WO2006011253A1 - フラップエンドヌクレアーゼ変異体 - Google Patents

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WO2006011253A1
WO2006011253A1 PCT/JP2005/000792 JP2005000792W WO2006011253A1 WO 2006011253 A1 WO2006011253 A1 WO 2006011253A1 JP 2005000792 W JP2005000792 W JP 2005000792W WO 2006011253 A1 WO2006011253 A1 WO 2006011253A1
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flap
probe
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mutant
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Inventor
Eriko Matsui
Ikuo Matsui
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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Publication of WO2006011253A9 publication Critical patent/WO2006011253A9/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to a novel flap endonuclease mutant in which the substrate specificity of wild-type flap endonuclease has been changed, and a gene polymorphism analysis reagent using the mutant.
  • Flap endonuclease is an enzyme essential for DNA replication and repair, specifically recognizes the structure of DNA and cleaves the flap strand. This enzyme also has 5 'exonuclease activity. The crystal structure of this enzyme has been elucidated and the substrate recognition mechanism has been investigated in detail using mutants.
  • a thermostable enzyme derived from Pyrococcus is also known as a thermostable flap endonuclease.
  • Gene polymorphism means that different individuals have different base sequences at the same position on the gene, and is distinguished from mutations by their frequency.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • the invader method is known as the SNP analysis using the above Flap endonuclease.
  • a flap base endonuclease forms a three-base overlapping structure formed by annealing an invader probe and a signal probe in a target nucleic acid (region having a single nucleotide polymorphism on the genome).
  • Non-Patent Document 1 Kaiser, M., Lyamicheva, Tsuji, Ma, W., Miller, C "Neri, B., Fors, and Lyamichev, V” (1999) J. Biol. Chem. , 274, 21387-21394
  • Patent Document 2 Lyamichev, V., Brow, M.A.D., Varvel, V.E., and Dahlberg, J.E., (1999) Pro Natl. Acad. Sci., 96, 6143-6148
  • An object of the present invention is to provide an analysis means that converts the substrate specificity of flap endonuclease and is more accurate in gene polymorphism analysis and has higher detection efficiency than conventional methods. It is. Means for solving the problem
  • the present inventor introduced a mutation into the substrate binding site of Veg flap endonuclease that solves the above-mentioned problems, and produced a mutant having altered substrate specificity.
  • a wild-type flap endonuclease is a substrate in which one DNA strand of double-stranded DNA is cleaved with a 3 ′ terminal overhang structure, a substrate without the 3 ′ end overhang structure, or a nick. While acting on a substrate with (nick), etc. and having a wide substrate specificity, the above mutant has one DNA strand of a double-stranded DNA cleaved with a 3 ′ terminal protruding structure, and The complementary strands of the cleaved DNA strand are linked to act on a substrate that forms a strong base pair with the missing portion of the other DNA strand.
  • the mutant of the present invention acts on a substrate having a 3 ′ terminal protruding structure, and a substrate having no 3 ′ terminal protruding structure has a property that it cannot be cleaved. Even so, it acts only on DNA strands with a specific structure.
  • a flap endonuclease mutant in which an amino acid in an amino acid sequence of a wild-type flap endonuclease is substituted with another amino acid, Among the substrates, one DNA strand of double-stranded DNA is cleaved with a 3 ′ terminal overhang structure, and each cleaved DNA strand has a base sequence portion complementary to the other DNA strand. Complementary base sequence parts are linked to each other to act on a DNA substrate that forms a base pair with no missing part with respect to the other DNA strand and does not act on other substrates.
  • a flap endonuclease variant characterized by being reduced.
  • a gene polymorphism analysis reagent comprising the flap endonuclease mutant according to (1) or (2) above.
  • the flap endonuclease mutant of the present invention acts only on a substrate with a protruding 3 ′ end, particularly a nick and double flap substrate having a 3 ′ protruding end shown in FIG. 1, and other wild type flap ends.
  • Nuclease substrates have a novel property that they can hardly be cleaved.
  • the flap endonuclease modification of the present invention having such substrate specificity.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a substrate for flap endonuclease.
  • FIG. 2 is a graph showing the activity of each flap endonuclease mutant against double flap, nick and 5 ′ recess end substrates.
  • FIG. 3 is a graph showing the activity of each flap endonuclease mutant against Singnore flap and pseudo-Y substrate.
  • FIG. 4 is a graph showing the activity of the flap endonuclease mutant of the present invention against each of the above six types of substrates.
  • FIG. 5 A schematic diagram showing a technique when the flap endonuclease mutant of the present invention is used for gene polymorphism analysis.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing another method when the flap endonuclease mutant of the present invention is used for gene polymorphism analysis.
  • FIG. 7 A schematic diagram showing another technique when the flap endonuclease mutant of the present invention is used for gene polymorphism analysis.
  • FIG. 8 An electropherogram showing the results of testing the substrate specificity required for using the flap endonuclease mutant of the present invention for gene polymorphism analysis.
  • FIG. 9 A diagram schematically showing the structure of the substrate used in the experiment of Example 5.
  • FIG. 10 is an electrophoresis photograph showing the activity of each of the flap endonuclease mutants (Y33AF79A, Y33AF35A) of the present invention against each substrate.
  • FIG. 11 A diagram schematically showing the structure of the substrate prepared in Example 7.
  • FIG. 14 A diagram schematically showing the structure of the substrate prepared in Example 9.
  • FIG. 15 is a graph showing the results of measuring the activity of the enzyme variant of the present invention with respect to the substrate prepared in Example 9 by fluorescence intensity.
  • FIG. 16 is a diagram schematically showing the structure of a substrate prepared in Example 10.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of measuring the activity of the enzyme mutant of the present invention with respect to the substrate prepared in Example 10 by fluorescence intensity.
  • FIG. 18 is a diagram schematically showing the structure of a substrate prepared in Example 11.
  • FIG. 19 is an electrophoretogram showing the activity of the enzyme mutant of the present invention against the substrate prepared in Example 11.
  • FIG. 20 is a schematic diagram showing a technique for determining the presence / absence of SNP in the DNA to be analyzed and its homozygote and heterozygote using the enzyme mutant of the present invention.
  • FIG. 21 is a diagram schematically showing the structure of a substrate prepared in Example 12.
  • FIG. 22 Wild strain and enzyme mutant of the present invention against the substrate prepared in Example 12
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring the activity of (F79A, F79H) by fluorescence intensity.
  • FIG. 23 shows an enzyme variant of the present invention (Y33A, to the substrate prepared in Example 12).
  • 3 is a graph showing the results of measuring the activity of Y33L, F35A) by fluorescence intensity.
  • FIG. 24 shows the enzyme variant of the present invention (Y33AF79A) against the substrate prepared in Example 12.
  • F278AF279A, Y33AF35A is a graph showing the results of measurement by fluorescence intensity.
  • FIG. 25 is a diagram schematically showing the structure of a substrate prepared in Example 13.
  • FIG. 26 is a graph showing the results of mass spectrometric analysis of each of the cleavage flap portions obtained by allowing the enzyme variant of the present invention to act on the substrate prepared in Example 13.
  • FIG. 27 is a diagram showing that the molecular weight based on the mass spectrometry results and the predicted molecular weight are almost the same.
  • the flap endonuclease mutant of the present invention has a modified substrate specificity of wild-type flap endonuclease.
  • Wild type flap endonucleases are nick, 3 'projection, 5' Recess-end, sink, single flap, Dazonorefufupu (Double flap It is applied to the substrate material called “-YY” ((PPsseeuudd 00 __YY)), and it is applied to the merging flow part more quickly (gap gap) ) ggaapp aatt jjuunnccttiioonn ;; In the following, it will be called Dadaf Funorere Hula Lappup, which has a gigaapp. . )) Is also used for the DDNNAA-based substrate that has a structural structure called)).
  • the structure of these DDNNAA substrates is shown in Figure 11. .
  • (junction) substrate is a force having a 3 'terminal overhang structure in which one DNA strand of double-stranded DNA is cleaved.
  • Each cleaved DNA strand is complementary to the other DNA strand of double-stranded DNA.
  • Each has a base sequence portion, but even when the complementary base sequence portion is combined, there is a base missing from the other DNA strand, and a base pair continuous with the other DNA is not formed.
  • wild-type flap endonuclease acts on DNA substrates having different structures in each of these seven species with wide substrate specificity.
  • the flap endonuclease has an endonuclease action and an exonuclease action, and the wild-type flap endonuclease has a nick, 3'-protrusion among the above seven DNA substrates due to the exonuclease action.
  • Nick with 3 'projection and 5 Recess-end 5' terminal side of the downstream strand (Downstream) in the substrate is deleted.
  • Flap strands with single flap, double flap, pseudo-Y substrate, double flap with gap at junction due to endonuclease action Cut the 5 ′ end i3 ⁇ 4g side flap of (Flap Strand) and delete the 5 ′ end side of the cleavage site by exonuclease action.
  • the flap endonuclease mutant of the present invention is a substrate having a 3 'overhanging nick (Nick with 3'projection) and a double flap (Double flap). flap) only affects the substrate.
  • the downstream strand (Down Strand (Cl)) 5 and the terminal base extend to the upstream strand (Upstream Strand (B_2)) just before the base of the flap base.
  • the strands complementary to the template strands of the downstream strand (Down Strand (Cl)) and the upstream strand (Upstream Strand (B_2)) As a result, a base pair having no missing portion is formed with respect to the other DNA strand (Template Strand (A)).
  • the complementary sequence part of the flap strand (Flap strand (C-3)) and the upstream strand (Upstream Strand (B_2)) to the other DNA strand (Template Strand (A)) is connected. Then, the other DNA strand (Template Strand (A)) forms a base pair with no missing portion.
  • the endonuclease mutant of the present invention does not act on the above five other DNA substrates, or its activity is extremely low.
  • the mode of action of the flap endonuclease mutant of the present invention itself is not different from the wild type.
  • the flap endonuclease mutant of the present invention is obtained by mutating the amino acid at the substrate binding site of wild-type flap nuclease.
  • a gene encoding the amino acid sequence of wild-type flap endonuclease 1 shown in SEQ ID NO: 2 or a plasmid containing the same is used as a saddle, and a primer with a mutation is used.
  • a mutant gene is obtained by site-directed mutagenesis using PCR amplification, the mutant gene is linked to an appropriate expression vector, and the recombinant expression vector is introduced into a host microorganism to prepare a transformant. Then, the transformant can be cultured, and the desired flap nuclease mutant can be obtained from the culture.
  • a mutant gene of the gene of wild-type flap endonuclease-1 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) of Pyrococcus, Horikoshi (Registration No. JCM9974) is obtained by this method.
  • a thermostable flap endonuclease mutant that substantially acts only on a DNA substrate having a 3 ′ protruding end of a specific structure was found. The following are specific examples of this.
  • the amino acid sequence of the mutant enzyme is shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
  • the Y33A, Y33L, F35Y, F79A, F79H, Y33AF79, Y33AF35A, and F278A F279A genes are not particularly limited as long as they encode these mutant peptides. Sequence number in sequence list Examples include the sequences shown in 3, 5, 7, 9, 11, 13, 53 and 15. Table 1 below shows the amino acid sequences of the flap endonuclease 1-1 (wild-type) family in alignment.
  • FAM and TAMRA indicate fluorescent dyes, respectively.
  • One A- on the upper side of the two lines is a normal base without SNP, G-, one C one, and T one are polymorphic. Indicates base.
  • An oligonucleotide is synthesized as probe A so as to be a base (T) that forms a base pair with (A).
  • the ends have a base sequence complementary to the sample DNA containing the SNP site, its 3 'end extends to a position corresponding to the SNP site, and the 3' end is a base (A ) And the base (C, G) other than the base (T) that forms a base pair with the base to synthesize an oligonucleotide as probe B, and the 5 ′ end of probe A and 3 ′ of probe B When the ends are close to each other, they are labeled with a dye that produces a FRET effect and does not emit fluorescence or at least decreases the emission intensity.
  • TAMRA and FAM are TAMRA and FAM, BHQ-1 and TET, HEX, FAM, etc. as combinations of fluorescent dyes that produce the FRET effect.
  • FAN is used to label the 5 'end of probe A
  • TAMRA to label the 3' end of probe B.
  • probe B with 3 'terminal C if there is a polymorphism in the SNP site of the sample DNA, that is, the base of the SNP site of the sample DNA is either G, C or T.
  • G is complementary to the base (C) at the 3 'end of probe B. Since it forms a pair, it does not form a 3 'terminal overhang structure ((A) in Fig. 5 (1)).
  • the 5 'terminal base (T) of probe A and the 3' terminal base (C) of probe B are the same as the base (G) of the SNP site of the sample DNA.
  • the base at the 5 'end of probe A (T) and the base at the 3' end of probe B (C) have a protruding structure, and both probe A and probe B
  • the complementary base sequence part does not form a continuous base pair with the sample DNA, creating a gap ((B) in Fig. 5 (1))
  • the 5 ′ end of probe A is T, so it forms a base pair.
  • the 3 ′ end of probe B is (C) or (G), it does not form a base pair with the base (A) of the SNP site of the sample DNA, and becomes a protruding end. That is, the structure at this time is a nick structure having a 3 ′ protruding end as shown in FIG. 1.
  • the 5 ′ end of probe A and the base sequence portion complementary to the sample DNA excluding the flap portion of probe B are It forms a continuous base pair with DNA without any missing parts (Fig. 5 (1) (C)).
  • the flap endonuclease mutant does not act on the DNA substrate having the structure shown in ( ⁇ ), ( ⁇ ), or ( ⁇ ') in Figure 5 (1) above.
  • the fluorescent dye TAMRA of probe A and the fluorescent dye FAM of probe B are close to each other, and no fluorescence is generated due to the FRET effect.
  • the nick structure In contrast, in the absence of SNP, the nick structure has a 3 'protruding end, so the flap endonuclease mutant recognizes the structure as a substrate, and the 5 terminal end of probe A is cleaved, resulting in fluorescence.
  • the dye TAMRA deviates from the position close to the FAM, fluorescence is generated.
  • the presence or absence of SNP can be determined by detecting the presence or absence of fluorescence.
  • probe A the 3 'end and 5' end of probe A are labeled with a fluorescent dye (for example, a combination of TAMRA and FAM, etc.) that produces a FRET effect by proximity, and probe B is not fluorescently labeled.
  • a fluorescent dye for example, a combination of TAMRA and FAM, etc.
  • probe B is not fluorescently labeled.
  • the rest is the same as Analysis Method 1.
  • the molecular length of the probe A is designed so that the fluorescent dyes at both ends are close to each other and the fluorescence intensity is reduced by the FRET effect (for example, 20 mer or less).
  • probe B does not form a 3 'terminal protruding structure (Fig. 5 (2) (A)), or the sample in probe A and probe B. Since the complementary base sequence part to DNA does not form a continuous base pair with the sample DNA and creates a gap ((B), ( ⁇ ') in Fig. 5 (2)), SNP is present in the sample DNA. In some cases, none of the flap endonuclease mutants used will work, and the FRET effect results in low intensity fluorescence. On the other hand, when there is no SNP, the nick structure has a protruding end.
  • the flap endonuclease mutant recognizes this structure as a substrate, and the 5 end of probe A is cleaved (Fig. 5 (2) (C)), the fluorescence intensity increases when the fluorescent dye TAM RA deviates from the position close to the FAM, and the presence or absence of SNP can be determined by observing the fluorescence intensity.
  • the probe is 3 ′ protruding from the gene to be analyzed.
  • the flap strand can be cleaved without a decrease in enzyme activity. It becomes possible to do.
  • the enzyme activity does not decrease and analysis can be performed with high sensitivity.
  • the method indicated by (3) in FIG. 5 is a method for determining the base of SNP.
  • This method uses three types of probes A, with the 5 'end of probe A, for example, C, G, and A, respectively, and different fluorescent dyes for labeling the 5' end.
  • the fluorescent dye a fluorescent dye labeled at the 3 terminal of probe B and a dye that quenches by the FRET effect are used.
  • other methods are the same as Analysis Method 1 above.
  • a nick structure having a 3 ′ protruding end is formed only when the 5 ′ terminal base is complementary to the SNP base of the sample DNA.
  • endonuclease is allowed to act, the 5 'end is cleaved and generates fluorescence.
  • the type of fluorescence wavelength indicates which probe A is derived, and the type of SNP base can be identified from its 5 'terminal base.
  • the method shown in Fig. 6 is a simple detection method when the SNP base is already known. For example, if the base of SNP is (A) and the base without SNP is (G), the 5 'end of probe A is set to (T) of the complementary base of (A) At the same time, the 3 ′ end and 5 ′ end are labeled with, for example, TAMRA and FAM.
  • the length of this probe A is preferably 20 mer or less as in the above analysis method 1. Also,
  • the 3 'terminal base of the lobe should be a SNP-free base (C) complementary to the base (G).
  • the SNP base is already known, the SNP can be easily analyzed in a single test by configuring each probe as described above.
  • the method shown in Fig. 7 is a method that simultaneously analyzes a large number of SNPs present in the genome. For example, if SNPs exist at positions A, B, and C on the genome, probes A and B are created as shown in Fig. 7B. For probe A, insert C, which is complementary to SNP G, into the junction. The 3 'end of probe B should be a base (A) that is complementary to the base (T) without SNP. When these probes are annealed with the genomic DNA of the sample, if there is an SNP, a double flap structure is formed, and the flap endonuclease mutant of the present invention enters one base from the junction. It is cut at one place. On the other hand, when there is no SNP, a single flap structure is formed and it is not cut.
  • Probe A used in this analysis method is synthesized so that the length of the 5 'end flap changes for each SNP site to be detected, and piotin is bound to the 5' end. For example, as shown in Fig. 7, the length of the 5 'protruding end is increased by 2-3 bases in order for each SNP site, A, B, and C. This results in DNA fragments of different lengths by cleavage of the 5 ′ end flap by the endonuclease variant of the present invention. Since the 5 'end has a biotin, it can be purified on an avidin column, and the molecular weight of the purified DNA fragment is detected by a mass spectrometer (MS).
  • MS mass spectrometer
  • the SNP location can be identified by the detected molecular weight.
  • MALDI-TOF MS 384 samples can be analyzed, and more than 10 SNPs can be analyzed simultaneously in the food.
  • piotine is bound to the 5 'end of probe A for purification of the DNA fragment.
  • DNA purification means such as ZipTip
  • the DNA fragment can be purified without using piotin. Thereafter, the molecular weight of the fragment can be measured in the same manner as described above.
  • the bases constituting DNA have different molecular weights
  • the molecular weight of the flap strand can be changed, and the cut flap can be identified by measuring the molecular weight of the cleaved DNA fragment. That is, as shown in FIG. 7C, for example, even if the length of the 5 ′ flap chain is the same 14 mer, the molecular weight of one fragment should be 4865 due to the difference in its constituent bases, and the other should be 4940. And both are identifiable. Therefore, by designing the bases of the 5 'flap strand and measuring the molecular weight of the cleaved DNA fragment, the cleaved flap can be identified and the SNP position corresponding to this can be determined.
  • genomic genes and alleles may have the same SNP (homo) or different (hetero), and according to the present invention, the SNP base is already known, In addition to the presence or absence of SNP in the sample, it is also possible to easily identify whether the SNP is homozygous or heterozygous.
  • probe A (T) with 5'-end base as T and probe A (C) with C as the base are synthesized respectively.
  • the ends are labeled with different fluorescent dyes.
  • the fluorescent dye at the 5 ′ end is made different, for example, FAM in probe A (T) and TET in probe A (C).
  • probe A (T) when the DNA to be analyzed is annealed with probe A (T), probe A (C), and probe B, and the enzyme mutant of the present invention is allowed to act, when there is no SNP (in the case of A) In this case, only probe A (T) forms a 3 ′ protruding Nick structure, which is cleaved by the enzyme of the present invention to detect fluorescence derived from the fluorescent dye FAM.
  • both probe A (T) and probe A (C) A nick structure is formed and cleaved by the enzyme of the present invention, and two fluorescences having different wavelengths derived from TET and FAM are detected.
  • the gene for mutant Y33A was prepared as follows.
  • Y33A-R primer containing the mutation and the FEN-R primer containing the restriction enzyme site (Xhol) were used.
  • PCR with Y33A-U containing the mutation DNA polymerase was added after heating at 96 ° C for 5 minutes.
  • the nucleotide sequence of the structural gene of the flap endonuclease mutant Y33A is shown in SEQ ID NO: 3.
  • flap endonuclease mutants Y33L, F35Y, F79A, F79H, Y33AF79A, F278AF279A and Y33AF35A were also prepared in the same manner as described above.
  • the base sequences of these structural genes are shown in SEQ ID NO: 5, 7, 9, 11, 13, 15, 53 in the sequence listing, respectively. It is.
  • E. coli BL21 (DE3), Novagen) thawed and transferred 0.1 ml each to two Falcon tubes. Add 0.005 ml of each of the above expression plasmid solutions separately to ice. After standing for 30 minutes, heat shock at 42 degrees for 30 seconds, add 0.9 ml of SOCmedium, and incubate with shaking at 37 degrees for 1 hour.
  • Each transformant was cultured in 2YT medium (2 liters) containing ampicillin at 37 ° C until the absorption at 660 nm reached 0.4, and then IPTG (Isopropy-bD-thiogalactopyranoside) was added to become ImM.
  • IPTG Isopropy-bD-thiogalactopyranoside
  • the cells were cultured at 30 ° C for 4 hours. After culture, the cells were collected by centrifugation (6,000 rpm, 20 min).
  • the collected cells were frozen and thawed at ⁇ 20 ° C., and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) twice that of the cells was added to obtain a suspension.
  • Each obtained suspension Nirre, Te 30 minutes heating centrifuged at 85 degrees (ll, 000 rpm, 2 0min) and, HiTrapSP (Pharmacia Co., Ltd.) was adsorbed on the column, the activity carried out elution with NaCl gradient Fractions were obtained and used as purified enzyme solutions of Y33A, Y33L, F35Y, F79A, F79H, F278AF279A, Y33AF35A, and Y33AF79A.
  • Oligonucleotides having the following base sequences were synthesized. All oligonucleotides were synthesized by Hokkaido System Science.
  • Flap Strand (C-2); 32mer, 5, TAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3 '
  • the downstream strand (C-l), Flap strand (C-2) and Flap strand (C_3) oligonucleotides were fluorescently labeled (FAM) at the 5' end.
  • the substrate structure is a single flap structure with 5 protruding lmer (Fig. 9A), a double flap structure with 1 mer gap in the nick region (Fig. 9B), and nick There are three types of with 3 'projection structure (Fig. 9C).
  • the lOpmoles fluorescently labeled substrate prepared in Example 7 was added to 10 microliters of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0, 15 mM MgCl, lOOmg / ml bovine serum albumin), and each substrate was further treated. Enzyme wild type and 10 ng mutant were added to each and reacted at 60 degrees for 5 minutes. Next, stop the reaction by adding 200 microliters of 50 mM Tris-HCl buffer ⁇ 8 ⁇ 0 and placing on ice. The fluorescence intensity was measured with a spectrofluorometer, FP-750 (JASCO) using excitation light of 494 nm and fluorescence of 520 nm and a filter of 500 nm.
  • 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0, 15 mM MgCl, lOOmg / ml bovine serum albumin
  • the results are shown in FIG.
  • the values in each bar graph in FIG. 13 are values obtained by subtracting the value of the control port from the sample in which the enzyme was added, with the sump nore without the enzyme as the control port. According to this result, the wild-type enzyme exhibits activity against all the above-mentioned A-C substrates, and the force mutant enzyme exhibits activity only on the substrate C in which the 3 ′ end protrudes. In addition, the 3 'end protrudes but does not show activity against substrate B with an lmer gap.
  • each substrate labeled with lOpmoles was labeled.
  • 50 ng and 400 ng of each mutant were added, and reacted at 60 degrees for 5 minutes.
  • stop the reaction by adding 200 microliters of 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.0 and placing on ice.
  • Fluorescence intensity is measured with a spectrofluorometer, FP_750 (JASCO) using excitation light of 494 nm, fluorescence of 520 nm, and a filter of 500 nm.
  • FP_750 JASCO
  • both wild-type and mutant enzymes are less active than those without a fluorescent label at the 3 ′ end. Only When the amount of enzyme was increased (50 ng), the activity was detected. The wild-type enzyme showed high activity for substrates A, B, and C, whereas the mutant enzyme showed high activity only for substrate A. Therefore, polymorphism analysis is also possible by such a fluorescent labeling technique.
  • oligonucleotides were synthesized as models of genes to be analyzed for polymorphism analysis.
  • oligonucleotides have different underlined bases and assume that there is a SNP at this position.
  • probe A the following oligonucleotide was synthesized as probe A. These oligonucleotides have different underlined bases and different fluorescent dyes for labeling. Probe A (C); 28mer 5 and £ CTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3, (SEQ ID NO: 46)
  • TET Fluorescence
  • Probe A (G); 28mer 5'-GCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3 '(SEQ ID NO: 47)
  • HEX Fluorescence
  • Probe A (A); 28mer 5'-ACTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3 '(SEQ ID NO: 48) The 5 terminal is labeled with fluorescence (FAM).
  • each substrate formed by this annealing is shown in (1) -1 (9) of FIG.
  • Substrate 2 Template Strand (G) + Probe A (G) + Probe B
  • Substrate 4 Template Strand (C) + Probe A (C) + Probe B
  • Substrate 7 Template Strand (T) + Probe A (C; + Probe B
  • Substrate 8 Template Strand (T) + Probe A (G) + Probe B
  • Substrate 9 Template Strand (bottom) + probe eight (eight) + probe B
  • Detection of enzyme action on each substrate is based on the excitation wave of TET, HEX, FAM for each substrate.
  • the fluorescence intensity was measured with a spectrofluorometer, FP-750 (JASCO) through the filter. Also, use a sample that has no enzyme in it as the control port, and subtract the control port value from the sample in which the enzyme has been added. This was taken as the value for each sample.
  • the wild type showed activity against all substrates.
  • All the enzyme variants of the present invention showed high activity against substrates 1, 5, and 9. This means that for each template strand, only probe A (C), probe A (A), and probe A (G) formed a base pair, forming a 3 'overhanging Nick. Meaning ( Figure 16). Therefore, for example, when TET fluorescence derived from probe A (C) is detected, it is found that the base of the site assumed as the SNP site of Template Strand is G, and the enzyme variant of the present invention is used.
  • the base of SNP can be specified by the type of fluorescence generated.
  • the following experimental example is ⁇ J using the enzyme mutant of the present invention in order to determine whether or not the SNP is present in the analyzed gene when the SNP base has already been clarified. .
  • G is a normal base
  • A is an SNP in the base sequences synthesized from the following oligonucleotides.
  • probe A an oligonucleotide having the following sequence corresponding to SNP and having 5' end is T A nucleotide was synthesized, and FAM was added to the 5 ′ end of the oligonucleotide, and TAMRA was added to the 3 ′ end of the oligonucleotide.
  • Probe A (T); 20mer, 5′-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3 ′ (SEQ ID NO: 49) Further, the following oligonucleotide was used as probe B. Probe B; 27-mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3 '(SEQ ID NO: 3 3)
  • Example 4 The above oligonucleotides were annealed in the same manner as in Example 4. As a result, substrates having two structures shown in FIG. 18 are formed (however, the fluorescent dye is not shown).
  • the wild-type enzyme shows activity against substrates A and B, but the mutant enzyme of the present invention shows activity only against substrate A, and shows activity against substrate B. No or very weak activity. That is, when the base of SNP is clear, if probe A having a base that forms a base pair with this base is used at the 5 ′ end, 3, a protruding nickel is formed, and the enzyme mutation of the present invention The 5 'terminal side of probe A is cleaved by the body, and FAN-derived fluorescence bound to the terminal is generated. In contrast, in the absence of SNP, probe A is not cleaved and does not emit fluorescence. Therefore, the presence or absence of SNP can be determined by the presence or absence of fluorescence (see Figure 6).
  • the enzyme mutant of the present invention is used to determine the presence or absence of the SNP of the gene to be analyzed and whether the SNP is homozygous or heterozygous. It is an example used.
  • oligonucleotides were synthesized as models of genes to be analyzed.
  • A is normal and G is SNP.
  • GGTCA-3 GGTCA-3 '(SEQ ID NO: 43)
  • the following oligonucleotide was synthesized as probe A, FAM was labeled at the 5' end of probe A (T), BHQ-1 was labeled at the 3 'end, and probe A (C) TET was labeled at the 5 'end and BHQ-1 was labeled at the 3' end.
  • Probe A (T); 20mer, 5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3 '(SEQ ID NO: 49)
  • Probe A (C); 20mer, 5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (SEQ ID NO: 50) upstream strand B ⁇ 2);
  • Substrate 2 Template Strand (A) + Pro-B A (C) + Pro-B
  • Substrate 5 Template Strand (A), Template Strand (G) + Probe A (T) + Probe B
  • Substrate 6 Template Strand (A), Template Strand (G) + probe A (C) + probe B
  • Substrate 1 1-6 The structure of Substrate 1 1-6 is shown in FIG.
  • the excitation light and the fluorescence wavelength differ depending on the fluorescence type, and the filter type also differs.
  • the fluorescence intensity generated by the excitation wavelength of TET, HEX, and FAM is filtered for each substrate, and the fluorescence intensity is measured with a spectrofluorometer, FP-750 (JASCO). It went by. In addition, the sample is not sampled, and the control value is subtracted from the sample containing the enzyme. This was taken as the value for each sample.
  • Example 13 In the following experiment example, when multiple SNPs present in the genome are analyzed simultaneously, the position of the detected SNP in (Analysis Method 5) can be changed without changing the length of the 5 'flap strand to be cleaved. It verifies that it can be identified by changing its base.
  • Frap Strand (C_5) and (C-6) are both 14mer and the same length.
  • the base of the flap part is different (C-5;
  • Example 4 The above oligonucleotides were annealed as in Example 4 to form the following substrates A and B.
  • the structures of substrates A and B are shown in FIG.
  • peaks were detected at 4868 and 4911.
  • 4868 corresponds to an oligonucleotide with a molecular weight of 4865 Da from which the Flap strand of substrate A was cleaved
  • 4991 corresponds to an oligonucleotide with a molecular weight of 4940 Da from which the Flap strand of substrate B was cleaved.
  • Oligonucleotides were purified with ZipTip.
  • the flap strand was degraded by exonuclease and detected at a small molecular weight, which did not interfere with sample detection.
  • Downsteam Strand B was not detected.
  • Template StrandA and Downstream Strand B are still stranded, and this structure binds to the enzyme and Downstrean Strand B was not detected. Seem.

Abstract

　フラップエンドヌクレアーゼの基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した変異体を得る。該変異体を遺伝子多型解析試薬として使用することにより、従来法に比べ、より正確であり、簡便で検出効率の良い遺伝子多型解析が可能となる。 　

Description

明 細 書
フラップエンドヌクレアーゼ変異体
技術分野
[0001] 本発明は、野生型フラップエンドヌクレア一ゼの基質特異性を変化せしめた新規フ ラップエンドヌクレア一ゼ変異体、及び該変異体を利用した遺伝子の多型解析用試 薬に関する。 背景技術
[0002] フラップ（Flap)エンドヌクレア一ゼは DNA複製.修復に必須な酵素であり、 DNAの 構造を特異的に認識しフラップ鎖を切断する。また、この酵素は、 5 'exonuclease活 性も有してレ、る。この酵素は、結晶構造が明らかにされ、基質認識機構に関して変異 体を用いて詳しく調べられている。また、耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼとして、 パイロコッカス由来の耐熱性酵素も知られている。
一方、最近は、このようなフラップエンドヌクレア一ゼの基質特異性を利用して、遺 伝子の多型解析に利用されている。
[0003] 遺伝子の多型とは、異なる個体間で、遺伝子上の同一箇所の塩基配列が異なるこ とをいい、その頻度により突然変異と区別されるが、遺伝子の多型が直接疾病原因と なっていることもあり、また、近年、最も頻度の高い多型である一塩基多型（SNP)が 複雑に関連し、生活習慣病等の遺伝的要因になっているとも考えられ、そのため SN Pの位置及び SNPの塩基に関する膨大なデータが集積されつつある。
上記 Flapエンドヌクレアーゼを使用する SNP解析としては、インベーダー法が知ら れている。この方法はターゲット核酸 (ゲノム上での一塩基多型を持った領域）に、ィ ンベーダープローブとシグナルプローブがァニールすることにより形成される 3塩基 の重複構造をフラープエンドヌクレア-ゼが認識してフラップ部分を切断するか否かを 指標にして、 SNPの有無等を解析するものである力 現在まで知られているフラップ エンドヌクレアーゼは、いずれも基質特異性が比較的広レ、ものであるため、 SNP以 外の、例えば単なるニック (nick)等の遺伝子欠陥も検出してしまうため、信頼性にお
差替 え 用 紙 (規則 26) レ、て十分ではなレ、ものであった。
[0004] 非特許文献 1： Kaiser, M., Lyamicheva, Ν·， Ma, W.， Miller, C" Neri, B.， Fors,し， and Lyamichev, V" (1999) J. Biol. Chem., 274, 21387-21394
特許文献 2 : Lyamichev, V., Brow, M.A.D. , Varvel, V.E. , and Dahlberg, J. E.， (1999) Pro Natl. Acad. Sci.， 96, 6143-6148
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明の課題は、フラップエンドヌクレア一ゼの基質特異性を変換し、遺伝子の多 型解析において、従来法に比べ、より正確であり、検出効率の良い解析手段を提供 することである。 課題を解決するための手段
[0006] 本発明者は、以上のような課題を解決すベぐフラップ（Flap)エンドヌクレアーゼの 基質結合部位に変異を導入し、基質特異性が変化した、変異体を作製した。
野生体のフラップ（Flap)エンドヌクレアーゼは、 2本鎖 DNAの一方の DNA鎖が 3 ' 末端突出構造を有して切断されている基質、同 3 '末端突出構造を持たない基質あ るいはニック (nick)を有する基質等に作用し、基質特異性が広いのに対して、上記 変異体は、 2本鎖 DNAの一方の DNA鎖が 3 '末端突出構造を有して切断され、か つ切断された DNA鎖の相補鎖部分は連なって、他方の DNA鎖に対して欠落部分 力 い塩基対を形成している基質に作用する。すなわち、本発明の上記変異体は 3 ' 末端突出構造を有する基質に作用し、 3 '末端突出構造を有しない基質は殆ど切断 できないという性質を有するが、さらに、 3 '末端突出構造を有する基質であっても、さ らに特定構造の DNA鎖のみに作用する。
このような変異体酵素の基質特異性を利用すれば、遺伝子の多型解析において、 多型が存在する場合のみを正確に蛍光検出できる新しい手段を提供できる。
[0007] すなわち、本発明は以下（1)一（6)に示すとおりである。
(1) 野生型フラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に 置換したフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、該野生型エンドヌクレアーゼの 基質のうち、 2本鎖 DNAの一方の DNA鎖が 3 '末端突出構造を有して切断され、 かつ切断された各 DNA鎖は、他方の DNA鎖と相補の塩基配列部分を有し、これら 相補の塩基配列部分は連らなって、他方の DNA鎖に対し欠落部分のない塩基対を 形成している DNA基質に作用し、他の基質に対しては作用しなレ、かあるいは活性が 低下してレ、ることを特徴とする、フラップエンドヌクレアーゼ変異体。
(2)配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、（A) 33番目のアミノ酸が ァラニン又はロイシン、 （B) 35番目のアミノ酸がチロシン、 （C) 79番目のアミノ酸がァ ラニン又はヒスチジン、 (D) 33番目と 79番目のアミノ酸がともにァラニン、（E) 33番目 と 35番目のアミノ酸がともにァラニン及び (F) 278番目及び 279番目のアミノ酸がとも にァラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異 体。
(3)上記（2)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードする DNA。
(4)上記（3)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードする DNAを含有す る組み換えベクター。
(5)上記 (4)に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
(6)上記（1)または（2)に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる、遺伝子 多型解析用試薬。
発明の効果
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、 3 '末端が突出している基質、特に 第 1図に示す、 3'突出末端を有するニック及びダブルフラップ基質のみに作用し、こ れ以外の野生型フラップエンドヌクレア一ゼの基質は殆ど切断できないとレ、う新規な 性質を有する。このような基質特異性を有する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変 異体を使用することにより、遺伝子の多型解析において、多型が存在する場合のみ を正確に検出でき、し力もその検出が簡便に行えるという効果を奏する。 図面の簡単な説明
[図 1]フラップエンドヌクレア一ゼの基質の構造を模式的に示した図である。
[図 2]ダブルフラップ、ニック及び 5 'レセスエンド基質に対する各フラップエンドヌクレ ァーゼ変異体の活性を示すグラフである。
[図 3]シングノレフラップ、シユード一 Y基質に対する各フラップエンドヌクレアーゼ変異 体の活性を示すグラフである。
園 4]上記 6種の各基質に対する本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の活性 を示すグラフである。
園 5]本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合 の手法を示す模式図である。
園 6]本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合 の他の手法を示す模式図である。
園 7]本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を、遺伝子多型解析に用いた場合 の他の手法を示す模式図である。
園 8]本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析に使用するため に、必要な基質特異性にっレ、て試験した結果を示す電気泳動図である。
園 9]実施例 5の実験に用いた基質の構造を模式的に示した図である。
[図 10]本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体（Y33AF79A,Y33AF35A)の各基質 に対する活性を示す電気泳動写真である。
園 11]実施例 7において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
園 12]実施例 7において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示す 電気泳動写真である。
園 13]実施例 7において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光 強度により測定した結果を示すグラフである。
園 14]実施例 9において作成した基質の構造を模式的に示した図である。 [図 15]実施例 9において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍光 強度により測定した結果を示すグラフである。
[図 16]実施例 10において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
[図 17]実施例 10において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を蛍 光強度により測定した結果を示すグラフである。
[図 18]実施例 11において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
[図 19]実施例 11において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体の活性を示 す電気泳動写真である。
[図 20]本発明の酵素変異体を用いて、解析対象 DNAにおける SNPの有無及びそ のホモ、ヘテロを判定するための手法を示す模式図である。
[図 21]実施例 12において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
[図 22]実施例 12において作成した基質に対する、野生株及び本発明の酵素変異体
(F79A、 F79H)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
[図 23]実施例 12において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体 (Y33A、
Y33L、 F35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフである。
[図 24]実施例 12において作成した基質に対する、本発明の酵素変異体 (Y33AF79A
、 F278AF279A, Y33AF35A)の活性を蛍光強度により測定した結果を示すグラフであ る。
[図 25]実施例 13において作成した基質の構造を模式的に示した図である。
[図 26]実施例 13において作成した基質に本発明の酵素変異体を作用させ、得られ た各切断フラップ部分の質量分析結果を示すグラフである。
[図 27]上記質量分析結果に基づく分子量と予想分子量がほぼ同一であることを示す 図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップエンドヌクレアーゼ の基質特異性を変更したものである。野生型フラップエンドヌクレアーゼは、ニック（ni ck)、 3 '突出末端を有するニック（Nick with 3 ' projection)、 5，レセス末端（5' Recess-end)、シンク、、/レフフップ (Single flap)、ダゾノレフフップ (Double flapノ及びシュ ーードド --YY ((PPsseeuudd00__YY))とと呼呼ばばれれるる基基質質にに作作用用しし、、ささららにに、、合合流流部部ににギギャャッッププ（（隙隙間間））をを有有
Figure imgf000007_0001
ggaapp aatt jjuunnccttiioonn ;;以以下下、、ギギャャッッププをを有有すするるダダフフノノレレ フフララッッププとといいうう。。））とと呼呼ばばれれるる構構造造をを有有すするる DDNNAA基基質質ににもも作作用用すするる。。ここれれららのの DDNNAA基基 質質のの構構造造はは図図 11にに示示さされれるる。。
これらの基質のうち、
Figure imgf000007_0002
junction)基質は、 2本鎖 DNAの一方の DNA鎖が切断された 3 '末端突出構造を有 する力 切断された各 DNA鎖は、 2本鎖 DNAの他方の DNA鎖に対して相補の塩 基配列部分をそれぞれ有するが、該相補の塩基配列部分を併せても、他方の DNA 鎖に対して欠落する塩基があり、他方の DNAと連続する塩基対が形成されていない ものである。
[0011] すなわち野生型フラップエンドヌクレアーゼは、基質特異性が広ぐこれら 7種の各 々構造が異なる DNA基質に作用する。また、フラップエンドヌクレアーゼは、エンドヌ クレアーゼ作用とェキソヌクレアーゼ作用とを有し、野生型フラップエンドヌクレアーゼ は、ェキソヌクレアーゼ作用により、上記 7種の DNA基質のうち、ニック（nick)、 3 '突 出末端を有するニック（Nick with 3'projection)、及び 5，レセス末端（5， Recess-end) 基質における下流側ストランド（Downstream)の 5 '末端側を削除していく。また、ェン ドヌクレアーゼ作用により、シングルフラップ（Single flap)、ダブルフラップ (Double flap )、シユード一 Y (Pseudo-Y)基質、ギャップを有するダブルフラップ基質（Double flap with gap at junction)有するフラップストランド（Flap Strand)の 5 '末 i¾g側フラップを切 断するとともに、さらにェキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の 5 '末端側を削除す る。
[0012] これに対して、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、上記野生型エンドヌ クレア一ゼの基質のうち、 3 '突出末端を有するニック（Nick with 3'projection)基質と ダブルフラップ (Double flap)基質のみに作用する。
すなわち、 3 '突出末端を有するニック基質においては、下流側ストランド（Down Strand(C-l))の 5，末端側塩基は、上流側ストランド (Upstream Strand (B_2》のフラッ プ基部の塩基の直前まで伸びており、下流側ストランド（Down Strand(C-l))と上流側 ストランド (Upstream Strand (B_2)のテンプレートストランドに対する相補鎖部分は、連 なって、他方の DNA鎖（Template Strand (A) )に対して欠落部分のない塩基対を形 成してレ、る。 ダブルフラップ基質も、同様に他方の DNA鎖（Template Strand (A) ) に対するフラップストランド（Flap strand (C-3))及び上流側ストランド（Upstream Strand(B_2))の相補配列部分は、連らなって、他方の DNA鎖（Template Strand (A) ) と欠落部分のなレ、塩基対を形成してレ、る。
[0013] し力し、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体は、これら以外の上記 5種の DNA基質 に対しては、作用しなレ、かあるいはその活性は極めて低レ、。
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体の作用形態自体は、野生型と異ならず
、 3 '突出末端を有するニック（Nick with 3'projection)の下流ストランドの 5 '末端側を 削除し、ダブルフラップ (Double flap)のフラップストランド（Flap Strand)のフラップ部 分を切断するとともに、さらにェキソヌクレアーゼ作用により、切断部位の 5 '末端側を 削除する。
[0014] 本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、野生型フラップヌクレア一ゼの基質 結合部位のアミノ酸を変異させたものである。この変異体酵素を得るには、配列番号 2に示す野生型フラップエンドヌクレアーゼー 1のアミノ酸配列をコードする遺伝子ある いはこれを含むプラスミドを铸型とし、かつ変異を入れたプライマーを用いて、 PCR 増幅を行う部位特異的変異作成法により、変異体遺伝子を得て、該変異遺伝子を適 当な発現ベクターに連結し、この組み換えられた発現ベクターを宿主微生物に導入 して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養し、培養物から目的のフラップェン ドヌクレアーゼ変異体を得ることができる。
[0015] 本発明においては、この手法により、パイロコッカス、ホリコシ（登録番号 JCM9974) の野生型フラップエンドヌクレアーゼ— 1の遺伝子（配列表の配列番号 1)の変異体遺 伝子を得、これを用いて得られた様々な酵素変異体の各基質に対する酵素活性を 測定した結果、特定構造の 3 '突出末端を有する DNA基質のみに実質的に作用す る耐熱性のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を見いだしている力 これを具体的に 例示すると以下のとおりである。
[0016] ノ イロコッカス ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ _1のアミノ酸配列
(配列表の配列番号 2)において、 (A) 33番目のアミノ酸であるチロシンがァラニン又はロイシンに置換された変異体。 (以下、それぞれ Y33A、 Y33Lと表示する場合がある。 ) 該変異体酵素のアミノ酸 配列は、それぞれ配列表の配列番号 4及び 6に示される。
(B) 35番目のアミノ酸であるフエ二ルァラニンがチロシンに置換された変異体。 (以下、 F35Yと表示する場合がある。 )該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の 配列番号 8に示される。
(C) 79番目のアミノ酸であるフエ二ルァラニンがァラニン又はヒスチジンに置換された 変異体。 （以下、それぞれ F79A、 F79Hと表示する場合がある。）該変異体酵素の アミノ酸配歹 IJは、それぞれ配列表の配列番号 10、 12に示される。
(D) 33番目のアミノ酸であるチロシンおよび 79番目のアミノ酸であるフエ二ルァラ二 ンがともにァラニンに置換された変異体（以下、 Y33AF79Aと表示する場合がある。 ) 該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号 14に示される。
(E) 33番目のアミノ酸であるチロシンおよび 35番目のアミノ酸であるフエ二ルァラ二 ンがともにァラニンに置換された変異体（以下、 Y33AF35Aと表示する場合がある。 ) 該変異体酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号 54に示される。
(F) 278番目のアミノ酸であるフエ二ルァラニンおよび 279番目のアミノ酸であるフエ二 ルァラニンがともにァラニンに置換された変異体。
(以下、 F278AF279Aと表示する場合がある。）該変異体酵素のアミノ酸配列は、配 列表の配列番号 16に示される。 上記 Y33A、 Y33L、 F35Y、 F79A、 F79H、 Y33AF79、 Y33AF35A、 F278A F279Aの各遺伝子は、これら変異体ペプチドをコードするものであれば、特に制約 はないが、これら遺伝子の塩基配列を例示すると、それぞれ順に配列表の配列番号 3、 5、 7、 9、 11、 13、 53、 15に示す配列が挙げられる。 以下の表 1に、フラップエンドヌクレア一ゼ一 1(野生型）ファミリ一のアミノ酸配列を ァライメン卜して示す。
[0018]
Figure imgf000010_0001
表中の符号は以下のとおりである
phFEN-l;Pyrococcus horikoshiiのフラップエンドヌクレア—ゼ一 1 (FEN-1) mjFEN- 1； Methanococcus jannaschiiの Fじ N - 1
spRAD2； Schizosaccharomyces pombの RAD2
hFEN - 1;ヒ卜の FEN - 1
T5 EXO;T5ェキソヌクレアーゼ
T7 EXO;T7gene6ェキソヌクレア一ゼ
E.coli pol.l;E.coliポリメラーゼ 1における 5'ェキソヌクレア一ゼドメイン
Tag.pol.l;Thermus aguaticusポリメラ一ゼ 1における ェキソヌクレアーゼドメイン
[0019] これによれば、ノ、。イロコッカス ホリコシ由来のフラップエンドヌクレア一ゼ一 1の基質 結合ドメインにおける、変異の対象とした部位のアミノ酸はほぼ共通しており、特に、 フラップエンドヌクレア一ゼ一 1(FEN— 1)については、ヒトを含めて全く共通している このことは、上記パイロコッカス ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ —1について施した変異を、他の生物由来の野生型フラップエンドヌクレア一ゼ一 1 にも施せば、同様な基質特異性変化が起こることを強く示唆する。
差替え 用紙（規則 26) 基質のみに実質的に作用するという基質特異性は、簡便、正確でかつ全く新しい、 遺伝子の多型解析手法を提供する。
本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体を遺伝子多型解析用試薬として用いた 場合における、遺伝子多型解析手法について以下に説明する。
[0021] 解析手法 1
以下に図 5の SNP解析を例にとり、説明する。
なお、図 5中、 FAM、 TAMRAはそれぞれ蛍光色素を示し、 2本線上側の一 A—は SNPがなく正常の場合の塩基、 G—、一 C一、 T一は、多型の場合の塩基を示す。
(a) SNP部位を含む試料 DNAと相補の塩基配列を有し、その 5'末端が SNP部位と 対応する位置まで伸長し、かつ該 5末端が、検体試料 DNAに SNPがない場合の塩 基 (A)と塩基対を形成する塩基 (T)となるようオリゴヌクレオチドを合成してプローブ Aとする。また、 SNP部位を含む試料 DNAと相補の塩基配列を有し、その 3 '末端が SNP部位と対応する位置まで伸長し、かつ該 3 '末端が、試料 DNAに SNPがない 場合の塩基 (A)及び該塩基と塩基対を形成する塩基 (T)以外の塩基 (C、 G)となる ようにオリゴヌクレオチドを合成してプローブ Bとし、プローブ Aの 5，末端およびプロ一 ブ Bの 3'末端を、近接すると FRET効果を生じて、蛍光が発生しないかあるいは少な くとも発光強度が低下する色素でそれぞれ標識する。
FRET効果を生じる蛍光色素の組み合わせとしては、 TAMRAと FAM、 BHQ-1 と TET、 HEX, FAM等がある。例えば、プローブ Aの 5 '末端の標識に FANを用い た場合、プローブ Bの 3'末端の標識は TAMRAを用いればょレ、。
(b)次いで試料 DNAに上記プローブ A及びプローブ Bをァニールさせる。このァニ ールした場合の 2本鎖 DNAの構造は、 SNPがある場合とない場合とでは異なる。
[0022] 〔SNPがある場合〕
3 '末端を Cとしたプローブ Bを使用したとき、試料 DNAの SNP部位に多型がある 場合、すなわち試料 DNAの SNP部位の塩基は G、 Cまたは Tのいずれかである。
1)このうち Gの場合には、プローブ Bの 3'末端の塩基（C)と相補の関係にあり塩基 対を形成するので、 3 '末端突出構造を形成しない（図 5 (1)中 (A) )。
2) Cの場合には、プローブ Aの 5 '末端の塩基（T)及びプローブ Bの 3'末端の塩基 (C)は、試料 DNAの SNP部位の塩基（G)とレ、ずれも塩基対を形成せず、 プローブ Aの 5'末端の塩基 (T)及びプローブ Bの 3 '末端の塩基（C)はレ、ずれも突出構造をと り、プローブ Aとプローブ Bとにおける、試料 DNAに対する相補の塩基配列部分は、 試料 DNAに対して連続した塩基対を形成せず、ギャップを生じる（図 5 (1)中（B) )
3) Tの場合は、上記 2)と同様に、プローブ Αの 5'末端の塩基（Τ)及びプローブ Β の 3'末端の塩基（C)は、試料 DNAの SNP部位の塩基 (T)とレ、ずれも塩基対を形成 せず、 プローブ Aの 5'末端の塩基（T)及びプローブ Bの 3 '末端の塩基（C)はレ、ず れも突出構造をとり、プローブ Aとプローブ Bとにおける、試料 DNAに対する相補の 塩基配列部分は、試料 DNAに対して連続した塩基対を形成しない（図 5 (1)中（Β' 一方、 3'末端塩基を (G)としたプローブ Βを使用したときも、同様で、試料 DNAの SNP部位に多型がある場合には必ず、図 5 (1)の（Α)、（Β)または（Β' )のいずれか の構造となる。
[0023] 〔SNPがない場合〕
これに対して、試料 DNAの SNP部位に多型がない場合、すなわち試料 DNAの S NP部位の塩基が（A)である場合は、プローブ Aの 5'末端は Tであるから塩基対を形 成するとともに、プローブ Bの 3 '末端は（C)または（G)であるから、試料 DNAの SNP 部位の塩基 (A)とは塩基対を形成せず、突出末端となる。すなわち、このときの構造 は図 1に示される 3 '突出末端を有するニック構造となり、プローブ Aの 5 '末端と、プロ ーブ Bのフラップ部分を除く試料 DNAに対する相補の塩基配列部分は、試料 DNA とともに欠落部分のない連続した塩基対を形成する（図 5 (1) (C) )。
[0024] (c)次いで、上記プローブ Aと Bが試料 DNAとァニールした状態で、本発明の遺伝 子多型解析用試薬である、フラップエンドヌクレアーゼ変異体を作用させる。
試料 DNAに SNPがある場合には、該フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、上記 図 5 (1)の（Α)、（Β)、（Β' )に示される構造の DNA基質にはいずれも作用しないの で、プローブ Aの蛍光色素 TAMRAとプローブ Bの蛍光色素 FAMとは近接位置に あり、 FRET効果により、蛍光は発生しない。
これに対して、 SNPがない場合には、 3 '突出末端を有するニック構造となるから、 フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造を基質として認識し、プローブ Aの 5末 端が切断され、蛍光色素 TAMRAが上記 FAMとの近接位置から外れることにより蛍 光を生じる。
したがって、蛍光の有無を検出することにより SNPの有無を判定できる。
解析手法 2
解析手法 2は、図 5 (2)に示される。
なお、この手法は、プローブ Aの 3'末端及び 5'末端をそれぞれ近接により FRET 効果を生じる蛍光色素（例えば、 TAMRAと FAM等の組み合わせ）により標識し、ま た、プローブ Bには蛍光標識しない他は、解析手法 1と同様である。なお、この場合に おいてはプローブ Aの分子長は、その両端の蛍光色素が近接して、 FRET効果によ り蛍光強度が低下するように、設計する（例えば、 20mer以下）。
SNPがある場合においては、解析手法 1と同様に、プローブ Bは 3 '末端突出構造 を形成しなレ、か（図 5 (2) (A) )、あるいはプローブ Aとプローブ Bとにおける、試料 D NAに対する相補の塩基配列部分は、試料 DNAに対して連続した塩基対を形成せ ず、ギャップを生じるので（図 5 (2)中（B)、 （Β' ) )、試料 DNAに SNPがある場合に は、使用したフラップエンドヌクレアーゼ変異体は、いずれも作用しないので、 FRET 効果により、蛍光は強度は低いものとなる。れに対して、 SNPがない場合には、 3，突 出末端を有するニック構造となるから、フラップエンドヌクレアーゼ変異体は、該構造 を基質として認識し、プローブ Aの 5末端が切断され（図 5 (2) (C) )、蛍光色素 TAM RAが上記 FAMとの近接位置から外れることにより蛍光強度が増大し、蛍光強度を 観察することにより、 SNPの有無を判定できる。
この蛍光標識手法によれば、プローブ Aの両端にそれぞれ異なる蛍光標識を行い 、プローブ Bの 3 '末端に蛍光標識しないので、遺伝子多型解析においてプローブが 解析対象遺伝子との間で、 3 '突出末端を有するニックあるいはダブルフラップを形 成した場合、酵素活性が低下せずフラップストランドを切断できるので、感度よく解析 することが可能となる。 遺伝子多型解析においてプローブが解析対象遺伝子との間で 3 '突出末端を形成し た場合、酵素活性が低下せず、感度よく解析することが可能となる。
[0026] 解析手法 3
図 5中（3)で示される方法は SNPの塩基を決定する方法である。
この方法は、プローブ Aの 5 '末端をそれぞれ、例えば C、 G、 Aとした 3種類のプロ ーブ A を用レ、るもので、該 5 '末端を標識する蛍光色素を各々異ならせるとともに、 該蛍光色素として、プローブ Bの 3末端を標識した蛍光色素と FRET効果により消光 する色素を用いる。 しかし、その他の手法は上記解析手法 1と同様である。
このような 3種類のプロープ Aを用いた場合、その 5 '末端の塩基が、試料 DNAの S NPの塩基と相補の場合のみ、 3'突出末端を有するニック構造となるから、本発明の フラップエンドヌクレアーゼを作用させた場合に 5 '末端は切断され、蛍光を発生する 。蛍光波長の種類から、どのプローブ A由来のものかが分かり、その 5 '末端塩基から SNPの塩基の種類を特定できる。
[0027] 解析手法 4
図 6の方法は、 SNPの塩基がすでに明らかとなっている場合に、簡便に検出する 方法である。例えば、 SNPの塩基が（A)であり、 SNPのない場合の塩基が（G)であ る場合には、プロ -ブ Aの 5'末端を (A)の相補塩基の（T)とするとともに、その 3 '末端 と 5 '末端を、例えば TAMRAと FAMで標識する。このプローブ Aの長さは、上記解 析手法 1と同様に 20mer以下にすることが好ましい。また、プ
ローブの 3 '末端塩基は SNPのなレ、場合の塩基（G)と相補の塩基（C)にする。
試料 DNAに SNPがある場合には、試料 DNAとプローブ A及び Bをァニールさせ たとき、 3 '末端突出ニック構造を形成するから、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ を作用させると、プローブ Aの 5'末端が切断され、 5 '末端に標識された蛍光色素（F AM)が蛍光を発生する。一方、 SNPがない場合はプローブ Bの 3末端の塩基（C)は 試料 DNAの SNPのないときの塩基 (G)と塩基対を形成し、 3'末端突出構造を有し なレ、（5'シングルフラップ構造）ので切断できなレ、。したがって、プローブ Aの両末端 に標識された上記蛍光色素は、 FRET効果により消光されている。
したがって、 SNPの塩基がすでに明らかであれば、上記のように各プローブを構成 すれば、一回の試験で、簡便に SNPを解析できる。
[0028] 解析手法 5
図 7に示す方法は、ゲノムに存在する SNPを多数同時に解析する方法である。 例えば、ゲノム上の A， B, Cの位置に SNPが存在する場合、図 7Bに示したように、 プローブ A、 Bを作成する。プローブ Aには SNPの Gに相補する Cを接合部に入れる。 プロ-ブ Bの 3 '末端は、 SNP無しの場合の塩基 (T)と相補する塩基 (A)にする。これら プローブを試料のゲノム DNAとァニールさせた場合、 SNPが有る場合は、ダブルフラ ップ（double flap)構造ができ、本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体により、接 合部より 1塩基中に入った所、 1箇所で切断される。一方、 SNPが無い場合は、シング ルフラップ（single flap)構造ができ、切断されない。
この解析手法に用いるプローブ Aは、検出する SNPの部位毎に、 5 '末端フラップ の長さが変わるよう合成し、その 5 '末端にはピオチンを結合させる。例えば、図 7に 示される様に、 SNPの部位、 A、 B、 C毎に順に 5 '突出末端の長さを 2-3塩基ずつ長 くなるようにする。このことにより、本発明のエンドヌクレアーゼ変異体による、 5 '末端 フラップの切断により、長さの異なった DNAフラグメントが得られる。 5 '末端にビォチ ンがついているため、アビジンカラムで精製することができ、精製された DNAフラグメ ントの分子量は質量分析機 (MS)により検出される。 SNPの箇所により、得られる DNA フラグメントの長さが異なるために、検出される分子量により、 SNPの箇所が特定でき る。 MALDI-TOF MSを使用すれば、 384検体を解析でき、 食体で、 10箇所以上の SNPを同時に解析できる。
[0029] 上記手法においては、 DNAフラグメントの精製のためプローブ Aの 5 '末端にピオ チンを結合させるが、 ZipTip等の DNA精製手段を用いれば、ピオチンを用いることな ぐ DNAフラグメントを精製でき、以後、上記と同様にして該フラグメントの分子量を 測定できる。
また、 DNAを構成する塩基はその分子量がそれぞれ異なるため、 5 '末端フラップ が同じ長さであっても、該フラップを構成する塩基の組み合わせを変えることにより、 フラップ鎖の分子量を変えることができ、切断された DNAフラグメントの分子量を測 定することにより、切断されたフラップを特定できる。すなわち、図 7Cに示されるように 、例えば、 5 'フラップ鎖の長さを同じ 14merにしても、その構成塩基の差異により、一 方のフラグメントの分子量は 4865であり、他方は 4940とすることが可能であり、両者 は識別可能である。したがって、 5 'フラップ鎖の構成塩基をデザインし、切断 DNAフ ラグメントの分子量を測定することにより、切断されたフラップの特定を行レ、、これに対 応する SNPの位置が明らかになる。
さらに、フラップ鎖が長くなると、フラップエンドヌクレアーゼ変異体により切断しにく くなるが、塩基の組み合わせと塩基の長さを変えることにより、フラップエンドヌクレア ーゼ変異体の作用の良好なフラップ鎖長さの範囲内において、極めて多種の分子 量の異なったフラップ鎖を作成することが可能になる。
解析手法 6
遺伝子多型においては、ゲノム遺伝子と対立遺伝子の間で SNPが同じ場合 (ホモ） と異なる場合がある（ヘテロ）、本発明によれば、 SNP塩基がすでに明らかな場合にお いて、解析対象遺伝子試料の SNPの有無に加えて、該 SNPがホモなのかあるいはへ テロなの力も簡単に見分けることができる。
この手法を図 20に基づき以下に説明する。、例えば SNPがなく正常な塩基力 で 、 SNPが Gである場合、 5'末端の塩基を Tとしたプローブ A (T)と、 Cとしたプローブ A ( C)とをそれぞれ合成し、その両末端を異なる蛍光色素で標識する。このとき 5 '末端 の蛍光色素を、例えば、プローブ A (T)においては FAMとし、プローブ A (C)では T ETとするように各々異なるようにする。
この後、解析対象の DNAに対し、プローブ A (T)およびプローブ A (C)とプローブ Bとをアニーリングし、本発明の酵素変異体を作用させると、 SNPがない場合 (Aの場 合）には、プローブ A (T)のみが 3'突出 Nick構造を形成し、本発明の酵素により切 断されて、蛍光色素 FAMに由来する蛍光が検出される。
SNPがホモ（ともに G)の場合、プローブ A (C)のみ力 3 '突出 Nick構造を形成し、 本発明の酵素により切断されて、蛍光色素 TETに由来する蛍光が検出される。
一方、ヘテロの場合（Aと G)には、プローブ A (T)とプローブ A (C)は、ともに 3'突 出 nick構造を形成し、本発明の酵素により切断されて、 TETと FAM由来の波長の 異なる 2つの蛍光が検出される。
なお、これ以外は、ギャップを有するダブルフラップ構造力あるいは 3 '突出構造を 有しないシングルフラップ構造を形成するため。本発明の酵素により切断されない。 したがって、 5 '末端塩基が異なる 2種のプローブ Aを使用し、本発明の酵素変異体 を作用させて発生する蛍光波長を検出することにより SNPの有無及びホモ、ヘテロ の判定を同時に行うことができる。 以下に、本発明の実施例を示すが、本発明はこれら実施例により限定されるもので はない。
実施例
〔実施例 1〕
変異体の作製
変異体 Y33Aの遺伝子の作成は、以下のように行った。
以下に示す、共通プライマー及び変異の入ったプライマー（Y33A作成用プライマ 一）を合成し、パイロコッカス'ホリコシ由来の野生型フラップエンドヌクレアーゼ _1 ( FEN- 1)の遺伝子（配列番号 1)を含む PETllaプラスミドを鎳型として、初めに、制限 酵素サイト (Ndel)の入った FEN-Uプライマ-と変異の入った Y33A-Rプライマ-、それ と制限酵素サイト（Xhol)の入った FEN-Rプライマ-と変異の入った Y33A-Uで PCR (96 度で 5分加熱後に、 DNA polymeraseを入れた。その後に 96度 1分、 55度 2分、 70度 2 分の 1サイクルを 25回行った。）を行い、変異の入った、 2つの断片を作成し、次に、こ れらの断片を铸型にし、 FEN-Uプライマ-と FEN-Rプライマ-で PCR (上記と同様の条 件)を行い、変異を導入し、同時に遺伝子の前後に制限酵素サイトを導入した。
フラップエンドヌクレアーゼ変異体 Y33Aの構造遺伝子の塩基配列は、配列番号 3 に示す。
他のフラップエンドヌクレアーゼ変異体 Y33L、 F35Y、 F79A、 F79H、 Y33AF79A、 F278AF279A及び Y33AF35Aの各遺伝子も上記と同様に作成した。これら構造遺伝 子の塩基配列は、それぞれ順に配列表の配列番号 5、 7、 9、 11、 13、 15、 53に示さ れる。
共通に使用 マ FEN-U
5
号 17)
FEN-R
5，
3， (配列番号 18)
Y33 A作成用プライマ Y33A-U
5，
- 配列番号 19)
Y33A-R
5，
- 配列番号 20)
Y33L作成用プライマー Y33L-U
5， 配列番号 21)
Y33L-R 配列番号 22)
F35Y作成用
F35Y-U
5，
-G
配列番号 23)
F35Y-R
5，
-A「
配列番号 24)
F79A作成用プライマ F79A-U
5，
-G(
(配列番号 25) F79A-R
5' -
' (配列番号 26)
F79H作成用プライマ F79H-U
5' - 配列番号 27)
F79H-R 配列番号 28)
F278AF279A作成用プライマー；
F278AF279A-U
' (配列番号 29)
F278AF279A-R
5， 配列番号 30)
Y33AF35A作成用プライマー；
Y33AF35A-U
GG-3' (配列番号 39)
Y33AF35A-R
T-3' (配列番号 40) また、 Y33AF79A遺伝子については、上記 Y33Aの遺伝子（配列番号 3)を含有する プラスミドを精製し、これを铸型にして F79Aのプライマー（配列番号 25, 26)を用いて 作成した（配列番号 13)。 次いで、 PETlla(Novagen社製）を制限酵素 Ndelと Xholで切断.精製した後、上記 の各変異遺伝子と T4リガーゼで 16°C、 2時間反応させ連結した。連結した DNAの 一部を E. coli— XU— BlueMRFのコンビトセルに導入し各形質転換体のコロニーを 得た。得られたコロニーからプラスミドをアルカリ法で精製し各発現プラスミドを得た。
[0034] 〔実施例 2〕
組換え遺伝子の発現
大腸菌 . coliBL21(DE3)， Novagen社製）のコンビテントセルを融解して、二本の ファルコンチューブに各々 0.1mlづっ移し、その中に上記の各発現プラスミド溶液 0.005mlを別々に加え氷中に 30分間放置した後 42度でヒートショックを 30秒間行い 、 SOCmedium0.9mlを加え、 37度で 1時間振とう培養したる。
その後アンピシリンを含む 2YT寒天プレートに適量まき、 37度で一晩培養し、各形 質転換体を得た。
当該各形質転換体をアンピシリンを含む 2YT培地（2リットル）で 660nmの吸収が 0 .4 に達するまで 37°Cで培養した後、 IPTG(Isopropy-b-D-thiogalactopyranoside)を ImMになるように加え、 30°Cで 4時間培養した。培養後遠心分離（6,000rpm, 20 min で集菌した。
[0035] 〔実施例 3〕
ϋの
それぞれ集菌した菌体を - 20度で凍結融解し、菌体の 2倍の 50mMトリス塩酸緩 衝液 (pH8.0)を加え懸濁液を得た。得られた各懸濁液にっレ、て 85度で 30分加熱後 遠心分離（l l ,000rpm, 20min)し、 HiTrapSP (フアルマシア社製）カラムに吸着させ、 NaCl濃度勾配による溶出を行い活性画分を得、 Y33A、 Y33L、 F35Y、 F79A、 F7 9H、 F278AF279A, Y33AF35A、及び Y33AF79Aの精製酵素溶液とした。
[0036] 〔実施例 4〕
酵素反応条件
( 1 )合成オリゴヌクレオチド
以下の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。なお、全てのオリゴヌタレ ォチドは北海道システムサイエンス社により合成された。
Template Strand(A); 54-mer, 5 - TCA-3' (配列番号 31)
Downstream Strand(C-l)； 28mer,
5 -TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号 35)
Upstream Strand(B_l) ; 26— mer, 5'— TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG— 3'; (配列番号 32)
Upstream Strand(B— 2) ; 27— mer,5，— TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC— 3' ( 配列番号 33)
Flap Strand(C-2)； 32mer, 5，- TAACTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3'
(配列番号 36)
Flap
CAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番号 37) このうち Downstream Strand(C-l), Flap Strand(C- 2), Flap Strand(C_3)のオリゴヌタレ オタイドは 5 '末端が蛍光ラベル (FAM)された。
(2)基質の調整
上記オリゴヌクレオチドを〔(A)+(C- 1)+(B-1)、（A)+(C_1)+(B- 2)、（A)+(C- 1)、
(A)+(C-2)+(B_l)、（A)+(C_3)+(B-2)及び (A)+(C_2)〕のように組み合わせて、それぞれ 150mMNaClを含む、 20mMトリス塩酸緩衝液（ph7.4)の中で煮沸し、溶液の温度を 徐々に 4度までさげることのよりアニーリングさせ、各々の基質を作製した。基質の名 称と構造を図 1に示す。
[0038] (3) flapエンドヌクレアーゼ活性
10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mM MgC l
2、 100mg/ml,牛 血清アルブミン）に 2pmolesの蛍光ラベル（FAM)された各基質に酵素変異体 Y33A ， Y33L, F35Y, F79A, F79L, F79H, F278AF279Aをそれぞれカ卩え、 60度で 1分 力も 10分まで反応させ、 1分間隔で活性を測定した。次ぎに、 10マイクロリットルの 95 %ホルムアミド、 20mM EDTA, lmg/mlキシレンシァノールを加え酵素反応を停止さ せた。これを 100°C加温、氷中急冷後、 7M尿素を含む 15%polyacryylamide gel電気 泳動（PAGE)で分析した。この電気泳動パターンを phosphoImager(Bio-Rad社製）で オートラジオグラフィー化し、反応物の分子種と量を測定した。 Kinetics解析を行ない 、 Kmと Kcatを算出した。
(4)変異体の基質特異性
上記各変異体の基質特異性の変化を他の変異体及び野生型酵素 (WT)とともに 図 2、 3、 4に示す。変異体 Y33A, Y33L, F35Y, F79A, F79L, F79H, F278AF279 Aは、 Nick,Recess-end，Single flap，Pseudo_Y基質に対して、活性が著しく減少した。 し力し、 Double flap, Nick with3 ' Projection基質に対しては、 WTと比べて活性は殆ど 変化がなかった。
5 '末端の蛍光ラベルの基質は、野生型フラップエンドヌクレアーゼおよび該変異体 のいずれもが切断した。
[0039] 〔実施例 5〕
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。このうちり C—1及び C一 4の 5 '末端は蛍光 ラベル (FAM)されている。次いでこれらオリゴヌクレオチドを、実施例 4と同様にァニ 一リングし図 9に示す構造の基質を作成しした。
Ί emplate Strand (A); 54-mer
5
GTCA-3 (配列番号 31)
Upstream Strand (B_3), 26-mer, 5 ' -TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3 ' ( 配列番号 34)
Downstream Strand(C-l)； 28mer,
5 -TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号 35)
Downstream Strand (C-4); 29mer, 5'
-CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3 ' (配列番号 38) なお、基質の構造は、 5，が lmer突出の single flap構造（図 9A)、 nick領域に 1 mer gapの入った double flap構造（図 9B)、及び nick with 3' projection構造（図 9C)の 3 種である。
ついで、 10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl , lOOmg/ml牛血清アルブミン）に、 2pmolesの蛍光ラベル（FAM)された各基質を加え 、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体 F79A， Y33A, F278AF279Aを O. lngと lng をそれぞれ加え、 60度で 5分反応させた。次ぎに 10マイクロリットルの 95%ホルムアミド 、 20mM EDTA, lmg/mlキシレンシァノ -ルを加え酵素反応を停止させた。これを、 100 度加熱、氷中急冷後、 7M尿素を含む 15%polyacrylamide gel 電気泳動（PAGE)で分 析した。この電気泳動パターンを phosphoImager(Bio_Rad社製)でォ-トラジオグラフィ -化した。
結果を図 8に示す。これによれば、基質 Cに対しては、野生型酵素及び本発明の変 異体酵素はともに活性を示すが、基質 A、 Bに対しては野生型酵素が活性を示すの に対し、本発明の変異体酵素は、いずれも活性を示さない。この様な基質特異性は 本発明のフラップエンドヌクレアーゼ変異体力 上記多型解析手法に用いる試薬とし て、十分な性能を有することを示す。 [0041] 〔実施例 6〕
10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl， 100mg/ml牛血 清アルブミン）に、実施例 4、 5において作製された、 2pmolesの蛍光ラベル（FAM)さ れた合計 7種の基質をそれぞれカ卩え、さらに各基質毎に酵素の野生型 O. lngと lng, 変異体 Y33AF35A, Y33AF79A lngをそれぞれ加え、 60度で 5分反応させた。次ぎに 10マイクロリットルの 95%ホルムアミド、 20mM EDTA, lmg/mlキシレンシァノ-ルを加え 酵素反応を停止させた。これを、 100度加熱、氷中急冷後、 7M尿素を含む
15%polyacrylamide gel 電気泳動（PAGE)で分析した。この電気泳動パターンを phosphoImager(Bio-Rad社製)でォ-トラジオグラフィ-ィ匕した。結果を図 10に示す。 これによれば、野生型酵素は、上記 7種の総ての基質に対して、活性を示すが、変 異体 Y33AF35A, Y33AF79Aは、 3'が突出している F (Nick with3' Projection構造）と G (Double flap構造）のみ活性を示す。し力し、 3'が突出している力 lmer gapがある C ( ギャップを有するダブルフラップ構造）に対しては活性を示さなレ、。
[0042] 〔実施例 7〕
以下の各オリゴヌクレオチドを合成した。
Template Strand (A); 54mer,
GGTCA-3' (配列番号 31)
Upstream Strand(B-l) ; 26-mer, 5'_TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG— 3，；（ 配列番号 32)
Upstream Strand(B-2) ; 27_mer,5，-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC— 3， ( 配列番号 33)
Upstream Strand (B_3), 26-mer, 5 ' -TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3 ' ( 配列番号 34)
Downstream Strand(C-l-l) ; 20mer, 5，_TCTTGAGGCAGAGTCCGACA_3， （配列 番号 41)
Flap Strand (C-4-1); 20mer, 5， - CTCTTGAGGCAGAGTCCGAC-3' (配列番号 42) このうち C-4-l、 C-l-1については、 5'末端に FAM, 3'末端に TAMRAをラベルし、 実施例 4と同様にアニーリングし図 11に示す構造の基質を作成しした。
[0043] 次いで、 10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl ,
100mg/ml牛血清アルブミン）に、 lpmolesの蛍光ラベルされた上記基質をそれぞれ 加え、さらに各基質毎に酵素の野生体と変異体 lngをそれぞれ加え、 60度で 5分反 応させた。次ぎに 10マイクロリットルの 95%ホルムアミド、 20mM EDTA, lmg/mlキシレン シァノ -ルを加え酵素反応を停止させた。これを、 100度加熱、氷中急冷後、 7M尿素 を含む 15%polyacrylamide gel 電気泳動（PAGE)で分析した。この電気泳動パターン を phosphoImager(Bio_Rad社製)でォ-トラジオグラフィ-ィ匕した。
結果を図 12に示す。これによれば、野生型酵素は、図中（A)—（C)の総ての基質 に対して、活性を示すが、変異体酵素は、 3'末端が突出している（C)のみ活性を示 す。 3'が突出しているが、 lmer gapがある（B)、及び (A)に対しては活性を示さないか 、又は非常に弱い活性を示す。
[0044] 〔実施例 8〕
10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl， lOOmg/ml牛血 清アルブミン）に、実施例 7で作成した、 lOpmolesの蛍光ラベルされた基質をそれぞ れ加え、さらに各基質毎に酵素の野生型と変異体 10ngをそれぞれ加え、 60度で 5分 反応させた。次に、 50mMトリス塩酸緩衝液 ρΗ8·0 200マイクロリットルを加え、氷中に 置くことで反応を止める。励起光 494nm，蛍光 520nmで、フィルタ- 500nmを使用して、 分光蛍光光度計、 FP-750 (日本分光)で蛍光強度を測定した。
結果を図 13に示す。なお、図 13の各棒グラフの値は、酵素を入れないサンプノレを コント口-ノレとし、酵素を入れたサンプルから、コント口-ルの値を差し引いた値である。 この結果によれば、野生型酵素は、上記 A— Cの総ての基質に対して、活性を示す 力 変異体酵素は 3' 末端が突出している基質 Cのみ活性を示す。又 3'末端が突出 しているが、 lmer gapがある基質 Bに対しては活性を示さない。
[0045] 〔実施例 9〕
以下のオリゴヌクレオチドを合成し、
Template strand (A); 54mer, GGTCA-3' (配列番号 31)
Upstream Strand(B_l) ; 26_mer, 5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCG_3，； (配列番号 32)
Upstream Strand(B-2) ; 27_mer,5，-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC— 3， ( 配列番号 33)
Upstream Strand (B_3), 26-mer, 5 ' -TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCA-3 ' ( 配列番号 34)
Downstream Strand(C-l)； 28mer,
5 -TCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3';
(配列番号 35)
Flap Strand (C_4); 29mer, 5，_CTCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC_3' ( 配列番号 38)
B-l、 B-2、 B-3の 3'末端を TAMRAでラベルし、 C_l、 C-4の 5'末端は FAMでラベル した。次に、これらオリゴヌクレオチドを実施例 4と同様にアニーリングし図 14に示す 構造の基質を作成した。
10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl， 100mg/ml牛血 清アルブミン）に、 lOpmolesの蛍光ラベルされた上記各基質をそれぞれカ卩え、さらに 各基質毎に酵素の野生体 50ngと変異体を 400ngをそれぞれ加え、 60度で 5分反応 させた。次に、 50mMトリス塩酸緩衝液 pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置く ことで反応を止める。励起光 494nm,蛍光 520nmで、フィルタ- 500nmを使用して、分光 蛍光光度計、 FP_750 (日本分光）で蛍光強度を測定する。酵素を入れないサンプル をコント口 -ルとし、酵素を入れたサンプルから、コント口-ルの値を差し引く。これを各 サンプルの値とする。
結果を図 15に示す。
upstream Strand B_l, B_2， B_3の 3 '末端に TAMRAが結合していると、野生型酵 素、変異体酵素共に、 3 '末端に蛍光ラベルがないものに比べ活性が低くなる。しか し、酵素量を増加する（50ng)と、活性が検出された。野生型酵素は、基質 A, B, C に高い活性を示したが、変異体酵素は、基質 Aのみ高い活性を示した。したがって、 このような蛍光標識手法によっても、多型解析が可能である。
[0047] 〔実施例 10〕
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下 3種のオリゴヌクレオチドを合成 した。
これらのオリゴヌクレオチドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、この位置に SNPがあ ると想定している。
Template Strand (G); 54mer,
GGTCA-3' (配列番号 43)
Template Strand (C); 54mer,
GGTCA-3' (配列番号 44)
Template Strand (T); 54mer,
GGTCA-3' (配列番号 45)
[0048] —方、プローブ Aとして以下のオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオ チドは下線部の塩基がそれぞれ異なり、また各々標識する蛍光色素が異なる。 プロ-ブ A(C); 28mer 5し £CTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC- 3， （配列番 号 46)
5末端に蛍光 (TET)がラベルされてレ、る。
プロ-ブ A(G); 28mer 5'-GCTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番 号 47)
5末端に蛍光（HEX)がラベルされてレ、る。
プロ-ブ A(A); 28mer 5'-ACTTGAGGCAGAGTCCGACATCTAGCTC-3' (配列番 号 48) 5末端に蛍光（FAM)がラベルされてレ、る。
また、プローブ Bとして以下の DNAを合成し、その 3'末端にクェンチヤ- (BHQ-1)を ラベノレした。
フ口一フ B^upstrem strand b-2)；
27— mer,5，-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC_3，（酉己歹' J番号 33) 以上のオリゴヌクレオチドを実施例 4の方法と同様にアニーリングし、以下 の基質 1一 9を作成した。
このアニーリングにより形成される各基質の構造は図 16の（1)一（9)に示される。
[0049] 基質 1 Template Strand (G)+プロ-ブ八（ ：:) +プロ-ブ B
基質 2 Template Strand (G)+プロ-ブ A (G ) +プロ-ブ B
基質 3 Template Strand (〇)+プロ-ブ八（八 ) +プロ-ブ B
基質 4 Template Strand (C)+プロ-ブ A (C ) +プロ-ブ B
基質 5 Template Strand (C)+プロ-ブ A (G ) +プロ-ブ B
基質 6 Template Strand (C)+プロ-ブ A (A ) +プロ-ブ B
基質 7 Template Strand (T)+プロ-ブ A (C; +プロ-ブ B
基質 8 Template Strand (T)+プロ-ブ A (G ) +プロ-ブ B
基質 9 Template Strand (下)+プロ-ブ八(八 ) +プロ-ブ B
[0050] 次いで、 10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl ,
100mg/ml牛血清アルブミン）に、 40pmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに 各基質毎に酵素の野生体 170ngと変異体 400ngをそれぞれ加え、 60度で 10分反応 させた。次に、 50mMトリス塩酸緩衝液 pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置く ことで反応を止めた。蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なる。また、フィノレタ- の種類も異なる。
TET 励起波長 510nm 蛍光波長 540nm フィルタ- 520nm
HEX 励起波長 520nm 蛍光波長 550nm フィルタ- 540nm
FAM 励起波長 494nm 蛍光波長 525nm フィルタ- 500nm
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、 TET、 HEX, FAMの励起波 長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、 FP-750 (日本分光）により 蛍光強度を測定した。また、酵素を入れないサンプノレをコント口-ルとし、酵素を入れ たサンプルから、コント口-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値とした。
[0051] 結果を図 17に示す。
これによると、野生型は全ての基質に対して活性を示した力 本発明の全ての酵素 変異体は、基質 1、 5、 9に対して高い活性を示した。このことは、各 Template Strand に対しては、それぞれプロ-ブ A (C)、プローブ A (A)及びプローブ A (G)のみが塩基 対を形成し、 3'突出の Nickを形成したことを意味する（図 16)。 したがって 例えば 、プローブ A (C)に由来する TETの蛍光が検出された場合には、 Template Strandの SNP部位として想定した部位の塩基が Gであることが分かり、本発明の酵素変異体 を使用して生ずる蛍光の種類により SNPの塩基を特定することができる。
[0052] 〔実施例 11〕
以下の実験例は、 SNPの塩基がすでに明らかになつている場合において、解析対 象の遺伝子に当該 SNPがある化否か判定するために、本発明の酵素変異体を使用 した^ Jである。
多型解析の解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した これらの塩基配列中、下線部の Gは正常な塩基であり、 Aは SNPであると想定してい る。
Template strand (A); 54mer,
GGTCA-3' (配列番号 31)
Template Strand (G); 54mer,
GGTCA-3' (配列番号 43) 一方、プローブ Aとして、 SNPに対応する 5 '末端が Tである以下の配列のオリゴヌ クレオチドを合成し、該オリゴヌクレオチドの 5 '末端に FAM， 3 '末端に TAMRAをそ れぞれラベノレした。 プロ-ブ A(T); 20mer, 5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号 49) また、プローブ Bとして以下のオリゴヌクレオチドを使用した。 プロ-ブ B ; 27-mer,5'-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC-3' (配列番号 3 3)
以上のオリゴヌクレオチドを実施例 4の方法と同様にアニーリングした。これにより、 図 18に示される 2種の構造の基質が形成される（ただし、蛍光色素は図示せず。 )
[0053] 次いで、 10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl，
2 lOOmg/ml牛血清アルブミン）に、 lpmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに 各基質毎に酵素の野生体と変異体は lngをそれぞれ加え、 60度で 5分反応させた。 次ぎに 10マイクロリットルの 95%ホルムアミド、 20mM EDTA, lmg/mlキシレンシァノ-ル を加え酵素反応を停止させた。これを、 100度加熱、氷中急冷後、 7M尿素を含む 15%polyacrylamide gel 電気泳動（PAGE)で分析した。この電気泳動パターンを phosphoImager(Bio-Rad社製)でォ-トラジオグラフィ-ィ匕した。
結果を図 19に示す。
これによれば、野生型酵素は、基質 A、 Bに対して、活性を示すが、本発明の変異 体酵素は、いずれも基質 Aのみに活性を示し、基質 Bに対して、活性を示さないか叉 は極めて弱い活性を示す。すなわち、 SNPの塩基が明らかである場合においては、 この塩基と塩基対を形成する塩基を 5 '末端に有するプローブ Aを使用すれば、 3，突 出の Nickを形成し、本発明の酵素変異体により、プローブ Aの 5 '末端側は切断され 、該末端に結合した FAN由来の蛍光を生ずる。これに対して、 SNPがない場合には プローブ Aは切断されず、蛍光を発生しない。したがって、蛍光の有無により SNPの有 無を判定できる（図 6参照）。
[0054] 〔実施例 12〕 以下の実験例は、 SNPの塩基がすでに明らかになつている場合において、解析対 象の遺伝子の SNPの有無及び該 SNPがホモかへテロかを判定するために、本発明 の酵素変異体を使用した例である。
解析対象遺伝子のモデルとして、以下のオリゴヌクレオチドを合成した。なお、下線 部の塩基は Aが正常で、 Gが SNPである。
Ί emplate Strand (A); 54mer,
GGTCA-3 ' (配列番号 31 )
Template Strand (G); 54mer,
GGTCA-3 ' (配列番号 43) プローブ Aとして以下のオリゴヌクレオチドを合成、プローブ A (T)の 5 '末端に FA M, 3 '末端に BHQ-1を標識し、また、プローブ A (C)の 5 '末端に TET、 3 '末端に BHQ- 1を標識した。
プロ-ブ A(T); 20mer, 5'-TCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号 49) プロ-ブ A(C); 20mer， 5'-CCTTGAGGCAGAGTCCGACA-3' (配列番号 50) フ口-フ B、upstream strand B~2)；
27— mer, 5，-TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC_3，（酉己歹' J番号 33)
以上のオリゴヌクレオチドを実施例 4の方法と同様にアニーリングし、以下 の基質 1一 6を作成した。
基質 ITemplate Strand(A)+プロ -ブ A (T) +プロ-ブ B
基質 2 Template Strand(A)+プロ -ブ A (C) +プロ -ブ B
基質 3Template Strand(G)+プロ -ブ A (T) +プロ-ブ B
基質 4Template Strand(G)+プロ -ブ A (C) +プロ -ブ B
基質 5Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ-ブ A (T) +プロ-ブ B 基質 6Template Strand(A), Template Strand(G)+プロ -ブ A (C) +プロ -ブ B
基質 1一 6の構造を図 21に示す。
次いで、 10マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（pH8.0、 15mMMgCl ,
100mg/ml牛血清アルブミン）に、 lOpmolesの蛍光ラベルされた各基質を加え、さらに 各基質毎に酵素の野生体と変異体は 10ngをそれぞれ加え、 60度で 10分反応させた 。次に、 50mMトリス塩酸緩衝液 pH8.0 200マイクロリットルを加え、氷中に置くことで 反応を止めた。
以下のように、蛍光種類により励起光、蛍光の波長が異なり、フィルタ-の種類も異 なる。
TET 励起波長 510nm 蛍光波長 540nm フィルタ- 520nm
FAM 励起波長 494nm 蛍光波長 525nm フィルタ- 500nm
各基質に対する酵素作用の検出は、上記基質毎に、 TET、 HEX, FAMの励起波 長で生じた蛍光をフィルターを通して、分光蛍光光度計、 FP-750 (日本分光）により 蛍光強度を測定することにより行った。また、酵素を入れないサンプノレをコント口-ルと し、酵素を入れたサンプルから、コント口-ルの値を差し引き。これを各サンプルの値と した。
[0056] 結果を図 22、 23、 24に示す。
本発明の変異体酵素を使用した場合、 Template Strand(A)の場合は FAMが検出さ れ、基質 1に対し高い活性を示した。 Template Strand (G)の場合は TETが検出され、 基質 4に高い活性を示した。 Template Strand (A)と（G)の場合は， FAMと TETが検出 され、基質 5、 6に高い活性を示した。基質 1、 2は、解析対象遺伝子に SNPがない場 合、基質 3、 4は、 SNPが Gでホモの場合、及び基質 5、 6は SNPが Aと Gヘテロの場 合にそれぞれ比定される。これらの場合において、各々異なる蛍光が検出できたこと は、本発明の多型解析手法が、 SNPの有無のみならずホモ、ヘテロの判定にも有効 であることをします。 これに対して、野生型酵素の場合は、各基質に対して検出され る FAMと TETの蛍光強度の差が明らかでなかった。
[0057] 〔実施例 13〕 以下の実験例は、ゲノムに存在する複数の SNPを多数同時に解析する場合におい て、（解析手法 5)において、検出された SNPの位置を、切断される 5'フラップ鎖の長 さ変えずに、その塩基を変えることにより識別できることを検証するものである。
以下のオリゴヌクレオチドをそれぞれ合成した。 Frap Strand (C_5)及び（C—6)は 、ともに 14merで長さは同じにした力 フラップ部分の塩基は異なる（C—5；
C C CAAAAAAAAAAA, C-6； AAAAAAAAAAAAAA)
Template strand (A); 54mer,
GGTCA-3' (配列番号 31)
Upstream Strand(B— 2) ; 27— mer,5，— TGACCTCGAGTGCACGTTGACTACCGC— 3' ( 配列番号 33)
Flap Strand (C_5) 43mer; 号 51)
Flap Strand (C-6) 43mer; 番号 52)
以上のオリゴヌクレオチドを実施例 4と同様にアニーリングし、以下の基質 Aと Bを 形成した。基質 Aと Bの構造は、図 25に示される。
基質 A Template Strand (A) + Flap Strand (C_5)+ Upstream Strand(B_2) 基質 B Template Strand (A) + Flap Strand (C_6)+ Upstream Strand(B-2) 次いで、 190マイクロリットルの 50mMトリス塩酸緩衝液（ρΗ8·0、 15mMMgCl ,)に、
2.5マイクロモル各基質をカ卩え、さらに各基質毎に酵素の野生体酵素 1.5マイクロモ ルをそれぞれ加え、 60度で 60分反応させた。 0.2Μ EDTAを 9.5マイクロリットル加え 、最終濃度 10mMにし、活性を止めた。各基質から得られた 5 '切断されたフラップ部 を含むサンプル溶液を混合した後、以下の a)— k)のようにして、 ZipTip(Millipore corporation)で精製し、 MALDI- TOF/MS分析器により分子量を測定した。この精製 及び分子量測定工程以下の a)— k)に示す。
[0059] a) ZipTip (Millipore社製 C18)を P10ピペットに装着し、 50%AcCN中で 5回ピぺッティン グ
b) 0.1M TEAA溶液中で 5回ピペッティング
c)サンプル（600ul中 200ulを採取し乾燥後、 20ul滅菌水で溶解したもの）を 10回ほど ピペッティング
d) 0.1M TEAA溶液を吸い取り、別の容器に排出する（5回実施）
e) 50%ァセトニトリルにて DNAサンプルをマイクロチューブで溶出
f) DOWEX?50W?Hydrogen (SIGMA社製）をアンモニアフォームに置換したビーズを パラフィルム上にうすく撒き、その上に溶出したサンプル 7ulをスポット
g)数回ピペッティングの後、乾燥しないように 10分間ほど静置
h) TOF/MS測定用サンプルプレートに、マトリックス（3HPA ;東京化成製の飽和水溶 液）を lulスポット
i)ビーズを吸い取らないように注意しながらサンプルを lul採取し、マトリックスとプレ ート上で混合 (ピペッティング）
j)サンプルプレートを風乾
k) MALDト TOF/MS分析器において測定
[0060] 結果を図 26、 27に示す。
MASSの結果は、 4868、 4911にピ-クが検出された。 4868は基質 Aの Flap鎖が切断さ れたオリゴヌクレオタイド 分子量 4865Daに相当し、 4991は基質 Bの Flap鎖が切断さ れたオリゴヌクレオチド 分子量 4940Daに相当する。
他のピ-クは検出されなかった。フラップエンドヌクレア-ゼの切断点は、ジャンクショ ン部分より lmer中にはいつたところの一ヶ所であった。
オリゴヌクレオチドは ZipTipで精製された。 Flap strandは exonucleaseで分解されて 、小さな分子量の所に検出され、サンプルの検出に邪魔にならなかった。 Downsteam Strand Bは、検出されなかった。 Template StrandAと Downstream Strand Bはまだァ 二-ルしており、この構造が酵素と結合し、 Downstrean StrandBが検出されなかったと 思われる。
このように、切断されたオリゴヌクレオチドのみ検出できた。このこと力ら、 Flap strand の長さを変え、配列を変えることにより一度に多くの種類の SNP解析ができる。

Claims

請求の範囲
野生型フラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸に置換 したフラップエンドヌクレアーゼ変異体であって、該野生型フラップエンドヌクレア一 ゼの基質のうち、 2本鎖 DNAの一方の DNA鎖が 3 '末端突出構造を有して切断さ れ、かつ切断された各 DNA鎖は、他方の DNA鎖と相補の塩基配列部分を有し、こ れら相補の塩基配列部分は連らなって、他方の DNA鎖に対して欠落部分のない塩 基対を形成している DNA基質に作用し、他の基質に対しては作用しないかあるいは 活性が低下していることを特徴とする、フラップエンドヌクレアーゼ変異体。
[2] 配列表の配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、（A) 33番目のアミノ酸がァ ラニン又はロイシン、 （B) 35番目のアミノ酸がチロシン、 （C) 79番目のアミノ酸がァラ ニン又はヒスチジン、 （D) 33番目と 79番目のアミノ酸力ともにァラニン、（E) 33番目と 35番目のアミノ酸がともにァラニン、及び（F) 278番目及び 279番目のアミノ酸がとも にァラニンである変異のうちいずれか一つを有するフラップエンドヌクレアーゼ変異 体。
[3] 請求項 2に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードする DNA。
[4] 請求項 3に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体をコードする DNAを含有する 組み換えベクター。
[5] 請求項 4に記載の組み換えベクターにより形質転換された形質転換体。
[6] 請求項 1または 2に記載のフラップエンドヌクレアーゼ変異体からなる、遺伝子多型 解析用試薬。
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