferably a portion of SEQ ID NO: 3.
  • the recombinant nucleic acid present in the cells allows these cells to express all or part of the lactoferrin, or to over-express all or part of such a receptor, when the cells already possess a basal level of expression.
  • the nucleic acid generally allows the cells to over-express lactoferrin, i.e.
  • the term over-expression generally denotes an expression increased by a factor of 2, more generally by a factor of 3, ideally by a factor of at least 5.
  • the cells are preferably mammalian cells, in particular human cells. It is understood that cells of other species may be used, such as for example mouse, rat, monkey, hamster, etc. cells.
  • a particular object of the present invention therefore relates to a cell, in particular an endothelial or lymphoid cell or a bacterium E. coli, genetically modified overexpressing all or part of lactoferrin, preferably all or part of SEQ ID NO: 2.
  • genetically modified term indicates that the cell (or an ancestor thereof) has been modified to contain a recombinant nucleic acid encoding said receptor.
  • the recombinant nucleic acid or the gene construct comprises, in addition to a region coding all or part of the lactoferrin, one or more regulatory regions of the transcription, typically a transcriptional promoter and / or terminator, as defined above.
  • the nucleic acid may be present or incorporated into a plasmid, viral vector, etc.
  • Expression vectors that may be used in the context of the invention are, for example, Gateway® T7 and pRSET vector systems compatible with a prokaryotic expression system.
  • the nucleic acid can be integrated into the genome of the cells or remain in extrachromosomal form (replicative or not).
  • the subject of the invention is also a method for preparing recombinant cells expressing all or part of lactoferrin, in particular an endothelial cell, a lymphoid cell, a genetically modified bacterium overexpressing all or part of the lactoferrin or a recombinant nucleic acid as defined above.
  • the method of the invention comprises, in general, the introduction of a recombinant nucleic acid as defined above coding all or part of the lactoferrin in a host cell.
  • the host cells may be any cell population as described above, it is preferably cells as mentioned above, in particular PBMC (Peripheral Blood Mononuclear CeIIs) or DMVEC (Dermal Microvascular Epithelial CeIIs) cell lines. .
  • PBMC Peripheral Blood Mononuclear CeIIs
  • DMVEC Demal Microvascular Epithelial CeIIs
  • the recombinant cells are obtained by transfection of host cells by means of a plasmid vector comprising a gene construct comprising the sequence SEQ ID NO: 1, or a fragment thereof.
  • the transfection is carried out in the presence of a second gene construct encoding a selection or resistance gene, and the cells are selected on the basis of the expression of said selection or resistance gene as well as the coding nucleic acid. all or part of lactoferrin.
  • the term "transfection” generally refers to any technique allowing the transfer of a nucleic acid into a cell. It can be chemical, physical, biological, etc. By way of example, mention may be made of electroporation, precipitation with calcium phosphate, the use of agents facilitating transfection, such as, for example, lipids, polymers, peptides, etc., or the use of techniques. such as the "gun gene", projectile use, bombing, etc.
  • the nucleic acid is introduced into the cells by infection using a viral vector comprising said nucleic acid.
  • the introduction is carried out using a recombinant virus comprising the recombinant nucleic acid encoding all or part of the lactoferrin, preferably all or part of SEQ ID NO: 2, and, where appropriate, a selection or resistance gene ("infection").
  • recombinant viruses may be employed, for example retroviruses, adenoviruses, AAVs (Adenovirus Associated Viruses), herpesviruses, modified baculoviruses, and the like.
  • retroviruses for example retroviruses, adenoviruses, AAVs (Adenovirus Associated Viruses), herpesviruses, modified baculoviruses, and the like.
  • the preferred recombinant viruses are adenoviruses and recombinant retroviruses.
  • a particular object of the present invention resides in a population of cells comprising a recombinant nucleic acid encoding all or part of lactoferrin, preferably all or part of SEQ ID NO: 2.
  • the preparation (eg, transfection, infection) of the cells is carried out with a gene construct which comprises, in addition to a region encoding an active peptide, for example all or part of SEQ ID NO: 2, a transcription regulation region or regions, typically a transcriptional promoter and / or terminator.
  • a transcription regulation region or regions typically a transcriptional promoter and / or terminator.
  • they are functional regulatory regions in mammalian cells.
  • promoters inducible or noninducible, tissue-selective or ubiquitous, strong or weak, such as, for example, promoters of viral origin (for example: 11, CMV, LTR, SV40 ) or from cellular genes.
  • the preparation (eg, transfection) of the cells is carried out with a gene construct according to the invention which comprises, in addition to a region encoding a active peptide, ie, a peptide capable of binding a herpesvirus, for example a fragment of SEQ ID NO: 2.
  • the preparation is carried out with a sequence comprising the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the host cells may be brought into contact with the gene encoding all or part of the lactoferrin or the recombinant nucleic acid or the vector or the virus under any appropriate condition, then the recombinant cells are recovered.
  • the contacting can be carried out in any suitable support and in any culture medium appropriate to the cell type (for example: DMEM, RPMI 1, etc.).
  • the stable cell lines in culture are selected.
  • Preferred genetically modified cells overexpressing the gene encoding all or part of lactoferrin are stable lines.
  • the present invention also relates to methods for identifying, selecting, characterizing or optimizing compounds, mimicking or promoting the action of the peptides or polypeptides according to the invention, capable of reducing
  • the subject of the present invention is a
  • Method for identifying, selecting, characterizing or optimizing compounds capable of modulating virus infection characterized in that (i) contacting a test compound with cells (preferably eukaryotic cells, for example lymphoid or endothelial, for example from
  • PBMC or lymphoid lineages DMVEC as defined above
  • the viral infection of said cells is measured or determined, and (iii) preferably, this infection is compared with the infection of the same cells in the absence of said test compound.
  • the viral infection is preferably caused by a herpesvirus, for example by HSV-I, HSV-II, CMV or HHV, in particular HHV-8.
  • the cells are cells as described above (on-) expressing all or part of the lactoferrin, preferably all or part of SEQ ID NO: 2.
  • the measurement of the viral infection can be carried out by determining the expression of at least one specific marker of the virus responsible for the infection, preferably a marker selected from the group comprising, for example: K8 surface antigens .1 as well as latent nuclear antigens LANA.
  • the invention also relates to a method for the selection, identification or characterization of compounds mimicking the action of a peptide according to the invention, ie, capable of binding a herpesvirus, for example HHV-8, which comprises: contacting a test compound with said herpesvirus, in the presence of a portion of the lactoferrin, preferably all or part of the lactoferrin fragment corresponding to SEQ ID NO: 2, and - determining the displacement of the binding said part of lactoferrin to said herpesvirus by said test compound.
  • the methods of the invention are remarkable in that they make it possible to identify compounds capable of reducing viral infection, such as compounds constituting mimetics of an active fragment of lactoferrin, ie, of part of the Lf capable of binding a herpesvirus, eg, the peptide of sequence SEQ ID NO: 2.
  • compounds capable of reducing viral infection such as compounds constituting mimetics of an active fragment of lactoferrin, ie, of part of the Lf capable of binding a herpesvirus, eg, the peptide of sequence SEQ ID NO: 2.
  • compounds capable of reducing viral infection such as compounds constituting mimetics of an active fragment of lactoferrin, ie, of part of the Lf capable of binding a herpesvirus, eg, the peptide of sequence SEQ ID NO: 2.
  • the method of the invention makes it possible: to identify compounds capable of reducing the cellular penetration of the virus and constituting mimetics or agonists of lactoferrin,
  • activator e.g. agonist, or inhibitor, e.g., antagonist, lactoferrin
  • inhibitor e.g., antagonist, lactoferrin
  • activator is a compound that activates or inhibits the binding of said lactoferrin to herpesvirus, particularly to HHV-8, respectively.
  • the test compound can be of varied origin and nature. It can be isolated compounds, biological extracts, organic or inorganic molecules, molecules banks (synthetic, peptides, nucleic acids, etc.) or microorganisms, etc.
  • the test compound can be put in contact with the nucleic acid construct or the cells on (or in) any suitable support and in particular on a plate, in a tube or a flange, a membrane, etc. Generally, the contacting is performed in a multiwell plate which allows to conduct, in parallel, many and varied tests.
  • the typical carriers are microtiter plates and more particularly plates of 96 or 384 wells (or more). Depending on the support and the nature of the test compound, varying amounts of cells may be used in the implementation of the described methods.
  • 3 to 10 6 cells are contacted with one type of test compound, in a suitable culture medium, and preferably between 10 4 and 10 5 cells.
  • the amount (or concentration) of the test compound can be adjusted by the user according to the type of compound (its toxicity, its cell penetration capacity, etc.), the number of cells, the length of the incubation period, etc.
  • the cells are exposed to amounts of test compounds ranging from 1 nM to 1 mM. It is of course possible to test other concentrations without deviating from the present invention.
  • Each compound can be further tested in parallel at different concentrations.
  • different adjuvants and / or vectors and / or products facilitating the penetration of the compounds into the cells can, in addition, be used if necessary.
  • the contact may be maintained for example between a few minutes and several hours or days, particularly between 5 and 72 hours, generally between 12 and 48 hours.
  • the invention further relates to a new therapeutic approach which consists in blocking viral infection at an early stage by inhibiting the adhesion of herpesviruses to their target cells.
  • An object of the invention thus resides in the use of a part of lactoferrin, preferably all or part of the sequence SEQ ID NO: 2, or of a compound mimicking its action, identified, selected, characterized or optimized according to a process described above for the preparation of a composition or a medicament intended for the implementation of a therapeutic or prophylactic treatment method for the human or animal body, in particular for the curative or preventive treatment of induced pathologies by a viral infection, including cancer such as Kaposi's sarcoma (SK), primary effusion lymphomas (PEL), Castleman's disease (CDD), etc.
  • SK Kaposi's sarcoma
  • PEL primary effusion lymphomas
  • CDD Castleman's disease
  • Another object of the invention is a process for the preparation of a medicament comprising (i) a step of selecting a compound capable of decreasing the viral infection, as described above, and (ii) the setting in contact with a selected compound, or an analogue thereof, with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Another object of the invention resides in a process for preparing an active compound on the viral infection, comprising (i) a step of selecting a compound capable of reducing the viral infection, as described above and (ii) synthesizing the selected compound, or an analogue thereof.
  • Another aspect of the invention relates to the use of active compounds for the implementation of methods of therapeutic or prophylactic treatment of the human or animal body. These include compounds as defined above capable of mimicking the action of an active fragment of lactoferrin, Le., Of a fragment capable of binding a herpesvirus, eg, all or part of the fragment of sequence SEQ ID NO: 2.
  • An object of the invention also relates to a pharmaceutical composition, for example a composition capable of preventing or treating infection caused by a herpesvirus, comprising a peptide or polypeptide according to the invention and a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • Another subject of the invention relates to the use of a peptide or polypeptide according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition intended to prevent or treat an infection caused by a herpesvirus, such as for example HSV-I, HSV-II, CMV or HHV, in particular HHV-8.
  • a herpesvirus such as for example HSV-I, HSV-II, CMV or HHV, in particular HHV-8.
  • the peptide or polypeptide expressed or present in the pharmaceutical composition according to the invention recognizes a herpesvirus, such as for example HSV-I, HSV-II, CMV or HHV, in particular HHV-8.
  • a herpesvirus such as for example HSV-I, HSV-II, CMV or HHV, in particular HHV-8.
  • Another subject of the invention relates to a method for treating an infection caused by a herpesvirus, chosen for example from the HSV-I, HSV-II, CMV and HHV viruses, in particular HHV-8, comprising the administration, to a subject liable to present such an infection, a pharmaceutical composition according to the invention comprising a peptide or polypeptide according to the invention and a pharmaceutically acceptable adjuvant.
  • a herpesvirus chosen for example from the HSV-I, HSV-II, CMV and HHV viruses, in particular HHV-8
  • treatment or “treating”, within the meaning of the invention, include therapeutic and prophylactic treatments.
  • the composition can be used in the early stages of the disease, before the infection or its first signs, or at a later stage of the disease.
  • Another subject of the invention concerns a kit comprising said peptide or polypeptide according to the invention and another component intended to detect the complex comprising this peptide or polypeptide and at least one antibody specifically fixed on it.
  • the component in question may be an anti-antibody or other antibody directed against said peptide or polypeptide according to the invention.
  • the component and / or the peptide or polypeptide according to the invention can be labeled.
  • Figure 1 illustrates the binding of the entire HHV-8 virus to human saliva.
  • biotinylated HHV-8 probes for 2 hours at room temperature. Bound biotinylated HHV-8 particles were detected using a peroxidase-streptavidin complex as described in the Materials and Methods section. The results correspond to
  • VHSK (lines 2-9) were separated on 10% SDS-PAGE gel and transferred to a nitrocellulose membrane as described in the Materials and Methods section. Proteins were detected by staining with Coomassie blue
  • Line 1 contains molecular weight markers. The arrows indicate the position of the 78 kDa band.
  • Figure 2 shows the identification of the protein of interest after two-dimensional electrophoresis (2DE) separation.
  • Human clarified saliva 300 mg protein was separated in a first dimension by IEF in a pH range of 10 to 3. The second dimension was carried out by SDS-PAGE 10%. (A) the proteins were detected _
  • HHV-8 binding activity was detected using biotinylated HHV-8 as described in the material and methods part.
  • Line 1 molecular weight markers
  • Lane 2 sample separated only by SDS-PAGE (1 DE) (50 ⁇ g protein);
  • line 3 sample after 2DE.
  • the arrow indicates the spot that has been taken by MALDI-ToF.
  • FIG. 3 illustrates the MALDI-TOF spectrum obtained for the spots of interest. Masses of monoisotopic peptides were used to search the protein databases to identify and identify the spot corresponding to the protein of interest.
  • Figure 4 illustrates the binding of HHV-8 to human lactoferrin (Lfh) after proteolytic cleavage.
  • LfH was treated with endoproteinase V8.
  • Untreated (line 2) and treated (line 3) samples were analyzed on a 10-20% SDS-Tricine gel and transferred to a nitrocellulose membrane as described in the Materials and Methods section. Protein and peptide fragments were detected by staining with Coomassie blue (A). Binding activities were detected using biotinylated ConA plant lectin (B) and biotinylated HHV-8 (C).
  • Lanes 1a and 1b correspond to Mark12 molecular weight standards (Invitrogen) and biotinylated molecular weight standards (Sigma), respectively.
  • the arrows indicate the position of the 8 kDa peptide. * corresponds to a non-specific recognition.
  • Salivary samples were collected from 76 unstimulated individuals in a sterile plastic tube and diluted 1: 2 with cold, sterile phosphate buffer (PBS). The salivary samples are clarified by centrifugation at 7000 ⁇ g for 20 min at 4 ° C. and the supernatant is stored at -20 ° C. before analysis. Blood samples (20 ml) are collected on EDTA tube and centrifuged at 2500 xg for 30 min on Ficoll Hypaque. The plasma is aliquoted in a 15 ml tube and stored at -80 ° C. until it is analyzed.
  • PBS cold, sterile phosphate buffer
  • the lymphoblastoid cell line BC-3 (ATCC CRL-2277) 35 is routinely maintained in RPMI medium supplemented with 2 mM glutamine, serum inactivated fetal calf 10%, antibiotics (Sigma Chemical Co., St. Louis , Mo), in an incubator at 37 ° C in an atmosphere enriched with 5% CO 2 .
  • the culture supernatant is centrifuged at 2,000 xg for 10 min to remove cells and cell debris.
  • the supernatant containing the virus is filtered through a 0.45 ⁇ m filter and centrifuged at 46,000 xg for 3 h at 4 ° C.
  • the pellet containing the HHV-8 particles is taken up in cold, sterile PBS and centrifuged again under the same conditions.
  • the HHV-8 viral particles are taken up in 2 ml of cold and sterile PBS to obtain the concentrated viral preparation which is quantified by the use of real-time PCR according to the method described below.
  • the characteristic value obtained from 1.1 liters of BC-3 cell culture is 3.4. 4 copies of HHV-8 DNA / ml concentrated viral preparation before purification according to the method described below.
  • HHV-8 Purification and marking of HHV-8.
  • a continuous gradient of 24 to 42% of Nycodenz in 1 mM potassium phosphate is carried out according to the method described by Akula et al.
  • the HHV-8 particles are purified by ultracentrifugation at 70,000 xg for 2 h at 4 ° C in a Backman SW28 rotor according to the method described by Lake and Hutt-Fletcher.
  • the fractions (500 ⁇ l) are collected from the top of the tube and analyzed for the presence of virus particles by the use of real-time PCR.
  • the fractions containing the viral particles are collected at the interface 34-36% of the gradient, collected and dialysed against PBS to remove Nycodenz.
  • the characteristic value obtained is 2.8.
  • Biotinylated HHV-8 is prepared according to the method described by Harlow and Lane. Briefly, the purified virus preparation is incubated at room temperature for 4 h with stirring with biotin-NHS in a ratio of 250 ⁇ g of biotin-NHS per 1 mg of protein. The reaction is stopped by the addition of 1 M NH 4 Cl. The excess of biotin is removed by dialysis against PBS at 4 ° C. The biotinylated virus preparation is stored at -80 ° C. before use.
  • Quantitative PCR in real time To determine the number of viral DNA molecules in the HHV-8 preparations, the real-time quantitative PCR technique is performed according to the method described by Lallemand et al. Briefly, 50 ⁇ l of each fraction are incubated at 37 ° C. for 1 hour in the presence of 100 units of DNase to remove virus particles devoid of DNA. The reaction is stopped by incubation at 65 ° C for 10 min. The DNA is extracted using the QIAamp Blood kit (Qiagene SA, Courtaboeuf, France) and subjected to the real-time quantitative PCR test combining the simultaneous quantification of the HHV-8 DNAs and the albumin gene.
  • QIAamp Blood kit Qiagene SA, Courtaboeuf, France
  • test is performed by using the fluorescense TaqMan methodology on the ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems PE, Forster City, California, USA). Negative controls are included in all tests and analyzed in parallel, they correspond to two reactions that do not contain DNA.
  • Antibodies to latent nuclear antigens (LANA) of HHV-8 are detected in the sera of individuals by immunofluorescence assay (IFA) on the BC-3 lymphoblastoid cell line.
  • IFA immunofluorescence assay
  • the IFA assay is performed by diluting the test serum 1: 100 th according to the method described by Milliancourt et al ..
  • a double-blind reading is performed and the samples showing specific reactivity at a dilution of 1: 100 th are considered positive for anti-HHV-8 antibodies.
  • Direct contact test The binding activity of HHV-8 can be detected by the use of a viral direct contact test (or virus overlay assay, VOA).
  • the saliva is diluted in 50 mM carbonate-bicarbonate buffer, pH 9.6 at a concentration of 25 ⁇ g protein / well and immobilized on 96-well polystyrene plate for 18 h at 37 ° C.
  • the wells are washed 3 times with 0.2 ml of PBS containing 0.05% Tween 20 (PBS-Tween).
  • the biotinylated HHV-8 virus (0.1 ml of a concentration ranging from 0.1 to 10 ⁇ g / ml in PBS-Tween) is added to the wells and incubated at room temperature for 1 hour.
  • the wells are washed 3 times with 0.2 ml of PBS-Tween.
  • streptavidin-peroxidase complex (0.1 ml at 0.5 ⁇ g / ml in PBS-Tween) is added to the wells and incubated at room temperature for 1 h. After washing, the bound peroxidase is detected by the chromogenic substrate 2,2'-azino-bis (3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic acid) in 50 mM sodium citrate (pH 5.0).
  • salivary proteins 50 ⁇ g are separated by 10% polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions (SDS-PAGE) and transferred to a nitrocellulose membrane (0, 45 ⁇ m) according to the method described by Towbin et al.
  • the membrane is saturated for 18 h at 4 ° C in PBS buffer containing 5% BSA, 0.05% Tween-20 (PBT buffer).
  • Binding activity is detected by incubating the membrane with 20 ml of PBT containing biotinylated HHV-8 (0.1 ⁇ g / ml) for 2 h at room temperature and with 2 ml of PBT containing HH V-8 particles.
  • HHV-8 particles are detected by incubation of the membrane with the peroxidase-streptavidin complex (20 ml at 0.5 ⁇ g / ml in PBT) for 1 h at room temperature. After washing, the peroxidase activity is detected by the use of the 3,3'-diaminobenzidine substrate in the presence of CoCl 2 and H 2 O 2 .
  • the unlabeled HHV-8 particles are detected by incubation of the membrane with the mouse monoclonal antibody directed against the envelope glycoprotein K8.1A / B (10 ⁇ g / ml) for 18 h at room temperature.
  • the membrane is washed 3 times in PBT and the mouse antibodies are detected by incubating the membrane for 45 min at room temperature with the peroxidase-coupled rabbit polyclonal antibodies directed against mouse IgG. After washing, the peroxidase activity is detected as described above. Negative controls using peroxidase-streptavidin conjugate, anti-K8.1 antibody and anti-IgG alone are performed in parallel.
  • the IPG strip is equilibrated for 30 min in the solution [6 M urea, 30% glycerol (wt / vol), 0.05 M Tris-HCI, 2% SDS (wt / vol), bromophenol blue 0.002%, 100 mM DTT] and for 30 min in the solution [6 M urea, 30% glycerol (wt / vol), 0.05 M Tris-HCI, 2% SDS (wt / vol), 0.002% bromophenol blue 400 mM iodoacetamide].
  • the IPG strip is then deposited on the SDS-PAGE 10% gel. Two gels are developed in parallel for 6 hours at 70 mA at constant intensity.
  • the proteins are detected by staining with silver nitrate without the glutaraldehyde step.
  • the spot of interest is detected in the second gel by the use of the VOA test.
  • the silver nitrate stained gel and the nitrocellulose membrane are juxtaposed and the spot of interest is taken from the gel.
  • Rapid evaporating matrix films are produced according to the method described by Vorm et al. by the use of a saturated solution of 4-hydroxy- ⁇ -cyanocinnamic acid (Sigma, St. Louis, MO) diluted in acetone.
  • the spot of the protein of interest is subjected to tryptic digestion.
  • the peptide solution is deposited on the matrix film and dried at room temperature.
  • the deposited sample is washed with pure water and inserted into the MALDI mass spectrophotometer (Applied Biosystems, Voyager DE super STR) equipped with a N 2 laser at 337 nm.
  • the internal calibration of the spectra is carried out by the use of self-digestion of porcine trypsin.
  • the peptide masses are compared in the SWISS-PROT and Genpept databases.
  • the purified commercial Lfh (500 ⁇ g, Sigma) is denatured at 100 ° C. for 5 min in the digestion buffer (20 mM sodium phosphate, 50 mM EDTA, 1% SDS) and degraded by PNGase F (N-glycanase).
  • PNGase F N-glycanase
  • recombinant Flavobacterium meningosepticum in Escherichia coli 80 mU, Prozyme, Inc., San Leandro, CA
  • the enzymatic reaction is stopped by mixing the sample with the electrophoresis sample buffer and denaturation at 100 ° C. for 3 min.
  • Deglycosylated Lfh is tested for its ability to be recognized by biotinylated HHV-8 in the direct contact test.
  • the efficiency of deglycosylation is controlled by the decrease in apparent molecular weight determined after separation by Coomassie blue electrophoresis gel and by reaction with the plant lectin RCA-I (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Calif. .) in a direct contact test. Briefly, deglycosylated and non-deglycosylated Lfh are separated by electrophoresis and transferred to nitrocellulose membrane.
  • HEPES-BSA 0.5% BSA, 0.15 M NaCl, CaCl 2 0.1 mM, MnCl 2 .4H 2 O 0.01 mM HEPES-Na + 0.01 M (pH 7.5)]
  • HEPES-BSA buffer
  • the binding activity is detected by incubation of the membrane for 1 h at room temperature with 20 ml of HEPES-BSA containing 0.2 ⁇ g / ml of RCA plant lectins. Biotinylated I and ConA. The excess of plant lectin is removed by 3 washes of 15 min each with 20 ml of HEPES-BSA.
  • the bound biotinylated plant lectins are detected by incubation for 1 hour at room temperature of the membrane with the peroxidase-streptavidin complex (20 ml at 0.5 ⁇ g / ml). The membrane is washed 3 times and the peroxidase activity is detected as described above.
  • the purified commercial Lfh (500 ⁇ g) is digested with Staphylococcus aureus V8 GIu-C endoprotease (50 ⁇ g, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) in 25 mM NH 4 CO 3 reaction buffer (pH 7.8). in a final volume of 250 ⁇ l by incubation at 27 ° C. for 18 h.
  • the enzymatic reaction is stopped by mixing the sample with the electrophoresis sample buffer and denaturation at 100 ° C. for 3 min.
  • the peptide fragments obtained are separated by 10-20% SDS-Tricine gradient gel electrophoresis, transferred onto nitrocellulose membrane and PVDF.
  • the peptide fragments transferred to PVDF are detected by staining with Coomassie blue, the peptides transferred to nitrocellulose are tested for their ability to be recognized by HHV-8 in the direct contact test.
  • the glycopeptides are detected by reaction with the ConA biotinylated plant lectin as described above.
  • N-terminal end is carried out on 20 ⁇ g of peptide mixture deposited per lane. After electrophoretic separation, the peptide mixture is transferred onto a PVDF membrane in the buffer [10% methanol, 10 mM 3- (cyclohexylamino) -1-propanesulfonic acid (pH 11.0)]. Peptides are detected by staining with 0.1% Coomassie Blue (wt / vol) in 50% methanol to visualize the 8 kDa band which is then cut. Several bands are taken from the same membrane and the material is subjected to the mircosequencing by the Edman method in the 494HT protein sequencer (Procise Applied Biosystems, Foster City, CaMf.).
  • Integrin a3b1 (CD 49c / 29) is a cellular receptor for Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV / HHV-8) entry into the target cells.
  • CeIl 108 407-419.
  • Herpesvirus-like DNA sequences in non-AIDS Kaposi's sarcoma J. Infect. Dis.
  • Kedes D.H., E. Operskalski, M. Busch, R. Kohn, J. Flood, and D. Ganem. 1996.
  • the seroepidemiology of human herpes virus (Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus): distribution of infection in KS. Nat. Med.
  • Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus human herpesvirus 8

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Abstract

La présente invention concerne de nouveaux peptides dérivés de la lactoferrine, des anticorps et des compositions pharmaceutiques les comprenant ainsi que des kits et des méthodes de criblage de molécules actives, en particulier de molécules ayant une activité dans le traitement des infections provoquées par un herpesvirus. L'invention se rapporte également à des constructions génétiques, cellules et compositions utiles pour la mise en œuvre de telles méthodes de criblage, par exemple des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer une partie de la lactoferrine, ainsi que les procédés de préparation desdites cellules. L'invention peut être mise en œuvre pour l'identification de composés actifs ou utilisables comme têtes de séries pour le développement de médicaments actifs pour la prise en charge de pathologies provoquées par une infection virale.

Description

NOUVEAUX DERIVES PEPTIDIQUES, COMPOSITIONS ET UTILISATIONS DANS UN TRAITEMENT THERAPEUTIQUE DE L'INFECTION PAR UN HERPESVIRUS
La présente invention concerne de nouveaux peptides dérivés de la lactoferrine (Lf), des anticorps et des compositions pharmaceutiques les comprenant ainsi que des kits et des méthodes de criblage de molécules actives, en particulier de molécules ayant une activité dans le traitement des infections provoquées par un herpesvirus. L'invention se rapporte également à des constructions génétiques, cellules et compositions utiles notamment pour la mise en œuvre de telles méthodes de criblage, par exemple des cellules génétiquement modifiées pour surexprimer une partie de la lactoferrine, ainsi que les procédés de préparation desdites cellules. L'invention peut être mise en oeuvre pour l'identification de composés actifs ou utilisables comme têtes de séries pour le développement de médicaments destinés à la prise en charge de pathologies provoquées par une infection virale, un cancer (par exemple le sarcome de Kaposi), les lymphomes primaires d'effusion (PEL), la maladie de Castleman (MCD), etc.
L'invention est basée notamment sur la mise en évidence et la caractérisation du rôle de la lactoferrine dans le mécanisme d'infection et en particulier d'adhésion cellulaire des herpesvirus et notamment sur la capacité de cette protéine, lorsqu'elle est surexprimée, de sensibiliser les cellules à l'infection virale.
L'invention repose sur l'identification de fragments de la lactoferrine capables de lier les herpesvirus et également sur l'obtention de vecteurs particuliers permettant l'expression d'une partie de la lactoferrine, de préférence de tout ou partie de la séquence localisée dans la portion Ala606-Glu679 de la forme mature de la lactoferrine humaine (Lfh), ainsi que sur des lignées cellulaires génétiquement modifiées, contenant le plasmide d'expression d'une partie de la séquence peptidique de la lactoferrine.
La lactoferrine (protéine de 78 kDa représentant moins de 5% des protéines de la salive) est une protéine de liaison du fer qui faciliterait l'absorption de ce dernier et régulerait la croissance et la différenciation cellulaire. Lf est par ailleurs connue pour interagir dans la salive avec des microorganismes et interviendrait dans la lutte antimicrobienne. L'activité antimicrobienne de la lactoferricine, dérivée de la lactoferrine, suscite beaucoup d'intérêt. Récemment, une activité anïï-Helicobacter pylori a été démontrée chez l'homme après ingestion de composants de yaourt.
Les inventeurs se sont plus particulièrement intéressés à l'action anti-virale potentielle de la lactoferrine laquelle est capable de lier de nombreux herpesvirus, notamment le virus HSV-I1 le virus HSV-II, le cytomégalovirus (CMV), les virus HHV, en particulier le virus HHV-8, etc.
II existe de façon très inhabituelle pour un herpesvirus une hétérogénéité de la diffusion de l'HHV-8 avec une prévalence faible de 0 à 5% en Europe du nord, pouvant s'élever jusqu'à 30%, dans les zones du sud de la méditerranée où la proportion de Sarcome de Kaposi (SK) est élevée. Le taux d'infection peut dépasser les 50% en Afrique tropicale où l'on retrouve les formes endémiques d'un SK très agressif. De plus, au sein d'une population VIH+, l'infection par le virus HHV-8 est significativement plus importante et est déterminante dans l'apparition du SK. En effet, 30-40% d'une population homosexuelle masculine VIH+ est infectée par le HHV-8 aux USA et en Europe du Nord où l'incidence de l'infection par HHV-8 dans la population générale est faible.
L'herpès virus 8 humain (HHV-8 ou KSHV) est un rhadinovirus appartenant à la famille des Herpesviridae et à la sous-famille des gammaherpesvirinae. Il a été récemment caractérisé comme étant le γ2-herpes virus 8. Le HHV-8 est appelé également KSHV pour Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus à cause de la détection de son ADN dans toutes les formes épidémiologiques de SK. Il est constitué d'un génome d'ADN double-brins dont la séquence nucléotidique (environ 140 kb) a été déterminée à partir de biopsies de SK et PEL (Genbank n°
KSU75698).
Le HHV-8 est ainsi communément détecté dans toutes les formes épidémiologique de SK mais également dans les lymphomes primaires d'effusion (PEL) ou lymphome des séreuses et dans certaines formes de syndromes lymphoprolifératifs multifocaux identifiés sous le nom de maladie de Castleman (MCD).
Le HHV-8 humain infecte les cellules lymphoïdes et endothéliales. In vivo, on le retrouve dans les « spindle cells » caractéristiques du SK, dérivant de cellules endothéliales et, dans le cadre du MCD, dans les cellules de type plasmoblastiques du manteau folliculaire qui présentent une restriction de l'expression des chaînes légères lambda.
Le mode de transmission du HHV-8 fait l'objet de nombreuses questions et la transmission par la voie sanguine apparaît, à ce jour, peu probable ou faible. La forte prévalence du HHV-8 dans les populations homosexuelles masculines, suggère un mode de transmission par voie sexuelle. Cependant, la prévalence également importante de SK chez les enfants provenant de régions où l'infection par le HHV-8 est endémique, indique une possible autre voie de transmission par contact rapproché, principalement par la salive. En effet, des études sur une population présentant un SIDA associé à un SK ont montré que le virus HH V-8 est plus communément retrouvé dans la salive (en particulier au niveau de l'oropharynx) que dans les sécrétions génitales avec une charge virale salivaire élevée et qu'une exposition à de la salive infectée par le HHV-8 pouvait être un facteur de risque dans la transmission de ce virus. Les inventeurs ont récemment démontré, sur une population VIH+ et VIH- avec ou sans SK, qu'il existait une compartimentalisation de l'infection par HHV-8 orale et sanguine avec un niveau d'infection et de production virale différent entre ceux-ci. La présence importante de virus HHV-8 dans la salive n'est pas corrélée avec une charge virale élevée dans les cellules mononuclées sanguines (PBMCs) ni même avec l'état d'avancement du SK. En revanche, la charge virale retrouvée dans les cellules amygdaliennes est très proche de celle retrouvée dans les PBMCs, suggérant, comme indiqué ci-dessus, un possible rôle de réservoir et de relargage du virus de la zone oro-pharyngée.
A ce jour, les traitements antirétroviraux actifs sur le VIH ont transformé le pronostic du Sarcome de Kaposi, leur bénéfice dans la maladie de Castleman restant, dans la majorité des cas, faible. La charge virale HHV-8 reste inchangée et seule une chimiothérapie dont l'efficacité reste médiocre est actuellement envisageable pour le traitement de cette maladie. Si l'implication des groupements héparan sulfate (HS) semble être importante dans le processus de reconnaissance des cellules cibles par le HHV-8 et par les autres herpesvirus, notamment ceux mentionnés ci-dessus, la spécificité exacte de reconnaissance reste à déterminer et les récepteurs cellulaires membranaires in situ, impliqués dans l'adhésion desdits virus, ne sont pas connus. De même, les mécanismes moléculaires exacts responsables de la capture desdits virus dans la salive ne sont pas connus.
Les molécules de surface cellulaire ayant la propriété de lier les particules virales (récepteurs viraux), sont un des déterminants essentiels dans la sélection de l'hôte et de la cible tissulaire par les virus. L'infection d'une cellule par les herpesvirus fait intervenir deux étapes. La première est considérée comme une étape initiale permettant un attachement rapide du virus sur la membrane de la cellule cible. Elle est suivi par une seconde étape de liaison correspondant à une stabilisation et à un renforcement de l'attachement, conduisant à la pénétration du virus dans la cellule.
L'adhésion de HHV-8 se caractérise par une interaction initiale impliquant un premier récepteur sensible à l'héparine tandis que la pénétration du virus dans la cellule semble liée à un autre récepteur non inhibé par l'héparine. Le HHV-8 exprime plusieurs glycoprotéines d'enveloppe (les glycoprotéines gB, gH, gM, gL et K8.1 sont spécifiquement retrouvées dans le HHV-8), codées à partir de la séquence d'ADN de 137 kb qui contient de 80 à 90 cadres ouverts de lecture (ORF). Jusqu'à présent, seule l'implication de trois glycoprotéines de surface virales dans le processus de reconnaissance a pu être démontrée.
Les inventeurs ont pour la première fois mis en évidence la reconnaissance spécifique de la lactoferrine humaine par les herpesvirus et notamment par le HHV-8 et l'implication, dans ce processus, de la partie C-terminale non glycosylée de la glycoprotéine Lf, plus précisément d'un peptide non glycosylé de 8kDa (environ 75 acides aminés) localisé en position Ala606-Glu679 de la forme mature de la Lfh (Accession # AY137470.1). Un criblage préliminaire de 80 individus indique par ailleurs qu'environ 10% des individus non infectés par HHV-8 possèdent un Lf non reconnu par le virus suggérant la présence de modifications localisées sur le site de liaison, plus vraisemblablement de modifications post- traductionnelles.
Un premier objet de l'invention concerne donc un peptide ou polypeptide, caractérisé en ce qu'il présente une séquence partielle d'au moins 5, de préférence d'au moins 10 acides aminés successifs de la séquence localisée dans la portion Ala606-Glu679 de la forme mature de la lactoferrine humaine, encore plus préférentiellement d'au moins 20, d'une manière encore plus préférée d'au moins 30 ou d'au moins 40 acides aminés successifs, et d'au plus 650 acides aminés successifs, de préférence moins d'environ 200 acides aminés, avantageusement moins d'environ 100 acides aminés, encore plus avantageusement moins d'environ 60 acides aminés. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention le peptide ou polypeptide comprend moins de 45 acides aminés successifs de la séquence localisée dans la portion Ala606-Glu679 de la lactoferrine humaine.
L'invention concerne également un acide nucléique destiné à être utilisé pour la préparation par ingénierie génétique d'un tel peptide ou polypeptide comportant la séquence (SEQ ID NO : 1) :
gct aga agc tgc cat ctt gcc atg gcc ccg aat cat gcc gtg gtg tct cgg atg gat aag gtg gaa cgc ctg aaa cag gtg ctg ctc cac caa cag gct aaa ttt ggg aga aat gga tct gac tgc ccg gac aag ttt tgc tta ttc cag tct gaa ace aaa aac ctt ctg ttc aat gac aac act gag tgt ctg gcc aga ctc cat ggc aaa aca aca tat gaa
ou une séquence partielle de celle-ci comportant au moins 4 nucléotides, de préférence au moins 20 nucléotides. L'invention concerne également un vecteur comprenant tout ou partie d'un tel acide nucléique. Un aspect particulier de l'invention porte également sur des virus et bactéries recombinant(e)s ou sur des vecteurs viraux codant une partie de la lactoferrine, de préférence tout ou partie de SEQ ID NO :2, i.e., tout ou partie de :
arsch lamapnhaw srmdkveήk qvllhqqakf gmgsdcpdk fclfqsetkn llfndntecl arlhgktty.
Elle concerne par ailleurs un anticorps dirigé contre tout ou partie d'un peptide ou polypeptide tel que décrit ci-dessus.
Un autre objet de l'invention concerne un kit comportant un peptide ou polypeptide tel que décrit ci-dessus et permettant de diagnostiquer, chez un être humain ou un mammifère, une infection par un herpesvirus.
L'invention concerne en outre une nouvelle approche thérapeutique qui consiste à bloquer l'infection virale à un stade précoce en inhibant l'adhésion des herpesvirus sur leurs cellules cibles, par exemple par saturation desdits virus à l'aide d'une partie de la lactoferrine, de préférence à l'aide d'un peptide ou polypeptide tel que défini ci-dessus.
Un objet de l'invention concerne ainsi une composition pharmaceutique, par exemple une composition susceptible de prévenir ou traiter une infection provoquée par un herpesvirus, comprenant un peptide, un polypeptide, un acide nucléique ou un vecteur selon l'invention et un adjuvant acceptable sur le plan pharmaceutique.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un peptide, d'un polypeptide, d'un acide nucléique ou d'un vecteur selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter une infection provoquée par un herpesvirus, choisi par exemple parmi les virus HSV-I, HSV-II, CMV et HHV, en particulier HHV-8.
L'invention concerne également une méthode pour la sélection, l'identification ou la caractérisation de composés mimant l'action du peptide ou polypeptide selon l'invention de séquence SEQ ID NO : 2, i.e., capables de lier un herpesvirus, par exemple le HHV-8, qui comprend : la mise en contact d'un composé test avec ledit herpesvirus, en présence d'une partie de la lactoferrine, de préférence de tout ou partie du fragment de la lactoferrine correspondant à SEQ ID NO :2, et la détermination du déplacement de la liaison de tout ou partie de la lactoferrine audit herpesvirus par ledit composé test.
L'invention se rapporte aussi à des constructions génétiques, cellules et compositions utiles pour la mise en œuvre de telles méthodes de criblage ainsi que les procédés de préparation desdites cellules.
L'invention concerne également l'utilisation d'un composé identifié à l'aide d'une méthode telle que décrite ci-dessus pour la préparation d'une composition destinée à prévenir ou à traiter une infection provoquée par un virus, en particulier un herpesvirus, ou par une bactérie.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les inventeurs sont parties de la constatation que la grande variabilité antigénique des virus contraste avec la conservation des sites de liaison de ceux-ci sur leurs récepteurs ou sur les analogues desdits récepteurs, qui peuvent être utilisés comme cibles pour l'élaboration de nouveaux traitements.
Un premier objet de l'invention concerne donc un peptide ou polypeptide, caractérisé en ce qu'il présente une séquence partielle d'au moins 5, de préférence d'au moins 10 acides aminés successifs de la séquence localisée dans la portion Ala606-Glu679 de la forme mature de la lactoferrine humaine, encore plus préférentiellement d'au moins 20, d'une manière encore plus préférée d'au moins 30 ou d'au moins 40 acides aminés successifs et d'au plus 650 acides aminés successifs, de préférence moins d'environ 200 acides aminés, avantageusement moins d'environ 100 acides aminés, encore plus avantageusement moins d'environ 60 acides aminés. Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention le peptide ou polypeptide comprend moins de 45 acides aminés successifs de la séquence localisée dans la portion Ala606-Glu679 de la lactoferrine humaine. Les inventeurs ont constaté qu'un peptide ou polypeptide tel que défini ci-dessus était capable de réagir avec un herpesvirus et pouvait être utilisé dans le cadre de la préparation d'une composition pharmaceutique susceptible de prévenir ou traiter une infection provoquée par un herpesvirus.
L'invention concerne également un acide nucléique destiné à être utilisé pour la préparation par ingénierie génétique d'un tel peptide ou polypeptide comportant la séquence : SEQ ID NO : 1 ou une séquence partielle de celle-ci comportant au moins 4 nucléotides, de préférence au moins 20 nucléotides, encore plus préférentiellement au moins 100 nucléotides ou au moins 200 nucléotides.
L'invention propose également une nouvelle méthode de criblage de molécules actives, en particulier de molécules ayant une activité anti-rétrovirale (mimant l'action du peptide ou polypeptide selon l'invention de séquence SEQ ID NO :2), basées sur l'utilisation, en présence de tout ou partie de la lactoferrine, en particulier de tout ou partie de SEQ ID NO :2, d'un virus cible de cette dernière comme cible moléculaire.
Il s'agit d'une méthode pour la sélection, l'identification ou la caractérisation de composés inhibiteurs de l'infection virale, mimant l'action du peptide ou polypeptide selon l'invention, Le., capables de lier un herpesvirus, qui comprend : la mise en contact d'un composé test avec ledit herpesvirus, en présence d'une partie de la lactoferrine, de préférence de tout ou partie du fragment de la lactoferrine correspondant à SEQ ID NO :2, éventuellement, la détermination de la liaison dudit composé test avec ledit herpesvirus, et la détermination du déplacement de la liaison de la partie de la lactoferrine audit herpesvirus par ledit composé test, i.e. la mise en évidence de la capacité du composé test à rentrer en compétition ss/ec cette dernière pour lier ledit rétrovirus.
Une telle méthode est utile pour identifier des composés actifs dans le traitement des pathologies liées à une infection provoquée par un herpesvirus tels qu'un cancer tel que le SK (HHV-8), les lymphomes primaires d'effusion (PEL / HHV-8), la maladie de Castleman (MCD / HHV-8), etc.
L'invention concerne également une méthode pour la sélection, l'identification ou la caractérisation de virus capables de lier un peptide ou un polypeptide selon l'invention, qui comprend : la mise en contact d'un virus avec ledit peptide ou polypeptide ou avec la lactoferrine entière, la détermination de la liaison dudit virus avec ledit peptide ou polypeptide ou avec ladite lactoferrine entière.
L'invention se rapporte aussi à des constructions génétiques, cellules (par exemple des cellules endothéliales ou des cellules de type plasmoblastique), et compositions utiles pour la mise en œuvre de telles méthodes de criblage ainsi que les procédés de préparation desdites cellules.
Lactoferrine
La présente invention repose notamment sur l'identification du rôle de la lactoferrine dans le processus d'infection virale, sur la caractérisation des régions actives de la lactoferrine et des mécanismes qui sous-tendent le rôle de cette dernière, ainsi que sur l'exploitation de cette molécule dans un but thérapeutique.
Au sens de la présente invention, la lactoferrine désigne un polypeptide comprenant la séquence primaire en acides aminés SEQ ID NO : 3, ou un fragment ou variant fonctionnel de celle-ci.
Séquence SEQ ID NO :3 : mklvflvllf Igalglclag rrrrsvqwct vsqpeatkcf qwqmmrrvr gppvscikrd spiqciqaia enradavtld ggfiyeagla pyklrpvaae vygterqprt hyyavawkk ggsfqlnelq glkschtglr rtagwnvpig tlrpflnwfg ppepieaava rffsascvpg adkgqfpnlc rlcagtgenk cafssqepyf sysgafkclr dgagdvafir estvfedlsd eaerdeyell cpdntrkpvd kfkdchlarv pshavvarsv ngkedaiwnl Irqaqekfgk dkspkfqlfg spsgqkdllf kdsaigfsrv ppridsglyl gsgyftaiqn Irkseeevaa rrarwwcav geqelrkcnq wsglsegsvt cssasttedc ialvlkgead amsldggyvy tagkcglvpv laenyksqqs sdpdpncvdr pvegylavav vrrsdtsltw nsvkgkksch tavdrtagwn ipmgllfπqtf gsckfdeyfs qscapgsdpr snlcalcigd eqgenkcvpn sneryygytg afrclaenag dvafvkdvtv Iqntdgnnne awakdlklad fallcldgkr kpvtearsc/? lamapnhaw srmdkveήk αyllhααakf qmσsdcpdk fclfαsetkn llfndntecl arlhαkttve kylgpqyvag itnlkkcsts plleaceflr k
Le terme « fragment » désigne typiquement un peptide ou polypeptide comprenant de 5 à 200 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO : 3, préférentiellement de 5 à 150, encore plus préférentiellement de 5 à 100. Des exemples particuliers de fragments sont des polypeptides de 5 à 80 acides aminés, préférentiellement de 15 à 40 acides aminés. Préférentiellement, les fragments comprennent un domaine fonctionnel, i.e., un domaine capable de lier un herpesvirus, de préférence la séquence SEQ ID NO : 2 :
arsch lamapnhaw srmdkveύk qvllhqqakf grngsdcpdk fclfqsetkn llfndntecl arlhgktty
Le terme « variant fonctionnel » englobe les variants naturels, notamment ceux résultant de polymorphisme(s), épissage(s), variation(s) entre espèces, etc. Ce terme inclut également des variants synthétiques, notamment des polypeptides comprenant une séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 par une ou plusieurs mutations, délétions, substitutions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus. Préférentiellement, un variant synthétique comporte 75% d'homologie de séquence primaire avec la séquence SEQ ID NO : 2, plus préférentiellement, au moins 85%. Les fragments ou variants peuvent en outre comporter des régions hétérologues ajoutées ou des modifications chimiques, enzymatiques, immunologiques, etc. De telles modifications peuvent permettre par exemple de faciliter la production ou la purification d'une partie de la lactoferrine, d'améliorer sa stabilité, d'augmenter son activité, etc.
Le terme « gène lactoferrine » désigne généralement toute portion du génome codant la lactoferrine telle que définie ci-avant.
Le terme « construction génique » ou « acide nucléique recombinant » désigne généralement tout acide nucléique codant un polypeptide tel que défini ci-avant. Il peut s'agir d'un ADN ou d'un ARN, par exemple d'un ADN génomique, d'un ADNc, d'un ARNm, d'un ADN synthétique ou semi-synthétique. Ceux-ci peuvent être obtenus par clonage à partir de banques ou plasmides, ou par synthèse, ou par toute autre technique connue de l'homme de l'art.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la construction génique est un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 , un fragment de celle- ci ou toute séquence s'hybridant avec l'une des séquences mentionnées ci- dessus dans des conditions de stringence modérée et codant une partie de la lactoferrine.
Des conditions de stringence modérées sont bien connues de l'homme du métier. Il s'agit, à titre d'exemple, des conditions suivantes : incubation à 42°C pendant 12 heures dans un milieu comprenant 50% formamide, 5 X SSPE, 5 X Denhardt's solution, 0,1% SDS.
Typiquement, l'acide nucléique utilisé pour la recombinaison (acide nucléique recombinant) ou la construction génique comporte, outre une région codant une partie de la lactoferrine, une ou des régions de régulation de la transcription, typiquement un promoteur et/ou un terminateur transcriptionnel. Ces régions régulatrices sont généralement choisies en fonction de l'hôte cellulaire considéré. Préférentiellement, il s'agit de régions régulatrices fonctionnelles dans les cellules de mammifères. A titre d'exemples on peut citer des promoteurs constitutifs ou régulés, inductibles ou non, sélectifs de tissus ou ubiquitaires, forts ou faibles, comme par exemple des promoteurs d'origine virale (par exemple : CMV, LTR, SV40) ou provenant de gènes cellulaires.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la construction génique utilisée est un acide nucléique comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 , un fragment de celle-ci ou toute séquence s'hybridant avec celle-ci dans des conditions de stringence modérée. Dans un mode plus spécifique, la construction génique utilisée est un acide nucléique comprenant une séquence codant un polypeptide de séquence SEQ ID NO :2 ou un fragment de ce dernier, liée de manière opérationnelle à un promoteur transcriptionnel ou un fragment de celle-ci.
L'invention concerne par ailleurs un anticorps dirigé contre tout ou partie d'un peptide ou polypeptide tel que décrit ci-dessus.
Cellules génétiquement modifiées
Les cellules peuvent être toute cellule cultivable, une cellule hôte procaryote, une cellule hôte eucaryote, de préférence de mammifère, par exemple humaine. Il peut s'agir de cellules primaires ou de lignées établies. De préférence, les cellules hôtes sont des cellules endothéliales, des cellules lymphoïdes, des cellules de type plasmoblastique du manteau folliculaire, notamment celles qui présentent une restriction de l'expression des chaînes légères lambda, etc. D'autres cellules de mammifères susceptibles d'être utilisées peuvent être des cellules embryonnaires ou des cellules telles que les cellules CHO, des fibroblastes, Vero, etc. De manière encore plus préférée, notamment pour produire (en vue d'isoler) un peptide selon l'invention, les cellules hôtes sont des cellules procaryotes, en particulier des bactéries choisies par exemple parmi E. coli BL21 et DH5α, ou des levures. Il peut également s'agir d'une cellule végétale ou d'une cellule d'insecte.
Un objet particulier de l'invention réside donc dans une cellule génétiquement modifiée, caractérisée en ce qu'elle comprend un acide nucléique recombinant codant une partie de la lactoferrine, de préférence une partie de SEQ ID NO : 3. L'acide nucléique recombinant présent dans les cellules permet à ces cellules d'exprimer tout ou partie de la lactoferrine, ou de sur-exprimer tout ou partie d'un tel récepteur, lorsque les cellules possèdent déjà un niveau basai d'expression. Ainsi, dans le cas des cellules endothéliales ou des cellules de type plasmoblastiques du manteau folliculaire qui présentent une restriction de l'expression des chaînes légères lambda, l'acide nucléique permet généralement aux cellules de sur-exprimer la lactoferrine, c'est-à-dire de produire la lactoferrine à un niveau supérieur à celui observé dans les mêmes cellules en l'absence de construction d'acide nucléique recombinant. Le terme sur-expression désigne généralement une expression augmentée notamment d'un facteur 2, plus généralement d'un facteur 3, idéalement d'un facteur 5 au moins. Les cellules sont préférentiellement des cellules de mammifères, en particulier des cellules humaines. Il est entendu que des cellules d'autres espèces peuvent être utilisées, comme par exemple des cellules de souris, rat, singe, hamster, etc.
Un objet particulier de la présente invention concerne donc une cellule, notamment une cellule endothéliale ou lymphoïde ou une bactérie E. coli, génétiquement modifiée sur-exprimant tout ou partie de la lactoferrine, de préférence tout ou partie de SEQ ID NO : 2. Le terme génétiquement modifié indique que la cellule (ou un ancêtre de celle-ci) a été modifiée pour contenir un acide nucléique recombinant codant ledit récepteur.
Typiquement, l'acide nucléique recombinant ou la construction génique comporte, outre une région codant tout ou partie de la lactoferrine, une ou des régions de régulation de la transcription, typiquement un promoteur et/ou un terminateur transcriptionnel, tels que définis ci-avant. L'acide nucléique peut être présent ou incorporé dans un vecteur plasmidique, viral, etc. Des vecteurs d'expression susceptibles d'être utilisés dans le cadre de l'invention sont par exemple les systèmes vecteur Gateway® T7 et pRSET compatibles avec un système d'expression procaryote. L'acide nucléique peut être intégré au génome des cellules ou rester sous forme extra-chromosomique (réplicative ou non). L'invention a également pour objet un procédé de préparation de cellules recombinantes exprimant tout ou partie de la lactoferrine, notamment une cellule endothéliale, lymphoïde, une bactérie génétiquement modifiées sur-exprimant tout ou partie de la lactoferrine ou un acide nucléique recombinant tels que définis ci- dessus. Le procédé de l'invention comprend, de manière générale, l'introduction d'un acide nucléique recombinant tel que défini ci-avant codant tout ou partie de la lactoferrine dans une cellule hôte. Les cellules hôtes peuvent être toute population de cellules telle que décrite ci-avant, il s'agit de préférence de cellules telles que mentionnées ci-dessus, notamment les lignées cellulaires PBMC (Peripheral Blood Mononuclear CeIIs) ou DMVEC (Dermal Microvascular Epithelial CeIIs).
Selon un premier mode de réalisation préféré de l'invention, les cellules recombinantes sont obtenues par transfection de cellules hôtes au moyen d'un vecteur plasmidique comprenant une construction génique comprenant la séquence SEQ ID NO : 1 , ou un fragment de cette dernière. Avantageusement, la transfection est réalisée en présence d'une seconde construction génique codant un gène de sélection ou de résistance, et les cellules sont sélectionnées sur la base de l'expression dudit gène de sélection ou de résistance ainsi que de l'acide nucléique codant tout ou partie de la lactoferrine.
Au sens de l'invention, le terme « transfection » désigne, de manière générale, toute technique permettant le transfert d'un acide nucléique dans une cellule. Il peut s'agir de techniques chimiques, physiques, biologiques, etc. A titre d'exemple, on peut citer l'électroporation, la précipitation au phosphate de calcium, l'utilisation d'agents facilitant la transfection, comme par exemple de lipides, polymères, peptides, etc., ou encore l'emploi de techniques physiques telles que le « gène gun », l'utilisation de projectile, le bombardement, etc. Selon un autre mode préféré de réalisation du procédé de l'invention, l'acide nucléique est introduit dans les cellules par infection au moyen d'un vecteur viral comprenant ledit acide nucléique. Selon un mode particulièrement préféré de mise en œuvre de l'invention, l'introduction est réalisée en utilisant un virus recombinant comprenant l'acide nucléique recombinant codant tout ou partie de la lactoferrine, de préférence tout ou partie de SEQ ID NO : 2, et, le cas échéant, un gène de sélection ou de résistance (« infection »).
Différents types de virus recombinants peuvent être employés, comme par exemple des rétrovirus, des adénovirus, des AAV (Adenovirus Associated Virus), des virus de l'herpès, des baculovirus modifiés, etc. Les virus recombinants préférés sont les adénovirus et les rétrovirus recombinants.
Un objet particulier de la présente invention réside dans une population de cellules comprenant un acide nucléique recombinant codant tout ou partie de la lactoferrine, de préférence tout ou partie de SEQ ID NO :2.
Selon un mode particulier de mise en œuvre de l'invention, la préparation (e.g., transfection, infection) des cellules, par exemple des cellules endothéliales, des cellules lymphoïdes ou des bactéries, par exemple des bactéries E. coli, est effectuée avec une construction génique qui comporte, outre une région codant un peptide actif, par exemple tout ou partie de SEQ ID NO : 2, une ou des régions de régulation de la transcription, typiquement un promoteur et/ou un terminateur transcriptionnel. Selon un mode préféré de l'invention, il s'agit de régions régulatrices fonctionnelles dans les cellules de mammifères. A titre d'exemples non limitatifs on peut citer des promoteurs constitutifs ou régulés, inductibles ou non, sélectifs de tissus ou ubiquitaires, forts ou faibles, comme par exemple des promoteurs d'origine virale (par exemple : 11, CMV, LTR, SV40) ou provenant de gènes cellulaires.
Selon un mode particulier de mise en œuvre de l'invention, la préparation (e.g., transfection) des cellules (e.g., PBVC, DMVEC, etc.) est effectuée avec une construction génique selon l'invention qui comporte, outre une région codant un peptide actif, i.e., un peptide capable de lier un herpesvirus, par exemple un fragment de SEQ ID NO : 2. Selon un autre mode particulier, la préparation est réalisée avec une séquence comprenant la séquence SEQ ID NO : 1. Pour la préparation des cellules recombinantes de l'invention par ingénierie génétique, les cellules hôtes peuvent être mises en contact avec le gène codant tout ou partie de la lactoferrine ou l'acide nucléique recombinant ou le vecteur ou le virus dans toute condition appropriée, puis les cellules recombinantes sont 5 récupérées. La mise en contact peut être réalisée dans tout support adapté et dans tout milieu de culture approprié au type cellulaire (par exemple : DMEM, RPMI1 etc.).
Dans un mode de réalisation particulier, après l'infection ou la transfection, les 10 lignées stables de cellules en culture sont sélectionnées. Les cellules génétiquement modifiées préférées présentant une sur-expression du gène codant tout ou partie de la lactoferrine sont des lignées stables.
Méthodes de Criblage
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La présente invention a aussi pour objet des méthodes d'identification, de sélection, de caractérisation ou d'optimisation de composés, mimant ou favorisant l'action des peptides ou polypeptides selon l'invention, capables de diminuer
; l'infection virale. Ces méthodes peuvent être réalisées en tests cellulaires ou in
20 vitro, par exemple par des tests de liaison. Ces méthodes utilisent essentiellement un fragment de la lactoferrine, de préférence un fragment de SEQ ID NO : 2 (ou un acide nucléique correspondant) comme cible moléculaire.
; Dans un premier mode de mise en œuvre, la présente invention a pour objet une
25 méthode d'identification, de sélection, de caractérisation ou d'optimisation de composés capables de moduler l'infection virale, caractérisée en ce que (i) on met en contact un composé à tester avec des cellules (de préférence des cellules eucaryotes, par exemple lymphoïdes ou endothéliales, par exemple issues des
: lignées lymphoïdes PBMC ou DMVEC) telles que définies ci-dessus,
30 éventuellement en présence d'un fragment de la lactoferrine, de préférence un fragment de SEQ ID NO : 2, (ii) on mesure ou on détermine l'infection virale desdites cellules et (iii), de préférence, on compare cette infection à l'infection des mêmes dites cellules en l'absence dudit composé à tester. L'infection virale est de préférence provoquée par un herpesvirus, par exemple par HSV-I, HSV-il, CMV ou HHV, en particulier HHV-8.
De préférence, les cellules sont des cellules telles que décrites ci-avant (sur- )exprimant tout ou partie de la lactoferrine, de préférence tout ou partie de SEQ ID NO :2.
La mesure de l'infection virale peut être réalisée par détermination de l'expression d'au moins un marqueur spécifique du virus responsable de l'infection, de préférence d'un marqueur choisi dans le groupe comprenant par exemple : les antigènes de surface K8.1 ainsi que les antigènes nucléaires de latence LANA.
L'invention concerne également une méthode pour la sélection, l'identification ou la caractérisation de composés mimant l'action d'un peptide selon l'invention, i.e., capables de lier un herpesvirus, par exemple le HHV-8, qui comprend : la mise en contact d'un composé test avec ledit herpesvirus, en présence d'une partie de la lactoferrine, de préférence de tout ou partie du fragment de la lactoferrine correspondant à SEQ ID NO :2, et - la détermination du déplacement de la liaison de ladite partie de la lactoferrine audit herpesvirus par ledit composé test.
Les méthodes de l'invention sont remarquables en ce qu'elles permettent d'identifier des composés capables de diminuer l'infection virale tels que des composés constituant des mimétiques d'un fragment actif de la lactoferrine, i.e., d'une partie de la Lf capable de lier un herpesvirus, e.g., le peptide de séquence SEQ ID NO :2. Ainsi, elles permettent notamment d'identifier des composés capables de diminuer l'infection virale et constituant des inhibiteurs de la pénétration cellulaire, des mimétiques ou des agonistes de la lactoferrine.
Selon des mises en œuvre particulières, la méthode de l'invention permet : - d'identifier des composés capables de diminuer la pénétration cellulaire du virus et constituant des mimétiques ou des agonistes de la lactoferrine,
- d'identifier des composés capables d'augmenter la pénétration cellulaire du virus constituant des antagonistes de la lactoferrine,
- d'identifier, en présence d'activateur de la lactoferrine, des composés capables de réduire la pénétration cellulaire du virus.
On entend par activateur, e.g. agoniste, ou inhibiteur, e.g., antagoniste, de la lactoferrine un composé qui active ou inhibe la liaison de ladite lactoferrine à l'herpesvirus, en particulier au HHV-8, respectivement.
Le composé test peut être d'origine et de nature variées. Il peut s'agir de composés isolés, d'extraits biologiques, de molécules organiques ou inorganiques, de banques de molécules (synthétiques, peptides, acides nucléiques, etc.) ou de microorganismes, etc.. Le composé test peut être mis en contact avec la construction d'acide nucléique ou les cellules sur (ou dans) tout support approprié et notamment sur une plaque, dans un tube ou une flasque, une membrane, etc. Généralement, la mise en contact est réalisée dans une plaque multipuits ce qui permet de conduire, en parallèle, des essais nombreux et variés. Parmi les supports typiques on trouve des plaques de microtitration et plus particulièrement des plaques de 96 ou 384 puits (ou plus). Selon le support et la nature du composé test, des quantités variables de cellules peuvent être utilisées lors de la mise en œuvre des méthodes décrites. De manière classique, 103 à 106 cellules sont mises en contact avec un type de composé test, dans un milieu de culture approprié, et de manière préférentielle entre 104 et 105 cellules. La quantité (ou la concentration) de composé test peut être ajustée par l'utilisateur selon le type de composé (sa toxicité, sa capacité de pénétration cellulaire, etc.), le nombre de cellules, la longueur de la période d'incubation, etc. Généralement, les cellules sont exposées à des quantités de composés test qui varient de 1nM à 1mM. Il est bien sûr possible de tester d'autres concentrations sans dévier de la présente invention. Chaque composé peut de plus être testé en parallèle, à différentes concentrations. Par ailleurs, différents adjuvants et/ou vecteurs et/ou produits facilitant la pénétration des composés dans les cellules peuvent, en outre, être utilisés si nécessaire. Le contact peut être maintenu par exemple entre quelques minutes et plusieurs heures ou jours, particulièrement entre 5 et 72 heures, généralement entre 12 et 48 heures.
Thérapie
L'invention concerne en outre une nouvelle approche thérapeutique qui consiste à bloquer l'infection virale à un stade précoce en inhibant l'adhésion des herpesvirus sur leurs cellules cibles.
Un objet de l'invention réside ainsi dans l'utilisation d'une partie de la lactoferrine, de préférence de tout ou partie de la séquence SEQ ID NO : 2, ou d'un composé mimant son action, identifié, sélectionné, caractérisé ou optimisé selon un procédé décrit ci-avant pour la préparation d'une composition ou d'un médicament destiné à la mise en œuvre d'une méthode de traitement thérapeutique ou prophylactique du corps humain ou animal, notamment au traitement curatif ou préventif de pathologies induites par une infection virale, notamment un cancer tel que le sarcome de Kaposi (SK), les lymphomes primaires d'effusion (PEL), la maladie de Castleman (MCD), etc.
Un autre objet de l'invention réside dans un procédé de préparation d'un médicament comprenant (i) une étape de sélection d'un composé capable de diminuer l'infection virale, telle que décrite ci-avant, et (ii) la mise en contact d'un composé sélectionné, ou d'un analogue de celui-ci, avec un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique.
Un autre objet de l'invention réside dans un procédé de préparation d'un composé actif sur l'infection virale, comprenant (i) une étape de sélection d'un composé capable de diminuer l'infection virale, telle que décrite ci-avant, et (ii) la synthèse du composé sélectionné, ou d'un analogue de celui-ci. Un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de composés actifs pour la mise en œuvre de méthodes de traitement thérapeutique ou prophylactique du corps humain ou animal. Il s'agit notamment de composés tels que définis ci- dessus capables de mimer l'action d'un fragment actif de la lactoferrine, Le., d'un fragment capable de lier un herpesvirus, e.g., de tout ou partie du fragment de séquence SEQ ID NO :2.
Un objet de l'invention concerne aussi une composition pharmaceutique, par exemple une composition capable de prévenir ou de traiter l'infection provoquée par un herpesvirus, comprenant un peptide ou polypeptide selon l'invention et un adjuvant acceptable sur le plan pharmaceutique.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un peptide ou polypeptide selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter une infection provoquée par un herpesvirus, tel que par exemple HSV-I, HSV-II, CMV ou HHV, en particulier HHV-8.
De manière préférée, le peptide ou polypeptide exprimé ou présent dans la composition pharmaceutique selon l'invention reconnaît un herpesvirus, tel que par exemple HSV-I, HSV-II, CMV ou HHV, en particulier le HHV-8.
Un autre objet de l'invention concerne une méthode de traitement d'une infection provoquée par un herpesvirus, choisi par exemple parmi les virus HSV-I, HSV-II, CMV et HHV, en particulier HHV-8, comprenant l'administration, à un sujet susceptible de présenter une telle infection, d'une composition pharmaceutique selon l'invention comprenant un peptide ou polypeptide selon l'invention et un adjuvant acceptable sur le plan pharmaceutique.
Les expressions « traitement » ou « traiter », au sens de l'invention, incluent les traitements thérapeutique et prophylactique. Ainsi, la composition peut être utilisée aux premiers stades de la maladie, avant l'infection ou ses premiers signes, ou à un stade plus avancé de la maladie. Un autre objet de l'invention concerne un kit comportant ledit peptide ou polypeptide selon l'invention et un autre composant destiné à déceler le complexe comportant ce peptide ou polypeptide et au moins un anticorps fixé de manière spécifique sur lui. Le composant en question peut être un anti-anticorps ou un 5 autre anticorps dirigé contre ledit peptide ou polypeptide selon l'invention. Le composant et/ou le peptide ou polypeptide selon l'invention peuvent être marqués.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et des dessins en annexe, fournis à titre illustratif et non 10 limitatif, dans lesquels :
la figure 1 illustre la liaison du virus HHV-8 entier à la salive humaine.
(A) La salive clarifiée de patients infectés par le VHSK (25μg de protéines par puit) a été immobilisée toute la nuit à 37°C sur une plaque de 96 puits et mise en
15 présence de différentes concentrations (de 0.01 à 16 μg/ml) de sondes de HHV-8 biotinylé pendant 2 heures à température ambiante. Les particules biotinylées liées de HHV-8 ont été détectées à l'aide d'un complexe peroxydase-streptavidine tel que décrit dans la partie matériels et méthodes. Les résultats correspondent à
: la moyenne de trois échantillons différents testés trois fois. Les protéines de la
20 salive (50 mg des protéines totale par ligne) provenant de patients infectés par le
VHSK (lignes 2-9) ont été séparées sur gel SDS-PAGE 10% et transférées sur une membrane de nitrocellulose comme décrit dans la partie matériels et méthodes. Les protéines ont été détectées par coloration au bleu de Coomassie
; (B). L'activité de liaison de HHV-8 a été détectée avec du HHV-8 biotinylé (0.1
25 mg/ml) (C) et des particules concentrées de HHV-8 (D) comme décrit dans la partie matériels et méthodes. La ligne 1 contient des marqueurs de masse moléculaire. Les flèches indiquent la position de la bande de 78 kDa.
la figure 2 montre l'identification de la protéine d'intérêt après une séparation par 30 électrophorèse en deux dimensions (2DE).
De la salive clarifiée humaine (300 mg de protéine) a été séparée dans une première dimension par IEF dans une zone de pH variant de 10 à 3. La seconde dimension a été réalisée par SDS-PAGE 10%. (A) les protéines ont été détectées _
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par coloration à l'argent. (B) L'activité de liaison de HHV-8 a été détectée à l'aide HHV-8 biotinylé comme décrit dans la partie matériel et méthodes. Ligne 1 , marqueurs de masse moléculaire ; ligne 2, échantillon séparé seulement par SDS- PAGE (1 DE) (50 μg de protéine) ; ligne 3, échantillon après 2DE. La flèche indique le spot qui a été prélevé par MALDI-ToF.
la figure 3 illustre le spectre MALDI-TOF obtenu pour les spots d'intérêt. Des masses de peptides monoisotopique ont été utilisées pour chercher dans les bases de données de protéines afin de repérer et d'identifier le spot correspondant à la protéine d'intérêt.
la figure 4 illustre la liaison de HHV-8 à la lactoferrine humaine (Lfh) après clivage protéolytique.
La Lfh a été soumise à un traitement par l'endoprotéinase V8. Les échantillons non traités (ligne 2) et traités (ligne 3) ont été analysés sur un gel à 10-20% de SDS-Tricine et transférés sur une membrane de nitrocellulose comme décrit dans la partie matériels et méthodes. Les fragments de protéines et peptides ont été détectés par coloration au bleu de Coomassie (A). Les activités de liaison ont été détectées à l'aide de lectine végétale ConA biotinylée (B) et de HHV-8 biotinylé (C). Les lignes 1a et 1b correspondent à des standards de masse moléculaire Mark12 (Invitrogène) et à des standards de masses moléculaires biotinylées (Sigma), respectivement. Les flèches indiquent la position du peptide de 8 kDa. * correspond à une reconnaissance non spécifique.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent qui reflètent les travaux mis en œuvre par les inventeurs pour aboutir à la conception et à la mise en oeuvre de l'invention.
MATERIELS ET METHODES
Collecte des échantillons. La population étudiée est composée de patients en consultation générale à l'hôpital et de patients infectés ou non par le HHV-8 et le VIH en consultation de routine. Un personnel spécialisé a obtenu un consentement écrit pour chacun d'entre eux. Les échantillons salivaires ont été collectés à partir de 76 individus non stimulés dans un tube plastique stérile et dilués au 1 :2 avec du tampon phosphate (PBS) froid et stérile. Les échantillons salivaires sont clarifiés par centrifugation à 7 000 x g pendant 20 min à 4°C et le surnageant est conservé à -2O0C avant analyse. Les échantillons de sang (20 ml) sont collectés sur tube EDTA et centrifugés à 2 500 x g pendant 30 min sur Ficoll Hypaque. Le plasma est aliquoté en tube de 15 ml et conservé à -800C jusqu'à ce qu'il soit analysé.
Lignée cellulaire et production virale. La lignée cellulaire lymphoblastoïde BC- 3 (ATCC CRL-2277)35 est maintenue en routine dans le milieu RPMI complémenté avec de la glutamine 2 mM, du sérum de veau fœtal inactivé 10%, des antibiotiques (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo), dans un incubateur à 37°C en atmosphère enrichie à 5% en CO2. Après 4 jours d'induction par le TPA à 2 ng/ml concentration finale, le surnageant de culture est centrifugé à 2 000 x g pendant 10 min pour enlever les cellules et les débris cellulaires. Le surnageant contenant le virus est filtré sur filtre 0,45 μm et centrifugé à 46 000 x g pendant 3 h à 4°C. Le culot contenant les particules HHV-8 est repris dans du PBS froid et stérile et centrifugé à nouveau dans les mêmes conditions. Les particules virales HHV-8 sont reprises dans 2 ml de PBS froid et stérile pour obtenir la préparation virale concentrée qui est quantifiée par l'utilisation de la PCR en temps réel selon la méthode décrite plus bas. La valeur caractéristique obtenue à partir de 1 ,1 litre de culture cellulaire BC-3 est de 3,4. 104 copies d'ADN de HHV-8/ ml de préparation virale concentrée avant purification selon la méthode décrite plus bas.
Purification et marquage du HHV-8. Un gradient continu de 24 à 42% de Nycodenz dans le phosphate de potassium 1 mM est réalisé selon la méthode décrite par Akula et al.. Les particules HHV-8 sont purifiées par ultracentrifugation à 70 000 x g pendant 2 h à 4°C dans un rotor Backman SW28 selon la méthode décrite par Lake and Hutt-Fletcher. Les fractions (500 μl) sont collectées à partir du haut du tube et analysées pour la présence des particules virales par l'utilisation de la PCR en temps réel. Les fractions contenant les particules virales sont collectées à l'interface 34-36% du gradient, rassemblées et dialysées contre Ie PBS pour enlever le Nycodenz. La valeur caractéristique obtenue est de 2,8. 106 copies d'ADN de HHV-8/ ml de préparation virale purifiée. La concentration protéique est estimée par la méthode de Lowry avec la sérum albumine bovine utilisée comme standard selon la méthode décrite par Peterson. Le HHV-8 biotinylé est préparé en accord avec la méthode décrite par Harlow and Lane. Brièvement, la préparation de virus purifié est incubée à température ambiante pendant 4 h sous agitation avec la biotine-NHS dans un rapport de 250 μg de biotine-NHS pour 1 mg de protéine. La réaction est arrêtée par l'addition de NH4CI 1 M. L'excès de biotine est enlevé par dialyse contre le PBS à 4°C. La préparation de virus biotinylé est conservée à -8O0C avant utilisation.
PCR quantitative en temps réel. Pour déterminer le nombre de molécules d'ADN viral dans les préparations de HHV-8, la technique de PCR quantitative en temps réel est réalisée selon la méthode décrite par Lallemand ef al.. Brièvement, 50μl de chaque fractions sont incubés à 37°C pendant 1 h en présence de 100 unités de DNase pour éliminer les particules virales dépourvues d'ADN. La réaction est arrêtée par incubation à 65°C pendant 10 min. L'ADN est extrait par l'utilisation du kit QIAamp Blood (Qiagene SA, Courtaboeuf, France) et soumis au test de PCR quantitative en temps réel combinant la quantification simultanée des ADN du HHV-8 et du gène de l'albumine. Le test est réalisé par l'utilisation de la méthodologie par fluorescense TaqMan sur le système ABI Prism 7700 Séquence Détection (PE Applied Biosystems, Forster City, California, USA). Les contrôles négatifs sont inclus dans tous les tests et analysés en parallèle, ils correspondent à deux réactions qui ne contiennent pas d'ADN.
Détection sérologique des anticorps anti-HHV-8. Les anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires de latence (LANA) du HHV-8 sont détectés dans les sérum des individus par un test d'immunofluorescence (IFA) sur la lignée cellulaire lymphoblastoïque BC-3. Le test d'IFA est réalisé par dilution du sérum à tester au 1 :100ème selon la méthode décrite par Milliancourt ef al.. Une lecture en double aveugle est effectuée et les échantillons montrant une réactivité spécifique à la dilution de 1 :100eme sont considérés comme positifs pour les anticorps anti-HHV-8. Test de contact direct. L'activité de liaison du HHV-8 peut être détectée par l'utilisation d'un test de contact direct viral (ou virus overlay assay, VOA). Brièvement, la salive est diluée dans le tampon carbonate-bicarbonate 50 mM, pH 9,6 à une concentration de 25 μg de protéines/ puit et immobilisée sur plaque de polystyrène 96 puits pendant 18 h à 37°C. Les puits sont lavés 3 fois par 0,2 ml de PBS contenant 0,05% de Tween 20 (PBS-Tween). Le virus HHV-8 biotinylé (0,1 ml d'une concentration allant de 0,1 à 10 μg/ml dans le PBS-Tween) est ajouté dans les puits et incubé à température ambiante pendant 1 h. Les puits sont lavés 3 fois par 0,2 ml de PBS-Tween. Le complexe streptavidine-peroxidase (0,1 ml à 0,5 μg/ml dans le PBS-Tween) est ajouté dans les puits et incubé à température ambiante pendant 1 h. Après lavage, la peroxidase liée est détectée par le substrat chromogénique 2,2'-azino-bis(3-ethyl-benzthiazoline-6-sulfonic acid) dans le citrate de sodium 50 mM (pH 5,0).
Pour identifier les molécules impliquées dans l'activité de liaison du HHV-8, les protéines salivaires (50 μg) sont séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide 10% en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et transférées sur membrane de nitrocellulose (0,45 μm) selon la méthode décrite par Towbin et al.. La membrane est saturée pendant 18 h à 4°C dans le tampon PBS contenant BSA 5%, Tween-20 0,05% (tampon PBT). L'activité de liaison est détectée par incubation de la membrane avec 20 ml de PBT contenant le HHV-8 biotinylé (0,1 μg/ml) pendant 2 h à température ambiante et par 2 ml de PBT contenant les particules HH V-8 concentrées non marquées pendant 4 h à 37°C. L'excès de virus est éliminé par 3 lavages avec le PBT. Les particules HHV-8 biotinylées sont détectées par incubation de la membrane avec le complexe peroxidase- streptavidine (20 ml à 0,5 μg/ml dans PBT) pendant 1 h à température ambiante. Après lavages, l'activité peroxydase est détectée par l'utilisation du substrat 3,3'- diaminobenzidine en présence de CoCI2 et de H2O2. Les particules HHV-8 non marquées sont détectées par incubation de la membrane avec l'anticorps monoclonal de souris dirigé contre la glycoprotéine d'enveloppe K8.1A/B (10 μg/ml) pendant 18 h à température ambiante. La membrane est lavée 3 fois dans le PBT et les anticorps de souris sont détectés par incubation de la membrane pendant 45 min à température ambiante avec les anticorps polyclonaux de lapin couplés à la peroxidase et dirigés contre les IgG de souris. Après lavages, l'activité peroxidase est détectée comme décrit plus haut. Les contrôles négatifs utilisant le conjugué peroxidase-streptavidine, l'anticorps anti-K8.1 et l'anti-lgG seuls sont réalisés en parallèle.
Analyse par électrophorèse tridimensionnelle. Un gradient de pH 10-3 immobilisé sur un gel de 13 cm (strip IPG) (Amersham-Bioscience, Sweden) est réhydraté à 200C pendant 13 h avec 250 μl de solution IEF [urée 8 M, CHAPS 2% (wt/vol), tampon IPG pH 3-10 0,5% (vol/vol), bleu de bromophénol 0,002%] contenant 200 μg de protéines de salive clarifiée. La résolution isoélectrophorétique est réalisée en 4 étapes, 1 h à 200 V, 1 h à 500 V, 30 min à 8000 V dans un mode plateau et 2 h 30 à 8000 V dans un mode gradient par l'utilisation du système Ettan IPGphor (Amersham-Pharmacia, Sweden). Pour la seconde dimension, le strip IPG est équilibré pendant 30 min dans la solution [urée 6 M, glycérol 30% (wt/vol), Tris-HCI 0,05 M, SDS 2% (wt/vol), bleu de bromophénol 0,002%, DTT 100 mM] et pendant 30 min dans la solution [urée 6 M, glycérol 30% (wt/vol), Tris-HCI 0,05 M, SDS 2% (wt/vol), bleu de bromophénol 0,002%, iodoacétamide 400 mM]. Le strip IPG est alors déposé sur le gel SDS- PAGE 10%. Deux gels sont développés en parallèle pendant 6 h à 70 mA à intensité constante. Dans le premier gel, les protéines sont détectées par coloration par le nitrate d'argent sans l'étape glutaraldéhyde. Le spot d'intérêt est détecté dans le second gel par l'utilisation du test VOA. Le gel coloré par le nitrate d'argent et la membrane de nitrocellulose sont juxtaposés et le spot d'intérêt est prélevé à partir du gel.
Caractérisation de la protéine d'intérêt par MALDI-ToF. Les films matriciels à évaporation rapide sont produits selon la méthode décrite par Vorm et al. par l'utilisation d'une solution saturée d'acide 4-hydroxy-α-cyanocinnamique (Sigma, St. Louis, MO) diluée dans l'acétone. Le spot de la protéine d'intérêt est soumis à une digestion trypsique. La solution peptidique est déposée sur le film matriciel et séchée à température ambiante. L'échantillon déposé est lavé avec de l'eau pure et inséré dans le spectrophotomètre de masse MALDI (Applied Biosystems, Voyager DE super STR) équipé d'un laser N2 à 337 nm. La calibration interne des spectres est réalisée par l'utilisation d'une auto-digestion de la trypsine porcine. Les masses peptidiques sont comparées dans les banques de données SWISS- PROT et Genpept.
Western-blot. Les échantillons protéiques salivaires et la lactoferrine humaine commerciale (Lfh) sont séparés par SDS-PAGE 10% et transférés sur membrane de nitrocellulose. La membrane est saturée pendant 18 h à 4°C dans le tampon
PBT et incubée à température ambiante pendant 1 h avec l'anticorps polyclonal de lapin anti-Lfh dilué au 1 :1000eme dans le même tampon. Après lavages, les anticorps sont détectés par incubation de la membrane 30 min à température ambiante avec l'anticorps polyclonal de chèvre couplé à la peroxidase anti-lgG de lapin dilué au 1 :5000 dans le PBT. Après lavages, l'activité peroxidase est détectée comme décrit précédemment.
Traitement par l'endoglycosidase. La Lfh commerciale purifiée (500 μg; Sigma) est dénaturée à 1000C pendant 5 min dans le tampon de digestion (phosphate de sodium 20 mM, EDTA 50 mM, SDS 1%) et dégradée par la PNGase F (N- glycanase) de Flavobacterium meningosepticum recombinée dans Escherichia coli (80 mU; Prozyme, Inc., San Leandro, CA) dans un volume final de 532 μl, pendant 40 h à 37°C. La réaction enzymatique est arrêtée par le mélange de l'échantillon avec le tampon d'échantillon d'électrophorèse et dénaturation à 1000C pendant 3 min. La Lfh déglycosylée est testée pour sa capacité à être reconnue par le HHV-8 biotinylé dans le test de contact direct. L'efficacité de la déglycosylation est contrôlée par la diminution de la masse moléculaire apparente déterminée après séparation en gel d'électrophorèse coloré par le bleu de Coomassie et par réaction avec la lectine végétale RCA-I (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Calif.) dans un test de contact direct. Brièvement, la Lfh déglycosylée et non déglycosylée sont séparées par électrophorèse et transférées sur membrane de nitrocellulose. Après saturation de la membrane avec 20 ml de tampon [BSA 0,5%, NaCI 0,15 M, CaCI2 0,1 mM, MnCI2.4H2O 0.01 mM, HEPES-Na+ 0.01 M (pH 7.5)] (HEPES-BSA) pendant 18 h à 4°C, l'activité de liaison est détectée par incubation de la membrane pendant 1 h à température ambiante avec 20 ml de HEPES-BSA contenant 0,2 μg/ml des lectines végétales RCA-I et ConA biotinylées. L'excès de lectine végétale est enlevé par 3 lavages de 15 min chacuns avec 20 ml de HEPES-BSA. Les lectines végétales biotinylées liées sont détectées par incubation pendant 1 h à température ambiante de la membrane avec le complexe peroxidase-streptavidine (20 ml à 0.5 μg/ml). La membrane est lavée 3 fois et l'activité peroxidase est détectée comme décrit plus haut.
Traitement protéolytique. La Lfh commerciale purifiée (500 μg) est digérée par l'endoprotéase V8 GIu-C de Staphylococcus aureus (50 μg; Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) dans le tampon de réaction NH4CO3 25 mM (pH 7,8) dans un volume final de 250 μl par incubation à 27°C pendant 18 h. La réaction enzymatique est arrêtée par le mélange de l'échantillon avec le tampon d'échantillon d'électrophorèse et dénaturation à 1000C pendant 3 min. Les fragments peptidiques obtenus sont séparés par électrophorèse en gel de gradient 10-20% SDS-Tricine, transférés sur membrane de nitrocellulose et de PVDF. Les fragments peptidiques transférés sur PVDF sont détectés par coloration par le bleu de Coomassie, les peptides transférés sur nitrocellulose sont testés pour leur capacité à être reconnus par le HHV-8 dans le test de contact direct. Les glycopeptides sont détectés par réaction avec la lectine végétale biotinylée ConA comme décrit plus haut.
Séquençage de l'extrémité N-terminale. La détermination de l'extrémité N- terminale est réalisée sur 20 μg de mélange peptidique déposé par piste. Après séparation électrophorétique, le mélange peptidique est transféré sur une membrane PVDF dans le tampon [méthanol 10%, l'acide 3-(cyclohexylamino)-1 - propanesulfonique 10 mM (pH 11 ,0)]. Les peptides sont détectés par coloration par le bleu de Coomassie à 0,1% (wt/vol) dans le méthanol 50% pour visualiser la bande de 8 kDa qui est alors découpée. Plusieurs bandes sont prélevées à partir de la même membrane et le matériel est soumis au mircoséquençage par la méthode d'Edman dans le séquenceur de protéine 494HT (Procise Applied Biosystems, Foster City, CaMf.). Bibliographie
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Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide, caractérisé en ce qu'il présente une séquence partielle d'au moins 5 acides aminés successifs de la séquence localisée dans la portion AIa606- GIu679 de la forme mature de la lactoferrine humaine et d'au plus 200 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO : 3, de préférence d'au plus 150 acides aminés de la SEQ ID NO : 3, avantageusement au plus 100 acides aminés de la SEQ ID NO : 3, encore plus avantageusement au plus 80 acides aminés de la SEQ ID NO : 3.
2. Polypeptide selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend au moins 20 acides aminés.
3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il présente une séquence partielle d'au moins 40 acides aminés successifs de la séquence localisée dans la portion Ala606-Glu679 de la forme mature de la lactoferrine humaine.
4. Polypeptide selon la revendication 1 , consistant en la séquence d'acides aminés SEQ ID NO .2, c'est-à-dire la portion Ala606-Glu679 de la forme mature de la lactoferrine.
5. Polypeptide selon la revendication 1 , consistant en une séquence d'au moins 40 acides aminés successifs de la séquence localisée dans la portion Ala606-Glu679 de la forme mature de la lactoferrine humaine et d'au plus 80 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 3.
6. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il réagit avec un herpesvirus.
7. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il a été exprimé par ingénierie génétique dans une cellule hôte procaryote ou eucaryote.
8. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il a été exprimé par ingénierie génétique dans une cellule hôte eucaryote.
9. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il a été synthétisé par voie chimique.
10. Acide nucléique pour la préparation par ingénierie génétique d'un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte la séquence SEQ ID NO :1 : gct aga agc tgc cat ctt gcc atg gcc ccg aat cat gcc gtg gtg tct cgg atg gat aag gtg gaa cgc ctg aaa cag gtg ctg ctc cac caa cag gct aaa ttt ggg aga aat gga tct gac tgc ccg gac aag ttt tgc tta ttc cag tct gaa ace aaa aac ctt ctg ttc aat gac aac act gag tgt ctg gcc aga ctc cat ggc aaa aca aca tat gaa
ou une séquence partielle de celle-ci comportant au moins 20 nucléotides.
11. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 et un adjuvant acceptable sur le plan pharmaceutique.
12. Composition pharmaceutique selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le polypeptide reconnaît un herpesvirus.
13. Utilisation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 9 pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter une infection provoquée par un herpesvirus.
14. Utilisation d'un polypeptide selon la revendication 13, caractérisée en ce que le virus herpès est le HHV-8.
PCT/FR2005/002331 2004-09-21 2005-09-20 Derives peptidiques , compositions et utilisations dans un traitement therapeutique de l’infection par un herpevirus WO2006032781A2 (fr)

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