WO2006008886A1 - インターフェロン産生細胞の活性調節剤 - Google Patents

インターフェロン産生細胞の活性調節剤 Download PDF

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WO2006008886A1
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seq
amino acid
antibody
interferon
ipc
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PCT/JP2005/010561
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Jun Ohkawa
Yumiko Kamogawa
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Ginkgo Biomedical Research Institute Co., Ltd.
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues

Definitions

  • the present invention relates to an activity regulator of interferon producing cells (IPC) and a method of regulating activity.
  • IPC interferon producing cells
  • Interferon a IFN a
  • IFN ⁇ interferon ⁇
  • IFNa Interferon a
  • IFN ⁇ interferon ⁇
  • IFNa is related to autoimmune diseases. For example, abnormal production of IFNa has been reported in the following autoimmune disease patients. It has also been suggested that neutralization of IFN a may alleviate autoimmune symptoms.
  • IFNa induces the differentiation of dendritic cells.
  • Dendritic cells are also antigen presenting cells. Therefore, induction of dendritic cell differentiation is considered to constitute an important mechanism in autoimmune diseases.
  • IFN Hino and induction of differentiation of dendritic cells the development of systemic lupus erythematosus, deep that the relevance is there has been suggested (Blanco et al, Science, 16 : 294, 1540-1543, 2001) o
  • IFN is closely related to autoimmune diseases as well as antitumor activity.
  • IPC has been identified as a cell producing a large amount of type 1 IFN in association with viral infection.
  • IPC has no power in the blood.
  • the percentage of IPC in peripheral blood lymphocytes is considered to be less than 1%.
  • IPC has a very high ability to produce IFN.
  • the ability of IPC to produce IFN reaches, for example, 3000 pg / mL / 10 6 cells. In other words, although the number of cells is small, it can be said that the majority of IFN a or IFN iS in the blood is brought about by IPC.
  • IPC is an undifferentiated lymphoid dendritic cell that is positioned as a precursor cell of a dendritic cell.
  • IPCs are sometimes called plasmacytoid dendritic cells.
  • IPC differentiates into dendritic cells upon viral stimulation and induces the production of IFN- ⁇ and IL-10 by T cells.
  • IPCs also differentiate into dendritic cells upon IL-3 stimulation. Dendritic cells differentiated by IL-3 stimulation induce the production of Th2 site force-in (IL-4, IL-5, IL-10) by T cells.
  • Th2 site force-in IL-4, IL-5, IL-10
  • IPC is a cell having two aspects as an IFN-producing cell and a precursor cell of a dendritic cell. All cells play an important role in the immune system. In other words, IPC is one of the important cells that support the immune system in various ways.
  • Non-patent literature l Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992
  • Non-Patent Document 2 Hopkins et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988
  • Non-Patent Document 3 Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995
  • Non-Patent Document 4 Perez et al "Am. J. Hematol. 49, 365, 1995
  • Non-Patent Document 5 Blanco et al., Science, 16: 294,1540-1543,2001
  • An object of the present invention is to provide a regulator and a method for regulating IPC activity. Another object of the present invention is to provide a marker that can be used as an index of IPC activation. Another object of the present invention is to provide a screening method using an activation marker for IPC and a method for isolating or detecting activated IPC.
  • anti-BDCA-2 monoclonal antibody or anti-BDCA-4 monoclonal antibody (Dzionek A. et al. J. Immunol. 165: 6037-6046,2000) is a human IPC-specific monoclonal antibody.
  • anti-BDCA-2 monoclonal antibodies have been shown to have the effect of suppressing IFN production of human IPC.
  • interferon a monoclonal antibody that recognizes mouse interferon-producing cells, is also suppressed (Blood 2004 Jun 1; 103/11: 420 1-4206. Epub 2003 Dec).
  • a decrease in the number of dendritic cells by a monoclonal antibody against mouse plasmacytoid dendritic cells was reported (J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477).
  • BDCA2 has been identified as an IPC-specific antigen. BDCA2 expression in IPC is constitutive. In other words, an antibody that recognizes BDCA2 binds to IPC regardless of the level of IPC activation. However, IFN is produced by activated IPC. Therefore, it would be ideal if an antibody that selectively acts on activated IPC can be obtained. In addition to reports other than monoclonal antibodies that recognize BDCA, the antigen molecules recognized by the monoclonal antibodies and their expression patterns have not been identified.
  • Increased therapeutic efficiency can be expected by selective action on activated IPC. Specifically, the desired therapeutic effect can be obtained with a smaller amount of antibody. In addition, the selective action on the target cells can reduce the possibility of unexpected side effects.
  • the present inventors have conducted research on methods that can specifically act on activated IPC and regulate its activity. As a result, it acts on the antibody-activated IPC that binds to BST2 and / or its homologues. The present invention was completed by clarifying that the activity is regulated.
  • antibodies against BDCA-2 also suppress IFN production. However, it differs from BST2 in that BDCA-2 is constitutively expressed in IPC regardless of the activation level of IPC.
  • antibodies against the BDCA-2, IL-12 in has been reported to increase the production (Dzionek, A. et al H um Immunol 63;.. 1133-1348.2002) 0
  • the present inventors have found that BST2 and its homolog can be used as an index of IPC activation, and have completed the present invention. That is, the present invention provides the following IPC activity modulator, preparation method, production method thereof, detection and separation method of activated IPC, measurement method of IPC activation level, or detection of action regulating IPC activation.
  • the present invention relates to a method and a screening method for a substance having the action.
  • An interferon-producing cell activity inhibitor comprising, as an active ingredient, an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog.
  • interferon-producing cell activity inhibitor which is any one or both of S, interferon-producing activity, and interferon-producing cell survival.
  • BST2 and its homologous force A protein comprising the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, selected from the group consisting of [1] ]
  • the interferon-producing cell activity inhibitor described in the above is not limited to:
  • a method for suppressing interferon-producing cell activity comprising a step of contacting an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homologue with an interferon-producing cell.
  • a method for producing an antibody that suppresses the activity of interferon-producing cells comprising the following steps:
  • a method for detecting activated interferon-producing cells comprising the step of detecting the indicator substance according to any one of (a) to (d) below.
  • a method for separating activated interferon-producing cells comprising the step of isolating cells having the indicator substance described in any of (a) to (d) below.
  • activated comprising an antibody recognizing a protein having an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6 Reagent for detecting interferon-producing cells.
  • a continuous base sequence consisting of at least 15 bases selected from the base sequence described in any one of the sequence numbers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • An activated interferon-producing cell detection reagent comprising an oligonucleotide comprising
  • [15] activated comprising an antibody recognizing a protein having an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6 Reagent for separating interferon-producing cells.
  • a method for measuring the level of activation of interferon-producing cells in a living body comprising the following steps.
  • a sample collected from a living body is selected from the group consisting of body fluid, skin, synovial tissue, hematopoietic tissue, pus, alveolar lavage fluid, and biopsy tissue sample that may contain blood cells.
  • a method for detecting an action that regulates the activation of an interferon-producing cell of a test substance comprising the following steps.
  • the cell stimulating agent is at least one cell stimulating agent selected from the group consisting of a virus, a virus component, bacterial DNA, and an interferon.
  • a screening method for a test substance having an action of regulating the activation of interferon-producing cells comprising the following steps.
  • test compound having a greater effect of regulating the activation than the control [21] comprising a test substance selected by the method according to [20] as an active ingredient, of an interferon-producing cell A pharmaceutical composition for regulating activity.
  • An interferon-producing cell comprising an antibody that recognizes a protein having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6.
  • a continuous base sequence consisting of at least 15 bases selected from the base sequences described in any one of the sequence numbers selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • a polynucleotide comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. Ochido;
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, having one or more amino acid sequences substituted, deleted, inserted, and / or added, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • a polynucleide tide that encodes a protein functionally equivalent to a sequence protein
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5;
  • V A polynucleotide encoding the amino acid sequence of positions 139 to 158 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • a protein comprising an amino acid sequence encoded by the polynucleotide according to [24]
  • [30] A transformed cell carrying the polynucleotide according to [24] or a vector containing the polynucleotide.
  • [31] A method for producing the protein according to [25], comprising culturing the transformed cell according to [30] and collecting the protein according to [25] from the culture.
  • a monoclonal antibody comprising a step of culturing the hybridoma 3D3 # 7 deposited as FERM ABP-10339 or the hybridoma 3G7 # 6 deposited as FERM ABP-10340 and recovering the immunoglobulin contained in the culture Alternatively, a method for producing a fragment containing the antigen-binding region.
  • [35] Contains a monoclonal antibody produced by hybridoma 3D3 # 7 deposited as FERM ABP-10339 or hybridoma 3G7 # 6 deposited as FERM ABP-10340, or a fragment containing the antigen-binding region as an active ingredient An inhibitor of interferon-producing cell activity.
  • the present invention provides a technique that acts on activated IPC and suppresses its activity. That is, an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homologue binds to activated IPC and suppresses its activity. An antibody that recognizes either or both of BST2 and its homologue can be used as an inhibitor or method for inhibiting IPC activity. Since BST2 and its homologues are upregulated in activated IPC, the IPC activity inhibitor or suppression method based on the present invention specifically acts on activated IPC.
  • IPC With IPC, few cells produce large amounts of IFN. Neutralization of IFN requires an antibody corresponding to the number of IFN molecules. In the present invention, the activity of the production cell is directly suppressed. As a result, compared to neutralization with anti-IFN antibodies, a stronger IFN suppression effect can be expected with a smaller amount of antibodies. Furthermore, when IFN is produced continuously, neutralization of IFN with an antibody is expected to be only transient suppression. In the present invention, since IPC activity is suppressed, a long-term effect of suppressing IFN production can be expected. In particular, according to a preferred embodiment of the present invention, an antibody that recognizes BST2 or a homologue thereof suppresses not only IFN production of IPC but also the number of cells. These effects act synergistically and IFN production is effectively suppressed.
  • the present invention isolated novel splicing variants BST2H and BST 2HS of BST2 derived from human.
  • the antigen molecule identified in the present invention is specifically expressed in HI HPC and is useful as a marker for HI HPC. That is, the arrangement found in the present invention.
  • a polynucleotide having a base sequence described in any one of the sequence numbers selected from the group consisting of column number: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5 is useful as a marker for IPC.
  • proteins having amino acid sequences encoded by these base sequences are also useful as IPC markers.
  • mouse BST2H and mouse BST2HS which are homologs in mice, were also identified as novel molecules. Like humans, these molecules were thought to be related to the known molecule mouse BST2D in splicing variants. These molecules are useful as markers for mouse IPC.
  • the present invention has revealed that the expression level of BST2 and its homologues increases with the activation of IPC. Therefore, the level of IPC activation can be evaluated using these markers as indices. Furthermore, using these markers as indicators, the effect of regulating the activation of IPC can be evaluated. It is also possible to evaluate the action of various substances to regulate the activation of IPC and to screen for substances having the action. Such screening can find drugs that modulate IPC activation.
  • the drug having the action of regulating the activity of IPC found based on the present invention is useful as a therapeutic agent for autoimmune diseases and allergic diseases.
  • FIG. 1 FACS analysis image of mouse bone marrow cells (IPC-enriched) cultured for 10 days after addition of FLT-3 ligand and stained with the prepared antibody and other markers. .
  • the culture supernatant positive fraction and negative fraction were designated R2 and R3, respectively.
  • R1 & R2 represents an antibody positive cell population
  • R1 & R3 represents an antibody negative cell population.
  • FIG. 2 is a photomicrograph (x400) showing the morphology of cells extracted with each monoclonal antibody.
  • (A) shows the form before infection with influenza virus PR8, and
  • (b) shows the form after incubation with influenza virus PR8 for 24 hours.
  • the cells after infection had dendrites and showed a morphology typical of dendritic cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the interferon-producing ability of cells separated using monoclonal antibody SNK01.
  • the horizontal axis indicates the type of cell treatment, and the vertical axis indicates the IFN a concentration (pg / mL) in the culture supernatant.
  • P (+) on the horizontal axis shows the virus in the cells bound to the monoclonal antibody.
  • N (+) infects cells that did not bind to the monoclonal antibody
  • N (-) does not infect cells that did not bind to the monoclonal antibody. Results are shown.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of monoclonal antibody SNK01 on interferon production ability.
  • the horizontal axis represents the concentration of the antibody used for treatment (x g / mL), and the vertical axis represents the IFN concentration (pg / mL) in the culture supernatant.
  • the horizontal axis (-) indicates the result when virus processing is not performed.
  • S-fraction 1 showed interferon production inhibitory activity in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of Western blotting assay using monoclonal antibody SNK01.
  • the photo shows the results with the anti-His tag antibody, and the bottom shows the results with the monoclonal antibody SNK01 of the present invention.
  • the left side of the photograph is the result of COS7 cells transformed with pcDNA3.1-mBST2DHis, and the right side is pcDNA3.1_mBST2H-His.
  • the results for the precipitate (P) and the supernatant (S) when the cultured cells were lysed were shown.
  • FIG. 7 shows the amino acid sequence and genomic structure of mouse BST2 and its homologue.
  • (A) shows the alignment of amino acid sequences of each isoform, and
  • (b) shows exon mapping.
  • FIG. 8 shows the amino acid sequence and genomic structure of human BST2 and its homologue.
  • (A) shows the alignment of amino acid sequences of each isoform, and
  • (b) shows exon mapping.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of comparing human BST2 mRNA expression levels between tissues and cells.
  • FIG. 11 is a graph showing the influence of the produced monoclonal antibody against human BST2 on the ability to produce interferon.
  • A is a graph showing the effect of the interferon producing ability, in the figure, the horizontal axis is used to process the antibody type and concentration, and the vertical axis in the culture supernatant when stimulated human IPC with HSV Indicates IFN a concentration (pg / mL).
  • B BST2 clones of clones 3D3 # 7 and 3G7 # 6 It is the result of analyzing the reactivity to the type.
  • FIG. 12-1 Wild-type mouse (WT) or IFN receptor knockout mouse (IFNR-KO) cells were stimulated with CpG or influenza virus PR8, and then stained with SNK01 antibody labeled with the fluorescent dye Alexa488. is there.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of SNK01, that is, the expression intensity of BST2, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • A is a diagram analyzing whole spleen cells
  • (b) is a diagram analyzing each cell
  • (c) is a diagram analyzing IPC.
  • FIG. 12-2 is a diagram showing a continuation of FIG. 12_1.
  • FIG. 13 is a diagram showing the expression of BST2 when human IPC was stimulated with IFN using anti-BDCA-4 and BDCA-2 antibodies as markers for human IPC.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of the 5C11 # 7 antibody, that is, the expression intensity of BST2, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • FIG. 14 This figure shows the expression of BST2 when human IPC was stimulated with CpG.
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity of anti-human BST2 antibodies 3E2 # 8 and 5C 11 # 7, that is, the expression intensity of BST2, and the vertical axis indicates the number of cells.
  • Each thick line shows the pattern when stimulated with CpG, and the dotted line shows the unstimulated pattern.
  • FIG. 15 shows an analysis using cells collected from mice administered with anti-mouse BST2 antibody SNK01.
  • A shows the schedule of administration.
  • B shows the IPC ratio in each organ, the horizontal axis shows the administered antibody, and the vertical axis shows the IPC ratio.
  • - Indicates a group in which only PBS was administered instead of the antibody.
  • c shows the concentration of IFN produced when bone marrow cells were stimulated with CpG or influenza virus PR8.
  • the horizontal axis represents the administered antibody.
  • FIG. 16 shows analysis using mice infected with a virus administered with anti-mouse BST2 antibody SNK01.
  • A shows the schedule of administration.
  • B shows the concentration of IFNa in the serum, and the horizontal axis shows the administered antibody.
  • C shows the IPC ratio in the spleen, the horizontal axis shows the administered antibody, and the vertical axis shows the IPC ratio.
  • - Indicates a group in which only PBS was administered instead of the antibody.
  • FIG. 17 is a drawing showing analysis of cells collected from mice administered with anti-mouse BST2 antibody SNK01, clone 12, and control antibody rat IgG (expressed as IgG).
  • (a) shows an example of the results of FACS analysis of the lymph node cells of mice administered with each antibody. The cell fraction indicated by the square is IPC.
  • (B) is a graph showing the percentage of IPC in lymph nodes based on the results of (a).
  • (c) and (d) show the percentage of IPC in the spleen and peripheral blood, The horizontal axis indicates the administered antibody, and the vertical axis indicates the IPC ratio.
  • the present invention relates to an IPC activity inhibitor containing an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a method for suppressing IPC activity, comprising a step of contacting an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog with IPC.
  • the present invention relates to a method for suppressing IPC activity in vivo, comprising the step of administering an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog.
  • the present invention relates to the use of an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog in the production of an IPC activity inhibitor.
  • the IPC is not particularly limited as long as it expresses either or both of human BST2 and its homolog and produces IFN.
  • human and mouse IPCs are preferred as IPCs in the present invention.
  • the expression level of BST2 and its homolog is markedly increased with its activation. Therefore, antibodies that recognize BST2 and its homologues act specifically on activated IPC in humans.
  • human IP C is particularly preferred as the IPC of the present invention.
  • the BST2 gene is a human-derived protein defined by the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is encoded by cDNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • Human BST2 cDNA cloning and monoclonal antibodies have been reported (Ishikawa J. et al. Genomics 26: 527, 1995; GenBank Acc # .D28137) 0 BST2 is a membrane protein that has the ability to support pre-B cell proliferation.
  • White matter Japanese Patent Laid-Open No. 7-196694. Knowledge about the BST2 genomic gene and promoter has also been obtained (WO99 / 43803).
  • human BST2 has been shown to be an antigen recognized by anti-HM1.24 antibody, which is a monoclonal antibody against myeloma (Ohmoto T. et al. BBRC 258: 583, 1999).
  • Anti-HM1.24 antibody is a monoclonal antibody established using human plasma cell line as an immunogen (Goto T. et al. Blood 84: 19 92, 1994). Later, it was revealed that anti-HMl.24 antibody specifically recognizes myeloma, and a humanized antibody was created for the treatment of myeloma (Ozaki S. et al. Blood 93: 3922, 1 999; : WO98 / 14580).
  • Humanized anti-HMl.24 antibody has a therapeutic effect on cancer of hematopoietic tissue (WO02 / 064159).
  • WO02 / 064159 hematopoietic tissue
  • human BST2 is used as a marker in hematopoietic tumors.
  • IPC intracranial pressure
  • BST2 includes a homologue thereof.
  • the homologue of BST2 can be defined as a protein that is functionally equivalent to the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • proteins include naturally occurring proteins.
  • eukaryotic genes have a polymorphism (polymo ⁇ hism), as is known for IFN genes and the like.
  • polymorphism polymorphism
  • a BST2 splicing variant or a mutant caused by a gene polymorphism is included in the BST2 homolog.
  • the present inventors have clarified the presence of a splicing variant for cDNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • This splicing variant consisted of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, and encoded the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • BST2 includes a splicing variant thereof. Therefore, all of these splicing variants are included in human BST2 or mouse BST2.
  • a splicing variant may be described as a subtype.
  • the amino acid sequence may not change even if the base sequence changes due to the polymorphism.
  • Such a nucleotide sequence variation is called a silent variation.
  • a gene comprising a nucleotide sequence having a silent mutation is also included in the present invention.
  • the polymorphism mentioned here means that a certain gene has a different nucleotide sequence among individuals within a population.
  • polymorphisms and mutations are genetically defined by genotype distribution rates.
  • polymorphisms and mutations are used as terms indicating that different base sequences exist regardless of the distribution rate unless otherwise specified.
  • Homologs of BST2 include functionally equivalent proteins in species other than humans.
  • a protein functionally equivalent to BST2 can be identified using, for example, hybridization. That is, a polynucleotide encoding BST2 as shown in SEQ ID NO: 1 or a fragment thereof is used as a probe, and a polynucleotide capable of hybridizing therewith is isolated. When hybridization is performed under stringent conditions, a highly homologous polynucleotide is selected as the base sequence, and as a result, a protein functionally equivalent to BST2 is selected as the isolated protein. Increased possibility of inclusion.
  • the inventors of the present invention have confirmed that antibody activity against homologues of BST2 in mice is similar to that of antibodies in humans and suppresses the activity of mouse IPC.
  • Mouse BST2 had the base sequence set forth in SEQ ID NO: 9 and encoded the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10. Furthermore, the present inventors also confirmed the presence of homologues in mice in the same way for BST2H, a splicing variant of BST2.
  • the base sequence of mouse BST2H is shown in SEQ ID NO: 7, and the amino acid sequence encoded by this base sequence is shown in SEQ ID NO: 8. It was confirmed that the antibody against BST2H in mice also suppresses IPC activity.
  • the stringent conditions specifically include conditions such as 6 X SSC, 40% formamide, hybridization at 25 ° C, and washing at 1 X SSC, 55 ° C.
  • String Diency depends on conditions such as salt concentration, formamide concentration, or temperature.
  • One skilled in the art can adjust these conditions accordingly to obtain the required stringency.
  • a polynucleotide encoding a homologue of BST2 in a non-human animal species can be isolated.
  • a protein encoded by a polynucleotide isolated using a hybridization technique or the like usually has high homology in amino acid sequence with human BST2D (SEQ ID NO: 2).
  • High homology is at least 30. / o or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more (e.g., 95./ 0 or more, or 98./ 0, even 99./ 0 or higher) refers to sequence identity.
  • the identity of nucleotide sequences and amino acid sequences can be examined using a homology search site using the Internet.
  • homology such as FAS TA, BLAST, PSI_BLAST, SSEARCH, etc.
  • BST2 homologues in other species can be found by searching the base sequence information of cDNA or genomic DNA whose structure has already been clarified. That is, similar sequence information is searched by a homology search using a base sequence information of human BST2 and a Z or amino acid sequence information as a query for a database that stores known base sequence information or amino acid sequence information. . If known homologous genes and proteins from other species exist in the database, they can be found by homology search. Even if the full length of the gene has not been identified, the full length sequence of the gene may be constructed by in silico cloning if fragment sequence information such as EST is obtained. A homolog derived from another species thus clarified can be used as a homolog of BST2 in the present invention if the expression in the IPC of the animal species can actually be confirmed.
  • an interferon-producing cell refers to a cell that has an IFN-producing ability and expresses BST2 and its homologues, shifts, or both on the cell surface. It includes the case where either or both of BST2 and its homologues are expressed upon cell activation.
  • IPC interferon-producing cell
  • cells that are progenitor cells of rod cells and produce IFN upon stimulation are preferred as IPC.
  • IPC has not only cells that are dendritic cell progenitor cells but also IFN-producing ability, and BST2 and its homologues on the cell surface, either or both, Cells that express Such an IPC identification method is known.
  • IPC can be distinguished from other blood cells using several cell surface markers as indicators.
  • the cell surface marker profile of HI HPC is as follows (Shortman, K. and Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002).
  • BDCA-2 positive cells positions BDCA-2 positive cells as IPC (Dzi onek, A. et al. J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000.).
  • CD4 positive CD123 positive
  • a cell having an expression profile of these known markers and having the ability to produce IFN can also be referred to as IPC. Furthermore, the expression pattern of the expression profile of these markers Even in a cell group having a profile different from that of the cell, cells in the living body having the ability to produce IFN are included in the IPC.
  • mouse IPC is defined by the following profile.
  • CD l lc, B220, Ly6C, and CD45RB are positive
  • Type-1 interferon A large amount of Type-1 interferon is produced in a short period of time during virus infection
  • IPC activity suppression refers to suppression of at least one of the functions of IPC.
  • the function of IPC can show IFN production and cell survival. Cell survival can be rephrased as the number of cells. Therefore, it is said that IPC activity is suppressed when both or any of these functions are suppressed.
  • Type 1 IFN produced by IPC has been shown to cause various diseases. Therefore, suppressing its production is useful as a therapeutic strategy for these diseases.
  • IFN autoimmune disease pathology
  • IPC IPC-associated fibroblasts
  • suppression of IFN production by IPC refers to suppression of production of at least one type of IFN produced by IPC.
  • a preferred IFN in the present invention is type 1 IFN. IFN is especially important.
  • the present invention relates to an IFN production inhibitor containing an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog as an active ingredient.
  • the present invention provides BST2 And a method for suppressing IFN production, comprising the step of administering an antibody that recognizes the homologue, lag, or both.
  • the present invention relates to the use of an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog in the production of a pharmaceutical composition for suppressing IFN production.
  • IPC includes cells that produce large amounts of IFN with a small number of cells.
  • dendritic cell progenitors stimulated by viruses produce most of the IFN produced by the body. Suppressing the number of IPC cells that produce large amounts of IFN results in suppression of IFN production. Therefore, suppression of the IPC cell number can also alleviate the pathology caused by IFN.
  • An antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog used in the present invention can be prepared using BST2 and its homolog or a fragment thereof as an immunogen.
  • the antibodies in the present invention may be of any class.
  • the species from which the antibody is derived is not limited.
  • a fragment containing an antigen-binding region of an antibody can be used as an antibody.
  • an antibody fragment containing an antigen binding site produced by enzymatic digestion of IgG can also be used as the antibody in the present invention.
  • antibody fragments such as Fab or F (ab ') can be obtained by digestion with papain or trypsin.
  • these antibody fragments can be used as antibody molecules having binding affinity for an antigen.
  • an antibody constructed by gene recombination can be used as long as the necessary antigen-binding activity is maintained.
  • Examples of antibodies constructed by genetic recombination can include chimeric antibodies, CDR-grafted antibodies, single chain Fv, diabody (diabodies), linear antibodies, and multispecific antibodies formed from antibody fragments. . Methods for obtaining these antibodies using any immunogen are known.
  • the antibody can be modified as necessary.
  • an antibody that recognizes BST2 or its homologue, shift, or both has an action of suppressing the number of IPC cells. That is, it was considered that the antibody itself has a cytotoxic effect on IPC.
  • Subclasses of antibodies that exhibit strong effector activity are known. Some can further enhance the IPC activity-inhibiting effect by modifying the antibody with a cytotoxic agent. Cytotoxic substances include the following substances Can be shown.
  • Toxins Pseudomonas aeruginosa toxin (Pseudomonas Endotoxin; PE), diphtheria toxin, ricin radioisotope: Tc "m, Sr 89, I 131, Y 90
  • Anticancer drugs calikiamycin, mitomycin, paclitaxel
  • Toxins that also have protein strength can bind to antibodies or fragments thereof with bifunctional reagents.
  • a fusion protein of both can be obtained by joining a gene encoding a toxin to a gene encoding an antibody.
  • Methods for binding radioisotopes to antibodies are also known. For example, a method for labeling an antibody with a radioisotope using a chelating agent is known.
  • anticancer agents can be bound to antibodies by using sugar chains or bifunctional reagents.
  • the antibody used in the present invention may be an artificially modified antibody.
  • various modification methods for improving the cytotoxic effect and stability of antibodies are known.
  • an immunoglobulin having a modified heavy chain sugar chain is known (Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem. 278: 3466-3473. 2003).
  • the modification of the sugar chain enhanced the ADCC (antibody dependent cell-mediated cytotoxicity) activity of immunoglobulin.
  • immunoglobulins with modified Fc region amino acid sequences are also known. Namely, ADCC activity was enhanced by artificially increasing the binding activity of immunoglobulin to the Fc receptor (Shield, RL. Et al. J. Biol. Chem. 27 6; 6591-6604, 2001. ).
  • IgG bound to the Fc receptor is once taken up into cells. Subsequently, it has been revealed that it binds to Fc receptors expressed in endosomes and is released into the blood again. IgG with high Fc receptor binding activity is more likely to be released into the blood after being taken up by cells. As a result, the residence time of IgG in the blood is extended (Hinton'PR. Et al. J Biol Chem. 279: 6213-6216. 2004).
  • modification of the amino acid sequence of the Fc region is said to result in a change in CDC (Complement-dependent cytotoxicity) activity. Antibodies with these modifications can be used as antibodies in the present invention.
  • a monoclonal antibody is an antibody-producing cell that produces the monoclonal antibody. Force can be collected.
  • Monoclonal antibody-producing cells that can be used in the present invention include, for example, BST2 or a homolog thereof, a fragment thereof, a cell that produces them, or a cell membrane fraction thereof administered to an immunized animal as an immunogen, It can be obtained by cloning. That is, the present invention provides a method for producing an antibody that suppresses the activity of IPC, including the following steps.
  • a step of recovering an antibody that suppresses the activity of interferon-producing cells from the culture of (3) In a general method for producing a monoclonal antibody, a hyperidoma obtained by cell fusion of immune cells and tumor cells is used. Used as antibody-producing cells.
  • BST2 or a homologue thereof, or a fragment thereof can be used as an immunogen in the present invention.
  • the immunogen can be purified from cells transformed with the gene encoding it.
  • cells expressing BST2 or a homologue thereof can be used as an immunogen. Specific examples of such cells include the following cells.
  • the cell membrane fraction of these cells can also be used as an immunogen.
  • a target cell may be collected based on the expression profile of a cell surface marker as described above.
  • Methods for collecting specific cells using a plurality of cell surface markers as an index are known. For example, by using immunostaining and a cell sorter, cells that meet the target expression profile can be easily sorted.
  • human IPC selects BDCA-2 positive cells By doing so, IPC is concentrated. IPCs collected from humans are used as an immunogen after being activated as necessary.
  • IPC can also be obtained as cultured cells in addition to the peripheral blood or hematopoietic tissue of a living body. For example, it can be obtained in large quantities by culturing human and mouse hematopoietic stem cells and differentiating them into IPC. Conditions for differentiating human and mouse hematopoietic stem cells into IPC in vitro are known.
  • differentiation into IPC is induced by culturing a cell population containing hematopoietic stem cells in the presence of an IPC inducer.
  • a cell population containing hematopoietic stem cells for example, bone marrow cells can be used.
  • the IPC inducer FLT-3 ligand or a combination of FLT-3 ligand and thrombopoietin (TPO) can be used.
  • the concentration of FLT-3 ligand in the medium can be usually 1 to 100 ng / mL.
  • general blood cell culture conditions may be applied. That is, RPMI1640 or the like can be used as the basal medium, and about 10% fetal calf serum can be added.
  • Yssel's Medium was used for induction of HPC. Differentiation into IPC in vitro peaks in humans, for example, around 25 days.
  • IPC for the immunogen can be obtained.
  • cells with cell surface antigens characteristic of IPC are sorted using several cell surface markers. That is, for example, BDCA-2 positive cells can be obtained as HCHP.
  • CDl lc positive, CDl lb negative, and B220 positive cell fractions can be sorted using a cell sorter to obtain mouse IPC.
  • the antibody-positive cells can be sorted as IPC.
  • Mouse IPC-specific antigen established by the present inventors Monoclonal antibody-producing cell 2E6 (WO 2004/013325, FERM-BP-8445) that recognizes can be used for sorting of mouse IPC.
  • IPC can also be used to collect peripheral blood force.
  • the population of IPC in peripheral blood is extremely low, so a large amount of blood is required to collect peripheral blood IPC. Therefore, it is advantageous to use cells differentiated from hematopoietic stem cells for IPC as an immunogen.
  • a protein containing the amino acid sequence 1J described in any one of SEQ ID NO: selected from the group consisting of: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, or a fragment thereof can also be used as an immunogen.
  • the monoclonal antibody of the present invention recognizes, as an antigen, a protein comprising the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, whichever is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6. It was revealed that Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by using these proteins as immunogens.
  • a protein containing the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6 can be obtained as a recombinant.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 1 encodes the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 3 encodes the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4. Therefore, if the DNA consisting of these base sequences is expressed using an appropriate host vector, the target protein can be obtained.
  • an oligopeptide having a continuous amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in any one of SEQ ID NOs: 2 selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6 It can also be an immunogen.
  • the amino acid sequence to be selected as an immunogen consists of, for example, about 5-50, preferably about 7-20 amino acids.
  • Methods for obtaining oligopeptides having an arbitrary amino acid sequence are known.
  • an amino acid can be chemically bonded to obtain an oligopeptide having the target amino acid sequence.
  • a fragment having a predetermined amino acid sequence can be obtained by cleaving a protein having a full-length amino acid sequence obtained as the above recombinant.
  • the resulting oligopeptide can be made more immunogenic by binding to an appropriate carrier protein. it can.
  • the carrier protein keyhole limpet Hesiyaninu serum serum albumin and the like are used.
  • two specific proteins can be distinguished from the other by using an amino acid sequence shared by the two types.
  • a monoclonal antibody that specifically identifies each protein can be obtained by using an amino acid sequence unique to each amino acid sequence.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 the amino acid sequence IJ of N-terminal force et al. 139 to 158 is an amino acid sequence unique to SEQ ID NO: 4.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 it is an amino acid sequence unique to SEQ ID NO: 6 from 96 to 100 from the N-terminal.
  • An antibody that recognizes an epitope composed of such an amino acid sequence can act on a cell that expresses a subtype recognized by the antibody and regulate its activity.
  • SEQ ID NO: 4 (hBST2H) specific antibody 3D3 # 7 regulated the activity of IPC.
  • an appropriate immunized animal is subsequently immunized with an immunogen.
  • IPC can be administered to an immunized animal with a suitable adjuvant.
  • the protein described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, or a peptide consisting of a partial amino acid sequence thereof, together with an adjuvant is given to an immunized animal. Can be administered.
  • transformation is carried out so that DNA encoding the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6 can be expressed.
  • Cells can be used as immunogens.
  • a DNA containing a base sequence constituting the coding region of the sequence is preferred as the DNA.
  • a host cell for use as an immunogen can be a cell derived from the same species as the immunized animal. By using the same type of cells, it is possible to induce a specific immune response against foreign proteins. For example, if a rat is used as an immunized animal, it is advantageous to use a host cell derived from the rat.
  • a fraction of transformed cells containing the protein can also be used as an immunogen. As shown in the Examples, a transmembrane domain is found in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 6. It was (the transmembrane region of FIG.
  • proteins having these amino acid sequences can be expressed on the cell membrane.
  • a larger amount of the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10 was detected in the precipitate fraction of the transformant culture. Therefore, the cell membrane fraction of cells expressing the above protein can be used as an immunogen.
  • the immunized animal in the present invention can use any non-human vertebrate that recognizes IPC as a foreign substance.
  • an animal for which a fusion partner for obtaining a hyperpridoma is readily available is advantageous.
  • hybridomas derived from cells such as mice, rats, rabbits, bushes, and goats has been established.
  • These immunized animals can be used in the present invention.
  • Freund's complete adjuvant or Freund's incomplete adjuvant is used as the adjuvant.
  • the immunized animal is immunized multiple times at intervals of 3 to 10 days.
  • the number of IPCs used for one immunization is arbitrary. Usually, 10 3 to: 10 8 , eg 10 6 IPCs are immunized.
  • immunization with protein peptide is immunized with 1 to 100 xg.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by collecting immunocompetent cells from an immunized animal that has undergone multiple immunizations and cloning cells that produce the desired antibody.
  • An immunocompetent cell refers to a cell having antibody-producing ability in an immunized animal.
  • Immunocompetent cells can be cloned, for example, by the hypridoma method.
  • immunocompetent cells one cell produces one kind of antibody. Therefore, if a cell population derived from one cell can be established (that is, cloning), a monoclonal antibody can be obtained.
  • the ibridoma method refers to a method in which immunocompetent cells are fused with an appropriate cell line, immortalized, and then cloned. Many cell lines useful for the hybridoma method are known. These cell lines are excellent in the immortalization efficiency of lymphocyte cells and have various genetic markers necessary for selection of cells successfully fused. Furthermore, for the purpose of obtaining antibody-producing cells, a cell line lacking antibody-producing ability can also be used.
  • mouse myeloma P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) is widely used as a cell line useful for mouse and rat Ito cell fusion.
  • mouse IP C is used as an immunogen
  • the immunized animal is an animal other than a mouse.
  • a hyperidoma is produced by fusion of cells of the same type, but a monoclonal antibody can be obtained from a heterohybridoma between closely related species.
  • a cell that has succeeded in cell fusion is selected based on a selection marker possessed by the fused cell. For example, when a HAT-sensitive cell line is used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion are selected by selecting cells that grow in HAT medium. Furthermore, confirm that the antibody produced by the selected cells has the desired reactivity.
  • each hybridoma is screened based on the reactivity of the antibody. That is, a hybridoma that produces an antibody that binds to either or both of BST2 and its homolog is selected. Preferably, the selected hyperidoma is subcloned, and when the production of the target antibody is finally confirmed, it is selected as the hyperidoma that produces the monoclonal antibody of the present invention.
  • a protein comprising the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 2, selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6, and parts thereof A peptide consisting of an amino acid sequence can be screened as an antigen.
  • the antigen is bound to an appropriate solid phase, and the monoclonal antibody that binds to the antigen can be detected by a labeled antibody that recognizes the immunoglobulin of the immunized animal.
  • Monoclonal antibodies can be rapidly screened by using the EUSA method using an enzyme-labeled antibody by binding an antigen to the inner wall of the microplate.
  • Monoclonal antibodies that have been confirmed to have an antigen-binding activity are actually confirmed to have an effect on IPC activity as needed.
  • the effect on IP C can be confirmed by, for example, a method described later.
  • Such a monoclonal antibody can be expressed by obtaining a cDNA encoding the antigen-binding region of the high-pridoma antibody and inserting it into an appropriate expression vector.
  • Techniques for obtaining cDNA encoding the variable region of an antibody and expressing it in an appropriate host cell are known.
  • Also known is a technique for producing a chimeric antibody by binding a variable region containing an antigen-binding region to a constant region.
  • the antigen-binding activity of the monoclonal antibody can be transplanted to other immunoglobulins.
  • the immunoglobulin antigen-binding region is composed of a complementarity determining region (CDR) and a frame region.
  • CDR complementarity determining region
  • the antigen-binding properties of each immunoglobulin are determined by CDR, and the frame maintains the structure of the antigen-binding region. While the CDR amino acid sequences are extremely diverse, the amino acid sequence in the frame portion is highly conserved. It is known that antigen-binding activity can also be transplanted by incorporating the CDR antigen into the frame region of another immunoglobulin molecule. Using this method, a method has been established for transplanting the antigen-binding properties of different types of immunoglobulins to human immunoglobulins.
  • any monoclonal antibody prepared in this manner can be used in the present invention. That is, a monoclonal antibody consisting of an immunoglobulin containing an antigen-binding region encoded by a polynucleotide derived from cDNA encoding the antigen-binding region of the monoclonal antibody can be used in the present invention.
  • hyperidoma producing a monoclonal antibody that can be used in the present invention
  • high-pridor 3D3 # 7 or 3G7 # 6 can be indicated.
  • Hypridoma 3 D3 # 7 and Hybridoma 3G7 # 6 were registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center on May 27, 2005, with receipt number FERM ABP-10339 and receipt number FERM. Deposited as ABP-10340. The contents specifying the deposit are described below.
  • the monoclonal antibody for use in the present invention can be recovered from the culture by culturing the hybridoma producing it.
  • Hypridoma can be cultured in vitro or in vivo. In vitro, Hypridoma can be cultured using a known medium such as RPMI1640.
  • the immunoglobulin secreted by the hyperidoma accumulates in the culture supernatant. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by collecting the culture supernatant and purifying it as necessary. Immunoglobulin can be easily purified without adding serum to the medium. However, for the purpose of more rapid growth of hyperidoma and promotion of antibody production, it is possible to remove about 10% of urine fetal serum in the medium.
  • Hypridoma can also be cultured in vivo. Specifically, a hyperidoma can be cultured in the peritoneal cavity by inoculating the peritoneal cavity of a nude mouse. Monoclonal antibodies accumulate in ascites. Therefore, the necessary monoclonal antibodies can be obtained by collecting ascites and purifying it as necessary. The obtained monoclonal antibody can be appropriately modified or processed according to the purpose.
  • An IPC activity inhibitor comprising at least one selected component as an active ingredient is provided.
  • the present invention relates to a method for inhibiting IPC activity, comprising a step of administering at least one component selected from the group consisting of the following (a) to (c).
  • the present invention relates to the use of at least one component selected from the group consisting of the following (a) to (c) in the production of an IPC activity regulator.
  • the monoclonal antibody that suppresses the activity of IPC includes a protein having an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NO: selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6.
  • Monoclonal antibodies that recognize can be used.
  • a plurality of types of monoclonal antibodies that recognize a specific BST2 or a subtype thereof can be formulated and used in the present invention.
  • IPC produces large amounts of IFN upon viral stimulation. Before and after virus stimulation of IPC, give antibody at the same time as virus stimulation, and compare the ability of IFN to produce IPC without antibody. The ability to produce IFN can be evaluated by measuring IFN-chicken IFN_j3 contained in the culture supernatant of IPC. As a result of the comparison, if the amount of IFN in the supernatant is significantly reduced by the addition of the antibody, it can be confirmed that the tested antibody has an action of suppressing IFN production ability. Methods for measuring these IFNs are known. I PC is a cell that produces most of IFN in the living body. Therefore, the production state of IFN in the living body can be regulated by suppressing the IFN production ability of IPC.
  • IPC activity includes maintenance of the number of cells of IPC. Therefore, the present invention Inhibition of the activity of IPC includes suppression of the number of IPC cells. Similar to IFN production, IPC activation is induced by stimulating infectious viruses. If it is confirmed that the number of activated IPC cells is suppressed in the presence of the antibody, it can be seen that the antibody suppresses the activity of IPC. As a comparative control, inactive immunoglobulin derived from the same animal species as the antibody whose activity is to be confirmed can be used, as in IFN production. The number of cells in IPC can be compared quantitatively by counting cells. The number of cells can be counted with a FACS microscope.
  • IPC is also said to differentiate into a cell that induces Th2, called DC 2 (Dendritic Cell 2), as a result of infection with a virus or the like. If the IFN production of IPC by virus stimulation can be suppressed, differentiation into Th2 may also be suppressed. Therefore, the monoclonal antibody of the present invention that suppresses IFN production can be expected to have therapeutic effects on various allergic diseases.
  • DC 2 Dense Cell 2
  • an antibody that recognizes either or both of BST2 and its homolog is administered to a host different from the species from which the antibody originates, it is processed into a form that is difficult for the host to recognize as a foreign substance. Is desirable. For example, by processing into the following molecules, it is possible to make it difficult to recognize immunoglobulin as a foreign substance. Techniques for processing an immunoglobulin molecule as follows are known.
  • a chimeric antibody composed of the antigen-binding domain of a monoclonal antibody and the constant domain of the host immunoglobulin (Gene Expression Experiment MANUANO Kodansha 1994 (Ishida Isao, Ando Tamie))
  • CDR-substituted antibody in which complementarity-determining region (CDR) in host immunoglobulin is replaced with CDR of monoclonal antibody
  • a non-human animal into which a human antibody gene has been incorporated as an immunized animal it is possible to obtain a human antibody while using the non-human animal.
  • transgenic mice with human antibody gene S which can be used as immunized animals to produce human antibodies.
  • human antibodies that recognize BST2 using human BST2 as an antigen.
  • Human antibodies are preferred antibodies for administration to humans.
  • the human immunoglobulin variable region gene can also be obtained by Kretzschmar T et.al, Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec; 13 (6): 598_602.).
  • a gene encoding a human immunoglobulin variable region is incorporated into a phage gene.
  • a phage library can also be created using various immunoglobulin genes as sources.
  • the phage expresses the variable region as a fusion protein of its constituent proteins.
  • the variable region of the phage surface expressed by the phage maintains the binding activity to the antigen.
  • a phage that binds to an antigen or a cell expressing the antigen a phage expressing a variable region having the desired binding activity can be screened from a phage library. Furthermore, the phage particles thus selected retain a gene that codes for a variable region having the desired binding activity. That is, in the phage display method, a gene that encodes a variable region having a target binding activity can be obtained using the binding activity of the variable region as an index.
  • an antibody or fragment thereof that recognizes either or both of BST2 and its homologues is a protein or a polynucleotide encoding the same.
  • An enhancer can also be placed in the vector.
  • Vectors that retain the heavy and light chain genes that make up immunoglobulin and are capable of expressing immunoglobulin molecules are known.
  • a vector capable of expressing immunoglobulin can be administered by introduction into a cell.
  • those that can infect cells by administration to a living body can be administered as they are. Or once from the living body It is also possible to introduce the vector into the separated lymphocytes and return them to the living body (ex vivo).
  • the amount of the monoclonal antibody administered to a living body is usually 0.5 mg to 10 Omg, for example, lmg to 50 mg per kg body weight as immunoglobulin. Preferably, it is 2 mg to 10 mg.
  • the administration interval of the antibody to the living body can be appropriately adjusted so that the effective concentration of immunoglobulin in the living body during the treatment period can be maintained. Specifically, for example, it can be administered at intervals of 1 to 2 weeks.
  • the administration route is arbitrary. One skilled in the art can appropriately select an effective route of administration for treatment. Specifically, it can indicate oral or parenteral administration.
  • the antibody can be administered systemically or locally by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, or subcutaneous injection.
  • preparations suitable for parenteral administration in the present invention include injections, suppositories, and sprays.
  • it is usually 1 ⁇ g / mL, preferably ⁇ g / mL or more, more preferably 50 / ig / mL or more, further preferably 0.5 mg / mL or more in the culture medium.
  • the monoclonal antibody can be administered to a living body by any method. Normally, monoclonal antibodies are combined with a pharmaceutically acceptable carrier. Monoclonal antibodies can contain additives such as thickeners, stabilizers, preservatives, and solubilizers as necessary. Such carriers or additives include latatose, citrate, stearic acid, magnesium stearate, sucrose, starch, talc, dielatin, agar, vegetable oil, ethylene glycol and the like.
  • pharmaceutically acceptable refers to animals, mammals, and especially humans, as approved by national supervisory authorities or national pharmacopoeias or generally recognized pharmacopoeias.
  • the IPC activity inhibitor of the present invention can also be supplied in the form of one or more doses of lyophilized powder or tablets.
  • the lyophilized powder or tablet may be further combined with sterile water for injection, physiological saline or buffer to dissolve the composition to the desired concentration prior to administration. .
  • each plasmid is expressed as 0.:! 10 mg, for example 1-5 mg can be administered.
  • 1-5 ⁇ g / 10 6 cell vectors are used for introduction into cells in vitro.
  • the present invention relates to a method for detecting activated IPC, comprising the step of detecting the indicator substance described in any of (a) to (d) below.
  • a polynucleotide comprising a contiguous base sequence selected from the base sequences described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • Activation markers can be detected by the presence of a protein or mRNA encoding the protein.
  • Proteins and mRNAs can be partial sequences as well as full lengths. When a partial sequence is to be detected, it is preferable to select a sequence having a length that can be expected to be specific. For example, in mRNA, generally, a continuous base sequence of 10b or more, preferably 15b or more, for example, about 15 to 500b is detected.
  • a polynucleotide such as the indicator substance (a) or (b) can be detected by hybridizing an oligonucleotide having a base sequence complementary to each base sequence.
  • proteins such as (c) or (d) It can be detected immunologically using an antibody that recognizes the protein.
  • the detection of activated IPC refers to confirming that cells constituting the sample contain IPC activated by some stimulus.
  • detecting activated IPC according to the present invention it is possible to clarify that IPC is in an activated state in the living body or tissue from which the sample is derived.
  • the activation level of IPC in a living body can be examined using the method of the present invention. That is, the present invention relates to a method for measuring the level of IPC activation in a living body, comprising the following steps.
  • a polynucleotide comprising a contiguous base sequence selected from the base sequences described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • any sample that may contain IPC can be used as a sample from which vitality is also collected.
  • Typical samples are body fluids, skin, synovial tissue, hematopoietic tissue, pus, alveolar lavage fluid, and other biopsy tissue samples that may contain blood cells.
  • the body fluid includes blood, spinal fluid, joint fluid, urine, tears, saliva, nasal discharge and the like.
  • Hematopoietic tissues include bone marrow and spleen.
  • peripheral blood can be used as a sample. Detect cells expressing any of the above markers in these tissues As a result, the number of activated IPCs can be known.
  • the ratio of the number of activated IPCs obtained to the total IPC it is possible to correlate the level of IPC activation in the living body with the number of cells in which the marker is detected.
  • a marker that can detect unactivated IPC can be used.
  • BDCA2 or BDCA4 can be indicated as such a marker.
  • the number of cells expressing these markers can be counted to determine the total number of IPCs.
  • the ratio of (number of BDCA2-positive cells) :( number of BST2 or its splicing variant-positive cells) indicates the ratio of activated IPC to IPC. It can be seen that the higher the percentage of activated IPC, the higher the activation level of the subject's IPC.
  • the expression level of the indicator substance detected in the biological sample can be correlated with the level of activation of the interferon-producing cells of the subject.
  • the indicator substance can hardly detect expression in an IPC that is not activated. Therefore, it can be said that the expression level of the indicator substance is directly correlated with the activation level of IPC. For this reason, when the expression level of the indicator substance in the biological sample is high, the activation level of IPC is increased in the biological sample of the subject. In other words, an increase in the activation level of IPC in a biological sample is detected by an increase in the expression level of the indicator substance.
  • the expression level of the indicator substance is determined by the level of activation of each cell of IPC and the number of activated cells.
  • the activation level of IPC can be evaluated based on the sum of the expression levels of the indicator substances, without necessarily evaluating both independently.
  • the expression of the above-mentioned indicator substance in inactive IPC cannot be detected, it is based on the expression level of the indicator substance alone without obtaining the number of indicator substance positive (or negative) cells. The level of activation can be evaluated.
  • IPC is an important cell that supports the immune system in the living body through production of IFN and the like. Therefore, knowing its activation has clinical significance. For example, if the activation level of the activated IPC or the activation level of the subject's IPC is confirmed by the present invention, it can be known that the subject's immune system is in an activated state. Specifically, autoimmune diseases and infections such as viruses are suspected. For example, accumulation of IPC in skin lesions of patients with systemic lupus erythematosus has been reported (Farkas, L. et al. Am. J. Pathol. 159: 237-243.2001).
  • the type of site force in which production is induced by infection may differ depending on the type of virus (Dalod, M. et al. J. Exp. Med. 195: 517-528.2002). Therefore, if the type of virus that specifically stimulates the activation of IPC is clarified in advance by the method of the present invention, the activation of IPC is one of diagnostic materials for identifying the type of virus that is the source of infection. Can be.
  • the present invention relates to a method for detecting an autoimmune disease or viral infection comprising the following steps.
  • a polynucleotide comprising a continuous base sequence selected from the base sequences described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • a protein comprising a continuous amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in any one of SEQ ID NOs: 2 selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6
  • an autoimmune disease or viral infection is detected when the number of cells or expression level measured in (1) is higher than that of the control.
  • a measurement result of a healthy person can be used as a control.
  • changes in symptoms of autoimmune disease or viral infection of the subject can be traced.
  • the detection method or the activation level measurement method of the present invention can be implemented as follows, for example.
  • a sample containing cells is contacted with a monoclonal antibody, and an antibody that binds to the marker is bound to IPC in the sample.
  • the cell sample and the antibody are contacted under conditions that allow the immunological binding activity of the antibody to be maintained. Specifically, it is desirable to make contact at a pH of slightly acidic to weakly alkaline and a salt concentration close to physiological saline.
  • the sample can be any sample that may contain IPC.
  • a peripheral blood lymphocyte population or a lymphoid tissue such as a lymph node or spleen can be used as a sample. Methods for preparing these cell samples are known.
  • hematopoietic stem cells can be differentiated into IPCs and used as cell samples. A method for differentiating a cell population containing hematopoietic stem cells into IPC in vitro or in vivo is known. Detection or identification of artificially differentiated IPC is useful in searching for conditions necessary for differentiation into IPC.
  • activated IPC can be detected by labeling an anti-BST2 antibody and following the label.
  • Methods for labeling antibodies are known.
  • the antibody can be labeled with a component such as an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a binding affinity substance, a microbead, or a radioisotope.
  • Methods for binding these components to antibodies are also known.
  • an enzyme, a fluorescent substance, or microbeads can be directly bound to an antibody using a bifunctional reagent such as a maleimide derivative.
  • the antibody can be physically adsorbed on the surface of the microbead.
  • the antibody can be bound to an appropriate solid phase.
  • the inner wall of a plate or tube, the inner wall of a column or capillary, or the surface of a beaded solid phase is used as the solid phase.
  • the antibody of the present invention can also be indirectly labeled.
  • a rat-derived antibody It can be indirectly labeled with a labeled antibody that recognizes rat immunoglobulin.
  • a labeled antibody for indirectly labeling an antibody is generally called a secondary antibody.
  • the labeling of the antibody can be traced by using a technique corresponding to each labeling component.
  • a technique corresponding to each labeling component for example, in the case of a fluorescent substance, fluorescence can be detected by irradiation with excitation light.
  • the label can be traced using the product of the enzyme reaction as an index.
  • cells that have reacted with the antibody can also be separated.
  • Antibodies that recognize different cell surface antigens can also be used for cell separation. That is, a combination of the antibody against the best and any antibody that recognizes IPC is used. For example, an IPC is specifically captured by contacting a cell population with an antibody specific to IPC immobilized on beads. Next, an arbitrary antibody that recognizes IPC is bound to the captured IPC. If any antibody that recognizes IPC is used as a labeled antibody, the ability to detect activated IPC can be detected.
  • an antibody that binds to BST2 and / or a splicing variant thereof can be used as a reagent for detecting activated IPC.
  • a kit for measuring the IPC activation level of a subject can be provided.
  • the IPC detection reagent refers to a reagent capable of detecting IPC regardless of the degree of activation.
  • an IPC detection reagent for example, an antibody that recognizes BDCA2 or BDCA4 can be shown.
  • the activated IPC detection reagent and the antibody in the IPC detection reagent of the present invention can be labeled with a labeling component as described above.
  • the antibody used in these reagents can be any fragment containing its antigen binding region. Accordingly, not only a complete immunoglobulin molecule but also a fragment retaining the antigen-binding activity of immunoglobulin can be used. Examples of such a fragment include F (ab) 2, Fab, and the like.
  • the detection method of the present invention can also be implemented, for example, as follows. That is, the index (a) or (b) is detected for mRNA contained in a cell sample.
  • Preferred finger As a marker, mention may be made in particular of mRNA or mRNA-induced cDNA.
  • the indicator (a) or (b) it was selected from any one of the nucleotide sequences described in SEQ ID NO: selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • An oligonucleotide having a base sequence complementary to a continuous base sequence can be used.
  • oligonucleotide for example, DNA, RNA or a derivative thereof having a length of 10-50b, preferably 15-30b can be used.
  • DNA can be synthesized chemically. In the synthesis, it is possible to obtain a cocoon derivative by using a derivative having fluorescence activity.
  • the oligonucleotide hybridizes to a polynucleotide having a complementary base sequence. By detecting this hybrid, it is possible to know the presence of mRNA having a base sequence to be detected. For example, by Northern blotting, it can be directly known that the target mRNA is contained in the mRNA. Some labs can also detect the presence of the mRNA of interest using RT-PCR. Furthermore, mRNA contained in cells can be directly analyzed by in situ hybridization or in situ PCR. All of these analysis methods are known.
  • the oligonucleotide that can be used in the detection method of the present invention can be used as a reagent for detecting activated IPC.
  • the oligonucleotide in the detection reagent for activated IPC of the present invention can be labeled.
  • a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive substance, or a binding affinity substance can be used as the label.
  • Known fluorescent substances include FITC and rhodamine. Piotin or digoxigenin is used as the binding affinity substance.
  • the oligonucleotide salt sequence used for detecting the activated IPC of the present invention is described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5. It consists of a base sequence complementary to the base sequence. To achieve specific hybridization, the base sequence does not necessarily have to be completely complementary to the target base sequence. If the required specificity can be achieved under stringent conditions, sequence variations are permissible. An oligonucleotide with a set base sequence can be obtained by chemical synthesis. And if you add the appropriate label to the oligonucleotide, It can be used for format hybridization.
  • Oligonucleotides according to the present invention include not only basic PCR, but also RT-PCR using RNA as a cage, nested PCR that allows high-sensitivity detection by nesting amplification regions, or cDNA synthesis, etc. It can be applied to various complementary strand synthesis reactions.
  • the level of IPC activation in a living body can be measured on the basis of a method using a hybridization assay or nucleic acid amplification, as in the method using an antibody. That is, by clarifying the ratio of the activated IPC detected by the present invention to the entire IPC, the level of IPC activation in the living body can be known.
  • a marker that can reflect the entire IPC the above-described BDCA2 and BDCA4 can be used. Measurement of markers by hybridization assay or nucleic acid amplification cannot directly determine the number of cells. However, results obtained with total RNA or total mRNA extracted from the sample reflect the number of cells expressing each marker. Therefore, the level of activation can be clarified by comparing the expression level of each marker.
  • genes whose expression levels are kept constant can be used to correct the number of cells.
  • actin or dalyseraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GPDH
  • the present invention provides a method for separating activated IPC using BST2 or a homologue thereof as an index. That is, the present invention relates to a method for separating activated IPC, comprising the step of isolating a cell having the indicator substance described in any of the following (a) _ (d).
  • a polynucleotide comprising a contiguous base sequence selected from the base sequences described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5 Ochido
  • the antibody that binds to the indicator substance can be bound to a labeling component or a solid phase in the same manner as the antibody in the detection method.
  • Activated IPC can be separated by binding a cell population containing activated IPC to an antibody against the marker (c) or (d), and then sorting the cells bound to the antibody.
  • activated IPC can be separated by tracking the labeling component and sorting out cells to which the labeling component is bound.
  • the activated IPC can be separated by recovering the solid phase.
  • a method for separating activated IPC using an antibody will be specifically described.
  • a method in which an antibody is immobilized on a water-insoluble carrier and cells are directly or indirectly bound thereto can be used.
  • the water-insoluble carrier beads or a matrix made of a cellulose derivative such as agarose is used.
  • the water-insoluble carrier on which the antibody is immobilized can be packed in a column to form an immunoadsorption column.
  • the active IPC captured by the antibody on the insoluble carrier can be eluted with a buffer that dissociates the immunological binding.
  • a fluorescent antibody-labeled cell separation method or a separation method using immunomagnetic beads can be used.
  • it is a method of separating target cells one by one, using antibody-bound cells as a fluorescent label or magnetic label.
  • a cell sorter such as FACS or MACS. Cell separation methods using a cell sorter are known.
  • an antibody recognizing a marker is brought into contact with a cell population containing activated IPC. After washing the cells with PBS, the secondary antibody is then reacted. If the antibody against the marker is mouse IgG, a secondary antibody such as a pyotin anti-mouse IgG antibody can be used. Alternatively, an antibody against the marker is previously If biotinylated, secondary antibodies are not necessary.
  • the streptavidin magnetic beads are reacted. Thus, magnetic beads are bound to the activated IPC. By passing the obtained cells through a magnetic column, the activated IPC can be captured by a force ram.
  • the activated IPC can be recovered by eluting the cells remaining in the column. If MACS is used, the operation is completed in about 30 minutes. That is, the separation method of the present invention is useful as a method for preparing a large amount of activated IPC that can be found only in a small amount in a living body.
  • the present invention relates to a method for separating activated IPC, comprising the step of isolating a cell having the indicator substance described in any of the indicator substances (a) _ (d).
  • the present invention revealed that the indicator substances ( a ) to (d) can be used as specific markers for activated IPC. Therefore, activated IPC can be separated by isolating cells in which these indicator substances are detected.
  • the method for detecting these indicator substances is as described above.
  • the present inventors have confirmed that the expression of the indicator substances (a) to (d) is enhanced by IPC virus stimulation. Based on this finding, the level of IPC activation can be determined by measuring the indicator substances (a) to (d). That is, the present invention provides a method for measuring the activation level of IPC, comprising the following steps.
  • activated IPC is detected when the expression level of the indicator substance measured in (1) is higher than that of IPC that is not stimulated.
  • the present invention provides a method for measuring the action of regulating the activation of IPC using the indicator substance (a) _ (d) in IPC as an indicator. That is, the present invention provides a method for detecting an action of the test substance that regulates the activation of IFN-producing cells, comprising the following steps.
  • a polynucleotide comprising a contiguous base sequence selected from the base sequences described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • the cell stimulator refers to a substance capable of inducing IPC activation.
  • viruses and virus components can be indicated as cell stimulants.
  • IPC is activated by administration of viruses such as simple herpes virus (Hen ⁇ es simplex virus; HSV) or influenza virus (Influenza virus). Yes.
  • viruses such as simple herpes virus (Hen ⁇ es simplex virus; HSV) or influenza virus (Influenza virus). Yes.
  • the IPC activation action of CpG which is DNA in bacteria, is also known.
  • activation of IPC by contact with interferon is also known.
  • IPC itself is activated by IFN- ⁇ .
  • These cell stimulants may be used alone or in combination with different cell stimulants.
  • the cell stimulant and the test substance may be contacted with the IPC at the same time, or the IPC and the test substance may be contacted before or after the contact with the cell stimulant.
  • the cell stimulant, IPC, and test substance can be contacted in vitro, in vivo, or ex vivo.
  • cell stimulants and test substances can be contacted with IPC in any order as described above under conditions where IPC can be cultured.
  • IPC is collected after administering a test substance or cell stimulating substance to IPC in vivo. After the collected IPC is contacted with a cell stimulating substance or a test substance in vitro, the level of cell activation can be evaluated. The level of cell activation can be evaluated by changes in the concentration of IFN produced by the cells.
  • a cell stimulant or test substance is brought into contact with IPC prepared in vitro.
  • the contacted IPC is administered to the body, and then the test substance or cell stimulant is administered.
  • the level of IPC activation in vivo is evaluated, and the effect of the test substance is evaluated.
  • the level of IPC activation can be evaluated using, for example, the level of IFN in the blood as an indicator.
  • the preparation of IPC in vitro means that IPC is collected from a living body or that IPC is artificially prepared by inducing differentiation of IPC progenitor cells.
  • IFN production can be regulated by regulating its activation.
  • modulation of IPC activation includes suppression or enhancement of activation.
  • a substance capable of enhancing IPC activation is useful as an enhancer of IFN production.
  • substances that can suppress IPC activation can be used as inhibitors of IFN production.
  • a substance whose influence on IPC activation is known in advance can be used in place of the test substance.
  • saline is a substance that does not affect IPC activation.
  • the action of a test compound can be evaluated by using a substance that has been confirmed to enhance or suppress the activation of IPC, and by comparing it with the substance.
  • the reagent for measuring the indicators (a) to (d) can be used as a reagent for measuring the action of regulating the activation of IPC according to the present invention.
  • an oligonucleotide comprising a continuous base sequence consisting of at least 15 bases selected from the base sequences described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • an antibody that recognizes either or both of BST2 and its splicing variant can be used.
  • the reagent for measuring the effect of regulating the activation of IPC according to the present invention is further combined with a cell stimulant for activating IPC, a medium for culturing IPC, a culture vessel, and the like. You can also. In addition, substances with clear effects on IPC activation can be combined as controls.
  • a method for screening a substance having an action of regulating IPC activation is provided by using the method for measuring the action of regulating the activation of IPC of the present invention. That is, the present invention provides a screening method for a test substance having an action of regulating IPC activity, comprising the following steps.
  • a polynucleotide comprising a continuous base sequence selected from the base sequences described in any one of SEQ ID NOs selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 5.
  • a protein comprising a continuous amino acid sequence selected from the amino acid sequences described in any one of SEQ ID NOs: 2 selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6
  • Step of selecting a test compound having a greater effect of regulating the activation than the control The compound that can be selected by the screening method of the present invention is useful as a modulator of IPC activation.
  • the screening method of the present invention if an IPC contacted with a substance that clearly exhibits an action to enhance the activation of IPC is used as a control, a substance having a greater activation enhancing action than this substance can be found.
  • a substance having a greater inhibitory action than that substance can be found.
  • IPC is an important cell that produces most of the IFN in the body. Therefore, the compound obtainable by the screening method of the present invention is important as a regulator of the immune system.
  • a method for screening a therapeutic agent for an autoimmune disease or allergy is provided using the method for measuring the action of suppressing the activation of IPC based on the present invention.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for autoimmune disease or allergy, which contains, as an active ingredient, a compound selected by the screening method of the present invention and having an action of suppressing IPC activation.
  • IFN ⁇ is currently used clinically as a therapeutic agent for hepatitis C virus.
  • IFN a is a very expensive formulation.
  • a substance having an action of enhancing the activation of IPC which can be selected by the screening of the present invention, can be used as a drug for promoting IFN production by IPC.
  • the administration of such drugs can be expected to have a therapeutic effect equivalent to that of IFN treatment.
  • IFN can be applied not only to hepatitis C but also to AIDS and other viral diseases.
  • an anticancer effect can be expected. That is, a method for screening a therapeutic agent for a viral disease or cancer is provided using the method for measuring the action of enhancing the activation of IPC based on the present invention.
  • the present invention relates to a therapeutic agent for a viral disease or cancer containing, as an active ingredient, a compound selected by the screening method of the present invention and having an action of enhancing the activation of IPC.
  • the test substance used in the screening method of the present invention includes a compound preparation synthesized by combinatorial chemistry, a mixture containing a plurality of compounds such as extracts of animal and plant tissues or microbial cultures, and the like. For example, a sample purified from the above.
  • a polynucleotide comprising the nucleotide sequence described in the following sequence numbers, and a protein having an amino acid sequence encoded by the polynucleotide was a new substance.
  • markers with a novel structure were considered to be splicing variants of the known gene BST2.
  • Each splicing variant is identified as BST2H and BST2HS in the present invention.
  • the present invention relates to the polynucleotide according to any one of the following i) _vi) or a protein comprising an amino acid sequence encoded by the polynucleotide.
  • a polynucleotide comprising the coding region of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. Ochido;
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, having one or more amino acid sequences substituted, deleted, inserted, and / or added, and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2
  • a polynucleide tide that encodes a protein functionally equivalent to a sequence protein
  • a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5;
  • V A polynucleotide encoding the amino acid sequence of positions 139 to 158 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the polynucleotide of the present invention includes an isolated polynucleotide.
  • an isolated polynucleotide is a polynucleotide that has been separated from other nucleic acid molecules present in the natural source from which the polynucleotide is derived.
  • An isolated polynucleotide can be, for example, a recombinant DNA molecule contained in a vector, a recombinant DNA molecule maintained in a heterologous host cell, a partially or substantially purified nucleic acid molecule, and synthetic. Of DNA molecules or RNA molecules.
  • an “isolated” polynucleotide such as a cDNA molecule, is substantially free of other cellular material or culture medium when made by recombinant techniques.
  • a chemically synthesized polynucleotide may be substantially free of chemical precursors or other chemicals.
  • the protein of the present invention includes an isolated or purified protein.
  • isolated or purified protein or biologically active portion thereof is, for example, cellular material or other from the origin of the cell or tissue from which the protein consisting of the amino acid sequence: 4 or SEQ ID NO: 6 is derived. Substantially free of contaminating proteins. Alternatively, when the protein of the present invention is chemically synthesized, it is substantially free of chemical precursors or other chemical substances. The term “substantially free of cellular material” means that the protein is separated from the cellular components of the isolated or recombinantly produced cell.
  • the phrase “a substantially free of cellular material” refers to other protein strengths S mixed in the protein of the present invention, less than about 30% by dry weight, more preferably less than about 20%, even more preferably less than about 10%, most preferably less than about 5%. Say that. Where the protein of the invention or biologically active portion thereof is produced recombinantly, it is preferably substantially free of culture medium. In the present invention, substantially free of culture medium means that the culture medium is less than about 20%, more preferably less than about 10%, most preferably less than about 5% of the volume of the protein preparation. .
  • amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 the amino acid sequence from the N-terminal to the 138th position is identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence from the N-terminal to the 95th position matches the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 is known as BST2 (bone marrow stromal cell antigen 2) (GenBank Acc # .BC027328) o
  • BST2 bone marrow stromal cell antigen 2
  • a protein comprising a novel amino acid sequence found by the present inventor is BST2 It was considered a splicing variant.
  • the polynucleotide of the present invention, the protein having an amino acid sequence encoded by the polynucleotide, and their functional equivalents are all useful as indicators of activated IPC.
  • the amino acid sequences unique to the protein of the present invention described below, which are clarified in the present invention are useful as an immunogen for obtaining an antibody that specifically binds to the protein of the present invention.
  • Such an antibody enables differential measurement of a protein consisting of the amino acid sequence IJ described in SEQ ID NO: 2 and a protein consisting of the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6. That is, the present invention relates to an antibody that recognizes a region containing the following amino acid sequence.
  • the antibody of the present invention can be prepared using a polypeptide containing the amino acid sequence as an immunogen.
  • a polypeptide having 5 to 50 amino acid residues, such as 5 to 30 amino acid residues can be used as an immunogen.
  • a polypeptide used as an immunogen can be obtained by chemical synthesis or by elimination of a protein comprising the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6.
  • An immunogenic polypeptide can bind to a carrier protein. wear.
  • the carrier protein keyhole limpet hemocyanin and the like can be used.
  • the protein consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 6 can be used as an immunogen as it is.
  • the obtained antibody can identify its antigenic determinant by epitopic mapping.
  • Epitope mapping refers to identifying the amino acid sequence (antigenic determinant) recognized by an antibody.
  • antigenic determinants are identified by absorption tests or binding tests using peptides consisting of the above amino acid sequences or partial sequences thereof, or multiple types of oligopeptides consisting of various amino acid sequences including the above amino acid sequences.
  • antibodies that identify the conformation specific to each subtype can also be used for differential measurement of subtypes. it can.
  • Antibodies that identify higher order structures can be selected by revealing the cross-reactivity of antibodies generated with each subtype as an immunogen to other subtypes. When the binding activity of an antibody that specifically binds to each selected subtype is not absorbed by, for example, the oligopeptide consisting of the above-mentioned unique amino acid sequence, the antibody recognizes a higher-order structure unique to the subtype. There is a possibility.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5 the nucleotide sequence encoding these amino acid sequences is useful as a target sequence for specifically detecting each gene. That is, an oligonucleotide that hybridizes to a polynucleotide comprising the following base sequence is useful as a probe or primer for detecting the polynucleotide of the present invention.
  • SEQ ID NO: 5 nucleotide sequence from position 289 to position 303
  • the polynucleotide of the present invention can be obtained by screening an IPC cDNA library using a probe designed based on the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1. Alternatively, using a primer designed based on the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1, an IPC cDNA library or a PCR method using mRNA as a saddle (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Puolish. John Wiley & According to Sons Section 6.1-6.4), the polynucleotide of the present invention can be synthesized. Those skilled in the art can design probes and primers based on a given base sequence.
  • the polynucleotide of the present invention has an amino acid sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6. And a polynucleotide encoding a protein functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • functionally equivalent proteins include proteins that are expressed in activated IPC and that increase in expression as IPC is activated.
  • a functionally equivalent protein can be characterized in that the activity of the cell is suppressed when an antibody that binds to the protein is brought into contact with a cell that expresses the protein.
  • the cell activity includes either or both of the ability to produce IFN and the number of cells.
  • the IFN-producing ability of the cell is preferably type 1 IFN. More specifically, it refers to the ability to produce either or both of IFN ⁇ and IFN.
  • the amino acid sequence mutation may be artificial or naturally occurring.
  • the protein of the present invention is preferably naturally derived.
  • the number of amino acid mutations allowed in the present invention is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids. For example, substitution within 5 amino acids or within 3 amino acids is allowed. When substituting amino acids, it is desirable that they are conservative substitutions.
  • the amino acid to be substituted is preferably an amino acid having properties similar to those of the amino acid before substitution. Such substitution of amino acid residues is called conservative substitution.
  • conservative substitution of amino acids can be performed by substitution between amino acids included in the following classifications.
  • Nonpolar amino acids Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp
  • Uncharged amino acids Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin
  • Acidic amino acids Asp and Glu
  • the polynucleotide of the present invention can be conjugated to a polynucleotide encoding another protein or polypeptide.
  • a polynucleotide provides a conjugate (fusion protein) of the protein of the present invention and other proteins or polypeptides.
  • fusion protein a conjugate of the protein of the present invention and other proteins or polypeptides.
  • a method of adding a histidine tag, a flag-tag, etc. to an arbitrary protein is known. By adding these proteins, they can be used for detection and purification of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention may be a fusion protein containing the protein.
  • the polynucleotide of the present invention includes a polynucleotide that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions.
  • the conditions for hybridization in the present invention are usually about “lxSSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” as a cleaning condition, and about “0.5xSSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” as stricter conditions. As stricter conditions, “0.1xSSC, 0.1% SDS, 65 ° C.” can be indicated. With stringency, the more stringent, the more homologous polynucleotides can be obtained.
  • the stringent conditions in this specification include stringent conditions for hybridization at "6 X SSC, 40% formamide, 37 ° C" and washing at "0.2 X SSC, 55 ° C". It can also be shown as a serious condition.
  • a polynucleotide having such a hybridization technique has high homology with the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • High homology is also expected for amino acid sequences encoded by polynucleotides with high nucleotide sequence homology.
  • high homology means identity of 90% or more, or 93% or more, or 95% or more, further 97% or more, and 99% or more. Identity can be determined using the BLAST search algorithm.
  • the present invention relates to a vector inserted with the polynucleotide of the present invention.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it stably holds the inserted DNA.
  • the cloning vector is preferably a pBluescript vector (Stratagene).
  • an expression vector can be used.
  • Various vectors are commercially available for expressing any gene.
  • the present invention relates to a transformant carrying the vector of the present invention.
  • the host cell into which the vector of the present invention is introduced is not particularly limited, and various host cells can be used depending on the purpose. Examples of eukaryotic cells for highly expressing proteins include COS cells and CHO cells.
  • Methods for introducing a vector into a host cell are also known. For example, Karushiu phosphate beam precipitation, electrophoresis Nono 0 Noresu obturator and methods (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9), Ripofuekutamin method (GIB CO -BRL) and the ability to introduce a vector into host cells using the microinjection method. By culturing the vector-introduced cells under conditions that induce the expression of the gene, the expression of the protein having the target amino acid sequence is induced.
  • the protein of the present invention can be isolated by purifying the protein from the culture of the transformant. Methods for purifying recombinant proteins are also known. In this way The protein of the present invention that can be obtained is useful, for example, as an immunogen for preparing an antibody that recognizes the protein of the present invention.
  • Cells used as an immunogen were prepared as follows. Bone marrow female (4-6 weeks old) bone marrow cells, 10% FCS_RPMI164 0 medium supplemented with 10 ng / ml FLT-3 ligand (R & D Systems) [10% fetal calf serum (FCS) and penicillin And RPMI16 40 medium containing streptomycin] for 10 days. Ten days later, IPC (Interferon producing cell) was separated with a cell sorter (FACSVantage, manufactured by Becton Dickinson) as a CDllc positive, CDl lb negative, B220 positive fraction. The antibody manufactured by Becton Dickinson was used.
  • FCS fetal calf serum
  • FAC16 40 medium containing streptomycin penicillin And RPMI16 40 medium containing streptomycin
  • the separated cells were injected into rat foot pads together with 6 lxlO per leg together with complete Freund's adjuvant (CFA: manufactured by Jatron).
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • the lymph nodes of the immunized rat were isolated and lymphocytes were collected.
  • Mouse myeloma cells P3x63Ag8.653 and rat lymphocytes were mixed at a ratio of 4: 5, and polyethylene glycol (PEG) was added to fuse the cells. The fused cells were thoroughly washed and dispersed in HAT medium, and spread on a 96-well plate to contain 5xl0 4 cells per well.
  • Bone marrow female (4-6 weeks old) bone marrow cells were supplemented with 10 ng / ml FLT-3 ligand 10 The cells were cultured in% FCS-RPMI 1640 medium for 10 days. On day 10, about 40% of the cells became IPC. Using these cells, the hyperpridoma culture supernatant was used as the primary antibody, and the secondary antibody was stained with FITC-labeled anti-rat Ig antibody (BD Pharmingen). Subsequently, double staining was performed with various antibodies (CDllb, CDllc, CD3, CD19, CD45RB, B220, Ly6C; all manufactured by Becton Dickinson), and analysis was performed by flow cytometry (FACS analysis).
  • the culture supernatant positive fraction and negative fraction were R2 and R3, respectively, and the expression of various antigens in each Gate was shown as a histogram (Fig. 1).
  • the cell groups stained with several types of antibodies were consistent with the cell surface antigen profile of mouse IPC (Nature Immunol, 2001; 2, 1144-1150.) Defined in the literature. Therefore, these antibodies were considered to be antibodies that specifically bind to mouse IPC.
  • Bone marrow cells cultured in the same manner as in Example 2 were stained using the culture supernatant as the primary antibody and FITC-labeled anti-ra Hg antibody as the secondary antibody. Thereafter, positive cells were separated using a cell sorter (FACSVantage, manufactured by Becton Dekinson). After cytospinning, Giemsa staining and observation under a microscope showed a form specific to IPC (Fig. 2a). That is, the shape of this cell had a large round nucleus.
  • FACSVantage manufactured by Becton Dekinson
  • lxlO 5 cells were cultured with influenza virus PR8 at 24 hours between 37 ° C at 96 well round bottom plate, after Giemsa staining similarly, was observed under a microscope, morphologically typical Differentiated into typical dendritic cells ( Figure 2b). From these results, it was confirmed that the cells isolated by the antibody have the characteristics of mouse IPC that differentiate into dendritic cells by viral infection. Among such mouse IPC-specific monoclonal antibodies and hybridomas producing the antibodies, SNK01 was selected and used for the subsequent experiments.
  • Bone marrow cells cultured in the same manner as in Example 2 were stained with SNK01 culture supernatant and secondary antibody, and then positive and negative cells were separated using a cell sorter. Dispense 5 lxlO cells from each fraction into a 96-well round bottom plate (100 ⁇ 1 / well), infect with influenza virus PR8, 2 The concentration of IFNa in the culture supernatant after 4 hours was measured by the following ELISA method.
  • rat anti-mouse IFNa antibody manufactured by PBL Biomedical Laboratory
  • 100 / l of culture supernatant was added and incubated at 4 ° C.
  • a labeled anti-interferon antibody that recognizes IFNa and IFN ⁇ was added and reacted for 1 hour for detection.
  • Each reaction was performed in triplicate and the average value was determined. By creating a calibration curve, the IFN concentration in the culture supernatant was calculated.
  • SNK01-positive cells produced higher levels of interferon than negative cells.
  • the antigen recognized by the monoclonal antibody SNK01 was confirmed to be a surface antigen specific for IPC (Fig. 3).
  • coli DH10 (Invitrogen) was used. Transformation was performed by the electopore method. This is cultured in 500 ml of LB medium (LB'carpenicillin) containing 100 / ig / ml of carpenicillin at 30 ° C, and the plasmid is prepared using the QIA filter plasmid ma xi kit (Qiagen) according to the protocol of the kit. Extraction and purification yielded an IP C-cDNA library.
  • LB medium LB'carpenicillin
  • Qiagen QIA filter plasmid ma xi kit
  • C_ ⁇ _S7 cells were seeded 5Xl0 10 sheets 5 one by the 6cm Deishu, 37 ° C, 5% CO 20 hours of culture in the presence, Effectene trasfection Reagent (Qiagen, Inc.) by sub-les ,, above protocol of the product
  • the IPC cDNA library obtained in 1) was transfected. 48 hours at 37 ° C under 5% CO, washed with PBS (Phosphate Buffered Saline), detached with PBS / 5mM EDTA, further washed with PBS, cell strainer (70 zm, Falcon) Made).
  • coli DH10 by the electopore polarization method, cultured at 30 ° C with 100 ml of L ⁇ carbenicillin at 30 ° C, and according to the protocol of the kit using QIA filter plasmid midi kit (manufactured by Qiagen). The plasmid was extracted and purified.
  • the nucleotide sequence of cDNA cloned on the obtained plasmid was determined, and the gene was determined by blast search with the nucleotide sequence information registered in the mouse gene database. At the same time, we searched the human gene database to identify the power partner.
  • the clone bound with the monoclonal antibody SNK01 had the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 9.
  • the amino acid sequences encoded by these base sequences are shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 9 was a base sequence known as mouse BST2 (GenBank Acc # .BC027328) o
  • the base sequence described in SEQ ID NO: 7 is the base of SEQ ID NO: 9.
  • a different base sequence was found on the 3 ′ end side, encoding a different amino acid sequence. That is, among the amino acid sequences described in SEQ ID NO: 8, the amino acid sequence from the N-terminal to the 139th position was identical to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 10.
  • the 140th to 178th amino acids from the N-terminal were unique to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the plasmid obtained by the above expression cloning method was again highly purified from Escherichia coli again using QIA filter plasmid midi kit (manufactured by Qiag en), and again transfected into COS7 cells.
  • the monoclonal antibody SNK01 was observed to bind to COS7 cells into which the plasmid was introduced. Therefore, cDNA cloned on a plasmid It was confirmed that both encoded the antigen recognized by this monoclonal antibody.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 10 was expressed as a gene recombinant, and the reactivity with the monoclonal antibody of the present invention was confirmed.
  • the specific operation is as follows.
  • a plasmid (l ⁇ g) encoding the cloned mBST2D and mBST2H is used as
  • a DNA having the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 9 was amplified by CR.
  • the base sequences of the primers used for PCR are as follows.
  • the composition of the reaction solution is as follows.
  • PCR was performed under the conditions of 25 times with [95 ° C 30 seconds / 55 ° C 30 seconds / 72 ° C 1 minute 30 seconds] as one cycle. After confirming that a DNA fragment of the desired size was amplified by agarose gel electrophoresis, phenol chloroform extraction and ethanol precipitation were performed, and the recovered amplification product was dissolved in TE buffer 10 / i L.
  • mammalian cell expression plasmid pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) was digested with restriction enzymes Nhe I and Xho I, treated with CIAP (Takara Bio), purified by agarose gel electrophoresis, and ethanol precipitated. Dissolved in 4 ⁇ L of TE buffer. 2 ⁇ L of each of the aforementioned DNA fragments and 0.5 ⁇ L of this plasmid were ligated using ligation kit ver. II (manufactured by Takara Bio Inc.), and transformed into E. coli DH5.
  • l-mBST2D in the case of pcDNA3.
  • l-mBST2D_His construction or pcDNA3.
  • l_m BST2H in the case of pcDNA3.1-mBST2H-His construction 1 ⁇ g of the base sequence encoding the His tag by PCR Added.
  • the base sequences of the primers used for PCR are as follows. Note that the same forward primer (SEQ ID NO: 13) was used for pcDNA3.1-mBST2D_His and pcDNA3.1-mBST2H_His.
  • the composition of the reaction solution and the temperature cycle conditions were the same as in 1).
  • pcDNA3.1_mBST2D and pcDNA3.1_mBST2H 5 xg were digested with restriction enzymes BamH I and Xho I, treated with CIAP (Takara Bio), purified by agarose gel electrophoresis, ethanol precipitated, and then added to 4 ⁇ L of TE buffer. Dissolved. 2 ⁇ L of each DNA fragment amplified by PCR and 0.5 ⁇ L of these plasmids were ligated using ligation kit ver. II (manufactured by Takara Bio Inc.), and transformed into E. coli DH5.
  • RIPA buffer containing IxHalt Protease Inhibitor Coctail (manufactured by PIERCE) was added and lysed on ice for 1 hour.
  • the composition of RIPA buffer is shown below.
  • Detection with an antibody was performed using an Imnostar kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • an HRP-labeled anti-His tag antibody manufactured by Invitrogene
  • the PVDF membrane was labeled with a denaturing solution (7 M guanidine hydrochloride, 50 mM glycine, 0.05 mM EDTA, 0.1 M potassium chloride, 20 mM 2-mercaptoethanol) for 1 hour at room temperature.
  • Anti-His tag antibody was removed.
  • a signal was similarly detected using a biotin-labeled SNK01 antibody. The results are shown in FIG.
  • the base sequence of the primer used for PCR is as follows.
  • Antisense primer SEQ ID NO: 21:
  • the cDNAs or cells with which the expression levels were compared are as follows. A commercially available product (manufactured by Clonetech) was used as the DNA panel. The cells were highly separated by a cell sorter (FACSVantage, manufactured by Becton Dekinson). The results are shown in FIG. BST2D (SEQ ID NO: 9) was expressed in several cells. It was IPC that showed strong expression. BST2 H (SEQ ID NO: 7) was observed to be strongly expressed in mouse IPC.
  • T cells CD3 positive cells (T cells).
  • Example 8 a short amplified fragment was observed in addition to the amplified fragment corresponding to the cDNA of SEQ ID NO: 7 by the combination of primers for SEQ ID NO: 7. Regular method for this amplified fragment
  • the nucleotide sequence was confirmed by cloning, the nucleotide sequence lacking the second exon part of mBST2H shown in SEQ ID NO: 7 was found. That is, it was considered to be a novel splicing variant of mouse BST2 having the base sequence shown in SEQ ID NO: 22.
  • the amino acid sequence encoded by this gene is shown in SEQ ID NO: 23. As shown in Example 8, it was confirmed that this gene was also expressed in mouse IPC.
  • the gene set forth in SEQ ID NO: 22 is also referred to as mBST2HS below.
  • Fig. 7 (a) The alignment of the amino acid sequences of mBST2D, mBST2H, and mBST2HS is shown in Fig. 7 (a), and the genome structure of each is shown in Fig. 7 (b).
  • the mBST2D and mBST2H cDNAs obtained in Example 6 were used as PCR, and PCR was performed under the following conditions using primers consisting of the following nucleotide sequence IJ.
  • DNA polymerase LA Taq (Takara Bio Inc.)
  • Each amplified fragment was cleaved by treating with restriction enzymes Nhel and Xhol (Le, also manufactured by Takara Bio Inc.) and then similarly treated with Nhel and Xhol.
  • PcD NA3.1-Zeo ( +) (Invitrogene) and ligation kit ver.II (Takara Bio) were used to make each expression vector.
  • the mBST2HS expression vector was prepared by removing the second exon portion of mBST2H using a PCR method according to a standard method.
  • mice When a human orthologue of the mouse IPC-specific antigen BST2 identified in the present invention was searched, it was a known gene reported as human BST2 (IshikawaJ. Et al. Genomics, 1995; 26, 527-; GenBank Acc #. D28137).
  • human BST2 IshikawaJ. Et al. Genomics, 1995; 26, 527-; GenBank Acc #. D28137.
  • the new splicing variant humanolog found in mice was cloned by PCR as follows, Three types of expression vectors were created.
  • human IPC stimulated with Herpes Simplex virus was prepared, RNA was extracted, and first strand cDNA was extracted using Superscript First Strand System Kit (Invitrogen). Synthesized.
  • hBST2 pr lmer P aaaaaaaagctagctggatggcatctacttcgtatg ( ⁇ Self column number: 26) and hBST2 primer R; (95 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes, 25 cycles)
  • the amplified fragment was digested with restriction enzymes Nhel and Xhol, and then pcDNA3.to Zeo (+ ) (Invitrogen) 's Nhe Xhol site was used as an expression plasmid for human BST2.
  • the gene having this sequence is also referred to as hBST2D.
  • the base sequence of the human ortholog of mBST2H (hereinafter also referred to as hBST2H) obtained as described above is shown in SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4
  • the human ortholog of mBST2HS hereinafter also referred to as hBST2HS.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 6.
  • hBST2D The alignment of the amino acid sequences of hBST2D, hBST2H, and hBST2HS is shown in Fig. 8 (a), and the genome structure of each is shown in Fig. 8 (b). It was suggested that hBST2H and hBST2HS are novel splicing variants.
  • PCR was performed according to a conventional method to examine the expression of each variant of human BST2.
  • PCR conditions include 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 73 ° C for 45 seconds, D type for 30 cycles, The H type and HS type were reacted for 35 cycles (Fig. 9).
  • Primer sequences are as follows.
  • Reverse primer for Fi HS; aatgtggcaggtggagggtag (Tatsumi column number: 32)
  • Lymph nodes were collected on the 12th day from rats immunized by performing such operations on the 0th, 4th, and 11th days, and nobridomas were prepared in the same manner as shown in Example 1. . Yes The culture supernatant of bridoma was screened by Cell ELISA, and clones were selected that reacted with COS7 cells transfected with the three expression vectors but did not react with host COS7 cells. In addition, FACS analysis confirmed the binding activity and cloned the cells. Finally, 5 positive clones were obtained.
  • Example 14 Using the culture supernatant of the obtained clone, the effect on IFN production was examined according to the method shown in Example 5. All of them had activity to suppress IFN production of IPC compared to the control antibody. . Furthermore, when stimulated with CpG ODN 1668 (MWG Biotech) of ⁇ . ⁇ , it also showed IFN production inhibitory activity (Fig. 10). From this, it was confirmed that antibodies against mBST2 other than SNK01 also showed activity to suppress IFN production from IPC.
  • Example 14 Using the culture supernatant of the obtained clone, the effect on IFN production was examined according to the method shown in Example 5. All of them had activity to suppress IFN production of IPC compared to the control antibody. . Furthermore, when stimulated with CpG ODN 1668 (MWG Biotech) of ⁇ . ⁇ , it also showed IFN production inhibitory activity (Fig. 10). From this, it was confirmed that antibodies against mBST2 other than SNK01 also showed activity to suppress IFN production from I
  • An antibody that recognizes one or more of the three subtypes D, H, and HS of human BST2 was prepared in the same manner as in Example 13.
  • the three types of expression vectors cloned in each type of human cDNA prepared in Example 11 were used, and the screening of the hyperidoma was performed by FACS analysis of the culture supernatant. Multiple clones including clones that react only with hBST2H (3D3 # 7), clones that react with hBST2H and hBST2D (3E2 # 8, 5C11 # 7), clones that react with any of hBS T2H, hBST2D, and hBST2HS (3G7 # 6) Clones were obtained. Purified antibodies of the obtained clones were obtained and further analyzed.
  • Peripheral blood was collected from healthy individuals and PBL (peripheral blood lymphocytes) were isolated. Various cells were removed by MACS with Lineage antibodies (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56 antibodies), and then CD4-positive, CD123-positive, and Lineage-negative cell groups were separated as IPCs using a cell sorter.
  • the good urchin acquired human IPC was seeded in 96 well plates at 2xl0 4 cells / well, were each cultured for 1 hour at 3, 10, 30 ⁇ g / in a concentration mL by the addition of anti-BST2 antibody 37 ° C. After 1 hour of culture, Herpes Simplex virus (20 pili / cell) was added and cultured at 37 ° C.
  • the mouse BST2 protein expression was analyzed by FACS using the monoclonal antibody SNK01. Spleen cells of Balb / c mice or Typel IFN receptor knockout mice were stimulated with CpG (0.5 ⁇ ) or influenza virus PR8 for 24 hours, and then stained with various antibodies. Under normal conditions without stimulation, as shown in Fig. 1, BST2 was expressed specifically in IPC. In Balb mice, stimulation induced BST2 expression in many cells. It became clear (Fig. 12). Similar trends were detected in CD3 positive T cells, CD19 positive B cells, DX5 positive NK cells, and Gr_l positive granulocytes. Furthermore, since BST2 expression enhancement by these CpG and viruses was not detected in IFNR knockout mice, it was estimated that BST2 expression was induced via IFN signals.
  • Example 14 Using the antibody 5C11 prepared in Example 14 1), the expression of human BST2 protein was analyzed by FACS. PBL was collected from peripheral blood of healthy individuals, IFN was added at a concentration of lng / ml, incubated at 37 ° C for 24 hours, and double-stained with anti-BDCA-2 antibody, anti-BDCA-4 antibody and 5C11 (Fig. 13). As a result, it was revealed that BST2 expression was not normally detected in human IPC, but BST2 expression was induced by IFN stimulation. In other words, it was revealed that the expression of BST2 molecule is induced by IFN in humans as well as mice and further affects the production of IFN itself. It was also revealed that expression was induced on IPC when stimulated with CpG (Fig. 14).
  • Balb / c mice were intraperitoneally administered SNK01 and control rat IgG, 300 ⁇ g per mouse, 3 times every other day (0.9 mg / mouse). On the 6th day, spleen and bone marrow were collected. The presence of IPC was analyzed by staining with B220, CDllc, and CDllb. Furthermore, bone marrow cells were seeded in 96well plates at lxl0 6 / well, and stimulated by CpG (0.5 mu Micromax) or Influenza Virus PR8, were measured by ELISA site force in value of the culture supernatant after 24 h ( ( Figure 15).
  • the prevalence of IPC in organs was measured by FACS analysis. In that case, staining was performed using SNK02 antibody, which is an IPC-specific antibody prepared by the method shown in Example 1, and CDllc antibody (manufactured by Beckton Dickinson).
  • a modulator or method for regulating IPC activity is provided.
  • IPC includes cells that produce thousands of times more IFN than other cells. Therefore, IFN production can be effectively suppressed by suppressing either or both of its ability to produce IFN and cell survival (or cell number).
  • Overproduction of type 1 IFN produced by IPC has been shown to be closely related to the pathogenesis of autoimmune diseases. Therefore, the IPC activity modulator or method provided by the present invention can be used for the treatment of autoimmune diseases.
  • the present invention also provides the use of BST2 and its homologs as activation markers for IPC.
  • Activation of IPC in vivo indicates that the type 1 IFN production increase switch was turned on.
  • BST2 and its homologues are useful as detection markers for autoimmune diseases caused by IFN or as diagnostic indicators.
  • IPC activation occurs early in the viral infection. Therefore, IPC activation can also be used as a marker for knowing the possibility of viral infection when viral antibodies cannot be found in the blood. In any case, the level of IPC activation in vivo is clinically important information.
  • the activity of the test compound that regulates the activation state of IPC can be evaluated. That is, compounds that modulate IPC activation can be screened using the expression level of BST2 and its homologues as an index. It can be found by the screening method based on the present invention. Are also useful for IPC activity modulators or methods. Such compounds can be used as therapeutic agents for autoimmune diseases.

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Abstract

　BST2および／またはそのホモログに結合する抗体を有効成分とするインターフェロン産生細胞(IPC)の活性調節剤、あるいはこの抗体を利用するIPCの活性調節方法が提供された。本発明によって、IPCのインターフェロン(IFN)の産生能、並びに細胞数を直接制御することができる。また本発明は、BST2および／またはそのホモログの、IPC活性化マーカーとしての用途を提供する。IPC活性化マーカーによって、IPCの活性化を調節する化合物をスクリーニングすることができる。

Description

明 細 書
インターフェロン産生細胞の活性調節剤
技術分野
[0001] 本発明は、インターフェロン産生細胞 (Interferon producing Cells;IPC)の活性調節 剤、ならびに活性調節方法に関する。
背景技術
[0002] インターフェロン a (IFN a、以下「インターフェロン」を IFNと省略して記載する）、お よびインターフェロン β (IFN β )は、抗ウィルス活性、あるいは抗腫瘍活性を有する ty pe 1 IFNとして知られている。一方で、 IFN aは自己免疫疾患に関連していることも明 らかにされている。たとえば、以下のような自己免疫疾患患者において IFN aの異常 産生が報告されている。そして IFN aの中和によって自己免疫症状が緩和される可 能性も示唆されている。
全身性エリテマトーデス (Shiozawa et al. , Arthr. & Rheum. 35， 412, 1992) 慢性関節リウマチ (Hopkins et al. ,Clin. Exp. Immunol. 73， 88, 1988)
更に組み換え IFNひ 2の投与によって自己免疫疾患症状が発現あるいは悪化した 症例が報告されている (Wada et al , Am.J. Gastroenterol. 90， 136, 1995; Perez et al ·， Am. J. Hematol. 49, 365， 1995)。
[0003] また IFN aが、樹状細胞 (dendritic cell)の分化を誘導していることも明らかにされて いる。樹状細胞 (dendritic cell)は抗原提示細胞でもある。したがって樹状細胞の分化 誘導は、 自己免疫疾患における重要なメカニズムを構成していると考えられる。実際 、 IFNひの樹状細胞の分化誘導と、全身性エリテマトーデスの発症には、深い関連性 があることが示唆されている (Blanco et al , Science, 16:294, 1540-1543, 2001)oこのよ うに IFNひは、抗腫瘍活性とともに、自己免疫疾患との密接な関連性が指摘されてい る。
[0004] さて、ウィルス感染に伴って、 type 1 IFNを大量に産生する細胞として同定されたの が IPCである。 IPCは血中にわず力 か存在していなレ、。末梢血リンパ球に占める IPC の割合は、 1%以下と考えられている。し力し IPCは、きわめて高い IFNの産生能を有す る。 IPCの IFN産生能は、たとえば 3000pg/mL/106cellsに達する。つまり、細胞の数は 少ないが、血中 IFN aあるいは IFN iSの大部分は、 IPCによってもたらされていると言 つて良い。
[0005] 一方 IPCは、樹状細胞 (dendritic cell)の前駆細胞に位置付けられる未分化のリンパ 球系樹状細胞である。 IPCは、プラズマ細胞様樹状細胞 (Plasmacytoid dendritic cell) と呼ばれることもある。 IPCは、ウィルス刺激によって樹状細胞に分化し、 T細胞による IFN- γと IL-10の産生を誘導する。また IPCは、 IL-3刺激によっても樹状細胞に分化 する。 IL-3刺激によって分化した樹状細胞は、 T細胞による Th2サイト力イン (IL-4、 IL -5、 IL-10)の産生を誘導する。このように IPCは、刺激の違いによって異なる樹状細胞 に分化する性質を有してレ、る。
[0006] したがって IPCは、 IFN産生細胞としての側面と、樹状細胞の前駆細胞としての 2つ の側面を有する細胞である。いずれの細胞も、免疫システムにおいて重要な役割を 担っている。つまり IPCは、様々な面で免疫システムを支える重要な細胞の一つであ る。
非特許文献 l : Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35， 412, 1992
非特許文献 2 : Hopkins et al.,Clin. Exp. Immunol. 73, 88， 1988
非特許文献 3 :Wada et al., Am.J. Gastroenterol. 90， 136, 1995
非特許文献 4 : Perez et al" Am. J. Hematol. 49, 365, 1995
非特許文献 5 : Blanco et al., Science, 16:294,1540-1543,2001
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、 IPCの活性を調節するための調節剤および調節方法の提供を課題とす る。あるいは本発明は、 IPCの活性化の指標とすることができるマーカーの提供を課 題とする。更に本発明は、 IPCの活性化マーカーを用いたスクリーニング方法、並び に活性化 IPCの単離あるいは検出のための方法の提供を課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] IFNのような液性因子の活性調節には、当該因子を認識する抗体の投与が有効で ある。たとえばインターロイキン (IL)_ 1、あるいは IL- 4に対する抗体によって自己免 疫疾患を治療する試みが実用化された (Guler et al., Arthritis Rheum., 44. S307, 200 1)。またインターフェロンにおいても同様に、中和抗体が自己免疫疾患の治療薬とな りうるとされている (Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003)。 I PCが産生する IFNに対しても同様のアプローチが有効であろうことは予想できる。し かしこのようなアプローチは、産生された後の液性因子の作用の阻害に基づいてい る。 目的とする液性因子の産生を直接的に制御することができれば、より本質的な治 療効果を達成することができる。
[0009] ヒト IPCを認識する抗体が報告されている。たとえば、抗 BDCA-2モノクローナル抗 体、あるいは抗 BDCA- 4モノクローナル抗体 (Dzionek A. et al. J. Immunol. 165:6037 -6046,2000)は、ヒト IPC特異モノクローナル抗体である。このうち抗 BDCA-2モノクロ ーナル抗体は、ヒト IPCの IFN産生を抑制する作用を有することが明らかにされている 。その他にもマウスのインターフェロン産生細胞を認識するモノクローナル抗体力 ィ ンターフェロンの産生を抑制することも報告されている (Blood 2004 Jun 1; 103/11:420 1-4206. Epub 2003 Dec)。マウスのプラズマ細胞様榭状細胞 (Plasmacytoid Dendritic Cell)に対するモノクローナル抗体による樹状細胞数の減少が報告された (J. Immunol . 2003, 171:6466-6477)。
BDCA2は、 IPC特異抗原として同定された。 IPCにおける BDCA2の発現は恒常的で ある。つまり BDCA2を認識する抗体は、 IPCの活性化のレベルとは無関係に、 IPCに 結合する。ところが IFNは活性化された IPCによって産生される。したがって、活性化さ れた IPCに選択的に作用する抗体を得ることができれば理想的である。また BDCAを 認識するモノクローナル抗体以外の報告にぉレ、ては、モノクローナル抗体が認識す る抗原分子やその発現パターンは同定されていない。
[0010] 活性化 IPCへの選択的な作用によって、治療効率の向上が期待できる。具体的に は、より少量の抗体によって目的とする治療効果を得ることができる。また、 目的とす る細胞への選択的な作用によって、予期できない副作用の可能性を小さくすることが できる。このような考え方に基づいて、活性化 IPCに特異的に作用し、その活性を調 節することができる方法について本発明者らは研究を重ねた。その結果、 BST2およ びそのホモログのいずれかあるいは両方に結合する抗体力 活性化 IPCに作用して その活性を調節することを明らかにして本発明を完成した。先に述べたように BDCA- 2に対する抗体も IFN産生を抑制する。しかし BDCA-2が IPCの活性化レベルに関わら ず、恒常的に IPCにおいて発現している点で、 BST2とは相違する。更に、 BDCA-2に 対する抗体は、 IL-12の産生を上昇させることが報告されている（Dzionek, A. et al. H um Immunol. 63; 1133-1348.2002) 0
更に本発明者らは、 BST2およびそのホモログが IPCの活性化の指標として利用でき ることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の IPC活性の調節剤、調 節方法、その製造方法、活性化 IPCの検出と分離方法、 IPCの活性化レベルの測定 方法、あるいは IPCの活性化を調節する作用の検出方法、そして当該作用を有する 物質のスクリーニング方法に関する。
〔1〕BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体を有効成分とし て含有するインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
〔2〕インターフェロン産生細胞の活性力 S、インターフェロン産生活性およびインターフ エロン産生細胞の生存のいずれカ または両方である〔1〕に記載のインターフェロン 産生細胞の活性抑制剤。
〔3〕インターフェロン産生細胞の活性力 インターフェロン産生活性であり、かつイン ターフェロンがタイプ 1インターフェロンである〔2〕に記載のインターフェロン産生細胞 の活性抑制剤。
〔4〕BST2およびそのホモログ力 配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6から なる群から選択されるレ、ずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質であ る〔1〕に記載のインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
〔5〕配列番号 : 4に記載のアミノ酸配歹 IJを含む蛋白質を認識する抗体を有効成分とし て含有する、 〔4〕に記載のインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
〔6〕配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6に記載のアミノ酸配列を含む蛋 白質の全てを認識する抗体を有効成分として含有する、〔4〕に記載のインターフエ口 ン産生細胞の活性抑制剤。
〔7〕 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体をインターフエ口 ン産生細胞に接触させる工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性抑制方法。 〔8〕インターフェロン産生細胞の活性力 S、インターフェロン産生活性およびインターフ エロン産生細胞の生存のいずれカ または両方である〔5〕に記載のインターフェロン 産生細胞の活性抑制方法。
〔9〕次の工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体の製造方法
(1) BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方、もしくはその断片を免疫原として 免疫動物に投与する工程
(2) (1)の免疫動物の抗体産生細胞から、 BST2およびそのホモログのレ、ずれかまたは 両方を認識する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、
(3) (2)で選択された抗体産生細胞を培養するか、または当該抗体産生細胞が産生す る抗体をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を発現可能に保持する細胞を培養 する工程、および
(4) (3)の培養物からインターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体を回収する工程
〔10〕免疫原が、ヒトから採取されたインターフェロン産生細胞である〔9〕に記載の方 法。
〔11〕次の (a)-(d)のいずれかに記載の指標物質を検出する工程を含む、活性化され たインターフェロン産生細胞の検出方法。
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質 〔12〕次の (a)-(d)のいずれかに記載の指標物質を有する細胞を単離する工程を含む 、活性化されたインターフェロン産生細胞の分離方法。
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
〔13〕配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいず れかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体を含む、活性 化されたインターフェロン産生細胞検出用試薬。
〔14〕配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいず れかの配列番号に記載の塩基配列から選択された少なくとも 15塩基からなる連続し た塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、活性化されたインターフェロン産生細 胞検出用試薬。
〔15〕配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいず れかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体を含む、活性 化されたインターフェロン産生細胞分離用試薬。
〔16〕次の工程を含む、生体のインターフェロン産生細胞の活性化のレべノレを測定す る方法。
(1)生体力も採取された試料に含まれるインターフェロン産生細胞における、（a)_(d)の いずれかに記載の指標物質を発現している細胞、およびその発現レベルのいずれ 力、または両方を検出する工程、および
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
(2)(1)で測定された細胞の数、およびその発現レベルのいずれかまたは両方を、被検 者のインターフェロン産生細胞の活性ィ匕のレベルに関連付ける工程
〔17〕生体から採取された試料が、体液、皮膚、滑膜組織、造血組織、膿、肺胞洗浄 液、および血液細胞を含む可能性のある生検組織試料からなる群から選択されるレ、 ずれかの試料である〔16〕に記載の方法。
〔18〕次の工程を含む、被験物質のインターフェロン産生細胞の活性化を調節する 作用の検出方法。
(1)インターフェロン産生細胞を被験物質とともに細胞刺激剤と接触させるか、または インターフェロン産生細胞と被験物質の接触の前、若しくは後に細胞刺激剤と接触さ せる工程
(2)インターフェロン産生細胞における、（a)-(d)のいずれかに記載の指標物質の発現 レベルを測定する工程、および
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質 (d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
(3) (2)で測定された指標物質の発現レベルを、対照と比較し、発現レベルが対照より も有意に高い場合に被験物質のインターフェロン産生細胞の活性化を増強する作用 が、また対照よりも有意に低レ、場合には被験物質のインターフェロン産生細胞の活 性化を抑制する作用が検出される工程
〔19〕細胞刺激剤がウィルス、ウィルスの構成要素、バクテリアの DNA、およびインタ 一フエロンからなる群から選択される少なくとも 1つの細胞刺激剤である〔18〕に記載 の方法。
〔20〕次の工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性化を調節する作用を有する 被験物質のスクリーニング方法。
(1)〔18〕に記載の方法によって、被験物質のインターフェロン産生細胞の活性化を調 節する作用を測定する工程、および
(2)対照と比較して前記活性化を調節する作用が大きい被験化合物を選択する工程 〔21〕〔20〕に記載の方法によって選択された被験物質を有効成分として含有する、 インターフェロン産生細胞の活性を調節するための医薬組成物。
〔22〕配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいず れかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体を含む、イン ターフェロン産生細胞の活性化を調節する作用を検出するための試薬。
〔23〕配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいず れかの配列番号に記載の塩基配列から選択された少なくとも 15塩基からなる連続し た塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、インターフェロン産生細胞の活性化を 調節する作用を検出するための試薬。
[24]次の i)_vi)のレ、ずれかに記載のポリヌクレオチド。
i)配列番号: 4、または配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード するポリヌクレ才チド；
ii)配列番号： 3、または配列番号： 5に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレ ォチド；
iii)配列番号: 4、または配列番号: 6に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数の アミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号 : 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等なタンパク質をコードするポ リヌクレ才チド；
iv)配列番号： 3、または配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェント な条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド；および
V)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にぉレ、て、 N末端から 139〜 158位のアミノ酸配 列をコードするポリヌクレオチド
vi)配列番号： 6に記載のアミノ酸配列において、 N末端から 96〜100位のアミノ酸配 列をコードするポリヌクレオチド
〔25〕 [24]に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質
〔26〕〔25〕に記載の蛋白質に対する抗体であって、配列番号: 4に記載のアミノ酸配 列の N末端から 139〜 158位のアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体。
〔27〕〔25〕に記載の蛋白質に対する抗体であって、配列番号： 6に記載のアミノ酸配 列の N末端から 96〜100位のアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体。
〔28〕モノクローナル抗体である〔26〕または〔27〕に記載の抗体。
〔29〕〔24〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔30〕〔24〕に記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含むベクターを保 持する形質転換細胞。
〔31〕〔30〕に記載の形質転換細胞を培養し、培養物から〔25〕に記載の蛋白質を採 取する工程を含む、〔25〕に記載の蛋白質の製造方法。
[32] FERM ABP- 10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-1 0340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6。
[33] FERM ABP- 10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-1 0340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体、またはそ の抗原結合領域を含む断片。 [34] FERM ABP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-1 0340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6を培養し、培養物に含まれるィムノグロブ リンを回収する工程を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断 片の製造方法。
[35] FERM ABP- 10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-1 0340として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体、またはそ の抗原結合領域を含む断片を有効成分として含有するインターフェロン産生細胞の 活性抑制剤。
発明の効果
[0011] 本発明により、活性化 IPCに作用しその活性を抑制する技術が提供された。すなわ ち BST2およびそのホモログのいずれ力または両方を認識する抗体は、活性化 IPCに 結合してその活性を抑制する。 BST2およびそのホモログのいずれ力または両方を認 識する抗体は、 IPCの活性の抑制剤、あるいは抑制方法に利用することができる。 BS T2およびそのホモログは、活性化された IPCにおいて発現が上昇しているので、本発 明に基づく IPCの活性の抑制剤、あるいは抑制方法は、活性化 IPCに特異的に作用 する。
[0012] IPCは、わずかな細胞が多量の IFNを産生する。 IFNの中和には、 IFNの分子数に応 じた抗体が必要である。し力 本発明においては、産生細胞の活性が直接抑制され る。その結果、抗 IFN抗体による中和と比較して、より少量の抗体で強力な IFNの抑制 効果を期待できる。更に、持続的に IFNが産生されている場合には、 IFNの抗体によ る中和は、一過的な抑制に留まると予想される。本発明においては、 IPCの活性を抑 制することから、長期間にわたる IFN産生抑制効果が期待できる。特に、本発明の望 ましい態様によれば、 BST2あるいはそのホモログを認識する抗体は、 IPCの IFN産生 のみならず、細胞数をも抑制する。これらの効果が相乗的に作用し、 IFNの産生は効 果的に抑制される。
[0013] 更に本発明は、ヒト由来の BST2の新規なスプライシングバリアント BST2Hおよび BST 2HSを単離した。本発明において特定された抗原分子は、ヒ HPCに特異的に発現し ており、ヒ HPCのマーカーとして有用である。すなわち本発明において見出された配 列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれかの配 列番号に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、 IPCのマーカーとして有用で ある。あるいはこれらの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質も 、 IPCのマーカーとして有用である。
また本発明において、マウスにおけるホモログである、マウス BST2Hおよびマウス BS T2HSも、新規分子として同定された。ヒトと同様に、これらの分子は既知分子である マウス BST2Dと、スプライシングバリアントの関係にあると考えられた。これらの分子は 、マウス IPCのマーカーとして有用である。
[0014] また本発明は、 BST2およびそのホモログが、 IPCの活性化に伴って発現レベルが 上昇することを明らかにした。したがってこれらのマーカーを指標として、 IPCの活性 化のレベルを評価することができる。更に、これらのマーカーを指標として、 IPCの活 性化を調節する作用を評価することができる。様々な物質の IPCの活性化を調節する 作用を評価し、当該作用を有する物質をスクリーニングすることもできる。このようなス クリーニングによって、 IPCの活性化を調節する薬剤を見出すことができる。本発明に 基づいて見出された IPCの活性を調節する作用を有する薬剤は、自己免疫疾患ゃァ レルギ一疾患の治療剤として有用である。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]FLT- 3リガンド添加後、 10日間培養したマウスの骨髄細胞（IPCが濃縮されてい る）の細胞表面を、作製した抗体及び他のマーカーで染色した FACS解析像である。 培養上清陽性分画、陰性分画をそれぞれ R2、 R3とした。グラフ内の、 R1 &R2は抗体 陽性の細胞集団、 R1 &R3は抗体陰性の細胞集団を表わす。
[図 2]各モノクローナル抗体で抽出した細胞の形態を表わす顕微鏡写真 (x400)であ る。 （a)はインフルエンザウイルス PR8に感染させる前の形態、（b)はインフルエンザゥ ィルス PR8と 24時間培養した後の形態を示す。感染後の細胞は樹状突起を持ち、樹 状細胞に典型的な形態を示した。
[図 3]モノクローナル抗体 SNK01を用いて分離した細胞のインターフェロン産生能を 示すグラフである。図中、横軸は細胞の処理の種類を、縦軸は培養上清中の IFN a 濃度 (pg/mL)を示す。横軸の P( + )はモノクローナル抗体に結合した細胞にウィルスを 感染させた場合、 N( + )はモノクローナル抗体に結合しなかった細胞にウィルスを感 染させた場合、そして N (— )はモノクローナル抗体に結合しなかった細胞にウィルスを 感染させなかった場合の結果を示す。
[図 4]モノクローナル抗体 SNK01のインターフェロン産生能への影響を示すグラフであ る。図中、横軸は処理に用いた抗体の濃度 ( x g/mL)を、縦軸は培養上清中の IFNひ 濃度 (pg/mL)を示す。横軸の (-)はウィルス処理していない場合の結果を示す。 S画 1は濃度依存的にインターフェロン産生抑制活性を示した。
[図 5]モノクローナル抗体 SNK01によるウェスタンブロッテイングアツセィの結果を示す 写真である。写真上は抗 Hisタグ抗体、下は本発明のモノクローナル抗体 SNK01によ る結果を示す。写真左側が pcDNA3.1-mBST2DHis、右側が pcDNA3.1_mBST2H-Hi sで形質転換した COS7細胞の結果である。培養した細胞を溶解処理した際の沈殿物 (P)と上清 (S)につレ、ての結果を示した。
[図 6]マウス BST2の mRNA発現レベルを組織、細胞間で比較した結果を示す写真で ある。レーンはそれぞれ解析した組織、細胞を示す。
[図 7]マウス BST2及びそのホモログのアミノ酸配列とゲノム構造を示す図である。（a)は 各ァイソフォームのアミノ酸配列のァライメントを、（b)はェキソンマッピングを示す。
[図 8]ヒト BST2及びそのホモログのアミノ酸配列とゲノム構造を示す図である。（a)は各 ァイソフォームのアミノ酸配列のァライメントを、（b)はェキソンマッピングを示す。
[図 9]ヒト BST2の mRNA発現レベルを組織、細胞間で比較した結果を示す写真である
[図 10]作製したマウス BST2に対するモノクローナル抗体のインターフェロン産生能へ の影響を示すグラフである。図中、横軸は処理に用いたハイプリドーマ培養上清の種 類を、縦軸は培養上清中の IFNひ濃度 (pg/mL)を示す。 CpGは CpGで処理した際、 P R8はインフルエンザウイルス PR8を感染させた際の結果を示す。
[図 11]作製したヒト BST2に対するモノクローナル抗体のインターフェロン産生能への 影響を示すグラフである。（a)はインターフェロン産生能への影響を示したグラフであり 、図中、横軸は処理に用いた抗体の種類と濃度、縦軸はヒト IPCを HSVで刺激した際 の培養上清中の IFN a濃度（pg/mL)を示す。（b)はクローン 3D3#7と 3G7#6の BST2サ ブタイプへの反応性を解析した結果である。
[図 12-1]野生型マウス（WT)あるいは IFNレセプターノックアウトマウス（IFNR-KO)の 各種細胞を CpGあるいはインフルエンザウイルス PR8で刺激した後、蛍光色素 Alexa4 88で標識した SNK01抗体で染色した図である。横軸は SNK01の蛍光強度、すなわち BST2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。 （a)は全脾臓細胞を解析した図、（b)は 各細胞を分画して解析した図、 （c)は IPCを分画して解析した図である。
[図 12-2]図 1 2 _ 1の続きを示す図である。
[図 13]ヒト IPCのマーカーとして抗 BDCA- 4、 BDCA- 2抗体を用いて、ヒト IPCを IFNひ にて刺激した際の BST2の発現を検討した図である。横軸は 5C 1 1#7抗体の蛍光強度 、すなわち BST2の発現強度を、縦軸は細胞数を示す。
園 14]ヒト IPCを CpGにて刺激した際の BST2の発現を検討した図である。横軸は、抗 ヒト BST2抗体 3E2#8、 5C 11#7の蛍光強度、すなわち BST2の発現強度を、縦軸は細 胞数を示す。それぞれ太線は CpGで刺激した場合、点線は未刺激の場合のパター ンを示す。
[図 15]抗マウス BST2抗体 SNK01を投与したマウスから採取した細胞を用いて解析し た図である。 （a)は投与のスケジュールを示す。 （b)は各臓器中の IPC割合を示し、横 軸が投与した抗体を、縦軸が IPCの割合を示す。 （-)は抗体のかわりに PBSのみを投 与した群を示す。 (c)は骨髄細胞を CpGあるいはインフルエンザウイルス PR8で刺激し た際に産生した IFNの濃度を示す。横軸が投与した抗体を示す。
[図 16]抗マウス BST2抗体 SNK01を投与し、ウィルス感染させたマウスを用いて解析し た図である。 （a)は投与のスケジュールを示す。 （b)は血清中の IFN aの濃度を示し、 横軸が投与した抗体を示す。 （c)は脾臓中の IPC割合を示し、横軸が投与した抗体を 、縦軸が IPCの割合を示す。 （-)は抗体のかわりに PBSのみを投与した群を示す。
[図 17]抗マウス BST2抗体 SNK01およびクローン 12、コントロール抗体であるラット IgG ( IgGと表記）を投与したマウスから細胞を採取して解析した図である。 (a)は各抗体を 投与したマウスのリンパ節細胞を FACSにて解析した結果の一例を示す。四角で示し た細胞画分が IPCである。 （b)は（a)の結果を元に、リンパ節中の IPCの割合をグラフ に示したものである。同様に、（c)、（d)はそれぞれ脾臓、末梢血中の IPC割合を示し、 横軸が投与した抗体を、縦軸が IPCの割合を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体を有効 成分として含有する IPCの活性抑制剤に関する。また本発明は、 BST2およびそのホ モログのいずれかまたは両方を認識する抗体を IPCに接触させる工程を含む、 IPCの 活性抑制方法に関する。更に本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは 両方を認識する抗体を投与する工程を含む、生体内において IPCの活性を抑制する 方法に関する。あるいは本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方 を認識する抗体の、 IPC活性抑制剤の製造における使用に関する。
[0017] 本発明において、 IPCはヒト BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を発現 し、かつ IFNを産生する細胞であれば特に限定されない。たとえば、ヒト、およびマウ スにおレ、ては、 IPCが BST2およびそのホモログのレ、ずれかまたは両方を発現してレ、る ことが確認された。したがって、ヒト、およびマウスの IPCは、本発明における IPCとして 好ましレ、。特にヒト IPCにおいては、その活性化に伴って BST2およびそのホモログの 発現レベルが顕著に上昇する。そのため、 BST2およびそのホモログを認識する抗体 は、ヒトにおいては、活性化された IPCに対して特異的に作用する。したがって、ヒト IP Cは本発明の IPCとして特に好ましい。
[0018] 本発明において、 BST2遺伝子は、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列によって定義 されるヒト由来の蛋白質である。配列番号： 2に記載のアミノ酸配列は配列番号： 1に 記載の塩基配列からなる cDNAによってコードされている。ヒト BST2の cDNAのクロー ユングと、モノクローナル抗体についての報告がある (Ishikawa J. et al. Genomics 26: 527, 1995; GenBank Acc#.D28137)0 BST2は、プレ B細胞増殖支持能を有する膜蛋 白質であるとされた (特開平 7-196694)。 BST2のゲノム遺伝子とプロモーターについて の知見も得られている (WO99/43803)。また、ヒト BST2は、ミエローマに対するモノクロ ーナル抗体である抗 HM1.24抗体が認識している抗原であることが明らかにされてい る (Ohmoto T. et al. B.B.R.C 258: 583， 1999)。抗 HM1.24抗体は、ヒトプラズマセルラ インを免疫原として樹立されたモノクローナル抗体である (Goto T. et al. Blood 84: 19 92， 1994)。 その後、抗 HMl.24抗体がミエローマを特異的に認識することが明らかにされ、ミエ ローマの治療を目的としてヒト化抗体が作成された (Ozaki S. et al. Blood 93: 3922， 1 999; ： WO98/14580)。ヒト化抗 HMl.24抗体は、造血組織の癌に対する治療効果を有 している (WO02/064159)。現在はその実用化を目指して臨床試験が進められている 。以上のようにヒト BST2は、造血器系の腫瘍におけるマーカーとして利用されている。 し力、し現在のところ BST2を認識する抗体と IPCの関連を示唆する報告は無い。
[0019] 本発明において、 BST2はそのホモログを含む。 BST2のホモログとは、配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質と定義することができ る。このような蛋白質は、天然に存在する蛋白質を含む。一般に真核生物の遺伝子 は、 IFN遺伝子等で知られているように、多型現象 (polymo卬 hism)を有する。この多型 現象によって生じた塩基配列の変化によって、 1または複数個のアミノ酸力 置換、 欠失、揷入、および Zまたは付加される場合がある。このようにヒトに由来する蛋白質 であって、かつ配列番号： 2に記載のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のァミノ 酸力 置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号： 2 に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質は、本発明の BST2ホ モログに含まれる。
[0020] 具体的には、たとえば BST2のスプライシングバリアント、あるいは遺伝子多型によつ て生じる変異体は、 BST2ホモログに含まれる。たとえば本発明者らは、配列番号： 1 の塩基配列からなる cDNAに対するスプライシングバリアントの存在を明らかにした。 このスプライシングバリアントは、配列番号： 3または配列番号： 5に示す塩基配列から なり、配列番号: 4または配列番号： 6に記載のアミノ酸配列をコードしていた。
本発明において、 BST2とはそのスプライシングバリアントを含む。したがって、これら のスプライシングバリアントは、いずれもヒト BST2あるいはマウス BST2に含まれる。以 下スプライシングバリアントをサブタイプと記載することもある。
[0021] あるいは多型現象によって塩基配列に変化はあっても、アミノ酸配列が変わらない 場合もある。このような塩基配列の変異は、サイレント変異と呼ばれる。サイレント変異 を有する塩基配列からなる遺伝子も、本発明に含まれる。なおここで言う多型現象と は、集団内において、ある遺伝子が個体間で異なる塩基配列を有することを言う。一 般に、遺伝学的には多型と変異は遺伝子型の分布率によって定義されている。しか し本発明においては、多型および変異は、特に断りが無ければ、いずれも、分布率 にかかわらず、異なる塩基配列が存在していることを示す用語として用いられる。
[0022] BST2のホモログは、ヒト以外の種における機能的に同等な蛋白質を含む。 BST2と 機能的に同等な蛋白質は、たとえばハイブリダィゼーシヨンを利用して同定すること ができる。すなわち、配列番号： 1に示すような BST2をコードするポリヌクレオチド、あ るいはその断片をプローブとし、これとハイブリダィズすることができるポリヌクレオチド を単離するのである。ノ、イブリダィゼーシヨンをストリンジェントな条件下で実施すれば 、塩基配列としては相同性の高いポリヌクレオチドが選択され、その結果として単離さ れる蛋白質には BST2と機能的に同等なタンパク質が含まれる可能性が高まる。
[0023] 本発明者らは、 BST2のマウスにおけるホモログに対する抗体力 ヒトにおける抗体と 同様にマウス IPCの活性を抑制することを確認した。マウス BST2は、配列番号： 9に記 載の塩基配列を有し配列番号： 10に記載のアミノ酸配列をコードしていた。更に本発 明者らは、 BST2のスプライシングバリアントである BST2Hについても同様に、マウスに おけるホモログの存在を確認した。マウス BST2Hの塩基配列は配列番号： 7に、この 塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号： 8に示した。マウスの BST2H に対する抗体も、 IPCの活性を抑制することが確認された。
本発明において明らかにされたヒトとマウスの BST2とそのホモログの塩基配列情報 、およびアミノ酸配列情報を以下にまとめた。
塩基配列 アミノ酸配列 アミノ酸配列の長さ ヒト BST2D 配列番号： 1 配列番号： 2 (180)
ヒト BST2H 配列番号： 3 配列番号： 4 (158)
ヒト BST2HS 配列番号： 5 配列番号： 6 (100)
マウス BST2H 配列番号： 7 配列番号： 8 (178)
マウス BST2D 配列番号： 9 配列番号： 10 (172)
マウス BST2HS 配列番号： 22 配列番号： 23 (105)
[0024] なおストリンジヱントな条件とは、具体的には例えば 6 X SSC、 40%ホルムアミド、 25°C でのハイブリダィゼーシヨンと、 1 X SSC、 55°Cでの洗浄といった条件を含む。ストリン ジエンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右される 。当業者は、これらの条件を必要なストリンジエンシーを得られるように適宜調節する こと力 Sできる。
[0025] ハイブリダィゼーシヨンを利用することによって、たとえばヒト以外の動物種における BST2のホモログをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。ヒト以外の動物 種、すなわちマウス、ラット、ゥサギ、ブタ、あるいはャギ等の動物種から得ることがで きるポリヌクレオチドがコードする BST2のホモログは、本発明における機能的に同等 な蛋白質を構成する。
[0026] ハイブリダィゼーシヨン技術等を利用して単離されるポリヌクレオチドがコードする蛋 白質は、通常、ヒト BST2D (配列番号： 2)とアミノ酸配列において高い相同性を有する 。高い相同性とは、少なくとも 30。/o以上、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 80% 以上（例えば、 95。/0以上、あるいは 98。/0、更には 99。/0以上）の配列の同一性を指す。 塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジ一検索サイト を利用して調べることができる [例えば日本 DNAデータバンク（DDBJ)において、 FAS TA、 BLAST, PSI_BLAST、および SSEARCH等の相同性検索が利用できる [例えば 日本 DNAデータバンク（DDBJ)のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis)の へ1 ~~ン； http://www.aabj.nig.ac.jp/E_mail/homology_j.html]。まブこ、 Nationalし ente r for Biotechnology Information (NCBI)において、 BLASTを用いた検索を行うことが できる（例えば NCBIのホームページのウェブサイトの BLASTのページ； http：〃 www.n cbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403— 10; Altschul, S.F. & Gish, W.， Meth. Enzymol., 1996， 266:460-480; Altschul, S.F. et al. ， Nucleic Acids Res., 1997， 25:3389-3402) 0
[0027] 例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラム に blastpを用い、 Expect値を 10、 Filterは全て OFFにして、 Matrixに BLOSUM62を用 レヽ、 Gap existence cost、 Per residue gap cost、および Lambaa ratioをそれてれ 11、 1 、 0.85 (デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性 (identity)の値 (％)を得ることが できる（Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Pro Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873—7)。 [0028] 更に既に構造が明らかにされている cDNA、あるいはゲノム DNAの塩基配列情報の 検索によって、他の種における BST2ホモログを見出すこともできる。すなわち、公知 の塩基配列情報あるいはアミノ酸配列情報を蓄積したデータベースを対象として、ヒ ト BST2の塩基配列情報および Zまたはアミノ酸配列情報をクエリーとする相同性検 索によって、類似の配列情報が検索される。もしも他の種に由来する相同性の高い 既知の遺伝子並びに蛋白質がデータベース中に存在すれば、相同性検索によって それを見出すことができる。遺伝子の全長が同定されていなくても、 ESTなどの断片 配列情報が得られれば、インシリコクローユングによって、遺伝子の全長配列を構成 できる場合もある。こうして明らかにされた他の種に由来するホモログについて、実際 に当該動物種の IPCにおける発現が確認できれば、本発明における BST2のホモログ として利用することができる。
[0029] 本発明においてインターフェロン産生細胞 (IPC)は、 IFN産生能を有し、かつ細胞表 面に BST2およびそのホモログのレ、ずれかまたは両方を発現する細胞を言う。 BST2お よびそのホモログのいずれ力または両方は、細胞の活性化に伴って発現する場合が 含まれる。たとえばヒト並びにマウスにおいて、榭状細胞の前駆細胞であって、刺激 により IFNを産生する細胞は、 IPCとして好ましい。以下、特に断りの無い場合には、 IP Cは、樹状細胞の前駆細胞である細胞のみならず、 IFN産生能を有し、かつ細胞表 面に BST2およびそのホモログのレ、ずれかまたは両方を発現する細胞を含む。このよ うな IPCの同定方法は公知である。たとえばいくつかの細胞表面マーカーを指標とし て IPCを他の血液細胞と識別することができる。具体的には、ヒ HPCの細胞表面マー カーのプロファイルは次のとおりである (Shortman，K. and Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161， 2002)。近年になって、 BDCA-2陽性細胞を IPCと位置づける報告もある (Dzi onek, A. et al. J. Immunol. 165: 6037 - 6046， 2000.)。
[ヒト IPCの細胞表面抗原のプロファイル]
CD4陽性、 CD123陽性、
Lineage(CD3、 CD14、 CD16、 CD19、 CD20、 CD56)陰性、 CDl lc陰性
したがって、これらの公知のマーカーの発現プロファイルを持ち、 IFN産生能を持つ 細胞を IPCと言うこともできる。更に、これらのマーカーの発現プロファイルの発現パタ 一ンとは異なるプロファイルを持つ細胞群であっても、 IFN産生能を有する生体中の 細胞は IPCに含まれる。
[0030] あるいはマウス IPCは、以下のプロファイルによって定義されている。
[マウス IPCの細胞表面抗原のプロファイル]
_ CD l lc、 B220、 Ly6C、および CD45RBが陽性
_ CD l lb、 CD3、 CD 19が陰性
更に、ヒトあるいはマウスの IPCに共通して見られる特徴として、以下のような特徴を 示すことができる。
[細胞の形態上の特徴]
—プラズマ細胞に似ている
一細胞表面が平滑な丸い細胞
一核が比較的大きい
[細胞の機能的な特徴]
ウィルス感染時に、短期間に大量の Type-1 interferonを産生する
ウィルス感染後、榭状細胞に分化する
[0031] 本発明において、 IPCの活性抑制とは、 IPCが有する機能の少なくとも一つを抑制 することを言う。 IPCの機能として、 IFNの産生と細胞生存を示すことができる。細胞の 生存は、細胞数と言い換えることもできる。したがって、これらの機能の両方あるいは いずれかを抑制する場合に、 IPCの活性を抑制すると言う。 IPCによって産生されるタ ィプ 1IFNが種々の疾患の原因となっていることが明らかにされている。したがってそ の産生を抑制することは、それらの疾患の治療戦略として有用である。
たとえば、 自己免疫性の疾患の病態と IFNひの関連性が指摘されている。 IFN aの 大部分が IPCによって産生されている。したがってその産生を抑制すれば、 IFNひに よってもたらされる病態を緩和すること力できる。なお本発明において、 IPCによる IFN 産生抑制とは、 IPCが産生する IFNの少なくとも 1種類の IFN産生を抑制することを言う 。本発明における好ましい IFNは、タイプ 1IFNである。中でも IFNひは重要である。
[0032] すなわち本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗 体を有効成分として含有する、 IFN産生抑制剤に関する。あるいは本発明は、 BST2 およびそのホモログのレ、ずれかまたは両方を認識する抗体を投与する工程を含む、 I FNの産生抑制方法を提供する。更に本発明は、 BST2およびそのホモログのいずれ 力または両方を認識する抗体の、 IFNの産生を抑制するための医薬組成物の製造に おける使用に関する。
[0033] IPCには、少数の細胞で大量の IFNを産生する細胞が含まれる。たとえば、ウィルス などで刺激を受けた樹状細胞の前駆細胞は、生体が産生する IFNの大部分を産生 する。大量の IFNを産生する IPCの細胞数を抑制することは、結果として IFNの産生量 を抑制することになる。したがって、 IPCの細胞数の抑制によっても、 IFNひによっても たらされる病態を緩和することができる。
[0034] 本発明に用いる BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体は 、 BST2およびそのホモログ、あるいはそれらの断片を免疫原として調製することがで きる。本発明における抗体は、任意のクラスであってよい。また抗体が由来する生物 種も限定されない。更に、抗体の抗原結合領域を含む断片を抗体として用いることが できる。たとえば IgGの酵素的な消化によって生成される、抗原結合部位を含む抗体 断片も、本発明における抗体として利用することができる。具体的には、パパインある いはトリプシンによる消化によって、 Fabあるいは F(ab')などの抗体断片を得ることが
2
できる。これらの抗体断片は、抗原との結合親和性を有する抗体分子として利用しう ることは周知である。あるいは、必要な抗原結合活性を維持している限り、遺伝子組 み換えによって構築された抗体を用いることもできる。遺伝子組み換えによって構築 された抗体とは、たとえばキメラ抗体、 CDR移植抗体、シングルチヱイン Fv、 diabody ( diabodies),線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を示すことがで きる。任意の免疫原を利用してこれらの抗体を得る方法は公知である。
[0035] 本発明において、抗体は、必要に応じて修飾することができる。本発明によれば、 B ST2またはそのホモログのレ、ずれかまたは両方を認識する抗体は、 IPCの細胞数を抑 制する作用を有する。すなわち、抗体そのものが IPCに対する細胞障害作用を有して レ、ると考えられた。強いエフェクター作用を示す抗体のサブクラスは公知である。ある レ、は、抗体を細胞障害物質 (cytotoxic agent)によって修飾することによって、 IPCの活 性抑制効果を更に増強することができる。細胞障害物質としては、以下のような物質 を示すことができる。
トキシン類：緑膿菌毒素 (Pseudomonas Endotoxin; PE)、ジフテリアトキシン、リシン 放射性同位元素: Tc"m、 Sr89、 I131、 Y90
抗癌剤：カリキアマイシン、マイトマイシン、パクリタキセル
蛋白質力もなるトキシン類は、 2官能性試薬によって抗体あるいはその断片などに 結合すること力 Sできる。あるいは、抗体をコードする遺伝子にトキシン類をコードする 遺伝子を接合し、両者の融合蛋白質を得ることもできる。放射性同位元素を抗体に 結合する方法も公知である。たとえば、キレート剤を利用して、抗体を放射性同位元 素で標識する方法が公知である。更に抗癌剤は、糖鎖あるいは 2官能性試薬などの 利用により、抗体に結合することができる。
[0036] 本発明において用いられる抗体は、人為的に構造を改変された抗体であっても良 レ、。たとえば、抗体の細胞障害作用や安定性を改善するための様々な修飾方法が 公知である。具体的には、重鎖の糖鎖が改変されたィムノグロブリンが知られている（ Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem.278:3466-3473. 2003·)。糖鎖の改変によって、ィム ノグロブリンの ADCC (抗体依存性の細胞障害; Antibody Dependent Cell-mediated C ytotoxicity)活性が増強された。あるいは、 Fc領域のアミノ酸配列を改変されたィムノ グロブリンも公知である。すなわち、ィムノグロブリンの Fc受容体との結合活性を人為 的に高めることによって、 ADCC活性が増強された（Shield,RL.et al. J.Biol.Chem. 27 6;6591- 6604， 2001.)。
また、 Fc受容体に結合した IgGは、細胞内にいったん取り込まれる。その後、エンド ソームに発現した Fc受容体と結合して、再び血中に放出される現象が明らかにされ ている。 Fc受容体との結合活性が高い IgGは、細胞に取り込まれた後に再び血中に 放出される可能性が高まる。その結果、 IgGの血中における滞留期間が延長される (H inton'PR. et al. J Biol Chem. 279:6213-6216. 2004)。その他、 Fc領域のアミノ酸配列 の改変は、 CDC (補体依存性の細胞障害作用; Complement D印 endent Cytotoxicity )活性の変化をもたらすとも言われている。これらの改変を施した抗体を本発明にお ける抗体として用いることができる。
[0037] たとえばモノクローナル抗体は、当該モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞 力 採取することができる。本発明に用いることができるモノクローナル抗体の産生細 胞は、たとえば BST2またはそのホモログ、その断片、あるいはそれらを産生する細胞 またはその細胞膜分画を免疫原として免疫動物に投与し、その抗体産生細胞をクロ 一ユングすることによって取得することができる。すなわち本発明は、次の工程を含 む、 IPCの活性を抑制する抗体の製造方法を提供する。
(1) BST2またはそのホモログを免疫原として免疫動物に投与する工程
(2) (1)の免疫動物の抗体産生細胞から、 BST2を認識する抗体を産生する抗体産生 細胞を選択する工程、
(3) (2)で選択された抗体産生細胞を培養するか、または当該抗体産生細胞が産生す る抗体をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を発現可能に保持する細胞を培養 する工程、および
(4) (3)の培養物からインターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体を回収する工程 一般的なモノクローナル抗体の製造方法においては、免疫細胞と腫瘍細胞との細 胞融合によって得られるハイプリドーマが抗体産生細胞として利用される。本発明に おける免疫原には、 BST2またはそのホモログ、あるいはその断片を用いることができ る。免疫原は、それをコードする遺伝子で形質転換した細胞から精製することができ る。更に、 BST2またはそのホモログを発現している細胞を免疫原として利用すること ができる。このような細胞としては、具体的には以下のような細胞を示すことができる。 これらの細胞の細胞膜分画を免疫原とすることもできる。
—生体力 採取された IPC
一造血幹細胞などから分化誘導された IPC
—外来性の BST2またはそのホモログ遺伝子を発現可能に保持する細胞
生体から IPCを採取するためには、たとえば先に述べたような細胞表面マーカーの 発現プロファイルに基づいて、 目的とする細胞を採取すればよい。複数の細胞表面 マーカーを指標として特定の細胞を集めるための方法は公知である。たとえば免疫 染色とセルソーターを利用することによって、 目的とする発現プロファイルに適合する 細胞を容易に分取することができる。たとえばヒトの IPCは、 BDCA-2陽性細胞を選択 することにより、 IPCが濃縮される。ヒトから採取された IPCは、必要に応じて活性化さ れた後に免疫原として利用される。
IPCは、生体の末梢血あるいは造血組織以外に、培養細胞として得ることもできる。 たとえばヒトおよびマウスの造血幹細胞を培養し、 IPCに分化させることによって大量 に得ることができる。ヒトおよびマウス造血幹細胞を in vitroで IPCに分化させるための 条件は公知である。
[0039] たとえば、 in vitroにおける造血幹細胞からのヒト (Blom， B. et al.J.Exp.Med. 192: 17 85-1796， 2000.； Chen, W. et al. Blood 103: 2547-2553, 2004.)、およびマウス (Gillie rt et al 2002, J. Exp. Med. 958-953)の IPCの誘導が報告されている。あるいは in vivo でのマウス IPCの誘導も公知である (Bjorckらの Blood 2001, 3520-3526)。 in vitroで 分化させた IPCは、 IPCを認識するモノクローナル抗体を得るための免疫原として有 利である。
[0040] 具体的には、造血幹細胞を含む細胞集団を IPC誘導剤の存在下で培養することに より、 IPCへの分化が誘導される。造血幹細胞を含む細胞集団としては、たとえば骨 髄細胞を用いることができる。また IPC誘導剤には、 FLT-3リガンド、あるいは FLT-3リ ガンドとトロンボポェチン (thrombopoietin;TPO)の組み合わせを用いることができる。 培地中の FLT-3リガンドの濃度は、通常 1〜： 100ng/mLとすることができる。その他の 培養条件は、一般的な血液細胞の培養条件を応用すればよい。すなわち基礎培地 としては、 RPMI1640等を用レ、、更に 10%程度の牛胎児血清を加えることができる。ある レ、はヒ HPCの誘導においては、 Yssel's Mediumが用いられた。 in vitroにおける IPCへ の分化は、ヒトでは、たとえば 25日前後にピークを迎える。
[0041] 培養された造血幹細胞から、 IPCに分化した細胞を取得すれば、免疫原のための I PCを得ること力できる。実際には、レ、くつかの細胞表面マーカーを利用して、 IPCに 特徴的な細胞表面抗原を有する細胞を分取する。すなわち、たとえば BDCA-2陽性 細胞をヒ HPCとして取得することができる。あるいは、 CDl lc陽性、 CDl lb陰性、およ び B220陽性の細胞分画をセルソーターで分取しマウス IPCを得ることができる。
あるいは、既に IPC特異的であることが明らかな抗体を利用して、当該抗体陽性の 細胞を IPCとして分取することもできる。本発明者らが樹立した、マウス IPC特異抗原 を認識するモノクローナル抗体産生細胞 2E6(WO 2004/013325, FERM-BP-8445)が 産生するモノクローナル抗体を、マウス IPCの分取に利用することができる。
[0042] IPCは、末梢血力 分取することもできる。しかし先に述べたように IPCの末梢血にお けるポピュレーションは極めて低いので、末梢血力 IPCを採集するには多量の血液 が必要となる。したがって、免疫原とする IPCには、造血幹細胞から分化させた細胞を 利用するのが有利である。
[0043] 本発明に用いるモノクローナル抗体の調製においては、 IPCのみならず、配列番号
: 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの配列番号 に記載のアミノ酸配歹 1Jを含む蛋白質、またはその断片を免疫原として利用することも できる。本発明のモノクローナル抗体は、配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番 号： 6からなる群から選択されるレ、ずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋 白質を抗原として認識していることが明らかにされた。したがって、これらの蛋白質を 免疫原として用いることによって、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
[0044] 配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれか の配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質は、組み換え体として得ることができ る。たとえば配列番号： 1に記載の塩基配列は、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列を コードしている。また配列番号： 3に記載の塩基配列は配列番号: 4に記載のアミノ酸 配列をコードしている。したがって、これらの塩基配列からなる DNAを適当な宿主一 ベクターを使って発現させれば、 目的とする蛋白質を得ること力 Sできる。
[0045] あるいは、配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択され るいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列 力 なるオリゴペプチドを免疫原とすることもできる。免疫原として選択すべきアミノ酸 配列は、たとえば 5— 50、好ましくは 7— 20程度のアミノ酸からなる。任意のアミノ酸 配列を有するオリゴペプチドを得る方法は公知である。たとえば、化学的にアミノ酸を 結合させて、 目的とするアミノ酸配列を有するオリゴペプチドを得ることができる。ある いは、上記組み換え体として得られた全長アミノ酸配列を有する蛋白質を切断するこ とによって、所定のアミノ酸配列を有する断片を得ることもできる。得られたオリゴぺプ チドは、適当なキャリアー蛋白質と結合することによって、より免疫原性を高めることが できる。キャリアー蛋白質には、キーホールリンペットへモシァニンゃゥシ血清アルブ ミンなどが用いられる。
[0046] 配列番号： 2と、配列番号: 4および配列番号： 6のアミノ酸配列の大部分は一致して いる。したがって、共通のアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列を利用することに よって、これらの蛋白質の全てを認識するモノクローナル抗体を得ることができる。こ のような抗体は、いずれかのサブタイプを発現する細胞に作用してその活性を調節 すること力 Sできる。実際に、全てのサブタイプに結合する抗体 3G7#6が、 IPCの活性を 調節することが実施例にぉレ、て確認されてレ、る。
[0047] また 3種類の蛋白質のそれぞれについて、 2種類が共有するアミノ酸配列を利用す ることによって、特定の 2つの蛋白質を、他の 1つと識別することができる。あるいは各 アミノ酸配列に固有のアミノ酸配列を利用することによって、各蛋白質を特異的に識 別するモノクローナル抗体を取得することもできる。たとえば、配列番号: 4に記載の アミノ酸配列において、 N末端力ら 139〜158のアミノ酸配歹 IJは、配列番号： 4に固有 のアミノ酸配列である。同様に、配列番号： 6に記載のアミノ酸配列においては、 N末 端から 96〜： 100のアミノ酸配列力 配列番号： 6に固有のアミノ酸配列である。このよ うなアミノ酸配列によって構成されるェピトープを認識する抗体は、当該抗体が認識 するサブタイプを発現する細胞に作用してその活性を調節することができる。実際、 実施例に示したように、配列番号: 4 (hBST2H)特異的な抗体 3D3#7は、 IPCの活性を 調節した。
[0048] モノクローナル抗体を得るためには、続いて免疫原を、適当な免疫動物に免疫する 。 IPCは適当なアジュバントとともに免疫動物へ投与することができる。あるいは、配列 番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの配列 番号に記載の蛋白質、若しくはその部分アミノ酸配列からなるペプチドを、アジュバ ントとともに免疫動物に投与することができる。
[0049] 更に、配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるい ずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列をコードする DNAを発現可能に保持した形 質転換細胞を免疫原として利用することができる。たとえば配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれかの配列番号に記載の塩基 配列のコード領域を構成する塩基配列を含む DNAは、上記 DNAとして好ましい。これ らの DNAを適当な発現ベクターに組み込み、宿主細胞を形質転換すれば免疫原とし て有用な形質転換細胞を得ることができる。
[0050] 免疫原とするための宿主細胞は、免疫動物と同じ種に由来する細胞とすることがで きる。同種の細胞を用いることにより、外来性の蛋白質に対する特異的な免疫応答を 誘導すること力 Sできる。たとえば、免疫動物にラットを用いるのであれば、ラットに由来 する宿主細胞を用いるのが有利である。上記蛋白質を含む形質転換細胞の分画を 免疫原として用いることもできる。実施例に示したように、配列番号： 2、配列番号: 4、 および配列番号： 6からなる群から選択されるレ、ずれかの配列番号に記載のアミノ酸 配列には、膜貫通ドメインが見られた（図 8の膜貫通領域; trasmembrane region) 0し たがって、これらのアミノ酸配列を有する蛋白質は、細胞膜に発現する可能性がある 。実際に COS細胞に発現させた場合には、配列番号: 8および配列番号： 10に記載 のアミノ酸配列を有する蛋白質は、形質転換体培養物の沈殿分画においてより多く の蛋白質が検出された。したがって、上記蛋白質を発現する細胞の、細胞膜分画を 免疫原として利用できる。
[0051] 本発明における免疫動物は、 IPCを異物と認識するあらゆる非ヒト脊椎動物を利用 すること力 Sできる。モノクローナル抗体を得るためには、ハイプリドーマとするための融 合パートナーの入手が容易な動物が有利である。たとえば、マウス、ラット、ラビット、 ゥシ、ャギなどの細胞に由来するハイブリドーマの樹立が確立されている。これらの 免疫動物を、本発明に用いることができる。一方アジュバントには、フロイントの完全 アジュバントゃフロイントの不完全アジュバント等が用いられる。
[0052] 免疫動物は、 3〜： 10日間隔で複数回免疫される。 1回の免疫に用いられる IPCの数 は、任意である。通常、 103〜： 108、たとえば 106の IPCが免疫される。また蛋白質ゃぺ プチドによる免疫においては、一般に 1〜： 100 x gが免疫される。複数回の免疫を経 た免疫動物から免疫担当細胞を回収し、 目的とする抗体を産生する細胞をクロー二 ングすることにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。免疫担当細胞 とは、免疫動物において抗体産生能を有する細胞を言う。
[0053] 免疫担当細胞は、たとえばハイプリドーマ法によってクローニングすることができる。 免疫担当細胞は、 1つの細胞が 1種類の抗体を産生している。したがって、 1つの細 胞に由来する細胞集団を確立すること（すなわちクローニング）ができれば、モノクロ ーナル抗体を得ることができる。ノ、イブリドーマ法とは、免疫担当細胞を適当な細胞 株と融合させ、不死化する (immortalize)した後にクローニングする方法を言う。ハイブ リドーマ法に有用な多くの細胞株が知られている。これらの細胞株は、リンパ球系細 胞の不死化効率に優れ、かつ細胞融合に成功した細胞の選択に必要な各種の遺伝 マーカーを有している。更に抗体産生細胞の取得を目的とする場合には、抗体産生 能を欠落した細胞株を用いることもできる。
[0054] たとえばマウスミエローマ P3x63Ag8.653(ATCC CRL- 1580)は、マウスやラットの糸田 胞融合法に有用な細胞株として広く用いられている。本発明においては、マウスの IP Cを免疫原としているので、免疫動物はマウス以外の動物となる。一般にハイプリドー マは、同種の細胞の融合によって作成されるが、近縁の異種間でのヘテロハイブリド 一マからモノクローナル抗体を取得することもできる。
[0055] 細胞融合の具体的なプロトコルは公知である。すなわち、免疫動物の免疫担当細 胞を適当な融合パートナーと混合し、細胞融合させる。免疫担当細胞には、脾細胞 や末梢血 B細胞などが用いられる。融合パートナーとしては、先に述べた各種の細胞 株を利用することができる。細胞融合には、ポリエチレングリコール法や、電気融合法 が用いられる。
次に、融合細胞が有する選択マーカーに基づいて、細胞融合に成功した細胞が選 択される。たとえば HAT感受性の細胞株を細胞融合に用いた場合には、 HAT培地に おいて成育する細胞を選択することによって、細胞融合に成功した細胞が選択され る。更に選択された細胞が産生する抗体が、 目的とする反応性を有していることを確 認する。
[0056] 各ハイブリドーマは、抗体の反応性に基づいて、スクリーニングされる。すなわち、 B ST2およびそのホモログのいずれ力、または両方に結合する抗体を産生するハイブリド 一マが選択される。好ましくは、選択されたハイプリドーマをサブクローユングし、最終 的に目的とする抗体の産生が確認された場合に、本発明のモノクローナル抗体を産 生するハイプリドーマとして選択する。 [0057] 具体的には、たとえば配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群か ら選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質や、その部 分アミノ酸配列からなるペプチドを抗原としてスクリーニングすることができる。抗原を 適当な固相に結合し、抗原に結合するモノクローナル抗体を、免疫動物のィムノグロ ブリンを認識する標識抗体によって検出することができる。マイクロプレートの内壁に 抗原を結合させ、酵素標識抗体を使った EUSA法を利用すれば、モノクローナル抗 体を迅速にスクリーニングすることができる。抗原に対する結合活性が確認されたモ ノクローナル抗体は、必要に応じて実際に IPCの活性に与える影響が確認される。 IP Cに対する影響は、たとえば後に述べるような方法によって確認することができる。
[0058] このようなモノクローナル抗体は、当該ハイプリドーマ力 抗体の抗原結合領域をコ ードする cDNAを取得し、これを適当な発現ベクターに揷入することによって発現させ ること力 Sできる。抗体の可変領域をコードする cDNAを取得し、適当な宿主細胞に発 現させる技術は公知である。また抗原結合領域を含む可変領域を、定常領域と結合 させることによってキメラ抗体とする手法も公知である。
[0059] 更に、モノクローナル抗体の抗原結合活性を他のィムノグロブリンに移植することも できる。ィムノグロブリンの抗原結合領域は、相補性決定領域（CDR)と、フレーム領域 で構成されている。各ィムノグロブリンの抗原結合特性は CDRによって決定されてお り、フレームは抗原結合領域の構造を維持している。 CDRのアミノ酸配列がきわめて 多様性に富むのに対して、フレーム部分のアミノ酸配列は高度に保存されている。 C DRの抗原を他のィムノグロブリン分子のフレーム領域に組み込むことによって、抗原 結合活性も移植できることが知られている。この方法を利用して、異種のィムノグロブ リンが有する抗原結合特性をヒト ·ィムノグロブリンに移植する方法が確立されている
[0060] このようにして作成されたモノクローナル抗体はいずれも本発明に利用することがで きる。すなわち、当該モノクローナル抗体の抗原結合領域をコードする cDNAに由来 するポリヌクレオチドによってコードされた抗原結合領域を含むィムノグロブリンからな るモノクローナル抗体を本発明に利用することができる。
本発明に利用することができるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマとして 、たとえば、ハイプリドーマ 3D3#7あるいは 3G7#6を示すことができる。ハイプリドーマ 3 D3#7およびハイブリドーマ 3G7#6は、 2005年 5月 27日付けで独立行政法人産業技 術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、受領番号 FERM ABP-10339およ び受領番号 FERM ABP-10340として寄託されている。以下に、寄託を特定する内容 を記載する。
(a)寄託機関の名称'あて名
名称:独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター
あて名：日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 1号中央第 6 (郵便番号 305-8566)
(b)寄託曰： 2005年 5月 27曰
(c)受領番号: ABP-10339 (ハイブリドーマ 3D3#7)
(c)受領番号: ABP-10340 (ハイブリドーマ 3G7#6)
[0061] 本発明に利用するためのモノクローナル抗体は、それを産生するハイブリドーマを 培養しその培養物から回収することができる。ハイプリドーマは、 in vitroまたは in vivo で培養することができる。 in vitroにおいては、 RPMI1640などの公知の培地を用いて 、ハイプリドーマを培養することができる。培養上清には当該ハイプリドーマが分泌し たィムノグロブリンが蓄積される。したがって、培養上清を採取し、必要に応じて精製 することにより、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。培地には、血清を 添加しない方が、ィムノグロブリンの精製が容易である。しかし、ハイプリドーマのより 迅速な増殖と、抗体産生の促進を目的として、 10%程度のゥシ胎児血清を培地に加 免ることちでさる。
[0062] ハイプリドーマは、 in vivoにおいて培養することもできる。具体的には、ヌードマウス の腹腔にハイプリドーマを接種することにより、腹腔内でハイプリドーマを培養するこ とができる。モノクローナル抗体は、腹水中に蓄積する。したがって、腹水を採取し、 必要に応じて精製すれば、必要なモノクローナル抗体を得ることができる。得られた モノクローナル抗体は、 目的に応じて適宜、修飾、あるいは加工することができる。
[0063] BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方に結合する抗体は、 IPCに接触さ せるとその活性を抑制する。したがってこれらの抗体を、 IPCの活性抑制剤、あるいは 抑制方法に利用することができる。すなわち本発明は、下記 (a)-(c)からなる群から選 択される少なくとも 1種類の成分を有効成分として含む、 IPCの活性抑制剤を提供す る。あるいは本発明は、下記 (a)-(c)からなる群から選択される少なくとも 1種類の成分 を投与する工程を含む IPCの活性抑制方法に関する。更に本発明は、下記 (a)-(c)か らなる群から選択される少なくとも 1種類の成分の IPC活性調節剤の製造における使 用に関する。
(a) BST2およびそのホモログのレ、ずれかまたは両方に結合する抗体、またはその抗 原結合領域を含む断片
(b) (a)の抗体の相補性決定領域を移植したィムノグロブリン、またはその抗原結合領 域を含む断片、および
(c) (a)または (b)に記載の成分をコードするポリヌクレオチド
本発明において、 IPCの活性を抑制するモノクローナル抗体としては、配列番号： 2 、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの配列番号に 記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識するモノクローナル抗体を利用することが できる。本発明においては、 1種類あるいは複数種類のモノクローナル抗体を利用す ること力 Sできる。たとえば、ある特定の BST2またはそのサブタイプを認識する複数種 のモノクローナル抗体を配合して、本発明に利用することができる。あるいは、異なる BST2またはそのサブタイプを認識する複数種のモノクローナル抗体を組み合わせて 用レ、ることちでさる
[0064] 抗体が IPCの IFN産生活性の抑制作用を有することは次のようにして確認することが できる。 IPCはウィルスの刺激によって IFNを大量に産生する。 IPCに対するウィルス 刺激の前、後、あるいはウィルス刺激と同時に抗体を与え、抗体を与えない IPCを対 照として、 IFNの産生能を比較する。 IFN産生能は、 IPCの培養上清中に含まれる IFN -ひや IFN_ j3を測定することによって評価することができる。比較の結果、抗体の添 加によって、上清中の IFNの量が有意に低下すれば、試験された抗体は、 IFN産生 能を抑制する作用を有することが確認できる。これら IFNの測定方法は公知である。 I PCは、生体における IFNの大部分を産生する細胞である。したがって、 IPCの IFN産 生能の抑制によって、生体の IFNの産生状態を調節することができる。
[0065] 本発明において、 IPC活性には IPCの細胞数の維持が含まれる。したがって本発明 における IPCの活性の抑制は、 IPCの細胞数の抑制を含む。 IFN産生と同様に、感染 性のウィルスなどの刺激によって IPCの活性化が誘導される。活性化された IPCの細 胞数が、抗体の存在下で抑制されることを確認すれば、当該抗体が IPCの活性を抑 制していることがわかる。比較対照としては、 IFN産生と同様に、活性を確認すべき抗 体と同じ動物種に由来する不活性なィムノグロブリンを用いることができる。 IPCの細 胞数は、細胞の計数によって定量的に比較することができる。細胞数は、 FACSゃ顕 微鏡によって計数することができる。
[0066] また、 IPCはウィルスなどの感染の結果 DC 2(Dendritic Cell 2)という Th2を誘導する 細胞へ分化するとも言われてレ、る。ウィルス刺激による IPCの IFN産生を抑制できれ ば、 Th2への分化も抑制できる可能性がある。したがって、 IFN産生を抑制する本発 明のモノクローナル抗体は、各種アレルギー疾患の治療効果も期待できる。
[0067] BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体を、その抗体が由 来する生物種とは異なる宿主に投与する場合には、当該宿主にとって異物と認識さ れにくい形に加工するのが望ましい。たとえば、次のような分子に加工することにより 、ィムノグロブリンを異物として認識されにくくすることができる。ィムノグロブリン分子 を以下のように加工する手法は公知である。
一定常領域を欠失した抗原結合領域を含む断片 (Monoclonal Antibodies： Principle s and Practice, third edition, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
モノクローナル抗体の抗原結合領域と宿主のィムノグロブリンの定常領域とで構成 されるキメラ抗体 (遺伝子発現実験マ二ユアノレ 講談社 1994年 （石田 功、安東 民衛 編））
—宿主のィムノグロブリンにおける相補性決定領域 (CDR)をモノクローナル抗体の CD Rに置換した CDR置換抗体 (遺伝子発現実験マニュアル 講談社 1994年 （石田 功、安東 民衛 編)）
[0068] あるいはヒト抗体遺伝子を組み込まれた非ヒト動物を免疫動物として用いることによ り、非ヒト動物を用いながら、ヒト抗体を得ること力 Sできる。たとえば、ヒト抗体遺伝子を 組み込んだトランスジヱニックマウス力 S、ヒト抗体を製造するための免疫動物として実 用化されている (Ishida et al" Cloning and Stem Cells, 4:85-95,2002)。このような動物 を用いることにより、ヒトの BST2を抗原として、 BST2を認識するヒト抗体を得ることがで きる。ヒト抗体は、ヒトに投与する抗体として好ましい抗体である。
[0069] あるレ、は、ファージディスプレー法 (McCafferty J. et al., Nature 348:552-554, 1990;
Kretzschmar T et.al , Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec; 13(6):598_602.)によって、ヒト のィムノグロブリン可変領域遺伝子を取得することもできる。ファージディスプレー法 においては、ヒトイムノグロブリン可変領域をコードする遺伝子がファージ遺伝子に組 み込まれる。多様なィムノグロブリン遺伝子をソースとして、ファージライブラリーを作 成することもできる。ファージは自身を構成する蛋白質の融合蛋白質として、当該可 変領域を発現する。ファージによって発現されたファージ表面の可変領域は、抗原と の結合活性を維持している。したがって、抗原あるいは抗原を発現した細胞などに結 合するファージを選択することによって、ファージライブラリーから、 目的とする結合活 性を有する可変領域を発現したファージをスクリーニングすることができる。更に、こう して選択されたファージ粒子の中には、 目的とする結合活性を有する可変領域をコ ードする遺伝子が保持されている。すなわち、ファージディスプレー法においては、 可変領域の結合活性を指標として、 目的とする結合活性を有する可変領域をコード してレ、る遺伝子を取得することができる。
[0070] 本発明による IPCの活性抑制斉 lj、または抑制方法において、 BST2およびそのホモ ログのいずれ力または両方を認識する抗体またはその断片は、蛋白質として、あるい はそれをコードするポリヌクレオチドとして、投与することができる。ポリヌクレオチドを 投与するには、 目的とする蛋白質を発現できるように、適当なプロモーターの制御下 に目的とする蛋白質をコードするポリヌクレオチドを配置したベクターを利用するのが 望ましい。ベクターには、ェンハンサーゃターミネータ一を配置することもできる。ィム ノグロブリンを構成する重鎖と軽鎖の遺伝子を保持し、ィムノグロブリン分子を発現す ることができるベクターが公知である。
ィムノグロブリンを発現することができるベクターは、細胞に導入することにより投与 すること力 Sできる。生体への投与にあたっては、生体への投与によって細胞に感染さ せることができるものはそのまま投与することができる。あるいは、いったん生体から分 離したリンパ球にベクターを導入して再び生体に戻すこともできる (ex vivo)。
[0071] 本発明に基づく IPCの活性抑制剤、または抑制方法において、生体に投与される モノクローナル抗体の量は、ィムノグロブリンとして体重 lkgあたり、通常 0. 5mg〜10 Omg、たとえば lmg〜50mg、好ましくは 2mg〜10mgである。生体への抗体の投与間 隔は、治療期間中の生体内におけるィムノグロブリンの有効濃度が維持できるように 適宜調節することができる。具体的には、たとえば、 1〜2週間間隔で投与することが できる。投与経路は、任意である。当業者は、治療に際して効果的な投与経路を適 宜選択すること力 Sできる。具体的には、経口的に、あるいは非経口的な投与を示すこ とができる。たとえば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、あるいは皮下注射等 により、全身あるいは局所に抗体を投与することができる。本発明における非経口投 与に適当な製剤として、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。また細胞に与える 場合には、培養液中に通常 1 μ g/mL、好ましくは ΙΟ μ g/mL以上、より好ましくは 50 /i g/mL以上、更に好ましくは 0. 5mg/mL以上のィムノグロブリンを与える。
[0072] 本発明の IPCの活性抑制剤または抑制方法において、モノクローナル抗体は、任 意の方法により生体に投与することができる。通常モノクローナル抗体は、薬学的に 許容される担体と配合される。モノクローナル抗体には、必要に応じて増粘剤、安定 剤、防腐剤および可溶化剤などの添加剤を配合することができる。このような担体ま たは添加剤としては、ラタトース、クェン酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、 スクロース、デンプン、タルク、ジエラチン、寒天、植物油、エチレングリコールなどが 挙げられる。 「薬学的に許容される」という用語は、各国政府の監督当局により承認さ れているカ または各国の薬局方もしくは一般的に認知されている薬局方に動物、 哺乳動物、および特にヒトへの使用に関して列記されていることを言う。本発明の IPC の活性抑制剤は、 1回または複数回の用量の凍結乾燥粉末または錠剤の形態で供 給することもできる。凍結乾燥粉末または錠剤には、更に、投与の前に該組成物を所 望の濃度となるように溶解するための注射用の滅菌済みの水、生理的食塩水または 緩衝液を組み合わせることもできる。
[0073] 更に、ィムノグロブリンを発現するベクターとして投与する場合には、重鎖と軽鎖を 別のプラスミドとしてコトランスフエタトするとして、体重 lkgあたり各プラスミドを 0.：!〜 10mg、たとえば l〜5mgを投与することができる。また in vitroにおいて細胞に導入す るためには、 1〜5 μ g/106cellのベクターが用いられる。
[0074] IPCにおいては、 BST2あるいはそのスプライシングバリアントは、 IPCの活性に伴つ て発現が増強されることが明らかにされた。活性化されていないヒ HPCにおいては BS T2あるいはそのスプライシングバリアントの発現はほとんど見られなレ、。またマウス BS T2は、活性化される前の IPCでも発現が見られるとともに、 IPCの活性化に伴ってその 発現レベルが上昇する。したがって BST2あるいはそのスプライシングバリアントは、 IP Cの活性化のマーカーとして有用である。すなわち本発明は、次の (a)-(d)のいずれか に記載の指標物質を検出する工程を含む、活性化された IPCの検出方法に関する。
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力、の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を含むポリヌクレ ォチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
[0075] 活性化のマーカーは、蛋白質あるいは当該蛋白質をコードする mRNAの存在によ つて検出することができる。蛋白質や mRNAは、全長のみならずその部分配列であつ てもよレ、。部分配列を検出の対象とする場合には、特異性を期待できる程度の長さ の配列を検出対象として選択することが好ましい。たとえば mRNAにおいては、一般 に 10b以上、好ましくは 15b以上、たとえば 15_ 500b程度の連続した塩基配列が検 出対象となる。
上記指標物質の検出方法は、公知である。たとえば指標物質 (a)または (b)のような ポリヌクレオチドは、各塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドのハ イブリダィズによって検出することができる。一方 (c)または (d)のような蛋白質は、当該 蛋白質を認識する抗体を用いて免疫学的に検出することができる。
[0076] 本発明において、活性化された IPCの検出とは、試料を構成する細胞に何らかの刺 激によって活性化された IPCが含まれることを確認することを言う。本発明による活性 化された IPCの検出により、試料が由来する生体あるいは組織において、 IPCが活性 化された状態にあることを明らかにできる。更に本発明の方法を利用して生体の IPC の活性化レベルを検查することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、生体 の IPCの活性化のレベルを測定する方法に関する。
(1)生体力も採取された試料に含まれるインターフェロン産生細胞における、（a)_(d)の いずれかに記載の指標物質を発現している細胞、およびその発現レベルのいずれ 力、または両方を検出する工程、および
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力、の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を含むポリヌクレ ォチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
(2) (1)で測定された細胞の数、およびその発現レベルのいずれかまたは両方を、被検 者のインターフェロン産生細胞の活性ィ匕のレベルに関連付ける工程
[0077] 本発明において、生体力も採取される試料としては、 IPCを含む可能性のある任意 の試料を用いることができる。代表的な試料は、体液、皮膚、滑膜組織、造血組織、 膿、肺胞洗浄液、および血液細胞を含む可能性のあるその他の生検組織試料であ る。体液には、血液、髄液、関節液、尿、涙液、唾液、および鼻汁等が含まれる。造 血組織には、骨髄、および脾臓が含まれる。あるいは末梢血を試料とすることもできる 。これらの組織に含まれる上記マーカーのいずれかを発現している細胞を検出する ことによって、活性化された IPCの数を知ることができる。得られた活性化 IPCの数の IP C全体に占める割合を明らかにすることによって、生体の IPCの活性化のレベルと前 記マーカーが検出された細胞の数とを関連付けることができる。両者の割合を求める ためには、活性化されていない IPCも検出できるマーカーを利用することができる。こ のようなマーカーとして、たとえば BDCA2あるいは BDCA4を示すことができる。これら のマーカーを発現している細胞を計数して IPC全体の数を求められる。その結果、た とえば、（BDCA2陽性細胞の数）：（BST2またはそのスプライシングバリアント陽性の 細胞数）の比は、 IPCに占める活性化された IPCの割合を示す。活性化 IPCの割合が 高いほど、被検者の IPCの活性化レベルが高いことがわかる。
[0078] あるいは生体試料中に検出される前記指標物質の発現レベルを、被検者のインタ 一フエロン産生細胞の活性化のレベルに関連付けることもできる。たとえばヒトにおい ては、前記指標物質は、活性化されていない IPCにおいてはほとんど発現を検出す ること力 Sできない。したがって、前記指標物質の発現レベルは、 IPCの活性化レベルと 直接的に相関していると言ってよい。そのため、生体試料における前記指標物質の 発現レベルが高いとき、被検者の当該生体試料においては、 IPCの活性化のレベル が亢進している。言い換えれば、指標物質の発現レベルの上昇によって、生体試料 における IPCの活性化レベルの上昇が検出される。指標物質の発現レベルは、 IPCの 各細胞の活性化のレベルと、活性化された細胞の数によって決定される。しかし、必 ずしも両者を独立して評価しなくても、指標物質の発現レベルの総和に基づいて、 IP Cの活性化のレベルを評価することができる。特にヒトにおいては、不活性な IPCにお ける前記指標物質の発現が検出できないことから、指標物質陽性 (あるいは陰性)細 胞の数を求めることなぐ指標物質の発現レベルのみに基づいて、 IPCの活性化のレ ベルを評価することができる。
[0079] IPCは、生体において、 IFNなどの産生を介して免疫システムを支える重要な細胞 である。したがって、その活性化を知ることには、臨床的な意義がある。たとえば、本 発明によって活性化 IPC、あるいは被検者の IPCの活性化のレベルの上昇が確認さ れれば、被検者の免疫システムが活性化された状態にあることを知ることができる。 具体的には、 自己免疫疾患、およびウィルスなどの感染が疑われる。 たとえば、全身性エリテマトーデス患者の皮膚病変部における IPCの蓄積が報告さ れている (Farkas, L.et al. Am. J. Pathol. 159:237-243.2001)。あるいは、脊椎関節 症患者の関節液中における IPCの増加が観察されている (Van Krinks. C.H. et al. Rh eumatology, 43:453-460. 2004)。これらの生体試料中における前記指標物質の発現 レベルを明らかにすることによって、 自己免疫症状の程度を評価するための情報を 得ること力 Sできる。
またウィルス感染においては、感染によって産生が誘導されるサイト力インの種類が 、ウィルスの種類によって異なる場合のあることが知られている（Dalod，M. et al. J.Exp .Med.195 : 517-528.2002)。したがって、本発明の方法によって特に IPCの活生化を 刺激するウィルスの種類を予め明らかにしておけば、逆に IPCの活性化を感染源で あるウィルスの種類を特定するための診断材料の一つにすることができる。
すなわち本発明は、次の工程を含む自己免疫疾患あるいはウィルス感染の検出方 法に関する。
(1)生体試料中の、下記 (a)-(d)のいずれかに記載の指標物質を発現している細胞 および、前記 (a)-(d)のいずれかに記載の指標物質の発現レベルのいずれ力、または 両方を測定する工程、および
(2) (1)で測定された細胞の数、およびその発現レベルのいずれかまたは両方を、 自 己免疫疾患あるいはウィルス感染に関連付ける工程
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列からなるポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列からなる蛋 白質 本発明においては、対照と比較して、（1)で測定された細胞の数あるいは発現レべ ルが高い場合には、自己免疫疾患あるいはウィルス感染が検出される。本発明にお いて、対照としては、健常者の測定結果を利用することができる。あるいは、同一の被 検者について本発明の検出方法を繰り返すことによって、当該被検者の自己免疫疾 患あるいはウィルス感染の症状の変化を追跡することもできる。
[0081] 本発明の検出方法、あるいは活性化レベルの測定方法は、たとえば次のようにして 実施すること力 Sできる。
細胞を含む試料をモノクローナル抗体と接触させ、試料中の IPCに前記マーカーに 結合する抗体を結合させる。細胞試料と抗体は、抗体の免疫学的結合活性が維持 できる条件下で接触させられる。具体的には、弱酸性〜弱アルカリ性の pHで、かつ 生理食塩水に近い塩濃度のもとで接触させるのが望ましい。試料には、 IPCを含む可 能性があるあらゆる試料を用いることができる。たとえば、末梢血のリンパ球集団、あ るいはリンパ節や脾臓等のリンパ系組織を試料とすることができる。これらの細胞試料 の調製方法は公知である。あるいは、造血幹細胞を、 IPCに分化させて細胞試料とす ることもできる。造血幹細胞を含む細胞集団を、 in vitroで、あるいは in vivoにおいて I PCに分化させる方法は公知である。人為的に分化させた IPCの検出あるいは同定は 、 IPCへの分化に必要な条件の探索において有用である。
[0082] 次いで、細胞に結合した抗体が検出される。例えば抗 BST2抗体を標識し、当該標 識を追跡することにより活性化 IPCを検出することができる。抗体を標識する方法は公 知である。抗体は、たとえば酵素、蛍光物質、発光物質、結合親和性物質、マイクロ ビーズ、あるいはラジオアイソトープ等の成分によって標識することができる。これらの 成分を抗体に結合する方法も公知である。たとえば、マレイミド誘導体等の 2官能性 試薬を用いて、酵素、蛍光物質、あるいはマイクロビーズ等を抗体に直接結合するこ とができる。あるいは、マイクロビーズの表面に抗体を物理吸着させることもできる。 その他、抗体を、適当な固相に結合しておくこともできる。プレートやチューブの内 壁、カラムやキヤピラリーの内壁、あるいはビーズ状の固相の表面などが固相として 利用される。
本発明の抗体は、間接的に標識することもできる。たとえば、ラット由来の抗体は、 ラットイムノグロブリンを認識する標識抗体によって、間接的に標識することができる。 抗体を間接的に標識するための標識抗体は、一般に二次抗体と呼ばれる。
[0083] 本発明による活性化 IPCの検出方法あるいは活性化レベルの測定方法において、 抗体の標識は、各標識成分に応じた手法を利用することにより、追跡することができ る。たとえば、蛍光物質であれば、励起光の照射により、蛍光を検知することができる 。酵素標識の場合には、酵素反応の生成物を指標として、標識を追跡することができ る。
[0084] 標識の検知に先立ち、抗体と反応した細胞を分離することもできる。細胞の分離に は、異なる細胞表面抗原を認識する抗体を利用することもできる。すなわち、前記マ 一力一に対する抗体と、 IPCを認識する任意の抗体の組み合せが利用される。たとえ ば、ある細胞集団をビーズに固定化した IPCに特異的な抗体と接触させて、 IPCを特 異的に捕捉する。次に、捕捉された IPCに対して、 IPCを認識する任意の抗体を結合 させる。 IPCを認識する任意の抗体を標識抗体としておけば、活性化 IPCを検出する こと力 Sできる。
[0085] BST2およびそのスプライシングバリアントのレ、ずれかまたは両方に結合する抗体は 、活性化 IPCの検出用試薬とすることができる。本発明による活性化 IPCの検出用試 薬に、更に IPCの検出用試薬を組み合わせることによって、被検者の IPCの活性化の レベルを測定するためのキットを提供することができる。本発明において IPCの検出 用試薬とは、活性化の程度にかかわらず IPCを検出することができる試薬を言う。 IPC 検出用試薬としては、たとえば BDCA2あるいは BDCA4を認識する抗体を示すことが できる。本発明の活性化 IPCの検出用試薬および IPCの検出用試薬における抗体は 、上記のような標識成分で標識しておくことができる。あるいは、二次抗体と組み合せ て供給することもできる。これらの試薬に用いる抗体は、その抗原結合領域を含む任 意の断片とすることができる。したがって、完全なィムノグロブリン分子のみならず、ィ ムノグロブリンの抗原結合活性を保持した断片を用いることができる。このような断片 としては、たとえば F(ab)2や、 Fab等を示すことができる。
[0086] 本発明の検出方法は、たとえば次のようにして実施することもできる。すなわち、細 胞試料が有する mRNAを対象として、前記指標 (a)または (b)を検出する。好ましい指 標として、特に mRNAまたは mRNA力 誘導された cDNAを挙げることができる。指標 (a )または (b)の検出には、配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群か ら選択されるいずれかの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基 配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いることができる。オリゴヌ クレオチドには、たとえば 10— 50b、好ましくは 15— 30bの長さを有する DNA、 RNA あるいはその誘導体を用いることができる。このような DNAは、化学的に合成すること ができる。合成にあたり、蛍光活性を有する誘導体などを用いることによって、匪の 誘導体とすることもできる。
[0087] オリゴヌクレオチドは、相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダィズ する。このハイブリダィズを検出することにより、検出対象とした塩基配列を有する mR NAの存在を知ることができる。たとえばノーザンブロッテイング法により、 mRNA中に対 象となる mRNAが含まれていることを直接知ることができる。あるレ、は RT- PCR法を禾 IJ 用して、対象となる mRNAの存在を検出することもできる。更に、細胞中に含まれる mR NAを in situハイブリダィゼーシヨンや in situ PCR法によって直接解析することもできる 。これらの解析方法はいずれも公知である。
[0088] 本発明の検出方法に利用することができるオリゴヌクレオチドは、活性化 IPCの検出 用試薬とすることができる。本発明の活性化 IPCの検出用試薬におけるオリゴヌクレオ チドは、標識しておくことができる。標識には、蛍光物質、発光物質、放射活性物質、 あるいは結合親和性物質などを用いることができる。蛍光物質としては、 FITCやロー ダミンなどが知られている。結合親和性物質としては、ピオチンゃジゴキシゲニンなど が利用される。
[0089] 本発明の活性化 IPCの検出に用いるオリゴヌクレオチドの塩配列は、配列番号： 1、 配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれかの配列番号に 記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる。特異的なハイブリダィズを達成する 塩基配列は、 目的とする標的塩基配列に対して必ずしも完全に相補的である必要は 無レ、。ストリンジェントな条件の元で、必要な特異性を達成できれば、配列の変異は 許容される。設定された塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドは化学合成によって得 ること力 Sできる。そしてそのオリゴヌクレオチドに適当な標識を付加すれば、さまざまな フォーマットのハイブリダィゼーシヨンアツセィに利用することができる。
[0090] プライマーとして利用する場合には、相補鎖の合成原理に応じて複数の領域を設 定すること力 Sできる。たとえば PCRのためのプライマーであれば、合成の対象となるセ グメントの 5'側と 3'側の両端を規定する領域がプライマーとして選択される。本発明に よるオリゴヌクレオチドは、基本的な PCRのみならず、 RNAを铸型とする RT-PCR、増 幅領域をネストさせて高感度な検出を可能とするネステッド PCR、あるいは cDNAの合 成等、様々な相補鎖合成反応に応用することができる。
[0091] 更に抗体を用いた方法と同様に、ハイブリダィゼーシヨンアツセィあるいは核酸増幅 を利用する方法に基づレ、て、生体の IPCの活性化のレベルを測定することができる。 すなわち、本発明によって検出される活性化 IPCの、 IPC全体に対する割合を明らか にすることによって、生体の IPCの活性化のレベルを知ることができる。 IPC全体を反 映することができるマーカーとしては、先に述べた BDCA2および BDCA4などを用いる ことができる。ハイブリダィゼーシヨンアツセィあるいは核酸増幅によるマーカーの測 定では、細胞の数を直接的に決定することはできない。しかし、試料から抽出された 全 RNA、または全 mRNAを対象として得られる結果は、各マーカーを発現している細 胞の数を反映する。したがって各マーカーの発現レベルを比較することによって、活 性化のレベルを明らかにすることもできる。なお試料間で発現レベルを正確に比較す るためには、比較対照試料の間の細胞数の補正が必要な場合がある。細胞の種類 および状態にかかわらず、発現レベルが一定に保たれている遺伝子は、細胞数の補 正に利用することができる。このような遺伝子マーカーとして、 ァクチンあるいはダリ セルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH)などが用いられる。
[0092] 更に本発明は、 BST2あるいはそのホモログを指標とする、活性化 IPCの分離方法を 提供する。すなわち本発明は、次の (a)_(d)のいずれかに記載の指標物質を有する細 胞を単離する工程を含む、活性化された IPCの分離方法に関する。
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力、の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を含むポリヌクレ ォチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
[0093] 本発明の分離方法において、指標物質に結合する抗体は、前記検出方法におけ る抗体と同様に、標識成分や固相に結合することができる。活性化 IPCを含む細胞集 団と上記マーカー (c)または (d)に対する抗体を結合させた後に、抗体と結合した細胞 を分取することによって、活性化 IPCを分離することができる。たとえば、標識成分と結 合させた抗体を用いる場合には、標識成分を追跡し、標識成分が結合している細胞 を分取することによって、活性化 IPCを分離することができる。固相と結合させた抗体 を利用する場合には、固相を回収すれば、活性化 IPCが分離される。
[0094] 続いて抗体を利用した活性化 IPCの分離手法を、具体的に述べる。たとえば、水不 溶性担体に抗体を固定化し、これに細胞を直接的または間接的に結合させる方法を 利用することができる。水不溶性担体には、セルロース誘導体ゃァガロース等からな るビーズやマトリックス等が利用される。抗体を固定化した水不溶性担体は、カラムに 充填して免疫吸着カラムとすることもできる。不溶性担体上の抗体に捕捉された活性 ィ匕 IPCは、免疫学的な結合を解離させる緩衝液によって溶出することができる。
[0095] あるいは蛍光抗体標識細胞分離法や、免疫磁気ビーズによる分離法を利用するこ ともできる。すなわち抗体が結合した細胞を蛍光標識や磁気標識を目印に、 目的と する細胞を一つ一つ分離する方法である。これらの分離法には、 FACSや MACSなど のセルソーターを用いるのが有利である。セルソーターを用いた細胞の分離方法は 公知である。
[0096] 例えば AutoMACSによる細胞の分離においては、活性化 IPCを含む細胞集団に、 マーカーを認識する抗体を接触させる。細胞を PBSで洗浄後、次いで二次抗体を反 応させる。マーカーに対する抗体がマウス IgGであれば、二次抗体にはピオチンィ匕抗 マウス IgG抗体などを利用することができる。あるいは、マーカーに対する抗体を予め ビォチン化しておけば、二次抗体は不要である。さらに、細胞を PBSで洗浄後、ストレ プトアビジンマグネティックビーズを反応させる。こうして活性化 IPCには、マグネテイツ クビーズが結合される。得られた細胞を磁気カラムに通すことにより、活性化 IPCを力 ラムに捕捉することができる。このカラムを洗浄した後、カラムに残った細胞を溶出さ せれば、活性化 IPCを回収することができる。 MACSを利用した場合には、操作は 30 分間程度で完了する。つまり本発明の分離方法は、生体中にはわずかしか見出すこ とのできない活性化 IPCを大量に調製するための方法として有用である。
[0097] あるいは本発明は、前記指標物質 (a)_(d)のいずれかに記載の指標物質を有する細 胞を単離する工程を含む、活性化 IPCの分離方法に関する。本発明によって、前記 指標物質 (a)-(d)が活性化 IPCの特異的なマーカーとして利用できることが明らかにさ れた。したがって、これらの指標物質が検出された細胞を単離することにより、活性化 IPCを分離することができる。これらの指標物質の検出方法は、先に述べたとおりであ る。
[0098] 更に本発明者は、前記指標物質 (a)-(d)が IPCのウィルス刺激によって発現が増強 することを確認した。この知見に基づいて、前記指標物質 (a)-(d)の測定によって、 IPC の活性化のレベルを知ることができる。すなわち本発明は、次の工程を含む、 IPCの 活性化のレベルを測定する方法を提供する。
(1) IPCにおける、前記 (a)-(d)のいずれかに記載の指標物質の発現レベルを測定する 工程、および
(2) (1)で測定された指標物質の発現レベルが、刺激を与えなレ MPCと比較して上昇し ていた場合に、被検細胞が活性化されていると判定する工程
あるいは、（1)で測定された指標物質の発現レベルが、刺激を与えない IPCと比較し て上昇していた場合に、活性化された IPCが検出される。
[0099] 前記 (a)-(d)の指標物質の発現レベルを測定するための方法は既に述べた。 in vivo または in vitroにおいて、 IPCにおいて前記 (a)-(d)の指標物質の発現レベル力 無刺 激の IPCと比較して上昇しているとき、その IPCは活性化していることが確認できる。 IP Cは、ウィルスの刺激により活性化されることが明らかにされている。したがって、 IPC における前記指標物質 (a)_(d)の発現レベルの上昇は、 IPCに対するウィルスの刺激 の指標として有用である。つまり前記指標物質 (a)-(d)の発現レベルの上昇を検出す ることによって、 IPCのウィルスとの接触を検出することができる。 IPCのウィルスとの接 触は、その IPCが由来する個体のウィルス感染経験を意味する。すなわち、本発明に よって、個体のウィルス感染を検出することができる。
[0100] 更に本発明は、 IPCにおける前記 (a)_(d)の指標物質を指標として、 IPCの活性化を 調節する作用を測定する方法を提供する。すなわち本発明は、次の工程を含む、被 験物質の IFN産生細胞の活性化を調節する作用の検出方法を提供する。
(1) IFN産生細胞を被験物質とともに細胞刺激剤と接触させる力 \または IFN産生細胞 と被験物質の接触の前、若しくは後に細胞刺激剤と接触させる工程
(2) IFN産生細胞における、（a)-(d)のいずれかに記載の指標物質の発現レベルを測 定する工程、および
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を含むポリヌクレ ォチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
(3) (2)で測定された指標物質の発現レベルを、対照と比較し、発現レベルが対照より も有意に高い場合に被験物質の IPCの活性化を増強する作用が、また対照よりも有 意に低い場合には被験物質の IPCの活性化を抑制する作用が検出される工程
[0101] 本発明の方法において、細胞刺激剤とは IPCの活性化を誘導しうる物質を言う。た とえば、ウィルスやウィルスの構成成分を、細胞刺激剤として示すことができる。具体 的には、単純へルぺスウィルス (Hen^es simplex virus;HSV)、あるいはインフルエンザ ウィルス (Influenza virus)などのウィルスの投与により IPCが活性化することが知られて いる。その他、バクテリア中の DNAである CpGの IPC活性化作用も公知である。その 他、インターフェロンとの接触による IPCの活性化も公知である。具体的には、図 13に も示すように、 IFN- αによって IPC自身が活性化される。これらの細胞刺激剤は、単 独で用いても良いし、異なる細胞刺激剤を組み合わせて用いることもできる。細胞刺 激剤と被験物質とは、同時に IPCに接触させても良いし、細胞刺激剤との接触の前あ るいは後に IPCと被験物質を接触させることもできる。
[0102] 本発明において、細胞刺激剤、 IPC,および被験物質は、生体外 (in vitro),生体内 (in vivo),あるいは ex vivoにおいて接触させることができる。生体外 (in vitro)において は、 IPCを培養可能な条件下で、先に述べたような任意の順番で細胞刺激剤および 被験物質を IPCと接触させることができる。また生体内 (in vivo)においては、生体内の IPCに対して、被験物質あるいは細胞刺激物質を投与した後に、 IPCを採取する。採 取された IPCを生体外において細胞刺激物質あるいは被験物質に接触させた後、細 胞の活性化のレベルを評価することができる。細胞の活性化のレベルは、細胞が産 生する IFNの濃度の変化などによって評価することができる。
更に ex vivoでの評価においては、生体外で調製された IPCに対して、細胞刺激剤 または被験物質を接触させる。接触後の IPCを生体に投与し、更に被験物質または 細胞刺激剤を投与する。生体内における IPCの活性化のレベルを評価し、被験物質 の作用が評価される。 IPCの活性化のレベルは、たとえば血中の IFNのレベルを指標 として評価すること力 Sできる。なお生体外における IPCの調製とは、生体から IPCを採 取すること、あるいは IPCの前駆細胞の分化誘導によって人工的に IPCを調製するこ とを言う。
[0103] IPCに対する刺激は IFNの産生を誘導することから、その活性化の調節によって IFN 産生を調節することができる。本発明において、 IPCの活性化の調節とは、活性化を 抑制または増強することを含む。具体的には、 IPCの活性化を増強することができる 物質は、 IFN産生の増強剤として有用である。本発明によって、様々な物質について 、ウィルスなどの刺激による IPCの活性化を増強あるいは抑制する作用を評価するこ とができる。逆に、 IPCの活性化を抑制することができる物質は IFN産生の抑制剤とし て用いることができる。 [0104] なお本発明の方法における対照としては、被験物質に代えて IPCの活性化に対す る影響が予め知られている物質を用いることができる。たとえば、生理食塩水は IPCの 活性化に影響を与えない物質である。あるいは IPCの活性化を増強、あるいは抑制 することが確認されている物質を対象として用レ、、その物質との相対的な比較によつ て被験化合物の作用を評価することもできる。
[0105] 前記 (a)-(d)の指標を測定するための試薬は、本発明に基づく IPCの活性化を調節 する作用を測定するための試薬として利用することができる。たとえば配列番号： 1、 配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれかの配列番号に 記載の塩基配列から選択された少なくとも 15塩基からなる連続した塩基配列を含む オリゴヌクレオチドは、 IPCの活性を調節する作用を検出するための試薬として有用 である。
[0106] あるいは配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択される いずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体は、 IPC の活性を調節する作用を検出するための試薬として有用である。このような抗体とし ては、 BST2およびそのスプライシングバリアントのいずれ力、または両方を認識する 抗体を用いることができる。
[0107] 本発明による IPCの活性化を調節する作用を測定するための試薬には、更に IPCを 活性化するための細胞刺激剤、 IPCの培養のための培地や培養容器などを組み合 わせることもできる。また、 IPCの活性化作用に与える影響が明らかな物質を対照とし て組み合わせることもできる。
[0108] 更に本発明の IPCの活性化を調節する作用を測定する方法を利用して、 IPCの活 性化を調節する作用を有する物質のスクリーニング方法が提供される。すなわち本 発明は、次の工程を含む、 IPCの活性を調節する作用を有する被験物質のスクリー二 ング方法を提供する。
(1) IFN産生細胞を被験物質とともに細胞刺激剤と接触させる力 \または IFN産生細胞 と被験物質の接触の前、若しくは後に細胞刺激剤と接触させる工程
(2) IFN産生細胞における、（a)-(d)のいずれかに記載の指標物質の発現レベルを測 定する工程、 (a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列からなるポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列からなる蛋 白質
(3) (2)で測定された指標物質の発現レベルを、対照と比較し、発現レベルが対照より も有意に高い場合に被験物質の IPCの活性化を増強する作用が、また対照よりも有 意に低い場合には被験物質の IPCの活性化を抑制する作用が検出される工程、およ び
(4)対照と比較して前記活性化を調節する作用が大きい被験化合物を選択する工程 本発明のスクリーニング方法によって選択することができる化合物は、 IPCの活性化 の調節剤として有用である。本発明のスクリーニング方法において、 IPCに対する活 性化を増強する作用が明らかな物質を接触させた IPCを対照として用いれば、この物 質よりも活性化増強作用の大きい物質を見出すことができる。逆に、 IPCの活性化を 抑制する作用を有する物質を接触させた IPCを対照とすることで、当該物質よりも更 に抑制作用の大きい物質を見出すことができる。
IPCは生体中の IFNの大部分を産生する重要な細胞である。したがって、本発明の スクリーニング方法によって得ることができる化合物は、免疫システムの調節剤として 重要である。たとえば、本発明に基づく IPCの活性化を抑制する作用を測定する方法 を利用して、 自己免疫疾患あるいはアレルギーの治療薬のスクリーニング方法が提 供される。あるいは本発明は、本発明のスクリーニング方法によって選択された、 IPC の活性化を抑制する作用を有する化合物を有効成分として含有する、 自己免疫疾患 あるいはアレルギーの治療薬に関する。 [0110] たとえば、 IFN αは現在 C型肝炎ウィルスの治療薬として臨床的に用いられている。
IFN aは非常に高価な製剤である。本発明のスクリーニングによって選択することが できる、 IPCの活性化を増強する作用を有する物質は、 IPCによる IFN産生を促進する ための薬剤とすることができる。このような薬剤の投与によって、 IFNひ投与と同等の 治療効果が期待できる。 IFNひには、 C型肝炎のみならずエイズや、その他のウィル ス疾患への適応も考えられる。また、抗癌効果も期待できる。すなわち、本発明に基 づく IPCの活性化を増強する作用を測定する方法を利用して、ウィルス疾患あるいは 癌の治療薬のスクリーニング方法が提供される。あるいは本発明は、本発明のスクリ 一ユング方法によって選択された、 IPCの活性化を増強する作用を有する化合物を 有効成分として含有する、ウィルス性疾患、あるいは癌の治療薬に関する。
[0111] 本発明のスクリーニング方法に用いる被験物質としては、コンビナトリアルケミストリ 一により合成された化合物標品のほか、動 ·植物組織の抽出物もしくは微生物培養 物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられ る。
[0112] 本発明において活性化 IPCの特異マーカーとして特定された物質のうち、以下の配 列番号に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド、並びに当該ポリヌクレオチドによ つてコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質は、新規物質であった。これらの新規な 構造を有するマーカーは、既知の遺伝子 BST2のスプライシングバリアントであると考 えられた。各スプライシングバリアントを、本発明においては、 BST2Hおよび BST2HS として識別する。
塩基配列 塩基配列によってコードされるアミノ酸配列
BST2H 配列番号： 3 配列番号： 4
BST2HS 配列番号： 5 配列番号： 6
すなわち本発明は、次の i)_vi)のいずれかに記載のポリヌクレオチド、あるいは当該 ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質に関する。
i)配列番号: 4、または配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード するポリヌクレ才チド；
ii)配列番号： 3、または配列番号： 5に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレ ォチド；
iii)配列番号: 4、または配列番号: 6に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数の アミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号 : 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等なタンパク質をコードするポ リヌクレ才チド；
iv)配列番号： 3、または配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェント な条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド；および
V)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にぉレ、て、 N末端から 139〜 158位のアミノ酸配 列をコードするポリヌクレオチド
vi)配列番号： 6に記載のアミノ酸配列において、 N末端から 96〜100位のアミノ酸配 列をコードするポリヌクレオチド
[0113] 本発明のポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドを含む。本発明において、 単離されたポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチドが由来する天然起源に存在す る他の核酸分子から分離されたポリヌクレオチドのことである。単離されたポリヌクレオ チドは、たとえば、ベクターに含有されている組換え DNA分子、異種宿主細胞内に維 持されている組換え DNA分子、部分的または実質的に精製された核酸分子、および 合成の DNA分子または RNA分子が含まれる。 cDNA分子のような「単離された」ポリヌ クレオチドは、組換え技術により作製された場合には、他の細胞材料もしくは培養培 地を実質的に含まない。または化学合成されたポリヌクレオチドは、化学前駆物質も しくはその他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。
[0114] また本発明のタンパク質は、単離されたあるいは精製されたタンパク質を含む。「単 離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的活性部分は、たとえば 前記アミノ酸配列： 4あるいは配列番号: 6からなるタンパク質が由来する細胞もしくは 組織の起源からの細胞材料もしくはその他の混入タンパク質を実質的に含まない。 あるいは本発明のタンパク質が化学合成された場合には、化学前駆物質もしくはそ の他の化学物質を実質的に含まない。 「細胞材料を実質的に含まない」という用語は 、単離されたまたは組換え作製された細胞の細胞要素からタンパク質が分離されて レ、ることを意味する。 1つの態様において、「細胞材料を実質的に含まなレ、」という用 語は、本発明のタンパク質に混入したそれ以外のタンパク質力 S、乾重量で約 30%未 満、より好ましくは約 20%未満、さらに好ましくは約 10%未満、最も好ましくは約 5%未 満であることを言う。本発明のタンパク質またはその生物学的活性部分が組換え作製 される場合には、好ましくは培養培地も実質的に含まない。本発明において培養培 地を実質的に含まないとは、培養培地がタンパク質調製物の容量の約 20%未満、よ り好ましくは約 10%未満、最も好ましくは約 5%未満であることを言う。
[0115] 配列番号: 4に記載のアミノ酸配列のうち、 N末端から 138位までのアミノ酸配列は、 配列番号： 2に記載されたアミノ酸配列と一致している。同様に、配列番号: 6に記載 のアミノ酸配列のうち、 N末端から 95位までのアミノ酸配列は、配列番号： 2に記載さ れたアミノ酸配列と一致している。配列番号： 2に記載されたアミノ酸配列は、 BST2(b one marrow stromal cell antigen 2)として公知である (GenBank Acc#.BC027328)o本 発明者が見出した新規なアミノ酸配列からなる蛋白質は、 BST2のスプライシングバリ アントであると考えられた。
[0116] 本発明のポリヌクレオチド、ならびに当該ポリヌクレオチドによってコードされるァミノ 酸配列を有する蛋白質、更にそれらの機能的同等物は、いずれも活性化 IPCの指標 として有用である。また本発明において明らかにされた以下に記載の本発明の蛋白 質に固有のアミノ酸配列は、本発明の蛋白質に特異的に結合する抗体を得るための 免疫原として有用である。このような抗体によって、配列番号： 2に記載のアミノ酸配 歹 IJからなる蛋白質と、配列番号: 4および配列番号: 6に記載のアミノ酸配列からなる 蛋白質の分別測定が可能となる。すなわち本発明は、次のアミノ酸配列を含む領域 を認識する抗体に関する。
配列番号： 4における 139 _ 158位のアミノ酸配列
配列番号： 6における 96— 100位のアミノ酸配列
[0117] 本発明の抗体は、前記アミノ酸配列を含むポリペプチドを免疫原として作成すること ができる。具体的には、たとえば 5〜50アミノ酸残基、たとえば 5〜30アミノ酸残基の ポリペプチドを免疫原として用いることができる。免疫原とするポリペプチドは、化学 合成や、配列番号: 4および配列番号: 6に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質の消 化によって得ることができる。免疫原ポリペプチドは、担体蛋白質と結合することがで きる。担体蛋白質としては、キーホールリンペットのへモシァニン等を用いることがで きる。あるいは、配列番号: 4および配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなる蛋白 質をそのまま免疫原として利用することもできる。
[0118] 得られた抗体は、ェピトープマッピングによって、その抗原決定基を同定することが できる。ェピトープマッピングとは、抗体が認識するアミノ酸配列（抗原決定基）を同定 することを言う。実際には、上記アミノ酸配列またはその部分配列からなるペプチド、 もしくは上記アミノ酸配列を含む各種のアミノ酸配列からなる複数種のオリゴペプチド を使った吸収試験、あるいは結合試験によって、抗原決定基を同定することができる
[0119] 更に、これらの一次構造 (primary structure)上の相違に加えて、各サブタイプに固 有の高次構造 (conformation)を識別する抗体も、サブタイプの分別測定に利用するこ とができる。高次構造を識別する抗体は、各サブタイプを免疫原として作成された抗 体の、他のサブタイプに対する交差性を明らかにすることによって選択することができ る。選択された各サブタイプに特異的に結合する抗体の結合活性が、たとえば、上記 の固有アミノ酸配列からなるオリゴペプチドによって吸収されない場合、当該抗体は、 サブタイプに固有な高次構造を認識している可能性がある。
同様に、配列番号： 3あるいは配列番号： 5の塩基配列中、これらのアミノ酸配列を コードする塩基配列は、それぞれの遺伝子を特異的に検出するための標的配列とし て有用である。すなわち、次の塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してハイブリダ ィズするオリゴヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドを検出するためのプローブ あるいはプライマーとして有用である。
配列番号： 3における 418— 477位の塩基配列
配列番号： 5における 289— 303位の塩基配列
[0120] 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号： 1に記載の塩基配列に基づいてデザインさ れたプローブを利用して、 IPCの cDNAライブラリーをスクリーニングすることによって 得ること力 Sできる。あるいは、配列番号： 1に記載の塩基配列に基づいてデザインされ たプライマーを利用して、 IPCの cDNAライブラリーや mRNAを錡型とする PCR法（Curr ent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Puolish. John Wiley & Sons Section 6.1-6.4)によって、本発明のポリヌクレオチドを合成することができる。 当業者は、与えられた塩基配列に基づいてプローブやプライマーをデザインすること ができる。
[0121] 本発明のポリヌクレオチドは、配列番号: 4、または配列番号： 6に記載のアミノ酸配 列において 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、揷入、および/または付加したァ ミノ酸配列を有し、配列番号: 4、または配列番号： 6に記載のアミノ酸配列からなる蛋 白質と機能的に同等なタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。本発明にお いて機能的に同等な蛋白質とは、活性化 IPCにおいて発現が見られ、かつ IPCの活 性化に伴って発現が上昇する蛋白質を含む。本発明の好ましい態様において、機能 的に同等な蛋白質は、当該蛋白質に結合する抗体を、当該蛋白質を発現する細胞 に接触させたときに、当該細胞の活性が抑制されることによって特徴付けることができ る。ここで細胞の活性には、 IFNの産生能、および細胞数のいずれか、または両方が 含まれる。本発明における細胞の IFN産生能とは、好ましくはタイプ 1IFNである。より 具体的には、 IFN αおよび IFN のいずれカ または両方の産生能を言う。
[0122] アミノ酸配列の変異は、人為的なものであっても、 自然において生じる変異であつ てもよレ、。本発明の蛋白質は、好ましくは天然由来である。本発明において許容され るアミノ酸の変異の数は、通常 50アミノ酸以内であり、好ましくは 30アミノ酸以内であ り、さらに好ましくは 10アミノ酸以内である。例えば、 5アミノ酸以内、あるいは 3ァミノ 酸以内の置換は許容される。アミノ酸を置換する場合には、保存的置換であることが 望ましレ、。一般に蛋白質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のァ ミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の 置換は、保存的置換と呼ばれている。
[0123] 例えば、以下に示す各分類に含まれるアミノ酸間の置換によって、アミノ酸の保存 的置換を行うことができる。
非極性アミノ酸： Ala、 Val、 Leu、 Ile、 Pro, Met, Phe、 Trp
非荷電性アミノ酸： Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、 Gin
酸性アミノ酸： Aspおよび Glu
塩基性アミノ酸： Lys、 Arg、 His [0124] また本発明のポリヌクレオチドは、他のタンパク質またはポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドと接合することができる。このようなポリヌクレオチドは、本発明のタンパ ク質と、それ以外のタンパク質あるいはポリペプチドとの接合体 (融合タンパク質）を与 える。たとえば、ヒスチジンタグ、 flag-tagなどを、任意のタンパク質に付加する方法が 公知である。これらのタンパク質を付加することによって、本発明のタンパク質の検出 や精製に利用することができる。本発明のタンパク質の機能が維持される限り、本発 明のタンパク質は、それを含む融合タンパク質であつても良い。
[0125] また本発明のポリヌクレオチドは、配列番号： 1に記載の塩基配列からなる DNAとス トリンジヱントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドを含む。本発明における ハイブリダィゼーシヨンの条件は、洗浄条件として通常「lxSSC、 0.1% SDS、 37°C」程 度であり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、 0.1% SDS、 42°C」程度であり、さらに厳し い条件としては「0.1xSSC、 0.1% SDS、 65°C」程度を示すことができる。ストリンジヱンシ 一は、厳しい条件とするほど、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。本 明細書においてストリンジ工ントな条件としては、ハイブリダィゼーシヨンを「6 X SSC、 4 0 %ホルムアミド、 37 °C」、洗浄を「0.2 X SSC、 55 °C」で行う条件をストリンジェントな条 件として示すこともできる。
[0126] 上記 SSC、 SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示である。当業者は、ハイブリ ダイゼーシヨンのストリンジエンシーを決定する種々の条件を調節することにより、上 記と同様のストリンジエンシーを実現することができる。たとえば、上記条件の他にも プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダィゼーシヨン反応時間などは、ストリンジ工 ンシーを左右する条件として挙げられる。
[0127] このようなハイブリダィゼーシヨン技術を利用してポリヌクレオチドは、配列番号： 1に 記載の塩基配列と高い相同性を有する。また塩基配列の相同性が高いポリヌクレオ チドによってコードされるアミノ酸配列も、高い相同性が期待される。本発明において 高い相同性とは、 90%以上、または 93%以上、あるいは 95%以上、更には 97%以 上、そして 99%以上の同一性を言う。同一性は、 BLAST検索アルゴリズムを用いて 決定すること力 Sできる。
[0128] 本発明におけるアミノ酸配列や塩基配列の相同性は、 Karlin and Altschulによるァ ルゴリズム BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定す ること力 Sできる。このアルゴリズムに基づいて、 blastnや blastxと呼ばれるプログラムが 開発されている (Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403- 410, 1990)。 BLASTに基づいて blastnによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 100、 w ordlength = 12とする。また、 BLASTに基づいて blastxによってアミノ酸配列を解析す る場合には、パラメータ一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。 BLASTと Ga pped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを 用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である (http：〃 www.ncbi.nlm.nih.g ov.)。
[0129] 加えて本発明は、本発明のポリヌクレオチドが揷入されたベクターに関する。本発 明のベクターは、揷入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限されない。 例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしては pBluescri ptベクター (Stratagene社製)などが好ましい。本発明の蛋白質を生産するためにべク ターを用いる場合には、発現ベクターを用いることができる。任意の遺伝子を発現さ せるための様々なベクターが市販されている。これらのベクターのクローニングサイト に本発明の DNAを挿入することにより、 目的とするベクターを得ること力 Sできる。
[0130] 更に本発明は、本発明のベクターを保持する形質転換体に関する。本発明のベタ ターが導入される宿主細胞としては特に制限はなぐ 目的に応じて種々の宿主細胞 が用いられる。蛋白質を高発現させるための真核細胞としては、例えば、 COS細胞、 CHO細胞などを例示することができる。
[0131] ベクターを宿主細胞に導入するための方法も公知である。たとえば、リン酸カルシゥ ム沈殿法、電気ノヽ0ノレス穿子し法 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 9.1-9.9)、リポフエクタミン法（GIB CO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの方法で宿主細胞にベクターを導入 すること力 Sできる。ベクターを導入した細胞を、当該遺伝子の発現が誘導される条件 下で培養することによって、 目的とするアミノ酸配列を有する蛋白質の発現が誘導さ れる。更に形質転換体の培養物から蛋白質を精製することによって、本発明の蛋白 質を単離することができる。組み換え蛋白質の精製方法も公知である。このようにして 得ることができる本発明の蛋白質は、たとえば本発明の蛋白質を認識する抗体を調 製するための免疫原として有用である。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
以下、実施例に基づレ、て本発明を更に詳細に説明する。
実施例 1
[0132] モノクローナル抗体作成プロトコール
免疫原とする細胞は以下のようにして調製した。 Balbんマウス雌 (4〜6週令）の骨髄 細胞を、 10ng/mlの FLT-3リガンド（R&D Systems社製）を添加した 10%FCS_RPMI164 0培地〔10%牛胎児血清（FCS)、およびペニシリン、ストレプトマイシンを含む RPMI16 40培地〕にて 10日間培養した。 10日後、 IPC (Interferon producing cell)を、 CDl lc陽 性、 CDl lb陰性、 B220陽性分画としてセルソーター（FACSVantage, Becton Dickinso n社製）で分離した。抗体は Becton Dickinson社製のものを用いた。
上記の分離した細胞を、 0、 4、 11日目に、片足あたり lxlO6個ずつ、完全フロインド アジュバント（CFA:ャトロン社製）と共にラットのフットパッド（foot pad)へ注入した。 12 日目に免疫ラットのリンパ節を分離し、リンパ球を採取した。マウスのミエローマ細胞 P 3x63Ag8.653とラットのリンパ球を 4 : 5の割合で混合し、ポリエチレングリコール（PEG) を加えて細胞を融合した。融合後の細胞を十分に洗浄して HAT培地に分散させ、 1 ゥエルあたり 5xl04個の細胞を含むように 96 well plateにまいた。
[0133] 細胞が増殖したゥエルの細胞を回収して希釈して、その培養上清をマウス脾臓細 胞、及び培養骨髄細胞に対する反応性を指標としてスクリーニングした。スクリーニン グ方法の詳細は実施例 2のとおりである。陽性反応を示したゥエルの細胞を限外希釈 によりクローニングし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを確立し た。更に、ハイプリドーマの培養上清、あるいはハイプリドーマをマウスの腹腔内に移 植して得られた腹水より精製された抗体の反応性を解析した。
実施例 2
[0134] 培養上清のスクリーニング
Balbんマウス雌（4〜6週令）の骨髄細胞を、 10ng/mlの FLT-3リガンドを添加した 10 %FCS-RPMI 1640培地にて 10日間培養した。 10日目には約 40%の細胞が IPCになつ た。この細胞を用い、ハイプリドーマ培養上清を 1次抗体とし、 2次抗体に FITC標識 抗ラット Ig抗体（BD Pharmingen社製）を用いて染色した。その後、各種抗体（CD l lb、 CD l lc、 CD3、 CD 19、 CD45RB、 B220、 Ly6C；いずれも Becton Dickinson社製）により 二重染色し、フローサイトメトリー法により解析 (FACS解析）した。
[0135] 培養上清陽性分画、陰性分画をそれぞれ R2、 R3とし各々の Gate内での各種抗原 の発現をヒストグラムで示した（図 1)。作成した数種類の抗体によって染色される細胞 群は、文献上で定義されているマウス IPC (Nature Immunol , 2001 ; 2, 1144-1150. ) の細胞表面抗原プロファイルが一致した。したがって、これらの抗体はマウス IPCに特 異的に結合する抗体であると考えられた。
実施例 3
[0136] 抗体で分離した細胞の形態
実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を、培養上清を 1次抗体とし、 2次抗体に FITC 標識抗ラッ Hg抗体を用いて染色した。その後、セルソーター（FACSVantage, Becton Dekinson社製)を用いて陽性細胞を分離した。サイトスピン後、ギムザ染色し、顕微 鏡下にて観察したところ、 IPCに特異的な形態を示した（図 2a)。すなわち、この細胞 の形は丸ぐ大きな核を有していた。
[0137] lxlO5個の細胞を 96 well丸底プレートにてインフルエンザウイルス PR8と共に 24時 間 37°Cにて培養し、同様にギムザ染色した後、顕微鏡下にて観察したところ、形態的 に典型的な樹状細胞に分化した（図 2b)。この結果から、上記抗体によって分離され た細胞は、ウィルス感染によって樹状細胞に分化するというマウス IPCの特徴を有し ていることが確認された。このようなマウス IPC特異的なモノクローナル抗体およびそ の抗体を産生するハイブリドーマのうち、 SNK01を選択して以降の実験に用レ、た。 実施例 4
[0138] 抗体で分離した細胞のインターフェロン産生能
実施例 2と同様に培養した骨髄細胞を SNK01培養上清および 2次抗体で染色後、 セルソーターにて陽性、陰性細胞を分離した。各々の分画の細胞、 lxlO5個ずつを 96 well丸底プレートに分注し（100 μ 1/well)、インフルエンザウイルス PR8を感染させ、 2 4時間後の培養上清中の IFN aの濃度を以下のような ELISA法にて測定した。
[0139] まずラット抗マウス IFN a抗体（PBL Biomedical Laboratory社製）を 96 wellプレート に 4°Cで一晩反応させ、プレートコートした。プレートを洗浄後、培養上清 100 / lを添 加し、 4°Cでー晚反応させた。プレートを洗浄後、 IFN aと IFN βを認識する標識化抗 インターフェロン抗体を添加し、 1時間反応させて、検出を行った。それぞれの反応は 3連で行い、平均値を求めた。検量線を作成することにより、培養上清中の IFNひ濃 度を算出した。
SNK01陽性細胞では、陰性細胞に比べて、高いインターフェロンの産生が認められ た。すなわち、モノクローナル抗体 SNK01が認識する抗原は IPCに特異的な表面抗 原であることが確認できた（図 3)。
実施例 5
[0140] 抗体のマウスインターフェロン産生能への影響
実施例 2と同様に培養したマウス骨髄細胞を lxlO5個ずつ、 96 well丸底プレートに 分注した。これに SNK01抗体、またはコントロール抗体であるラッ HgGを添加し、 37°C にて 30分間培養後、インフルエンザウイルス PR8を添加し、 37°Cにて 24時間培養し、 培養上清中の IFNひを上記実施例 4に示した ELISAにより測定した（図 4)。その結果 、 SNK01は濃度依存的に IFNひの産生を抑制した。すなわち、この抗体のマウス IPC に与える作用は、特異的な作用であると考えられた。
実施例 6
[0141] 抗体が認識する分子のクローニング
1) IPC-cDNAライブラリーの作製
実施例 2と同様に FLT-3リガンドで骨髄細胞から誘導した IPCより全 RNAをフエノー ノレ-グァニジン法により抽出し、 oligo-dTカラムにより mRNAを精製した。精製した mRN Aから Gubler-Hoffinan法により cDNAを合成し、両端に EcoRト Notlアダプター (インビト ロジェン社製)を結合後、スパンカラム (クロマスピン 400、クロンテック社製）により未反 応の EcoRIアダプターおよび 500塩基以下の短い cDNAを除去した。得られた両端に EcoRIサイトを有する cDNAを動物細胞用発現用ベクター pME18s (Xhol断片を除レヽた もの)の EcoRIサイトに T4リガーゼにより結合し、大腸菌 DH10 (インビトロジェン社製）に エレクト口ポーレーシヨン法により形質転換した。これを 100 /i g/mlのカルペニシリンを 含む LB培地（LB 'カルペニシリン） 500mlで 30°Cでー晚培養し、 QIA filter plasmid ma xi kit (Qiagen社製)により同キットのプロトコールに従って plasmidを抽出、精製し、 IP C-cDNAライブラリーを得た。
[0142] 2) COS7細胞による発現クローニング
C〇S7細胞を 6cmデイシュに 5xl05個ずつ 10枚まき、 37°C、 5%CO存在下で 20時間 培養後、 Effectene trasfection Reagent(Qiagen社製)により同製品のプロトコールに従 レ、、上記 1)で取得した IPC cDNAライブラリーを transfectionした。 48時間、 37°C、 5% CO下で培養後、 PBS (Phosphate Buffered Saline)で洗浄、 PBS/5mM EDTAで細胞 をデイシュから剥離し、さらに PBSで洗浄後、セルストレナー（70 z m,ファルコン社製） を通した。遠心後（1300卬 m, 5分）上清を除去し、 PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAを lml 添加して懸濁し、 Fc block (ファーミンジヱン社製） 40 a 1を加え 4°Cで 20分間置いた。 これにビォチン化した SNK01抗体 30〜50 /i gを加え、氷上で 30分間保持した。 PBSで 洗浄後、 100 /i lの PBSに懸濁し、ストレプトアビジンマイクロビーズ（Miltenyi Biotec社 製） 10-20 μ 1を加え 10°Cで 15分静置した。 PBS/ 0.5%BSA/2mM EDTAで洗浄すること により過剰なストレプトアビジンマイクロビーズを除去し、 lmlの PBS/ 0.5%BSA/2mM E DTAに懸濁した。 AutoMACS (Miltenyi Biotec社製）で posseldsの条件で細胞を分取 した。改良 Hirt法（BioTechniques Vol.24,760_762，1998)により plasmidを抽出、精製し た。得られた plasmidを大腸菌 DH10にエレクト口ポーレーシヨン法により形質転換し、 L Β ·カルべニシリン 100mlで 30°Cでー晚培養し、 QIA filter plasmid midi kit (Qiagen社 製)により同キットのプロトコールに従って plasmidを抽出、精製した。
[0143] 以上の操作を 1クールとして、この後同じ操作を 4回繰り返し、 SNK01抗体に反応す る抗原をコードする plasmidを濃縮した。最後に、 AutoMACSのかわりにセルソーター（ FACSVantage, Becton Dickinson社製）により陽性細胞を分取し、これらより抽出した plasmidを形質転換した大腸菌 DH10を適量 LB 'カルべニシリンプレートに塗布した。 3 0°Cでー晚培養し、現れたコロニーを 30個ピックアップし、それぞれより plasmidを抽出 、 C〇S7細胞に transfectionし、 SNK01抗体を用いて FACS解析することにより陽性 plas midを選抜した。 [0144] 得られた plasmid上にクローン化されている cDNAの塩基配列を決定し、マウス遺伝 子データベースに登録されている塩基配列情報と blastサーチすることにより、その遺 伝子を決定した。また、同時にヒト遺伝子データベースをサーチすることによりその力 ゥンターパートを同定した。
その結果モノクローナル抗体 SNK01が結合したクローンは、配列番号： 7および、配 列番号： 9に記載の塩基配列を有していた。これらの塩基配列によってコードされるァ ミノ酸配列を、配列番号： 8および配列番号： 10に示した。
配列番号： 9に記載の塩基配列は、マウス BST2として既知の塩基配列であった (Ge nBank Acc#.BC027328)o一方、配列番号： 7に記載の塩基配列は、配列番号： 9の塩 基配列と部分的に同一の塩基配列を有していたが、 3'末端側に異なる塩基配列が 見られ、異なるアミノ酸配列をコードしていた。すなわち、配列番号： 8に記載のァミノ 酸配列のうち、 N末端から 139位までのアミノ酸配列は、配列番号： 10に記載されたァ ミノ酸配列と一致した。そして配列番号: 8に記載のアミノ酸配列において、 N末端か ら 140〜178番目のアミノ酸は、配列番号： 8に記載のアミノ酸配列に固有の配列であ つた。両者はォータナティブスプライシングによって生じたバリアントであると考えられ た。これらの知見に基づいて、配列番号： 7に記載の塩基配列によってコードされるァ ミノ酸配列（配列番号: 8)からなるタンパク質は、マウス BST2の新規なスプライシング バリアントであると考えられた。以下、配列番号： 7に記載の塩基配列からなる遺伝子 を mBST2H、配列番号： 9に記載の塩基配列からなる遺伝子を mBST2Dとも称する。 （ 図 7(a))
[0145] 3) FACSによる確認
上記発現クローニング法により得られたプラスミドを QIA filter plasmid midi kit (Qiag en社製)により再度大腸菌より高度に精製し、もう一度 COS7細胞に transfectionした。
48時間後、定法に従って、 SNK01抗体および FITC標識抗ラット Ig抗体で反応させ、 F ACS解析を行うことで、 plasmid上にクローン化されている cDNA力 抗原をコードして レ、るかどうかを確認した。
その結果、上記モノクローナル抗体 SNK01は、プラスミドを導入した COS7細胞に対 する結合が観察された。したがって、プラスミド上にクローン化されている cDNAは、い ずれもこのモノクローナル抗体によって認識された抗原をコードしていることが確認さ れた。
実施例 7
[0146] ウェスタンブロティング法による抗体の反応性の確認
前記モノクローナル抗体が、配列番号： 8または配列番号： 10に記載のアミノ酸配 列を有する蛋白質を認識し結合することを、ウェスタンブロッテイング法によって確認 した。配列番号： 8または配列番号： 10に記載のアミノ酸配列を遺伝子組み換え体と して発現させ、本発明のモノクローナル抗体との反応性を確認した。具体的な操作は 次のとおりである。
[0147] l) pcDNA3.1_mBST2Dおよび pcDNA3.1_mBST2Hの構築
クローユングした mBST2Dおよび mBST2Hをコードする plasmid(l μ g)を铸型として、 P
CRにより配列番号： 7または配列番号： 9に記載の塩基配列を有する DNAを増幅した
。 PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおりである。
forward primer (酉己歹番 "^：丄 1)：
5 -tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagatgggggggaa gcaagga-3
reverse primer (酉己歹 [j番号： 12)
5 -tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac-3
また反応液の組成は以下のとおりである。
1XGC bufferl,
dNTP mix (0.25 mM )，
LA Taq DNA polymerase 5U (以上タカラバイオ製)/ 100 μ L
rorward primer (1 pmol):
reverse primer (1 pmol)
[0148] 95°Cで 1分インキュベート後、 [95°C30秒 /55°C30秒 /72°C 1分 30秒]を 1サイ クノレとして、 25回の条件で PCRを行った。ァガロースゲル電気泳動にて目的の大きさ の DNA断片が増幅されていることを確認後、フエノールクロロフオルム抽出、エタノー ル沈殿後、回収した増幅産物を TE buffer 10 /i Lに溶解した。これを制限酵素 Nhe I および Xho I (タカラバイオ製)で切断後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製 )を用いてァガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール沈殿後、 TE buffer 4 /i L に溶解した。
一方、哺乳動物細胞発現 plasmid pcDNA3.1 (インビトロジヱン社製） 5 μ gを制限酵 素 Nhe Iおよび Xho Iで消化、 CIAP (タカラバイオ製)処理後、ァガロースゲル電気泳 動により精製し、エタノール沈殿後、 TE buffer 4 μ Lに溶解した。前述の DNA断片そ れぞれ 2 μ Lと、この plasmid 0.5 μ Lを ligation kit ver.II (タカラバイオ製)を用いて連結 し、大腸菌 DH5に形質転換した。
LB培地（100 a g/mlアンピシリン）にて 37°Cでー晚培養後、出現したコロニー数個 を選び、 QIAprep Spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いて plasmidを抽出した。抽出 されたプラスミドに揷入されている DNA断片の塩基配列を定法に従って決定した。配 列番号： 8または配列番号： 10に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する DNA断片が挿入されているプラスミドであることを確認し、 目的の構築物 PCDNA3.1- mBST2Dおよび pcDNA3. l_mBST2Hを得た。
[0149] 2) pcDNA3.1- mBST2D_Hisおよび pcDNA3.1- mBST2H_Hisの構築
pcDNA3. l-mBST2D (pcDNA3. l-mBST2D_His構築の場合）あるいは pcDNA3. l_m BST2H (pcDNA3.1-mBST2H- His構築の場合） 1 μ gを铸型として、 PCRにより Hisタグ をコードする塩基配列を付加した。 PCRに用いたプライマーの塩基配列は次のとおり である。なお forward primer (配列番号： 13)は、 pcDNA3.1- mBST2D_Hisと pcDNA3.1 -mBST2H_Hisに同じものを用いた。反応液の組成と温度サイクルの条件は 1)と同様 とした。
forward primer (酉己歹 [J畨亏： 13)：
0 -ccagctcacccgcacccaggacagtc-3
reverse primer (pcDNA3.1_mBST2D-His用、配列番号： 14)：
5 -tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatgaaagagcagaaacagtgacactttga-3
reverse primer (pcDNA3.1_mBST2H_His用、配列番号： 15)：
5 -tttttttctcgagtcaatgatgatgatgatgatggaagtctccttttggatcctgagctg-j'
[0150] ァガロースゲル電気泳動にて目的の大きさの DNA断片が増幅されていることを確認 後、フエノールクロロフオルム抽出、エタノール沈殿後、 TE buffer 10 μ Lに溶解した。 これを制限酵素 BamH Iおよび Xho I (タカラバイオ製)で切断後、 QIAquick Gel Extra ction Kit (QIAGEN社製)を用いてァガロースゲル電気泳動により精製し、エタノール 沈殿後、 TE buffer 4 μ 1に溶解した。
一方、 pcDNA3.1_mBST2Dおよび pcDNA3.1_mBST2H 5 x gを制限酵素 BamH Iお よび Xho Iで消化、 CIAP (タカラバイオ製)処理後、ァガロースゲル電気泳動により精 製し、エタノール沈殿後、 TE buffer 4 μ Lに溶解した。 PCRで増幅された DNA断片そ れぞれ 2 μ Lとこれらの plasmid 0.5 μ Lを ligation kit ver.II (タカラバイオ製)を用いて 連結し、大腸菌 DH5に形質転換した。
LB培地（100 a g/mlアンピシリン）にて 37°Cでー晚培養後、出現したコロニー数個 を選び、 QIAprep Spin miniprep kit(QIAGEN社製)を用いてこれらより plasmidを抽出 した。抽出されたプラスミドに揷入されている DNA断片の塩基配列を定法に従って決 定した。 Hisタグをコードする塩基配列が付加された DNA断片が挿入されていることを 確認し、 目的の構築物 pcDNA3.1-mBST2D- Hisおよび pcDNA3.1_mBST2H- Hisを得 †- ό) Western-blotting
6cmデイシュに COS7細胞を 5xl05で 10枚まき、 37°C、 5%CO下で 20時間培養し た。培養後の COS7細胞に、 Effectene trasfection Reagent(Qiagen社製)により、 cDN A3. l-mBST2D- Hisあるいは pcDNA3.1-mBST2H_Hisを形質転換した。操作は、同製 品のプロトコールに従った。 37°C ' 5%CO下で 48時間の培養後、 PBSで洗浄、 PBS/
5mM EDTAで細胞をデイシュから剥離し回収した。回収した細胞は、さらに PBSで洗 浄後、 IxHalt Protease Inhibitor Coctail (PIERCE社製)を含む 2mlの RIPA bufferを加 えて氷上で 1時間溶解した。 RIPA bufferの組成を以下に示す。
50 mM Tris-HCl(pH7.4),
150 mM NaCl,
1% Triton x-100,
0.5% sodium deoxycholate,
0.1% SDS [0152] 溶解後の細胞は、 4°C、 15000卬 m、 5分間の遠心分離した。上清は Microcon YM- 10(MILLIPORE社製)にて 50 μ L以下まで濃縮し、ウェスタンブロッテイングの試料とし た。一方、沈殿物は、 lxHalt Protease Inhibitor Coctail (PIERCE社製)を含む lmLの RIPA bufferでもう一度洗浄後に、ウェスタンブロッテイングの試料とした。
沈殿には 200 μ Lの lx変性 bufferを、濃縮した上清には等量の 2x変性 bufferをカロえ 100°Cにて 10分間煮沸した後、それぞれ 5 μ Lを NuPAGE4_12% Bis-Tris Gel (イン ビトロジェン社製)にて電気泳動した。泳動後のゲル力 試料をセミドライ方式のブロッ ティング装置（BI〇 CRAFT社製、 MODEL BE-330)にて、 PVDF膜（MILLIPORE社製 )にトランスファーした。
抗体による検出はィムノスターキット（和光純薬社製）を用いた。まず、 1次抗体とし て、 HRP標識抗 His tag抗体 (インビトロジヱン社製）を 5000倍希釈の濃度で用いて、 ィムノスターキットのプロトコールに従ってシグナルを検出した。シグナルの検出後、 P VDF膜を変性溶液（7M 塩酸グァニジン、 50mMグリシン、 0.05mM EDTA、 0.1 M 塩化カリウム、 20 mM 2-メルカプトエタノール）で室温で 1時間振とう処理することによ り、標識抗 His tag抗体を除去した。次に、ビォチン標識した SNK01抗体を用いて、同 様に、シグナルを検出した。結果を図 5に示す。
[0153] モノクローナル抗体 SNK01において、アミノ酸配列力 予想される分子量（約 20kD) の位置に明瞭なバンドが見られた。 SNK01は、 BST2D (配列番号： 10)と BST2H (配列 番号： 8)の両方に対して強く反応した。 20kD以上の位置にも強い反応が検出された 。これらの分子量の大きい蛋白質は、糖鎖の修飾を有していると予想された。 BST2D (配列番号： 10)は、上清よりも沈殿で強いシグナルが見られた。 BST2H (配列番号： 8)も沈殿でより強いシグナルが見られたが、上清に対しても抗体の強い反応が検出 された。 BST2D (配列番号： 10)に対する Hisタグ抗体のシグナルが検出されていない のは、 C末端に付カ卩した Hisタグがプロセシングによって除去されてしまったためと考 えられた。
実施例 8
[0154] RT-PCR法によるマウス BST2の発現確認
各細胞より抽出した RNAより合成した cDNAを铸型として、定法に従って PCRを行い 、抗原遺伝子が IPCに特異的に発現していることを確認した。 PCRに用いたプライマ 一の塩基配列は次の通りである。
配列番号： 7用 forward (配列番号： 16)：
5 -acatggcgccctctttctatcac-3'
reverse (配列番号： 17)：
5 -gagcccaggttttgaaggaagtg-3'
配列番号： 9用 forward (配列番号： 18)：
5 -agctcacccgcacccaggacagt-j'
reverse (配列番号： 19)：
5 -cactccccagtcctaaagttct-3
βァクチン用センスプライマー（配列番号： 20)：
5 -gtgggccgctctaggcaccaa-3
アンチセンスプライマー（配列番号： 21)：
5 -ctctttgatgtcacgcacgatttc-3
[0155] 発現レベルを比較した cDNAまたは細胞は次の通りである。 DNAパネルは市販品（ Clonetech社製）を利用した。細胞は、セルソーター（FACSVantage, Becton Dekinson 社製）により高度に分離したものを用いた。結果は図 6に示した。 BST2D (配列番号： 9)は、複数の細胞で発現が見られた。強い発現が見られたのは IPCであった。 BST2 H (配列番号： 7)はマウス IPCで強レ、発現が観察された。
CD3陽性細胞 (T細胞）、
CD8陽性細胞、
マウス IPC、
myeloid DC、および
マウス各臓器より抽出した RNAより合成した cDNAパネル、
実施例 9
[0156] マウス BST2の新規スプライシングバリアントのクローニング
実施例 8において、配列番号： 7用プライマーの組み合わせにより、配列番号： 7の c DNAに該当する増幅断片の他に、短い増幅断片が観察された。本増幅断片を定法 によりクローニングして塩基配列を確認したところ、配列番号： 7に示した mBST2Hの 第 2ェクソン部分が欠失した塩基配列を有していた。すなわち、配列番号： 22に示し た塩基配列を有する、マウス BST2の新規のスプライシングバリアントであると考えられ た。この遺伝子がコードするアミノ酸配列を配列番号： 23に示した。実施例 8に示した ように、本遺伝子もマウス IPCに発現していることを確認した。この配列番号： 22記載 の遺伝子を、以下 mBST2HSとも称する。
mBST2D、 mBST2H、 mBST2HSのアミノ酸配列のァライメントを図 7(a)に、それぞれ のゲノム構造を図 7(b)に示す。
実施例 10
[0157] マウス BST2発現ベクターの作成
実施例 6により得られた mBST2Dおよび mBST2Hの cDNAを铸型とし、以下の塩基配 歹 IJからなるプライマーを使って以下の条件で PCRを行った。
mBb Γ2~Ρ ； tttttgctagcgacggatcacatggcgccctctttctatcactatctgcccgtgcccatggatgagat gggggggaagcaagga (酉己歹 lj番号： 24)および
mBb Γ2- R； tttttttctcgagtcctcaaaagagcaggaacagtgac (酉己列番号： 25)
DNAポリメラーゼ： LA Taq (タカラバイオ社）
[95°Cを 30秒、 55°Cを 30秒、 72°Cを 2分]を 25サイクノレ
増幅されたそれぞれの断片を制限酵素 Nhel及び Xhol (レ、ずれもタカラバイオ社製） で処理して切断した後、同様に Nhelと Xholで処理した動物細胞発現用ベクター pcD NA3.1- Zeo(+) (インビトロジヱン社）と ligation kit ver.II (タカラバイオ社製）を用いて連 結し、それぞれの発現ベクターとした。 mBST2HSの発現ベクターについては mBST2H の第 2ェクソン部分を PCR法を用いて定法に従って除去することによって作成した。 実施例 11
[0158] ヒトォーソログ cDNAのクローニングと発現ベクターの作成
本発明において同定されたマウス IPC特異抗原 BST2のヒトォーソログを検索したと ころ、ヒト BST2として報告された既知の遺伝子であった（IshikawaJ. et al. Genomics, 1995 ; 26, 527- ; GenBank Acc#. D28137)。更にマウスで見出された新規スプライシ ングバリアントのヒトォーソログも含めて以下のようにして PCR法によりクローニングし、 3種類の発現ベクターを作成した。
[0159] 下記の実施例に示した方法に従って、 Herpes Simplex virus刺激を行ったヒト IPCを 調製し、 RNAを抽出後、スーパースクリプトファーストストランドシステムキット (インビト ロジェン社）を用いて、ファーストストランド cDNAを合成した。これを錡型に、 hBST2 pr lmer P ; aaaaaaagctagctggatggcatctacttcgtatg (酉己列番号： 26)および hBST2 primer R ； aaaaaaactcgagacccataacaacaggcagcacat (酉己歹 I [番号： 2 で、、 LA raq (タカフノ ィ ) を酵素にもちいて PCR(95°Cを 30秒、 55°Cを 30秒、 72°Cを 2分、 25 cycle)を行った。 増幅された断片を、制限酵素 Nhelおよび Xholで切断後、 pcDNA3.ト Zeo(+) (インビト ロジェン社）の Nheト Xholサイトに揷入し、ヒト BST2の発現プラスミドとした。
[0160] マウススプライシングバリアントのォーソログである遺伝子に関しては、 IPCの cDNA ライブラリーを錡型として以下の塩基配列からなるプライマーで、 LA Taq (タカラバイ ォ)を酵素にもちいて PCR(95°Cを 30秒、 55°Cを 30秒、 72°Cを 2分、 25 cycle)を行った 。 cDNAは、 GeneRacer kit (インビトロジェン社）によって合成した。増幅された断片を 、制限酵素 Nhelおよび Xholで切断後、 pcDNA3.1_Zeo(+) (インビトロジェン社）の Nhel -Xholサイトに挿入し、発現プラスミドとした。
mBST2Hォーソログ用のプライマー
hBST2 primer F (配列番号： 26)および
pnmerhBHR ; ttttttctcgagctagggatgtgggggtgagaggaatgtggcaggtggagggtagcgggggaagg ctatctctgacctcagtcgctccacctctgcagac (酉己歹1 号： 28)
mBST2HSォーソログ用のプライマー
hBST2 primer F (配列番号： 26)および
pnmerhBj) 2HSRl； aaaaaaactcgagcttatggtttaatgtagtgatctctccacagtgtggttgcaggtggc ggcct (配列番号： 29)
[0161] 既知遺伝子であるヒト BST2の塩基配列を配列番号： 1に、アミノ酸配列を配列番号： 2に示した。以下、この配列を有する遺伝子を hBST2Dとも称する。また、上記により得 られた mBST2Hのヒトォーソログ（以下、 hBST2Hとも称する）の塩基配列を配列番号： 3に、アミノ酸配列を配列番号： 4に、また、 mBST2HSのヒトォーソログ（以下、 hBST2H Sとも称する）の塩基配列を配列番号： 5に、アミノ酸配列を配列番号： 6に示した。 hBST2D、 hBST2H、 hBST2HSのアミノ酸配列のァライメントを図 8(a)に、それぞれの ゲノム構造を図 8(b)に示した。 hBST2Hおよび hBST2HSは新規スプライシングバリアン トであることが示唆された。
実施例 12
[0162] RT-PCR法によるヒト BST2遺伝子の発現の確認
各細胞より抽出した RNAより合成した cDNAを铸型として、定法に従って PCRを行い 、ヒト BST2の各バリアントの発現を検討した。 PCR条件としては、 95°C、 1分間反応さ せた後、 95°Cを 30秒、 60°Cを 30秒、 73°Cを 45秒を、 1サイクルとして、 Dタイプは 30サイ クル、 Hタイプ及び HSタイプは 35サイクル反応させた（図 9)。
プライマーの配列は次の通りである。
Forward primer; gccttcgggcagtgatggagtgtc (目 d歹1 J¾-¾" : dO)
D用 Reverse primer; tcaagcgaaaagccgagcaggac (ld^J¾ -^" : ύ ΐ )
Fi、 HS用 Reverse primer; aatgtggcaggtggagggtag (酉己列番号： 32)
結果、ヒト BST2mRNAは複数の組織、細胞で発現していることがわ力 た。また、 IP Cにおいては HSV刺激により、発現が増強されることがわかった。
実施例 13
[0163] マウス BST2を認識する抗体の作製と評価
1)抗マウス BST2抗体の作製
マウス BST2の 3種類のサブタイプ D、 H、 HSのいずれ力、あるいは複数を認識する 抗体を以下のように作製した。
6cmディッシュ 5枚に、 夂あたり 4xl05個の COS7細胞を播種し、 20時間培養後に Eff ectene trasfection Reagent(Qiagen社製)を用いて同製品のプロトコールに従い、上記 実施例 10で作製したそれぞれのタイプの cDNAがクローニングされた 3種類の発現べ クタ一を同量（ディッシュ 夂あたり 1 μ g)ずつ混合してトランスフエクシヨンした。 24時 間後、新鮮な培地に交換し、更に 24時間後、 PBS/5mM EDTAで細胞を回収し、 PBS で洗浄した後に、 Wister rat (5〜6週令）の両足の foot padにアジュバンド CFAとともに 注入した。このような操作を 0、 4、 11日目に行って免疫したラットから、 12日目にリンパ 節を採取して、実施例 1に示したのと同様の方法で、ノ、イブリドーマを作製した。ハイ ブリドーマの培養上清を Cell ELISAによってスクリーニングし、 3種類の発現ベクター をトランスフエクシヨンした COS7細胞には反応し、宿主の COS7細胞には反応しないク ローンを選択した。更に FACS解析でも結合活性を確認して細胞のクローニングを行 レ、、最終的には 5つの陽性クローンを得た。
[0164] 2)マウス IFN産生能への影響
得られたクローンの培養上清を用いて、実施例 5に示した方法に従って、 IFN産生 に与える影響を検討したところ、いずれもコントロール抗体と比較して IPCの IFN産生 を抑制する活性があった。更に、 Ο. Ι μ Μの CpG ODN 1668 (MWG Biotech社）を用い て刺激した際にも、 IFN産生抑制活性を示した（図 10)。このことから、 SNK01以外の mBST2に対する抗体も IPCからの IFN産生を抑制する活性を示すことが確認された。 実施例 14
[0165] ヒト BST2 (hBST2)を認識する抗体の作製と評価
1)ヒト BST2抗体の作製
ヒト BST2の 3種類のサブタイプ D、 H、 HSのいずれか、あるいは複数を認識する抗体 を実施例 13と同様の方法に従って作製した。実施例 11で作製したそれぞれのタイ プのヒト cDNAがクローニングされた 3種類の発現ベクターを用レ、、ハイプリドーマのス クリーニングは培養上清を FACS解析することによって行った。 hBST2Hにのみ反応す るクローン (3D3#7)、 hBST2H及び hBST2Dに反応するクローン (3E2#8、 5C11#7)、 hBS T2H、 hBST2D、 hBST2HSいずれにも反応するクローン (3G7#6)など、複数のクローン が得られた。得られた複数のクローンの精製抗体を取得し、更に解析を行った。
[0166] 2)ヒ HFN産生能への影響
健常人より末梢血を採取し、 PBL (末梢血リンパ球）を分離した。 Lineage抗体 (CD3、 CD14、 CD16、 CD19、 CD20、 CD56抗体)にて MACSで種々の細胞を除去した後、 CD 4陽性、 CD123陽性、 Lineage陰性細胞群を IPCとしてセルソーターで分離した。このよ うに取得したヒト IPCを 2xl04cells/wellで 96 wellプレートに播種し、それぞれ 3、 10、 30 μ g/mLの濃度で抗 BST2抗体を添加して 37°Cで 1時間培養した。 1時間培養後に Her pes Simplex virus(20 pili/cell)を添加し、 37°Cで 24時間培養し、培養上清中の IFN α を ELISA kit(Bender Med System社)により、測定した。その結果、抗ヒト BST2抗体は、 既に報告のある BDCA2抗体 (Miltenyi社)と同様に、ヒ HFN産生抑制活性を示すこと が明らかとなった。 （図 11a)クローン 3D3#7は hBST2Hに、クローン 3G7#6は hBST2H、 hBST2D、および hBST2HSのいずれにも反応した。 （図 l ib)すなわち、ヒト BST2を認 識する抗体は、 IPCの IFN産生活性に影響を与えることが明らかとなった。
実施例 15
[0167] BST2タンパク質の発現パターン
1) マウス BST2の発現パターン
モノクローナル抗体 SNK01を用いて、マウス BST2タンパク質の発現を FACSにより解 析した。 Balb/cマウス、あるいは Typel IFN receptorノックアウトマウスの脾臓細胞を、 CpG (0.5 μ Μ)あるいはインフルエンザウイルス PR8で 24時間刺激した後、各種抗体 を用いて細胞染色を行った。刺激をしていない通常の状態では、図 1に示したように BST2は IPCに特異的に発現していた力 Balbんマウスにおいては刺激によって、多く の細胞において BST2の発現が誘導されることが明らかになった（図 12)。 CD3陽性で ある T細胞、 CD19陽性である B細胞、 DX5陽性である NK細胞、 Gr_l陽性である顆粒 球、いずれにおいても同様の傾向が検出された。更に、それらの CpG、ウィルスによ る BST2の発現増強は、 IFNRノックアウトマウスでは検出されなかったことから、 IFNの シグナルを介して BST2の発現が誘導されることが推定された。
[0168] 2) ヒト BST2の発現パターン
実施例 14の 1)で作製した抗体 5C11を用いて、ヒト BST2タンパク質の発現を FACS により解析した。健常人の末梢血より PBLを採取し、 IFNひを lng/mlの濃度で添加し て 37°C、 24時間培養し、抗 BDCA-2抗体、抗 BDCA-4抗体と 5C11との二重染色を行 つた（図 13)。この結果、ヒト IPCにおいて、通常は BST2の発現が検出されないが、 IF N刺激により BST2の発現が誘導されることが明らかになった。すなわち、 BST2分子は マウスと同様ヒトにおいても、 IFNにより発現が誘導され、更に IFNの産生自体に影響 を与えることが明らかになった。また、 CpGにより刺激した場合にも、 IPC上で発現が 誘導されることが明らかになった（図 14)。
実施例 16
[0169] 抗体の in vivoにおける評価 1)抗体投与マウスより採取した細胞の解析
Balb/cマウスの腹腔内に SNK01、およびコントロールのラット IgGを 1匹あたり 300 μ g ずつ、一日おきに 3回投与し (0.9mg/マウス）、 6日目に脾臓、骨髄をそれぞれ採取し 、 IPCの存在率を B220、 CDllc、 CDllbの染色によって解析した。更に、骨髄細胞を lxl06/wellにて 96wellプレートに播種し、 CpG (0.5 μ Μ)あるいはインフルエンザウィル ス PR8によって刺激し、 24時間後の培養上清のサイト力イン値を ELISAにより測定した (図 15)。
その結果、 SNK01投与群において、各種刺激に対しての IFNの産生能が低いことが 明らかになった。なお、 IL-12の産生への影響は認められなかった。このことより、本 抗体投与により、分子が発現している細胞の機能に変化を生じ、 in vitroでの刺激に よる IFN産生能が抑制されたことが示された。
[0170] 2)ウィルス感染マウスを用いた解析
抗体を前投与（1.5日前と 0.5日前にそれぞれ一匹あたり 500 μ g)したマウス (n=3)に 5xl04pfli/mouseの MCMV (マウスサイトメガロウィルス）を腹腔内に投与し、感染を起 した。この感染後、 1.5日後のマウスの血清中の IFN aを ELISAにより測定した。また、 脾臓での IPCの存在率を B220、 CDl lc、 CDllbの染色によって解析した（図 16)。 その結果、 SNK01投与群において、血清中の IFN産生量は抑制されていた。なお、 TNF aの産生への影響は認められなかった。すなわち、本抗体投与により、 in vivoに おける IFN産生能が抑制されたことが示された。抗体の細胞への結合が、細胞機能を 調節したものと考えられた
[0171] 3)抗体を投与したマウスの細胞の解析
Balbんマウス（n=3)の腹腔内に SNK01、および実施例 13で作製した抗マウス BST2 抗体クローン #12、ラッ HgG (コントロール）を 1匹あたり 500 x gずつ投与し、 24時間後 に、各臓器での IPCの存在率を FACS解析によって測定した。その際には、実施例 1 に示した方法により作製された IPC特異的抗体である SNK02抗体、及び CDl lc抗体（ Beckton Dickinson社製）を用いて染色を行なった。
その結果、抗マウス BST2抗体投与群において、末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄の各 臓器での IPCの減少が確認された（図 17)。なお、リンパ節において、 T細胞 B細胞に は大きな変化は認められなかった。すなわち本抗体が、 IPCの活性を調節することが 示された。
産業上の利用可能性
[0172] 本発明によって IPC活性の調節剤、あるいは調節方法が提供された。 IPCには他の 細胞の数千倍もの IFNを産生する細胞が含まれる。したがって、その IFN産生能、お よび細胞生存（あるいは細胞数）のいずれかあるいは両方を抑制すれば、 IFNの産生 を効果的に抑制することができる。 IPCによって産生されるタイプ 1IFNの過剰産生は 自己免疫疾患の発症メカニズムと密接に関連していることが明らかにされている。し たがって、本発明によって提供された IPC活性の調節剤、あるいは調節方法は、 自己 免疫疾患の治療に利用することができる。
[0173] また、 BDCA-2および BDCA-4陽性細胞による白血病が報告されている (Jacob, MC . et al. Haematologica 88; 941—955.2003; uhaperot L.et al. Eur. J. Immunol. 34; 4丄 8-426. 2004)。このような白血病に対しては、本発明に基づいて癌性の細胞を直接抑 制することができる可能性がある。すなわち、本発明による IPCの活性化の抑制剤は 、 BST2またはそのホモログを発現する細胞からなる癌細胞の抑制剤として有用であ る。
[0174] また本発明は、 BST2およびそのホモログの、 IPCの活性化マーカーとしての用途を 提供した。生体内における IPCの活性化は、タイプ 1IFNの産生増加スィッチがオンさ れたことを示している。したがって、たとえば IFNによってもたらされる自己免疫疾患の 検出マーカー、あるいは診断指標として BST2およびそのホモログは有用である。ある いは IPCの活性化は、ウィルス感染の初期の段階で起きる。そのため、 IPCの活性化 を、ウィルス抗体が血中に見出せない時期に、ウィルス感染の可能性を知るための マーカーとすることもできる。いずれにせよ、生体内における IPCの活性化のレベルは 、臨床的に重要な情報である。
[0175] 更に、培養細胞における BST2およびそのホモログの発現レベルを指標として、被 験化合物の IPCの活性化状態を調節する活性を評価することができる。すなわち、 BS T2およびそのホモログの発現レベルを指標として、 IPCの活性化を調節する化合物を スクリーニングすることができる。本発明に基づくスクリーニング方法で見出すことがで きる化合物も、 IPC活性の調節剤、あるいは調節方法に有用である。このような化合 物は、 自己免疫疾患の治療剤として利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] BST2およびそのホモログのレ、ずれかまたは両方を認識する抗体を有効成分として含 有するインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
[2] インターフェロン産生細胞の活性力 インターフェロン産生活性およびインターフエ口 ン産生細胞の生存のいずれか、または両方である請求項 1に記載のインターフェロン 産生細胞の活性抑制剤。
[3] インターフェロン産生細胞の活性力 インターフェロン産生活性であり、かつインター フエロン力 Sタイプ 1インターフェロンである請求項 2に記載のインターフェロン産生細胞 の活性抑制剤。
[4] BST2およびそのホモログ力 配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる 群から選択されるいずれかの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質である請 求項 1に記載のインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
[5] 配列番号: 4に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質を認識する抗体を有効成分として含 有する、請求項 4に記載のインターフェロン産生細胞の活性抑制剤。
[6] 配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質 の全てを認識する抗体を有効成分として含有する、請求項 4に記載のインターフエ口 ン産生細胞の活性抑制剤。
[7] BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方を認識する抗体をインターフェロン 産生細胞に接触させる工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性抑制方法。
[8] インターフェロン産生細胞の活性力 インターフェロン産生活性およびインターフエ口 ン産生細胞の生存のいずれか、または両方である請求項 5に記載のインターフェロン 産生細胞の活性抑制方法。
[9] 次の工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体の製造方法。
(1) BST2およびそのホモログのいずれかまたは両方、もしくはその断片を免疫原として 免疫動物に投与する工程
(2) (1)の免疫動物の抗体産生細胞から、 BST2およびそのホモログのレ、ずれかまたは 両方を認識する抗体を産生する抗体産生細胞を選択する工程、
(3) (2)で選択された抗体産生細胞を培養するか、または当該抗体産生細胞が産生す る抗体をコードする遺伝子を単離し、この遺伝子を発現可能に保持する細胞を培養 する工程、および
(4)(3)の培養物からインターフェロン産生細胞の活性を抑制する抗体を回収する工程
[10] 免疫原が、ヒトから採取されたインターフェロン産生細胞である請求項 9に記載の方 法。
[11] 次の (a)_(d)のいずれかに記載の指標物質を検出する工程を含む、活性化されたイン ターフェロン産生細胞の検出方法。
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力、の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
[12] 次の (a)-(d)のいずれかに記載の指標物質を有する細胞を単離する工程を含む、活 性化されたインターフェロン産生細胞の分離方法。
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力、の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
[13] 配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの 配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体を含む、活性化され たインターフェロン産生細胞検出用試薬。
[14] 配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれかの 配列番号に記載の塩基配列から選択された少なくとも 15塩基からなる連続した塩基 配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、活性化されたインターフェロン産生細胞検出 用試薬。
[15] 配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの 配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体を含む、活性化され たインターフェロン産生細胞分離用試薬。
[16] 次の工程を含む、生体のインターフェロン産生細胞の活性化のレベルを測定する方 法。
(1)生体力も採取された試料に含まれるインターフェロン産生細胞における、（a)-(d)の いずれかに記載の指標物質を発現している細胞、およびその発現レベルのいずれ 力または両方を検出する工程、および
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
(2) (1)で測定された細胞の数、およびその発現レベルのいずれかまたは両方を、被検 者のインターフェロン産生細胞の活性ィ匕のレベルに関連付ける工程
[17] 生体から採取された試料が、体液、皮膚、滑膜組織、造血組織、膿、肺胞洗浄液、お よび血液細胞を含む可能性のある生検組織試料からなる群から選択されるいずれか の試料である請求項 16に記載の方法。
[18] 次の工程を含む、被験物質のインターフェロン産生細胞の活性化を調節する作用の 検出方法。
(1)インターフェロン産生細胞を被験物質とともに細胞刺激剤と接触させる力、、または インターフェロン産生細胞と被験物質の接触の前、若しくは後に細胞刺激剤と接触さ せる工程
(2)インターフェロン産生細胞における、（a)-(d)のいずれかに記載の指標物質の発現 レベルを測定する工程、および
(a)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ 力の配列番号に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載の塩基配列から選択された連続する塩基配列を有するポリヌク レオチド
(c)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列を含む蛋白質
(d)配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号： 6からなる群から選択されるいずれ かの配列番号に記載のアミノ酸配列から選択された連続するアミノ酸配列を有する 蛋白質
(3) (2)で測定された指標物質の発現レベルを、対照と比較し、発現レベルが対照より も有意に高い場合に被験物質のインターフェロン産生細胞の活性化を増強する作用 が、また対照よりも有意に低レ、場合には被験物質のインターフェロン産生細胞の活 性化を抑制する作用が検出される工程
[19] 細胞刺激剤がウィルス、ウィルスの構成要素、バクテリアの DNA、およびインターフエ ロンからなる群から選択される少なくとも 1つの細胞刺激剤である請求項 18に記載の 方法。
[20] 次の工程を含む、インターフェロン産生細胞の活性化を調節する作用を有する被験 物質のスクリーニング方法。
(1)請求項 18に記載の方法によって、被験物質のインターフェロン産生細胞の活性 化を調節する作用を測定する工程、および
(2)対照と比較して前記活性化を調節する作用が大きい被験化合物を選択する工程
[21] 請求項 20に記載の方法によって選択された被験物質を有効成分として含有する、ィ ンターフェロン産生細胞の活性を調節するための医薬組成物。
[22] 配列番号： 2、配列番号: 4、および配列番号: 6からなる群から選択されるいずれかの 配列番号に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質を認識する抗体を含む、インターフ エロン産生細胞の活性化を調節する作用を検出するための試薬。
[23] 配列番号： 1、配列番号： 3、および配列番号： 5からなる群から選択されるいずれかの 配列番号に記載の塩基配列から選択された少なくとも 15塩基からなる連続した塩基 配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、インターフェロン産生細胞の活性化を調節す る作用を検出するための試薬。
[24] 次の i)-vi)のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
i)配列番号: 4、または配列番号: 6に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコード するポリヌクレ才チド；
ii)配列番号： 3、または配列番号： 5に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレ ォチド；
iii)配列番号: 4、または配列番号: 6に記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数の アミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号 : 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等なタンパク質をコードするポ リヌクレ才チド；
iv)配列番号： 3、または配列番号： 5に記載の塩基配列からなる DNAとストリンジェント な条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチド；および
V)配列番号： 4に記載のアミノ酸配列にぉレ、て、 N末端から 139〜 158位のアミノ酸配 列をコードするポリヌクレオチド
vi)配列番号： 6に記載のアミノ酸配列において、 N末端から 96〜100位のアミノ酸配 列をコードするポリヌクレオチド
[25] 請求項 24に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質。
[26] 請求項 25に記載の蛋白質に対する抗体であって、配列番号: 4に記載のアミノ酸配 列の N末端から 139〜 158位のアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体。
[27] 請求項 25に記載の蛋白質に対する抗体であって、配列番号： 6に記載のアミノ酸配 列の N末端から 96〜100位のアミノ酸配列を含む領域を認識する抗体。
[28] モノクローナル抗体である請求項 26または請求項 27に記載の抗体。
[29] 請求項 24に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[30] 請求項 24に記載のポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含むベクターを保 持する形質転換細胞。
[31] 請求項 30に記載の形質転換細胞を培養し、培養物から請求項 25に記載の蛋白質 を採取する工程を含む、請求項 25に記載の蛋白質の製造方法。
[32] FERM ABP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-10340 として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6。
[33] FERM ABP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-10340 として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体、またはその抗 原結合領域を含む断片。
[34] FERM ABP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-10340 として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6を培養し、培養物に含まれるィムノグロブリンを 回収する工程を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合領域を含む断片の製 造方法。
[35] FERM ABP-10339として寄託されたハイブリドーマ 3D3#7、または FERM ABP-10340 として寄託されたハイブリドーマ 3G7#6が産生するモノクローナル抗体、またはその抗 原結合領域を含む断片を有効成分として含有するインターフェロン産生細胞の活性 抑制剤。
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