WO2006019105A1

WO2006019105A1 - 蛍光ラベル化剤

Info

Publication number: WO2006019105A1
Application number: PCT/JP2005/014983
Authority: WO
Inventors: Tetsuo Nagano; Yasuteru Urano; Tomoko Mineno; Tasuku Ueno
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.
Priority date: 2004-08-17
Filing date: 2005-08-17
Publication date: 2006-02-23
Also published as: JP5068535B2; JPWO2006019105A1

Description

明細書

蛍光ラベル化剤

技術分野

[0001] 本発明は蛍光ラベル化剤に関する。

背景技術

[0002] タンパク質や生理活性物質など微量の生体物質を高感度、高精度で検出'定量することはケミカルバイオロジーやバイオテクノロジーの発展における重要な研究課題である。この目的のため、蛍光ラベルイ匕技術が汎用されている。蛍光ラベル化とは、有機蛍光色素などラベル化剤を標的物質である生体物質と結合させ、ラベル化剤特有の励起 ·蛍光スぺ外ル等の蛍光特性を利用することにより標的物質の検出'定量を可能とする方法である。この目的のため、蛍光ラベル化剤には、強い蛍光を持つ蛍光団と、標的物質である生体物質と迅速に反応できる反応性の高い活性基 (反応性官能基)とを持つことが望まれる。

[0003] フルォレセインは吸収極大 492 nm、蛍光極大 515 nmを示す蛍光性色素であり、量子収率も 0.85と高ぐ蛍光ラベル化剤の母核として汎用されている。フルォレセインは、通常、 488 nmのアルゴンレーザーにて励起され、 530 nmにて検出される。このフルォレセインを応用した最も汎用される蛍光ラベル化剤としてカルボキシフルォレセィンが知られている。この物質は、高い蛍光性のフルォレセインに対してタンパク質などに結合させるためのラベルイ匕部位 (反応性官能基）としてカルボキシル基が導入された化学構造を有しており、 2種の位置異性体 (5-カルボキシフルォレセイン及び 6- カルボキシフルォレセイン）が存在する。し力しながら、これらの 2つの異性体を分離して合成することは困難であり、ほとんどの場合には混合物のまま蛍光ラベル化剤として用いられている。また、蛍光ラベル化剤はタンパクのリシン残基などのアミノ基修飾の目的のため、スクシンィミジルエステルやイソチオシァネート体として提供されることも多い。

Fluorescein 5-Carboxyfluorescein (5CF) 6-Carboxyfluorescein (6CF)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明者らは、これまで蛍光ラベル化剤として汎用されてきたカルボキシフルォレセイン類の化学構造を光物理化学的観点から最適化することで、さらなる高感度化を可能とする新規蛍光ラベル化剤を開発すべく研究を行なった。

本発明者らは、カルボキシフルォレセインを用いてタンパク質などをラベルイ匕するためにエステル体やアミド体に変換すると、カルボキシフルォレセインの蛍光量子収率が低下する場合があることを見いだした。これは光誘起電子移動によることが考えられる。

[0005] 一方、本発明者らは、ごく最近、従来フルォレセインの蛍光特性に必須であると考えられてきた 2-位のカルボキシル基は他の置換基に置き換えることが可能であることを見いだした（WO2004/005917)。そして、フルォレセインのカルボキシル基をメチル基又はメトキシ基に置換したィ匕合物の蛍光特性は、フルォレセインと同様の励起 '蛍光波長、蛍光量子収率を示すと!ヽぅ知見を得ることに成功した。

以上の知見を併せ、フルォレセインを蛍光団であるキサンテン部位とこれに直交するベンゼン環部位に分けて考える手法を採用し、フルォレセインのベンゼン環部の 2 位のカルボキシル基をメチル基又はメトキシ基などに置換することにより、ベンゼン環部位の電子密度を高め、励起蛍光団からの光誘起電子移動 (Donor-Excited Photoi nduced Electron Transfer; d-PeT)を起こしにくくし、カルボキシフルォレセインで見られたラベル化による蛍光量子収率の低下を克服した新規蛍光ラベル化剤を開発することに成功した。

[0006] 本発明により、下記の式 (I)： [化 2]

(

R⁴はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示すが、これらのうち少なくとも 1個は、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能な反応性官能基を示し; R⁵は水素原子、カルボキシル基またはスルホン酸基以外の一価の基を示し; R⁶及び R⁷はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し; R⁸は水素原子、アルキルカルボ-ル基、又はアルキルカルボ-ルォキシメチル基を示し、ただし、

R⁴、及び R⁵の組み合わせは、式 (I)で表される化合物が被ラベル化物質に共有結合した後、実質的に高い蛍光性になるように、それらが結合するべ

、還元電位を与える組み合わせである）で表される蛍光ラベル化剤が提供される。

[0007] 上記発明の好ましい態様によれば、 R⁵がアルキル基又はアルコキシ基である上記蛍光ラベル化剤;該反応性官能基が、カルボキシル基又はその反応性誘導体である上記蛍光ラベル化剤；該反応性官能基が活性エステル基である上記蛍光ラベルイ匕剤;被ラベル化物質がタンパク質、核酸、又は脂質である上記蛍光ラベル化剤が提供される。

[0008] 式 (I)で表される化合物にお!、て、 Ri〜R⁵の組み合わせは、例えば、被ラベル化物質に共有結合した後、式 (I)で表される化合物に由来する残基が実質的に高い蛍光性になるように、それらが結合するベンゼン環の還元電位を- 2.1V以下にする組み合わせである。

別の観点からは、被ラベルイ匕物質を蛍光ラベルイ匕する方法であって、上記の蛍光ラベル化剤と被ラベルイ匕物質とを反応させる工程を含む方法が本発明により提供される。

発明の効果 [0009] 本発明の蛍光ラベル化剤は、カルボキシフルォレセインで見られたラベル化による蛍光量子収率の低下を克服しており、高い量子収率を有する蛍光ラベル化剤としてタンパク質又は有機化合物などのラベル化に有用である。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]図 1は本発明の蛍光ラベル化剤及び対照のカルボキシフルォレセイン- SEにより修飾された BSAの吸収スペクトルを示した図である。

[図 2]図 2は本発明の蛍光ラベル化剤及び対照のカルボキシフルォレセイン- SEにより修飾された BSAの蛍光スペクトル (励起波長： 490 nm)を示した図である。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 本発明の蛍光ラベル化剤の代表例を以下に示す。これらの化合物においては、ベンゼン環に置換するカルボキシル基が被ラベルイ匕物質に存在するァミノ基、水酸基、チオール基などと反応して、被ラベルイ匕物質を蛍光ラベルイ匕することができる。

[化 3]

特に、上記の各化合物は、ベンゼン環上のカルボキシル基を使用し、被ラベルイ匕物質の水酸基ゃァミノ基との間でエステル結合又はアミド結合などの共有結合を介して蛍光ラベルイ匕しても実質的に蛍光強度が低下しないという優れた特徴を有しており、カノレボキシフ

ルォレセインに比べて標的物質の高感度なラベルイ匕が可能である。

[0012] ラベル化剤としては、上記の化合物において、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能なベンゼン環上のカルボキシル基力その誘導体であってもよぐ例えば、カルボキシル基が酸ノヽロゲン化物又は混合酸無水物を形成してもよぐまた、ニトロまたはハロゲン置換フエノール、 N-ヒドロキシスクシンイミドと活性エステルを形成してもよい。特にベンゼン環に置換するカルボキシル基を活性エステル (例えば、 N-ヒドロキシスクシンイミジノレエステノレ、 p-ニトロフエ二ノレエステノレ、ペンタフノレオロフェニノレエステルなど）に変換した化合物は本発明の蛍光ラベル化剤として好ましい。また、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能なベンゼン環上の官能基として、例えば、イソシアナ一ト基、イソチオシアナ一ト基を用いてもよい。さらに、モレキュラープロ一ブス社のカタログ (Handoook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Ninth Edition)の ¾¾1皁 (Fluorophores and Their Amine— Reactive Derivatives)、第 2皁 (Thi oト Reactive Probes)第5享（Reagents for Modifying Groups Other Than Tniols and A mines)に記載された反応性官能基を用いることもできる。

ベンゼン環上の 2位の置換基としては、例えば、アルキル基又はアルコキシ基が好ましぐより好ましくはメチル基又はメトキシ基を用いることができる。

以下に示すとおり、従来のカルボキシフルォレセインを水酸基に対する蛍光ラベルィ匕剤として使用すると顕著な蛍光量子収率の減少が観測されるが、本発明の化合物 12を蛍光ラベル化剤として用いた場合には、ラベルイ匕後にも高い量子収率を保っている。

[化 4]

6CF 6CF-Ester

φ=0.87 φ=0.20 さらに、この新しい蛍光ラベル化剤は合成的観点からも有利である。すなわち、力ルポキシル基の置換位置が限定された単一の異性体を高収率で得ることが可能であり、この点に置いてもカルボキシフルォレセイン類に比べて有用性が高い。

本発明の蛍光ラベル化剤は、被ラベルイ匕物質 (例えば、タンパク質、核酸、脂質類などの生体分子のほか、各種の有機低分子又は有機高分子化合物など）のラベル化に用いることができる。ラベルイ匕の方法は特に限定されず、従来の蛍光ラベル化剤であるカルボキシフルォレセインなどを用いたラベルイ匕の方法に準じて行なうことが可能である。

実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

例 1：本発明の蛍光ラベル化剤の製造

<スキーム 1 >

[化 5]

(スキーム中、 Meはメチル基、は tert-ブチル基を示す。以下同様である。 ) (A)3-ブロモ -4-メチル安息香酸 tert-ブチルエステル（2)

よく乾燥した容器に 3-ブロモ -4-メチル安息香酸（1) (430 mg, 2 mmol)を tert-ブタノール（10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下で Boc 0 (Boc=tert-ブトキシカルボ-ル， 0

2

.46 mL, 2 mmol)とジメチルァミノピリジン（DMAP, 73 mg, 0.6 mmol)をカ卩えた。 40°Cにて撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸ェチエ / :- 邈彔 '¾ ^ - ε- rci i- κα) [8ioo]

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C86M0/S00Zdf/X3d L S0T610/900Z OAV よく乾燥した容器に 4-ブロモ -3-メチル安息香酸（5) (430 mg, 2 mmol)を tert-ブタノール（10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下で Boc 0 (0.46 mL, 2 mmol)と DMAP (73

2

mg, 0.6 mmol)を加えた。 40 °Cにて撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶媒を水で希釈した後、酢酸ェチル (3 X 10 mL)にて抽出し、水、飽和食塩水で洗浄して無水 Na SOで乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムに

2 4

て精製 (溶出溶媒:へキサン/酢酸ェチル（9:1))し、無色の油性化合物 6 342 mg (収率 63%)を得た。

^JH NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 7.83 (d, 1Η, J = 2.0), 7.64 (dd, 1H, J = 8.3, 2.0), 7.5

3

6 (d, 1H, J = 8.3) 2.43 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).

[0019] (E)化合物 7

よく乾燥した容器にアルゴン雰囲気下 tert-ブチルエステル体 6 (271 mg, 1 mmol) をテトラヒドロフラン（20 mL)に溶かした。 -100 °Cにて、 tert-ブチルリチウム（1.48 M, 0.7 mL, 1 mmol)をゆっくり加え 30分間同温で撹拌した。この溶液に 3,6-ビス- (tert-ブチルジメチルシラ-ルォキシ)-キサンテン- 9-オン（91 mg, 0.2 mmol)のテトラヒドロフラン（10 mL)溶液をゆっくりと滴下し、容器をアルミニウムホイルで覆って、さらに 1時間同温で撹拌した。反応溶液に 2 N HC1 (5 mL)をカ卩ぇ 10分間撹拌した。反応溶液を飽和 NaH PO水溶液で希釈した後、酢酸ェチル（3 X 15 mL)にて抽出し、飽和食塩

2 4

水で洗浄して無水 Na SOで乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカ

2 4

ゲルクロマトグラフィーにて精製 (溶出溶媒:ジクロルメタン/メタノール（9:1))し、ォレンジ色の固体状の化合物 7 68 mg (収率 85%)を得た。

1H NMR (300 MHz,メタノール— d ) δ 8.05 (s, 1H), 8.01 (d, 1H, J = 8.1), 7.36 (d, 1

4

H, J = 7.9), 7.03 (d, 2H, J = 9.2), 6.68-6.71 (m, 4H), 2.12 (s, 3H), 1.65 (s, 9H); HR MS (ESI-MS) [M+H]⁺ calcd for C H O 403.1546, found 403.1501.

25 23 5

[0020] (F)化合物 8

よく乾燥した容器に化合物 7 (60 mg, 0.15 mmol)をトリフルォロ酢酸/ジクロルメタン（ 1:1, 10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下 1時間室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製 (溶出溶媒:ジクロルメタン/メタノール（8:2))し、オレンジ色の固体状の化合物 8 49 mg (収率 94%)を得た。 H NMR (300 MHz, DMSO- d ) δ 8.05 (s, IH), 7.98 (d, IH, J = 8.0), 7.43 (d, IH, J

6

= 7.9), 6.96 (d, 2H, J = 9.2), 6.77-6.73 (m, 4H), 2.07 (s, 3H); HRMS (ESト MS) [M+ H]+ calcd for C H O 347.0920, found 347.0897.

21 15 5

例 2 :蛍光特性

各化合物の量子収率は、 490 nmにおける吸光度が 0.02以下となるように、 pH 7.4 (6 CF類については pH 9.0)の 0.1Mリン酸緩衝液に溶解し、 0.1N NaOH水溶液中のフルォレセインを対照（蛍光量子収率 = 0.85)として、相対法により決定した。

[表 1]

例 3 :本発明の蛍光ラベル化剤の製造

<スキーム 2>

[化 6]

17

[0023] (A)3-ブロモ -4-メトキシ安息香酸 tert-ブチルエステル (10)

よく乾燥した容器に 3-ブロモ -4-メトキシ安息香酸 (9) (462 mg, 2 mmol)を tert-ブタノール（10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下で Boc 0 (0.46 mL, 2 mmol)と DMAP (73

2

mg, 0.6 mmol)をカ卩えた。撹拌しつつ 10時間還流し反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸ェチル (3 X 10 mL)にて抽出し、水、飽和食塩水で洗浄して無水 Na SO

2 4 で乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製 (溶出溶媒:へキサン/酢酸ェチル（9:1))し、白色の固体状の化合物 10 356 mg (収率 62%)を得た。

^JH NMR (300 MHz, CDCl ) δ 8.15 (d, IH, J = 2.0), 7.93 (dd, IH, J = 8.6, 2.0), 6.8

3

9 (d, IH, J = 8.6) 3.94 (s, 3H), 1.58 (s, 9H).

[0024] (B)化合物 11

よく乾燥した容器にアルゴン雰囲気下 tert-ブチルエステル体 10 (287 mg, 1 mmol) をテトラヒドロフラン（20 mL)に溶かした。 -100 °Cにて、 tert-ブチルリチウム（1.48 M, 0.7 mL, 1 mmol)をゆっくり加え 30分間同温で撹拌した。この溶液に 3,6-ビス- (tert-ブチルジメチルシリルォキシ)キサンテン- 9-オン（91 mg, 0.2 mmol)のテトラヒドロフラン (10 mL)溶液をゆっくりと滴下し、容器をアルミニウムホイルで覆って、さらに 1時間同温で撹拌した。反応溶液に 2 N HC1 (5 mL)をカ卩ぇ 10分間撹拌した。反応溶液を飽和 NaH PO水溶液で希釈した後、酢酸ェチル（3 X 15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で

2 4

洗浄して無水 Na SOで乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルク

2 4

口マトグラフィ一にて精製 (溶出溶媒:ジクロルメタン/メタノール（9:1))し、オレンジ色の固体状の化合物 11 48 mg (収率 57%)を得た。

^JH NMR (300 MHz,メタノール— d ) δ 8.24 (dd, 1Η, J = 8.8, 2.2), 7.82 (d, 1H, J = 2.

4

2), 7.35 (d, 1H, J = 8.8), 7.13 (d, 2H, J = 9.3), 6.74-6.70 (m, 4H), 3.82 (s, 3H), 1.5 8 (s, 9H); HRMS (ESト MS) [M+H]⁺ calcd for C H O 419.1495, found 419.1461.

25 23 6

[0025] (C)化合物 12

よく乾燥した容器に化合物 11 (63 mg, 0.15 mmol)をトリフルォロ酢酸/ジクロルメタン (1:1, 10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下 1時間室温で撹拌した。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製 (溶出溶媒:ジクロルメタン/メタノール（8:2))し、オレンジ色の固体状の化合物 12 45 mg (収率 83%)を得た。

JH NMR (300 MHz, DMSO— d ) δ 8.20 (dd, 1H, J = 8.8, 2.2), 7.82 (d, 1H, J = 2.0),

6

7.43 (d, 1H, J = 8.8), 7.09 (d, 2H, J = 9.7), 6.76-6.73 (m, 4H), 3.78 (s, 3H); HRMS (ESI— MS) [M+H]⁺ calcd for C H O 363.0869, found 363.0840.

21 15 6

[0026] (D)化合物 14

よく乾燥した容器に 4-ブロモ -3-メトキシ安息香酸 (13) (462 mg, 2 mmol)をジメチルホルムアミド (10 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下でカルボジイミド（CDI, 486 mg, 3 m mol)、 DMAP (367 mg, 3 mmol),ピロリジン（0.33 mL, 4 mmol)をカ卩えた。室温で撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸ェチル (3 X 1 0 mL)にて抽出し、水、飽和食塩水で洗浄して無水 Na SOで乾燥させた。有機溶媒

2 4

を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製 (溶出溶媒:へキサン /酢酸ェチル (2:1 to 1:1))し、白色の固体状の化合物 14 488 mg (収率 86%)を得た。 JH NMR (300 MHz, CDC1 ) δ 7.40 (d, 1H, J = 8.1), 6.96 (d, 1H, J =1.7), 6.83 (dd,

3

1H, J = 8.0, 1.8) 3.77(s, 3H), 3.47 (t, 2H, J = 6.6), 3.28 (t, 2H, J = 6.4), 1.86—1.71 ( m, 4H).

[0027] (E)化合物 15

よく乾燥した容器にアルゴン雰囲気下ピロリジンアミド 14 (284 mg, 1 mmol)をテトラヒドロフラン（20 mL)に溶かした。 -100 °Cにて、 tert-ブチルリチウム（1.48 M, 0.7 mL, 1 mmol)をゆっくり加え 30分間同温で撹拌した。この溶液に 3,6-ビス- (tert-ブチルジメチルシラ-ルォキシ)-キサンテン- 9-オン（91 mg, 0.2 mmol)のテトラヒドロフラン（1 0 mL)溶液をゆっくりと滴下し、容器をアルミニウムホイルで覆って、さらに 1時間同温で撹拌した。反応溶液に 2 N HC1 (5 mL)をカ卩ぇ 10分間撹拌した。反応溶液を飽和 Na H PO水溶液で希釈した後、酢酸ェチル (3 X 15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗

2 4

浄して無水 Na SOで乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロ

2 4

マトグラフィ一にて精製 (溶出溶媒:ジクロルメタン/メタノール（9:1))し、オレンジ色の固体状の化合物 15 35 mg (収率 42%)を得た。

^JH NMR (300 MHz,メタノール— d ) δ 7.37 (s, 1H), 7.32 (s, 2H), 7.00 (d, 2H, J = 9.

4

0), 6.56-6.52 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 3.68—3.60 (m, 4H), 2.07—1.99 (m, 4H); HRMS ( ESI-MS) [M-H]" calcd for C H N O 414.1342, found 414.1332.

25 20 1 5

[0028] (F)化合物 16

化合物 15 (62 mg, 0.15 mmol)を 1 N NaOH (10 mL)に溶かし 2時間還流した。反応溶液を 2 N HC1で中和し、酢酸ェチル (3 X 15 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水 Na SOで乾燥させた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマト

2 4

グラフィ一にて精製 (溶出溶媒:ジクロルメタン/メタノール（8:2))し、オレンジ色の固体状の化合物 16 49 mg (収率 90%)を得た。

1H NMR (300 MHz,メタノーノレ— d ) δ 7.82 (d, 1H, J = 1.1), 7.75 (dd, 1H, J = 7.7, 1.

4

3), 7.21 (d, 1H, J = 7.9), 7.02 (d, 2H, J = 9.0), 6.56-6.51 (m, 4H), 3.79 (s, 3H); HR MS (ESI-MS) [M-H]" calcd for C H O 361.0712, found 361.0704.

21 13 6

[0029] (G)化合物 17

よく乾燥した容器に化合物 16 (36 mg, 0.10 mmol) ert-ブタノール（5 mL)に溶かし、アルゴン雰囲気下で Boc 0 (0.11 mL, 0.50 mmol)と DMAP (18 mg, 0.15 mmol)を加

2

えた。室温にて撹拌しつつオーバーナイトで反応させた。反応溶液を水で希釈した後、酢酸ェチル (3 X 5 mL)にて抽出し、飽和食塩水で洗浄して無水 Na SOで乾燥さ

2 4 せた。有機溶媒を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製 (溶出溶媒：ジクロルメタン/メタノール（9:1))し、オレンジ色の固体状の化合物 17 12 mg ( 収率 29%)を得た。

1H NMR (300 MHz,メタノーノレ— d ) δ 7.79-7.77 (m, 2H), 7.33 (d, 1H, J = 8.3), 6.94

4

(d, 2H, J = 9.2), 6.56-6.50 (m, 4H), 3.80 (s, 3H); HRMS (ESI-MS) [M+H]⁺ calcd for C H O 419.1495, found 419.1489.

25 23 6

[0030] 例 4 :蛍光特性

[表 2]

[0031] 例 5 :化合物 19の合成

[化 7]

化合物 18は J. Am. Chem. So ， 123, pp.2530-2536(2001)に記載の方法で合成した。

化合物 18をメタノール溶解し、数滴の硫酸をカ卩え、 20時間還流した。ついで、反応液を氷中に注ぎ入れ、酢酸ェチルにて抽出し、無水 Na SOで乾燥させた。有機溶媒

2 4

を留去し、得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにて精製し、メタノール/ジクロルメタンにて再結晶して化合物 19を得た。 H NMR (300 MHz, DMSO— d ): δ 3.63 (s, 3H); 6.30 (br, 2H); 6.84 (m, 4H); 7.76 (m

6

, 2H); 8.06 (m, 2H); 8.30 (m, IH); 8.89 (s, IH); 11.04 (br, IH). HRMS (ESI+): calcd for M++1, 397.107; found, 397.105. Mp: 325°C dec. Anal. Calcd for C H O -0.75

25 16 5

H O: N; 0, C; 73.25, H; 4.30. Found: N, 0; C; 73.43, H; 4.37.

2

[0032] 例 6 :化合物 11、 17、及び 19、並びに 4-メトキシカルボ-ルフルォレセインの蛍光量子収率とベンゼン環部位の還元電位の関係

[表 3]

[0033] 化合物 11、 17、及び 19、並びに 4-メトキシカルボ-ルフルォレセインの蛍光量子収率とベンゼン環部位の還元電位の関係を上記の表 3に示した。上記のベンゼン環部位の還元電位は、 A、 B、及び Cについてはァセトニトリル中で、 Dについては水溶液中で飽和カロメロ電極 (SCE)を参照電極として測定した値である。

4-メトキシカルボ-ルフルォレセインの蛍光量子収率（0.203)〖こ対し、化合物 19の蛍光量子収率は高ヽ（0.673)。両ィ匕合物のベンゼン環部位の還元電位の高低も同様の関係にあった。これらの結果から、電子密度が高く還元されにくい化合物は励起蛍光団からの光誘起電子移動 (Donor- Excited Photoinduced Electron Transfer; d- P eT)を起こしにくく（Petァクセプターになりにくく）、高蛍光量子収率となることを示すものと考えられた。

[0034] 別のベンゼン環部位の例として、 4_カルボキシァ-ソールおよび 3_カルボキシァ- ノールのメチルエステル体 (A及び B)についてその還元電位を確認すると、それぞれ -2.54V、 -2.34Vであり、化合物 19のベンゼン環部位の 2-メトキシカルボ-ルナフタレン (C)の還元電位より低ぐより PeTァクセプターになりにくいと考えられた。 4-カルボキシァ-ソールおよび 3-カルボキシァ-ソールをベンゼン環部位として有する化合物 12及び 16のエステル体の蛍光量子収率はそれぞれ 0.842及び 0.558であり、 6-カルボキシフルォレセインメチルエステルの蛍光量子収率より高い。このようにして、実質的に高、蛍光性になるようにベンゼン環に低、還元電位を与える置換基の組合わせを選択することができることがわ力つた。化合物 12及び 16は高量子収率の蛍光ラベル化剤として好適である。

例 7：スクシンィミジルエステル（SE)類の合成

[化 8]

3 eq. NHS

3 eq. WSCD

- D 2 t

10 eq. NHS

10 eq. WSCD

DMF

r. t., 1 h

18%

16(47b) 化合物 4(2la)、化合物 8(2lb)、化合物 I2(47a)、化合物 I6(47b)、それぞれ l mmol、 N -ヒドロキシスクシンイミド（NHS) 2、 3又は 10 mmolを無水ジメチルホルムアミド 5 mL に溶解し、これらの溶液に 2、 3又は 10 mmolの水溶性カルボジイミド（WSCD: N-(3-ジメチルァミノプロピル)- Ν'-ェチルカルポジイミド)を氷冷下カ卩え、 0。Cで 1又は 2時間反応させた。反応後リン酸水溶液を添加し、塩化メチレンで抽出して乾燥した後。溶媒を減圧留去して目的のスクシンィミジルエステル体を得た。必要に応じてシリカゲル力ラムにより目的物の精製を行った。

[0037] 21aSE

^JH NMR (300 MHz,メタノール— d ) δ 8.28 (dd, 1H, J = 8.2, 1.8), 8.02 (d, 1H, J = 1.

4

7), 7.74 (d, 1H, J = 8.2), 7.06 (d, 2H, J = 9.3), 6.77-6.73 (m, 4H), 2.89 (s, 4H), 2.1 9 (s, 3H); HRMS (ESト MS) [M+H]⁺ calcd for C H NO + 444.1083, found 444.1117.

25 18 7

21bSE

^JH NMR (300 MHz,メタノール— d ) δ 8.26 (s, 1H), 8.19 (d, 1H, J = 9.2), 7.52 (d, 1

4

H, J = 7.9), 7.06 (d, 2H, J = 9.0), 6.77-6.73 (m, 4H), 2.94 (s, 4H), 2.17 (s, 3H); HR MS (ESI-MS) [M+H]⁺ calcd for C H NO ⁺ 444.1083, found 444.1041.

25 18 7

[0038] 47aSE

^JH NMR (300 MHz, CD CN) δ 8.37 (dd, 1H, J = 8.8, 2.2), 7.97 (d, 1H, J = 2.2), 7.

3

39 (d, 1H, J = 8.8), 7.03 (d, 2H, J = 9.5), 6.60—6.57 (m, 4H), 3.82 (s, 3H), 2.83(s, 4 H); HRMS (ESI-MS) [M+H]⁺ calcd for C H NO + 460.1032, found 460.0989.

25 17 8

47bSE

^JH NMR (300 MHz, CD CN) δ 7.94 (dd, 1H, J = 7.9, 1.5), 7.87 (d, 1H, J = 1.5), 7.

3

44 (d, 1H, J = 7.9), 7.01 (d, 2H, J = 9.7), 6.58-6.55 (m, 4H), 3.79 (s, 3H), 2.89(s, 4 H); HRMS (ESI-MS) [M+H]⁺ calcd for C H NO + 460.1032, found 460.1009.

25 17 8

[0039] 例 8 :本発明の蛍光ラベル化剤を用いた BSAの蛍光修飾

ゥシ血清アルブミン (BSA) 15 mgを 500 μ Lの 100 mmol/Lホウ酸バッファー（ρΗ 9.0) に溶解し、ここに本発明の蛍光ラベル化剤の 20 mMのジメチルホルムアミド溶液 50 μ Lを攪拌しながら添加した。そのまま室温で 1.5時間反応させた後、これを 1.5 gのセフアデックス G25により精製した。溶離液は 1 X PBS (100 mmol/L NaCl、 40 mmol/L N aPi)を用いた。図 1には本発明の蛍光ラベル化剤でラベルイ匕された BSAの吸収スぺクトルを示し、図 2には本発明の蛍光ラベル化剤でラベルイ匕された BSAの蛍光スぺクトル (励起波長: 490 nm)を示した。図に示した結果から、本発明の蛍光ラベル化剤により BSAの高蛍光性修飾が可能であることが示された。

産業上の利用可能性

本発明の蛍光ラベル化剤は、カルボキシフルォレセインで見られたラベル化による蛍光量子収率の低下を克服しており、高い量子収率を有する蛍光ラベル化剤としてタンパク質は有機化合物などのラベル化に有用である。

Claims

請求の範囲下記の式（I)：

[化 1]

(式中、

及び R⁴はそれぞれ独立に水素原子又は一価の置換基を示すが、これらのうち少なくとも 1個は、被ラベル化物質に共有結合を介して結合可能な反応性官能基を示し; R⁵は水素原子、カルボキシル基またはスルホン酸基以外の一価の基を示し; R⁶及び R⁷はそれぞれ独立に水素原子又はハロゲン原子を示し; R⁸は水素原子、アルキルカルボ-ル基、又はアルキルカルボ-ルォキシメチル基を示し、ただし、

及び R⁵の組み合わせは、式 (I)で表される化合物が被ラベル化物質に共有結合した後、実質的に高い蛍光性になるように、それらが結合するべンゼン環に低 1、還元電位を与える組み合わせである）で表される蛍光ラベル化剤。

[2] R⁵がアルキル基又はアルコキシ基である、請求項 1に記載の蛍光ラベル化剤。

[3] 該反応性官能基が、カルボキシル基又はその反応性誘導体である請求項 1又は 2に記載の蛍光ラベル化剤。

[4] 該反応性官能基が活性エステル基である請求項 3に記載の蛍光ラベル化剤。

[5] 被ラベルイ匕物質力 Sタンパク質、核酸、又は脂質である請求項 1な、し 4の、ずれか 1 項に記載の蛍光ラベル化剤。

[6] 被ラベルイ匕物質を蛍光ラベルイ匕する方法であって、請求項 1な、し 5の、ずれか 1項に記載の蛍光ラベル化剤と被ラベル化物質とを反応させる工程を含む方法。