WO2006030985A1

WO2006030985A1 - 過酸化脂質の測定方法

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Publication number: WO2006030985A1
Application number: PCT/JP2005/017558
Authority: WO
Inventors: Ken-Ich Yoshida; Hiroko Kimura; Koji Uchida; Kazuko Matsumoto
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2004-09-16
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2007-03-16
Also published as: JPWO2006030985A1

Abstract

抗4-ヒドロキシ-2-ノネナール(HNE)抗体と抗HNE抗体に結合する修飾抗体を用いるサンドイッチ式時間分解蛍光免疫測定による過酸化脂質の測定方法であって、第1抗体として抗HNE抗体Aを担体上に固定した担体に被測定試料を接触させ、次に被測定試料に第2抗体として抗HNE抗体Bを接触させ、さらにこの第2抗体に第3抗体として修飾抗体を接触させ、この第3抗体にランタノイドを接触させて、第1抗体、被測定試料、第2抗体、第3抗体およびランタノイドからなる複合体を形成させ、複合体のランタノイドの蛍光を測定する。すなわち、4-ヒドロキシ-2-ノネナール(HNE)を高感度、高精度、短時間・低コストで、感染症動物モデルや女性の閉経・ストレス負荷に伴う血中HNEの変化等を測定できる過酸化脂質の測定方法を提供する。

Description

明細書過酸化脂質の測定方法技術分野

本願発明は、過酸化脂質の測定方法に関するものである。背景技術

生態における脂質は、生体内で発生する活性酸素によって、たとえば

4 -ヒドロキシ - 2 -ノネナ一ル（HNE) やマロンジアルデヒド（MDA)、チォバルビツール酸反応物（TABARS) 等のような過酸化脂質となることが知られている。このような脂質の過酸化（過酸化脂質）が、動脈硬化症、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧症、髙脂肪血症等の各種の疾病に関与することが、近年明らかにされてきている。このため、生体内の脂質の過酸化の状態を把握して、その結果を上記各種の疾病の重症度、病態評価、治療薬や食事療法の方針決定や効果判定等に活用すべく、各種の手法が検討されている。たとえば、脂質の過酸化物がチォバルビツール酸と反応することを利用した TBA法や、赤血球内ヘモグロビン中のダル夕チォン付加ヘモグロビン量を酸化ストレスのマ一カーとして測定する酸化ストレスの測定方法が提案されている。

特に、 4 -ヒドロキシ - 2 -ノネナ一ル（HNE)は、生成量や反応性、生理作用等から最も代表的な過酸化脂質である。このため、この HNEを、高速液体クロマトグラフィーを利用して測定する方法等が開発され臨床検査にも応用されている。さらに、より効率的な HNEの測定として、たとえば、 HNEに対する特異抗体（抗 HNE抗体）を作成し、これを ELISA に用いた免疫学的測定法が提案されている（特許文献 1 )。

特許文献 1 ：特開平 8-168394号公報発明の開示

従来からある過酸化脂質の測定である TBA法や、グルタチオン付加へモグロビン量による測定、高速液体クロマトグラフィーによる HNE測定方法等では、抽出操作や反応生成物の測定操作が困難であることや、測定感度が低く、測定の精度が十分でないという問題があった。また、各種クロマトグラフィー質量分析計等を利用して測定する過程で、競合阻害をする類似物質の除去や感度の向上のためにカラムによる分離を行う必要があり、測定に長時間を要した。さらに、比較的高価な機器や維持費用を要する等、コストが高くなる問題もあった。

一方、特許文献 1記載の方法は、上記の問題を解決し、短時間に多数の検体を測定できる利点を有するものの、使用する抗体（つまり、抗 HNE 抗体）の抗体量や、抗体と抗原との結合能力を示す力価に左右されてしまい、必ずしも高感度，高精度に HNE を測定することができなかった。このため、高感度 ·高精度に HNEを測定することが要求される、過酸化脂質（つまり、 HNE) が関与する種々の疾病やストレス、つまり、たとえば女性の閉経 ·ストレス負荷に伴う血中 HNE の変化を捉えることや、また、これら疾病やストレス等のモデル動物、たとえば感染症動物モデルの血中 HNEの変化等を捉えるまでには至っていないという問題があつた。

そこで、本願発明は、従来の脂質過酸化物測定技術の問題点を解決すベく、代表的な過酸化脂質である 4 -ヒドロキシ - 2 -ノネナ一ル（HNE)を高感度、高精度、短時間、かつ、低コストで、たとえば、感染症動物モデルや女性の閉経 ·ストレス負荷に伴う血中 HNEの変化等を測定することのできる、新しい過酸化脂質の測定方法を提供することを課題としている。

本願発明は、前記の課題を解決するものとして、第 1には、 4 -ヒド口キシ- 2 -ノネナ一ル（HNE) 特異的に結合する 2つの抗 HNE抗体とこの抗 HNE抗体に結合する修飾抗体を用いるサンドィツチ式時間分解蛍光免疫測定による過酸化脂質の測定方法であって、以下の工程：

< 1 > 担体上に、第 1抗体として抗 HNE抗体 Aを固定し、第 1抗体固相化担体とする工程；

< 2 > 前記第 1抗体固相化担体に、被測定試料を接触させる工程； < 3 > 前記被測定試料に、第 2抗体として抗 HNE抗体 Bを接触させる工程；

< 4 > 前記第 2抗体に、第 2抗体と結合する第 3抗体として結合性物質で修飾された修飾抗体を接触させる工程；

< 5 > 前記第 3抗体に、上記 < 4 >の工程の結合物質と対応する結合性物質で修飾されたランタノィドを接触させる工程；および

< 6 > 上記ぐ 1 >からぐ 5 >の工程によつて、第 1抗体、被測定試料、第 2抗体、第 3抗体およびランタノイドからなる複合体を形成させ、この複合体のランタノィドが発する蛍光を測定する工程；

を含むことを特徴とする。

また、本願発明は、第 2には、上記第 1の発明における結合性物質が、ピオチンとストレプトアビジンであることを特徴とし、第 3には、上記第 1または第 2の発明におけるランタノィドが、サマリウム、ユウロピゥム、テルビウムおよびジスプロシウムの内の少なくとも 1つであることを特徴とする。図面の簡単な説明

図 1は、本願発明にかかる過酸化脂質測定方法の工程を例示した概略図である。

図 2は、本願発明の過酸化脂質の測定方法である 2種類の抗 HNE抗体 (第 1抗体と第 2抗体）と第 3抗体を用いた場合と、 2種類の抗 HNE抗体を用いた場合との比較評価の結果を示した図である。

図 3は、本願発明の過酸化脂質の測定方法による、 HNE各濃度の測定評価の結果を示した図である。図 4は、従来の過酸化脂質の測定方法（競合式 ELI SA) による、 HNE 各濃度の測定評価の結果を示した図である。

図 5は、本願発明の過酸化脂質の測定方法による、敗血症モデル動物 (ラット）の血中 HNE濃度の測定結果（A) と、 HNE濃度と MDPH酸化酵素との関係を検証した結果（B ) を示した図である。

図 6は、本願発明の過酸化脂質の測定方法による、心理ストレス負荷を与えたヒトの血中 HNE濃度の測定結果を示した図である。

図 7は、本願発明の過酸化脂質の測定方法による、 in vU ro実験として、ヒト末梢血の HNE濃度の測定結果（A ) と、 HNE濃度と NADPH酸化酵素との関係を検証した結果（B ) を示した図である。発明を実施するための最良の形態

本願発明は、上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について詳しく説明する。

本願発明は、生体（特に血中）において、その生成量や反応性（たとえば、タンパク質と安定に結合）、生理作用等から最も代表的な過酸化脂質ともいえる、 4 -ヒドロキシ - 2 -ノネナール（HNE) を測定の対象としている。本願発明は、この HNEと特異的に結合する 2種類の抗 HNE抗体を用いるサンドイッチ式時間分解蛍光免疫測定（TR- FIA) であって、さらに前記 2種類の抗 HNE抗体のうちの一方の抗 HNE抗体に結合する修飾抗体を用いる過酸化脂質の測定方法である。図 1の例に沿って、具体的にその工程を説明すると、以下の工程を経ることで、本願発明の過酸化脂質の測定を実現することができる。すなわち：

まず、第 1工程として、試験管や培養シャーレ、測定プレート等の担体上に、第 1抗体として抗 HNE抗体 Aを固定して、担体を第 1抗体固相化担体とする工程を行う。このとき、第 1抗体としての抗 HNE抗体 Aは、 HNEとの特異的な結合反応を高めるため、モノクローナル抗体であることが好ましい。つぎに、第 2工程として、前記第 1抗体固相化担体に、たとえば、ヒトゃサル、マウス、ラット、ヒッジ、ゥマ等の生体から公知の方法で被測定試料（たとえば、血液）を採取し、前処理を行って希釈調整した被測定試料を接触させることで、第 1抗体固相化担体の第 1抗体と被測定試料中に含まれる HNEもしくは HNE付加物質とを結合させる。もちろん、被測定試料の由来は、上記生体由来である天然の試料に限定されるものではない。

つづいて、第 3工程として、リン酸緩衝液ゃトリス緩衝液等の洗浄液で、第 2工程における余分な成分（たとえば、未結合の HNEもしくは HNE 付加物質等）を洗浄した後、前記被測定試料に、第 2抗体として抗 HNE 抗体 Bを接触ざせることで、被測定試料中に含まれる HNEもしくは HNE 付加物質に、第 2抗体がさらに結合する。これにより、 HNEもしくは HNE 付加物質は、第 1抗体と第 2抗体との間に挟まれた状態（サンドィツチ）となる。このとき、第 2抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。なお、洗浄液には、必要に応じて、界面活性剤として Tween-20 (登録商標）や Tr i ton-X (登録商標）等や、ブロッキング剤としてスキムミルクゃゥシ血清アルブミン（BSA) 等を含有させてもよい。

第 4の工程として、第 3工程と同様に洗浄液で、余分な成分（たとえば、未結合の第 2抗体等）を洗浄した後、前記第 2抗体に、第 3抗体として結合性物質で修飾された修飾抗体を接触させて、第 2抗体と第 3抗体とを結合させる。

さらに、第 5の工程として、第 3工程および第 4工程と同様に洗浄液で、余分な成分（たとえば、未結合の第 3抗体等）を洗浄した後、前記第 3抗体に、第 4の工程における修飾抗体の結合物質と対応する結合性物質で修飾されたランタノィドを接触させ、結合性物質を介して第 3抗体とラン夕ノィドとを結合させる。

そして、第 6の工程として、上記第 1の工程から第 5の工程によって、第 1抗体、被測定試料、第 2抗体、第 3抗体およびランタノイドから構成される複合体を形成させ、この複合体のランタノィドが強く発する金属イオン特有の蛍光を、分光光度計や蛍光測定器、マルチラベルカウン夕一等で測定する。

したがって、本願発明では、使用する抗体（第 1抗体である抗 HNE抗体 Aおよび第 2抗体である抗 HNE抗体 B) の力価が低い場合でも、被測定試料の血清中の代表的な過酸化脂質である HNEもしくは HNE付加物質を高感度、高精度、短時間、かつ、低コストで測定できることから、臨床応用に活用することができる。つまり、このような特徴を有する本願発明によって、従来の HNE測定方法では困難であった、たとえば、感染症動物モデルや女性の閉経 ·ストレス負荷に伴う血中 HNEの変化等を測定することができる。その他にも、本願発明は、脂質過酸化（過酸化脂質）が関与する動脈硬化症、糖尿病、虚血性心疾患、高血圧症、高脂肪血症等の重症度、病態評価、治療薬や食事療法の方針決定や効果判定等に活用することができる。さらにまた、本願発明の測定方法は、従来、酸化ストレスや脂質過酸化の関与確証が得られなかった炎症、閉経、心理的ストレス、喫煙、飲酒等に対しての評価にも活用することができることも考慮される。

また、本願発明における結合性物質が、ピオチンとストレブトァビジンであることが好ましい。ピオチンとストレブトアビジンは生体結合性物質であり、この両物質による結合は特異的で強い等から、その取り扱いが容易である。

さらに、特定の配位子と錯生成をすると金属イオン特有の蛍光を強く発することを考慮すると、ラン夕ノィドが、サマリウム、ユウ口ピウム、テルビウムおよびジスプロシウムの内の少なくとも 1つであることが好ましい。ランタノイドの蛍光は、通常の有機蛍光化合物の蛍光と比べると、これらの錯体の蛍光は次の優位な特徴を有している。つまり、ぐ 1 >蛍光寿命が非常に長い。たとえば、通常の有機蛍光化合物は、数ナノ秒の蛍光寿命であるが、ランタノィドの蛍光、その中でも特にユウ口ピウムとテルビウムは、数百マイクロ秒以上の蛍光寿命を有する。ぐ 2 >ストークスシフトが非常に大きい。多くの場合、これらのランタノィドは紫外光を吸収して励起され、 500nm以上の可視光を発する。一番強い発光の波長は、ユウ口ピウムで約 615nm、サマリウムで約 643nm、テルピウムで約 545nm、ジスプロシウムで約 574nmである。 < 3 >蛍光発光ピークの半値幅が約 10-20ηπιであり、非常にシャープである。本願発明の過酸化脂質の測定方法は、このような特徴を有するランタノィドを利用することで、様々な短寿命のバックグラウンド蛍光をなくすことができ、より高感度な測定を実現することができる。

本願発明の過酸化脂質の測定方法における、抗 ΗΝΕ抗体は、市販のものでもよいし、公知である種々の抗体作製方法によって作製することもできる。たとえば、抗原（この場合、 ΗΝΕ) 感作させたラットゃマウス、ゥサギ、ヒッジ、ャギ等の動物の血清免疫グロブリンの画分から、抗原ァフィ二ティーカラム等を利用して精製したり（ポリクローナル抗体 )、抗体産生細胞と骨髄腫細胞株とを融合させて融合細胞を作製する細胞融合法を利用して抗体を作製したり（モノクローナル抗体）、さらに遺伝子組換え技術によっても抗体を作製することができる（モノクロ一ナル抗体）。

以下に実施例を説明し、さらに詳しく本願発明の過酸化脂質の測定方法について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。実施例

実施例 1 ：過酸化脂質の測定方法の評価

( 1 ) 2種類の抗 ΗΝΕ抗体を用いた場合と、さらに第 3抗体として第 2 抗体に対するピオチン化抗体を用いた場合との比較評価

本願発明の過酸化脂質の測定方法は、 2種類の抗 ΗΝΕ抗体を用いてのサンドイッチ式時間分解蛍光測定である。そこで、ランタノイドとして Eu³⁺を用いて、 2種類の抗 HNE抗体（第 1抗体および第 2抗体）を用いたサンドィツチ式時間分解蛍光測定と、さらに第 3抗体として第 2抗体に対するピオチン化抗体を用いたサンドィツチ式時間分解蛍光測定とを比較評価した。

なお、本実施例における第 1抗体はモノクローナル抗体（2. 5 g/ml, 100 / l/wel l)を、第 2抗体はポリクローナルゥサギ抗体（3. 6 j g/ml 50 1)を、第 3抗体はピオチン化ゥサギ IgG (7. 5 /t g/ml, 50 1 ) を、そして、 Eu³⁺はストレプトアビジン結合 Eu³⁺-BHHCTを用いた。そして、波長 615Mで Eu³⁺が発する蛍光を測定した。反応固相は蛍光測定用 H 夕イタ一プレート rFuloronuncj を用い，蛍光測定は ArvoSX1420 を利用して行った。

結果は、図 2に示したとおり、 2種類の抗 HNE抗体とさらに第 3抗体を用いた場合（図 2中の丸印で示したグラフ）のほうが、 2種類の抗 HNE 抗体を用いただけの場合（図 2中の Ξ角印で示したグラフ）よりも、最大で約 1 0倍も最小検出感度が優れていることを確認できた。

( 2 ) ヒト血清中における本願発明の過酸化脂質の測定方法の評価ヒト血清中に含まれる HNE の回収率を測定し、測定精度を評価した。具体的には、ヒト血清 0. 157nmo l/ml に、 0. 001nmo l/mK 0. 01nmol/ml および 0. lnmo l/ml の HNEを加え、その添加回収率を、本願発明の過酸化脂質の測定方法で測定した。

結果は、表 1に示したとおりであった。すなわち、いずれの HNE添加濃度でも、高い回収率を示し、微量の HNEでも検出でき、測定感度および測定精度が高いことを確認できた。表 1

( 3 ) 各濃度における HNEの測定の評価

さらに、 0. 0001nmol/mK 0. 001nmol/mK 0. O lnmo l/mK 0. lnmol/ml Iniaol/mK lOnmol/mlおよび 100nmol/mlの HNEにおける蛍光強度を、サンドイッチ式時間分解蛍光測定で測定した。なお、ラン夕ノィドは、 Eu³⁺ を用いた。

結果は、図 3に示したとおり、 HNEの濃度依存的に蛍光強度が上昇した。つまり、 HNEの濃度が高いほど、蛍光を発する Eu³⁺が、第 1抗体や第 2抗体、第 3抗体を介して HNEに多く結合していることが分かる。しかも、図 3の結果をみると、 HNEの濃度が、 0. 0001nmol/ml (0. I M)であつても、蛍光測定できることが確認できた。本願発明の方法では、血中 HNE の測定感度が、従来の HNE測定方法（たとえば、特開平 8-168394 号公報）の測定感度（約 0. lmM)に比べて、 1 0 0 0倍高いことが確認された。そして、比較実験として行った、従来の競合式免疫分析法（競合式 ELISA) による蛍光強度の測定（波長 450nm) の場合では、図 4に示したとおり、 HNE濃度依存的に蛍光強度が低下することが確認できた。この競合 ELISAの HNEの検出感度は約 1 nmol/mL (1 M)であり、これに比べても高い検出感度であることが確認できた。

また、表 2に示した本願発明の過酸化脂質の測定方法における誤差 (CV% ) は、併行精度（int ra-assay prec i s ion) を行ったところ、小さいことが確認できた。さらに、表 3に示した従来の競合式免疫分析法 (競合式 ELI SA) の場合と比べても小さいことが確認できた。つまり、本願発明による過酸化脂質の測定方法の測定精度は、従来に比べて優れていることが確認できた。

なお、表 2における、 F lu l、 Flu2および Flu3は、 Euの 615 nmの蛍光強度を表し、それぞれ n=2または n=3で行った結果を表している。また、表 3における、 Abs l、 Abs2および Abs3は、 450 nmの吸光度を表し、 n=3で行った結果を表している。表 2

表 3

実施例 2 ：敗血症モデル動物の血中 HNE濃度の測定（in vivo)

( 1 ) 敗血症モデル動物として、ラット（n=3)に細胞毒であるリポ多糖（l ipopo lysccaride、 LPS) を 0. 5mg/kgを投与した。 LPS投与後、 1 時間、 2時間、 4時間、 8時間、 1 6時間および 2 4時間における血中 HNEを測定した。結果は、図 5 ( A ) に示したとおりであった。 LPSを投与した後、 3 つのピークがあり、 HNEが上昇していた。これは感染症の初期の血中過酸化脂質上昇を示したはじめての結果である。この結果より、本願発明の過酸化脂質の測定方法は、高感度な炎症指標として活用することができることを確認することができた。

( 2 ) また、 HNE生成に関与する NADPH酸化酵素についても検証するため、 3グループ（n=4、各グループ）のラットに、前処理として、 75mg/kg のアポシニン（apocyn in； Calb io-chem, l a lo l l a, CA) または 0. 6 %のジメチルスルフォキシド（DMS0) もしくは生理食塩水を投与し、 3 0分後に実験を行った。その後、このラットに LPSを投与し、 2 0分間静置し、血中の HNEを測定した。

結果は、図 5 ( B ) に示したとおり、アポシニンを用いた場合、 HNE 濃度は顕著に抑制された。アポシニンは、 NADPH酸化酵素の活性阻害物であることから、 NADPH酸化酵素が HNE生成に関与していることが示唆された。

実施例 3 ：心理ストレス負荷を与えたヒ卜の血中 HNE濃度の測定

被験者として、閉経女性（n=7) と若年女性（n=5) に対して、カラ一ワードテストを行い、被験者それぞれの血中の HNE濃度を測定した。測定の夕イミングは、休憩時（図 6中の re s t)、カラーワードテスト時（図 6中の CW) およびカラーワードテスト終了時（図 6中の recovery) であった。

結果は、図 6に示したとおり、閉経女性は、若年女性と比べ全体的に HNEの濃度が高かった。また、ストレス負荷後の上昇度が高かった。つまり、閉経女性は、若年女性と比較して、血中脂質過酸化（酸化ストレス）の平常時のレベルが高く、心理ストレス負荷によってより高度に上昇することがわかった。このことより、閉経後の女性の虚血性心疾患硬化発症率の上昇に、脂質過酸化が関与していることが示唆された。なお、若年女性の月経期（M- Phase) および排卵期（F-Phase) において、大きな差異はなかった。

実施例 4 ：ヒト末梢血における HNE濃度の測定（in vi t ro)

( 1 ) ヒト末梢血を、密度勾配遠心法で、単核性白血球と多形核性白血球とに分画し、リン酸緩衝液（PBS, pH7. 3) で 2回洗浄した。この各分画を、それぞれ血漿で再懸濁し、 LPS (7. 2 i g/mL；血漿で溶解）を加えて、測定試料として調整した。この測定試料（単核性白血球含有試料および多形核性白血球含有試料）を、 3 7でで、 1 0分間、 2 0分間、 3 0分間、 6 0分間インキュベーションして、 HNEを測定した。

結果は、図 7 ( A ) に示したとおり、特にインキュベーション時間 1 0分のピークにおいて、 HNE濃度は、単核性白血球含有試料の方が、多形核性白血球含有試料によりも高いことを測定、確認することができた。なお、このィンキュベーシヨン時間 1 0分でピークが確認できたことは、図には示していないが、実施例 2のラットを用いた血中の HNE濃度測定 ( in v ivo) よりも、早い段階（実施例 2では、 2 0分）で測定されたものである。

( 2 ) また、 HNE生成に関与する NADPH酸化酵素についても検証した。具体的には、上記の単核性白血球含有試料を、 NADPH酸化酵素の活性阻害物であるアポシニン（apocynin； Calbio-chem, l a Jol l a, CA) を用いて 3 0分間の前処理を行い、その後、 LPS と 3 7でで 1 5分間のインキュベ一シヨンを行った。また、 DMS0 (0. 2mM, 0. 2¾)、生理食塩水を用いた場合もそれぞれ検証した。

結果は、図 7 ( B ) に示したとおり、アポシニンを用いた場合、 HNE 濃度は顕著に抑制された。アポシニンは、 NADPH酸化酵素の活性阻害物であることから、 NADPH酸化酵素が HNE生成に関与していることが改めて示唆された。産業上の利用可能性

本願第 1の発明によれば、測定対象として、その生成量や反応性、生理作用等から最も代表的な過酸化脂質である 4 -ヒドロキシ - 2 -ノネナール（HNE)を、高感度かつ高精度に測定でき、測定に要する時間を短縮でき、しかもコストを低減することをもできる。

また、第 2の発明によれば、第 3抗体とランタノィドとをより確実に結合させることができ、より高感度に過酸化脂質を測定することができる。

さらに、第 3の発明によれば、ランタノイドの長寿命蛍光を利用した時間分解蛍光測定により生体物質中に含まれる蛍光を除去して測定のバックグラウンドを下げ、さらに効率よく過酸化脂質を測定することができる。

Claims

請求の範囲

1. 4-ヒドロキシ- 2-ノネナール（HNE) に特異的に結合する 2つの抗 HNE抗体とこの抗 HNE抗体に結合する修飾抗体を用いるサンドィツチ式時間分解蛍光免疫測定による過酸化脂質の測定方法であって、以下の工程：

< 1> 担体上に、第 1抗体として抗 HNE抗体 Aを固定し、第 1抗体固相化担体とする工程；

<2> 前記第 1抗体固相化担体に、被測定試料を接触させる工程； <3> 前記被測定試料に、第 2抗体として抗 HNE抗体 Bを接触させる工程；

<4> 前記第 2抗体に、第 2抗体と結合する第 3抗体として結合性物質で修飾された修飾抗体を接触させる工程；

<5> 前記第 3抗体に、上記ぐ 4>の工程の結合物質と対応する結合性物質で修飾されたランタノィドを接触させる工程；および

<6> 上記 < 1>から <5>の工程によって、第 1抗体、被測定試料、第 2抗体、第 3体およびランタノィドからなる複合体を形成させ、この複合体のラン夕ソィドが発する蛍光を測定する工程；

を含むことを特徴とする過酸化脂質の測定方法。

2. 結合性物質が、ピオチンとストレプトアビジンである請求項 1記載の過酸化脂質の測定方法。

3. ランタノイドが、サマリウム、ユウ口ピウム、テルビウムおよびジスプロシウムの内の少なくとも 1つである請求項 1または 2記載の過酸化脂質の測定方法。