WO2006018998A1

WO2006018998A1 - クローン哺乳動物の作成方法

Info

Publication number: WO2006018998A1
Application number: PCT/JP2005/014474
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Wakao; Akihiko Koseki; Masaru Taniguchi; Atsuo Ogura; Kimiko Inoue
Original assignee: Riken
Priority date: 2004-08-18
Filing date: 2005-08-01
Publication date: 2006-02-23
Also published as: US20100083393A1; EP1792537A4; EP1792537A1; JP2006081542A

Abstract

ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラーＴ細胞を用いることを特徴とするクローン哺乳動物の作成方法、該方法によって得られるクローン哺乳動物、該クローン動物の胚からＥＳ細胞を得る方法並びに該方法によって得られるＥＳ細胞の提供。

Description

明細書

クローン nilし動物の作成方法

技術分野

本発明はクローン哺乳動物胚及びクローン哺乳動物、それを製造する為の方法、及ぴそれらの用途等に関する。さらに本発明はクローン哺乳動物胚性幹細胞（以下 E S細胞ともいう）、それを製造する為の方法及びそれらの用途等に関する。

背景技術

英国でのクローン羊ドリーの誕生以来 (Wilmut, I. ら，「Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. J, Nature, (英国）， 1997年， 385, p. 810 - 813)、動物のクローン力 S様々な手法で樹立されたが体細胞由来の核を直接、核除去された卵子に移植してクローンを得る手法は非常に効率が悪く、また移植に使用したドナー細胞の由来を特定することは非常に困難であるため再現性に問題があった。後者を克服するため細胞特異的表面マーカーを発現しているリンパ球がドナーとして使用された;^効率力 S悪く、余計なプ口セスが必要になってしまった。例えば T細胞、 B細胞等の末梢リンパ球を使用した場合は 1 Z 5 0 0 ( 0. 2 %) 禾の確率でしか E S細胞が樹立されてレ、なレヽ (Hochedlinger, K. , and R. Jaenisch.， Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B a nd T donor cells. J, Nature, (英国）， 2002年， 415, p. 1035 - 1038)。また神経嗅覚細胞をドナーとしたは多少 E S細胞樹立の確率が上昇するがこれらのいずれの場合でも E S 細胞の樹立と te raploid complementationという二つステップがクローン個体産生に必要ヽ可欠となっている (Eggan, K. ら， IMice cloned from olfactory sensory neurons.」， Nat ure, (英国)， 2004年， 428, p. 44 - 49)。このように末梢の終分化した細胞を使用してクローンを作成するのは非常に時間と労力を要するものであった。一方、ヒトへの応用を考えた場合いつたん E S細胞を経るということはクローンの H L Aがドナーのそれと一致しなくなるため（自己移植の^を除いて）必然的に免疫拒絶反応を起こしてしまい使用不可能である。そこでこれらの技術的、免疫学的制約を凌駕するドナー細胞として使用可能な体細胞の同定が求められていた。また従来の体細胞クローン技術ではドナー細胞の由来を正確に同定することはほぼ不可能であり、全個体再生能力のある細胞群を特定することは不可能であった。また、従来行われてきたクローン技術では、胚移植後、実際に産仔に至るのは極めて僅かであり、より産仔に至る確立の高いクローン哺乳動物の作成方法が求められている。

発明の開示

本発明はより効率よく、且つ生存率の高いクローン動物の作成方法の «、該方法によつて得られるクローン動物、その子孫、胚等、ならびにそれらから得られる細胞、組織、器官、生産物等の驗を目的とする。本発明の別の目的は、クローン動物胚から E S細胞を得る方法、該方法によって得られるクローン動物 E S細胞、及びそれらから得られる細胞、，«、器官、生産物等を «することである。本発明のさらなる別の目的は、ドナー細胞の由来を正確に同定し得る体細胞クローン技術を ¾^することである。

本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を行った結果、核を樹共するドナー細胞としてナチュラルキラー T細胞（以下 NKT細胞ともいう）を用いることによって、得られたク口ーン胚が、 E S細胞の樹立ならびに逐次的な tetraploid complementationを必要とすることなく発生、産仔に至ることを見出した。さらに得られたクローン動物が正常な生殖能力を有することを確認して本発明を完成するに至った。すなわち本発明は以下の通りである。

〔 1〕ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラー τ細胞を用いることを特徴とする、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

〔 2〕哺乳動物のナチュラルキラー T細胞の核を哺乳動物の赚卵母細胞に導入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

〔3〕哺乳動物のナチュラルキラー T細胞に由来する核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入して蘭築胚を形成し、該赚築胚を宿主哺乳動物に移入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

〔4〕ナチュラルキラー T細胞が、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、上記〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。〔5〕ナチュラルキラー T細胞と除核卵母細胞が同種の哺乳動物由来である、上記〔1〕〜〔 4〕のレ、ずれかに記載のクローン非ヒト t fし動物の作成方法。

〔6〕ナチュラルキラー T細胞と除核卵母細胞が異種の哺乳動物由来である、上記〔1〕〜〔4〕のいずれかに記載のクローン非ヒト Hf?し動物の作成方法。〔7〕ナチュラルキラー T細胞が、臍帯血、末梢血、月懂、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる,観より採取されるものである、上記〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

〔8〕上記〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法によって作成されたクローン非ヒト哺乳動物。

〔9〕上記〔1〕〜〔7〕のいずれかに記載の方法によって得られるクローン非ヒト哺乳動物の胎仔。

〔1 0〕上記〔8〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。

〔1 1〕 Τ細胞上で発現する T C R V 鎖が実質的に単一の T C R V /3鎖レパートリ一で構成されていることを特徴とする、上記〔1 0〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。

〔1 2〕単一の T C R V iS鎖レパートリーが、ドナー細胞として用いたナチュラルキラー T細胞の T C RV ]3鎖レパートリーと同一である、上記〔1 1〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。

〔1 3〕遺伝子爾冓成済みの T C Rひ鎖である V 1 4 - J α 2 8 1を含む対立遺伝子を有しナチュラルキラー Τ細胞の数が増カ卩していることを特徴とする、上記〔1 0〕記載のクローン非ヒト哺孚 L動物の子孫。

〔1 4〕上記〔8〕記載のクローン非ヒト哺乳動物から得られる細胞、，観、器官又は生産物。

〔1 5〕上記〔9〕記載のクローン非ヒト i ?し動物の胎仔から得られる細胞、繊、器官又は生産物。

〔1 6〕上記〔1 0〕記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫から得られる細胞、糸赚、器官又は生産物。

〔1 7〕ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、上記〔1 4〕又は〔1 5〕記載の細胞、繊、器官又は生産物。

〔1 8〕治療用、移植用及び Ζ又は細胞移植用である、上記〔1 4] 〜〔1 7〕のいずれかに記載の細胞、繊、器官又は生産物。

〔1 9〕ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラー T細胞を用いることを特徴とする、クローン哺乳動物胚の作成方法。〔2 0〕哺乳動物のナチュラルキラー T細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入することを含む、クローン哺乳動物胚の作成方法。

〔2 1〕ナチュラルキラー Τ細胞が、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、上記〔1 9〕又は〔2 0〕記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

〔2 2〕ナチュラルキラー Τ細胞と,卵母細胞が同種の哺乳動物由来である、上記〔1 9〕〜〔2 1〕のいずれかに記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

〔2 3〕ナチュラルキラー Τ細胞と除核卵母細胞が異種の哺乳動物由来である、上記〔1 9〕〜〔2 1〕のいずれかに記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

〔2 4〕ナチュラルキラー Τ細胞が、臍帯血、末梢血、删蔵、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる糸纖より採取されるものである、上記〔1 9〕〜〔2 3〕のいずれかに記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

〔2 5〕上記〔1 9〕〜〔2 4〕のいずれかに記載の方法によって作成されたクローン哺乳動物月

〔2 6〕上記〔2 5〕記載のクローン哺乳動物胚を胚纏包期又は前胚麵包期まで培養し、得られる胚翻包期又は前包期の内部細胞塊から胚性幹細胞を分離することを含む、ク口一ン哺乳動物胚性幹細胞の作成方法。

〔2 7〕上記〔2 6〕記載の方法によって得られるクローン哺乳動物胚性幹細胞。

〔2 8〕上記〔2 7〕記載のクローン哺乳動物胚性幹細胞を所望の細胞分化を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することを含む、クローン哺乳動物の分化細胞、 ,織、器官又は生産物の作成方法。

〔2 9〕上記〔2 8〕記載の方法によって得られるクローン哺乳動物の分化細胞、糸職、器官又は生産物。

〔3 0〕ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、上記〔2 9〕記載の分化細胞、繊、器官又は物。

〔3 1〕治療用、 Ι1 移植用及び/又は細胞移植用である、上記〔2 9〕又は〔3 0〕記載の分化細胞、繊、器官又は生産物。

図面の簡単な説明

図 1は、 N KT細胞由来のクローンマウス作成並びに E S細胞株の樹立の概要を示す模式図である。図 2は、 T C R V a:鎖遺伝子座ならびにプラィマーの位置を示 i 莫式図である。

図 3は、 TCRV]3鎖遺伝子座ならびにプライマーの位置を示 H 式図である。

図 4は、 NKTクローンマウス #1 (尾と胎、 #2 (尾と胎盤）、 #3 (胎 ® 、

#4 (死産、胎^) のゲノム DN Aを使用したサザンプロット角 ¾)?の結果を示す図（電気泳動写真）である。白抜き矢頭は遺伝子蒲成の起こったバンドを、黒塗り矢印は遺伝子帮冓成の起こる以前のバンドを示している（germline configuration)。

図 5は、クローンマウスにおいて TCRVa 14— Jひ 281遺伝子！ ¾f成が行われていることを PCR法を利用して証明した図（電気泳動写真）である。

図 6は、 N KT細胞由来クローンマウスにおける T C R V a鎖塩基配列を示した図である。

図 7は、 NKT細胞由来のクローンマウスにおける T CRVj3鎖塩基配列を示した図である。

図 8は、 NKT細胞由来の ES細胞（レーン 1~6) ゲノム DNAを使用したサザンブロット角晰の結果を示した図（電気泳動写真）である。プローブはクローンマウス角晰に使用したものと同じである。 TCRVo! 14プローブによって 13 k bのバンドのシフトが見られる（レーン 1〜6) とともにレーン 3及び 4の ES細胞では 2. 5kbのバンドの消失力 s観察された。また、 TCRVJSプローブを用いた場合にも遺伝子冓成の済んだバンドが観察された。白抜き矢頭は遺伝子蘭成の起こったバンドを示している。黒塗り矢印は遺伝子冓成の起こる以前のバンドを示している（germline configuration)。

図 9は、 NKTクローンマウス # 1と I CR種マウスとの掛け合わせによる F 1でのサザンプロット解析の結果を示した図（電気泳動写真）である。クローンマウス由来の遺伝子再構成済みの TCRVQ! 14由来 8 k bのバンドを受け継いだ F 1が雄 1番、雌 6番に見られる（上部パネル、矢印）。又、クローンマウス # 1由来の TCRV0を含む対立遺伝子はそれぞれ約 9 k bと 8 k bに分離している（図 4参照、黒塗り矢頭）。各 F 1は母親マウス由来の 10. 4 kbのバンド（白抜き矢頭）と約 9 k b若しくは 8 k bのバンドを受け継いでいる。

図 10は、 NKTクローンマウス # 1と I CR種との掛け合わせによる F 1での FAC S解折の結果を示した図である。上段はクローンマウス子孫における TCRVjS 8の割合を全 TCRV β陽 1·生細胞中に占める割合として示した。下段はクローンマウス子孫における NKT細胞の割合を示す。パネル 1は、コントロールの I CR種マウス（野生型）の、ノネノレ 2は、遺伝子再構成の終了した T C R V ]38をインフレームで遺伝的に継承するマウスの、ノ、。ネノレ 3は、 ¥0； 14—】 281の遺伝子謹成が終了しこれを継承するマウスの結果をそれぞれ示している。 NKT細胞群を円で囲み、全細胞数に対する NKT細胞の数としてパーセント（％) で示した。

図 1 1は、 NKT細胞核あるいは T細胞核を移植して得られる冓築胚のインビトロ培養（48ならびに 72時間）における分化あるいは生存の状況を角？!)？した結果を示す図であり、表 1の 48ならびに 72時間での結果をダラフ化したものである（マウスの誕生は除く）。縦軸は培養胚の経時的な生存率を示したもの、あるいは偽妊娠マウスに再構築胚を導入した場合の個体の発生率（移植胚の誕生率）を示したものである。 *pく 0. 00 01 ； **p< 1 X 10— ²⁵

図 12は、クローンマウス（# 1、 # 2) の末梢リンパ球の F ACS角 ¾)?の結果 (TC RV β V s TCRV)38) を示す図である。

図 13は、 NKT細胞の人工ァゴニストである a— GCで刺激後、 0、 4、 12、 24 時間経過後のマウスから血清を採取し、得られた血清中のサイト力イン（I FN— γ、 I L— 2、 GM— CSF、 I L一 4、 I L一 10、 I L一 5、 TNF— (¾、 I L-1 β) レベルを EL I SA法により測定した。各測定時で 4匹のマウスについて測定した。縦軸に各サイト力イン濃度を示し、横軸に測定ポイントを示す。データは平均土標準偏差で表した。

図 14は、あらかじめ a— GC処理を施した樹状細胞（DC) (5 X I 0⁴細胞）と応答細胞となる脾臓細胞（SPC) (1 X 10⁶細胞）との混合培養物の培養上清中の I L 一 4及び I FN— γの量を測定した。縦軸に各サイトカインの濃度を示し、横軸に脾臓細胞の由来を示す。データは 3回測定してその平均土標準偏差で表した。

発明の詳細な説明

文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明力 S属する技術分野の当業者に一般に糊军されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験にぉレヽて使用することができる力好ましい方法及び材料を以下に記る。本明細書で言及したすべての刊行物及び特許は、例えば、記載された発明に関連して^ ffiされうる刊行物に記載されている、構築物及び方法論を記載及び開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明の一例の要約を図 1に示す。

本発明において用いるナチュラルキラー T (NK T) 細胞は、その割合は少ないが免疫系で制御的な役割を担っているリンパ球の一種である。 NKT細胞は T細胞レセプタ一 (T C R) と NKレセプターの 2つのレセプターを有する。 ΝΚΤ細胞は通常の Τ 細胞や ΝΚ細胞とは異なる特異的なレパートリーを発現している。例えばマウスの鎖については NK T細胞の 9 0 %以上は主に V j8 8、他に V ]3 7や V β 2という限られたレパ一トリーを発現し、ひ鎖については均一な V 1 4 - J α 2 8 1を発現している。この均一な T C R 鎖は、 T C R遺伝子の蘭成の際に、 V及び J遺伝子群から Vひ 1 4遺伝子と J 2 8 1遺伝子とが選ばれゲノム上で雨冓成された結果として作成される (Taniguchi et al. , (2003) Annu Rev Immunol 21, 83-513 The regulatory role of Valphal4 NKT cell s in innate and aquired immune response) ₀ ヒトではマウスの V a 1 4と†目同个生の r¾い非多型性の V a 2 4 , 及び V β 8 . 2に近縁の V j3 1 1の組み合わせであることが知られている。このような性質は、得られたクローン動物におけるドナー細胞の起源を追跡するのに適している。 NKT細胞の由来は特に限定されず、ヒトを含む霊長類、げっ β、ゥサギ、ネコ、ィヌ、ゥマ、ゥシ、ヒッジ、ャギ及びブタ等の哺乳動物の臍帯血、末梢血、肝臓、骨髄、脾臓、リンパ節、胸腺等から回収することができる。本明細書で用いる「霊長類」という用語は、サル、類人猿、及びヒトが含まれるがこれらに限定されない、哺乳類の群に属する、任意の動物を意味する。具体的には末梢血や肝臓のホモジネートから回収される単細胞の懸濁液を、 ΝΚ Τ細胞に高度に保持された T C Rに認識さ辱る、 C D 1 d分子と結合したひ一ガラクトシノラミド（a— G a 1 C e r若しくは a— G C) のような ¾¾¾脂質を用いて F A C S角? Wすることによって選別、回収することができる。本発明で用いられる NK T細胞は活性化されていてもされていなくても構わない。好ましくは抗原刺激されてレ、ない状態の細胞が好まし、。また、 N K T前駆細胞を N K T細胞分ィ匕誘導能を付与する因子の下で培養することによって得られる N κ τ細包であつてもかまわなレ、。 N K T前駆細胞は胎児月田胞あるいは末梢血や臍帯血由来であり得る。

本発明のクローン哺乳動物の作成方法においては、 NKT細胞をドナー細胞として用いることを特徴とする。具体的には NKT細胞の難植によって実施される。核移植の方法は、 NKT細胞の核をドナー細胞核として実施され得るものであれば特に限定されない。細胞核を当該細胞核と同じ種の哺乳動物由来の I»卵母細胞に導入する ¾ ^と細胞核を当該細胞核と異なる種の哺乳動物由来の除核卵母細胞に導入するがある。異なる種の哺乳動物由来の除核卵母細胞への ί繊植の技術は、絶藤の復活、絶滅危†雄の保存、増殖に有用である。同じ種の哺乳動物由来の除核卵母細胞への核移植はより効率よく産仔に至る。

NKT細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入する方法としては、未受精卵子の核が最終的にドナー細胞である NK T細胞の核と置き換わればその方法は特に限定されなレヽが、 NKT細胞の大きさを考慮すると、 NKT細胞の細胞膜にピペット等で傷をつけ、傷をつけた NKT細胞をマイクロマニュピレーター等を用いて直接除核卵母細胞に導入する方法力 S好適に用いられる。 NKT細胞と除核卵母細胞との細胞融合によって難植カ S行なわれても良い。より具体的には例えば、 Wakayamaら（Nature 394, 369-374(1998))、 Inoueら（Bio 1. Reprod 69， 1394-1400(2003))によって報告されている方法に準じて、また適宜改変して実施することができる。 NKTiB月包と除核母糸田 J3包を融合させることで I»植を実施する場合、市販の装置を用いた電気融合法により融合させることができる。

除核を施す哺乳動物の卵母細胞は、ホノ^ ン投与による過排卵処理によって得ることができる。除核は卵母細胞に微小なピぺットを用、未受精卵母細胞の核と周りの細胞質を吸 V、込み、ちぎり取るような操作によつて実施するが、そのままでは細胞骨格が壊れ卵母細胞; ^破壌される。従ってあらかじめ未受精卵母細胞の細胞骨格を消失させる処理を施すことが好ましレ、。細胞骨格の消失はサイトカラシンを用いることで実施できる。また、核移植後にもサイトカラシン等で処理することが好ましレヽ。植が施される卵母細胞は活性化されていなくてもされていても構わないが、活性化されている状態が好ましい。当該活 †生化は»植の前後、どちらで施されても構わない。活性化は電気的方法や薬剤処理法によつて刺激することによつて実施し得るが特に限定されるものではなレ、。特に好ましくは自然に成熟した終期の卵母細胞を用いる。活性化は、例えば卵母細胞中の 2価のカチオン濃度を上げること、及び/又は卵母細胞中の細胞性タンパク質のリン酸化の程度を低下させることによって行うことができる。これは一般に 2価のカチオン、例えばマグネシウム、ストロンチウム、ノリウム、カルシウムを、例えばィオノフォアの形で卵母細胞の細胞質に導入することによって行われる。 2価のカチオン濃度を増加させる他の方法は、電気ショック、ェタノール処 s¾びケージキレート剤の処理の利用が含まれる。リン酸化の程度知の方法、例えばキナーゼ阻豁 U、例えば 6—ジメチルァミノプリン、 2—アミノブリン及ぴスフィンゴシンのようなセリン一スレオニンキナーゼ阻害剤の添加によって低減されることがある。あるいは卵母細胞中へのホスファターゼの導入によってリン酸化を阻害することもできる。

NK T細胞の核を除核卵母細胞に導入して、再冓築胚を形成し、さらに冓築胚を宿主哺乳動物に移植することによって該冓築胚を宿主哺乳動物に発生させ、それによつてクローン哺乳動物を得ることができる。

上述したように、ドナー細胞として N Κ T細胞を用レ、た場合、体細胞 »植により、 E S細胞の樹立ならぴに逐次的な tetraploid embryo complementationを必要とすること力 S なくクローン哺乳動物が得られる。すなわち、 NKT細胞は全能性を有しているものと予測される。

本明細書で用いる「全能性を有する」という用語は、胚、胎児、及び動物等の発生中の細胞塊中のすべての細胞を生じる細胞を意味する。好ましい態様では、「全能性を有する」という用語は、動物のあらゆる細胞を生じる細胞を意味する。全能性を有する細胞は、 1個又は複数の »植段階から胚を作成する手順で使用されると、発生中の細胞塊のあらゆる細 J3包を生じることができる。

本明細書で用いる「全能性を有する」という用語は、「多能性を有する」という用語と区別される。後者の用語は、発生中の細胞塊内における細胞の雄団に分化するが、そのような発生中の細胞塊におけるすべての細胞を生じることはできない細胞を意味する。本明細書で用いる「胚」又は「胚性」という用語は、宿主哺乳動物の子宮膜に着床していない、発生中の細胞塊を含む。したがって本明細書で用いる「胚」又は「胚性」という用語は、受精した卵母細胞、細胞質雑種、前胚麵包期の発生中の細胞塊、及ひ又は、宿主哺乳動物の子宮膜への着床前の発生期にある、他の任意の発生中の細胞塊を意味する場合がある。再構築胚とは、ドナー細胞核を赚卵母細胞に核移植することによって得られる、ドナー細胞由来の核と卵母細胞由来の細胞質成分とで再構成された胚を意味する。胚は細胞発生の複数の段階を提示する¾ がある。例えば 1個の細胞胚は接合体と呼ぶことができ、接合体は分割胚から生じる中実で球状の細胞塊であり桑実胚と呼ぶことができ、さらに割腔を有する胚は胚^!包と呼ぶことができる。再構築胚の宿主哺乳動物への移植は、当分野で通常実施される方法に従って行うことができる。具体的には再構築胚を 2〜 8細胞期になるまで培養しつづけて 2〜 8細胞期の胚を宿主哺乳動物に移植し、さらにその再構築胚を哺乳動物に発生させてクローン哺乳動物を作成する。藤築胚の培養と成熟に適した培地は技術的に良く知られており、除核卵母細胞の起源となる哺乳動物の種類に応じて適！^定される。さらに再構築胚の培養は所望によりフィーダー細胞と共に、好ましくはフィーダー細胞層上で行ってもよい。藤築胚は宿主哺乳動物に移植するのに適したサイズに針る迄培養される。好ましくは約 2 ~4 0 0細胞、より好ましくは約 4 ~ 1 2 8細胞（マウスであれば時間にして約 4 8時間〜 7 · 2時間となるまで培養さ iL る。この培養は適当な条件下、即ち約 3 7 °C〜3 8. 5 °C、約 5〜7. 5 % C 0₂存在下で行われ、適宜培地を交換する。宿主哺乳動物は、その中で雨冓築胚を発生させることができるものであれば特に限定されないが、好ましくは除核卵母細胞と同じ種由来の哺乳動物であり、より好ましくは偽した雌の哺乳動物である。例えばマウスの:^、偽婦雌マウスは、正常性周期の雌マウスを、精管結紮等により去勢した雄マウスと交配することにより得ることができる。作出した偽妊娠マウスに対して、上述の方法により得られた S冓築胚（クローン胚）を子宮内移植、特に卵管内に移植し、出産させることによりクローン哺乳動物を作成することができる。クローン胚の着床 · 通がより確実に起こるようにするために、籠になる偽簾マウスは、除核を施す卵母細胞を採取する雌マウスと同一の性周期にある雌マウス群から選択することが好ましい。

本明細書で用いる「胎仔」という用語は、宿主哺乳動物の子宮膜に着床した発生中の細胞塊を意味する。胎仔は例えば生殖隆起のような明確な特徴を含む場合がある。生殖隆起は当業者により容易に同定される特徴であり、多くの動物種の胎仔で認識可能な特徴である。胎仔の細胞とは、胎仔から単離された、及び Z又は胎仔から生じた任意の細胞、又は胎仔に由来する細胞を意味するがある。本発明のクローン哺乳動物の胎仔は、上記したクローン哺乱動物の作成過程において、再構築胚を仮親へ移植した後、ィ壬意の段階で採取することによって得ることができる。

本発明のクローン哺乳動物の子孫は、蒲築胚から発生したクローン哺乳動物を第 2の哺乳動物と交配させることによって得ることができる。第 2の哺乳動物は、クローン哺乳動物（便宜上第 1の哺乳動物ともいう）と同じ種の正常な哺乳動物（クローンではない）、あるいはクローン胚から発生したクローン哺乳動物又はその子孫等であり得る。後述するトランスジェニック B甫乳動物あるいはトランスジェエック哺乳動物胚から発生したクローン哺乳動物又はその子孫であってもよい。本発明において「子孫」とは、本発明のクローン哺乳動物を親とする仔世代 (F l) 、 F 1を親とする仔世代 (F2)、 F 2を親とする仔世代（F 3 ) 等の本発明のクローン哺乳動物を発生の起源とするものであれば何世代のものであっても構わない。本発明において、上記したクローン哺乳動物、クローン哺乳動物の胎仔、クローン哺乳動物の子孫を用いて任意に細胞、組織又は器官を得ることができる。細胞、組織又は器官の採取 ·回収は特に限定された方法で行う必要はなく、通常当分野で実施される方法で行われる。さらに、得られた細胞、組織又は器官から分泌、産生、抽出される生産物も本発明の範囲内である。クローン哺乳動物から得られる生産物としては、纖哺乳動物から得られるものと同様多種多様であるが、糖タンパク質、神経べプチド、ィムノグロブリン、酵素、ペプチド及びホルモンが挙げられる。より具体的にはヒト a 1アンチトリプシン、ヒト血液凝固因子 V I I I、 t PA (tissue specific plasrainoge n activator)、アンチスロンビン I I I、プロテイン C、フィプリノーゲン、ヒト血液凝固因子 I Xなどが挙げられる。

上記のようにして得られたクローン哺乳動物の組織、器官はドナー細胞である N K T細胞と同一の組謹合性抗原（例えばヒトでは HLA) を有し、得られたクローン哺乳動物の糸!^ 器官をドナー細胞の «者である哺乳動物に移植した場合、非自己と認識されることなく免疫寛容状態となり、免疫拒絶^が起こらない。

さらに、本発明のク口一ン哺乳動物の子孫は以下の特徴を有する（後述の実施例に詳細ベる) 。

(1) 個体内で発現する TCRV]3鎖が実質的に単一の TCRV^鎖レパートリー、特にドナー細胞として用いた NKT細胞の TCRV]3鎖レパートリーと同一である。

(2) NKT細胞の数力 S増加している。

TCR遺伝子群の再構成は、その T細胞の分化及び選択に関与する膨大な数のリンパ球のレパートリー形成において重要な役割を果たす。例えば組み換え活性化遺伝子 (RA G) の発現は、これらの遺伝子稱冓成に必須であり、 RAGの異常や欠損により難複合疫不^やォーメン症候群力 S発症することが明らかにされている。上記 ( 1 ) のような、個体内の T C Rがある特定の一種類に限定されるという現象は T C Rトランスジエニック動物以外に報告例がなく、このような特徴を有するクローン哺乳動物の子孫を用いることによって、本来 1 0万個や 1 0 0万個に 1つといったただ一種類の T細胞クローンの分化と選択を個体レベルで観察することができる。例えば単一の T C RV ]3鎖を発現する T細胞では a ]3型の T C Rを発現し γ δ型の T C Rの発現が抑制されている。カゝかる現象は大腸炎等の腸疾患で観察される現象と類似しており、従って本発明のクローン哺乳動物の子孫は、大腸炎等のモデル動物としても有用である。さらに本発明の遺伝子再構成済みの T C R 鎖である V a l 4 _ J o; 2 8 1を含む対立遺伝子を有するクローン哺乳動物の子孫では、 NKT細胞の数が増加している。 NKT細胞の数の増カロは、 ^JM蔵細胞に対する割合（NKT細胞の割合）においても、また絶対数においても認められる。 NKT細胞力 S免疫系を制御する機能を有する細胞であることから、より NKT細胞の数の多い本発明のクローン哺乳動物の子孫は、 NKT細胞が関与している疾患及び/又は病態の研究、特に自己免疫疾患やアレルギー疾患の発症機構、移植骨髄拒絶、膾瘍免疫の解明に大きく貢ることが期待される。より具体的な疾患及び/又は病態としては、ヒトおよひ ¾]物における炎症状態、種々の疼痛、膠原病、自己免疫疾患、種々の免疫疾患、特に関節および筋肉における炎症および疼痛（慢†生関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、骨関節症、尿酸性関節炎等）、皮膚の炎症性状態（湿疹等）、眼の炎症性状（結膜炎等）、炎症を伴う肺の障害（喘息、気管支炎等）、炎症を伴う消化器の状態（ァフタ性潰瘍、クローン病、萎縮性胃炎、いぼ状胃炎、潰; †生大腸炎、脂肪便症、限局性回腸炎、過敏性腸症候群等）、歯肉炎、または障害後の炎症、疼痛、 fl動長）、炎症に関連した発熱、疼痛、その他の状態、移植による拒絶、全身†生エリテマトーデス、強皮症、性筋炎、麵生軟骨炎、結節性動脈周囲炎、強直性脊椎炎、炎症隨性腎状態（糸球体腎炎、ルーブス腎炎、 fl†生腎炎等）、リウマチ熱、シエーダレン症候群、ベーチェット病、甲状腺炎、 I型糖尿病、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、憩筋無力症、グレーヴス病、性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性血液疾患（溶血性貧血、真性赤血球性貧血、頻生血小板減少症、再生不良性貧血等）、ぶとう膜炎、接触皮膚炎、乾癬、川崎病、 I型アレルギ一反応が関与する疾患（アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、奪麻疹、アレルギー性結膜炎、花粉症等）、ショック（敗血'性ショック、アナフィラキシー '性ショック、成人型呼吸窮迫症候群等）、サルコィドーシス、ゥェゲナー肉芽腫症、ホジキン病、癌（肺癌、胃癌、結腸癌、胃癌、肝癌等）、ウィルス疾患（肝炎）等が例示される。

本発明はまた、上記した冓築胚（クローン胚、あるいはクローン哺乳動物胚ともいう）を用いるクローン哺乳動物 E s細胞の作成方法及びそれによつて得られるクローン哺乳動物 E S細胞を^する。 E S細胞は、好ましくはインビトロ細胞培養で維持された胚力^単離された、多能性を有する細胞を含む。 E S細胞は、支持細胞の有無にかかわらず培養することができるが好ましくは支持細胞を用いる。支持細胞としては、当分野で通常用いられるものカ利用できるが、例えばマウス E S細胞の場合であればマウス胎仔由来の線锥芽細胞を用いることができる。クローン哺乳動物 E S細胞は、胚«包期の胚及ぴ前胚 ®包期の胚を含む、任意の発生時期に胚から単離された胚性細胞から樹立することができる。より詳細にはドナー細胞である NKT細胞の核を除核卵母細胞に導入し、得られたク口一ン哺乳動物胚を胚盤包期及び Z又は前胚額包期迄培養し、得られた内部細胞塊から単离 trることによって作成される。本明細書で用いる「内部細胞塊」という用語は、胚本体を生じる細胞を意味する。胚翻包の外側に並ぶ細胞は、胚の栄養芽層と呼ばれる。胚から内部細胞塊を単難 H "る方法は当業者に公知である。

当該クローン哺乳動物 E S細胞は所望の細胞分化を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することができ、所望の分化細胞、 «ならびに器官を作成することができる。所望の細胞分化を誘導し得る条件は、その分化の種類ゃにより設定されるべきであり、当業者には容易に設定することが可能である。例えば胚性幹細胞を造血幹細胞へと分化誘導し、さらに分化を進めて最終的に赤血球や白血球等の血液細胞を生じさせる。もしくは神経幹細胞に分化させ、個々の神経細胞に分化誘導させてやることが可能である。

本発明において得られた胎仔、産仔がドナー細胞である NKT細胞由来であることの確認は、得られた胎仔、産仔の遺伝子、具体的には T C R遺伝子を調べることによって行われる。 NKT細胞は T C R遺伝子が爾冓成され、その結果、例えばマウスでは、上述したようにひ鎖については特徴的に V a l 4 ~ ] a 2 8 1を発現している。さらに遺伝子痛成の済んだ V /3鎖を有する。 NKT細胞の遺伝情報を弓 |き継いだクロン哺乳動物の胎仔、産仔のゲノム D NAについて、 T C RV a 1 4プローブ及び/又は T C R V j3プローブを用いて、好ましくは T C RVひ 1 4プローブ及び T C RV J3プロープの両方を用いてサザンプロット角 ¾ί?を行い、その T C R遺伝子が雨冓成されたものであるカゝ、特にドナー細胞として用いた NKT細胞と同じ T C R再構成パターンを示す力かを廳 ¾することによつて得られたクローン哺乳動物の胎仔、産仔がドナー体細胞である NKT細胞由来であるか否かを判定することができる。また、再構成された T C R遺伝子を継承している力かは P C R法によっても確認することができる。具体的な ¾!忍の手順は実施例にて後述する。本発明の上記したクローン哺乳動物を作成する方法は、遺伝子操作された哺乳動物又はトランスジエニックな哺乳動物をクローニングするためにも利用できる。具体的には、ドナー細胞として所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われた哺乳動物の NKT細胞を用いることを特徴とし、より詳細には、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われた哺乳動物の NKT細胞の核を除核卵母細胞に導入して再構築胚（トランスジエニック胚）を形成し、該蘭築胚を宿主哺乳動物に移入することによって実施される。「トランスジエニック胚」とは、 1個又は複数の細胞が人の介入により導入された異種核酸を含む胚を意味する。導入遺伝子は、細胞の前駆体へ導入することにより、意図的な遺伝子操作により、又は糸且換えゥィルスの感染により、細胞に直接又は間接的に導入することができる。本明細書に記載されるトランスジエニック胚では、導入遺伝子により細胞力 s所望の形質を示しうる構; if¾伝子を発現する。しかしながら、導 Λ¾伝子がサイレントな状態にあるトランスジエニック胚も含まれる。該トランスジェニック胚は、ドナー細胞の核が所望の形質を発現するよう遺伝子操作が行われた細胞の核である以外は、上記したクローン哺乳動物の作成の過程で得られるものと同様のものであり同様にして作成される。

本発明のトランスジエニック哺乳動物には、遺伝的変化又は遺伝情報が生殖細胞系に導入されることによって、遺伝情報を子孫に伝 ίϋ"る能力が付与される生殖細胞系のトランスジエニック動物をも包含される。

「遺伝子」という用語は、ポリペプチド又は前駆体の産生に必要な、調節配列及ぴコード配列を含む D Ν Α配列を意味する。ポリぺプチドは完全長のコ -ド酉己列にコードされ得る力、、又は所望の活性力保持されているかぎりはコード配列の任意の部分にコードされ得る場合がある。

「導 Ait伝子」という用語は、動物のゲノムへ導入される任意の核酸を広く意味し、おそらく通常はゲノム上にしなレ、配列を有する遺伝子もしくは D N A、する力 S所与のゲノムでは通常は転写及 Ό¾!訳（発現）されない遺伝子、又はゲノムへの導入が望まれる、他の任意の遺伝子もしくは DNAを含むが、これらに限定されない。導入遺伝子には、非トランスジエニックゲノム上に通常存在するが、発現の変更が望まれる遺伝子、又は変更型又は異型としての導入が望まれる遺伝子力 S含まれるがある。導入遺伝子は、特異的に、限定された遺伝子座に向けられるがあり、染色体内に無作為に組み込まれる場合があり、又は染色体外で纏する D N Aとなる場合がある。導入遺伝子は、 1つ又は複数の転写調節配列、及び選択された核酸が適切に発現するために必要であり得る、イントロン等他の任意の核酸を含む場合がある。導 Λ¾伝子は、コード配列又は非コード配列、又はそれらの組み合わせのがある。導 Λ¾伝子は、適切な条件下で 1つ又は複数の導入遺伝子の発現を睡する能力をもつ、調節エレメントを含むがある。

「所望の形質を示しうる構^！:伝子」という用語は、例え « l望する形質（例えば生物学的な活性を示す）を示すタンパク質又はアンチセンス RN Aを発現する、構 ii t伝子を意味する。構 5 it伝子は、植物、真菌、動物、細菌のゲノムもしくはェピソーム、 ¾ ^生物の核 D NAもしくはプラスミド D NA、 c D NA、ウィルス D NA、又は化学合成された D NAを含む、当技術分野で公知の任意の供給源に、全体として又は部分的に由来するがある。構 i^t伝子配列は例えば、受容体、酵素、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、免疫グロブリン、細胞周期タンパク質、細胞内情報伝達タンパク質、膜タンパク質、細胞骨格タンパク質、又はレポータータンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（G F P ) 、 0—ガラクトシダーゼ、ノレシフェラーゼ）等のポリペプチドをコードする^がある。さらに構鐘伝子は心血管疾患、神経疾患、生殖障害、癌、眼疾患、内分泌障害、肺疾患、代謝障害、自己免疫異常、老化等の特定の疾患又は障害に関連する遺伝子であつてもよい。構纖伝子は、発現生産物の生物学的活性もしくは化冓造、発現速度、又は発現制御様式に影響を及ぼしうる 1個又は複数の改変をコード領域又は非翻訳領域に含む場合がある。このような改変には、 1個又は複数のヌクレオチドの変異、挿入、欠失、及び置換が含まれるがこれらに限定されない。構 3 it伝子は連続したコード配列を構成しうるカゝ、又は適切なスプライス接合に結合した、 1個もしくは複数のイントロンを含みうる。構造遺伝子は融合タンパク質をコードする:^もある。

上記した本発明のクローン哺乳動物 E S細胞の作成方法に準じた方法で、トランスジェエックの田胞を用いてトランスジエニック哺乳動物の E S細胞を作成することもできる。得られたトランスジエニック哺季し動物 E S細胞は、上述のクローン哺乳動物 E S細胞と同様、所望の細胞分化を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することができ、所望の分化細胞、 »ならびに器官を作成することができる。得られた分ィヒ細胞、糸纖ならびに器官は所望の形質を示しうる構 itit伝子を有し、該遺伝子を発現することによって所望の形質を有する分化細胞、，«ならびに器官、あるいはそれらから産生される生産物を得ることができる。細胞、，ならびに器官、あるいはそれらから回収される生産物の回収は当分野で通常実施されている方法を用いて行うことができ、所望の形質に応じて適宜設定される。さらに本発明で説明された方法を用ヽて、特定の疾患に関連した遺伝子を発現しうる、トランスジェニック霊長類の E S細胞を作成することもできる。したがって本発明で説明された方法ならびに得られる E S細胞等により、ヒトの多くの疾患を治療することができる。本発明は、上記したように、クローン哺乳動物を作成する方法だけでなく、トランスジェニックなクローン哺乳動物を作成する可能性も^する。このようなトランスジェ-ック哺乳動物は、重篤なヒト疾患の研究モデル、ならびに伝子及ひ田胞の治療方針の効力を評価するためのモデノレとしても用いることが可能である。さらに本発明によって得られる幹細胞は、多くの疾患や機能 (例えば老化、エイズ、癌、アルツハイマー病、自己免疫異常、代謝障害、肥満、器官形成、精神疾患、及び生殖）の研究に極めて重要であると言える。

本発明のクローン哺乳動物及びトランスジエニック動物の T C R V ]3鎖は単一で NK T 細胞数が相対的、絶対的に増加していると考えられる。

クローン動物及びトランスジェニック動物を利用して、疾患の発症機構を発見し、かつ分子医学的な治療法の作成ならびにィ匕を行うことができる。例えば、特定遺伝子に関して遺伝子ノックアウトにより作成した哺乳動物により、癌、心臓病及び脳卒中を引き起こす動脈硬化、先天性代謝異常、ならびに他の胎児性疾患及び新^性疾患の治療法の発見が促進されうる。このような動物はまた、糖尿病、肝障害、腎障害、人: の発達、創傷治癒、心臓発作による損傷、脳卒中による脳損傷、脊椎損傷、記憶喪失、ァルツハイマー病、及び他の痴呆症、筋肉及申経の損傷を含む、疾患の細胞療法の fffi及び改善に適している。

実施例

以下、実施例にそって本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限; るものではない。本出願全体を通して引用されたすベての刊行物は参照として本明細書に組み入れられる。また、本発明において使用する!^や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。

実施例 1 ： NKT細胞由来のクローンマウスの作成

8週齢〜 23週齢 (C57BL/6 x 129/S v- t e r) Fl雌性マウスの肝臓より報細胞を P e r c o 1 1 (商品名、 Ame r s h a m社）比重遠心法により取得した。これらの細胞を自家で調製した Ph y c o e r y t h r i n (PE) 一ひ一 g a l a c t o s y l c e r ami d e (ひ一 GC) カ結合した CD 1 dテトラマー（ひ一 GC 1 o a d e d CDl d— t e t r ame r ； Matsuda, J. L.， 0. V. NaidenKo, L. Gapin, T. N akayama, M. Taniguchi, C. R. Wang, Y. Koezuka, and Kronenberg. 2000. Tracking the response of natural killer T cells to a glycol ipid antigen using CDld tetramers. J E xp Med 192:741-754. ) ならびに f l uo r o s c e i n i s o th i o c y a n a t e (F I TC) —抗 TCRVjS抗体（H57) (P h a r M i n g e n社）で染色し、両者によって染められる細胞を NKT細胞とした（即ち、 NKT細胞は、一 GC 1 o a d e d CDl d-t e t r ame r +/TCR ]3+で定義される) 。

これらの細胞をフローサイトメーター Mo F 1 o (Cy t oma t i on 社）により P E+/F I TC+の細胞集団として純化し縣植のドナーとして使用した。ソーティングを 2回繰り返し、純度 99 %以上で N KT細 J3包を得た。

レシピエントの卵子を排卵誘発剤処理された B 6D2F 1の雌マウスより卵巣 f 1 u s h i ngによって取り出し、ヒアルロニダーゼ処理により卵丘細胞を除いた後に、倒立顕謹下でピエゾマイクロマニピュレーターを用いて除核し核移植に用いた。 NKT細胞をピぺット内に吸引しながらピエゾマイクロマユピュレーターの物理的刺激によりその細胞膜に傷をつけた。続いてピエゾマイクロマニピュレーターにより除核卵子の透明帯と細胞膜に窄孔し NKT細胞核を細胞質内に注入することによって植を行った。同様にして τ細胞を用いて、 τ細胞核を細胞質内に ¾Λして得られる冓築卵子を得、対照として用いた。

核移植 1時間後に再構築卵子をサイトカラシン及びストロンチウム入り KSOM培地中で 1時間活性化した後に、サイトカラシンのみを含む K S OM培地で 5時間培養、さらに K S OM培地中で培養し、経時的に観察した。培養 24時間後には NKT細胞由来及ぴ T 細胞由来のヽずれの稱冓築胚でも、そのほとんどが G 0期と思われる 2細胞期の状態であつた。さらに 24時間培養（合計 48時間）すると、 T細胞由来の核を移植して得られた築胚では 2細胞期のまま停止していたが、 NKT細胞由来の核を移植して得られた再構築胚では 4細胞期にしていた。さらに培養を続けると（合計 72時間）、 NKT細胞由来の核を移植した再構築胚では 7 1 %がモルーラ ·ブラストシストとなったのに対し、 T細胞由来の核を移植した再構築胚ではその割合は 12 %に過ぎなかった。

48時間から 72時間（それぞれ 4細胞ステージ、モルーラ■ブラストシストに対応）培養し、偽妊娠一日目の I CRマウスの卵管に戻した。 19日後に帝王切開によって産仔を取りだした（図 1) 。

272個の胚を偽妊娠マゥスに移植したところ 4匹のマウスが生まれた（約 1. 5 %の確率）。また胎盤のみの受胎産物が 13個あった（約 4. 8%の確率）。これらの結果は、ドナーとして E S細胞を用レ、た結果に酷似しており、分化した体細胞である N K T細胞はマウスの再生産の為のゲノムの再プロダラミングに E S細胞と同様効果的であることがわかった。クローニングされた胎盤は全て、マウス体細胞クローユングに認められる胎盤過形成を中に、あるいは高程度に示した。上記の結果を表 1及び図 1 1にまとめる。

表 1

M & B：モルーラ"ブラストシス卜得られたクローンマウスが NKT細胞由来であることを証明するためこの細胞特有の T CRのサブュニットである VCK 1 4を検出するサザンプロットを行った。

NKT細胞は TCRVo;鎖が Va 14- J α 28 1のみの組み合わせを有する。もし作成されたクローンマウスが ΝΚΤ細胞由来であるならば、このマウス、ならびに胎盤のゲノム DNAは Vo; 14- J α 281という遺伝子 SI冓成済みのゲノム DNAを持っているはずである。また同様にして V ]3鎖も遺伝子冓成済みのゲノム DNAを持っているはずである。サザンプロット用プローブは以下のようにして調製した。

サザンブロット用プローブの調製

以下のプライマーセットを用いて C 57BL/6マウスの尾から抽出したゲノム DNA をに PCR反応を行った。各プライマーは I n V i t r o g e n社のカスタムプラィマー合成を利用して作成した。

尚、 P CR産物の塩基配列は DNA s e qu e n c i n gによって廳忍されている。 <TCRVa 14サザンプローブ調製用 PCRプライマー >

プライマー配列 1 ： 5，一 CGCTTGTGCACATTTGTTCT— 3，（配列番号 1)

プライマー配列 2 ： 5' -TAAGTTTCTGGGGAGCATGG-3' (配列番号 2)

<TCRVi3サザンプローブ調製用 PCRプライマー >

プライマー配列 3 ： 5' -GGGGCTGTGAACCAAGACAC-3' (配列番号 3)

3' (配列番号 4)

図 2に TCRVa l 4サザンプローブの、図 3に T C RV ]3サザンプローブのゲノム上での位置を示した。図 2は V a 14遺伝子近傍の様々な V αフラグメントを模式的に表している。ェクソン部は四角で描力、れている。図 3は、各 V β、 D、 J、 Cセグメントを模式的に表している。

E c oR I (TCRVa l 4の^) もしくは B amHI (TCRV0の場合）でゲノム DNA 5— 30 μ gを消化後電気泳動によって DNA断片を分離し、ナイ口ン膜 Hy b o n d N+ (商品名、 Ame r s h am社）上に移した。 UVクロスリンク後、 P e r f e c. tHy b (登 «i、 TOYOBO社）液でプレハイプリダイゼーシヨンを行い（6 8°C, 60分）、 R e d i p r i me I I (Am e r s h a m社）によって R Iラベノレされた TCRVCK 14サザンプローブ、あるいは TCRV 3サザンプローブを加え、 6 8 °C、 16時間ハイブリダイゼーションを行つた。その後、 2 xSSC, 0. 1%SDS (68°C) 溶液で 5分二回、さらに 0. l x SSC, 0. 1%SDS (68°C) 窗夜で 1 5分二回洗浄した。洗浄後のナイロン膜は I m a g e p l a t e (Fu j i F i l m 社）にて露光させ、同社の Ima g e l a t e Re a d e r BAS 2500にて角斤を行った。

生まれてきた全てのマウスで V a 14鎖の遺伝子稱冓成 (rearrangement)が見られた。結果を図 4に示す。

遺伝子帮冓成の起きてレヽなヽ germline configurationを有するゲノム D N Aでは V - J aという再構成された産物がしないため Va 14プローブを用いてサザンブロットを行うと、 1 29/S V— t e rマウス由来の対立遺伝子を持つ 5 k bのバンドを生じ（図 4、レーン 2) 、 C 57BL/ 6マウス由来の対立遺伝子を持つ場合約 13 k bのバンドを生じる（図 4、レーン 1) 。これは E c oR Iで消化したときに生ずる断片が 1 29_ S v_ t e r由来の ¾ ^と C57BLZ6由来の ¾ ^とで異なる為である。ドナー細胞が由来する C 57BL/6 X 129/S v- t e rマウスでは両方の対立遺伝子を有し、約 2. 5 k bのバンドと約 13 k bのバンドの両方を生じる（図 4、レーン 3) 。クローンマウス # 1、 # 3及び #4では、遺伝子爾冓成を終了した Vひ 14遺伝子座を持つゲノム DNAでは組換えにより 8 k bのバンドが検出されるようになるが約 1 3 k bと 2. 5 k bのバンドはそのままであった（図 4、レーン 4及ぴレーン 5、レーン 8、レーン 9) 。後述する TCRVひ鎖の塩基配列決定の結果ともあわせて考えると、この 8 k bのバンドはクローンマウスにおいて C 57B LZ 6由来の対立遺伝子に由来するものであることがわかる。尚、遺伝子再構成後も約 13 k bのバンドが残るのは C 57BL/ 6種の対立遺伝子中にぉ、て V α 14の遺伝子が二つしており、一方が偽遺伝子のためと考えられる。

また、クローンマウス # 2では、遺伝子蘭成を終了した V « 14遺伝子座を持つゲノム DNAでは組換えにより 8 k bのバンドが検出されるようになり、約 13 k bのバンドはそのままであつたが 2. 5 k bのバンドが消失していた。このことから 129ZS V— t e r由来の対立遺伝子にも遺伝子精冓成が起こったことが予想される（図 4、レーン 6 及びレーン 7) 。 DNA塩基配列の結果（図 6) からクローンマウス # 2においては 1 2 9/Sv— t e r由来の Vo! 14— J α 281力 S使用されていることが明らかになった。同様に T C R V 3のサザンプロットを行つたところ片側もしくは両方の対立遺伝子が r earrangementしていた。遺伝子！成の起きていない germline configurationのグノム D N Aでは 10. 4 k bのバンドしか生じなレ、のに対して遺伝子再構成を終了した遺伝子座を持つものは組換えによりさまざまな大きさのバンドを生じる。結果を図 4に示す。

また、クローンマウスの作成過程で、産仔に至らず空の胎盤のみを得るがある。得られた空の胎盤のゲノム DNAを抽出し同様に TCRVひ 14と TCRVjSのサザンブロット解析を行った。その結果、空の胎盤由来のゲノム DNAのサザンプロットパターンは、クローンマウスの尾由来のゲノム DNAのサザンブロットパターンと V 14鎖、 Vj3鎖とも一致していた。（但し、胎盤由来のゲノム DNAには仮舰由来のバンド力 S観察される場合もある。 TCRV0の場合は 10. 4k b) 。

さらにこれらのゲノム DNAを^ Mにして PCRを行い鎖と J a鎖の DNA配列を検討した。クローンマウス（クローンマウス # 1、 # 2及び #4) の尾あるいはその胎盤よりゲノム DN Aを抽出し、 Va l 4— J a 281の配列を P CRによって増幅させた。もし、これらのゲノム D N Aの対立遺伝子が両方とも遺伝子雨冓成以前の configuration (germline configuration)ならば P CR産物は生じなレ、。なぜなら Va 14と J a 281 の遺伝子断片は数メガベース以上離れて存在する為、 P C Rで増幅することができな、からである。しかし遺伝子稱苒成された場合には 330 b p程度の PC R産物を生じるはずである（図 5参照）。さらに Vひ 14遺伝子中に配列ポリモルフィズムがするので得られた産物の DN A配列を決定すればその Vひが 1 29/S V- t e r由来なのか C 57 B L/6由来なのか区別が付く（ド^ "一 NKT細胞は C 57BL/6と 129/S v— t e rとの F 1である）（図 6参照）。

Va 14— Jひ 281検出用 PCRプライマーは以下の通りである。図 5に各プライマ一のゲノム上での位置を模式的に示した。

プライマー配列 5 ： 5' -CCCAAGTGGAGCAGAGTCCT-3' (配列番号 5)

プライマー配列 6 ： 5' — AGGTATGACAATCAGCTGAGTCC— 3' (配列番号 6)

クローンマウスの胎盤ならぴに尾よりのゲノム DN Aを^ ¾にして上記プライマー（プライマー 5ならびに 6) の糸且み合わせにより PCRを行った（麵 DNA50 n gについて、各プライマー濃度 0. 2μΜで AB I社の Amp 1 i Ta q Go 1 dを使用し、 9 4°Cで 10分処理し、 94°C1分、 60°C1分、 72 °C 1分のサイクルを 36回行った）ところ約 330 b p程度の PC R産物が得られた（図 5、 PCR図、それぞれレーン 2及びレーン 9) 。一方、コントロールである C 57BL/6、 129/S v jヽもしくは血液幹細胞由来クローンマウスのゲノム DNAでは予想どおり産物が得られなかった（図 5) 。この PC R産物の DNA塩基配列を決定したところ図 6に示すように遺伝子冓成済みインフレームの TCRVa 14— Jひ 281を有していることがわかった。クローンマウス # 1及び #4は C57BLZ6型であり、クローンマウス #2は 129/S v- t e r型であった。

NKT細胞において T CR V ;3鎖は T CR V α鎖と異なり一義的に決定されていない。そこでどの V ]3鎖が使用されているのかを調べるためさまざまな V ]3鎖を検出しうるプライマ一を使用してクローンマウス # 1の尾と胎盤ゲノム D Ν Αを醒にして P C Rを行ヽ DNA塩基配列を決定した（各プライマーのゲノム上の位置は図 3参照）。使用した PC Rプライマーの組み合わせは下記に示すプライマーの群 Aから任意の一本とプライマーの群 Bの任意の一本である。このも TCRVa鎖と同様、遺伝子再構成の終了している TCRV ]3遺伝子座を有する対立遺伝子からは PCRの産物力 S得られるのに対し ge lin e configurationをもつ通常の対立遺伝子からは産物が得られない。

<丁〇1 ¥]3検出用？〇1プラィマー>

プライマー群 A (TCRV 側）：

プライマー配列 7 (ν 2用）： 5， -CACGGGTCACTGATACGGAGC- 3' (配列番号 7)

プライマー酉己列 8 (Vj33用）： 5，一 TGAGTGTCCTTCAAACTCACC— 3' (配列番号 8)

プライマー配列 9 (V]34用）： 5， -AAACCATTTAGACCTTCAGAT- 3' (配列番号 9)

プライマー酉己列 10 5用）： 5， -AGTTTGATGACTATCACTCTG

-3' (配列番号 10)

プライマー配歹 IJl l (V]36用）： 5，一 GGGCAAAAACTGACCTTGAA— 3' (配列番号 1 1) プライマー配列 1 2 (Vj37用）： 5， -TCTCACGGAAGAAGCGGGAGC —3, (配列番号 12)

プライマー配歹 IJ1 3 (V|38用）： 5' —GATACAAGGCCTCCAGACCA— 3，（配列番号 13)

プライマー配列 14 (V|31 1用）： 5' -GCCCAATCAGTCGCACTCAA C-3⁵ (配列番号 14)

プライマー配列 15 (V/312用）： 5' -CATCCTTCTCCACTCTGAAG A-3⁵ (配列番号 1 5)

プライマー群 B；

プライマー配列 16 ： 5' —GAAGGGACGACTC丁 GTCTTACCTT— 3' (配列番号 16)

プライマー配列 1 7： 5' -TGAGAGCTGTCTCCTACTATCGATT- 3' (配列番号 1 7)

塩基配列決定した結果を図 7に示す。クローンマウス # 1は遺伝子再構成済みィンフレームの V 38 S 2—D1— J 2 S 5の枠組みを有し、クローンマウス #2は、 VjS 8 S 3-D 1- J β 1 S 4であった。さらに V/3表現型についてクローンマウス # 1及び # 2 の末梢血を F A C Sで角？ |lしたところ、ドナー細胞のそれとは異なりその殆ど全てが T C RV/38Hf生であった（図 12) 。このことは、両クローンマウスにおいて対立遺伝子排除が起こっていることを示している。これらのクローンマウスは外見上何の異常も認められず誕生より 12ヶ月以上経た現在でも少々の肥満傾向以外は全く正常である（2005 年 6月現在）。

以上の結果より、本発明で得られたクローンマウスの由来は、遺伝子帮誠の済んだ末梢の N K T細胞であることが蘭された。

実施例 2 ： N K T細胞からの E S細胞株の樹立

N K T細胞由来の核を用！/、て実施例 1で記載した直接跡植方法により E S細胞樹立を試みた。 97ケの NK T細胞をピぺットで傷をつけ前述の方法で雌した卵子に移植した。移植後 60時間（Da y 2. 5、 8細胞状態、 emb r y o) で ES用培地（FCS、 L 一 g l u、 NEAA、 P/S, L I F及ぴ 21^£を含有する01\^]^) を用いて細胞を洗浄し、予め «された胎児 '1¾線維芽細胞上に播き直した（1 emb r y。Z培養皿）。その後 37 °C、 7 % C O ₂条件下で内部細胞塊 (Inner Cell Mass； ICM)が十分に成長するまで培養を行つたところ（7〜10日 a¾) 16ケの I CMをもつ細胞力 S得られた。さらに I CMをシリンジ、針を用いて小片に分断し E Sコロニーが廳忍されるまで培養をした。これら一連の工程により 1 1ケの ES細胞株が得られた。これらのうち 5ケは分化してしまったが 6ケの ES細胞株を樹立できた。さらにこれら 6ケの ES細胞株のキメラマウス形成能を検討したところ 4ケの ES細胞にっレ、てキメラマウスを作成させる能力が確認でさた。一連の経過をまとめたものを表 2に示す。表 2

ES細胞

_核移植に使用した NKT細胞数： 97

I CMを生成したブラストシストの数： 16

_ICMから確立できた ES細胞株数（分化したものも含む）： 11

未分化のまま確立できた ES細胞数： 6

キメラマウスの形成能を確認した ES細胞株数： 4

ES細胞樹立率

(6/97). 6% さらに得られた E S細胞にっヽて、実施例 1と同様にして T C R V α遺伝子座を P C R により角晰した（図 5、レーン 3〜8) 。結果、いずれも 330 b ρの PC R産物が得られ、遺伝子菌成が行われていることが証明された。さらに実施例 1と同様にしてサザンプロット角晰を行った。結果、ドナー細胞である NKT細胞と同じ遺伝子雨冓成された T CRVcx 14鎖を有し、又 TCRV )3鎖についても遺伝子再構成されていることを鶴忍した（図 8、レーン 1〜6) 。

実施例 3 ：クローンマウスの子孫（クローンマウスの生殖能力）

NKT細胞由来のクローンマウスの生殖能力を調べるため、クローンマウス # 1を I C R、 C 57 B LZ6株の雌マウスと交配させた。その結果三ヶ月で 47匹の子供が生まれた。この事実よりこのクローンマウスの «能力は正常であると判断される。これらの子供（子孫 F 1) においてゲノム DNAがどのようになるのかサザンプロットを行った。クローンマウス由来の遺伝子再構成済みの TCRVa 14由来の 8 k bのバンドを受け継いだ F 1が雄 1番、雌 6番に見られ、クローンマウスの遺伝子爾冓成の終了した対立遺伝子 T C R Vひ 14鎖が生殖細胞に受け継がれていることが確認された（図 9、上段、矢印）。また親であるクローンマウス # 1由来の T C R V を含む対立遺伝子はそれぞれ約 9 k bと 8 k bに分離している（図 4参照）力各 F 1は母親マウス由来の 10. 4 k b のバンド（図 9、下段、白矢頭）と約 9 k bもしくは 8 k bのバンドを受け継いでいる

(図 9、下段、黒矢頭）。例えば雄の 1番、ならびに雌の 3、 6及び 7番は約 9 k bのバンドを、雄 2〜 6、雌 1、 2、 4、 5及び 8番は約 8 k bのバンドを受け継いでいることがわかる。すなわち、 TCRV )3鎖については父親のクローンマウスのもつ遺伝子稱冓成済みのゲノムを含む対立遺伝子がそれぞれ一本ずつ引き継がれて、くこと力判明した（図 9) 。これらの事実よりこれらの遺伝子辩冓成済みゲノム DNAは子孫に伝播されていくことが証明された。

遺伝子蘭成された対立遺伝子を持つ NKTクローンマウスの子孫の T細胞、 NKT細胞の細胞表面 ίίΐ を F A C Sによつて角晰した。 NKTクローンマウス F 1の脾臓並びに肝臓で晰した。脾臓は 2枚のスライドガラス上で押しつぶして単細胞にして赤血球を除去し染色に用いた。また月刊蔵は 75 μ mの網目の直径をもつ金属性のメッシュですりつぶし、 P e r c o 1 1の密度勾配によって職細胞まで調製し、その後赤血球を除去し単細胞として染色に用レ、た。これらの細胞は全 T CRV^を認識する抗体である抗 T C.R V β 抗体（実施例 1で用いたものと同じ）並びに TCRV 8のみを認識する抗体 (Ph a r Mi n g e n社、商品番号 553861) で染色して FAC S角浙することによりクローンマウス子孫における TCRV/38の割合を調べた。結果を図 10の上段に示す。又、同様に應厳び月舊を単一細胞まで^^した後、 CD I dテトラマー（実施例 1で用いたものと同じ）及 O¾tTCRV 抗体（実施例 1で用いたものと同じ）で染色して FACS解析することによりクローンマウス子孫における NK T細胞の割合を調べた。結果を図 10 の下段に示す。 TCRV/38を発現する割合は脾臓にお！/、ては野生型が T細胞の 20 %強であるのに対して T C R V 8をインフレームで受け,継、だマウス（図 10、 2のパネル）ではほぼ 100%であった。肝臓においても同様の傾向が見られた。野生型の脾臓細胞においては a— GC l o a d e d CD 1 d— t e t r ame r +/TCR ]3+で定義される NKT細胞の割合は全脾臓細胞のおよそ 0. 5%であったが、遺伝子爾冓成済み Va 14- J α 281を受け継いだもの（図 10、 3のパネノレ）では約 13 %まで上昇しこのマウスにお、て全脾臓細胞数は野生型の半分程になっていたが Ν Κ Τ細胞の絶対数では 1 3倍程度になっていた（図 10)。

以上の結果より、遺伝子冓成済みのィンフレームの TCRV]3鎖を遺伝的に受け継ヽだクローンマウスの子孫は、その T細胞上に発現する TCRV ]3鎖はほぼ全てインフレ一ムで規定された一義的な V ;3鎖レバートリーで構成されている。すなわちトランスジェニックマウスで観察されるようないわゆる対立遺伝子排除が観察される。さらに TCRVa 14- J a 281を受け継いだ子孫は NKT細胞の絶対数、割合とも野生型に比較して 1 0〜 20倍に上昇している。尚、これらの結果は I CRとの F 1の結果であるが C 57 B L/6と交酉己した F 1でも同様の ί頃向が観察された。

実施例 4：クローンマウスの子孫 (ΝΚΤ細胞の働き）

本実施例では、クローンマウスの子孫の ΝΚΤ細胞の働きについて確認した。 ΝΚΤ細胞の人工ァゴニストであるひ一ガラクトシルセラミド（_α— GC) で刺激した：！^のサイトカイン産生をィンビト口及びィンビボで調べた。

クローンマウス # 1とメス C 57BL/6とを掛け合わせて F 1を作成した。その後この F 1の雄のうち遺伝子再構成済みである V α 14- J α 281を含むものを I VF (in vitro fertilization)によって S P F化し再びメス C57BLZ6と掛け合わせて子孫を得た (Va 14- J α 281マウス）。三ヶ月齢の Va 14 - J α 281マウスと、齢を適合させた同腹仔（対照マウス）を用いて実験を行った。

ィンビボ朿 IJ激によるサイトカイン産生

(方法）

2μ gZマウスの用量で α—GCをマウスに鹏空内投与してインビポ刺激を行った。ィンビポ刺激したマウスの血、清を所定の時間で採取し、血清中の各種サイトカイン濃度を B i o— P 1 e Su s p e n s i o n Ar r a y Sy s t em (B i oRa d, H e r c u 1 e s, CA) で測定した。

(結果）

結果を図 1 3に示す。 Vo! 14- J α 281マウス（遺伝子精冓成済み Vo; 14~ J a 281を g e rml i n eでへテロに受け継ぐマウス）についてサイト力イン（I L (ィンターロイキン) —2， 4， 10、 GM-CSF (顆粒球 'マクロファージコロニー刺激因子）、 I L—1 ]3、 TNFa (膾瘍壌死因子 a) 、 I FN (インターフェロン）一 γ) 産生能力の増強力 ¾Sf忍された。実施例 3で鶴忍された NKT細胞の絶対数及ぴその割合の上昇に加え、その機能も維持されていること力 ¾||忍された。

インビトロ刺激による I ー4及ぴ1 FN— V産生

(方法）

CD 1 1 cマイクロビーズ（Mi 1 t e ny i社）を用いてマウス（Va l 4— J o; 2 81マウス、あるいは同腹仔の対照マウス）の脾臓から樹状細胞 (DC) を得た。各マウス由来の樹状細胞を a— GC (20 On g/mL) で 6時間刺激し、それぞれのマウス由来の脾臓細胞 (SPC) と混合した。これらの細胞を 72時間共培養し I FN— γ及ぴ I L— 4の産生を EL I SAキット（Ge n z yme TECHNE, Me n e a ρ o 1 i s， MN) を用いて測定した。

(結果）

結果を図 14に示す。対照マウスに比べて V 14— J 281マウス由来の脾臓細胞において I L— 4及び I F N— γ産生能が増大されていること力 ¾|!忍された。

配列表フリーテキスト

配列番号 1 ： TCRV 14サザンプローブ調製用 PC Rプライ（プライ配列 1)

配列番号 2： T C R V 14サザンプローブ調製用 P C Rプライ（ブラィ配列 . 2)

配列番号 3 ： T C R V サザンプローブ調製用 P C Rプライ（プライ配列 3 ) 配列番号 4： 1^1 ¥/3サザンプローブ調製用？じ1プラィマー（プライマー酉己列 4) 配列番号 5 ： TCRVa 14— J α 281検出用 PCRプライ（プライ配列 5) 配列番号 6： TCRVo; 14— J _α 281検出用 PCRプライ（プライ配列 6) 配列番号 7： TCRV^ 2検出用 PCRプライ（プライ配列 7)

配列番号 8 ： TCRV/33検出用 PCRプライ（プライ配列 8)

配列番号 9： TCRVJ34検出用 PCRプライ（プライ配列 9)

配列番号 10 ： TCRV/35検出用 PCRプライ（プライ配列 10)

配列番号 1 1 ： TCRVj36検出用 PCRプライ（プライ配列 1 1)

配列番号 12 ： TCRVj37検出用 PCRプライ（プライ配列 12) 配列番号 13 ： TCRV^S 8検出用 PCRプライマー（プライマー配列 13)

配列番号 14 ： TCRVj311検出用 PCRプライマー（プライマー配列 14) 配列番号 15 ： TCRVJ312検出用 PCRプライマー（プライマー配列 15) 配列番号 16 ： TCRV3検出用 PCRプライマー（プライマー配列 16)

配列番号 17 ： TCRVi3検出用 PCRプライマー（プライマー配列 17)

産業上の利用可能性

本発明によって得られるクローン哺乳動物、クローン哺乳動物胚ならびにそれらから得られる細胞、糸纖、器官及び生産物は、ドナーと全く同じ組謹合性 (例えば HL A) を有し、又観性も同等であり、移植時、投与時の免疫拒応が起こらない。また、 NKT細胞を用いた場合にはクローン作成に ES細胞の樹立と t e t r a p l o i d c om 1 erne n t a t i o nを必要としない。この為大幅な時間と労力の節約ができる。さらに NKT細胞の核を使用して E S細胞を樹立した; ^その効率は約 6 %であり、従来の末梢マウス T細胞、 B細胞をドナーとして用いた：^に比較して非常に高い。又、自家移植によりヒト ES細胞を樹立できる効率 (Hwang, W. S. ら，「Evidence of a pluripotent human embryonic stem ce丄丄 line derived from a cloned blastocyst. J, Science,

2004年， 303, p.1669-1674)と比較しても非常に高い。さらに移植した核から個体になる率はおよそ 1.5 %であり、これまで個体が比較的容易に得られるとされた E S細胞からのクローン作成の成 ¾ /率 (Wakayatna, T. り, 「Mice cloned from embryonic stem cells.」, P roceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, (米国)， 1999年， 96， p.14984- 14989)に匹敵する。

本発明の方法を用レヽれば、クローン哺乳動物がより高率でできることから有用動物（例えば生物医薬品等をミルク中に産生するトランスジェユック羊、牛等）を容易にクローン化することが可能となり、これらの医薬品の大量生産、コストダウンが可能となり、総医療費の肖減に貢献できる。

さらに、本発明のクローン哺乳動物の子孫は、 T細胞上で発現する TCRViS鎖が実質的に単一の T C R V /3鎖レパートリ一で構成されていることを特徴とし、より詳細にはドナー細胞として用いた NKT細胞の TCRV ]3鎖レノヽ。一トリーと同一である。さらに、遺伝子 f冓成済みの TCR α鎖である 1 -] a 281を含む対立遺伝子を有する子孫では NKT細胞の数が相対的且つ絶対的に野生型と比較して增カ卩している。これらの事実力ら、本発明のクローン哺乳動物の子孫は、自己免疫疾患等の病態モデル動物として、又、免疫制御における NK T細胞の役割や T C R V /3鎖のレパートリ一の多様性がもたらす意義を角晰する手法を与えるものである。本出願は、日本で出願された特願 2004-238836及び特願 2005— 1779 98を基礎としておりそれらの内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

請求の範囲

1 . ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラー τ細胞を用いることを特徴とする、ク口一ン非ヒト哺乳動物の作成方法。

2. 哺動物のナチュラルキラー Τ細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

3. 哺乳動物のナチュラルキラー Τ細胞に由来する核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入して再構築胚を形成し、該蒲築胚を宿主哺乳動物に移入することを含む、クローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

4. ナチュラルキラー Τ細胞力 S、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、請求項 1〜 3のヽずれか 1項に記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

5 . ナチュラルキラー T細胞と除核卵母細胞が同種の晡?し動物由来である、請求項 1〜4 のいずれか 1項に記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

6 . ナチュラルキラー T細胞と除核卵母細胞力 S異種の哺乳動物由来である、請求項 1〜4 の、ずれか 1項に記載のクローン非ヒト哺乳動物の作成方法。

7. ナチュラルキラー T細胞が、臍帯血、末梢血、肝臓、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる糸纖ょり採取されるものである、請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載のク口一ン非ヒト哺乳動物の作成方法。

8. 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の方法によって作成されたクローン非ヒト哺乳動物。

9. 請求項 1〜 7の、ずれか 1項に記載の方法によって得られるクローン非ヒト哺乳動物の胎仔。

1 0 . 請求項 8記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。

1 1 . T細胞上で発現する T C R V ]3鎖が実質的に単一の T C RV ^鎖レパートリ一で構成されていることを特徴とする、請求項 1 0記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。

1 2 . 単一の T C RV 3鎖レパートリーが、ドナー細胞として用いたナチュラルキラー T 細胞の T C R V i3鎖レパートリーと同一である、請求項 1 1記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫。

13. 遺伝子爾冓成済みの T C R α鎖である V « 14-J a 281を含む対立遺伝子を有しナチュラルキラー T細胞の数力 S増カ卩していることを特徴とする、請求項 10記載のク口一ン非ヒト哺乳動物の子孫。

14. 請求項 8記載のクローン非ヒト哺乳動物から得られる細胞、糸纖、器官又は生産物。

15. 請求項 9記載のクローン非ヒト哺乳動物の胎仔から得られる細胞、糸纖、器官又は生産物。

16. 請求項 10記載のクローン非ヒト哺乳動物の子孫から得られる細胞、糸纖、器官又は生産物。

17. ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、請求項 14又は 15記載の細 3包、 m器官又は生産物。

18. 治療用、植用及び/又は細胞移植用である、請求項 14〜17のいずれか 1 項に記載の細胞、 «、器官又は生産物。

19. ドナー細胞として哺乳動物のナチュラルキラー Τ細胞を用いることを特徴とする、クローン哺乳動物胚の作成方法。

20. 哺乳動物のナチュラルキラー Τ細胞の核を哺乳動物の除核卵母細胞に導入することを含む、クローン哺乳動物胚の作成方法。

21. ナチュラルキラー Τ細胞が、所望の形質を発現させるよう遺伝子操作が行われたものである、請求項 19又は 20記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

22. ナチュラルキラー Τ細胞と除核卵母細胞が同種の哺乳動物由来である、請求項 19 〜 21のレヽずれか 1項に記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

23. ナチュラルキラー Τ細胞と除核卵母細胞が異種の哺乳動物由来である、請求項 19 〜 21のレ、ずれか 1項に記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

24. ナチュラルキラー Τ細胞が、臍帯血、末梢血、月谦、骨髄、脾臓、胸腺からなる群より選ばれる糸職より採取されるものである、請求項 19〜 23のレ、ずれか 1項に記載のクローン哺乳動物胚の作成方法。

25. 請求項 19〜 24の Vヽずれか 1項に記載の方法によつて作成されたクローン哺乳動物 Εο

2 6 . 請求項 2 5記載のクローン哺乳動物胚を胚翻包期又は前胚盤包期まで培養し、得られる胚翻包期又は前胚翻包期の内部細胞塊から胚性幹細胞を分ることを含む、クローン喃乱動物胚性幹細胞の作成方法。

2 7. 請求項 2 6記載の方法によつて得られるク口ーン哺乳動物胚性幹細胞。

2 8 . 請求項 2 7記載のクローン哺乳動物胚 I·生幹細胞を所望の細胞分ィ匕を誘導し得る条件下で培養し分化誘導することを含む、クローン哺乳動物の分化細胞、紙織、器官又は生産物の作成方法。

2 9 . 請求項 2 8記載の方法によって得られるクローン哺乳動物の分化細胞、器官又は生産物。

3 0. ドナー細胞と免疫学的に同一であることを特徴とする、請求項 2 9記載の分化細胞、繊、器官又は生産物。

3 1 . 治療用、移植用及び Z又は細胞移植用である、請求項 2 9又は 3 0記載の分化細胞、繊、器官又は生産物。