WO2006030579A1 - 液体試料分析用多層分析素子 - Google Patents

液体試料分析用多層分析素子 Download PDF

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WO2006030579A1
WO2006030579A1 PCT/JP2005/012782 JP2005012782W WO2006030579A1 WO 2006030579 A1 WO2006030579 A1 WO 2006030579A1 JP 2005012782 W JP2005012782 W JP 2005012782W WO 2006030579 A1 WO2006030579 A1 WO 2006030579A1
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ammonia
polymer
liquid sample
analytical element
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PCT/JP2005/012782
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Hideaki Tanaka
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Fujifilm Corporation
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G01N33/525—Multi-layer analytical elements

Definitions

  • the present invention relates to a multilayer analytical element for liquid sample analysis. Specifically, for example, a liquid for analyzing ammonia or ammonia product substances such as creatinine and urea in a liquid sample such as blood and urine.
  • the present invention relates to a multilayer analysis element for sample analysis.
  • a typical example is a selectively permeable layer that includes a reagent layer containing urease and an alkaline buffer, and an indicator layer that detects gaseous ammonia, and selectively allows only gaseous ammonia to permeate between them.
  • It uses an integrated multi-layer analytical element that is integrated between the two.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 52-3488
  • a thin hydrophobic polymer layer is used as a selective permeation layer for ammonia gas.
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-77661 contains an indicator layer for gaseous ammonia, a liquid blocking layer, and an alkaline buffer on a transparent support, and reacts with a substrate as necessary to react with an amine.
  • the liquid blocking layer is porous.
  • Integrated multi-layer analysis for analysis of ammonia or ammonia-producing substrate in liquid samples which is characterized by the formation of air holes that are composed of active substances and that substantially block the liquid sample and allow gaseous ammonia to permeate under operating conditions.
  • a material is disclosed.
  • an integrated multilayer analysis element is disclosed in which a membrane filter is used as a selective transmission layer to improve adhesion to the indicator layer and to achieve high sensitivity.
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-157363 discloses a polyvinyl alkyl ether or the like substantially free of ammonia and ammonium ions in an undercoat layer of a support. Integrated polylayer for analysis of ammonia or ammonia-generating substances with high measurement accuracy with low color development optical density with higher color development optical density, using polybulu alkyl ether as binder for indicator layer or indicator layer An analytical element is disclosed.
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No.
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-122585 discloses an indicator layer containing an indicator that causes a change detectable by gaseous ammonia on a transparent support, and a liquid blocking layer that allows gaseous ammonia to pass therethrough.
  • a reagent layer containing an alkaline buffer and having a reagent capable of reacting with a substrate to produce ammonia if necessary, and an analytical element in which a spreading layer is integrally bonded and laminated in this order, the liquid blocking layer is disclosed.
  • Patent Document 1 JP-A 52-3488
  • Patent Document 2 JP-A-58-77661
  • Patent Document 3 Japanese Patent Laid-Open No. 4-157363
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 4-157364
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-122585
  • the integrated multilayer analytical element for analyzing ammonia or ammonia-generating substances disclosed in Patent Documents 2 to 5 has an indicator that produces a change detectable by gaseous ammonia on a transparent support.
  • An indicator layer (detection layer) containing, a liquid blocking layer that allows gaseous ammonia to pass through, an ammonia generation reaction reagent layer, and a development layer are integrally bonded and laminated in this order, and an overfill containing a bull polymer is provided on the development layer as necessary.
  • a coat layer is laminated.
  • an ammonia diffusion prevention layer and an endogenous ammonia supplement layer are laminated between the ammonia generation reaction reagent layer and the spreading layer.
  • the component contained in the detection layer oozes up to the liquid blocking layer, which is a porous film, and between the transparent support and the detection layer.
  • the adhesive strength was reduced, and peeling occurred due to handling during processing, so that productivity did not increase.
  • an object of the present invention is to analyze a liquid sample in which the adhesion between the transparent support and the detection layer is improved by handling during processing while maintaining basic performance such as sensitivity and storage performance. It is intended to provide a multilayer analytical element.
  • a detection layer containing a substance that causes a change detectable by the gaseous substance, a liquid blocking layer that selectively permeates the gaseous substance, and a spreading layer are arranged in this order.
  • the multilayer analytical element for liquid sample analysis of the present invention is characterized in that an adhesive polymer and a water-insoluble bull polymer are contained in a detection layer containing a substance that causes a change that can be detected by a gaseous substance.
  • a substance that causes a change that can be detected by a gaseous substance is a structure that changes as a result of reaction or interaction with the gaseous substance, and the spectroscopic characteristics such as an absorption wavelength. It means a substance that causes a change.
  • the change in structure includes a chemical structure, for example, a change in atomic composition, a bond relationship such as a covalent bond and a hydrogen bond, a change in steric structure, and the like.
  • the multilayer analytical element for liquid sample analysis of the present invention is transparent as long as at least a detection layer, a liquid blocking layer, and a development layer are integrally bonded and laminated in this order on a transparent support.
  • One or more layers can be provided at a position selected from at least one of the forces on the support detection layer, detection layer, liquid blocking layer, liquid blocking layer, one developing layer, and developing layer.
  • the multilayer analytical element for liquid sample analysis of the present invention includes an adhesive polymer in the detection layer.
  • This adhesive polymer is a polymer that contributes to the adhesion of each interface between the transparent support detection layer and the detection layer / liquid blocking layer.
  • the adhesive polymer used in the present invention preferably has a Tg of 0 ° C or less (more preferably from 1 to 150 ° C, particularly preferably from -100 to -10 ° C).
  • the adhesive polymer preferably has a mass average molecular weight of 10,000 to 1,000,000 (more preferably 10,000 to 500,000, particularly preferably 20,000 to 200,000).
  • Examples of the adhesive polymer include polyvinyl alkyl ethers (for example, polyvinyl methyl ether, polybutyl ether, polybutyl isobutyl ether, etc.), natural rubber, black-prene, styrene butadiene rubber, carbon number 2 to : 16 aliphatic alcohol attalinole ester as the main component, a polymer obtained by copolymerizing a small amount of monomers with polar groups such as acrylic acid and acrylamide, silicone composed of a combination of silicone rubber and silicone resin Adhesives based on styrene, isoprene, styrene block polymer, rosin resin, terpene resin, hydrogenated petroleum resin, polyisobutylene, indene, dammar, copal, coumarone, picopale, alkyd resin, cell Low ester, neo Ren and the like. Among them, polybulualkyl ether is preferable.
  • the amount of adhesive polymer added is:! To 500 times, preferably 3 to 300 times, more preferably 5 to 100 times the amount of indicator in the detection layer.
  • the water-insoluble butyl polymer contained in the detection layer is required to be insoluble in water, but is preferably an adhesive polymer that is preferably soluble in the coating solvent for forming the detection layer. It is preferably compatible with other polymers that can be used.
  • “insoluble in water” means that the solubility in 100 g of water at 20 ° C. is not more than lg.
  • the coating solvent is generally an organic solvent or a mixed solvent of an organic solvent and water.
  • the water-insoluble bull polymer is preferably soluble in alcohol, and particularly preferably ethanol-soluble.
  • the water-insoluble vinyl polymer preferably has a Tg of 10 ° C or higher (more preferably 20 to 150 ° C, particularly preferably 30 to 120 ° C). Further, it is preferable that the water-insoluble vinyl polymer has an average polymerization degree of S30 to 5000 (more preferably 50 to 3000, particularly preferably 100 to 2500).
  • the water-insoluble vinyl polymer preferably has an acetal group.
  • acetal groups include petital groups, acetal groups, and formal groups.
  • the water-insoluble polymer suitable for the present invention is a copolymer represented by the general formula (1).
  • This copolymer consists of repeating units x, y and ⁇ , and y has an acetal group.
  • X, y, z is a molar ratio representing an integer of 0 or more, and preferably x: y: z is (20 to 70): (20 to 90): (1 to: 10), more preferably (30-60): (30-80): (1-5).
  • R represents an alkyl group. R may be linear or branched, and is preferably a linear alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.
  • the water-insoluble vinyl polymer is polyvinyl butyral.
  • the polybutypetital means that in the above general formula (1), the scale of the y unit is a propyl group, and the y unit is 20 mol% or more.
  • the addition amount of the water-insoluble bull polymer is:! To 50% by mass, preferably 1 to 30% by mass, and more preferably 1 to 20% by mass with respect to the adhesive polymer.
  • a hydrophobic transparent support generally used in such an analytical element for example, a transparent support made of a polymer such as polyethylene terephthalate, polycarbonate, or a polyvinyl compound is used. .
  • the thickness of the transparent support is 50 to about 1000 ⁇ m, usually about 80 to 300 ⁇ m.
  • the detection layer includes at least a substance that causes a detectable change by ammonia as a gaseous substance, an adhesive polymer, and a water-insoluble vinyl polymer.
  • color precursor a compound that reacts with gaseous ammonia to cause a change in absorption wavelength
  • a color precursor a compound that reacts with gaseous ammonia to cause a change in absorption wavelength
  • color precursors include leuco dyes such as leuco cyanine dyes, nitro-substituted leuco dyes, and leucophthalein dyes (JP-A-52-3488, US Pat. No. RE 30 267).
  • PH indicators such as bromophenol blue, brom talesole green, bromothymol blue, quinoline blue and rosoleic acid (described in Kyoritsu Shuppan, Chemical Dictionary, pages 10-63-65); triarylmethane series Dye precursors; leucobenzylidene dyes (described in JP-A-56-145273); diazonium salts and azo dye couplers; base-bleachable dyes and the like.
  • a detection layer can be formed.
  • polymers other than those exemplified above can be used in combination as a binder polymer.
  • Other binder polymers include acid-treated gelatin, alkali-treated gelatin, Gelatin such as deionized gelatin; senorelose ester such as senorelose acetate, senorelose acetate butyrate, senorelose acetate propionate; Anolequinolesenoreloses; etc. are used.
  • the amount of the color precursor used is about 0.:! To about 50% by mass with respect to the mass of the adhesive polymer, the water-insoluble bull polymer and the other binder polymer (hereinafter sometimes simply referred to as the binder polymer). Preferably, about 0.5% by mass to 20% by mass is appropriate.
  • pH can be adjusted by adding various buffering agents, organic acids, inorganic acids, etc. for the purpose of adjusting sensitivity.
  • the buffering agent can be selected from the strengths described below.
  • Organic acids and inorganic acids include ethanesulfonic acid, aspartic acid, azelaic acid, glutaric acid, succinic acid, glutaconic acid, tartaric acid, pimelic acid, malonic acid.
  • the solvent used to form the coating solution is suitably an organic solvent such as acetone, 2-methoxyethanol, methylethylketone, methanol, ethanol, or a mixed solvent thereof.
  • a solid, a binder polymer, etc. are added so that the solid content concentration is about 1 to 30% by mass, preferably about 3 to 20% by mass, to obtain a coating solution. This is coated on a transparent support and dried to form a detection layer so that the dry film thickness is about 30 to 30 ⁇ m, preferably 2 to 20 ⁇ m.
  • a liquid blocking layer is provided on the detection layer.
  • the liquid blocking layer is substantially free of liquids such as coating liquids and sample liquids and interference components dissolved in these liquids (eg, alkaline components) during the manufacture of multilayer analytical elements and during Z or analytical operations. It is preferably composed of a microporous material having a through-air hole that can selectively permeate a gaseous substance such as gaseous ammonia.
  • the liquid blocking layer in the present invention is composed of one or more porous films.
  • the pore diameter of the uppermost porous membrane in contact with the reagent layer described later is preferably the same as or smaller than the pore diameter of the porous membrane immediately below.
  • the pore size of the uppermost porous membrane is 0.01-! / im, preferably 0.04 to 0.2 ⁇ m
  • the pore diameter of the porous membrane immediately below Is 0.2 to 20 111, preferably 0.5 to 10 zm
  • the ratio of the average pore diameter of the uppermost porous membrane to the pore diameter of the porous membrane immediately below is 0.001 to 1.0, preferably 0. 01 to 0.5.
  • the pore diameter in this specification is an average pore diameter unless otherwise specified.
  • the material of the porous membrane is not particularly limited, but examples thereof include fluorine-containing polymers such as polyethylene, polypropylene, and polytetrafluoroethylene, cellulose acetate, polysulfone, polyamide (nylons), and mixtures thereof. .
  • Preferred is a combination of a polyethylene porous membrane and a polypropylene porous membrane.
  • Each porous membrane has a thickness of 3 to 40 zm, preferably 5 to 20 ⁇ , and a liquid blocking layer is formed by combining two or more layers, usually 2 to 3 layers.
  • the porosity of the entire liquid blocking layer is 25 to 90%, preferably 35% to 90, and the total layer thickness is 10 to 50 ⁇ m, preferably 10 to 30 ⁇ m.
  • the liquid blocking layer adheres to the detection layer described above with practical strength.
  • the detection layer surface may be attached in a wet state and dried.
  • the wet state means that the solvent in which the Norder is dissolved remains or the dried membrane is wetted with the soluble solvent and the binder is in a swollen state, a dispersed state or a solution state.
  • the adhesion between the porous films is performed by physical and / or chemical means such as point contact using an adhesive such as thermocompression bonding or hot melt. These may be laminated one after another, or may be bonded to the detection layer after first laminating the porous films.
  • a reagent layer can be provided on the liquid blocking layer.
  • the reagent layer includes, for example, a reagent that reacts with an ammonia-generating substance to generate ammonia (generally, an enzyme or a reagent containing an enzyme), an alkaline buffer for efficiently releasing ammonia generated by the reaction as gaseous ammonia, and This layer usually contains a hydrophilic polymer binder having film-forming ability.
  • urea Z urease creatine Z creatine diminase, amino acid / amino acid dehydrogenase, amino acid z amino acid oxidase, amino acid / amino acid dehydratase, amino acid / ammonia Lyase, ammine Z amine monooxidase, diamine Z amine monooxidase, glucose and phosphoramidate Z phosphoramidate hexose phosphoryl transferase, ADPZ strength rubamate kinase and phosphate strength rubamol, acid amide Z amidohydrolase, nucleobase / deaminase, Nucleoside / deaminase, nucleoti De Z deaminase, guanine / guanase and the like.
  • a buffer having a pH in the range of 7.0 to 10.5, preferably 7.5 to 10.0 can be used.
  • the buffer include ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris), phosphate buffer, N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine), N-2 -Good buffer such as hydroxyethyl biperazine 1-N, 1-hydroxypropane 1-sulfonic acid (HEPPS), N-hydroxyethylpiperazine _N, monoethanesulfonic acid (HEPES), borate buffer, etc. be able to.
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • Tris tris (hydroxymethyl) aminomethane
  • phosphate buffer N, N-bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine)
  • Na-2 -Good buffer such as hydroxyethyl biperazine 1-N, 1-hydroxypropane
  • hydrophilic polymer binder having a film-forming ability examples include gelatin, agarose, polybutyl alcohol, polyacrylolamide, hydroxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, and polyvinylpyrrolidone. Can be mentioned.
  • the reagent layer includes a reagent that reacts with an ammonia-generating substance to generate ammonia, an alkaline buffer that efficiently releases ammonia generated by the reaction as gaseous ammonia, and a hydrophilic that has film-forming ability.
  • a wetting agent, a binder cross-linking agent (curing agent), a stabilizer, a heavy metal ion trapping agent (complexing agent) and the like can be included as necessary.
  • the reagent layer comprises a reagent that reacts with an ammonia-generating substrate to generate ammonia, an alkaline buffer, and the reagents that are added as necessary, and a hydrophilic polymer binder such as gelatin having film-forming ability. It can be formed into a coating solution by mixing, coating and drying on the liquid barrier layer.
  • the amount of the reagent that reacts with the ammonia-generating substrate contained in the reagent layer to generate ammonia is usually about 0.1 to about 50% by mass, preferably about 0.2 to about 20%, based on the mass of the binder. It is within the range of%.
  • the amount of alkaline buffer is in the range of about 0.1 to about 60 weight percent based on the weight of the binder.
  • the dry film thickness of this reagent layer is usually in the range of about 1 to about 40 x m, preferably about 2 to about 20 z m.
  • a development layer is provided on the reagent layer.
  • JP-A-55-164356 (corresponding US Pat. No. 4,292,272), JP-A-57-66359 (corresponding US Pat. 3 315) etc. (for example, flat knitted fabrics such as broad and poplin), knitted fabric development layers described in JP 60-222769 (corresponding EP Patent 0 162 302A), etc.
  • tricot knitted fabric double tricot knitted fabric, Miranese knitted fabric
  • organic polymer fiber pulp-containing papermaking paper development layer described in JP-A-57-148250 fiber described in JP-A-57-125847, etc.
  • a fibrous microporous development layer such as a development layer formed by applying a dispersion of a polymer and a hydrophilic polymer; a membrane filter layer (brush) described in JP-B-53-21677 (corresponding to US Pat. No. 3,992,158) Polymer layer), isotropic microporous development layer containing continuous micropores in which fine particles such as polymer microbeads are adhered in a point contact manner with a hydrophilic polymer binder, Japanese Patent Application Laid-Open No. 55-90859 (Patent 4 258 001) etc.
  • Isotropic microporous layer (three-dimensional lattice-like granular structure layer) containing layered micropores formed by adhering microbeads in a point contact with a polymer adhesive that does not swell with water.
  • Microporous spreading layer JP-A 61-4959 (corresponding US Pat. No. 5,019,347), JP-A 62-138756, JP-A 62-138757, JP-A 62-138758 (corresponding EP patent 0 226 465A)
  • a plurality of microporous layers eg, two layers of woven fabric or knitted fabric and membrane filter, three layers of woven fabric or knitted fabric and membrane filter and woven fabric or knitted fabric described in each of the above publications, etc.
  • There is a spread layer with excellent blood cell separation ability that is laminated and adhered with a fine discontinuous or island-like (dot-like in the printing field) adhesive.
  • the fabric or knitted fabric used for the spreading layer is subjected to physical activation treatment represented by Glow discharge treatment or corona discharge treatment described in JP-A-57-66359 on at least one side of the fabric fabric. Or water washing degreasing treatment described in JP-A-55-164356, JP-A-57-66359, etc., hydrophilization treatment such as impregnation with a hydrophilic polymer, or a combination of these treatment steps as appropriate.
  • the fabric can be made hydrophilic and the adhesive strength with the lower layer (side closer to the support) can be increased.
  • a polymer-containing aqueous solution or a polymer-containing water-organic solvent mixture is formed from above the spreading layer.
  • the development area or spread of the liquid sample can be controlled by applying a solution.
  • the ammonia diffusion prevention layer and the endogenous ammonia supplementation layer are described in, for example, JP-A-4-157364, etc., and a known force such as the ammonia diffusion prevention layer is substantially subjected to ammonia supplementation and ammonia generation reaction.
  • This layer is not a layer and can be formed using a hydrophilic polymer such as hydroxypropylcellulose.
  • the thickness of the ammonia diffusion preventing layer is, for example, 2 to 50 zm.
  • the endogenous ammonia capture layer is a layer containing a reagent that acts on endogenous ammonia already present in the liquid sample to change it to a state where it cannot substantially reach the reagent layer.
  • the reagent include a composition containing an enzyme having a catalytic ability to change an ammonia to a substrate to another substance.
  • a specific example of the composition is a composition containing ⁇ -ketoglutarate, NADPH, and glutamate dehydrogenase using a hydrophilic polymer such as hydroxyethyl cellulose as a binder polymer.
  • the thickness of the endogenous ammonia supplemental layer is, for example:! -30 / im.
  • a color shielding layer or a light reflecting layer can be provided between the reagent layer and the spreading layer.
  • the color shielding layer or the light reflecting layer is formed by dispersing white particles such as titanium dioxide fine particles and barium sulfate fine particles having light shielding properties or light shielding properties and light reflecting properties almost uniformly in a hydrophilic polymer binder such as gelatin. It is a layer with a thickness of about 2 / im force when dried and a range of about 20 ⁇ .
  • a known adhesive layer made of a hydrophilic polymer is provided on the reagent layer, the ammonia diffusion preventing layer, the endogenous ammonia supplementing layer, the color shielding layer, or the light reflecting layer for the purpose of firmly bonding and integrating the spreading layer.
  • the dry thickness of the adhesive layer is in the range of about 0.5 111 to about 5 m.
  • a surfactant can be contained in the reagent layer, the ammonia diffusion preventing layer, the endogenous ammonia supplementing layer, the color shielding layer or the light reflecting layer, the adhesive layer, the spreading layer, and the like.
  • An example is a nonionic surfactant.
  • Specific examples of nonionic surfactants include p-octylphenoxypolyethoxyethanol, p-nonylphenoloxypolyethoxyethanol, polyoxyethylene oleyl ether, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, p-nonolephenol. Cypolyglycidol, octyldarcoside and the like.
  • aqueous liquid samples such as blood, plasma, serum, urine, etc. 1-: Incubate at a substantially constant temperature in the range of about 20-40 ° C for 10 minutes, then clear The degree of color change (coloring or fading) of the detection layer from the support side may be reflected photometrically or visually compared with the standard color.
  • the detection layer On the transparent polyethylene terephthalate (PET) film having a thickness of 180 x m, the detection layer was applied with an ethanol solution and dried so as to have the following coating amount.
  • PET polyethylene terephthalate
  • a polyethylene membrane filter having an average pore size of 0.2 ⁇ m, a porosity of 75%, and a thickness of 100 ⁇ was uniformly pressed on the detection layer to provide a liquid blocking layer.
  • the reagent layer was applied from an aqueous solution and dried so as to have the following coating amount.
  • Reagent layer ( ⁇ 9 ⁇ 0)
  • ammonia diffusion preventing layer was applied on the reagent layer so as to have the following coating amount and dried.
  • Hydroxypropylcellulose 20 Og / m 2
  • an endogenous ammonia supplemental layer was applied on the ammonia diffusion preventing layer so as to have the following coating amount and dried.
  • the endogenous ammonia supplement layer was moistened almost uniformly with a 0.2% P-noyulphenoxypolyglycidol aqueous solution, and a polyester knitted fabric (gauge number 40) was immediately crimped uniformly. Furthermore, in order to improve the spreadability, this laminate was impregnated with polybulol pyrrolidone in ethanol so that the following coating amount was applied, dried, slitted to a width of 12 mm, and an integrated multilayer analytical element for Creatun quantitative analysis. Prepared.
  • the peeling force between the support transparent PET film and the detection layer was measured.
  • the peel force is a value measured by the following method.
  • Peeling force measurement method TENSILON UT M-II-20 manufactured by Orientec Co., Ltd. is used as a peeling force measuring device. Cut the sample into strips with a width of 12 mm and a length of 150 mm, and attach the PET film surface to the frame with double-sided tape. Manually peel off the PET film from the sensing layer, clip the peeled sensing layer with a clip, connect to the measuring device, and start measurement. The peel force is recorded on the graph as a recorder, and the peel force can be read from the graph.
  • Sensitivity was determined by placing a 10 ⁇ 1 point solution containing creatinine at a rate of 12.7 mg / dl on the spreading layer and measuring the color optical density (OD) after 5 minutes at a measurement wavelength of 650 nm. Shown as a relative value.
  • X greater than ⁇ 5%.
  • the analytical element of Example 1 has a peeling force about 15 times that of a conventional analytical element (Comparative Example 1) that does not use a water-insoluble bull polymer, and the force does not decrease in sensitivity. It can be seen that the existing performance is also good.

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Abstract

　感度、保存性能等の基本性能を保ったまま、加工時のハンドリングによっても透明支持体と検知層との間の密着力が改善された、液体試料分析用多層分析素子を提供することを課題とする。 　液体試料分析用多層分析素子は、透明支持体の上に、少なくとも、ガス状物質により検知可能な変化を生じる物質を含む検知層、ガス状物質を選択的に透過させる液体遮断層、及び展開層がこの順に一体に接着積層されてなり、前記検知層は接着性ポリマー及び水不溶性ビニルポリマーを含有することを特徴とする。

Description

明 細 書
液体試料分析用多層分析素子
技術分野
[0001] 本発明は、液体試料分析用多層分析素子に関するものであり、詳しくは、例えば血 液、尿等の液体試料中のアンモニア又はクレアチニン、尿素等のアンモニア生成物 質を分析するための液体試料分析用多層分析素子に関するものである。
背景技術
[0002] 従来、体液中の尿素窒素の測定法として、測定の簡易化、迅速化をはかり測定者 の個人差をなくすために乾式法 (ドライケミストリ）と呼ばれる方法が種々提案されてレヽ る。その典型的なものは、ゥレアーゼとアルカリ性緩衝剤を含有する試薬層と、ガス状 アンモニアを検出する指示薬層とを備え、両者の間にガス状アンモニアのみを選択 的に透過させるような選択透過層をはさんで一体化した一体型多層分析素子を使用 するものである。たとえば特許文献 1 (特開昭 52— 3488号公報）には、基本的に上 記多層構造を有する一体型分析素子が開示されている。この分析素子ではアンモニ ァガスの選択透過層として疎水性ポリマー薄層が使用されている。
[0003] 特許文献 2 (特開昭 58— 77661号）には、透明支持体上に、ガス状アンモニア用 の指示薬層、液体遮断層、アルカリ性緩衝剤を含有し必要により基質と反応してアン モニァを生成することの出来る試薬を有する試薬層、および展開層がこの順に一体 に接着積層された、液体試料中のアンモニア又はアンモニア生成基質分析用一体 型多層分析材料において、液体遮断層が、多孔性物質より成り、使用条件下に液体 試料を実質的に遮断しかつガス状アンモニアを透過させる空気孔を構成する事を特 徴とする液体試料中のアンモニア又はアンモニア生成基質分析用一体型多層分析 材料が開示されている。この多層分析材料においては、選択透過層としてメンブラン フィルターを使用して、指示薬層との接着性を改善し、かつ高感度化をはかった一体 型多層分析素子が開示されている。
[0004] そのほか、特許文献 3 (特開平 4—157363号公報）には、支持体の下塗層にアン モニァ及びアンモニゥムイオンを実質的に含まないポリビニルアルキルエーテル等を 用レ、、あるいは指示薬層のバインダーにポリビュルアルキルエーテルを用いて、発色 光学濃度がより高ぐバックグラウンドの発色光学濃度が低ぐ測定精度のより高いァ ンモユアまたはアンモニア生成物質分析用一体型多層分析素子が開示されている。 また、特許文献 4 (特開平 4—157364号公報）には、多孔性展開層にポリ（N—ビニ ルピロリドン)を含有させ、アンモニア生成反応試薬層にアンモニアを実質的に含ま ずかつ pH約 9. 0以上でアンモニアを発生せずバインダー性能も変化しないバイン ダーを用いて、発色光学濃度がより高ぐバックグラウンドの発色光学濃度が低ぐ測 定精度のより高いアンモニアまたはアンモニア生成物質分析用一体型多層分析素 子が開示されている。さらに、特許文献 5 (特開 2002— 122585号公報）には、透明 支持体の上に、ガス状アンモニアにより検知可能な変化を生じる指示薬を含む指示 薬層、ガス状アンモニアを通過させる液体遮断層、アルカリ性緩衝剤を含有し必要に より基質と反応してアンモニアを生成することのできる試薬を有する試薬層、及び展 開層がこの順に一体に接着積層された分析素子において、該液体遮断層が少なくと も 2層以上の多孔膜からなることを特徴とする液体試料中のアンモニアまたはアンモ ニァ生成物質分析用一体型多層分析素子が開示されている。
特許文献 1 :特開昭 52— 3488号公報
特許文献 2 :特開昭 58— 77661号
特許文献 3 :特開平 4— 157363号公報
特許文献 4 :特開平 4— 157364号公報
特許文献 5：特開 2002— 122585号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
前記のように、例えば特許文献 2〜5に開示されているアンモニアまたはアンモニア 生成物質分析用一体型多層分析素子は、透明支持体の上に、ガス状アンモニアに より検知可能な変化を生じる指示薬を含む指示薬層（検知層）、ガス状アンモニアを 通過させる液体遮断層、アンモニア生成反応試薬層、及び展開層がこの順に一体に 接着積層され、必要に応じて展開層上にはビュルポリマーを含むオーバーコート層 が積層されている。またとくにクレアチュン定量用一体型多層分析素子では、さらに アンモニア生成反応試薬層と展開層との間にアンモニア拡散防止層、内因性アンモ ニァ補足層を積層する場合がある。
[0006] し力 ながら、前記のように何層も積層するに従レ、、検知層に含まれる成分が多孔 性膜である液体遮断層にしみ上がり、透明支持体と検知層との間の密着力が低下し 、加工時のハンドリングにより剥離する場合があり、生産性が上がらないという問題点 があった。
[0007] したがって本発明の目的は、感度、保存性能等の基本性能を保ったまま、加工時 のハンドリングによっても透明支持体と検知層との間の密着力が改善された、液体試 料分析用多層分析素子を提供することである。
課題を解決するための手段
[0008] 上記課題は、以下の手段により解決することができる。
[0009] 1)透明支持体の上に、少なくとも、ガス状物質により検知可能な変化を生じる物質 を含む検知層、ガス状物質を選択的に透過させる液体遮断層、及び展開層がこの順 に一体に接着積層された液体試料分析用多層分析素子において、前記検知層は 接着性ポリマー及び水不溶性ビュルポリマーを含有することを特徴とする液体試料 分析用多層分析素子。
[0010] 2)前記水不溶性ビニルポリマーはァセタール基を有することを特徴とする上記 1)記 載の液体試料分析用多層分析素子。
[0011] 3)前記水不溶性ビュルポリマーはポリビュルブチラールであることを特徴とする上 記 1)または 2)記載の液体試料分析用多層分析素子。
発明の効果
[0012] 本発明によれば、検知層に特定のポリマーを含有させたため、感度、保存性能等 の基本性能を保ったまま、加工時のハンドリングによっても透明支持体と検知層との 間の密着力が改善された、液体試料分析用多層分析素子を提供することができる。 発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明の液体試料分析用多層分析素子は、ガス状物質により検知可能な変化を 生じる物質を含む検知層に接着性ポリマー及び水不溶性ビュルポリマーを含有させ たことを特徴とする。 [0014] 本明細書において、ガス状物質により検知可能な変化を生じる物質とは、ガス状物 質と反応乃至相互作用の結果、構造が変化し、それに伴って吸収波長等の分光学 的特性に変化を生じるような物質を意味する。ここで、構造の変化としては、化学構 造、例えば、原子組成の変化、共有結合、水素結合等の結合関係の変化、立体構 造の変化等が包含される。
[0015] 本発明の液体試料分析用多層分析素子は、透明支持体の上に、少なくとも、検知 層、液体遮断層、及び展開層がこの順に一体に接着積層されてなる構成であれば、 透明支持体 検知層間、検知層 液体遮断層間、液体遮断層一展開層間、展開 層上の少なくとも何れ力 1箇所から選択される位置に 1層以上設けることができる。
[0016] 本発明の液体試料分析用多層分析素子は、検知層に接着性ポリマーを含む。この 接着性ポリマーは、透明支持体 検知層間及び検知層 液体遮断層間の各々の 界面の接着に寄与するポリマーである。
[0017] 本発明で用いられる接着性ポリマーとしては、 Tgが 0°C以下（更に好ましくは一 150 〜― 5°C、特に好ましくは— 100〜― 10°C)であることが好ましい。また、接着性ポリ マーは、質量平均分子量が 1万〜 100万（更に好ましくは 1万〜 50万、特に好ましく は 2万〜 20万）であることが好ましい。
[0018] 接着性ポリマーとしては、ポリビエルアルキルエーテル（例えば、ポリビニルメチルェ 一テル、ポリビュルェチルエーテル、ポリビュルイソブチルエーテル等）、天然ゴム、 クロ口プレン、スチレンブタジエンゴム、炭素数 2〜： 16の脂肪族アルコールのアタリノレ エステルを主体とし、これにアクリル酸、アクリルアミド等の極性基を有するモノマーを 少量共重合させることにより得られるポリマー、シリコンゴムとシリコン樹脂の組み合わ せによって構成されるシリコーン系粘着斉 lj、スチレン 'イソプレン'スチレンブロックポリ マーを主体とした粘着剤、ロジン系樹脂、テルペン系樹脂、水添石油樹脂、ポリイソ ブチレン、インデン、ダンマー、コーパル、クマロン、ピコペール、アルキド樹脂、セル ロースエステル、ネオプレンが挙げられる。中でもポリビュルアルキルエーテルが好ま しい。
[0019] 接着性ポリマーの添カ卩量は、検知層の指示薬量に対し、：!〜 500倍、好ましくは 3 〜300倍、さらに好ましくは 5〜： 100倍である。 [0020] 検知層に含まれる水不溶性ビュルポリマーは、水に不溶であることが必要であるが 、検知層形成用塗布溶媒には可溶であることが好ましぐ接着性ポリマー、更には併 用し得る他のポリマーと相溶性であることが好ましい。ここで本明細書において、水に 不溶であるとは、 20°Cの水 100gへの溶解度 lg以下であることを意味する。検知層 塗布溶媒は、有機溶媒または有機溶媒と水との混合溶媒が一般的である。水不溶性 ビュルポリマーは、アルコールに可溶であることが好まし 特にエタノール可溶性で あることが好ましい。
[0021] また、水不溶性ビニルポリマーとしては、 Tgが 10°C以上（更に好ましくは 20〜： 150 °C、特に好ましくは 30〜： 120°C)であることが好ましい。また、水不溶性ビニルポリマ 一 ίま、平均重合度力 S30〜5000 (更に好ましく ίま 50〜3000、特に好ましく ίま 100〜 2500)であることが好ましレ、。
[0022] 水不溶性ビニルポリマーはァセタール基を有することが好ましい。ァセタール基とし ては、プチラール基、ァセタール基、ホルマール基等が挙げられる。
[0023] 中でも、本発明に好適な水不溶性ポリマーは、一般式（1)で表される共重合体であ る。この共重合体は繰り返し単位 x、 y及び ζからなり、 yはァセタール基を有する。
[0024] [化 1]
Figure imgf000006_0001
式（1)中、 X, y, zは 0以上の整数を表すモル比であり、好ましくは、 x : y : zとしては、 (20〜70)： (20〜90)： (1〜： 10)であり、更に好ましくは（30〜60)： (30〜80)： (1 〜5)である。 Rはアルキル基を表す。 Rとしては、直鎖でも分岐していてもよぐ好まし くは、炭素数 1〜5の直鎖アルキル基である。
また本発明は、水不溶性ビニルポリマーがポリビニルブチラールであることがとくに 好ましい。ここで、ポリビュルプチラールとは、上記一般式（1)において、 y単位の尺が プロピル基であって、 y単位が 20モル％以上のものを意味する。
[0026] 水不溶性ビュルポリマーの添加量は、前記接着性ポリマーに対し、：!〜 50質量％、 好ましくは 1〜30質量％、さらに好ましくは 1〜20質量％である。
[0027] 以下、本発明の液体試料分析用多層分析素子の好適な態様について、その構成 要素毎に説明する。なお、以下の説明において、ガス状物質としてガス状アンモニア を採用した場合を例にとり説明する。
(透明支持体）
透明支持体としては、このような分析素子において一般的に用いられているような 疎水性の透明支持体、たとえばポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリビ ニル化合物のようなポリマーから成る透明支持体が使用される。透明支持体の厚さは 50〜： 1000 μ m程度、通常 80〜300 μ m程度である。
(検知層）
検知層は、ガス状物質としてのアンモニアにより検知可能な変化を生じる物質、接 着性ポリマー、及び水不溶性ビニルポリマーを少なくとも含む。
[0028] ガス状物質により検知可能な変化を生じる物質としては、例えばガス状アンモニア と反応して吸収波長に変化を生じるような化合物（以下、発色前駆体という）が好適で ある。本発明の分析素子に使用可能な発色前駆体としては、たとえば、ロイコシァニ ン染料、ニトロ置換ロイコ染料及びロイコフタレイン染料のようなロイコ染料 (特開昭 5 2_ 3488号、米国特許 RE 30 267号に記載）；ブロムフエノールブルー、ブロム タレゾールグリーン、ブロムチモールブルー、キノリンブルー及びロゾール酸のような p H指示薬 (共立出版、化学大辞典、 10卷 63〜65頁に記載）；トリアリールメタン系染 料前駆体；ロイコべンジリデン色素（特開昭 56— 145273号に記載）；ジァゾニゥム塩 とァゾ染料カプラー；塩基漂白可能染料等が挙げられる。
[0029] これらの発色前駆体の少なくとも 1種を前記の接着性ポリマー及び水不溶性ビュル ポリマーと混合し、透明支持体上に塗布すれば、検知層を形成することができる。ま た、上記で例示したもの以外のポリマーをバインダーポリマーとして併用することもで きる。その他のバインダーポリマーとしては、酸処理ゼラチン、アルカリ処理ゼラチン、 脱イオンゼラチン等のゼラチン；セノレロースアセテート、セノレロースアセテートブチレ ート、セノレロースアセテートプロピオネート等のセノレロースエステノレ類；メチノレセノレ口 ース、ェチノレセノレロース、プロピノレセノレロース等のァノレキノレセノレロース類；等が用レヽ られる。
[0030] 接着性ポリマー、水不溶性ビュルポリマーおよびその他のバインダーポリマー（以 下、単にバインダーポリマーということがある）の質量に対して、発色前駆体の使用量 は 0.：!〜 50質量％程度、好ましくは 0. 5質量％〜20質量％程度が適当である。ま た、感度を調整する目的で各種緩衝剤、有機酸、無機酸等をカ卩えて pHを調整する ことができる。緩衝剤は後述するもののな力から選択することができ、有機酸、無機酸 としては、エタンスルホン酸、ァスパラギン酸、ァゼライン酸、グルタル酸、コハク酸、グ ルタコン酸、酒石酸、ピメリン酸、マロン酸、リンゴ酸、 3, 3—ジメチルダルタル酸、ク ェン酸、 P—トルエンスルホン酸、過塩素酸、塩酸等を使用できる。さらに、水酸化ナ トリウム、水酸化カリウム、炭酸ニナトリウム、炭酸水素ナトリウム等のアルカリ等を検知 層中に加えることもできる。塗布液を形成するのに用いる溶媒は、アセトン、 2—メトキ シエタノール、メチルェチルケトン、メタノーノレ、エタノール等の有機溶剤あるいは水、 またはこれらの混合溶媒が適当であり、これらの溶剤に発色前駆体、バインダーポリ マー等を固形分濃度が 1〜30質量％程度、好ましくは 3〜20質量％程度となるよう に加えて塗布液とする。これを乾燥膜厚:!〜 30 x m程度、好ましくは 2〜20 μ mとな るように透明支持体上に塗布、乾燥して検知層を形成する。
[0031] 検知層の上には液体遮断層を設ける。この液体遮断層は、多層分析素子の製造 時及び Z又は分析操作時において、塗布液、試料液等の液体及びこれらの液体に 溶解含有されている妨害成分 (例えば、アルカリ性成分等）が実質的に透過せずか つガス状アンモニアのようなガス状物質を選択的に透過できるような貫通空気孔を有 する微多孔性物質で構成されてレ、るのが好ましレ、。
[0032] 本発明における液体遮断層は、 1層または 2層以上の多孔膜からなる。 2層以上の 多孔膜の場合は、後述の試薬層と接する最上層の多孔膜の孔径がその直下の多孔 膜の孔径と同じかそれより小さいことが好ましい。具体的には、最上層の多孔膜の孔 径は 0. 01〜：！ /i m、好ましくは 0. 04〜0. 2 μ mであり、その直下の多孔膜の孔径 は 0. 2〜20 111、好ましくは0. 5〜10 z mであって、最上層の多孔膜の平均孔径 /その直下の多孔膜の孔径の比が 0. 001〜1. 0、好ましくは 0. 01〜0. 5である。 尚、本明細書における孔径は特に記載がなければ平均孔径である。多孔膜の材質 は特に限定されなレ、が、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルォロエチレン等 の弗素含有ポリマー、セルロースアセテート、ポリスルホン、ポリアミド（ナイロン類）、ま たはこれらの混合物等が挙げられる。好ましいものはポリエチレン多孔膜とポリプロピ レン多孔膜の組み合わせである。各多孔膜は厚さが 3〜40 z m、好ましくは 5〜20 μ ηιであり、これらを 2層以上、通常は 2〜3層を組み合わせて液体遮断層が形成さ れる。この液体遮断層全体の空隙率は 25〜90%、好ましくは 35%〜90、全層厚は 10〜50 μ m、好ましくは 10〜30 μ mが適当である。
[0033] 上記の液体遮断層は前述した検知層に実用的な強度をもって接着する。接着は、 検知層表面をウエット状態にして貼り付け乾燥すればよい。ここにウエット状態とは、 ノインダーを溶解している溶媒が残っているカ あるいは乾燥した膜が可溶性溶媒 で濡らされてバインダーが膨潤状態、分散状態又は溶液状態にあることを意味する。
[0034] 多孔膜間の接着は、熱圧着またはホットメルト等の接着剤を用いて点接触状に接 着する等の物理的および/または化学的手段により行う。これらは、順次積層しても 先に多孔膜同士を積層化後、検知層に接着してもよい。
[0035] 液体遮断層の上には、試薬層を設けることができる。試薬層は、例えばアンモニア 生成物質と反応してアンモニアを生成させる試薬 (一般には酵素又は酵素を含有す る試薬）、反応により生成したアンモニアをガス状アンモニアとして効率よく遊離させる ためのアルカリ性緩衝剤及びフィルム形成能を有する親水性ポリマーバインダーを 通常含有する層である。このアンモニア生成基質と試薬との組合わせとしては、たと えば、尿素 Zゥレアーゼ、クレアチュン Zクレアチュンディミナーゼ、アミノ酸/アミノ 酸一デヒドロゲナーゼ、アミノ酸 zアミノ酸ォキシダーゼ、アミノ酸/アミノ酸ーデヒドラ ターゼ、アミノ酸/アンモニア一リアーゼ、ァミン Zアミン一ォキシダーゼ、ジァミン Z アミン一ォキシダーゼ、グルコース及び燐アミダート Z燐アミダートへキソース燐トラン スフエラーゼ、 ADPZ力ルバミン酸塩キナーゼ及び燐酸力ルバモル、酸アミド Zアミ ドヒドロラーゼ、ヌクレオ塩基/デァミナーゼ、ヌクレオシド/デァミナーゼ、ヌクレオチ ド Zデァミナーゼ、グァニン/グアナーゼ等が挙げられる。
[0036] 試薬層に用いることができるアルカリ性緩衝剤としては、 pH7. 0から 10. 5、好まし くは 7. 5から 10. 0の範囲の緩衝剤を用いることができる。緩衝剤の具体例としては、 エチレンジァミン四酢酸（EDTA)、トリス（ヒドロキシメチル）ァミノメタン (Tris)、燐酸 塩緩衝剤、 N, N—ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン（Bicine)、 N— 2—ヒドロキシ ェチルビペラジン一 N，一 2—ヒドロキシプロパン一 3—スルホン酸（HEPPS〇）、 N— ヒドロキシェチルピペラジン _N，一エタンスルホン酸（HEPES)等の Goodの緩衝剤 、硼酸塩緩衝剤等を挙げることができる。
[0037] 試薬層に用いることができるフィルム形成能を有する親水性ポリマーバインダーとし ては、ゼラチン、ァガロース、ポリビュルアルコール、ポリアクリノレアミド、ヒドロキシメチ ルセルロース、ヒドロキシェチルセルロース、ポリビエルピロリドン等を挙げることがで きる。
[0038] 試薬層には、アンモニア生成物質と反応してアンモニアを生成させる試薬、反応に より生成したアンモニアをガス状アンモニアとして効率よく遊離させるためのアルカリ 性緩衝剤及びフィルム形成能を有する親水性ポリマーバインダー以外にも必要に応 じて、湿潤剤、バインダー架橋剤 (硬化剤）、安定剤、重金属イオントラップ剤 (錯化 剤）等を含有させることができる。
[0039] 試薬層は、アンモニア生成基質と反応してアンモニアを生成させる試薬、アルカリ 性緩衝剤及び必要に応じて加えられる上記試薬類を、フィルム形成能を有するゼラ チン等の親水性ポリマーバインダーと混合して塗布液とし、液体遮断層の上に塗布、 乾燥することにより形成すること力 Sできる。
[0040] 試薬層に含まれるアンモニア生成基質と反応してアンモニアを生成させる試薬の量 は、バインダーの質量に対して通常約 0. 1〜約 50質量％、好ましくは約 0. 2〜約 20 %の範囲内である。アルカリ性緩衝剤の量はバインダーの質量に対して約 0. 1〜約 60質量％の範囲内であるのが適当である。この試薬層の乾燥膜厚は通常約 1〜約 4 0 x m、好ましくは約 2〜約 20 z mの範囲内である。
[0041] 試薬層の上には展開層を設ける。展開層としては、特開昭 55— 164356号公報（ 対応米国特許 4 292 272)、特開昭 57— 66359号公報（対応米国特許 4 78 3 315)等に記載の織物布地展開層（例、ブロード、ポプリン等の平編物布地）、特 開昭 60— 222769号公報（対応 EP特許 0 162 302A)等に記載の編物布地展 開層（例、トリコット編物布地、ダブルトリコット編物布地、ミラニーズ編物布地）、特開 昭 57— 148250号公報に記載の有機ポリマー繊維パルプ含有抄造紙展開層、特開 昭 57— 125847号公報等に記載の繊維と親水性ポリマーの分散液を塗布して形成 した展開層等の繊維質微多孔性展開層；特公昭 53— 21677号公報 (対応米国特 許 3 992 158)等に記載のメンブランフィルタ一層（ブラッシュポリマー層）、ポリマ 一ミクロビーズ等の微粒子が親水性ポリマーバインダーで点接触状に接着されてな る連続微空隙含有等方的微多孔性展開層、特開昭 55— 90859号公報 (対応米国 特許 4 258 001)等に記載のポリマーミクロビーズが水で膨潤しないポリマー接 着剤で点接触状に接着されてなる連続微空隙含有等方的微多孔性層（三次元格子 状粒状構造物層)展開層等の非繊維等方的微多孔性展開層；特開昭 61—4959 ( 対応米国特許 5 019 347)、特開昭 62— 138756、特開昭 62— 138757、特開 昭 62— 138758号（対応 EP特許 0 226 465A)の各公報等に記載の複数の微 多孔性層（例、織物布地又は編物布地とメンブランフィルターの 2層、織物布地又は 編物布地とメンブランフィルターと織物布地又は編物布地の 3層）をそれらの表面で 微細な不連続点状又は島状（印刷分野における網点状)の接着剤で積層接着した 血球分離能力の優れた展開層がある。
[0042] 展開層に用いられる織物生地又は編物生地は特開昭 57— 66359号公報に記載 のグロ一放電処理又はコロナ放電処理に代表される物理的活性化処理を布生地の 少なくとも片面に施す力、又は特開昭 55— 164356号公報、特開昭 57— 66359号 公報等に記載の水洗脱脂処理、親水性ポリマー含浸等親水化処理、又はこれらの 処理工程を適宜に組み合せて逐次実施することにより布生地を親水化し、下側（支 持体に近い側）の層との接着力を増大させることができる。また、特開昭 59— 17186 4、特開昭 60— 222769、特開昭 60— 222770号の各公報等に記載のように、展開 層の上からポリマー含有水溶液又はポリマー含有水一有機溶媒混合溶液を塗布し て液体試料の展開面積又は広がりを制御することができる。
[0043] また、本発明の分析素子をクレアチニン定量用として用いる場合には、試薬層と展 開層との間には、アンモニア拡散防止層、内因性アンモニア補足層をこの順で設け ることもできる。アンモニア拡散防止層及び内因性アンモニア補足層は、例えば特開 平 4— 157364号公報等に記載され、公知である力 例えばアンモニア拡散防止層 は、アンモニアの補足およびアンモニア生成反応が実質的に行われない層であり、ヒ ドロキシプロピルセルロースのような親水性ポリマーを用いて形成することができる。 アンモニア拡散防止層の厚さは、例えば 2〜50 z mである。内因性アンモニア補足 層は、液体試料中にすでに存在する内因性アンモニアに作用してこれを実質的に試 薬層に到達しえない状態に変化させる試薬を含む層である。試薬としては、アンモニ ァを基質として他の物質に変化させる触媒能を有する酵素を含む組成物が挙げられ る。該組成物の具体例としては、ヒドロキシェチルセルロースのような親水性ポリマー をバインダーポリマーとし、 α—ケトグルタル酸、 NADPH、グルタミン酸デヒドロゲナ ーゼを含む組成物である。内因性アンモニア補足層の厚さは、例えば:!〜 30 /i mで ある。
[0044] さらに試薬層と展開層との間には、色遮蔽層又は光反射層を設けることができる。
色遮蔽層又は光反射層は光遮蔽性又は光遮蔽性と光反射性を兼ね備えた二酸化 チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子等の白色微粒子がゼラチン等の親水性ポリマー バインダー中にほぼ一様に分散されている乾燥時の厚さ約 2 /i m力 約 20 μ ΐηの範 囲の層である。
[0045] さらに試薬層、アンモニア拡散防止層、内因性アンモニア補足層、色遮蔽層又は 光反射層の上には展開層を強固に接着一体化する目的で親水性ポリマーからなる 公知の接着層を設けることができる。接着層の乾燥時の厚さは約 0. 5 111カ 約5 mの範囲である。
[0046] 試薬層、アンモニア拡散防止層、内因性アンモニア補足層、色遮蔽層又は光反射 層、接着層、展開層等には界面活性剤を含有させることができる。その例としてノニ オン性界面活性剤がある。ノニオン性界面活性剤の具体例として、 p—ォクチルフエ ノキシポリエトキシエタノーノレ、 p—ノニノレフエノキシポリエトキシエタノーノレ、ポリオキシ エチレンォレイルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、 p—ノニノレ フエノキシポリグリシドール、ォクチルダルコシド等がある。ノニオン性界面活性剤を展 開層に含有させることにより水性液体試料の展開作用（メータリング作用）がより良好 になる。ノニオン性界面活性剤を試薬層、アンモニア拡散防止層、内因性アンモニア 補足層、色遮蔽層又は光反射層、接着層などに含有させることにより分析操作時に 水性液体試料中の水が試薬層に実質的に一様に吸収されやすくなり、また展開層と の液体接触が迅速にかつ実質的に一様になる。
[0047] 本発明の分析素子を用いて液体試料中の、例えばアンモニア又はアンモニア生成 基質を測定するには、展開層の上に3〜30 ^レ好ましくは 6〜： 15 M Lの範囲の全 血、血漿、血清、尿等の水性液体試料滴を点着し、 1〜： 10分の範囲で、約 20〜40 °Cの範囲の実質的に一定の温度でインキュベーションを行った後、透明支持体側か ら検知層の色変化 (発色又は退色）の程度を反射測光するか、標準色と視覚的に比 較すればよい。
実施例 1
[0048] 以下、本発明を実施例および比較例によりさらに説明するが、本発明は下記例に 限定されるものではない。
[実施例 1]
厚さ 180 x mの透明ポリエチレンテレフタレート（PET)フィルムの上に下記の被覆 量となるように検知層をエタノール溶液により塗布 ·乾燥した。
[0049] 検知層
ブロムフエノールブルー 110mg/m2
ポリビュルメチルエーテル 1. 8g/m2 質量平均分子量：約 4万
ポリビュルブチラール 0. 18g/m2 平均重合度：約 300
水酸化ナトリウム 6. 8mg/m2
次いで、検知層の上に平均孔径 0. 2 x m、空隙率 75%、厚さ 100 μ ΐηのポリェチ レン製メンブレンフィルターを均一に圧着して液体遮断層を設けた。この液体遮断層 の上に試薬層を下記の被覆量となるように試薬層を水溶液から塗布 ·乾燥した。
[0050] 試薬層（ρΗ9· 0)
ヒドロキシェチルセルロース 3. Og/m2
平均分子量:約 4万 ヒドロキシェチル基平均置換度： DS = 1. 0-1. 3
平均値モル数： MS = 1. 8〜2. 5
四ホウ酸ナトリウム lgZm2
クレアチュンィミノヒドラーゼ 1800UZm2
(EC 3. 5. 4. 21)
さらに、試薬層の上に、下記の被覆量となるように、アンモニア拡散防止層を塗布し 、乾燥した。
[0051] アンモニア拡散防止層
ヒドロキシプロピルセルロース 20. Og/m2
メトキシ基 28〜30%
ヒドロキシプロポキシ基 7〜： 12%
2%水溶液の 20°Cでの粘度 0. 05Pa. s (50cps)
さらに、アンモニア拡散防止層の上に、下記の被覆量となるように、内因性アンモニ ァ補足層を塗布し、乾燥した。
[0052] 内因性アンモニア補足層（pH8. 2)
ヒドロキシェチノレセノレロース 5gZm2
アンフォライト 1 · 2g/m2
ひ一ゲ卜グノレタノレ酸 1. 2g/m2
NADPH 0. 4g/m2
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ 10000U/m2
(EC 1. 4. 1. 4)
上記内因性アンモニア補足層を 0. 2%P—ノユルフェノキシポリグリシドール水溶液 でほぼ均一に湿潤させ、直ちにポリエステル編布（ゲージ数 40)を均一に圧着した。 さらにこの積層物に、展開性を改良する目的で下記の被覆量となるようにポリビュル ピロリドンのエタノール溶液を含浸塗布'乾燥し、 12mm幅にスリットしてクレアチュン 定量分析用一体型多層分析素子を調製した。
[0053] ポリビュルピロリドン 7. 5g/m2 平均分子量：約 120万
[比較例 1] ポリビュルプチラールを使用せずに検知層を作成した以外は実施例 1と同様にタレ ァチニン定量分析用一体型多層分析素子を調製した。
[0054] 上記で得られたクレアチニン定量分析用一体型多層分析素子における、支持体透 明 PETフィルムと検知層との間の剥離力を測定した。剥離力は、以下の方法により測 定された値である。
[0055] 剥離力測定方法：剥離力測定装置として、オリエンテック社製、 TENSILON UT M— II— 20を用いる。サンプルを、幅 12mm、長さ 150mmの短冊状に切り取り、両 面テープで PETフィルム面を架台に貼り付ける。 PETフィルムと検知層との間を手動 で引き剥がし、はがした検知層をクリップで止め、測定装置に連結し、測定を開始す る。剥離力がレコーダ一としてグラフに記録され、グラフから剥離力を読み取ることが できる。
[0056] また同時にサンプルの感度、保存性能も測定した。
[0057] 感度は、クレアチニンを 12. 7mg/dlの割合で含む溶液を、展開層上に 10 μ 1点 着させ、 5分後の発色光学濃度（OD)を 650nmの測定波長で測定し、相対値で示し た。
[0058] 保存性能は、 45°C、 4日間の加速試験を実施することにより調べた。評価は、〇：土
5%以内、 X : ± 5%より大きいとした。
[0059] 結果を下記に示す。
[0060] 剥離力 感度 保存性能
実施例 1 218g 104% 〇
比較例 1 15g 100% 〇
実施例 1の分析素子では、水不溶性ビュルポリマーを使用していない従来の分析 素子（比較例 1)に比べて、約 15倍の剥離力を有し、し力も感度の低下が生じず、保 存性能も良好であることが分かる。

Claims

請求の範囲
[1] 透明支持体の上に、少なくとも、ガス状物質により検知可能な変化を生じる物質を 含む検知層、ガス状物質を選択的に透過させる液体遮断層、及び展開層がこの順 に一体に接着積層された液体試料分析用多層分析素子において、前記検知層は 接着性ポリマー及び水不溶性ビニルポリマーを含有することを特徴とする液体試料 分析用多層分析素子。
[2] 前記水不溶性ビニルポリマーはァセタール基を有することを特徴とする請求項 1記 載の液体試料分析用多層分析素子。
[3] 前記水不溶性ビニルポリマーはポリビニルプチラールであることを特徴とする請求 項 1または 2記載の液体試料分析用多層分析素子。
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