WO2006022295A1 - 抗エフリンb2抗体 - Google Patents

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WO2006022295A1
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Nobuyuki Takakura
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Kanazawa University NUC
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to an antibody or an antibody fragment that binds to Ephrin (Eph-receptor-interacting protein) B2 and inhibits the angiogenic activity of Ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue, the antibody or the antibody Methods for immunological detection of ephrin B2 or ephrin B2-expressing cells using antibody fragments and reagents for detection or quantification, diagnostic or therapeutic agents for diseases involving angiogenesis using the antibodies or antibody fragments, and the antibodies Provide hybridomas to produce.
  • the antibody is useful for treating various diseases involving ephrin B2.
  • the antibody can specifically detect ephrin B2 or ephrin B2 expressing cells by immunological techniques, and is useful for diagnosis of various diseases involving ephrin B2.
  • Ephrin B2 and EphB4 are membrane proteins expressed on vascular endothelium. Since ephrin B2 is selectively expressed in arterial endothelial cells and vascular smooth muscle cells around the artery, and EphB4 is selectively expressed in venous endothelial cells (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 to 3), ephrin B2 and EphB4 are It can be a marker that can distinguish arteries and veins, which has been difficult until now.
  • Non-patent Document 1 In ephrin-B2 gene-deficient mice, angiogenesis is impaired both in arteries and veins, and is fatal in the early stages of development (Non-patent Document 1). In addition, ephrin B2 and EphB4 play an important role in angiogenesis, as ephrin B2 and Z or EphB4 gene-deficient mice are impaired in angiogenesis and lethal in the early embryonic period. (Non-Patent Documents 1 and 4).
  • Angiogenesis that occurs in various pathological conditions is mainly formed to assist the infiltration of oxygen, nutrients, inflammatory cells, etc. into the affected tissue, and these environmental factors in the bloodstream are mainly used in the arteries. Be replenished. Therefore, in order to improve the pathology by inhibiting angiogenesis related to various pathological conditions, it is an appropriate means to inhibit arterial neoplasia.
  • polyclonal antibodies that react with ephrin B2 have been obtained by immunizing rabbits against the extracellular domain of human ephrin B2, which has been predicted to have the amino acid sequence of mouse ephrin B2, Epherin-B2 (P -20), the amino acid sequences of the polyclonal antibodies Epherin-B2 (H-83) and mouse ephrin B2 obtained by immunizing a rabbit with a polypeptide corresponding to amino acids 168-235 of the amino acid sequence of human ephrin B2
  • Polyclonal antibodies against human ephrin B2 of the polyclonal antibody Epherin-B2 (C-20) obtained by immunizing goats with the extracellular domain of human B2 estimated from E.
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
  • Polyclonal antibody Epherin-B2 H-83 can be used for immunoprecipitation
  • Monoclonal antibodies that react specifically with ephrin B2 are monoclonal antibodies whose subclass is IgM prepared for use in the cytofluorescent antibody method (Non-patent Document 6), and hamsters that react with mouse ephrin B2.
  • Patent Document 2 Known
  • Ephrin B2 has been suggested to be involved in angiogenesis
  • An antibody that binds to ephrin B2 and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 is not known.
  • ephrin B2 is expressed in mammalian glandular epithelial cells as a function of ephrin B2 other than vascular tissues, and is involved in hormone-dependent morphogenesis in adult mammals and ephrin B2 expression. It has been pointed out that the decrease may be involved in canceration of the gland (Non-patent Document 7). However, ephrin B2 is not known to be involved in breast tissue growth.
  • Patent Document 1 US Pat. No. 6,579,683 specification
  • Patent Document 2 US Patent Publication No. 2002-0136726
  • Non-Patent Document 1 Cell, 93, 741-753 (1998)
  • Non-Patent Document 2 Dev. Biol, 230, 151 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Blood, 98, 1028 (2001)
  • Non-Patent Document 4 Mol. Cell, 4, 403 (1999)
  • Non-Patent Document 5 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY website, [on line], [Heisei
  • Non-Patent Document 6 Arterioscler Thromb Vase Biol, 23, 190 (2003)
  • Non-Patent Document 7 Journal of Cell Science, 111, 2741 (1998)
  • An object of the present invention is to provide an antibody or an antibody fragment that binds to ephrin B2 and inhibits the angiogenic activity and the proliferation activity of mammary tissue of ephrin B2, and ephrin B2 using the antibody or antibody fragment. It is an object of the present invention to provide an immunological detection method and a reagent for detection or quantification, a diagnostic or therapeutic agent for a disease involving ephrin B2 using the antibody or the antibody fragment, and a hyperidoma that produces the antibody. .
  • the present invention relates to the following (1) to (23).
  • the monoclonal antibody is a monoclonal antibody produced from Hypridoma VERB2 (FERM BP-10100) (1) to (4) !, any monoclonal antibody or antibody fragment, (6) Any one of the monoclonal antibodies or antibodies according to (1) to (4), wherein the monoclonal antibody is a monoclonal antibody that binds to an epitope to which a monoclonal antibody produced from Hypridoma VERB2 (FERM BP-10100) binds. fragment,
  • the diagnostic agent according to (13), wherein the disease involving angiogenesis is a disease selected from the group consisting of solid tumors, rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, and dryness,
  • a therapeutic agent for a disease involving ephrin B2 comprising any one of the antibodies or antibody fragments as an active ingredient according to (1) to (6),
  • the therapeutic agent according to (18), wherein the disease involving angiogenesis is a disease selected from the group consisting of solid tumors, rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, and dryness,
  • the disease involving ephrin B2 is a disease that causes proliferation of mammary gland tissue (17) Medicine,
  • the disease that causes the growth of mammary gland tissue is selected as a group power that can also be a mammary gland type or breast cancer power.
  • an antibody or an antibody fragment that binds to ephrin B2 and inhibits angiogenic activity and mammary tissue proliferation activity of ephrin B2, ephrin B2 or ephrin B2 using the antibody or the antibody fragment Methods for immunological detection of expressed cells and reagents for detection or quantification, diagnostic or therapeutic agents for diseases involving ephrin B2 using the antibody or antibody fragment, and hybridomas producing the antibody .
  • FIG. 1 shows the results of sub-clustering of the produced VERB2 antibody.
  • FIG. 2 shows the results of staining rat and mouse ephrin B2 by flow cytometry using the prepared VERB2 antibody.
  • FIG. 3 shows the results of flow cytometry using the prepared VERB2 antibody.
  • the left column expresses ephrin B2! /, N! / And BaF / 3 cells, and the right column shows the reactivity of each antibody to BaF / 3 / ephrin B2 cells expressing ephrin B2. Indicates. From the top, the figure shows the results of the reaction without the primary antibody, when the control antibody was used as the primary antibody, and the VERB2 antibody was used as the primary antibody.
  • FIG. 4 shows the results of staining human ephrin B2 by flow cytometry using the prepared VERB2 antibody.
  • the present invention relates to ephrin B2 binding and angiogenic activity of ephrin B2 and mammary tissue.
  • the present invention relates to an antibody or an antibody fragment that inhibits the growth activity of.
  • the ephrin B2 angiogenic activity includes, for example, angiogenesis activity related to the growth or metastasis formation of solid tumor, angiogenesis activity related to the pathogenesis or promotion of diabetic retinopathy or rheumatoid arthritis.
  • the proliferative activity of mammary gland tissue of ephrin B2 includes, for example, the proliferative activity of mammary cells, fibrocytes, or fibroepithelial cells.
  • the ephrin B2 may be derived from any biological species. Specifically, the human ephrin B2, DN having a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, respectively. Examples include mouse ephrin B2 whose A sequence is represented by SEQ ID NO: 3 and amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 4, rat ephrin B2 whose DNA sequence is represented by SEQ ID NO: 5 and amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: 6, and the like.
  • Ephrin B2 is a polypeptide having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, and one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 And a polypeptide having an amino acid sequence having 60% or more homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, preferably having an amino acid sequence having 80% or more homology.
  • a polypeptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, or attached in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4, or 6, is described in [Molecular Cloning, AL Manual, second Edition (and old bpnng Harbor Laboratory Press, 1989), rrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci "USA, 79 , 6409 (1982), Gene, 3 4, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad.
  • a mutagenesis method for example, it can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 4 or 6.
  • Deletion, substitution or addition Amino acids The number of is not particularly limited, but is preferably 1 to several tens, for example 1 to 20, more preferably 1 to several, for example 1 to 5.
  • the numerical value of homology described in the present invention is a numerical value calculated using a homology search program known to those skilled in the art, unless otherwise specified.
  • BLAST J. Mol. Biol, 215, 403 (1990)
  • BLAST2 Nucleic Acids Res., 25, 33 89 (1997); Genome Res., 7, 649 (1997); http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/Education/B LASTinfo / information3.html]! /, Numerical values calculated using default parameters, etc. Can be given.
  • the default parameter 1 is 5 when G (Cost to open gap) is a base sequence, 11 when amino acid sequence, 2 when -E (Cost to extend gap) is base sequence, amino acid 1 for sequence, 1 q (Penalty for nucleotide mismatch; force 3, -r (reward for nucleotide match) is 1, -e (expect value) is 10, 11 if -W (wordsize) is a base sequence 3 residues for amino acid sequences, 20 if -y (Dropoff (X) for blast extensions in bits) is blastn, 7 for programs other than blastn,-X (X dropoff value for gapped alignment in bit s) force Si 5 and — Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits) 3 ⁇ 4 s 50 for blastn, 25 for programs other than blastn (http: ⁇ www.ncbi.nlm.nih.gov/ blast / html /blastcgihelp.html).
  • a polypeptide comprising a partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 can be produced by methods known to those skilled in the art, for example, the amino acid represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 It can be produced by culturing a transformant in which a part of the DNA encoding the sequence is deleted and an expression vector containing this is introduced. In addition, based on the polypeptide or DNA thus prepared, one or more amino acids are deleted, substituted or added in the partial sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6 by the same method as described above. A polypeptide having the determined amino acid sequence can be obtained.
  • an antibody that binds to ephrin B2 of the present invention and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue the ability to include polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, preferably monoclonal antibodies are used.
  • the monoclonal antibody include antibodies produced by wild and hybridomas, and recombinant antibodies produced by transformants transformed with an expression vector containing the antibody gene.
  • ibridoma for example, cells that express the above-mentioned ephrin B2 are prepared as antigens, and antibody-producing cells having antigen specificity are induced from animals immunized with the antigens. And can be prepared.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by culturing the hybridoma or by administering the hybridoma cell to an animal to cause ascites cancer, and separating and purifying the culture medium or ascites.
  • any animal can be used as long as it can produce wild and hybridomas, but mouse, rat, wild, muster, rabbit heron and the like are preferably used.
  • monoclonal antibodies, etc. produced by obtaining cells having antibody-producing ability from such animals, immunizing the cells with idim, and then fusing with myeloma cells and producing the ability of hybridomas are also included in the present invention. Included in antibodies.
  • Hypridoma VERB2 produced by Hypridoma VERB2.
  • Hypridoma VERB2 was entrusted to the Patent Biological Depositary Center of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST, Tsukuba 1-chome, 1-chome, 1-chome, 1-chuo, 6th), based on the Budapest Treaty as of August 19, 2004. Deposited as BP-10100.
  • the monoclonal antibody of the present invention also includes a monoclonal antibody that binds to an epitope to which the monoclonal antibody produced by the above-mentioned hyperidoma VERB2 (FERM BP-10100) binds.
  • a gene recombinant antibody is obtained by modifying the monoclonal antibody of the present invention using a gene recombination technique.
  • the recombinant antibody includes an antibody produced by genetic recombination, such as a humanized antibody, human antibody or antibody fragment.
  • the recombinant antibodies those having the characteristics of a monoclonal antibody and having a low antigenicity and an extended blood half-life are preferable as therapeutic agents.
  • the humanized antibody in the present invention refers to a human chimeric antibody and a human CDR (Complementarit y Determining Region; complementarity determining region; hereinafter referred to as CDR).
  • CDR Complementarit y Determining Region; complementarity determining region
  • a human chimeric antibody is composed of a heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) and a light chain variable region (hereinafter referred to as VL) of an antibody of a non-human animal, and a heavy chain constant region (hereinafter referred to as VL) of a human antibody.
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • VL heavy chain constant region
  • the human chimeric antibody of the present invention contains VH and VL from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that binds to ephrin B2 and inhibits ephrin B2 vascularization and breast tissue growth activity.
  • VH and VL from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that binds to ephrin B2 and inhibits ephrin B2 vascularization and breast tissue growth activity.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as "hlg"), but is preferably of the hlgG class, and more preferably hIgGl, hIgG2 belonging to the hlgG class. Any of the subclasses such as hIgG3 and hIgG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody any of those belonging to hlg can be used, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting the VH and VL CDR amino acid sequences of non-human animal antibodies to appropriate positions of the human antibody VH and VL.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention is a non-human antibody produced from a hybridoma that produces a monoclonal antibody that binds to ephrin-2 and inhibits the vascularization activity of ephrin-2 and the proliferation activity of mammary tissue.
  • VH and VL CDR amino acid sequences of human animal antibodies were grafted to VH and VL FRs of any human antibody to construct a cDNA encoding the V region and have genes encoding the human antibody CH and CL
  • Each can be inserted into an animal cell expression vector to construct a human CDR-grafted antibody expression vector and introduced into an animal cell for expression and production.
  • the CH of the human CDR-grafted antibody if it belongs to hlg! /, It may be anything! /, But the hlgG class is preferred, and hIgGl, hIgG2, Any of the subclasses hIgG3 and hIgG4 can be used.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody any of those belonging to hlg can be used. Togashi.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Also included are antibodies obtained from antibody-producing transgenic animal power.
  • Naturally occurring antibodies in the human body can be cultured by isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning the lymphocytes that produce the antibody.
  • the antibody can be purified from the culture supernatant.
  • a human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared for human B cell force into the phage gene. From the library, phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index. The antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule having two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, and transplanting the ES cell into an early mouse embryo, followed by generation.
  • Human antibody-producing transgenic animal-powered human antibodies can be produced in the culture supernatant by obtaining and culturing human antibody-producing hybridomas by a conventional hyperidoma production method for non-human animals. Can produce and accumulate human antibodies.
  • Examples of the antibody fragment of the present invention include peptides containing Fab, F (ab ') 2, Fab', scFv, diabody, dsFv and CDR.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain. It is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen binding activity bound by disulfide bond.
  • the Fab of the present invention can be obtained by treating a monoclonal antibody that binds to ephrin B2 and inhibits the angiogenic activity and mammary tissue growth activity of ephrin B2 with the proteolytic enzyme papain. .
  • the DNA encoding the Fab of the antibody is expressed in a prokaryotic expression vector.
  • Fab can be produced by inserting a vector into a eukaryotic expression vector and introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • F (ab ') 2 was constructed by decomposing the lower part of two disulfide bonds in the hinge region of IgG with the enzyme pepsin, and was composed of two Fab regions joined at the hinge region. This fragment has an antigen binding activity with a molecular weight of about 100,000.
  • F (ab ') 2 of the present invention is obtained by treating a monoclonal antibody that binds to ephrin B2 and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue with the protease pepsin. be able to.
  • the following Fab ′ can be produced by thioether bond or disulfide bond.
  • Fab ' is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen binding activity obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab') 2.
  • Fab 'of the present invention binds to ephrin B2 of the present invention and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue.
  • F (ab') 2 is a reducing agent dithiothreitol. It can be obtained by processing.
  • prokaryotic expression vector that encodes the Fab ′ fragment of the antibody! / ⁇ is expressed in a eukaryotic expression vector and introduced into the prokaryotic or eukaryotic vector.
  • Fab ′ can be produced.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P).
  • P an appropriate peptide linker
  • the scFv of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that binds to ephrin B2 of the present invention and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue, construct a DNA encoding scFv, insert the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, introduce the expression vector into a eukaryotic cell, scFv can be manufactured.
  • a diabody is an antibody fragment in which scFv is dimerized, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody of the present invention binds to ephrin B2 of the present invention, and angiogenesis of ephrin B2 Obtains cDNA that encodes VH and VL of monoclonal antibodies that inhibit the activity and proliferation activity of mammary tissue, and constructs the DNA encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of P is 8 residues or less
  • a diabody can be produced by inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector and introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • dsFv is obtained by binding a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Enginee ring, 7, 697-704, 1994).
  • the dsFv of the present invention obtains cDNA encoding VH and VL of a monoclonal antibody that binds to ephrin B2 of the present invention and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue, dsFv-encoding DNA is constructed, the DNA is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic expression, and expressed. dsFv can be manufactured.
  • the peptide containing CDR is constituted by including at least one region of CDR of VH or VL. Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via an appropriate peptide linker.
  • a peptide comprising the CDR of the present invention encodes the CDRs of monoclonal antibodies VH and VL that bind to ephrin B2 of the present invention and inhibit the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue.
  • a prokaryotic expression vector! / ⁇ is inserted into a eukaryotic expression vector and expressed by introducing the expression vector into prokaryotic or eukaryotic cells, including CDR Peptides can be produced.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as the Fmoc method (fluorylmethyloxycarbonyl method) or the t Boc method (t_butyloxycarbon method). it can.
  • the antibody of the present invention binds to the ephrin B2 of the present invention, and the antibody or antibody fragment that inhibits the angiogenic activity of the ephrin B2 and the proliferation activity of the mammary gland tissue contains a radioisotope, It includes derivatives of antibodies in which molecular drugs, high molecular drugs, proteins, etc., are conjugated chemically or genetically.
  • the derivative of the antibody of the present invention binds to ephrin B2 of the present invention and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of breast tissue, or the H chain or L chain of an antibody fragment.
  • ephrin B2 of the present invention binds to ephrin B2 of the present invention and encodes an antibody or an antibody fragment that inhibits the angiogenic activity and mammary tissue growth activity of ephrin B2, and binds ⁇ protein.
  • the DNA can be ligated, inserted into an expression vector, the expression vector is introduced into an appropriate host cell and expressed, and then produced.
  • radioisotope examples of the radioisotope, 131 1, 125 1 and the like, for example, can be conjugated to an antibody due chloramine T method.
  • alkylating agents such as nitrogen mustard and cyclophosphamide
  • antimetabolites such as 5-fluorouracil and methotrexate, daunomycin, bleomycin, mitomycin C, daunorubicin, doxorubicin and the like.
  • Anticancer agents such as antibiotics, hormonal agents such as plant anolekaloids such as vincristine, vinblastine, vindesine, tamoxifen, dexamethasone (Clinical Oncology, edited by Japan Clinical Oncology Society, Cancer and Chemotherapy, 1996), or Hyde mouth cortisone , Steroids such as prednisone, non-steroidal drugs such as aspirin and indomethacin, immunomodulators such as gold thiomalate and p-silamine, immunosuppressants such as cyclophosphamide and azathioprine, and chlorphenol maleate And anti-inflammatory agents such as antihistamines such as min and clemacitin (Inflammation and anti-inflammatory therapy, Ishiyaku Shuppan Co., Ltd., 1982).
  • hormonal agents such as plant anolekaloids such as vincristine, vinblastine, vindesine, tamoxifen, dexamethasone (Clinical Oncology,
  • daunomycin and antibody can be bound by binding between daunomycin and the amino group of the antibody via dartal aldehyde, or by binding the amino group of daunomycin to the carboxyl group of the antibody via water-soluble carpositimide. Can be given.
  • Polymeric drugs include polyethylene glycol (hereinafter referred to as PEG), albumi , Dextran, polyoxyethylene, styrene maleic acid copolymer, polybutylpyrrolidone, pyran copolymer, hydroxypropyl methacrylamide and the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • albumi Dextran
  • polyoxyethylene polyoxyethylene
  • styrene maleic acid copolymer polybutylpyrrolidone
  • pyran copolymer hydroxypropyl methacrylamide and the like.
  • a method of conjugating PEG with an antibody includes a method of reacting with a PEGylation modifying reagent (Bioconjugate Pharmaceutical, Yodogawa Shoten, 1993).
  • PEGylation modifying reagents include lysine ⁇ -amino group modifiers (JP-A 61-17 8926), aspartic acid and glutamic acid carboxyl group modifiers (JP-A 56-23 587), arginine gua- And a dino group modifier (JP-A-2-117920).
  • Examples of the protein include cyto force-in which activates immunocompetent cells, such as human interleukin 2, human granulocyte macrophage colony stimulating factor, human macrophage colony stimulating factor, human interleukin 12 and the like.
  • toxins such as ricin and diphtheria toxin having an activity of directly damaging cancer cells can be used.
  • a fusion antibody with a protein cDNA encoding the protein is linked to cDNA encoding the antibody or antibody fragment to construct a DNA encoding the fusion antibody, and the DNA is used for prokaryotic or eukaryotic organisms.
  • a fusion antibody can be produced by inserting into an expression vector and expressing the expression vector by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • Examples of the drug when the fusion antibody is used as a detection method, a quantification method, a detection reagent, a quantification reagent or a diagnostic agent include labels used in usual immunoassay methods.
  • Examples of the label include enzymes such as alkaline phosphatase, peroxidase, and luciferase, luminescent substances such as attalidum esters and mouth fins, and fluorescent substances such as FITC and RITC.
  • the biological activity of ephrin B2 may be any biological activity as long as ephrin B2 has, for example, an activity involved in angiogenesis.
  • the activity involved in angiogenesis includes, for example, arteriogenesis and invasion / migration of vascular endothelial cells.
  • Ephrin B2 used in the production of the antibody of the present invention is described in [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (and old bpnng Harbor Laboratory Press, 1989), Cur rent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987—1997). )] Can be produced by expressing DNA encoding ephrin B2 in a host cell, for example, by the following method.
  • the ephrin B2 to be expressed may be expressed in a soluble portion excluding the membrane-binding domain, which may be expressed in a membrane-bound state in the same manner as the wild-type ephrin B2.
  • the ephrin B2 to be expressed may be a full-length polypeptide of ephrin B2 or a part thereof.
  • a recombinant vector is prepared by inserting a full-length cDNA including the cDNA of the portion encoding the polypeptide downstream of the promoter of an appropriate expression vector. If necessary, prepare a DNA fragment of an appropriate length containing the ephrin B2 coding portion based on the full-length cDNA, and use the DNA fragment in place of the full-length cDNA. Also good. Subsequently, a transformant producing a polypeptide can be obtained by introducing the recombinant vector into a host cell suitable for the expression vector.
  • any strain can be used as long as it can express the target gene, such as Escherichia coli and animal cells.
  • the expression vector one that can autonomously replicate or integrate into a chromosome in the host cell to be used and contains an appropriate promoter at a position where DNA encoding ephrin B2 can be transcribed is used. .
  • the recombinant vector is capable of autonomous replication in a prokaryotic organism, and at the same time is used in a promoter, a ribosome binding sequence, and the present invention.
  • a vector containing DNA and a transcription termination sequence is preferred.
  • the recombinant vector may contain a gene that controls the promoter.
  • expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (all manufactured by Roche Diagnostics), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia), pSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega) , PQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYPIO (JP 58-110600), pKYP200 [A gricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 2 77 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci.
  • coli IGKA2 (FERM BP-6 798), JP 60-221091], pTerm2 (US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, Examples include pC194, pEG400 [j. BacterioL, 172, 2392 (1990)], pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), pME18SFL3, and the like.
  • the promoter may be any as long as it can function in the host cell to be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phage such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter, etc. can be mentioned.
  • artificially designed and modified promoters such as tandem promoter, tac promoter, lacT7 promoter, letl promoter, etc. in which two Ptrps are connected in series can also be used.
  • Shine'Dalgarno which is a ribosome binding sequence
  • a plasmid in which the distance between the sequence and the start codon is adjusted to an appropriate distance (eg 6 to 18 bases)! In the present invention! /
  • the base can be substituted so that it becomes the optimal codon for expression in the host, thereby reducing the target ephrin B2 production rate. It can be improved.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for gene expression in the above recombinant vector, but it is preferable to place a transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • a prokaryote used as such a host cell for example, a prokaryote belonging to the genus Escherichia can be used, and specifically, Escherichia coli XL1-Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Otsuki-recruited DH1 Otsuki-fungal MC1000, Otsuki-funded KY3276, Otsuki-funded W1485, Otsuki-funded JM109, E. coli HB101, E. coli No.49, E. coli W3110, E. coli NY49, etc. can be used.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)].
  • ephrin B2 used in the production of the antibody of the present invention is produced in E. coli, ephrin B2 is soluble in the cytoplasm, insoluble granules in the cytoplasm, or periplasmic space depending on the type of vector. It can be expressed in an expression mode such as a soluble form.
  • examples of expression vectors include pcDNAU pcD M8 (commercially available from Funakoshi), pAGE107 [JP-A-3-22979; Cytotechnology, 3, 133, (199 0)], pAS3 — 3 (JP-A-2-27075), pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 130 7 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can function in animal cells.
  • CMV cytomegalovirus
  • IE immediate early gene promoter
  • early sv40 Examples include promoters, retrovirus promoters, metallotine promoters, heat shock promoters, SRa promoters, and the like.
  • an enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with a promoter.
  • any method for introducing a recombinant vector any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into animal cells.
  • the electopore position method [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]
  • the calcium phosphate method JP-A-2-227075
  • the ribofusion method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • the transformant obtained as described above is cultured in a medium, and the ephrin B2 is produced and accumulated in the culture and collected from the culture to produce the ephrin B2 used in the present invention. can do.
  • the method for culturing the transformant in a medium can be carried out according to a usual method used for culturing a host.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • an inducer may be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium.
  • the lac promoter when cultivating a microorganism transformed with a recombinant vector using the lac promoter, when culturing a microorganism transformed with isopropyl- ⁇ -D-thiogalatatopyranoside, etc., or with a recombinant vector using the trp promoter.
  • Indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • a medium for culturing a transformant obtained using animal cells as a host a commonly used RPMI 1640 medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM Medium [Science, 122, 501 (1952)], Dulbecco's modified MEM medium [Virology, 8, 396 (1959)], 199 medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)] or these A medium obtained by adding fetal calf serum or the like to the medium can be used. Cultivation is usually carried out for 1 to 7 days under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and 5% CO. Also required during culture
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium.
  • a transformant derived from a microorganism or animal cell having a recombinant vector incorporating a DNA encoding ephrin B2 used in the production of the antibody of the present invention is cultured according to a normal culture method, and ephrin Ephrin B2 used in the production of the antibody of the present invention can be produced by producing and accumulating B2 and collecting it from the culture.
  • Ephrin B2 can be produced in a host cell or distributed outside the host cell. Depending on the host cell used and the structure of ephrin B2 to be produced, an appropriate method can be selected.
  • Ephrin B2 can be isolated and purified from the above culture or the like, for example, as follows.
  • ephrin B2 When ephrin B2 is expressed in a dissolved state in the cells, the cells are collected by centrifugation after culturing, suspended in an aqueous buffer, and then subjected to an ultrasonic crusher, a French press, a Mantongaurin homogenizer, A cell-free extract is obtained by disrupting the cells with dynomill or the like.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as ruaminoethyl (DEAE) -Sepharose and DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical), cation exchange chromatography using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Such as chromatography, hydrophobic chromatography using resins such as butyl sepharose and ferrule sepharose, gel filtration using molecular sieve, affinity chromatography, chromatofocusing, isoelectric focusing, etc. Purified preparations can be obtained using methods such as electrophoresis alone or in combination.
  • ephrin B2 When ephrin B2 is expressed by forming an insoluble granule in the cytoplasm, the cells are similarly collected and then crushed and centrifuged to obtain an insoluble granule of ephrin B2 as a precipitate fraction. Recover. The recovered insoluble granules of the protein are dissolved with a protein denaturant. By diluting or dialyzing the soluble solution, the protein is returned to a normal three-dimensional structure. After that, a purified preparation of ephrin B2 can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • a derivative such as ephrin B2 or a sugar modification product thereof When secreted extracellularly, a derivative such as ephrin B2 or a sugar modification product thereof can be recovered in the culture supernatant. That is, the culture supernatant is removed from the culture supernatant by treating the culture with a technique such as centrifugation as described above, and the same isolation and purification method as described above is used from the culture supernatant. As a result, a purified preparation can be obtained.
  • ephrin B2 When ephrin B2 is produced on the outer membrane, the cells are collected and disrupted, and then the cell membrane fraction is solubilized with an appropriate surfactant or the like and isolated in the same manner as described above. A purified sample can be obtained by using a purification method. In addition, when ephrin B2 is produced on the outer membrane, the expressed cells can be recovered and used as an immunogen.
  • Ephrin B2 can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-ptyloxycarbonyl method).
  • chemical synthesis can be performed using peptide synthesizers such as Advanced ChemTech, Norkin Enomer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthece U-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation.
  • Ephrin B2 obtained by the above method a peptide having a partial sequence of ephrin B2 or an ephrin B2-expressing cell can be used as an antigen.
  • mice 3 to 20-week-old mice, rats or hamsters are immunized with the antigen prepared as described above, and antibody-producing cells in the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the animals are collected.
  • Immunization is carried out in the subcutaneous or intravenous or intraperitoneal region of an animal together with an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine). Is administered.
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant, aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • the antigen is a partial peptide
  • a conjugate with a carrier protein such as BSA (cushion serum albumin) or KLH (Keyhole Limpet hemocyanin) is prepared and used as an immunogen.
  • BSA cushion serum albumin
  • KLH Keyhole Limpet hemocyanin
  • the antigen is administered 5 to 10 times every 1 to 2 weeks after the first administration. Three to seven days after each administration, blood is collected from the fundus venous plexus, and the serum reacts with the antigen using an enzyme immunoassay (Antibodies-A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)). The Mice, rats or hamsters whose serum showed a sufficient antibody titer against the antigen used for immunization are used as a source of antibody-producing cells.
  • Polyclonal antibodies can be prepared by separating and purifying the serum.
  • the polyclonal antibody strength binds to ephrin B2 and has the activity of inhibiting the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue by the method described in (6) below. Can do.
  • tissue containing antibody-producing cells such as spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster, and the antibody Producing cells are collected.
  • tissue containing antibody-producing cells such as spleen is removed from the immunized mouse, rat or hamster, and the antibody Producing cells are collected.
  • spleen cells spleen is shredded in MEM medium (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with tweezers, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant discarded, and Tris monosalt Treat with ammonia buffer (PH7.65) for 1-2 minutes to remove erythrocytes and wash with MEM medium 3 times to provide antibody producing cells for fusion.
  • myeloma cells cell lines obtained from mice are used.
  • myeloma cell line P3- X63Ag8- Ul P3-U1 (Current Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1, 1978), P3— NSl / 1 — Ag41 (NS— 1) (European J. Immunology, 6, 511, 1976), SP2 / 0-Agl4 (SP-2) (Nature, 276, 269, 197 8), P3- X63- Ag8653 (653) ( J.
  • HAT medium normal medium with hypoxanthine (104M), thymidine ( 1.5 X 10- 5 M) and suspended aminopterin (4 X 10- 7 M) in Ca ⁇ example media
  • HAT medium normal medium with hypoxanthine (104M), thymidine ( 1.5 X 10- 5 M) and suspended aminopterin (4 X 10- 7 M) in Ca ⁇ example media
  • a portion of the culture supernatant is taken to produce an antibody that binds to ephrin B2 and inhibits the angiogenic activity of ephrin B2 and the proliferation activity of mammary tissue by the hybridoma selection method described below. No, select a wel that includes an bridridoma.
  • the cloning was repeated twice by the limiting dilution method (1st time using HT medium (medium excluding HAT medium power aminopterin) and 2nd time using normal medium). Are selected as monoclonal antibody-producing hyperpridoma strains.
  • the subclass of the antibody is determined by enzyme immunoassay using a sub-clustering kit.
  • the amount of protein is quantified using the Raleigh method and absorbance at 280 ° C.
  • Examples of a method for selecting a hyperidoma producing a monoclonal antibody include the following methods.
  • a hybridoma producing a monoclonal antibody capable of specifically binding to ephrin B2 is selected using the following method.
  • the antigen protein or cells expressing the antigen protein are coated on a 96-well plate, and the reaction is carried out using the high-pridoma culture supernatant or the purified antibody obtained by the above method as the first antibody.
  • the antigenic protein include ephrin B2 prepared in (1) above, and specifically, soluble mouse ephrin B2-Fc (Blood, 98, 1028, 2001).
  • the cells expressing the antigen protein include cells expressing ephrin B2 prepared in (1) above. Specifically, the cells expressing mouse ephrin B2 described in (1) of Example 1 are expressed. Rati cells.
  • the plate is washed and the second antibody is added.
  • the second antibody is an antibody obtained by labeling an antibody capable of recognizing the immunoglobulin of the first antibody with piotin, an enzyme, a chemiluminescent substance or a radiation compound. Specifically, if a mouse is used in the preparation of the hyperidoma, an antibody capable of recognizing mouse immunoglobulin is used as the second antibody.
  • a reaction according to the substance labeled with the second antibody is performed, and it is selected as a hyperidoma that produces a monoclonal antibody that reacts specifically with the antigen. At this time, confirm that it does not react with other ephrin families, ephrin B1 and ephrin B3, by the same method.
  • a disease associated with ephrin B2 can be diagnosed.
  • the biological sample to be measured for ephrin B2 in the present invention includes ephrin B2 to be measured, such as tissue cells, blood, plasma, serum, knee fluid, urine, stool, tissue fluid, and culture fluid. Is not particularly limited as long as it may contain ephrin B2-expressing cells.
  • diseases associated with ephrin B2 include diseases involving angiogenesis.
  • diseases involving angiogenesis include growth or metastasis formation of solid tumors such as breast cancer, prostate cancer, colon cancer, stomach cancer, and lung cancer, arthritis in rheumatoid arthritis, retinopathy of diabetes, premature infant retina Diseases in which the pathology progresses due to angiogenesis abnormalities such as psoriasis and psoriasis.
  • diseases involving angiogenesis ephrin B2 are specifically expressed in the mammary epithelium, and therefore diseases involving ephrin B2 include diseases that cause breast tissue proliferation.
  • diseases that cause growth of mammary tissue include breast adenoma and breast cancer.
  • the diagnosis of a disease associated with angiogenesis can be performed, for example, as follows.
  • Biological strength of a plurality of healthy subjects Using the antibody or antibody fragment of the present invention, or a derivative thereof, a biological sample collected from several healthy individuals, ephrin B2 is detected or measured using the following immunological detection method. Investigate the abundance of ephrin B2 or ephrin B2 expressing cells in a biological sample of a healthy person. Similarly, the abundance of ephrin B2 or ephrin B2 expressing cells is also examined in the biological sample of the subject, and the abundance is compared with the abundance of healthy subjects. When the abundance of ephrin B2 or ephrin B2-expressing cells in the subject is increased compared to healthy subjects, it can be diagnosed that the cancer is positive.
  • the diagnostic agent containing the antibody or antibody fragment of the present invention or a derivative thereof may contain a reagent for performing an antigen-antibody reaction and a reagent for detecting the reaction, depending on the target diagnostic method.
  • the reagent for performing the antigen-antibody reaction include a buffer and a salt.
  • Detection reagents include antibodies or antibody fragments, or derivatives thereof, or conventional immunological methods such as labeled secondary antibodies that recognize antibodies or antibody fragments, or derivatives thereof, and substrates corresponding to the labels. Examples include reagents used in detection methods.
  • any known method may be mentioned.
  • immunological measurement methods can be mentioned.
  • An immunoassay is a method of measuring the amount of an antibody or the amount of an antigen using a labeled antigen or antibody.
  • the immunoassay includes radiolabeled immunoassay (RIA), enzyme immunoassay (EIA or ELISA), fluorescence immunoassay (FIA), and luminescence immunoassay. Standard methods (luminescent immunoassay), Western blotting, physicochemical detection methods (TI A, LAPIA, PCIA) and the like can be mentioned. As long as it is a method for detecting or measuring an antigen, any method may be used, but an immunoprecipitation method or a fluorescent cell staining method is preferable.
  • Radioactive-labeled immunoantibody method includes, for example, reacting an antibody of the present invention with an antigen or a cell expressing the antigen, and further reacting a radiolabeled anti-immunoglobin antibody or binding fragment. Then, measure with a scintillation counter.
  • an enzyme immunoassay for example, an antigen of the present invention is reacted with an antigen or a cell expressing the antigen, and a labeled anti-immunoglobulin antibody or binding fragment is used. After the reaction, the coloring dye is measured with an absorptiometer. For example, a sandwich ELISA method is used.
  • any known enzyme label edited by Koji Ishikawa et al., Enzyme immunoassay, Medical School
  • alkaline phosphatase label, peroxidase label, luciferase label, piotin label and the like can be used.
  • Sandwich ELISA is a method in which an antibody is bound to a solid phase and then measured! /, The antigen is trapped, and the second antibody reacts with the trapped antigen.
  • two types of antibodies or antibody fragments that recognize the measured antigen and have different antigen recognition sites are prepared, and one of the antibodies or antibody fragments is preliminarily placed on a plate (for example, 96 wells). Plate) and label the second antibody or antibody fragment with a fluorescent substance such as FITC, an enzyme such as peroxidase, or piotin.
  • antibody-adsorbed plate After the above-mentioned antibody-adsorbed plate is reacted with cells or its lysate, tissue or its lysate, cell culture supernatant, serum, pleural effusion, ascites, ophthalmic fluid, etc., separated from the living body, then labeled.
  • the detected monoclonal antibody or antibody fragment is reacted, and a detection reaction is performed according to the labeling substance.
  • the concentration of the test sample can be calculated from a calibration curve prepared by diluting antigens with known concentrations stepwise.
  • antibody fragments such as Fab, Fab ′, F (ab), etc., which may be either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, are used.
  • the combination of the two types of antibodies used in the sandwich ELISA method may be a combination of monoclonal antibodies or antibody fragments that recognize different epitopes, A combination of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody or antibody fragment may be used.
  • fluorescence immunoassay is described in the literature [Monoclonal Antibodies: Principles and practice, Third edition (Academic Press, 1996); Monoclonal antibody experiment manual (Kodansha Scientific, 1987)].
  • Method As the label used in the immunofluorescence assay, as described above, any known fluorescent label (Akira Kawao, fluorescent antibody method, Soft Science) can be used.
  • FITC tag, RITC tag, etc. can be used.
  • the label used in the luminescent immunoassay as described above is any known [Imai Kazuhiro, Bioluminescence and Chemiluminescence, Yodogawa Shoten; Clinical Examination 42 (1998) ] Of the luminescent material label.
  • an atelidum ester label, a mouth fin label, or the like can be used.
  • the physico-chemical detection method is to bind ephrin B2 as an antigen to an antibody or antiserum using an antibody or antiserum that specifically binds to ephrinB2. In More aggregates are formed and this aggregate is detected.
  • Other physicochemical detection methods include the capillary method, the one-dimensional immunodiffusion method, the immunoturbidimetric method, and the latex immunoturbidimetric method. [Proposal of clinical test methods, Kanbara Publishing, 499 (1998 )] 0
  • an antibody or antigen is sensitized and a carrier such as polystyrene latex having a particle size of about 0.1 to 1 ⁇ m is used to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antigen or antibody. Then, the scattered light in the reaction solution increases and the transmitted light decreases. By detecting this change as absorbance or integrating sphere turbidity, ephrin B2 can be measured.
  • the antibody of the present invention can bind to ephrin B2, it is preferably used for detection of ephrin B2-expressing cells.
  • ephrin B2-expressing cells For detection of ephrin B2-expressing cells, known immunological measurement methods can be used, but immunoprecipitation, fluorescent cell staining, immunohistochemical staining, and immunohistological staining are preferably used. It is done. In addition, fluorescent antibody staining using the FMAT8100HTS system (Applied Biosystems) can be used.
  • ephrin B2-expressing cells and the like are reacted with the monoclonal antibody or antibody fragment of the present invention, and then a carrier having specific binding ability to immunoglobulin such as protein G-sepharose is added. In this method, the antigen-antibody complex is precipitated. Yes! You can also do it by the following method.
  • the above-described antibody of the present invention is immobilized on a 96-well plate for ELISA, and then blocked with BSA-PBS. If the antibody is purified and is in a purified state such as a culture supernatant of a hyperidoma strain, anti-mouse immunoglobulin or rat immunoglobulin or protein A or G is added. Preliminarily immobilize on ELISA 96-well plate and block with BSA-PBS, then dispense and bind the Hypridoma strain culture supernatant. Discard the BSA-PBS, wash well with PBS, and then react with the lysate of cell tissue expressing ephrin B2. Immunoprecipitates are extracted from the well-washed plate with SDS-P AGE sample buffer and detected by Western blotting as described above.
  • Immune cell staining and immunohistochemical staining methods refer to cells or tissues that express an antigen.
  • the antibody of the present invention is reacted, and further, a fluorescent label such as fluorescin'isothiocyanate (FITC), peroxidase, etc.
  • FITC fluorescin'isothiocyanate
  • the label is visualized and viewed under a microscope, or a fluorescent-labeled antibody and a cell are reacted to produce a flow cytometer.
  • the fluorescent antibody staining method using the FMAT8100HTS system consists of the formed antibody-antigen complex and a free antibody or antigen not involved in the formation of the antibody-antigen complex. This is a homogenous assay method that can measure the amount of antigen or antibody without separating the antibody.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention binds to ephrin B2 and can treat diseases involving ephrin B2.
  • Diseases involving ephrin B2 include diseases associated with angiogenesis.
  • Diseases involving angiogenesis include growth or metastasis of solid tumors such as breast cancer, prostate cancer, colon cancer, stomach cancer, and lung cancer, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity, and psoriasis. Examples include diseases whose pathology progresses due to abnormal angiogenesis.
  • the therapeutic agent of the present invention includes a therapeutic agent for cancer involving ephrin B2, and cancer treatment by antibody-dependent cytotoxicity (ADCC), complement-dependent cytotoxicity (CDC), or apoptosis-inducing action. Agent is included.
  • ADCC antibody-dependent cytotoxicity
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • Agent is included.
  • Antibody-dependent cytotoxicity (ADCC) and complement-dependent cytotoxicity (CDC) possessed by an antibody can be measured, for example, by the method described in JP-A-6-205694.
  • An antibody having such activity can be used as a therapeutic agent for a disease because it can damage cells in which a specific antigen is expressed in ⁇ 2.
  • HgG class Human chimeric antibodies having human antibody constant regions, human CDR-grafted antibodies, and human antibodies are effectively used as therapeutic agents (Cancer Res., 56, 1118, 1996).
  • human-type chimeric antibodies, human-type CDR-grafted antibodies and human antibodies having human IgG class antibody constant regions containing the variable region CDRs of the antibodies damage ephrin B2-expressing cells in vivo or in idim.
  • Proliferation or metastasis of solid tumors such as breast cancer, prostate cancer, colon cancer, gastric cancer, lung cancer, arthritis in rheumatoid arthritis, diabetic retinopathy, retinopathy of prematurity and psoriasis It is useful for the treatment of diseases whose pathology progresses due to abnormalities.
  • ephrin B2 In addition to diseases involving angiogenesis, ephrin B2 is specifically expressed in the mammary epithelium. Therefore, it binds to ephrin B2 of the present invention and exhibits angiogenic activity and activity of ephrin B2.
  • Antibodies or antibody fragments that inhibit the growth activity of mammary gland tissue are useful in the treatment of diseases that cause mammary tissue growth.
  • diseases that cause growth of mammary tissue include, for example, breast adenoma and breast cancer.
  • the therapeutic agent containing the antibody or antibody fragment of the present invention or a derivative thereof may contain only the antibody or antibody fragment or the derivative thereof as an active ingredient, but is usually a drug. It is desirable to provide a pharmaceutical formulation prepared by any method well known in the pharmaceutical arts, mixed with one or more physically acceptable carriers.
  • the route of administration is preferably oral, for which it is desirable to use the most effective treatment, or parenteral, such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • parenteral such as buccal, respiratory, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous.
  • intravenous administration is desirable.
  • the dosage form include sprays, capsules, tablets, granules, syrups, emulsions, suppositories, injections, ointments, tapes and the like.
  • Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include sugars such as water, sucrose, sorbitol and fructose, darikols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p- Hydroxybenzoic acid ester It can be manufactured using preservatives such as strawberry, flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, It can be produced by using a binder such as bull alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • a binder such as bull alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Suitable formulations for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • An injection is prepared using a carrier made of a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the propellant is prepared using a carrier that does not irritate the antibody or antibody fragment itself or the recipient's oral cavity and respiratory mucosa and disperses the compound as fine particles to facilitate absorption.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • these parenteral preparations can be supplemented with the ingredients exemplified as additives for oral preparations.
  • the dose or frequency of administration varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc.
  • the usual adult dose is 10 g / kg to 8 mg / kg per day.
  • a mouse full-length ephrin B2 gene expression plasmid was prepared according to a known method (Blood, 98, 1028, 2001). Rati cells (Cancer Research, 46, 4787, 1986) were used as cells to immunize rats. The gene transfer was carried out using a ribofunction method (lipofectamine 2000; manufactured by Invitrogen). Transfected cells were supplemented with pesilin (100 units / ml) and streptomycin (100 ⁇ g / ml) (both from GIBCO) in DMEM medium containing 10% serum.
  • G418 (manufactured by GIBCO) was added at a final concentration of 500 ⁇ g / ml for surviving cells to serve as transgenic cells. These cells are seeded one by one in one well of a 96-well culture plate, the expanded cells are transferred to a 10 cm culture dish, and the culture dish force that occupies 80% of the cells in the culture dish is also EDTA. The cells were collected, and some of the cells were continuously cultured, and RNA and cell extracts were prepared from the remaining cells.
  • the extract was electrophoresed on an SDS gel, transferred to a nitrocellulose filter, and then subjected to Western blotting using a commercially available ephrin B2 polyclonal antibody (manufactured by SANTA CRUZ). Since Rati expresses rat ephrin B2, cells that have had a strong band detected with ephrin B2 antibody in cells that have not been transfected into non-transfected cells are candidates for cells into which mouse ephrin B2 has been introduced. chosen.
  • mouse ephrin B2 RT-PCR 5, -ATC TGTCTGCTTGGTCTTTATCAAC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • the PCR product was analyzed with the primer (5, -CTCTAGAGCCTCTGCTA ACCATGTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 8)), which is the base sequence of the above.
  • the resulting gene product is 387 bp.
  • the expression plasmid of ephrin B2-Fc gene and its soluble protein were purified according to the method described in Blood, 98, 1028, 2001.
  • a mouse full-length ephrin B2 gene expression plasmid was prepared according to a known method (Blood, 98, 1028, 2001). BaF / 3 cells not expressing mouse ephrin B2 (Cell, 41, 727, 1985) were used as cells for gene transfer.
  • a ribofunction (lipofectamine 2000; manufactured by invitrogen) was used for gene introduction.
  • Transfected cells were supplemented with penicillin (100 units / ml) and streptomycin (100 ⁇ g / ml) (V, both from GIBCO) in RPMI medium containing 10% serum, and G418 (GIBCO Manufactured at a final concentration of 500 ⁇ g / ml, and viable cells were used as transgenic cells.
  • 96 holes of these cells Seed each cell in a well of the culture plate, transfer the proliferated cells to a 10 cm culture dish, collect the culture dish force cells that occupied 80% of the culture dish, and partly fine cells. As the cell culture continued, RNA and cell extracts were made from the remaining cells.
  • the extract was electrophoresed on an SDS gel, transferred to a nitrocellulose filter, Western blotted with a commercially available ephrin B2 polyclonal antibody (manufactured by SANTA CRUZ), and ephrin B2 bands were detected.
  • a transgenic cell was established as a transgenic cell.
  • whether or not the mouse ephrin B2 gene has been introduced is determined by the nucleotide sequence of the mouse ephrin B2 RT-PCR primer (5, -ATCTGTCTGCTTGGTCTTTATCAAC-3, (SEQ ID NO: 9)) and the CAG promoter of the plasmid used for gene transfer. Analysis was performed with a certain primer (5, -CTCTAGAG CCTCTGCTAACCATGTTC-3, (SEQ ID NO: 10)) that can confirm the PCR product.
  • the resulting gene product is 387 bp.
  • Rati cells (2 ⁇ 10 8 cells) expressing mouse ephrin B2 obtained in (1) above were suspended in 500 1 phosphate buffer (PBS), and 8 weeks old female Fisher rats (manufactured by SLC, Japan) was administered intraperitoneally. This operation was performed every 2 weeks for a total of 4 doses. Blood was collected from the tail vein, the serum antibody titer was examined by the enzyme immunoassay shown below, and the spleen was removed 3 days after the final immunization from the rat that showed a sufficient antibody titer.
  • PBS phosphate buffer
  • the spleen is shredded in RPMI medium (manufactured by SIGMA), loosened with forceps while rubbing the spleen cut into a stainless steel mesh, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and then a cell strainer with a 40 ⁇ m pore. Cell mass was removed using BD Falcon. These were centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and the supernatant was discarded and used for cell fusion.
  • mice ephrin B2-Fc Dispense 1-10 ⁇ g / ml soluble mouse ephrin-2 Fc into a 96-well EIA plate (BD Falcon) at 50 ⁇ 1 / well each, and leave at 4 ° C overnight. It was adsorbed.
  • 1% BSA-PBS bovine serum albumin
  • 1% BSA-PBS bovine serum albumin
  • peroxidase-labeled goat anti-rat immunoglobulin manufactured by Biosource
  • Color was developed using [3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine] (manufactured by Wako Chemical), and the absorbance at OD450 nm was measured.
  • 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line X63-AG8 was cultured in RPMI medium containing 10% bovine serum, and at least 5 X 10 7 cells were secured at the time of cell fusion and used as the parent strain for cell fusion
  • the rat splenocytes obtained in (4) above and the myeloma cells obtained in (6) above were mixed at a ratio of 2: 1 (1 ⁇ 10 8 : 5 ⁇ 10 7 ) and centrifuged (1200 rpm 5 minutes), the supernatant was discarded, and the precipitated cells were thoroughly loosened. Then, 1 ml of a polyethylene glycol solution (manufactured by SIGMA) was added at 37 ° C. with stirring, and the mixture was allowed to stand for 2 minutes. Then, 20 ml of RPMI medium warmed to 37 ° C was added for 20 minutes while shaking the 50 ml tube in which the cells were suspended.
  • a polyethylene glycol solution manufactured by SIGMA
  • Incubator was cultured at 37 ° C for 10-14 days under 5% CO 2 in the incubator. This culture supernatant was used in Example (5).
  • VERB2 antibody The hybridoma strain (hereinafter referred to as VERB2) that produces anti-mouse ephrin B2 monoclonal antibody was established by repeating cloning twice and changing to normal medium.
  • the monoclonal antibody produced by Hypridoma strain VERB2 is called VERB2 antibody.
  • the antibody class of the VERB2 antibody was determined by an enzyme immunoassay using a sub-clustering kit [manufactured by Zymed]. The results are shown in Fig. 1.
  • the monoclonal antibodies established in the present invention were IgGl and kappa classes.
  • VERB2 antibody The specificity of the VERB2 antibody was confirmed using immune cell staining according to the following procedure.
  • Cells transfected gene mouse ephrin B2 cell lines Rati and Rati cells expressing the rat ephrin B2 voluntarily (Rati / Ephrin B2) l X 10 6 cells capacity 1.5ml enters tube (manufactured by Eppendor ⁇ 3 ⁇ 4)
  • the suspension was dispensed in 100 1 in an immune cell staining buffer (PBS containing 5% bovine serum).
  • This washing operation was further performed twice, and then an immune cell staining buffer 50 1 containing avidin-FITC (Pharmingen) at a concentration of 1/50 was added and reacted at 4 ° C for 30 minutes. After the reaction, the same washing operation as described above was performed three times, and then analysis was performed using a flow cytometer (manufactured by Becton).
  • Figure 4 shows the experimental results. No reaction was observed when no primary antibody was used or when a control antibody was used as the primary antibody, whereas a fluorescent reaction was confirmed by using VERB2 antibody as the primary antibody. Therefore, it was found that the VERB2 antibody recognizes human ephrin B2.
  • ephrin B2 is expressed in arteries but not in veins during fetal life. However, the strength that has been proved by detecting RNA. It has not been proved that ephrin B2 is expressed as a protein. Thus, expression analysis was performed using tissue sections of mouse embryos using the VERB2 antibody.
  • the fetus was removed from the uterus of the 13th day of pregnancy under a stereomicroscope (Leica) and permeated into PBS containing paraformaldehyde (Wako) at a concentration of 4% for 2 hours at 4 ° C. The tissue was fixed. Remove PBS containing paraformaldehyde and remove fetal tissue in PBS for 2 hours at 4 ° C. And soaked in PBS. The fetuses were dehydrated with PBS containing 40% methanol, 70% methanol and 100% methanol at 4 ° C for 20 minutes, respectively.
  • the fetus was shredded with a knife and permeated with a methanol solution containing 50 o / o polyester wax (Daiichi Kagaku Co., Ltd.) and 100% polyester powder at 42 ° C for 30 to 60 minutes. Further, this tissue was embedded in wax in a cassette, sliced into 8 m using a microtome (manufactured by Yamato Kagaku Co., Ltd.), fixed on a slide glass and dried. The tissue sections thus prepared were dewaxed with 100% ethanol, soaked in methanol containing 0.6% hydrogen peroxide and 0.2% sodium azide for 30 minutes at room temperature, and endogenous peroxidase-free I went live.
  • PBS blocking solution
  • a blocking solution containing 5% goat serum and 1% BSA was placed on the tissue slice and allowed to permeate at room temperature for 30 minutes to block the secondary antibody.
  • the blocking solution was discarded, and the VERB2 antibody was diluted with a blocking solution to a final concentration of 0.1-5 / zg / ml and reacted at room temperature or 4 ° C for 6-12 hours.
  • the antibody was discarded, and it was allowed to permeate in PBS (washing solution) containing 0.05% Tween20 at 4 ° C for 10 minutes, and the washing solution was discarded.
  • the VERB2 antibody showed a dark blue reaction in the dorsal artery, but no reaction in the vena cava. This indicates that the VERB2 antibody is an antibody that can be stained specifically in arteries in mouse fetuses.
  • VERB2 antibody was administered to pregnant mice and examined whether it could affect fetal angiogenesis.
  • the fetus of the womb that received the VERB2 antibody had an undeveloped vasculature with narrowed yolk sac blood vessels.
  • the blood vessels were significantly thinner and the number of blood vessels decreased compared to the fetus of the mother fetus administered with the control antibody.
  • red blood cells were not transported, and the fetus was anemic.
  • VERB2 remarkably suppresses angiogenesis
  • the antibody of the present invention is used as a therapeutic agent for suppressing angiogenesis that leads to worsening of the disease state in tumors and chronic inflammatory diseases. It was shown that it can be used.
  • Ephrin ⁇ 2 has been reported to be specifically expressed in the mammary epithelium connecting only blood vessels (Journal of Cell Science, 111, 2741 1998) Because knockout mice are lethal in the early stages of development, functional analysis of ephrin B2 in the mammary gland that can be analyzed in pregnant mice has not been performed. Therefore, we observed the function of ephrin B2 in relation to mammary gland development by administering VERB2 antibody to pregnant mice. Similar to the schedule described in (4) above, VERB2 antibody and control antibody were administered to pregnant mice.

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Abstract

　本発明は、エフリンB2に結合し、かつ、エフリンB2の血管新生活性および乳腺組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片を提供することを目的とし、腫瘍等の血管新生している組織細胞において発現されているエフリンB2に結合する抗体または抗体断片、該抗体または該抗体断片を用いるエフリンB2またはエフリンB2発現細胞の免疫学的検出方法および検出用試薬、該抗体または該抗体断片を用いるエフリンB2が関与する疾患の診断薬または治療薬、ならびに該抗体を産生するハイブリドーマを提供する。

Description

明 細 書
抗ェフリン B2抗体
技術分野
[0001] 本発明は、エフリン（Ephrin;Eph- receptor- interacting protein) B2に結合し、かつ、 エフリン B2の血管新生活性および乳腺組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体 断片、該抗体または該抗体断片を用いるエフリン B2またはエフリン B2発現細胞の免 疫学的検出方法および検出用試薬または定量用試薬、該抗体または該抗体断片を 用いる血管新生が関与する疾患の診断薬または治療薬および該抗体を産生するハ イブリドーマを提供する。該抗体はエフリン B2が関与する各種疾患の治療に有用で ある。また、該抗体はエフリン B2またはエフリン B2発現細胞を免疫学的手法により特 異的に検出することができ、エフリン B2が関与する各種疾患の診断に有用である。 背景技術
[0002] エフリン B2と EphB4(Erythopoietin producing hepatocellular carcinoma B4)は血管内 皮細胞上に発現する膜蛋白質である。エフリン B2は動脈内皮細胞と動脈周囲の血 管平滑筋細胞に、 EphB4は静脈内皮細胞に選択的に発現しているため（特許文献 1 、非特許文献 1〜3)、エフリン B2および EphB4は、これまで困難であった動脈と静脈 とを区別できるマーカーとなりうる。エフリン B2の遺伝子欠損マウスでは、動脈および 静脈の両方で血管新生に障害が発生し、発生初期で致死となる (非特許文献 1)。ま た、エフリン B2および Zまたは EphB4の遺伝子欠損マウスでは、血管新生に障害がも たらされ、胎生初期に致死となることからも、エフリン B2および EphB4は血管新生にお いて重要な役割を果たしている (非特許文献 1、 4)。
[0003] 種々の病態で生じる血管新生は、おもにその病変組織への酸素、栄養、炎症細胞 等の浸潤を補助するために形成されるものであり、これらの血流内環境因子はおもに 動脈を介して補給される。従って、種々の病態に関わる血管新生を阻害することによ りその病態を改善する際には、動脈の新生を阻害することが適切な手段である。
[0004] 動脈特異的にその新生を抑制する手段としては、エフリン B2の機能を抑制して、動 脈形成を抑制することが効果的であると考えられる。しかしながら、エフリン B2の機能 は未解明な点が多ぐ発生段階における血管形成、あるいは成熟体での血管新生へ のエフリン B2の機能は未知である。
[0005] これまでに、エフリン B2に反応するポリクローナル抗体については、マウスエフリン B 2のアミノ酸配列力 推測されたヒトエフリン B2の細胞外ドメインをゥサギに免疫して得 られたポリクローナル抗体 Epherin-B2 (P-20)、ヒトエフリン B2のアミノ酸配列の 168〜2 35番目のアミノ酸配列に相当するポリペプチドをゥサギに免疫して得られたポリクロー ナル抗体 Epherin-B2 (H-83)およびマウスエフリン B2のアミノ酸配列から推測されたヒ トェフリン B2の細胞外ドメインをャギに免疫して得られたポリクローナル抗体 Epherin- B2 (C-20)の 3種類のヒトエフリン B2に対するポリクローナル抗体が知られている（非 特許文献 5)。これらは、ヒト、マウスおよびラットのエフリン B2に反応するポリクローナ ル抗体であり、ウェスタンブロッテイングおよび免疫組織染色で使用できることが確認 されている。ポリクローナル抗体 Epherin-B2 (H-83)は、免疫沈降に用いることできる
[0006] エフリン B2に特異的に反応するモノクローナル抗体については、細胞蛍光抗体法 で利用するために作製されたサブクラスが IgMであるモノクローナル抗体 (非特許文 献 6)、マウスエフリン B2に反応するハムスターモノクローナル抗体であって、エフリン B2に特異的に結合し、マウスエフリン B2とエフリン B2の受容体の一つであるマウス Ep hB2の結合を in xiimの結合試験において、 60%に阻害するモノクローナル抗体が知 られている（特許文献 2)。
[0007] エフリン B2は血管新生への関与が示唆されている力 エフリン B2に結合し、エフリン B2の血管新生活性を阻害する抗体は知られていない。また、エフリン B2の血管組織 以外での機能としては、エフリン B2は哺乳動物の腺上皮細胞に発現しており、成体 の哺乳動物におけるホルモン依存的な形態形成に関与することおよびエフリン B2発 現の低下は腺の癌化に関与する可能性があることが指摘されている (非特許文献 7) 。し力しながら、エフリン B2が乳腺組織の増殖に関与することは知られていない。 特許文献 1：米国特許第 6579683号明細書
特許文献 2：米国特許公開公報第 2002-0136726号明細書
非特許文献 1 : Cell, 93, 741-753 (1998) 非特許文献 2 : Dev. Biol, 230, 151 (2001)
非特許文献 3 : Blood, 98, 1028 (2001)
非特許文献 4 : Mol. Cell, 4, 403 (1999)
非特許文献 5 : SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社ホームページ、 [on line] , [平成
16年 8月 21日検索]、インターネットく http://www.scbt.com/catalog/action.lasso?— r esponse=product— search— list. html&—Error=no— results. html&— token. order— ia=&search—f ield=ephnnB2&-nothing.x=8&-nothing.y=17
非特許文献 6 :Arterioscler Thromb Vase Biol, 23, 190 (2003)
非特許文献 7 Journal of Cell Science, 111, 2741(1998)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明の課題は、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳 腺組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片、該抗体または抗体断片を用い るエフリン B2の免疫学的検出方法および検出用試薬または定量用試薬、該抗体ま たは該抗体断片を用いるエフリン B2が関与する疾患の診断薬または治療薬、該抗体 を産生するハイプリドーマを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0009] 本発明は、以下の（1)〜（23)に関する。
[0010] (1) エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺組織の増殖 活性を阻害する抗体または抗体断片、
(2) エフリン B2が配列番号 2で表されるアミノ酸配列で示されるポリペプチドである、 (1)の抗体または抗体断片、
(3) 抗体が、モノクローナル抗体である（1)または（2)の抗体または抗体断片、
(4) モノクローナル抗体のクラスが IgGである（1)〜（3)のいずれかの抗体または抗 体断片、
(5) モノクローナル抗体が、ハイプリドーマ VERB2 (FERM BP- 10100)から生産され るモノクローナル抗体である（1)〜（4)の!、ずれかのモノクローナル抗体または抗体 断片、 (6) モノクローナル抗体が、ハイプリドーマ VERB2 (FERM BP-10100)から生産され るモノクローナル抗体が結合するェピトープと結合するモノクローナル抗体である（1) 〜（4)の、、ずれかのモノクローナル抗体または抗体断片、
(7) (1)〜（6)の 、ずれかの抗体または抗体断片を用いてエフリン B2を免疫学的に 検出する方法、
(8) 検出する方法が、免疫糸且織染色法である（7)の方法、
(9) 検出する方法が、免疫細胞染色法である（7)の方法、
(10) (1)〜（6)の 、ずれかの抗体または抗体断片を用いるエフリン B2の検出用試 薬、
(11) (1)〜（6)の 、ずれかの抗体または抗体断片を用いるエフリン B2の定量用試 薬、
(12) (1)〜（6)のいずれかの抗体または抗体断片を用いるエフリン B2が関与する 疾患の診断薬、
(13) エフリン B2が関与する疾患が、血管新生が関与する疾患である（12)の診断 薬、
(14) 血管新生が関与する疾患が固形腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、 未熟児網膜症および乾鮮からなる群から選択される疾患である（13)の診断薬、
(15) エフリン B2が関与する疾患が、乳腺組織の増殖をきたす疾患である（12)の診 断薬、
(16) 乳腺組織の増殖をきたす疾患が乳腺種または乳癌力 なる群力 選択される 疾患である（15)の診断薬、
(17) (1)〜（6)の 、ずれかの抗体または抗体断片を有効成分として含有するエフ リン B2が関与する疾患の治療薬、
(18) エフリン B2が関与する疾患が、血管新生が関与する疾患である（17)の治療 薬、
(19) 血管新生が関与する疾患が固形腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、 未熟児網膜症および乾鮮からなる群から選択される疾患である（18)の治療薬、
(20) エフリン B2が関与する疾患が、乳腺組織の増殖をきたす疾患である（17)の治 療薬、
(21) 乳腺組織の増殖をきたす疾患が乳腺種または乳癌力もなる群力 選択される 疾患である（20)の治療薬、
(22) (3)〜（6)の!、ずれかのモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ、なら びに
(23) ハイプリドーマがハイプリドーマ VERB2 (FERM BP- 10100)である、（22)のハ イブリドーマ。
発明の効果
[0011] 本発明により、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺 組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片、該抗体または該抗体断片を用い るエフリン B2またはエフリン B2発現細胞の免疫学的検出方法および検出用試薬また は定量用試薬、該抗体または該抗体断片を用いるエフリン B2が関与する疾患の診 断薬または治療薬および該抗体を産生するハイブリドーマが提供される。
[0012] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-244433号の明細書 および Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]作製した VERB2抗体のサブクラスタイピングの結果を示す。
[図 2]作製した VERB2抗体を用いたフローサイトメトリーでの、ラット及びマウスエフリン B2を染色した結果を示す。
[図 3]作製した VERB2抗体を用いたフローサイトメロリーの結果を示す。左段のカラム はエフリン B2を発現して!/、な!/、BaF/3細胞に対する、右段のカラムはエフリン B2を発 現している BaF/3/エフリン B2細胞に対するそれぞれの抗体の反応性を示す。図は上 から、一次抗体無し、一次抗体にコントロール抗体、一次抗体に VERB2抗体を用い たときの反応の結果をそれぞれ示す。
[図 4]作製した VERB2抗体を用いたフローサイトメトリーでの、ヒトエフリン B2を染色し た結果を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明は、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺組織 の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片に関する。
[0015] エフリン B2血管新生活性とは、例えば、固形腫瘍の増殖または転移形成に関わる 血管新生、糖尿病性網膜症または慢性関節リュウマチの病態形成あるいは促進に関 わる血管新生活性があげられる。
[0016] エフリン B2の乳腺組織の増殖活性とは、例えば、乳腺細胞、線維腺細胞または線 維上皮性細胞の増殖活性などがあげられる。
[0017] エフリン B2としては、いかなる生物種の由来であってもよいが、具体的には、 DNA配 列が配列番号 1、アミノ酸配列が配列番号 2でそれぞれ表されるヒトのエフリン B2、 DN A配列が配列番号 3、アミノ酸配列が配列番号 4でそれぞれ表されるマウスのエフリン B2、 DNA配列が配列番号 5、アミノ酸配列が配列番号 6でそれぞれ表されるラットの エフリン B2などがあげられる。
[0018] エフリン B2としては、配列番号 2、 4または 6で示されるアミノ酸配列を有するポリべ プチド、配列番号 2、 4または 6で示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠 失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに配列番号 2で 示されるアミノ酸配列と 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリべプチ ド、好ましくは 80%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、さらに 好ましくは 90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、最も好まし くは 95%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリべプチであって、エフリン B 2と実質的に同一の活性を有するポリペプチドなどがあげられる。
[0019] 配列番号 2、 4または 6で示されるアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置 換、または付カ卩されたアミノ酸配列を有するポリペプチドは、 [Molecular Cloning, A L aboratory Manual, second Edition (し old bpnng Harbor Laboratory Press, 1989)、 し rrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons 1987-1997)、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci" USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 3 4, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad.Sci USA, 82, 488 (1985) ]などに記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号 2 、4または 6で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DNAに部位特 異的変異を導入することにより得ることができる。欠失、置換または付加されるアミノ酸 の数は特に限定されないが、好ましくは 1個〜数十個、例えば、 1〜20個、より好まし くは 1個〜数個、例えば、 1〜5個である。
[0020] 本発明に記載される相同性の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の 相同性検索プログラムを用いて算出される数値であってょ 、が、塩基配列にっ 、て は、 BLAST [J. Mol. Biol, 215, 403 (1990)〕においてデフォルトパラメータを用いて 算出される数値など、アミノ酸配列については、 BLAST2 [Nucleic Acids Res., 25, 33 89 (1997)； Genome Res., 7, 649 (1997) ; http://www.ncbi.nlm.nih.gOv/Education/B LASTinfo/information3.html]にお!/、てデフォルトパラメータを用いて算出される数値 などがあげられる。
[0021] デフォルトパラメータ一としては、 G (Cost to open gap)が塩基配列の場合は 5、アミ ノ酸配列の場合は 11、 -E (Cost to extend gap)が塩基配列の場合は 2、アミノ酸配列 の場合は 1、一 q (Penalty for nucleotide mismatch;力 3、 -r (reward for nucleotide ma tch)が 1、 -e (expect value)が 10、 -W (wordsize)が塩基配列の場合は 11残基、ァミノ 酸配列の場合は 3残基、 -y (Dropoff (X) for blast extensions in bits)が blastnの場合 は 20、 blastn以外のプログラムでは 7、 - X (X dropoff value for gapped alignment in bit s)力 Si 5および— Z (final X dropoff value for gapped alignment in bits) ¾sblastnの場合 は 50、 blastn以外のプログラムでは 25である（http：〃 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html /blastcgihelp.html)。
[0022] 配列番号 2、 4または 6で示されるアミノ酸配列の部分配列を含むポリペプチドは、 当業者に公知の方法によって作製することができ、例えば、配列番号 2、 4または 6で 示されるアミノ酸配列をコードする DNAの一部を欠失させ、これを含む発現ベクター を導入した形質転換体を培養することにより作製することができる。また、こうして作製 されるポリペプチドまたは DNAに基づいて、上記と同様の方法により、配列番号 2、 4 または 6で示されるアミノ酸配列の部分配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換ま たは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを得ることができる。
[0023] 本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺組織 の増殖活性を阻害する抗体としては、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体 があげられる力 好ましくはモノクローナル抗体が用いられる。 [0024] モノクローナル抗体としては、ノ、イブリドーマにより生産される抗体、および抗体遺 伝子を含む発現ベクターで形質転換した形質転換体により生産される遺伝子組換え 抗体をあげることができる。
[0025] ノ、イブリドーマは、例えば上記のエフリン B2が発現した細胞などを抗原として調製し 、該抗原を免疫した動物より抗原特異性をもつ抗体生産細胞を誘導し、さらに、それ と骨髄腫細胞とを融合させて調製することができる。該ハイブリドーマを培養するか、 あるいは該ハイブリドーマ細胞を動物に投与して該動物を腹水癌化させ、該培養液 または腹水を分離、精製することにより本発明のモノクローナル抗体を取得すること ができる。
[0026] 抗原を免疫する動物としてはノ、イブリドーマを作製することが可能であれば、いかな るものも用いることができるが、マウス、ラット、ノ、ムスター、ラビットゥサギなどが好適に 用いられる。またこのような動物から抗体産生能を有する細胞を取得し、該細胞に idimで免疫を施した後に、ミエローマ細胞と融合して作製したノ、イブリドーマ力も生 産されるモノクローナル抗体なども本発明の抗体に包含される。
[0027] 本発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイプリドーマ VERB2が生産する ラット抗体 VERB2があげられる。ハイプリドーマ VERB2は 2004年 8月 19日付でブダぺ スト条約に基づき独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日 本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM BP-10100として寄 託されている。
[0028] また、本発明のモノクローナル抗体としては、上記のハイプリドーマ VERB2 (FERM BP-10100)により生産されるモノクローナル抗体が結合するェピトープに結合するモ ノクローナル抗体なども包含される。
[0029] 遺伝子組換え抗体は、上記本発明のモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を用 いて改変したものである。遺伝子組換え抗体としては、ヒト化抗体、ヒト抗体または抗 体断片など、遺伝子組換えにより製造される抗体を包含する。遺伝子組換え抗体に おいて、モノクローナル抗体の特徴を有し、抗原性が低ぐ血中半減期が延長された ものは、治療薬として好ましい。
[0030] 本発明におけるヒト化抗体とは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR (Complementarit y Determining Region;相補性決定領域;以下、 CDRと記す)移植抗体を包含する。
[0031] ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域 (以下、 VHと記す)およ び軽鎖可変領域 (以下、 VLと記す)とヒト抗体の重鎖定常領域 (以下、 CHと記す)お よび軽鎖定常領域 (以下、 CLと記す)とからなる抗体をいう。
[0032] 本発明のヒト型キメラ抗体は、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活 性および乳腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するハイブリド 一マより、 VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、ヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体 発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができ る。
[0033] ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン (以下、 hlgと表記する）に属すれ ばいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、 ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのものでもよぐ κクラスあるい は λクラスのものを用いることができる。
[0034] ヒト型 CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配 列をヒト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。
[0035] 本発明のヒト型 CDR移植抗体は、エフリン Β2に結合し、かつ、エフリン Β2の血管新 生活性および乳腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体を産生するハイブ リドーマから産生されるヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を 任意のヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植した V領域をコードする cDNAを構築し、ヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれ ぞれ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することに より発現させ、製造することができる。
[0036] ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すれば!/、かなるものでもよ!/、が、 hlgGク ラスのものが好適であり、さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4とい つたサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型 CDR移植抗体の CLとして は、 hlgに属すればいずれのものでもよぐ κクラスあるいはえクラスのものを用いるこ とがでさる。
[0037] ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、 細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリ 一およびヒト抗体産生トランスジエニック動物力 得られる抗体なども含まれる。
[0038] ヒト体内に天然に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィル スなどを感染させ不死化し、クローニングすること〖こより、該抗体を産生するリンパ球 を培養でき、培養上清中より該抗体を精製することができる。
[0039] ヒト抗体ファージライブラリ一は、ヒト B細胞力も調製した抗体遺伝子をファージ遺伝 子に挿入することにより Fab、 scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブ ラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標と して所望の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収す ることができる。該抗体断片は、さらに、遺伝子工学的手法により 2本の完全な H鎖お よび 2本の完全な L鎖力もなるヒト抗体分子へも変換することができる。
[0040] ヒト抗体産生トランスジヱニック動物は、ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物 を意味する。具体的には、例えば、マウス ES細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、該 ES細 胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジエニックマ ウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランスジエニック動物力ものヒト抗体の作 製方法は、通常のヒト以外の動物で行われているハイプリドーマ作製方法によりヒト抗 体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養上清中にヒト抗体を産生蓄積さ せることができる。
[0041] 本発明の抗体断片としては、 Fab、 F(ab')2、 Fab'、 scFv、 diabody, dsFvおよび CDR を含むペプチドなどがあげられる。
[0042] Fabは、 IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の 224 番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフイド 結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
[0043] 本発明の Fabは、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳 腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体を蛋白質分解酵素パパインで処 理して得ることができる。または、該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現べ クタ一ある!/ヽは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは 真核生物へ導入することにより発現させ、 Fabを製造することができる。
[0044] F(ab')2は、 IgGのヒンジ領域の 2個のジスルフイド結合の下部を酵素ペプシンで分 解して得られた、 2つの Fab領域がヒンジ部分で結合して構成された、分子量約 10万 の抗原結合活性を有するフラグメントである。
[0045] 本発明の F(ab')2は、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および 乳腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで 処理して得ることができる。または、下記の Fab'をチォエーテル結合あるいはジスルフ イド結合させ、作製することができる。
[0046] Fab'は、上記 F(ab')2のヒンジ領域のジスルフイド結合を切断した分子量約 5万の抗 原結合活性を有する抗体断片である。
[0047] 本発明の Fab'は、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性 および乳腺組織の増殖活性を阻害する F(ab')2を還元剤ジチオスレィトール処理して 得ることができる。または、該抗体の Fab'断片をコードする DNAを原核生物用発現べ クタ一ある!/ヽは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは 真核生物へ導入することにより発現させ、 Fab'を製造することができる。
[0048] scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する）を用 いて連結した、 VH- P-VLないしは VL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する 抗体断片である。
[0049] 本発明の scFvは、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性 および乳腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体の VHおよび VLをコード する cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現べク ターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物ある 、 は真核生物へ導入することにより発現させ、 scFvを製造することができる。
[0050] diabodyは、 scFvが二量体ィ匕した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体 断片である。二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原 結合活性とすることもできる。
[0051] 本発明の diabodyは、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生 活性および乳腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体の VHおよび VLをコ ードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを Pのアミノ酸配列の長さが 8残基以 下となるように構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現 ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによ り発現させ、 diabodyを製造することができる。
[0052] dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリ ペプチドを該システィン残基間のジスルフイド結合を介して結合させたものを ヽぅ。シ スティン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 (Protein Enginee ring, 7, 697-704, 1994)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することが できる。
[0053] 本発明の dsFvは、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性 および乳腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体の VHおよび VLをコード する cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現べク ターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物ある 、 は真核生物へ導入することにより発現させ、 dsFvを製造することができる。
[0054] CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構成 される。複数の CDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカ一を介して 結合させることができる。
[0055] 本発明の CDRを含むペプチドは、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2 の血管新生活性および乳腺組織の増殖活性を阻害するモノクローナル抗体の VHお よび VLの CDRをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターある!/ヽ は真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物 へ導入することにより発現させ、 CDRを含むペプチドを製造することができる。
[0056] また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc法（フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法）、 t Boc法 (t_ブチルォキシカルボ-ル法)などの化学合成法によって製造することもでき る。
[0057] 本発明の抗体は、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性 および乳腺組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片に放射性同位元素、低 分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などをィ匕学的あるいは遺伝子工学的に結合さ せた抗体の誘導体を包含する。
[0058] 本発明の抗体の誘導体は、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管 新生活性および乳腺組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片の H鎖あるい は L鎖の N末端側あるいは C末端側、抗体またはその抗体断片中の適当な置換基あ るいは側鎖、さらには抗体または抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子 の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法 (抗体工学入門、金光修著、地人 書館、 1994)により結合させることにより製造することができる。
[0059] また、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺 組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片をコードする DNAと、結合させた ヽ 蛋白質をコードする DNAを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを 適当な宿主細胞へ導入し、発現させること〖こより製造することができる。
[0060] 放射性同位元素としては、 1311、 1251などがあげられ、例えば、クロラミン T法などにより 抗体に結合させることができる。
[0061] 低分子の薬剤としては、ナイトロジェン 'マスタード、サイクロフォスフアミドなどのアル キル化剤、 5-フルォロウラシル、メソトレキセートなどの代謝括抗剤、ダウノマイシン、 ブレオマイシン、マイトマイシン C、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビ ンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物ァノレカロイド、タモキシフェン、 デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、 日本臨床腫瘍研究会 編、癌と化学療法社、 1996)、またはハイド口コーチゾン、プレドニゾンなどのステロイ ド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チォマレート、ぺ-シラミンな どの免疫調節剤、サイクロフォスフアミド、ァザチォプリンなどの免疫抑制剤、マレイン 酸クロルフエ-ラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗 炎症療法、医歯薬出版株式会社、 1982)などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと 抗体を結合させる方法としては、ダルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体 のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルポジイミドを介してダウノマイシンのァミノ 基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
[0062] 高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール (以下、 PEGと表記する）、アルブミ ン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビュルピロリ ドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの 高分子化合物を抗体または抗体断片に結合させることにより、（1)化学的、物理的あ るいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（2)血中半減期の顕著な延長、 (3)免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される (バイオコンジュゲ ート医薬品、廣川書店、 1993)。例えば、 PEGと抗体を結合させる方法としては、 PEG 化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる (バイオコンジュゲート医薬品、廣川 書店、 1993)。 PEG化修飾試薬としては、リジンの ε -ァミノ基の修飾剤（特開昭 61-17 8926)、ァスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特開昭 56-23 587)、アルギニンのグァ -ジノ基の修飾剤（特開平 2-117920)などがあげられる。
[0063] 蛋白質としては、免疫担当細胞を活性ィ匕するサイト力イン、例えば、ヒトインターロイ キン 2、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因 子、ヒトインターロイキン 12などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有 するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融 合抗体については、抗体または抗体断片をコードする cDNAに蛋白質をコードする c DNAを連結させ、融合抗体をコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物あるいは 真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ 導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
[0064] 融合抗体を検出方法、定量方法、検出試薬、定量試薬または診断薬として使用す る場合の薬剤としては、通常の免疫学的測定法で用いられる標識体があげられる。 標識体としては、アルカリフォスファターゼ、ペルォキシダーゼ、ルシフェラーゼなど の酵素、アタリジ-ゥムエステル、口フィンなどの発光物質、 FITC、 RITCなどの蛍光物 質などがあげられる。
[0065] エフリン B2の生物活性としては、エフリン B2が有する生物活性であればいずれでも よいが、例えば、血管新生に関与する活性などがあげられる。血管新生に関与する 活性としては、例えば、動脈形成、血管内皮細胞の浸潤'遊走の誘導などがあげられ る。
[0066] 以下に、本発明の抗体の製造方法について、具体的に説明する。 [0067] (1)抗原の調製
本発明の抗体の製造において用いられるエフリン B2は、 [Molecular Cloning, A La boratory Manual, Second Edition (し old bpnng Harbor Laboratory Press, 1989)、 Cur rent Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1987— 1997) ]などに記載さ れた方法などを用い、例えば以下の方法により、エフリン B2をコードする DNAを宿主 細胞で発現させて、製造することができる。発現させるエフリン B2は、野生型のエフリ ン B2と同様に膜に結合した状態で発現させてもよぐ膜結合ドメインを除いた可溶性 部分を発現させてもよい。また、発現させるエフリン B2は、エフリン B2の全長のポリべ プチドであっても、一部分であってもよい。
[0068] まず、該ポリペプチドをコードする部分の cDNAを含む完全長 cDNAを適当な発現 ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製する。こ の際もし必要であれば、完全長 cDNAをもとにしてエフリン B2をコードする部分を含む 適当な長さの DNA断片を調製し、上記完全長 cDNAの代わりに該 DNA断片を使用し てもよい。次いで、該組換えベクターを、該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入 することにより、ポリペプチドを生産する形質転換体を得ることができる。
[0069] 宿主細胞としては、大腸菌、動物細胞など、目的とする遺伝子を発現できるもので あれば!/、ずれをも用いることができる。
[0070] 発現ベクターとしては、使用する宿主細胞において自律複製または染色体中への 組込が可能で、エフリン B2をコードする DNAを転写できる位置に適当なプロモーター を含有して 、るものが用いられる。
[0071] 大腸菌などの原核生物を宿主細胞として用いる場合には、該組換えベクターは、 原核生物中で自律複製が可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、 本発明にお 、て用いられる DNAおよび転写終結配列を含むベクターであることが好 ましい。該組換えベクターは、さら〖こ、プロモーターを制御する遺伝子を含んでいても よい。
[0072] 発現ベクターとしては、例えば、 pBTrp2、 pBTacl、 pBTac2 (いずれも Roche Diagnos tics社製）、 pKK233-2 (Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 pGEMEX- 1 (P romega社製）、 pQE- 8 (QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 pKYP200 [A gricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)]、 pLSAl [Agric. Biol. Chem., 53, 2 77 (1989)]、 pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)]、 pBluescriptll SK (- Stratagene社製）、 pTrs30 [大腸菌 JM109/pTrS30 (FERM BP- 5407)より調製]、 p Trs32 [大腸菌 JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408)より調製]、 pGHA2 [大腸菌 IGHA2 (FERM BP- 400)より調製、特開昭 60- 221091]、 pGKA2 [大腸菌 IGKA2 (FERM BP- 6 798)より調製、特開昭 60- 221091]、 pTerm2 (US4686191、 US4939094, US5160735) 、 pSupex、 pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400[j. BacterioL, 172, 2392 (1990)]、 pGEX (Pharmacia社製）、 pETシステム（Novagen社製）、 pME18SFL3などをあげることができ る。
[0073] プロモーターとしては、使用する宿主細胞中で機能を発揮できるものであればいか なるものでもよい。例えば、 trpプロモーター（Ptrp)、 lacプロモーター、 PLプロモータ 一、 PRプロモーター、 T7プロモーターなどの、大腸菌やファージなどに由来するプロ モーターなどをあげることができる。また、 Ptrpを 2つ直列させたタンデムプロモーター 、 tacプロモーター、 lacT7プロモーター、 letlプロモーターなどのように、人為的に設計 改変されたプロモーターも用いることができる。
[0074] また、上記組換えベクターとしては、リボソーム結合配列であるシャイン'ダルガルノ
(Shine-Dalgarno)配列と開始コドンとの間を適当な距離 (例えば 6〜18塩基）に調節 したプラスミドを用いることが好まし!/、。本発明にお！/、て用いられるエフリン B2をコード する DNAの塩基配列においては、宿主内での発現に最適なコドンとなるように塩基を 置換することができ、これにより、 目的とするエフリン B2の生産率を向上させることがで きる。さらに、上記組換えベクターにおける遺伝子の発現には転写終結配列は必ず しも必要ではな 、が、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ま 、
[0075] このような宿主細胞として用いられる原核生物としては、例えば、ェシエリヒア属など に属する原核生物を用いることができ、具体的には大腸菌 XL1-Blue、大腸菌 XL2- Blue,大月募菌 DH1、大月募菌 MC1000、大月募菌 KY3276、大月募菌 W1485、大月募菌 JM1 09、大腸菌 HB101、大腸菌 No.49、大腸菌 W3110、大腸菌 NY49などが用いること ができる。 [0076] 組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へ DNAを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法 [Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、 Gene, 17, 107 (1982)、 Molecular & General Genetic s, 168, 111 (1979) ]に記載の方法などをあげることができる。
[0077] 本発明の抗体の製造において用いられるエフリン B2を大腸菌で生産した場合には 、ベクターの種類によりエフリン B2は、細胞質内に可溶型として、細胞質内に不溶性 顆粒としてまたはペリプラズミックスペースに可溶型としてなどの発現様式で発現させ ることがでさる。
[0078] 動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、 pcDNAU pcD M8 (フナコシ社より市販）、 pAGE107 [特開平 3- 22979 ; Cytotechnology, 3, 133, (199 0)]、 pAS3— 3 (特開平 2— 227075)、 pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)]、 pcDNAI/Am p (Invitrogen社製）、 pREP4 (Invitrogen社製）、 pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 130 7(1987)]、 pAGE210、 pME18SFL3などをあげることができる。
[0079] プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用い ることができ、例えば、サイトメガロウィルス（CMV)の IE (immediate early)遺伝子のプ 口モーター、 sv40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチォネィ ンプロモーター、ヒートショックプロモーター、 SR aプロモーターなどをあげることがで きる。また、ヒト CMVの IE遺伝子のェンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
[0080] 宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa)細胞、サルの細胞である C OS細胞、チャイニーズ'ノ、ムスターの細胞である CHO細胞、 HBT5637細胞（特開昭 6 3-299)などをあげることができる。
[0081] 組換えベクターの導入方法としては、動物細胞に DNAを導入する方法であればい ずれも用いることができ、例えば、エレクト口ポレーシヨン法 [Cytotechnology, 3, 133 ( 1990) ]、リン酸カルシウム法（特開平 2- 227075)、リボフヱクシヨン法 [Proc. Natl. Acad . Sci. USA, 84, 7413 (1987) ]などをあげることができる。
[0082] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold bpnng Haroor Laboratory Press, 1989ノ」【こ ti載 れて いる方法などに準じて、分泌生産、融合蛋白質発現などを行うことができる。真核生 物由来の細胞で発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたエフリン B2を得 ることがでさる。
[0083] 以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に該ェフリン B2を 生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明において用いられるエフリ ン B2を製造することができる。該形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養 に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
[0084] プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した 微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはイソプロピル- β -D-チォガラタトピラノシドなどを、 trpプロモーターを用いた 組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸など を培地に添カ卩してもよい。
[0085] 動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用さ れている RPMI 1640培地 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967) ]、 Eagleの MEM培地 [Science, 122, 501 (1952) ]、ダルベッコ改変 MEM培地 [ Virology, 8, 396 (1959) ]、 199培地 [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950) ]または これら培地に牛胎児血清などを添加した培地などを用いることができる。培養は、通 常 pH6〜8、 30〜40°C、 5%CO存在下などの条件下で 1〜7日間行う。また、培養中必
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要に応じて、カナマイシン、ペニシリンなどの抗生物質を培地に添加してもよい。 上記のとおり、本発明の抗体の製造において用いられるエフリン B2をコードする DN Aを組み込んだ組換えベクターを保有する微生物、動物細胞など由来の形質転換体 を、通常の培養方法に従って培養してエフリン B2を生成蓄積させ、該培養物より採取 することにより、本発明の抗体の製造において用いられるエフリン B2を製造することが できる。
[0086] 遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition (Cold bpnng Haroor Laboratory Press, 1989ノ」【こ ti載 れて いる方法などに準じて、分泌生産、融合蛋白質発現などを行うことができる。
エフリン B2の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分 泌させる方法、および宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞 や、生産させるエフリン B2の構造を変えることにより、適切な方法を選択することがで きる。
[0087] エフリン B2が宿主細胞内または宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンら の方法 [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989) ]、ロウらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci., U SA, 86, 8227 (1989)、 Genes Develop., 4, 1288 (1990)、特開平 05- 336963または WO 94/23021 ]などに記載の方法を準用することにより、該遺伝子産物を宿主細胞外に 積極的に分泌させることもできる。また、特開平 2-227075号公報に記載されている方 法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などを用いた遺伝子増幅系を利用して生 産量を上昇させることもできる。
[0088] エフリン B2は、例えば、以下のようにして、上記の培養物などから単離 ·精製するこ とがでさる。
[0089] エフリン B2が細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後に細胞を遠心分 離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウ リンホモゲナイザー、ダイノミルなどにより細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無 細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、 即ち、溶媒抽出法、硫安などによる塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジェチ ルアミノエチル（DEAE)—セファロース、 DIAION HPA-75 (三菱化学社製）などのレジ ンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、 S- Sepharose FF ( Pharmacia社製）など のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フエ-ルセ ファロースなどのレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ 過法、ァフィユティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳 動などの電気泳動法などの手法を単独または組み合わせて用い、精製標品を得るこ とがでさる。
[0090] また、エフリン B2が細胞質内に不溶性顆粒を形成して発現した場合は、同様に細 胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として該ェフリン B2の不溶 性顆粒を回収する。回収した該蛋白質の不溶性顆粒を蛋白質変性剤で可溶ィ匕する 。該可溶ィ匕液を希釈または透析することにより、該蛋白質を正常な立体構造にまき戻 した後、上記と同様の単離精製法によりエフリン B2の精製標品を得ることができる。
[0091] エフリン B2またはその糖修飾体などの誘導体が細胞外に分泌された場合には、培 養上清において、エフリン B2またはその糖修飾体などの誘導体を回収することができ る。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離などの手法により処理することにより、固 形物を取り除いた培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を 用いることにより、精製標品を得ることができる。
[0092] エフリン B2が細胞外膜上に生産された場合には、細胞を回収、破砕した後、細胞 膜画分を適当な界面活性剤などで可溶ィ匕し、上記と同様の単離精製法を用いること により、精製標品を得ることができる。また、エフリン B2が細胞外膜上に生産された場 合には、該発現細胞を回収して免疫原に用いることもできる。
[0093] また、エフリン B2は、 Fmoc法（フルォレ-ルメチルォキシカルボ-ル法）、 tBoc法 (t —プチルォキシカルボニル法)などの化学合成法によっても製造することができる。ま た、 Advanced ChemTech社、ノ ーキン 'ェノレマー社、 Pharmacia社、 Protein Technolo gy Instrument社、 SyntheceU- Vega社、 PerSeptive社、島津製作所などのペプチド合 成機を利用して化学合成することもできる。
[0094] 上記の方法により得られるエフリン B2、エフリン B2の部分配列を有するペプチドまた はエフリン B2発現細胞を抗原として用いることができる。
[0095] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
3〜20週令のマウス、ラットまたはハムスターなどに上記のように調製した抗原を免 疫して、その動物の脾臓、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を採取する。
[0096] 免疫は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹腔内に、適当なアジュバント〔例え ば、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund' s Adjuvant)や水酸化アルミ-ゥ ムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕とともに抗原を投与することにより行う。抗原が部分べ プチドである場合には、 BSA (ゥシ血清アルブミン）や KLH (Keyhole Limpet hemocyan in)などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いる。
[0097] 抗原の投与は、 1回目の投与の後 1〜2週間おきに 5〜10回行う。各投与後 3〜7日 目に眼底静脈叢より採血し、その血清が抗原と反応することを酵素免疫測定法〔Anti bodies - A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)〕などで べ る。免疫に用いた抗原に対し、その血清が十分な抗体価を示したマウス、ラットまたは ハムスターを抗体産生細胞の供給源として用いる。
[0098] ポリクローナル抗体は、該血清を分離、精製することにより調製することができる。該 ポリクローナル抗体力 エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性およ び乳腺組織の増殖活性を阻害する活性を有していることは、後述 (6)に記載の方法 で調べることができる。
[0099] 抗体産生細胞と骨髄腫細胞の融合に供するにあたって、抗原の最終投与後 3〜7 日目に、免疫したマウス、ラットまたはハムスターより脾臓などの抗体産生細胞を含む 組織を摘出し、抗体産生細胞を採取する。脾臓細胞を用いる場合には、脾臓を MEM 培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離 (1200rpm、 5分間） した後、上清を捨て、トリス一塩ィ匕アンモ-ゥム緩衝液 (PH7.65)で 1〜2分間処理し赤 血球を除去し、 MEM培地で 3回洗浄して融合用抗体産生細胞として提供する。
[0100] (3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使用する。たとえば、 8-ァザグ ァニン耐性マウス (BALB/cマウス由来)骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- Ul (P3-U1) (Curr ent Topics in Microbiology and Immunology, 18, 1 , 1978)、 P3— NSl/1— Ag41(NS— 1) ( European J. Immunology, 6, 511 , 1976)、 SP2/0- Agl4(SP- 2) (Nature, 276, 269, 197 8)、 P3- X63- Ag8653(653) ( J. Immunology, 123, 1548, 1979)、 P3- X63- Ag8(X63) (Nat ure, 256, 495, 1975)などが用いられる。これらの細胞株は、 8-ァザグァニン培地〔RP MI- 1640培地にク' レタミン (1.5mM)、 2-メルカプトエタノール (5 X 10— 5M)、ジェンタマ イシン（10 μ g/ml)および牛胎児血清 (FCS)を加えた培地（以下、正常培地と 、う。） に、さらに 8-ァザグァニン（15 g/ml)をカ卩えた培地〕で継代する力 細胞融合の 3〜4 日前に正常培地に継代し、融合当日 2 X 107個以上の細胞数を確保する。
[0101] (4)細胞融合
前述した抗体産生細胞と骨髄腫細胞を MEM培地または PBS (リン酸ニナトリウム 1.8 3g、リン酸一カリウム 0.21g、食塩 7.65g、蒸留水 1リットル、 pH7.2)でよく洗浄し、細胞 数力 抗体産生細胞:骨髄腫細胞 =5〜10: 1になるよう混合し、遠心分離（1200rpm、 5 分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで 、ポリエチレングライコ一ルー 1000 (PEG-1000) 2g、 MEM 2mlおよびジメチルスルホキ シド 0.7mlの混液の 0.2〜lmlを、 1 X 108個の抗体産生細胞に加え、 1〜2分間毎に ME M培地 l〜2mlを数回加えた後、 MEM培地をカ卩えて全量が 50mlになるようにする。遠 心分離 (900rpm、 5分間）後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピペット による吸込み、吹出しでゆるやかに細胞を HAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（ 10 4M)、チミジン（1.5 X 10— 5M)およびアミノプテリン（4 X 10— 7M)をカ卩えた培地〕 100ml中 に懸濁する。この懸濁液を 96ゥエル培養用プレートに 100 1/ゥエルずつ分注し、 5% COインキュベータ一中、 37°Cで？〜 14日間培養する。
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[0102] 培養後、培養上清の一部をとり後述するハイブリドーマの選択方法により、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺組織の増殖活性を阻害 する抗体を生産するノ、イブリドーマを含むゥエルを選択する。ついで、限界希釈法に よりクロー-ングを 2回繰り返し〔1回目は、 HT培地（HAT培地力 アミノプテリンを除 いた培地）、 2回目は、正常培地を使用する〕、安定して強い抗体価の認められたもの をモノクローナル抗体産生ハイプリドーマ株として選択する。
[0103] (5)モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理〔2,6, 10, 14-テトラメチルペンタデカン（Pristane) 0.5mlを腹腔内投与 し、 2週間飼育する〕した 8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、上記 (4)で得られ た抗エフリン B2モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞 2 X 106〜5 X 107細胞/匹 を腹腔内注射する。 10〜21日でハイプリドーマは腹水癌化する。このマウス力も腹水 を採取し、遠心分離 (3000rpm、 5分間）して固形分を除去後、 40〜50%硫酸アンモニ ゥムで塩祈した後、力プリル酸沈殿法、 DEAE-セファロースカラム、プロテイン A-カラ ムあるいはゲル濾過カラムによる精製を行ない、 IgGあるいは、 IgM画分^^め、精製 モノクローナル抗体とする。
[0104] 抗体のサブクラスの決定は、サブクラスタイピングキットを用いて酵素免疫測定法に より行う。蛋白量の定量は、ローリー法および 280應での吸光度より算出する。
[0105] (6)ハイプリドーマの選択方法
本発明の血管新生の阻害活性および乳腺組織の増殖阻害活性を有する、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺組織の増殖活性を阻害 するモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマを選択する方法としては、例えば、 以下の方法があげられる。
[0106] まず、以下の方法を用いて、エフリン B2に特異的に結合できるモノクローナル抗体 を生産するハイブリドーマを選択する。抗原蛋白質あるいは抗原蛋白質を発現した 細胞などを 96ゥエルプレートにコートし、ハイプリドーマ培養上清もしくは上述の方法 で得られる精製抗体を第一抗体として反応させる。抗原蛋白質としては、上記（1)で 作製されたエフリン B2などがあげられる力 具体的には、可溶性マウスエフリン B2-Fc (Blood, 98, 1028, 2001)があげられる。抗原蛋白質を発現した細胞としては、上記（1 )で作製されたエフリン B2を発現する細胞などがあげられるが、具体的には、実施例 1の (1)に記載のマウスエフリン B2を発現する Rati細胞があげられる。
[0107] 第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加する。
[0108] 第二抗体とは、第一抗体のィムノグロブリンを認識できる抗体を、ピオチン、酵素、 化学発光物質あるいは放射線化合物等で標識した抗体である。具体的にはハイプリ ドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としては、マウスィムノグロブ リンを認識できる抗体を用 、る。
[0109] 反応後、第二抗体を標識した物質に応じた反応を行ない、抗原に特異的に反応す るモノクローナル抗体を生産するハイプリドーマとして選択する。このとき、同様の方 法により、他のエフリンファミリーであるエフリン B1およびエフリン B3と反応しないことを 確認してちょい。
[0110] 得られたモノクローナル抗体が、血管新生の阻害活性および乳腺組織の増殖阻害 活性を有することは、例えば、実施例 2の (4)または（5)に記載の方法により、確認す ることがでさる。
[0111] (7)本発明の抗体を用いた疾患の診断方法
本発明の抗体または抗体断片を用いて生体試料中のエフリン B2を測定することに より、エフリン B2が関連する疾患を診断することができる。
[0112] 本発明においてエフリン B2を測定する対象となる生体試料としては、組織細胞、血 液、血漿、血清、膝液、尿、糞便、組織液、培養液など、測定しょうとするエフリン B2ま たはエフリン B2発現細胞を含む可能性のあるものであれば特に限定されない。 [0113] エフリン B2が関連する疾患としては、例えば、血管新生が関与する疾患があげられ る。血管新生が関与する疾患の具体例としては、乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、肺 癌などの固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リウマチにおける関節炎、糖 尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾癬などの血管新生の異常により病態が進行 する疾患などがあげられる。
[0114] また、血管新生が関与する疾患以外にも、エフリン B2は乳腺上皮に特異的に発現 しているので、エフリン B2が関与する疾患としては、乳腺組織の増殖をきたす疾患な ども包含される。乳腺組織の増殖をきたす疾患の具体例としては、乳腺腫、乳癌など があげられる。
[0115] 血管新生が関与する疾患の診断は、例えば、以下のようにして行うことができる。
[0116] 複数の健常者の生体力 採取した生体試料について、本発明の抗体または抗体 断片、またはこれらの誘導体を用い、下記の免疫学的検出法を用いて、エフリン B2の 検出あるいは測定を行い、健常者の生体試料中のエフリン B2またはエフリン B2発現 細胞の存在量を調べておく。被験者の生体試料中についても同様にエフリン B2また はエフリン B2発現細胞の存在量を調べ、その存在量を健常者の存在量と比較する。 被験者のエフリン B2またはエフリン B2発現細胞の存在量が健常者と比較して増加し ている場合には、癌が陽性であると診断できる。
[0117] 本発明の抗体または抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する診断薬は、目的 の診断法に応じて、抗原抗体反応を行なうための試薬、該反応の検出用試薬を含ん でもよい。抗原抗体反応を行なうための試薬としては、緩衝剤、塩などがあげられる。 検出用試薬としては、抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体、または抗体もし くは抗体断片、またはこれらの誘導体を認識する標識された二次抗体、標識に対応 した基質などの通常の免疫学的検出法に用いられる試薬があげられる。
[0118] 本発明においてエフリン B2またはエフリン B2発現細胞を定量する方法としては、任 意の公知の方法があげられる。例えば、免疫学的測定方法などがあげられる。
[0119] 免疫学的測定法とは、標識を施した抗原または抗体を用いて、抗体量または抗原 量を測定する方法である。免疫学的測定方法としては、放射性物質標識免疫抗体法 (RIA)、酵素免疫測定法 (EIAまたは ELISA)、蛍光免疫測定法 (FIA)、発光免疫測 定法（luminescent immunoassay)、ウェスタンブロット法および物理化学的検出法（TI A, LAPIA, PCIA)などがあげられる。抗原の検出または測定を行う方法であればい 力なる方法でもよ 、が好ましくは免疫沈降法または蛍光細胞染色法があげられる。
[0120] 放射性物質標識免疫抗体法 (RIA)としては、例えば、抗原または抗原を発現した 細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに放射線標識を施した抗ィムノグロプリ ン抗体または結合断片を反応させた後、シンチレーシヨンカウンターなどで測定する 方法があげられる。
[0121] 酵素免疫測定法 (EIAまたは ELISA)としては、例えば、抗原または抗原を発現した 細胞などに、本発明の抗体を反応させ、さらに標識を施した抗ィムノグロブリン抗体ま たは結合断片を反応させた後、発色色素を吸光光度計で測定する方法があげられ、 例えばサンドイッチ ELISA方などが用いられる。酵素免疫測定法で用いる標識体とし ては、前述のとおり、任意の公知 (石川榮次ら編、酵素免疫測定法、医学書院)の酵 素標識を用いることができる。例えば、アルカリフォスファターゼ標識、ペルォキシダ ーゼ標識、ルシフェラーゼ標識、ピオチン標識などを用いることができる。
[0122] サンドイッチ ELISA法は、固相に抗体を結合させた後、測定した!/、抗原をトラップさ せ、トラップされた抗原に第 2の抗体を反応させる方法である。該 ELISA法では、測定 した ヽ抗原を認識する抗体または抗体断片であって、抗原認識部位の異なる 2種類 の抗体を準備し、そのうち、一方の抗体または抗体断片を予めプレート（例えば、 96 ゥエルプレート）に吸着させ、第 2の抗体または抗体断片を FITCなどの蛍光物質、ぺ ルォキシダーゼなどの酵素、ピオチンなどで標識しておく。上記の抗体が吸着したプ レートに、生体内から分離された、細胞またはその破砕液、組織またはその破砕液、 細胞培養上清、血清、胸水、腹水、眼液などを反応させた後、標識したモノクローナ ル抗体または抗体断片を反応させ、標識物質に応じた検出反応を行う。濃度既知の 抗原を段階的に希釈して作製した検量線より、被験サンプルの濃度を算出すること ができる。サンドイッチ ELISA法に用いる抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクロ ーナル抗体のいずれを用いてもよぐ Fab、 Fab'、 F(ab)などの抗体フラグメントを用い
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てもよい。サンドイッチ ELISA法で用いる 2種類の抗体の組み合わせとしては、異なる ェピトープを認識するモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよいし、 ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体または抗体断片の組み合わせでもよい。
[0123] 蛍光免疫測定法（FIA)としては、文献 [Monoclonal Antibodies: Principles and pract ice, Third edition (Academic Press, 1996) ;単クローン抗体実験マニュアル（講談社 サイエンティフィック、 1987) ]などに記載された方法があげられる。蛍光免疫測定法 で用いる標識体としては、前述のとおり、任意の公知 (川生明著、蛍光抗体法、ソフト サイエンス社)の蛍光標識を用いることができる。例えば、 FITC標識、 RITC標識など を用いることができる。
[0124] 上記のような発光免疫測定法（luminescent immunoassay)で用いる標識体としては 、前述のとおり、任意の公知 [今井一洋編、生物発光と化学発光、廣川書店； 臨床 検査 42(1998)]の発光体標識があげられる。例えば、アタリジ-ゥムエステル標識、口 フィン標識などを用いることができる。
[0125] ウェスタンプロット法は、抗原または抗原を発現した細胞などを SDS-ポリアクリルアミ トケノレ 泳動 [Antibodies— A Laboratory Manual (Cold bpnng Haroor Laboratory, 1988) ]で分画した後、該ゲルを PVDF膜または-トロセルロース膜にブロッテイングし 、該膜に抗原を認識する抗体または抗体断片を反応させ、さらに FITCなどの蛍光物 質、ペルォキシダーゼなどの酵素標識、ピオチン標識などを施した抗マウス IgG抗体 または結合断片を反応させた後、該標識を可視化することによって確認する方法で ある。ウェスタンブロット法の一例を以下に示す。
[0126] エフリン B2を発現している細胞や組織を溶解し、還元条件下でレーンあたりのタン パク質量として 0.1〜30 /z gを SDS-PAGE法により泳動する。泳動されたタンパク質を P VDF膜にトランスファーし 1%BSAを含む PBS (以下、 BSA-PBSと記す）に室温で 30分 間反応させブロッキング操作を行う。ここで本発明のモノクローナル抗体を反応させ、 Tween-PBSで洗浄し、ペルォキシダーゼ標識したャギ抗マウス IgGを室温で 2時間反 J心 せる。 Tween— PBSで洗净し、 ECL Western blotting detection reagents (Amersh am社製)などを用いてモノクローナル抗体が結合したバンドを検出することにより、ェ フリン B2を検出することができる。
[0127] 物理ィ匕学的検出法とは、具体的には、エフリン B2と特異的に結合する抗体もしくは 抗血清を用いて、抗原であるエフリン B2と抗体、もしくは抗血清とを結合させることに より凝集体を形成させて、この凝集体を検出することにより行う。この他に物理化学的 検出法としては、毛細管法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法あるいはラテックス免疫 比濁法等で測定する方法があげられる [臨床検査法提要、金原出版， 499 (1998) ]0
[0128] 例えば、ラテックス免疫比濁法では、抗体または抗原を感作させた粒径 0.1〜1 μ m 程度のポリスチレンラテックス等の担体を用い、対応する抗原あるいは抗体により抗 原抗体反応を起こさせると、反応液中の散乱光は増加し、透過光は減少する。この 変化を吸光度あるいは積分球濁度として検出することによりエフリン B2を測定すること ができる。
[0129] 本発明の抗体は、エフリン B2に結合できるため、エフリン B2発現細胞の検出に好適 に用いられる。
[0130] エフリン B2発現細胞の検出には、公知の免疫学的測定法を用いることができるが、 免疫沈降法、蛍光細胞染色法、免疫組織染色法、および免疫組織染色法などが、 好ましく用いられる。また、 FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステム社）を用 V、る蛍光抗体染色法なども用いることができる。
[0131] 免疫沈降法とは、エフリン B2発現細胞などを本発明のモノクローナル抗体または抗 体断片と反応させた後、プロテイン G-セファロースなどのィムノグロブリンに特異的な 結合能を有する担体を加えて抗原抗体複合体を沈降させる方法である。ある!ヽは以 下のような方法によっても行なうことができる。
[0132] ELISA用 96ゥエルプレートに上述した本発明の抗体を固相化した後、 BSA-PBSによ りブロッキングする。抗体が精製されて 、な 、状態の例えばハイプリドーマ株培養上 清などの精製されて ヽな 、状態である場合には、抗マウスィムノグロブリンあるいはラ ットイムノグロブリンまたはプロテイン Aあるいは Gなどをあらかじめ ELISA用 96ゥエルプ レートに固相化し BSA-PBSでブロッキングした後、ハイプリドーマ株培養上清を分注 して結合させる。 BSA-PBSを捨て PBSでよく洗浄した後、エフリン B2を発現している細 胞ゃ組織の溶解液を反応させる。よく洗浄した後のプレートより免疫沈降物を SDS-P AGE用サンプルバッファーで抽出し、上記のウェスタンブロッテイングにより検出を行
[0133] 免疫細胞染色法および免疫組織染色法とは抗原を発現した細胞または組織などを 、場合によっては抗体の通過性を良くするため界面活性剤やメタノールなどで処理し た後、本発明の抗体を反応させ、さらにフルォレシン'イソチオシァネート（FITC)など の蛍光標識、ペルォキシダーゼなどの酵素標識、ピオチン標識などを施した抗ィムノ グロブリン抗体または結合断片を反応させた後、該標識を可視化し、顕微鏡にて顕 鏡するか、あるいは蛍光標識の抗体と細胞を反応させ、フローサイトメーターにて解 析する蛍光抗体染色法 (フローサイトメトリー）である。例えば、文献 [Monoclonal Anti bodies: Principles ana practice, Third edition (Academic Press, 1996)、単クロ ~~ン饥. 体実験マニュアル (講談社サイエンティフィック， 1987) ]などに記載された方法を用い て行うことができる。特に、本発明の抗体は、エフリン B2を特異的に認識し、かつ該細 胞外領域に結合できるため、フローサイトメトリーにより、エフリン B2が発現している細 胞の検出に好ましく用 ヽられる。
[0134] また、 FMAT8100HTSシステム（アプライドバイオシステム社）を用いる蛍光抗体染色 法とは、形成された抗体-抗原複合体と、抗体-抗原複合体の形成に関与していない 遊離の抗体または抗原とを分離することなく、抗原量または抗体量を測定することが できる、ホモジニァスなアツセィ方法である。
[0135] (8)本発明の抗体を用いた癌の治療方法
本発明の抗体または抗体断片は、エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2が関与す る疾患を治療することができる。エフリン B2が関与する疾患としては、血管新生が関 与する疾患などがあげられる。血管新生が関与する疾患としては、乳癌、前立腺癌、 大腸癌、胃癌、肺癌などの固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、慢性関節リウマチに おける関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾癬などの血管新生の異常 により病態が進行する疾患などがあげられる。本発明の治療剤には、エフリン B2が関 与する癌の治療剤、および抗体依存性細胞傷害作用 (ADCC)や補体依存性細胞傷 害作用（CDC)、あるいはアポトーシス誘導作用による癌の治療剤が含まれる。
[0136] 抗体の有する抗体依存性細胞傷害作用 (ADCC)や補体依存性細胞傷害作用（C DC)は、例えば、特開平 6-205694号公報に記載の方法で測定することができる。こ のような活性を有する抗体は、 in ϊίχ2において、特定の抗原が発現した細胞を傷害 することができるため、疾患の治療薬として用いることができる。特に、ヒ HgGクラスの 抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型 CDR移植抗体およびヒト抗体は治療 剤として、有効に用いられる（Cancer Res., 56, 1118, 1996)。
[0137] 本発明の抗体は、エフリン B2を認識することができるので、生体内に存在するエフリ ン B2発現細胞を認識することができる。従って、該抗体の可変領域の CDRを含むヒト I gGクラスの抗体定常領域を有するヒト型キメラ抗体、ヒト型 CDR移植抗体およびヒト抗 体は、 m vivoまたは in idimにおいて、エフリン B2発現細胞を傷害することができるの で、乳癌、前立腺癌、大腸癌、胃癌、肺癌などの固形腫瘍の増殖もしくは転移形成、 慢性関節リウマチにおける関節炎、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症および乾癬など の血管新生の異常により病態が進行する疾患などの治療に有用である。
[0138] また、血管新生が関与する疾患以外にも、エフリン B2は乳腺上皮に特異的に発現 しているので、本発明のエフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性およ び乳腺組織の増殖活性を阻害する抗体または抗体断片は、乳腺組織の増殖をきた す疾患などの治療に有用である。乳腺組織の増殖をきたす疾患の具体例としては、 例えば、乳腺腫、乳癌などがあげられる。
[0139] 本発明の抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体を含有する治療剤は、有効 成分としての該抗体もしくは抗体断片、またはこれらの誘導体のみを含むものであつ てもよいが、通常は薬理学的に許容される 1以上の担体と一緒に混合し、製剤学の 技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するの が望ましい。
[0140] 投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましぐ経口投与、 または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあ げることができ、抗体またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげること ができる。投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤 、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
[0141] 経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤などがあげられる。乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソル ビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのダリ コール類、ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル 類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添 加剤として用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ 糖、ショ糖、マン-トールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤 、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビュルアルコール、ヒドロキシ プロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グ リセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
[0142] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射 剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製 される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製さ れる。また、噴霧剤は該抗体または抗体断片自体、ないしは受容者の口腔および気 道粘膜を刺激せず、かつ該化合物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体などを用いて調製される。担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示され る。該抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が 可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分 を添カロすることちできる。
[0143] 投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体 重などにより異なる力 通常成人 1日当たり 10 g/kg〜8mg/kgである。
[0144] 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定さ れるものではない。
実施例
[0145] [実施例 1]
抗ェフリン B2モノクローナル抗体の作製
(1)抗原となるマウスエフリン B2を発現する Rati細胞の調製
マウス全長エフリン B2遺伝子の発現プラスミドについては公知の方法（Blood, 98, 1 028, 2001)に従って作製した。ラットに免疫する細胞としては Rati細胞（Cancer Resea rch, 46, 4787,1986)を用いた。遺伝子導入はリボフヱクシヨン法（lipofectamine2000; i nvitrogen製）を用いた。遺伝子導入細胞は 10%の血清を含む DMEM培地中にぺ- シリン（100unit/ml)とストレプトマイシン（100 μ g/ml) (いずれも GIBCO製)を添カ卩し、 7 日間 G418 (GIBCO製)を 500 μ g/mlの最終濃度で添加して、生存細胞を遺伝子導入 細胞とした。これらの細胞を 96穴培養プレートの一穴に一個一個の細胞を播種し、増 殖した細胞を 10cmの培養皿に移し、培養皿中細胞が 8割を占拠するに至った培養 皿力も EDTAを用いて細胞を回収し、一部を細胞培養を継続するとともに、残りの細 胞から RNAと細胞抽出液を作成した。
[0146] 抽出液は SDSゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルターに転写後、市販のェ フリン B2のポリクローナル抗体（SANTA CRUZ製）を用いてウェスタンブロットを行つ た。 Ratiはラットのエフリン B2を発現しているため、遺伝子導入していない細胞に対し 遺伝子導入した細胞にエフリン B2抗体で強いバンドの検出されたものをマウスエフリ ン B2が遺伝子導入された細胞の候補として選択された。実際にマウスエフリン B2遺 伝子が導入されているかどうかはマウスエフリン B2の RT-PCR用プライマー（5，-ATC TGTCTGCTTGGTCTTTATCAAC-3 ' (配列番号 7) )と遺伝子導入に用いたプラスミ ドの CAGプロモーターの塩基配列であるプライマー (5， - CTCTAGAGCCTCTGCTA ACCATGTTC- 3' (配列番号 8))で PCR産物が確認できるかいなかで解析した。得ら れる遺伝子産物は 387bpである。
[0147] (2)ハイプリドーマのスクリーニングで使用する可溶性のマウス細胞外エフリン B2ヒト F c融合蛋白 (エフリン B2-Fc)の精製
エフリン B2-Fc遺伝子の発現プラスミドおよびその可溶性蛋白の精製は、 Blood, 98, 1028, 2001に記載の方法に準じて行った。
[0148] (3)フローサイトメトリー法で使用するマウス全長エフリン B2を発現する BaF/3細胞（B aF/3/エフリン B2)の作製
マウス全長エフリン B2遺伝子の発現プラスミドについては公知の方法（Blood, 98, 1 028, 2001)に従って作製した。マウスエフリン B2を発現していない BaF/3細胞 (Cell, 4 1, 727, 1985)を遺伝子導入用の細胞として用いた。
[0149] 遺伝子導入はリボフヱクシヨン（lipofectamine2000; invitrogen製）を用いた。遺伝子 導入細胞は 10%の血清を含む RPMI培地中にペニシリン（100unit/ml)とストレプトマ イシン（100 μ g/ml) (V、ずれも GIBCO製)を添カ卩し、 7日間 G418 (GIBCO製）を 500 μ g/ mlの最終濃度で添加して、生存細胞を遺伝子導入細胞とした。これらの細胞を 96穴 培養プレートの一穴に一個一個の細胞を播種し、増殖した細胞を 10cmの培養皿に 移し、培養皿中細胞が 8割を占拠するに至った培養皿力 細胞を回収し、一部は細 胞培養を継続するとともに、残りの細胞から RNAと細胞抽出液を作成した。
[0150] 抽出液は SDSゲルで電気泳動し、ニトロセルロースフィルターに転写後、市販のェ フリン B2のポリクローナル抗体（SANTA CRUZ製）を用いてウェスタンブロットを行い、 エフリン B2のバンドが検出された細胞を遺伝子導入細胞として確立した。さらにマウ スェフリン B2遺伝子が導入されているかどうかはマウスエフリン B2の RT-PCR用プライ マー（5， -ATCTGTCTGCTTGGTCTTTATCAAC-3，（配列番号 9) )と遺伝子導入に 用いたプラスミドの CAGプロモーターの塩基配列であるプライマー (5， - CTCTAGAG CCTCTGCTAACCATGTTC-3，（配列番号 10) )で PCR産物が確認できる力 、なか で解析した。得られる遺伝子産物は 387bpである。
[0151] (4)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
上記（1)により得られたマウスエフリン B2を発現する Rati細胞（2 X 108個）を 500 1 のリン酸緩衝液 (PBS)にけん濁し、 8週令雌 Fisherラット（日本 SLC社製）の腹腔内に 投与した。本操作を 2週間毎に行い、計 4回投与した。尾静脈より採血し、その血清抗 体価を以下に示す酵素免疫測定法で調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免 疫 3日後に脾臓を摘出した。脾臓を RPMI培地 (SIGMA製）中で細断し、ステンレスメッ シュに細切された脾臓をこすりながらピンセットでほぐし、遠心分離（1200rpm、 5分間 )した後、 40 μ mのポアを有するセルストレイナー（BD Falcon製）を用いて細胞塊を除 去した。これらを遠心分離し（1200rpm、 5分）、上清を捨て、細胞融合に用いた。
[0152] (5)酵素免疫測定法 (ELISA)
(4)で得られたマウスエフリン B2を発現する Rati細胞を投与されたラットに由来する 抗血清およびハイプリドーマの培養上清の測定に関しては、抗原として、（2)で得ら れた、可溶性マウスエフリン B2-Fcを用いた。 96ゥエルの EIA用プレート（BD Falcon社 製）に、 PBS希釈 1〜10 μ g/ml可溶性マウスエフリン Β2- Fcを、それぞれ 50 μ 1/ゥエル で分注し、 4°Cで一晩放置して吸着させた。洗浄後、 1%牛血清アルブミン (BSA)を含 む PBS (以下、 1%BSA-PBSと記す）を 100 1/ゥヱルカ卩ぇ、室温 1時間反応させて残つ ている活性基をブロックした。 1%BSA-PBSを捨て、被免疫ラット抗血清およびハイブ リドーマの培養上清を 50 μ 1/ゥエルで分注し 2時間反応させた。 0.05%Tween-PBSで 洗浄後、ペルォキシダーゼ標識ャギ抗ラットイムノグロブリン (Biosource社製）を 50 μ 1 /ゥエルでカ卩えて室温、 1時間反応させ、 0.05%Tween-PBSで洗浄後 ΤΜΒ基質液 [3, 3 ' ,5,5' -テトラメチルベンジデイン] (Wako Chemical社製）を用いて発色させ OD450n mの吸光度を測定した。
[0153] (6)マウス骨髄腫細胞の調製
8-ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 X63-AG8を 10%牛血清を含む RPMI培地 で培養し、細胞融合時に 5 X 107以上の細胞を確保し、細胞融合に親株として供した
[0154] (7)ハイプリドーマの作製
上記 (4)で得られたラット脾細胞と、上記 (6)で得られた骨髄腫細胞とを 2: 1(1 X 108： 5 X 107)になるよう混合し、遠心分離（1200rpm、 5分間）した後、上清を捨て、沈澱した 細胞群をよくほぐした後、攪拌しながら、 37°Cで、ポリエチレングリコール溶液 (SIGMA 社製） lmlを加え、 2分間静置した。その後、 37°Cにあたためた RPMI培地 20mlを細胞 をけん濁している 50mlのチューブを震盪させながら 20分間にわたり添カ卩した後、遠心 分離 (900rpm、 5分間、室温)後、上清を捨て、ゆるやかに細胞をほぐした後、メスピぺ ットによる吸込み、吸出しでゆるやかに細胞を HAT (GIBCO社製)を 1%含む 10%牛 血清を添加した RPMI培地 50ml中に懸濁した。
[0155] この懸濁液を 96ゥヱル培養用プレートに 100 μ 1/ゥヱルずつ分注し、 5%COインキ
2 ュベータ一中、 37°Cで 10〜14日間 CO 5%下で培養した。この培養上清を実施例（5)
2
に記載した酵素免疫測定法で調べ、 (2)で得られた可溶性マウスエフリン B2に強く 反応し、市販の他の可溶性エフリン B1または B3に反応しないゥエルを選び、さらに H T培地 (GIBCO社製)と正常培地に換え、 2回クローユングを繰り返して、抗マウスエフ リン B2モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ株 (以下 VERB2と呼ぶ)を確立し た。ハイプリドーマ株 VERB2が生産するモノクローナル抗体を VERB2抗体と称する。
[0156] VERB2抗体の抗体クラスはサブクラスタイピングキット [ザィメット（Zymed)社製]を用 いた酵素免疫測定法を行った。その結果を図 1に示す。
[0157] 本発明で確立したモノクローナル抗体は IgGl、 kappaクラスであった。 [0158] (8)VERB2抗体の精製
プリスタン処理した 8週令 KSNヌード雌マウス（SLC社製）に（7)で得られたハイブリド 一マ株 VERB2を 5〜20 X 106細胞 Z匹それぞれ腹腔内に注射した。 10〜21日後に、 ノ、イブリドーマは腹水癌化した。腹水のたまったマウスから、腹水を採取（l〜8ml/匹） し、遠心分離 (3000rpm、 5分間）して固形分を除去した後硫酸アンモニゥム沈殿法（ アンチボディーズ 'ァ'ラボラトリー 'マ-ユアル）により精製し、さらに必要に応じて、 Pr oteinAカラム（amersham社製）を用いてさらに精製した。以下に示すフローサイトメトリ 一を用いた本発明の抗体の反応実験には精製した VERB2抗体を、ピオチン結合キッ ト（SIGMA社製)を用いてピオチンィ匕したものを用いた。
[0159] [実施例 2]
本発明の抗体の反応性の確認
(1)モノクローナル抗体のラットおよびマウスエフリン B2発現細胞におけるフローサイ トメトリーを用いた解析
VERB2抗体の特異性を、免疫細胞染色を用いて以下の手順に従い確認した。自 発的にラットエフリン B2を発現する細胞株 Ratiと Rati細胞にマウスエフリン B2を遺伝 子導入した細胞 (Rati/エフリン B2)l X 106個を 1.5mlの容量が入るチューブ（Eppendor ί¾製）に免疫細胞染色用緩衝液 (5%牛血清を含む PBS) 100 1に懸濁して分注した 。微量高速冷却遠心機 (TOMY工業製)を用い 4°C、 5000rpmで 1分間遠心分離後、 上清を除き、ピオチン化した精製抗体 50 μ 1(最終濃度 0.1〜5 μ g/ml)を加えて 4°Cで 3 0分間反応させた。反応後、 500 1の免疫細胞染色用緩衝液を各ゥエルに加え 4°C、 5000rpmで 1分間遠心分離後上清を除き細胞の洗浄を行った。この洗浄操作をさら に 2回行った後、 avidin-FITC (Pharmingen社製）を 1/50の濃度で含む免疫細胞染色 用緩衝液 50 1を加えて 4°Cで 30分間反応させた。反応後、上記と同様の洗浄操作を 3回行った後フローサイトメーター（Becton社製)を用いて解析を行った。
[0160] 結果を図 2に示した。細胞に抗体を添加せず avidin-FITCのみを添カ卩した場合に比 ベ VERB2抗体を添カ卩すると、 Rati細胞に若干の反応が見られた。これは VERB2抗体 力 Sラットのエフリン B2にも交叉することを意味する。し力しマウスエフリン B2を過剰発現 させた細胞ではさらに強 、反応が見られた。 [0161] 次に、実施例 1の（3)に記載の BaF/3細胞と BaF/3/エフリン B2細胞を用い、 VERB2 抗体がマウスエフリン B2に反応するか否かを検討した。上記の方法で細胞を染色し、 フローサイトメーターを用いて観察した。
[0162] 結果を図 3に示す。エフリン B2を発現しない BaF/3細胞に VERB2抗体で染色したも のはネガティブコントロールと同様に反応は見られな力つた（図 3左段)。一方、 BaF/3 /エフリン B2細胞では一次抗体無し、あるいは一次抗体にコントロール抗体を使用し た場合には反応が認められないのに対し、一次抗体に VERB2抗体を用いることによ つて、反応が認められた（図 3右段）。以上のことから、 VERB2はラットおよびマウスの エフリン B2を認識する抗体であることが判明した。
[0163] また、ヒトエフリン B2に本 VERB2抗体が反応することを確認するために、ヒトエフリン B2が発現しているヒト前立腺腫瘍細胞株 PC3細胞 (ATCC CRL-1435)を用い、上記 の方法で染色を行なった。
[0164] 実験結果を図 4に示す。一次抗体無し、あるいは一次抗体にコントロール抗体を使 用した場合には反応が認められないのに対し、一次抗体に VERB2抗体を用いること によって、蛍光反応が確認された。従って、 VERB2抗体はヒトのエフリン B2を認識す る抗体であることが判明した。
[0165] 同時に市販のポリクローナル抗体（SANTA CRUZ社製）を用いて、同様の検討を行 つたが、市販のポリクローナル抗体は、上記のコントロール抗体と同様の結果であつ た。従って、巿販のポリクローナル抗体は、フローサイトメトリーでは使用できないこと がわかった。
[0166] (2)モノクローナル抗体による免疫組織染色
胎児期にエフリン B2は動脈に発現するが静脈には発現しないことが報告されてい る。しかし、 RNAを検出することによる証明はなされている力 エフリン B2がタンパク質 として発現していることは証明されていない。そこで、 VERB2抗体を用いて、マウス胎 児の組織切片を用いて発現解析を行った。
[0167] 妊娠 13日目のマウスの子宮内より胎児を実体顕微鏡 (Leica製)下で取り出し、パラ ホルムアルデヒド (Wako社製）を 4%の濃度で含む PBSに 2時間 4°Cで浸透して組織を 固定した。パラホルムアルデヒドの入った PBSを除去し、胎児組織を PBSで 2時間 4°C で PBSに浸透して洗浄した。胎児は 40%メタノール、 70%メタノールを含む PBS、 100 %メタノールでそれぞれ 4°Cで 20分間脱水させた。胎児をナイフを用いて細切し、 50 o/oポリエステルワックス（第一化学社製）を含むメタノール溶液、 100%ポリエステルヮ ッタスでそれぞれ 42°Cで 30〜60分間ワックスを浸透した。さらにこの組織をカセット内 でワックスに包埋し、ミクロトーム（ャマト科学社製）を用いて 8 mに薄切し、スライドグ ラス上で固定、乾燥させた。このようにして作製した組織切片を 100%のエタノールで 脱ワックスを行 、、 0.6%の過酸化水素と 0.2%のアジ化ナトリウムを含むメタノールに 室温で 30分間浸透し、内因性のペルォキシダーゼの不活ィ匕を行った。続いて 70%メ タノールを含む PBS、ついで PBSの順にそれぞれ 5分間静置して、親水した。組織切 片に 5%ャギ血清および 1%BSAを含む PBS (ブロッキング液）をのせ室温で 30分間浸 透させ、二次抗体のブロッキングを行った。ブロッキング液を捨て、 VERB2抗体を最 終濃度 0.1〜5 /z g/mlにブロッキング液で希釈して、 6〜12時間室温あるいは 4°Cで反 応させた。抗体を捨て、 0.05%Tween20を含む PBS (洗浄液）中に 4°Cで 10分間浸透さ せ、洗浄液を捨てた。この操作を 3回繰り返した。ペルォキシダーゼ標識ャギ抗ラット ィムノグロブリン（Biosource社製）を 100分の 1〜500分の 1の濃度にブロッキング液で 希釈し、組織切片にのせ、室温で 1時間反応させた。二次抗体を捨て、洗浄液で上 記と同様切片を 3回洗浄した。組織切片にディアミノべンジディン (DAB;同人化学社 製)を 250 g/mlの濃度で PBSに溶解した DAB溶液 lmlに対して、 1.5%過酸化水素を 5 1添カ卩した溶液を発色液として用いて、 VERB2抗体によるエフリン B2の発現を解析 した。
[0168] VERB2抗体は背側動脈には濃青色の反応が認められるのに対して、大静脈には 反応が認められなかった。このことから、 VERB2抗体はマウスの胎児において、動脈 特異的に染色が可能な抗体であることが示された。
[0169] (3) VERB2を用いた腫瘍組織における血管のエフリン B2の発現解析
従来よりエフリン B2は胎児期ではその発現解析がすすめられているものの、成体の 病変部においてはまだ詳細な発現が明らかにされていない。そこで、成体で血管新 生が生じる腫瘍組織におけるエフリン B2の発現を VERB2抗体を用いて検討した。 C5 7B1/6マウス (SLC社製)に植え付けられた Lewis lung carcinoma肺ガン細胞を腫瘍とし て持つマウス力も腫瘍組織を取り出し、本実施例の（1)と同様の方法で処理し、組織 切片を作成し、 VERB2抗体により本実施例の（1)と同様の手段で染色した。
[0170] 腫瘍周囲の間葉系組織内では平滑筋細胞におおわれた動脈の血管内皮細胞お よび平滑筋の被覆のない静脈の内皮細胞において、染色が確認でき、これらの細胞 はエフリン B2を発現していることが確認できた。また、腫瘍内部では、ほぼ全ての血 管において、エフリン B2が発現していることが確認できた。以上のことから、腫瘍では VERB2抗体はほぼすベての内皮細胞を認識することから、 VERB2抗体は腫瘍の診 断や血管新生の抑制などの治療に有効であることが示された。
[0171] (4)VERB2抗体による血管新生の抑制
成体中の組織における血管新生は、病態が発生した時にのみ観察されるが、胎児 期においては臓器の形成が盛んであり血管新生が進行しないとマウスは致死となる。 そこで、 VERB2抗体を妊娠マウスに投与し、胎児の血管新生に影響を与える力否か を検討した。
[0172] 8週齢の C57B1/6妊娠マウス（SLCより購入）に経胎盤的に母体からの IgGが胎児に 浸透する妊娠 9日以降から、 VERB2抗体、あるいはコントロール抗体（B220)を、一匹 にっき l〜5mgを PBSで希釈し、妊娠 9、 10、 11、 12日に腹腔内投与し、 13日目に妊 娠マウスの子宮より胎児を実体顕微鏡 (Leica製)下で取り出し、血管新生について観 した。
[0173] コントロールの抗体を投与した母胎の胎児と比較して、 VERB2抗体を投与した母胎 の胎児は卵黄嚢の血管が細ぐ血管構造が未発達であった。また、頭部においては コントロールの抗体を投与した母胎の胎児と比較して、著しく血管が細ぐまた血管数 が減少していた。また、血管数の減少に応じて赤血球の運搬がなされず、胎児は貧 血色を呈していた。
[0174] 以上のことから、 VERB2は血管新生を顕著に抑制することが判明し、腫瘍や慢性炎 症性疾患などで病態の悪化に繋がる血管新生を抑制する治療薬として本発明の抗 体が使用できることが示された。
[0175] (5) VERB2による乳腺組織形成の破綻の誘導
エフリン Β2は血管だけでなぐ乳腺上皮に特異的に発現することが報告されている 力 (Journal of Cell Science, 111, 2741 1998)、ノックアウトマウスが発生初期に致死と なるため、妊娠マウスにおいて解析が可能な乳腺におけるエフリン B2の機能解析は なされてこなかった。そこで、 VERB2抗体を妊娠マウスに投与することにより乳腺の 発生に関してエフリン B2の機能を観察した。上記 (4)に記載のスケジュールと同様に VERB2抗体とコントロール抗体を妊娠マウスに投与した。
[0176] 2.4mgの VERB2抗体を投与した場合には、胎児は全て妊娠 14日目までに致死とな つたが、 lmgの VERB2抗体を投与した場合は出生するマウス新生児が確認された。 新生児は正常に出生したが、発育が遅延することが判明した。しかし、出生と同時に VERB2抗体を投与して ヽな 、妊娠マウスのケージに新生児を移した場合には、上記 の発育が遅延していたマウスの発育は、正常になることが判明した。これは、 VERB2 抗体投与により、妊娠マウスの乳腺の発達が遅延するため、新生児に与えられる母 乳量が少なくなるために、新生児の発育遅延が生じることが判明した。従って、 VERB 2抗体は乳腺組織の増殖をきたす疾患 (乳腺腫、乳ガンなど）に対し治療効果を有す ることが示された。
[0177] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[I] エフリン B2に結合し、かつ、エフリン B2の血管新生活性および乳腺組織の増殖活性 を阻害する抗体または抗体断片。
[2] エフリン B2が配列番号 2で表されるアミノ酸配列で示されるポリペプチドである、請求 項 1に記載の抗体または抗体断片。
[3] 抗体が、モノクローナル抗体である請求項 1または 2に記載の抗体または抗体断片。
[4] モノクローナル抗体のクラスが IgGである請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の抗体ま たは抗体断片。
[5] モノクローナル抗体が、ハイプリドーマ VERB2 (FERM BP- 10100)から生産されるモノ クローナル抗体である請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体また は抗体断片。
[6] モノクローナル抗体が、ハイプリドーマ VERB2 (FERM BP- 10100)から生産されるモノ クローナル抗体が結合するェピトープと結合するモノクローナル抗体である請求項 1
〜4のいずれか 1項に記載のモノクローナル抗体または抗体断片。
[7] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いてエフリン B2を免 疫学的に検出する方法。
[8] 検出する方法が、免疫組織染色法である請求項 7に記載の方法。
[9] 検出する方法が、免疫細胞染色法である請求項 7に記載の方法。
[10] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いるエフリン B2の検 出用試薬。
[II] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いるエフリン B2の定 量用 薬。
[12] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を用いるエフリン B2が関 与する疾患の診断薬。
[13] エフリン B2が関与する疾患が、血管新生が関与する疾患である請求項 12に記載の 診断薬。
[14] 血管新生が関与する疾患が固形腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟 児網膜症および乾鮮カもなる群力 選択される疾患である請求項 13に記載の診断 薬。
[15] エフリン B2が関与する疾患が、乳腺組織の増殖をきたす疾患である請求項 12に記 載の診断薬。
[16] 乳腺組織の増殖をきたす疾患が乳腺種または乳癌力 なる群力 選択される疾患で ある請求項 15に記載の診断薬。
[17] 請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の抗体または抗体断片を有効成分として含有す るエフリン B2が関与する疾患の治療薬。
[18] エフリン B2が関与する疾患が、血管新生が関与する疾患である請求項 17に記載の 治療薬。
[19] 血管新生が関与する疾患が固形腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、未熟 児網膜症および乾鮮からなる群から選択される疾患である請求項 18に記載の治療 薬。
[20] エフリン B2が関与する疾患が、乳腺組織の増殖をきたす疾患である請求項 17に記 載の治療薬。
[21] 乳腺組織の増殖をきたす疾患が乳腺種または乳癌力 なる群力 選択される疾患で ある請求項 20に記載の治療薬。
[22] 請求項 3〜6の 、ずれか 1項に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
[23] ハイプリドーマがハイプリドーマ VERB2 (FERM BP-10100)である、請求項 22に記載 のノヽイブリドーマ。
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