WO2006001473A1 - ヒアルロン酸を用いた小型肝細胞の選択的培養法および分離法 - Google Patents

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WO2006001473A1
WO2006001473A1 PCT/JP2005/011915 JP2005011915W WO2006001473A1 WO 2006001473 A1 WO2006001473 A1 WO 2006001473A1 JP 2005011915 W JP2005011915 W JP 2005011915W WO 2006001473 A1 WO2006001473 A1 WO 2006001473A1
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hyaluronic acid
carrier
cells
small hepatocytes
hepatocytes
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PCT/JP2005/011915
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Toshihiro Mitaka
Junko Kon
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Japan Science And Technology Agency
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/70—Polysaccharides
    • C12N2533/80—Hyaluronan

Definitions

  • the present invention relates to a method for separating proliferative hepatocytes derived from mammals including humans (small hepatocytes) and a method for selective culture.
  • the liver and hepatocytes have various functions that are called chemical factories in the body. For example, more than 90% of serum proteins are produced by hepatocytes and have a detoxification function that metabolizes harmful substances that are taken into the body or produced. For this reason, various research institutes have been conducting research to cultivate hepatocytes and to use them to detect harmful substances (biosensors) and to produce substances necessary for humans in vitro. In order to supply hepatocytes for use in these studies, there are currently cell lines that retain differentiated hepatocyte function, and therefore mature hepatocytes must be isolated for each experiment. Not. In such a case, the number of cells obtained depends on the number of individual individual hepatocytes.
  • hepatocytes can be engrafted on culture dishes and can retain about 70-80% of their functions as hepatocytes for a short period of time. Moreover, in these reports, thawed hepatocytes have almost no proliferative ability and die within a short period of time.
  • liver dysfunction due to various diseases such as hepatitis, cirrhosis, and liver cancer.
  • the artificial liver is not in a practical stage, so the fundamental treatment for such diseases must rely on liver transplantation.
  • the number of donors who donate organs will finally meet 10% of the required number. Therefore, a method for in vitro formation of liver tissue that can be used for liver transplantation.
  • a progenitor cell colony of liver tissue that can be used in the method and an in vitro preparation method thereof have been desired.
  • the present inventors showed a phenotype similar to that of mature hepatocytes in markers of albumin, transferrin, cytokeratin (CK) 8, CK18, etc. in liver tissue, and ultrastructurally. Although it has characteristics as a hepatocyte, it has been reported that there is a cell population with high proliferation ability and small cell force, and this was named ⁇ small hepatocyte '' (Mitaka T. et al., Hepatology, 16, 440—447's 1992), Mitaka T., Sato F, Mizuguchi T et al., Hepatology
  • the present inventors have reported a method for obtaining liver power from such a fraction rich in small hepatocytes (WO 01/92481), and can maintain the function and proliferation ability of hepatocytes.
  • a method for cryopreserving cells and a method for preparing small hepatocytes suitable for such a method have been reported (WO 01/92481) o
  • the present inventors have prepared a method for preparing transplantable liver tissue.
  • a marker protein specific for proliferating hepatocytes (small hepatocytes) derived from mammals including humans has not yet been clarified, so there is still room for improvement in efficient separation methods and culture methods. Has been.
  • the present invention provides an efficient method for separating proliferative hepatocytes derived from mammals including humans (small hepatocytes), and a culture method, particularly a selective culture method.
  • cells that have matured during the culture of small hepatocytes and have lost their ability to permanently proliferate as small hepatocytes (cells having at least a part of function as mature hepatocytes) and small hepatocytes are obtained.
  • Efficient separation and culturing method, ie selective culturing of small hepatocytes A feeding method is also provided.
  • Proliferative hepatocytes derived from animals including humans have had a clear specific marker protein, and it has been difficult to increase the efficiency of the separation method and culture.
  • the present inventors have found that small hepatocytes specifically express CD44, and that the ligand hyaluronic acid is extremely useful for the separation and culture of the cells.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is a method for culturing small hepatocytes, comprising culturing small hepatocytes in the presence of a carrier having hyaluronic acid attached to the surface and a carrier mainly composed of Z or hyaluronic acid. .
  • a method for culturing small hepatocytes comprising isolating cells that do not adhere to acid.
  • the present invention provides a method for culturing small hepatocytes comprising the following steps:
  • Steps i) to iii) are repeated for one or more cycles for the small hepatocytes obtained in step iii).
  • the present invention also provides a method for separating small hepatocytes comprising the following steps: i) in the presence of a carrier having hyaluronic acid attached to the surface and a carrier mainly composed of Z or hyaluronic acid. Culturing cells derived from a mammalian liver in step;
  • small hepatocytes are cells that are isolated from liver power using the method described below, or a method similar thereto, rather than just small cells derived from the liver. It has a strong proliferative ability, shows almost the same phenotype as that of mature hepatocytes for markers such as albumin, transferrin, cytokeratin (CK) 8 and CK18, and has ultrastructural characteristics as hepatocytes. It means a special kind of small cells derived from the liver. This cell was found by the inventors, and more specifically, Mitaka T. et al., Hepatology, 16, 440-447, 1992), Mitaka, T, Sato F, Mizuguchi T et al., Hepatology, 29, 111-135 (1999).
  • the fraction of cells whose liver power is also prepared can be cultured and separated as it is in the presence of hyaluronic acid according to the present invention, but a fraction rich in small hepatocytes was prepared by a simple method. Later, the method of the present invention can be applied to the fraction.
  • a fraction rich in small hepatocytes can be prepared, for example, as follows.
  • liver tissue collected from humans and other animals is treated with a solution containing collagenase
  • liver-derived cells can be obtained.
  • a normal collagenase liver perfusion method for example, a perfusion method according to the method of Seglen (Selgen, PO., Methods Cell Biol., 1976, 13, 29-83) can be used.
  • the obtained cell suspension may be passed through an appropriately sized mesh, if necessary, to remove undigested tissue residues and other tissue fragments.
  • Small hepatocytes can be directly separated from this cell suspension by the method of the present invention.
  • the method of the present invention can be applied by removing parenchymal cells and unnecessary tissue disruption as much as possible. I like it.
  • the removal of parenchymal cells can be performed by low speed centrifugation as follows.
  • the low-speed centrifugation refers to conditions sufficient to separate a fraction containing a large amount of parenchymal cells and unnecessary tissue fragments and a light fraction containing a large amount of non-parenchymal cells. Fractions mainly containing crushed tissue, etc., and small fractions containing many small hepatocytes and non-parenchymal cells. Sufficient conditions to separate the light fraction, which contains almost no vesicles. When liver-derived cells obtained by the above-described method under such conditions are fractionated, a larger number of small hepatocytes can be obtained in the aforementioned light fraction.
  • the percentage of parenchymal cells in the supernatant fraction decreases, but the percentage of small hepatocytes that precipitate also increases, so centrifugation is about 50 xg for about 1 minute.
  • the supernatant fraction can be further centrifuged, precipitated, and suspended to remove parenchymal cells and unwanted tissue debris. More specifically, for example, the supernatant fraction is centrifuged at 50 ⁇ g for 5 minutes, the precipitate is suspended in an appropriate medium, and further centrifuged at 50 ⁇ g for 5 minutes. Suspend the pellet in the same medium and centrifuge again at 50xg for 5 minutes.
  • the fraction containing a large amount of small hepatocytes prepared in this way is cultured and the fractional force containing a large amount of Z or small hepatocytes can be efficiently separated.
  • the fraction containing small hepatocytes prepared as described above preferably induces sufficient expression of cell surface receptors with hyaluronic acid as a ligand, and is preferably in the presence of hyaluronic acid for more than 3 days, particularly preferably for more than 5 days. It is preferable to isolate small hepatocytes after culturing. In the initial culture, the culture is preferably performed in a serum-free medium for 24 hours from the start of the culture in order to avoid non-specific cell adhesion.
  • CD44 which is a receptor for hyaluronic acid
  • CD44 is a receptor for hyaluronic acid
  • the present inventors have considered the possibility that it may take 2 to 3 days to activate small hepatocytes that were potentially present due to the injury of the preparation of the cell fraction from the liver.
  • the present inventors have also found that the expression of CD44 decreases with maturation of small hepatocytes.
  • the present inventors have confirmed that CD44-positive cells appear in liver tissues from several days after administration when rats are given strong liver damage by galactosamine or the like. Consistent with the considerations.
  • small hepatocytes can be separated by culturing in the presence of hyaluronic acid for a shorter period of time.
  • the fraction containing a large amount of small hepatocytes prepared as described above is cultured for a certain period in the absence of hyaluronic acid (pre-culture), and the small hepatocytes are proliferated before the method of the present invention. Therefore, culture and Z or small hepatocytes can be efficiently separated. Furthermore, there is a cell fraction obtained without performing the above-described enrichment procedure for small hepatocytes. Transferring mature hepatocytes already in culture to culture in the presence of hyaluronic acid, It can also be separated. These cell fractions naturally contain small hepatocytes. In addition, it is considered that small hepatocytes may appear during culturing of mature hepatocytes.
  • the medium and conditions for culturing normal human mature hepatocytes are described by the present inventors in WO 02/24875, and normal human mature hepatocytes cultured using such medium and conditions are further added.
  • the cells can be cultured and separated in the presence of hyaluronic acid.
  • the fraction (cell group) rich in small hepatocytes prepared as described above is generally used for serum, nicotinamide, vitamins, antibiotics, growth factors, and other cell cultures.
  • the medium for growing or maintaining small hepatocytes preferably contains nicotinamide, vitamin C, growth factor, DMSO and the like.
  • Vitamin C is usually added as ascorbic acid diphosphate, and its concentration is preferably 0.1 mM to 1.0 mM, more preferably 0.5 mM to 1.0 mM, and nicotinamide is used at a relatively high concentration, preferably Is used at 1 to 20 mM, more preferably 5 to 10 mM.
  • Growth factors include epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF),
  • HGF a can be used because it can be used as a growth factor a (TGF a)! /.
  • TGFa When TGFa is added, it is preferably used at a concentration of 1 ⁇ g / l to 100 g / l, more preferably 5 g / l to 50 g / 1.
  • DMSO is preferably added at a concentration of about 0.1 to about 2% (v / v), more preferably about 0.5% to about 1.5% (v / v) from the 4th day of the start of culture.
  • a culture vessel for preculture a hyaluronic acid-attached incubator described later may be used, or a culture dish used for normal cell culture may be used.
  • culture plates with collagen coating are used for culturing adherent cells.
  • culture plates of various sizes coated with collagen derived from pupa dermis and rat tail are commercially available.
  • Such a culture dish can be prepared if necessary, but it is preferable to use a culture dish without coating with collagen. This is because the fewer extracellular matrix, the easier the cells will peel off under milder conditions!
  • pre-cultured cells can be separated into individual cells in the presence of a metal chelator and Z or an enzyme.
  • the colony is peeled off from the culture vessel by an enzymatic method.
  • the metal chelating agents that can be used are those that are less cytotoxic and those commonly used for exfoliation treatment of adherent cells, such as EDTA, EGTA, and Z or their salts. Can be used in concentration.
  • a non-enzymatic cell detachment agent a solution in which EDTA, glycerol, sodium taenoate, etc. are added to Hanks' buffer solution (pH 7.3 to 7.5) that does not contain Ca or Mg can be used.
  • Non-enzymatic cell detachment agents prepared under the name Cell dissociation solution are commercially available.
  • a normal 5% carbon dioxide incubator can be used for the culture. The carbon dioxide gas concentration and the culture temperature are not essential as long as they are within the range allowed for normal cultured cells. More specifically, a cell suspension rich in small cells pre-cultured using the method and conditions described in WO 01/92481 can be obtained.
  • hyaluronic acid is attached (coated) to a carrier.
  • hyaluronic acid adhesion carrier small hepatocytes and cells derived from Z or mammalian liver are cultured.
  • Any carrier can be used as long as it can be coated with hyaluronic acid and is suitable for cell culture.
  • Suitable carriers include plastic or glass products (eg, culture dishes, culture flasks, culture bottles, plastic or glass beads), sepharose, eg, sepharose beads, porous (eg, sponge) coated with hyaluronic acid, metal, cellulose Is included.
  • a cell culture vessel it may be one that is generally used for animal cell culture, but a carrier to which cells are inherently difficult to adhere, such as an uncoated cell culture vessel and a bacterial culture vessel. A culture vessel is preferred.
  • a carrier that also has hyaluronic acid power or a carrier mainly composed of hyaluronic acid, for example, made of hyaluronic acid, or a porous material mainly composed of hyaluronic acid.
  • a carrier such as a sponge.
  • the culture vessel in that case is the same as that in the case of the culture in the presence of the hyaluronic acid coating carrier described above. Since the porous material is coated with hyaluronic acid and has a large surface area to which small hepatocytes can adhere, it is preferable as a carrier. This porous material can be coated with hyaluronic acid, so long as it does not contain substances that are harmful to cells, especially small hepatocytes.
  • Hyaluronic acid is commercially available.
  • Hyaluronic acid is generally classified into low molecular weight hyaluronic acid and high molecular weight hyaluronic acid with a molecular weight of about 1 million as a boundary.
  • Hyaluronic acid preferably a high amount of molecular weight hyaluronic acid in a suitable concentration, for example prepared solution of lml ⁇ 5ml the 10 / z ⁇ of the surface area of the carrier when contacted with a carrier / ⁇ 2 ⁇ 1000 / It is prepared as a solution in an appropriate medium or buffer so as to have an amount of ⁇ g / cm 2 , more preferably 50 g / « ⁇ 2 to 500 / ⁇ g / cm 2 . In general, it will be convenient to prepare the hyaluronic acid solution in a suitable medium or buffer as a stock solution with a concentration of the order of 10-20 mg / ml.
  • the buffer used can be any buffer as long as it is not harmful to the cells.
  • Hanks' solution general cell culture medium, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), etc.
  • the pH of the buffer may be in the range where hyaluronic acid dissolves, but 7.1 to 8.5 is generally preferred.
  • the temperature at which hyaluronic acid is dissolved should be the normal incubator set temperature, as long as it dissolves and does not decompose. For example, a temperature range of 30 ° C. to 40 ° C., particularly around 37 ° C. can be easily used.
  • the thus prepared hyaluronic acid solution is diluted as it is or optionally with an appropriate buffer or medium, and is allowed to coexist with the above-mentioned carrier, and the hyaluronic acid is coated on the carrier.
  • a relatively water-repellent carrier there is a possibility that the amount of the hyaluronic acid solution for coating is small and the surface of the carrier cannot be sufficiently coated, so dilute the hyaluronic acid solution. It would be particularly useful to increase the volume.
  • hyaluronic acid solution is preferably 10 g to 1000 g, more preferably 50 g to 500 g per lcm 2 of the carrier surface.
  • the coating can be performed by diluting hyaluronic acid prepared to 10 mg / ml to 1 mg / ml with PBS or the like and pouring the diluted 1 ml into the dish.
  • the incubation temperature and time should be sufficient for the hyaluronic acid to be coated on the support.
  • the incubation time for the coating can be longer than 24 hours, but the advantage of incubation for a long time is poor.
  • the hyaluronic acid solution is removed, and the surface of the carrier is washed with a buffer that is not harmful to cells, such as PBS.
  • the carrier can be sterilized by UV irradiation.
  • the carrier itself is a culture vessel, add a medium suitable for culturing small hepatocytes as described below. If the carrier is a bead, sponge, etc., transfer it to a suitable culture vessel, then Medium can be added. A cell suspension considered to contain small hepatocytes can be added to the culture vessel prepared in this way.
  • the initial cell density at this time is preferably 1 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the culture is performed using a basic medium further containing serum, nicotinamide, vitamin C, antibiotics, growth factors, and other additives commonly used in cell culture, such as these. It can be cultured in an added Dulbecco's modified Eagle medium at 37 ° C in the presence of a hyaluronic acid-adhering carrier as described above.
  • the hyaluronic acid-attached carrier is a culture dish coated with hyaluronic acid or a culture flask coated with hyaluronic acid.
  • the hyaluronic acid attachment carrier is hyaluronan.
  • the hyaluronic acid adherent carrier is a carrier made of hyaluronic acid or a carrier based on hyaluronic acid.
  • porous (sponge) is preferred as a carrier made of hyaluronic acid or a carrier mainly composed of hyaluronic acid.
  • the medium preferably further contains nicotinamide, vitamin C, growth factors, DMSO, etc.
  • Vitamin C is usually added as ascorbic acid diphosphate, and its concentration is preferably 0.1 mM to 1.0 mM, more preferably 0.5 mM to 1.0 mM, and nicotinamide is used at a relatively high concentration. Preferably, it is used at 1 to 20 mM, more preferably 5 mM to 10 mM.
  • growth factors epidermal growth factor (EGF), hepatocyte growth factor (HGF), transforming growth factor (X (TGFa)), etc. can be used, and TGFa is particularly preferred.
  • DMSO When added, it is preferably used at a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ 100 g / l, more preferably 5 g / ⁇ 50 g / 1 Small size prepared from mammalian liver rather than subcultured cells
  • DMSO also preferably has a force on the 4th day of culture, preferably about 0.1 to about 2% (v / v), more preferably about 0.5% to about 1.5%. It is preferable to use the above serum-free medium for the first 24 hours, and then replace it with the serum-added medium for the first 24 hours.
  • nonspecific adhesion such as sinusoidal endothelial cells can be reduced, and vitronectin contained in serum is also reduced.
  • such initial serum-free culture is not preferred.
  • a carbon dioxide incubator For culture, it is preferable to use a carbon dioxide incubator and basically perform medium exchange at a rate of about once every two days (three times a week).
  • DMS0 Dimethyl sulfoxide
  • the culture period is at least 2 days or more, preferably about 3 days or more, more preferably, in order to ensure sufficient adhesion to hyaluronic acid when individual cells that have not been previously damaged by liver are prepared.
  • Small hepatocytes can be isolated by culturing for a shorter period of time.
  • D-galatatosamine (Across) should be injected intraperitoneally at a concentration of 10 ⁇ ⁇ to 100 ⁇ ⁇ / 200 / ⁇ 1 PBS / 100g body weight in adult rats (8-10 weeks old). Then, cells can be isolated from the liver on the 3rd to 6th day after injection according to the method of Seglen.
  • the carrier with hyaluronic acid attached is a relatively large carrier such as a culture dish, culture flask or sponge, rinse the carrier surface with an appropriate buffer or medium, such as PBS or the medium for small hepatocyte culture described above. By doing so, cells that do not adhere to hyaluronic acid can be easily removed.
  • the carrier is a relatively small carrier such as a bead, fix it by centrifugation, or magnetically if it is a magnetic bead, and then remove the medium and, if necessary, wash with an appropriate buffer or medium if necessary. With acid The attached cells can be easily recovered, or the cells that do not adhere to hyaluronic acid can be easily removed. Thereafter, a fresh medium can be added to continue the culture in the presence or absence of hyaluronic acid, or can be subjected to a treatment for releasing small hepatocytes from the carrier as described later.
  • the medium is removed, and the carrier is washed with an appropriate buffer such as a medium or PBS as necessary, and then adhered to hyaluronic acid by allowing hyaluronan-dase to act.
  • an appropriate buffer such as a medium or PBS as necessary, and then adhered to hyaluronic acid by allowing hyaluronan-dase to act.
  • Small hepatocytes can be dissociated by carrier force.
  • Hyaluronidase is commercially available and can be prepared and used in a suitable buffer.
  • An appropriate buffer to be used is one that can dissolve hyaluronan-dase and does not significantly inhibit hyaluronidase activity.
  • Hank's solution general cell culture medium, physiological saline, phosphorus Acid buffered saline (PBS) can be used.
  • the concentration of hyaluronan-dase is not particularly limited, but it can be prepared, for example, at a concentration of 0.1 to 20 mg / ml, preferably 1 to 10 mg / ml.
  • the thus prepared hyaluronan-dase is allowed to act on the carrier hyaluronic acid cell complex.
  • the amount of hyaluronic acid to act is not particularly limited, and the incubation time can be adjusted according to the amount used. However, generally about 5 ⁇ g to 1000 ⁇ g, more preferably about 50 ⁇ g to 500 ⁇ g of hyaluronan nidase per l cm 2 of the carrier surface can be used.
  • the plate is washed with PBS, and 1 ml of ImM EDTA / PBS is added and incubated at room temperature for 1 minute. After removing ImM EDTA / PBS, cover the hyaluro-dase solution at the same concentration as the culture temperature, for example, 37 ° C, and incubate for an appropriate period of time in a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C. .
  • a 5% carbon dioxide incubator at 37 ° C.
  • the incubation time is typically from about 30 minutes to about 2 hours when using a hyaluronic acid coated carrier, such as a hyaluronic acid coated culture dish or culture flask.
  • a hyaluronic acid coated carrier such as a hyaluronic acid coated culture dish or culture flask.
  • a carrier made of hyaluronic acid or a carrier containing hyaluronic acid as a main component such as hyaluronic acid sponge
  • the whole of the carrier or the component hyaluronic acid is incubated until it is sufficiently dissolved.
  • cell release While observing the conditions, the incubation temperature and time can be adjusted optimally. Thereafter, an appropriate amount of the ice-cold culture solution is added and lightly pipetted, then collected in a tube and centrifuged at 50 ⁇ g for 5 minutes to collect small hepatocytes.
  • hyaluronidase treatment may not allow small hepatocytes to sufficiently migrate.
  • a commercially available cell dissociation solution such as a Cell dissociation solution available from Sigma can be used.
  • a commercially available cell dissociation solution such as a Cell dissociation solution available from Sigma can be used.
  • a cell dissociation solution available from Sigma can be used.
  • PBS an appropriate buffer
  • ImM EDTA / PBS After removing ImM EDTA / PBS, add an appropriate amount of Cell dissociation solution that has been pre-warmed to the same culture temperature, for example, 37 ° C, and incubate in a 5% carbon dioxide incubator for about 5-15 minutes.
  • the incubation temperature and time can be adjusted optimally while observing the free state of the cells.
  • the cell dissociation solution treatment as described above may be performed alone or in combination with the hyaluronan-dase treatment.
  • small hepatocytes dissociated from the carrier can be collected by an appropriate method. For example, after incubation, add an appropriate amount of an appropriate buffer or medium that is not harmful to cells such as PBS to the culture container, prepare a cell suspension of released small hepatocytes, and repeat centrifugation and resuspension as necessary. Carrier Small hepatocytes released from hyaluronic acid can be washed and recovered. Centrifugation is preferably performed at a relatively low speed for a short time, for example, 50 X g for about 5 minutes so as not to cause excessive damage to the small hepatocytes.
  • the carrier is a small carrier such as a bead
  • the suspension is further reduced by low-speed and Z or short-time centrifugation, or by simply standing for a few seconds to several minutes, preferably 1 minute or less.
  • Carrier Hyaluronic acid can be separated.
  • the small hepatocytes thus obtained are further selectively cultured in the presence of a carrier having hyaluronic acid attached to the surface and a carrier mainly composed of Z or hyaluronic acid, and the above-described operation is repeated. I can do it.
  • the small hepatocytes separated and Z or cultured in this way have a part of the function as hepatocytes.
  • Such ma
  • albumin secreted into the medium transferrin, urea production, glycogen content, amino acid metabolizing enzymes, cytochrome P450 and the like can be used.
  • These can be confirmed by ELISA, Western blot analysis, RT-PCR, etc. of medium or cell extract, or by directly immunostaining cells.
  • Small hepatocytes have the best of mature liver cell markers such as albumin, CK8, CK18, glycogen, peroxisome, etc., while they have markers of biliary epithelial cells such as CK7 and CK19.
  • oval cells known as a kind of hepatic stem cells, can be distinguished from small hepatocytes in that they have markers for biliary epithelial cells such as CK7 and CK19, and do not have mature hepatocyte markers such as glycogen and peroxisomes.
  • EDl / 2 Kerat cell marker
  • SE-1 sinusoidal endothelial cell marker
  • desmin Ito cell marker
  • vimentin liver epithelial cell marker
  • the small hepatocytes thus efficiently separated and maintained in culture are cultured in the same manner as in the case of culturing a fraction containing a large amount of small hepatocytes obtained from the liver, using the medium and the culture vessel described above. can do.
  • the culture vessel with hyaluronic acid as described above may be used as the culture vessel, or a culture dish used for normal cell culture may be used.
  • Collagen-coated culture vessels that are generally used for culturing adherent cells can be used, but small-sized hepatocytes that are suitable for preparing cryopreserved colonies or liver tissue formation can be used. If it is intended to detach hepatocytes from the culture vessel, it is preferable to use a culture dish that does not cover collagen. This is because the smaller the extracellular matrix, the sooner the cells peel off under milder conditions, and the smaller hepatocytes tend to peel off the container force preferentially when not covered with collagen. A normal 5% carbon dioxide incubator can be used for the culture. Carbon dioxide concentration and culture temperature are not essential as long as they are acceptable for normal cultured cells.
  • the small hepatocytes thus efficiently separated and maintained in culture can also be cryopreserved according to the method described in WO 01/9 2481, or according to the method described in WO 02/088332. It can also be used to mature into liver tissue, and to estimate drug function using mature liver tissue. [0032] It should be noted that the content disclosed in the present specification is incorporated herein by reference in its entirety.
  • livers of adult rats (10 to 15 weeks old) were perfused with the strength of 0.2 mM EGTA and the portal force with Hank's solution not containing magnesium. After flowing for about 4 minutes at a flow rate of 40 ml / min, Hank's solution containing 0.02% collagenase (Yakult) was flowed for 10 minutes at a flow rate of 20 ml / min.
  • the digested liver force was also shaken off in the beaker according to the standard method.
  • the cell suspension was filtered through a filter with holes of 250 and 70 micrometers and centrifuged at 50 xg for 1 minute. The supernatant was collected and centrifuged again at 50xg for 1 minute twice.
  • the supernatant was collected and centrifuged at 50 ⁇ g for 5 minutes.
  • the precipitated cells were washed with culture medium (Leivobitz L-15 + 10% ⁇ shea womb ⁇ Kiyoshi + 10- 7 M dexamethasone +0.5 mg / 1 Insulin + antibiotics) and centrifuged again for 5 minutes at 50 ⁇ g. After repeating the same operation, this time, centrifugation was performed at 150 ⁇ g for 5 minutes. After repeating the same operation, it was centrifuged again at 50xg for 5 minutes. The precipitated cells were suspended in a new culture solution, and the number of viable cells was counted and adjusted to 1.0 ⁇ 10 4 to 5.0 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the CD44 expression pattern of the cells prepared in Example 1 was examined.
  • GPDH glycol 3-phosphate dehydrogenase
  • DMS0 Dimethyl sulfoxide
  • Cells were lysed using ISOGEN according to the manufacturer's recommended protocol, mixed with Korokuholm and mixed well, and then centrifuged at 10000 X g for 15 minutes at 4 ° C. The upper layer was taken out, and isopropanol was added thereto. After centrifugation at 10,000 ⁇ g for 15 minutes at 4 ° C., the obtained precipitate was washed with 70% ethanol and dissolved in DEPC-water.
  • RNA extraction from mature hepatocytes was performed in the same manner from cells immediately after perfusion.
  • RT-PCR was performed using 10 ng of the obtained total RNA.
  • the PCR product was electrophoresed, each band obtained was read with a densitometer, and the intensity of the CD44 band was divided by the intensity of the GPDH band to calculate the relative intensity.
  • the primers used are as follows:
  • RNA extraction from mature hepatocytes was performed in the same manner from cells immediately after perfusion.
  • RT-PCR was performed in the same manner as in 1) to examine the relative expression level of CD44.
  • the number of PCR cycles was 35.
  • the PCR product was electrophoresed, each band obtained was read with a densitometer, and the CD44 band intensity was divided by the GPDH band intensity to compare the CD44 expression in small and mature hepatocytes as a relative intensity ( Figure 2).
  • CD44 is specific to small hepatocytes, and CD44 expression is induced by the injury of the preparation of the cell fraction from the liver. This suggests the possibility that small hepatocytes or their progenitor cells, which were potentially present in the region, have come to express their original properties as small hepatocytes.
  • hyaluronic acid stock solution in PBS to a concentration of lOmgZml and keep it at 37 ° C. I had it.
  • the hyaluronic acid used was purchased from Sigma (Sigma Hyaluronic acid (Human umbilical cords), catalog number H-1504).
  • PBS was added to an appropriate amount of the obtained hyaluronic acid stock solution, and a dilute hyaluronic acid solution was prepared so that 1 to 10 mg of hyaluronic acid was contained in 3 ml of the total volume.
  • the obtained hyaluronic acid solutions having various concentrations were placed on a 60 mm untreated dish (Kord-Valmark Co.). This dish was incubated at 37 ° C and used after washing with PBS.
  • the dish was seeded with a cell fraction rich in small hepatocytes prepared in 1).
  • the medium shown below was used for the first 24 hours, and then the medium was replaced with the above medium supplemented with 10% FBS (Hyclone Laboratories, ⁇ .
  • the culture was basically carried out using a carbon dioxide incubator for two days. The medium was changed once (three times a week).
  • the medium composition is as follows:
  • DMS0 Dimethyl sulfoxide
  • Hyaluronic acid lmg, 5mg, and 10mg were used to coat a 60mm culture dish, and the proliferation of small hepatocytes on the hyaluronic acid-coated culture dish was observed under a microscope on days 7, 14, and 21. The results are shown in FIG.
  • the small hepatocytes in the culture on the non-adherent cell culture dish (negative control), the small hepatocytes hardly form colonies and can be cultured on the culture dish for positive cell culture (positive control).
  • the hyaluronic acid-coated culture dish had a large area of small hepatocytes.
  • small hepatocytes differentiate instead of proliferating, that is, mature, and the area increase rate of small hepatocyte colonies decreases, but compared with the case where hyaluronic acid is not applied. It is shown that the area is still large at least until the 21st day. Microscopic observation also shows no change in the morphology of the growing small hepatocytes. It wasn't.
  • hyaluronan-dase (Sigma Chemical Co.). Culture dish force After the culture solution was wiped, the plate was washed with PBS, and ImM EDT A / PBS was added in an amount of 1 ml and incubated at room temperature for 1 minute. After removing ImM EDTA / PBS, add 1 ml of hyaluro-dase (5 mg / m or 10 mg / ml) pre-warmed to 37 ° C and incubate for 2 hours in a 37 ° C 5% carbonate gas incubator . Thereafter, 1 ml of ice-cooled culture solution was added and lightly pipetted, then collected in a tube and centrifuged at 50 ⁇ g for 5 minutes to collect small hepatocytes.
  • hyaluronan-dase Sigma Chemical Co.
  • the cells attached to the culture dish were treated using Cell dissociation solution (Sigma Chemical Co.) according to the protocol recommended by the manufacturer.
  • the obtained cells were morphologically equivalent to small hepatocytes and were CD44 positive.
  • the cells were able to grow and form colonies. Cells that formed colonies secreted albumin, and further analyzed by immunostaining.
  • non-parenchymal cell markers [ED1 / 2 (Kupffer cell marker), SE-1 (sinusoidal endothelial cell marker), desmin (Desmin (Ito cell marker), vimentin (liver epithelial cell marker)] were all negative. Therefore, it was confirmed that the obtained cells were small hepatocytes.
  • Example 5 Preparation of mature hepatocytes
  • the liver of an adult rat was perfused with a solution containing collagenase, and the resulting cell suspension was centrifuged at 50 ⁇ g for 1 minute at 4 ° C. to collect the precipitate.
  • the precipitate was suspended in Nontas buffer, centrifuged at 50 xg for 1 minute at 4 ° C, and this operation was repeated three times.
  • the obtained cells were suspended in 25 ml of Hanks buffer, added to 21.6 ml Percoll (Amersham), 2.4 ml of 10x Nontas buffer and mixed by inversion. The supernatant was removed by centrifugation at 50 xg for 15 minutes at 4 ° C. Cells were suspended in PBS, centrifuged at 50xg, lmin, 4 ° C, and the precipitate was collected to obtain mature hepatocytes.
  • Example 6 Comparison of culture of small hepatocytes and mature hepatocytes in the presence of hyaluronic acid Dish coated with small hepatocytes and mature hepatocytes prepared by the methods of Examples 1 and 4 by the method of Example 3 Sowing. The culture method was the same as in Example 3.
  • the media shown below were used for the first 24 hours, and then replaced with media supplemented with 10% FBS (Hyclone laboratories, Inc.). Cultivation was performed using a carbon dioxide incubator, and the medium was changed three times a week.
  • DMS0 Dimethyl sulfoxide
  • small hepatocytes can be efficiently separated from the livers of mammals including humans.
  • small hepatocytes can be selectively cultured.
  • small hepatocytes and mature hepatocytes are cultured in a culture dish coated with hyaluronic acid
  • mature hepatocytes rarely grow on the seventh day of culture, whereas small hepatocytes become 1 on the seventh day. Since the number of cells can reach about 7 times or more on the day, small hepatocytes can be selectively cultured and separated from the mature hepatocytes according to the present invention.
  • FIG. 1 shows the results of RT-PCR analysis of the expression of CD44 mRNA level at each time point after preparation and culture start.
  • the vertical axis represents relative intensity, and the horizontal axis represents the number of culture days.
  • FIG. 2 shows the results of RT-PCR comparison of CD44 mRNA expression in small hepatocytes and mature hepatocytes.
  • SH small hepatocytes
  • MH mature hepatocytes.
  • the vertical axis shows the relative strength.
  • Fig. 3 shows the results of comparison of the expression of CD44 mRNA levels in small hepatocytes and mature hepatocytes using a Northern plot.
  • SH small hepatocytes
  • MH mature hepatocytes.
  • the vertical axis shows the relative intensity. Upper represents the larger RNA of the detected mRNA, and Lower represents the smaller! /, RNA.
  • FIG. 4 shows the results of examining the CD44 expression in small hepatocytes induced to mature by Matrigel by Northern blot.
  • SH small hepatocytes
  • MH mature hepatocytes.
  • Vertical axis Indicates relative intensity.
  • FIG. 5 shows the time course of the growth of small hepatocyte colonies in culture dishes coated with various amounts of hyaluronic acid.
  • the vertical axis is the area xlO- 3 in mm 2 units.
  • Positive control culture dish for adherent cells
  • negative control culture dish for non-adherent cells
  • collagen collagen-coated culture dish
  • lmg HA, 5 mg HA, lOmg HA treated with lmg, 5 mg, lOmg hyaluronic acid respectively Culture dish.
  • FIG. 6 is a phase contrast micrograph of mature hepatocytes and small hepatocytes on a hyaluronic acid-coated culture dish.
  • A mature hepatocyte culture day 1
  • B mature hepatocyte culture day 7
  • C small hepatocyte culture day 1
  • D small hepatocyte culture day 7.
  • Mature hepatocytes on 60mm culture dishes coated with hyaluronic acid (MH) and small hepatocytes (SH) and sowing at a concentration of 3xl0 5 cells were cultured. The cell growth status on day 1 and day 7 is shown. Small hepatocytes proliferated in the same manner, whereas mature hepatocytes rounded off and almost all living cells disappeared on day 7.
  • the line in the figure indicates 200 micrometers.
  • FIG. 7 is a graph showing the growth of mature hepatocytes and small hepatocytes on hyaluronic acid-coated culture dishes. The number of engrafted cells was counted, the number of cells on day 1 was taken as 1, and the number of cells on day 7 was shown relatively.

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Abstract

　表面にヒアルロン酸を付着させた担体および／またはヒアルロン酸を主成分とする担体の共存下で小型肝細胞を培養することを含む、小型肝細胞の培養方法が提供される。また、本発明は表面にヒアルロン酸を付着させた担体および／またはヒアルロン酸を主成分とする担体の共存下で小型肝細胞を培養すること、および、ヒアルロン酸に付着する細胞とヒアルロン酸に付着しない細胞を分離すること、を含む、小型肝細胞の培養方法も提供される。

Description

明 細 書
ヒアルロン酸を用いた小型肝細胞の選択的培養法および分離法 技術分野
[0001] 本発明は、ヒトを含む哺乳動物由来増殖性肝細胞 (小型肝細胞)の分離方法およ び選択的培養用法に関する。
[0002] (背景技術）
肝臓および肝細胞は体内における化学工場と言われるほど多様な機能を持ってい る。例えば、血清タンパク質の 90%以上は肝細胞が産生しており、体内に取り込まれ たり産生された有害物質を代謝する解毒機能を有している。そのため、肝細胞を培 養し、その持っている機能を使って有害物質の検出（バイオセンサー）、ヒトに必要な 物質の体外生産を可能にしょうと様々な研究機関で研究がなされている。それらの 研究に用いる肝細胞を供給するためには、現在のところ分化した肝細胞機能を保持 して 、る細胞株は存在して 、な 、ため、実験毎に成熟肝細胞を単離しなければなら ない。このような場合には、得られる細胞数は個々の個体の肝細胞数に依存する。な ぜなら、肝細胞の機能を維持したまま、成熟細胞を増殖させる方法が十分に確立し ているわけではないからである。従って、成熟肝細胞機能の多くを有する細胞の恒常 的な大量供給が望まれている。ヒトを含めて動物の肝細胞を冷凍し、長期保存し、再 び使用する方法の開発は非常に重要な課題であって、世界中でなされている力 こ れまでに冷凍保存後、解凍した肝細胞が培養皿上に生着し、肝細胞としての機能の 70〜80%程度を短期間保持できることが報告されているのみである。しかも、これら の報告においては、解凍された肝細胞はほとんど増殖能を有せず、短期間に死滅し ている。
[0003] また、ヒトは種々の疾患により、例えば、肝炎、肝硬変、肝癌などにより肝機能不全 状態になる。現在のところ人工肝臓は実用段階にあるとは言えないため、このような 疾患の根本的な治療は肝臓移植に頼らざるを得ないのが現状である。しかも、我が 国を初め世界各国において、肝臓移植を必要としている患者は多数存在するにもか かわらず、臓器を提供するドナーの数は必要数の 1割を満たすのがやっとである。従 つて、肝臓移植に使用できるような肝組織を in vitroで形成させる方法、そのような方 法に使用できる肝組織の前駆細胞コロニーおよびその in vitro調製方法が望まれて きた。
[0004] 一方、本発明者らは、肝臓組織内に、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン (C K)8、 CK18などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微構 造的にも肝細胞としての特徴を有するが、増殖能の高 、小型の細胞力 なる細胞集 団があることを報告し、これを「小型肝細胞」 (small hepatocyte)と命名した (Mitaka T. ら、 Hepatology, 16, 440— 447ズ 1992)、 Mitaka T., Sato F, Mizuguchi Tら、 Hepatology
29, 111-135 (1999))。
さらに、本発明者らは、そのような小型肝細胞に富む画分を肝臓力 得る方法を報 告しており（WO 01/92481)、肝細胞の機能および増殖能を保持し得る、小型肝細胞 の凍結保存方法、および、そのような方法に適した小型肝細胞の調製方法を報告し てきた (WO 01/92481) oさらに、本発明者らは移植可能な肝組織を調製するために 適した小型肝細胞コロニー、その調製方法、その小型肝細胞コロニー力 肝組織を 誘導する方法を報告し (WO 02/088332)、薬物の作用、特に正常な肝機能と関連し た作用を in vitroで推定する方法も報告してきた (WO 02/088332)。しかしながら、ヒト を含む哺乳動物由来の増殖性肝細胞 (小型肝細胞）に特異的なマーカータンパク質 は必ずしも明らかにされておらず、そのため効率のよい分離方法および培養法には なお改善の余地が残されて 、た。
その他、小型肝細胞および増殖能を有する肝実質細胞に関する報告もいくつかな されている（特許第 3211941号、特開 2002-078481、特開平 09-313172、特開平 08-11 2092) oまた、特開 2002-045087にはヒトを含む異種動物由来の肝細胞からなる肝臓 を有するキメラ動物と、このキメラ動物を用いた試験方法が報告されている。
[0005] (発明の開示）
本発明によりヒトを含む哺乳動物由来増殖性肝細胞 (小型肝細胞)の効率的な分 離方法および、培養方法、特に選択的培養方法が提供される。
また、本発明により、小型肝細胞の培養中に成熟化して小型肝細胞としての永続 的増殖能を失った細胞 (成熟肝細胞としての機能を少なくとも一部有する細胞）と小 型肝細胞とを効率的に分離して培養する方法、すなわち、小型肝細胞の選択的培 養方法も提供される。
[0006] ヒトを含む動物由来の増殖性肝細胞 (小型肝細胞）は特異的マーカータンパク質が 明らかでな力つたこともあり、分離方法および培養の効率を増大させることが困難で あった。本発明者らは小型肝細胞が CD44を特異的に発現していること、および、そ のリガンドであるヒアルロン酸が該細胞の分離 '培養に極めて有用であることを見出し
、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアル ロン酸を主成分とする担体の共存下で小型肝細胞を培養することを含む、小型肝細 胞の培養方法である。
さらに、本発明により、表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアル ロン酸を主成分とする担体の共存下で小型肝細胞を培養すること、および、ヒアルロ ン酸に付着する細胞とヒアルロン酸に付着しない細胞を分離すること、を含む、小型 肝細胞の培養方法が提供される。
[0007] 本発明により以下の工程を含む、小型肝細胞の培養方法が提供される：
i)表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアルロン酸を主成分とする 担体の共存下で小型肝細胞を培養する工程；
ii) i)で得られる培養物にぉ ヽてヒアルロン酸に付着する細胞とヒアルロン酸に付着し ない細胞を分離する工程；
iii)工程 ii)で得られるヒアルロン酸に付着する小型肝細胞を前記ヒアルロン酸力 解 離させる工程;および、
iv)工程 iii)で得られた小型肝細胞について、工程 i)〜iii)を 1サイクル以上繰り返すェ 程。
[0008] また、本発明により以下の工程を含む、小型肝細胞の分離方法も提供される： i)表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアルロン酸を主成分とする 担体の共存下で哺乳動物肝臓由来の細胞を培養する工程；
ii) i)で得られる培養物にぉ ヽてヒアルロン酸に付着する細胞とヒアルロン酸に付着し ない細胞を分離する工程；
iii)ヒアルロン酸に付着する細胞を前記ヒアルロン酸力 解離させる工程； iv)工程 i)〜iii)を 1サイクル以上繰り返す工程;および
V)前記ヒアルロン酸力 解離させた細胞を回収する工程。
[0009] (発明を実施するための最良の形態）
本発明により小型肝細胞の効率的な分離方法および培養方法が提供される。本明 細書において、「小型肝細胞」とは、単に肝臓に由来する小型の細胞を意味するもの ではなぐ以下に記載する方法、あるいはこれに準じた方法を用いて肝臓力 単離さ れる細胞であって、強い増殖能を有し、アルブミン、トランスフェリン、サイトケラチン (C K) 8、 CK18などのマーカーについて成熟肝細胞とほぼ同様の表現型を示し、超微 構造的にも肝細胞としての特徴を有する、肝臓由来の特別な種類の小型の細胞を意 味する。この細胞は発明者らによって見出されたものであり、より詳しくは Mitaka T.ら 、 Hepatology, 16, 440— 447ズ 1992)、 Mitaka, T, Sato F, Mizuguchi Tら、 Hepatology, 2 9, 111-135 (1999)に記載されている。
[0010] 本発明にお 、て、肝臓力も調製した細胞画分をそのまま本発明によりヒアルロン酸 共存下で培養および分離することもできるが、簡便な方法により小型肝細胞に富む 画分を調製した後、その画分に本発明の方法を適用することもできる。
小型肝細胞に富む画分は、例えば以下のように調製することができる。ヒトその他の 動物から採取した肝臓組織をコラゲナーゼ等を含む溶液で処理すると肝臓由来の細 胞を得ることができる。この場合、通常のコラゲナーゼ肝灌流法、たとえば、 Seglenの 方法（Selgen, PO., Methods Cell Biol., 1976, 13, 29-83)に準じた灌流法を利用する ことができる。得られた細胞懸濁液は必要に応じて適当な大きさのメッシュ等を通し、 未消化の組織残渣その他の組織破砕片等を除去してもよ ヽ。この細胞懸濁液から本 発明の方法によって直接小型肝細胞を分離することもできるが、実質細胞および不 要な組織破砕物等を可能な限り除去して力 本発明の方法を適用することが好まし い。
実質細胞の除去は、以下のように低速遠心によって行うことができる。低速遠心とは 、実質細胞および不要な組織破砕物等を多く含む画分と、非実質細胞を多く含む軽 画分とを分離するために十分な条件をいい、好ましくは、実質細胞および不要な組 織破砕物等を主として含む画分と、小型肝細胞および非実質細胞を多く含み実質細 胞をほとんど含まな 、軽画分とを分離するために十分な条件を 、う。このような条件 で上述したような方法で得られる肝臓由来の細胞を分画すると、小型肝細胞は前述 の軽画分により多く得られる。より具体的には、例えば、この細胞懸濁液を低速遠心 、例えば 50xgで 1分間遠心することにより、主として実質細胞を含む重い画分と、星 細胞、クッパー細胞、類洞内皮細胞等の非実質細胞を主として含む比較的軽い細胞 を含む軽い上清画分とに分画することができる。小型肝細胞はこの遠心条件下で上 清画分に多く得られる。
[0011] 加速度が大きくなるほど、また、遠心時間が長くなるほど上清画分中の実質細胞の 割合は減るが、沈殿する小型肝細胞の割合も増加するため、遠心は約 50xgにて約 1 分間以下とするのが好ましい。上清画分は更に遠心、沈殿、懸濁を繰り返して実質 細胞および不要な組織破砕物等を除去することもできる。より具体的には、例えば、 上清画分を、 50xgで 5分間遠心し、沈殿を適当な培地に懸濁し、更に 50xgで 5分間 遠心する。沈殿を同様な培地に懸濁し、再び 50xgで 5分間遠心する。得られた沈殿 を同様な培地に懸濁し、 150xgで 5分間遠心して、沈殿した細胞を新鮮な培地に懸 濁する。細胞懸濁液中の細胞数を数え、その後の培養、あるいは処理のために必要 な細胞密度となるように調製することができる。通常、 1χ104〜5χ105細胞/ mlの密度 に調製される。
[0012] このようにして調製した、小型肝細胞を多く含む画分を本発明の方法によって培養 および Zまたは小型肝細胞を多く含む画分力 効率的に小型肝細胞を分離すること ができる。上述のように調製した小型肝細胞を含む画分は、ヒアルロン酸をリガンドと する細胞表面レセプターの充分な発現を誘導するため、好ましくは 3日間以上、特に 好ましくは 5日間以上ヒアルロン酸共存下で培養を行った後、小型肝細胞を分離する のが好ましい。初期培養の際、培養開始 24時間は細胞の非特異的接着を避けるた め無血清培地で培養することが好ましい。 RT-PCRによって調べたところ、ヒアルロン 酸のレセプターである CD44の発現が初代培養第 2〜3日目くらいから顕著であり、培 養開始 3〜5日後にはほぼ最大に達する傾向にあることが明らかになった。一方、成 熟肝細胞には CD44が発現していないことが知られている（Terpe H-J, Stark H, Preh m P, Guenthert U., Histochemistry, 101, 79—89 (1994); Goodison S, Urquidi V, Tari n D. , J. Clin. Pathol: Mol Pathol, 52, 189—196 (1999))。
本発明者らは、肝臓からの細胞画分の調製という傷害により潜在的に存在していた 小型肝細胞が活性ィ匕するのに 2日〜 3日ほど力かる可能性を考慮している。また、本 発明者らは、小型肝細胞の成熟化に伴って CD44の発現が低下することも見出した。 さらに、本発明者らは、ラットにおいて、ガラクトサミンなどにより強い肝障害を与えた 場合には、投与数日後より、肝臓組織において CD44陽性細胞が出現することを確認 しており、このことは前述の考察と一致する。また、このように予め強い肝障害を与え た個体の肝臓から細胞画分を調製した場合は、より短期間のヒアルロン酸共存下の 培養により小型肝細胞の分離が可能である。
[0013] あるいは、上述のように調製した小型肝細胞を多く含む画分をヒアルロン酸非共存 下で一定期間培養して (前培養)小型肝細胞を増殖させてから、本発明の方法によ つて培養および Zまたは小型肝細胞を効率的に分離することもできる。さらに、上述 のような小型肝細胞の濃縮操作を行なわずに得られる細胞画分、ある!、は既に培養 中の成熟肝細胞をヒアルロン酸共存下の培養に移して小型肝細胞を培養および Z 分離することもできる。これらの細胞画分は当然に小型肝細胞を含んでいる。また、 成熟肝細胞を培養中に小型肝細胞が出現し得ると考えられる。正常ヒト成熟肝細胞 を培養するための培地および条件は本発明者らにより WO 02/24875に記載されてお り、そのような培地および条件を使用して培養された正常ヒト成熟肝細胞を更に本発 明によりヒアルロン酸共存下で培養し、かつ分離することもできる。
[0014] 前培養する場合は、上述したように調製した小型肝細胞を多く含む画分 (細胞群） を血清、ニコチンアミド、ビタミン 、抗生物質、増殖因子、その他の細胞培養に一般 的に使用される添加物を更に含む基本培地、例えば、これらを添加したダルベッコ 改変イーグル培地等で 37°Cにて培養することができる。小型肝細胞を増殖させるある いは維持するための培地は、ニコチンアミド、ビタミン C、増殖因子、 DMSO等を含む ことが好ましい。ビタミン Cは通常、ァスコルビン酸 2リン酸として添加し、その濃度は、 好ましくは 0.1mM〜1.0mM、より好ましくは、 0.5mM〜1.0mMであり、ニコチンアミドは 比較的高濃度で使用され、好ましくは l〜20mM、より好ましくは 5mM〜10mMで使用 する。増殖因子としては、上皮細胞増殖因子 (EGF)、肝細胞増殖因子 (HGF)、トラン スフォーミング増殖因子 a (TGF a )等が利用でき、 TGF aが特に好まし！/、。 TGF aを 添加する場合には、好ましくは 1 μ g/l〜100 g/l、より好ましくは 5 g/l〜50 g/1の 濃度で使用する。また、初代培養においては DMSOは培養開始 4日目から好ましくは 約 0.1〜約 2%(v/v)、より好ましくは約 0.5%〜約 1.5%(v/v)の濃度で添加する。
[0015] 前培養のための培養容器としては、後述のヒアルロン酸付着培養器を使用しても良 いが、通常の細胞培養に使用される培養皿を使用してもよい。一般には接着細胞の 培養はコラーゲン被覆をした培養皿が使用され、例えば、ゥシ真皮、ラットの尾部由 来のコラーゲンを被覆した種々の大きさの培養皿が商業的に入手可能であり、また 必要であればそのような培養皿を調製することもできるが、コラーゲンを被覆しな 、培 養皿を使用することが好ましい。なぜならば、細胞外基質が少ないほどより温和な条 件で細胞が剥がれやす!、からである。本発明の分離または培養法を適用する場合、 前培養した細胞は、金属キレート剤および Zまたは酵素の存在下で個々の細胞に分 離することができるが、細胞への損傷が大きいため、非酵素的方法によってコロニー を培養容器力も剥がすのが好ましい。使用し得る金属キレート剤としては、細胞毒性 の少ないものであればよぐ接着細胞の剥離処理に一般的に使用されるもの、例え ば EDTA、 EGTA及び Zまたはその塩を、それぞれについて一般的な濃度で使用す ることができる。非酵素的細胞剥離剤としては、 Ca、 Mgを含まない Hanksの緩衝液 (p H7.3〜7.5)に EDTA、グリセロール、タエン酸ナトリム等を添カ卩した溶液が利用でき、 例えば Sigma社から Cell dissociation solutionの名で調製済みの非酵素的細胞剥離 剤を商業的に入手することができる。培養には、通常の 5%炭酸ガスインキュベータ 一を使用することができる。炭酸ガス濃度および培養温度は、通常の培養細胞に許 容される範囲であれば本質的ではない。より具体的には、 WO 01/92481に記載した 方法および条件を用いて前培養した小型細胞に富む細胞懸濁物を得ることができる
[0016] 本発明の一つの実施態様において、ヒアルロン酸が担体に付着 (コーティング)され
、そのヒアルロン酸付着担体共存下で小型肝細胞および Zまたは哺乳動物肝臓由 来の細胞が培養される。担体としては、ヒアルロン酸をコーティングすることができ、か つ細胞培養に適して担体であればどのようなものでも使用することができる。そのよう な担体には、プラスチック製品またはガラス製品（例えば、培養皿、培養フラスコ、培 養ボトル、プラスチックまたはガラスビーズ）、セファロース、例えばセファロースビーズ 、ヒアルロン酸をコーティングした多孔質（例えばスポンジ）、金属、セルロースが含ま れる。担体として細胞培養容器を使用する場合、一般に動物細胞培養に使用される のものでもよいが、細胞が本来的には付着しにくい担体、例えば、無コーティング細 胞培養容器、および、細菌培養用の培養容器が好ましい。
[0017] また、本発明の別の実施態様においては、ヒアルロン酸力もなる担体、または、ヒア ルロン酸を主成分とする担体、例えばヒアルロン酸でできた、またはヒアルロン酸を主 成分とする多孔質、例えばスポンジ、のような担体の共存下で小型肝細胞および Z または哺乳動物肝臓由来の細胞が培養される。その場合の培養容器は前述したヒア ルロン酸コーティング担体共存下の培養の場合と同様でょ 、。多孔質はヒアルロン酸 力 sコーティングされ、小型肝細胞が付着し得る表面積が多 、ので担体として好まし ヽ 。この多孔質は、ヒアルロン酸をコーティングすることができ、細胞、特に小型肝細胞 に有害な物質を含まない限り、どのようなものであってもよ 、。
[0018] ヒアルロン酸の担体へのコーティングは例えば以下のように行うことができる。ヒアル ロン酸は商業的に入手可能である。また、ヒアルロン酸は一般に分子量約 100万を 境に、低分子量ヒアルロン酸と高分子量ヒアルロン酸に分類されるが、本発明におい ては高分子量ヒアルロン酸を使用することが好ましい。ヒアルロン酸、好ましくは高分 子量ヒアルロン酸を適当な濃度で、例えば調製した溶液の lml〜5mlを担体と接触さ せた場合に担体の表面積に対して 10 /z §/αη2〜1000 /ζ g/cm2、より好ましくは 50 g/ «η2〜500 /ζ g/cm2の量となるよう、適切な培地またはバッファ一中で溶液として調製 する。一般には、ヒアルロン酸溶液は 10〜20mg/ml程度の濃度のストック溶液として 適切な培地またはバッファ一中に調製するのが便利であろう。使用するノ ッファーは 細胞に有害でない限りどのようなバッファーも使用できる力 例えば、ハンクス液、一 般的な細胞培養培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)等が利用できる。 バッファーの pHはヒアルロン酸が溶解する範囲でよいが、一般には 7.1〜8.5が好まし い。ヒアルロン酸を溶解するときの温度はヒアルロン酸が溶解し、かつ分解しない温 度であればどのような温度でもよぐ通常のインキュベーターの設定温度を考慮すれ ば、例えば、 30°C〜40°C、特に 37°C前後の温度範囲が簡便に利用できる。
[0019] このように調製したヒアルロン酸溶液を、そのまま、または場合により適切なバッファ 一または培地で希釈し、上述した担体と共存させ、担体上にヒアルロン酸をコーティ ングする。比較的撥水性の担体をコーティングする場合は、コーティング用のヒアルロ ン酸溶液の液量が少な 、と担体の表面を充分に被覆できな 、可能性があるので、ヒ アルロン酸溶液を希釈して液量を増やすことが特に有用であろう。コーティングのた めには、 0.5〜20mg/ml、好ましくは l〜10mg/mlのヒアルロン酸溶液を担体表面 lcm2 あたり、好ましくは 10 g〜 1000 g、より好ましくは 50 g〜500 gとなるように担体表 面と接触させる。例えば、 60mmディッシュにヒアルロン酸をコーティングする場合、 10 mg/mlに調製したヒアルロン酸を PBS等で lmg/mlに希釈し、その希釈液 lmlをデイツ シュに注ぐことによってコーティングを行うことができる。ヒアルロン酸溶液と担体との 接触は、 30°C〜40°C、特に 37°C前後にて 1時間〜 24時間程度インキュベーションす るのが好ましい。インキュベーションの温度と時間はヒアルロン酸が担体上にコーティ ングされるのに充分であればよぐコーティングのためのインキュベーション時間は 24 時間より長くても問題はないが、長時間インキュベーションすることの利点は乏しい。
[0020] コーティングに十分な時間が経過した後、ヒアルロン酸溶液を除去し、担体表面上 を細胞に有害でないバッファー、例えば PBSで洗浄する。必要に応じて、担体は UV 照射などにより滅菌することができる。担体自体が培養容器である場合は、後述する ような小型肝細胞の培養に適した培地を添カ卩し、担体がビーズやスポンジ等である 場合は適切な培養容器中に移した後、前述の培地を添加することができる。このよう に用意した培養容器に小型肝細胞を含むと考えられる細胞懸濁物を添加することが できる。この時の初期細胞密度は、 1χ104〜5χ105細胞/ mlとするのが好ましい。
[0021] 培養は、上述したように、血清、ニコチンアミド、ビタミン C、抗生物質、増殖因子、そ の他の細胞培養に一般的に使用される添加物を更に含む基本培地、例えば、これら を添加したダルベッコ改変イーグル培地等で 37°Cにて、上述したようにヒアルロン酸 付着担体共存下で培養することができる。本発明のある実施態様では、このヒアルロ ン酸付着担体は、ヒアルロン酸を塗布した培養皿、または、ヒアルロン酸を塗布した培 養フラスコである。また、別の実施態様では、このヒアルロン酸付着担体は、ヒアルロ ン酸を付着させたプラスチックビーズ、ガラスビーズ、セファロースビーズ、または、ヒ アルロン酸を付着させた磁気ビーズである。更にまた別の実施態様では、ヒアルロン 酸付着担体はヒアルロン酸でできた担体、またはヒアルロン酸を主成分とする担体で ある。特に、ヒアルロン酸でできた担体、またはヒアルロン酸を主成分とする担体とし て多孔質 (スポンジ）が好ま U、。
培地は、さらにニコチンアミド、ビタミン C、増殖因子、 DMSO等を含むことが好まし ヽ 。ビタミン Cは通常、ァスコルビン酸 2リン酸として添カ卩し、その濃度は、好ましくは 0.1m M〜1.0mM、より好ましくは、 0.5mM〜1.0mMであり、ニコチンアミドは比較的高濃度で 使用され、好ましくは l〜20mM、より好ましくは 5mM〜10mMで使用する。増殖因子と しては、上皮細胞増殖因子 (EGF)、肝細胞増殖因子 (HGF)、トランスフォーミング増 殖因子 (X (TGF a )等が利用でき、 TGF aが特に好まし 、。 TGF aを添加する場合に は、好ましくは 1 μ g/卜 100 g/l、より好ましくは 5 g/卜 50 g/1の濃度で使用する 。継代培養した細胞ではなく哺乳動物の肝臓から調製した小型肝細胞を含む細胞 画分を直接培養する場合 (初代培養）は、 DMSOは培養開始 4日目力も好ましくは約 0.1〜約 2%(v/v)、より好ましくは約 0.5%〜約 1.5%(v/v)の濃度で添加する。また、最 初の 24時間は無血清の上記培地を用い、その後血清を加えた上記培地と交換する のが好ましい。最初に 24時間、無血清培地で培養することにより、例えば類洞内皮細 胞等の非特異的な接着を低減させることができる。また、血清に含まれるビトロネクチ ン、フイブロネクチンの混入を防止するためにも、このような初期無血清培養が好まし い。
培養は炭酸ガス培養器を使用し、基本的に二日に一回 (週 3回)程度の割合で培 地交換を行うのが好ましい。
より具体的には以下の培地を使用することができる： [0023] Dulbe cco' s Modif i ed Eagl e Medi um (GIBCO Laboratori es)
+ 20 mM HEPES (Doj i ndo )
+ 25 mM NaHC03 (Katayama unemi cal Co. )
+ 30 mg/1 プロ リ ン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 0. 5 mg/1 インス リ ン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 10— 7 M デキサメタゾン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 10 % FBS (Hycl one Laboratori es, Inc . )
+ 10 mM ニコチンアミ ド (Katayama Chemi cal Co.， )
+ 1 mM L-ァスコルビン酸 2リ ン酸塩 (Wako Pure Chemi cal Ind. )
+ 10 a g/1 EGF (Col l aborat i ve Re search Inc. )
+ 抗生物質
1% ジメチルスルホキシド（DMS0) (ALDR ICH )
(DMS0は培養 4日目の培地交換時より添加)
[0024] 培養期間は、予め肝障害を与えていない個体力 細胞を調製した場合はヒアル口 ン酸への充分な接着を保証するため少なくとも 2日間以上、好ましくは約 3日間以上 、さらに好ましくは約 3日〜30日間、特に好ましくは約 3日〜21日間行うが、ガラクトサ ミン等により肝障害を予め与えた個体カゝら細胞を調製した場合や継代培養を行って きた細胞の場合はより短い期間の培養により小型肝細胞を分離することができる。ガ ラタトサミンによる障害を与える場合は、例えば、成熟ラット（8〜10週齢）に D-ガラタト サミン（ァクロス）を 10πι§〜100πι§/200 /ζ 1 PBS/100g体重の濃度で腹腔内注射をし、 注射後 3日目〜 6日目に Seglenの方法に準じて、肝臓より細胞を分離することができ る。
[0025] 培地交換時に、ヒアルロン酸に付着しない細胞は浮遊状態にある力、または担体上 力 剥がれやすくなつているため、培養物から容易に除去すること、または、ヒアルロ ン酸に付着する細胞を培養物から容易に回収することができる。本発明にお 、て、 培養物からヒアルロン酸に付着しな！ヽ細胞を除去することと、培養物からヒアルロン酸 に付着する細胞を回収することとは同等である。
ヒアルロン酸を付着させた担体が培養皿、培養フラスコまたはスポンジのような比較 的大型の担体の場合は担体表面を適切なバッファーまたは培地、例えば、 PBSまた は上述した小型肝細胞培養用培地でリンスすることによりヒアルロン酸に付着しない 細胞を容易に除去することができる。担体がビーズのような比較的小型の担体の場 合、遠心により、または、磁気ビーズの場合は磁気により固定し、続いて培地を除去 し、必要により適切なバッファーまたは培地で洗浄することによってヒアルロン酸に付 着した細胞を容易に回収する、あるいは、ヒアルロン酸に付着しない細胞を容易に除 去することができる。その後、新鮮な培地を添加して、ヒアルロン酸存在下または非存 在下でさらに培養を続けることもでき、また、後述するように担体から小型肝細胞を解 離させる処理に供することちできる。
[0026] 上述のように培養したのち、培地を除去し、必要に応じて担体を培地または PBS等 の適切なバッファーで洗浄した後、ヒアル口-ダーゼを作用させることによって、ヒア ルロン酸に付着した小型肝細胞を担体力 解離させることができる。ヒアルロニダ一 ゼは商業的に入手可能であり、適切なバッファ一中に調製して使用することができる 。使用する適切なバッファ一は、ヒアル口-ダーゼを溶解することができ、ヒアルロニダ ーゼ活性を著しく阻害しないバッファーであればよぐ例えば、ハンクス液、一般的な 細胞培養培地、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)を利用することができる。 また、ヒアル口-ダーゼの濃度も特に限定されないが、例えば 0.1〜20mg/ml、好まし くは l〜10mg/mlの濃度で調製することができる。担体からの小型肝細胞を解離させ るためにはこのように調製したヒアル口-ダーゼを担体 ヒアルロン酸 細胞複合体 に作用させる。作用させるヒアルロン酸の量は特に限定されず、使用量に応じてイン キュベーシヨン時間を調整することができる。し力しながら、一般には、担体表面 lcm2 あたり好ましくは約 5 μ g〜1000 μ g、より好ましくは約 50 μ g〜500 μ gのヒアル口ニダ ーゼを使用することが出来る。
[0027] 例えば、培養液を除去後、 PBSで洗浄し、 ImM EDTA/PBSを lmlカ卩え、室温で 1分 間インキュベートする。 ImM EDTA/PBSを除去後、予め培養温度と同じ、例えば 37°C に温めた上記濃度のヒアル口-ダーゼ溶液をカ卩え、 37°Cの 5%炭酸ガスインキュベー ターで適切な時間インキュベーションする。例えば、 60mm培養皿を用いた場合は、 5 mg/mlまたは lOmg/mlのヒアル口-ダーゼ溶液を約 lml使用するのが好まし!/、。インキ ュベーシヨン時間は、ヒアルロン酸を塗布した担体、例えば、ヒアルロン酸コーティン グ培養皿または培養フラスコを使用する場合は、典型的には約 30分間〜約 2時間で ある。特にヒアルロン酸で出来た、またはヒアルロン酸を主成分とする担体、例えばヒ アルロン酸スポンジ等を処理する場合は、その担体の全部、または成分であるヒアル ロン酸が充分に溶解するまでインキュベーションする。いずれの場合も、細胞の遊離 状態を観察しながら、インキュベーション温度および時間を最適に調整することがで きる。その後、氷冷した培養液を適当量カ卩え、軽くピペッティングした後、チューブに 回収し、 50 X g、 5分間の遠心を行うことにより小型肝細胞を回収することが出来る。
[0028] 培養期間等の条件に依存して、ヒアルロニダーゼ処理では小型肝細胞が充分に遊 離しない場合もあり得る。その場合は、市販の細胞解離溶液、例えば Sigma社から入 手できる Cell dissociation solutionを利用することが出来る。例えば、培養液を除去後 、 PBS等の適切なバッファーで洗浄し、 ImM EDTA/PBSを適当量カ卩え、室温で 1〜3 分間程度インキュベートする。続いて、 ImM EDTA/PBSを除去後、予め培養温度と 同じ、例えば 37°Cに温めた Cell dissociation solutionを適当量カ卩え、 5%炭酸ガスイン キュベータ一で例えば 5-15分間程度インキュベーションすることにより容易に小型肝 細胞を担体力も解離させることが出来る。インキュベーション温度および時間は細胞 の遊離状態を観察しながら最適に調整することができる。
上述したような細胞解離溶液処理は単独で行っても、ヒアル口-ダーゼ処理と併用 しても良い。
[0029] インキュベーション後、担体から解離した小型肝細胞を適切な方法により回収する ことができる。例えば、インキュベーション後、培養容器に PBS等の細胞に有害でない 適切なバッファーまたは培地を適当量添加し、遊離した小型肝細胞の細胞懸濁物を 調製し、必要により遠心および再懸濁を繰り返し、担体 ヒアルロン酸から遊離した 小型肝細胞を洗浄および回収することができる。遠心は小型肝細胞に過剰な傷害を 与えないよう、比較的低速にて短時間、例えば 50 X gにて 5分間程度行うのが好まし い。担体がビーズ等の小型担体である場合は、さらに低速および Zまたは短時間の 遠心、または、数秒間〜数分間程度、好ましくは 1分間以下、単に静置することにより 小型肝細胞懸濁物と担体 ヒアルロン酸とを分離することができる。このようにして得 られた小型肝細胞を、さらに、表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたは ヒアルロン酸を主成分とする担体の共存下で選択的に培養し、上述した操作を繰り 返すことちできる。
[0030] このようにして分離および Zまたは培養した小型肝細胞が肝細胞としての機能の一 部を有していることは、種々のマーカーを用いて確認することができる。そのようなマ 一力一としては、培地中に分泌されるアルブミンの他、トランスフェリン、尿素の産生、 グリコーゲン量、アミノ酸代謝酵素、チトクローム P450等が利用できる。これらは、培地 または細胞抽出液の ELISA、 Westernブロット解析、 RT- PCR等によって、あるいは直 接細胞を免疫染色することによって確認することができる。小型肝細胞は、成熟肝細 胞のマーカーであるアルブミン、 CK8、 CK18、グリコーゲン、ペルォキシゾーム等のマ 一力一を有しており、一方胆管上皮細胞のマーカーである CK7、 CK19等を有してい ない等の点で、他の細胞と区別し得る。例えば、肝幹細胞の一種として知られる oval 細胞は CK7、 CK19等の胆管上皮細胞のマーカーを有し、グリコーゲン、ペルォキシ ゾーム等の成熟肝細胞マーカーを有しない点で小型肝細胞と区別することができる
。またその他の非実質細胞マーカー [EDl/2(クッパー細胞のマーカー)， SE-1 (類洞 内皮細胞マーカー），デスミン（desmin) (伊東細胞のマーカー），ビメンチン (vimentin ) (肝上皮様細胞マーカー)]についても陰性であることを確認することができる。 このようにして効率的に分離および培養維持した小型肝細胞は、上述した培地およ び培養容器を用いて、肝臓から得た小型肝細胞を多く含む画分を培養するときと同 様に培養することができる。この場合、培養容器として前述したようなヒアルロン酸付 着培養器を使用しても良いが、通常の細胞培養に使用される培養皿を使用してもよ V、。一般に接着細胞の培養用に使用されるコラーゲン被覆培養容器を用いることも できるが、凍結保存用コロニーの調製または肝組織形成に適した小型肝細胞コ口- 一を調製する場合のように、小型肝細胞を培養容器から剥離することを意図するの であれば、コラーゲンを被覆しない培養皿を使用することが好ましい。細胞外基質が 少ないほどより温和な条件で細胞が剥がれやすぐかつ、コラーゲン等で被覆しない 場合には、小型肝細胞が優先的に容器力も剥離する傾向があるからである。培養に は、通常の 5%炭酸ガスインキュベーターを使用することができる。炭酸ガス濃度およ び培養温度は、通常の培養細胞に許容される範囲であれば本質的ではな 、。
さらに、このようにして効率的に分離および培養維持した小型肝細胞は、 WO 01/9 2481に記載された方法に従って凍結保存することもでき、また、 WO 02/088332に記 載された方法に従って、肝組織へ成熟化させること、さらには成熟化させた肝組織を 用いて薬物機能を推定するために使用することもできる。 [0032] なお、本明細書に記載の文献の開示内容は、引用によりその全体が本明細書に取 り込まれるものとする。
[0033] (実施例）
実施例 1.小型肝細胞を豊富に含む細胞画分の調製
成熟ラット（10〜15週令）の肝臓を Seglenの方法に準じて、 0.2mM EGTAをカ卩えた力 ルシゥム、マグネシウムを含まないハンクス液で門脈力ら灌流した。 40ml/分の流速で 約 4分流したあと、 0.02%コラゲナーゼ (ヤクルト）を含むハンクス液を 20ml/分の流速 で 10分間流した。消化された肝臓力も定法に従って肝細胞をビーカー内に振るい落 とした。細胞縣濁液を 250、 70マイクロメーターの穴のあいたフィルターで濾し、 50xg で 1分間遠心した。上清を集め、再び 50xgで 1分間の遠心を 2回くり返した。その上清 を集め、 50xgで 5分間遠心した。沈殿した細胞を培養液 (Leivobitz L-15+10%ゥシ胎 仔血清 + 10— 7 Mデキサメタゾン +0.5 mg/1インスリン +抗生物質）で洗浄し、再び 50xg で 5分間遠心した。同様の操作を繰り返した後、今度は 150xgで 5分間遠心した。同 様の操作を繰り返した後、再び 50xgで 5分間遠心した。沈殿した細胞を新しい培養 液で縣濁したあと、生細胞数を数え、 1.0 X 104〜5.0 X 105細胞/ mlに調製した。
[0034] 実施例 2. CD44の小型肝細胞における発現パターン
実施例 1で調製した細胞の CD44発現パターンを調べた。
1) CD44の発現パターンの経時的変化
調製直後の小型肝細胞、培養開始後の小型肝細胞及び成熟肝細胞から total RN Aを調整し、 RT- PCR法により CD44の発現を調べた。 GPDH (グリセロール 3-リン酸脱 水素酵素）を陽性対照 (ハウスキーピング遺伝子）として使用した。培養は以下の培 地で行った。 [0035] Dulbe cco' s Modif i ed Eagl e Medi um ( GIBCO Laboratori e s )
+ 20 mM HEPES (Doj i ndo )
+ 25 mM NaHC03 (Katayama unemi cal Co. )
+ 30 mg/1 プロ リ ン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 0. 5 mg/1 インス リ ン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 10— 7 M デキサメタゾン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 10 % FBS (Hycl one Laboratori es, Inc . )
+ 10 mM ニコチンアミ ド (Katayama Chemi cal Co.， )
+ 1 mM L-ァスコルビン酸 2リ ン酸塩 (Wako Pure Chemi cal Ind. )
+ 10 a g/1 EGF (Col l aborat i ve Re search Inc. )
+抗生物質
1% ジメチルスルホキシド（DMS0) (ALDR ICH )
(DMS0は培養 4日目の培地交換時より添加)
[0036] 約 1.0〜1.5 x 105個の小型肝細胞から total RNAを抽出した。 ISOGEN (-ッポンジ ーン）を用いて業者の推奨するプロトコルに従って細胞を溶解し、それにクロ口ホルム をカロえてよく混ぜた後、 10000 X g、 15分間、 4°Cにて遠心した。上層を取り出し、イソ プロパノールをカ卩え、 10000 X g、 15分間、 4°Cにて遠心後、得られた沈殿を 70%エタ ノールで洗浄し、 DEPC-水に溶解した。成熟肝細胞力もの RNA抽出は、灌流直後の 細胞から同様な方法で抽出した。
得られた total RNA 10ngを用いて、 RT-PCRを行った。 PCR産物を電気泳動し、得ら れた各バンドをデンシトメータで読み取り、 CD44のバンドの強度を GPDHのバンドの 強度で除算し相対強度を計算した。用いたプライマーは下記の通りである：
5 -cccgaattcatggacaaggtttggtggca-3 (目己列 ¾·号 1)
5 -cccgaattcctacaccccaatcttcatat-ύ (¾C列 ¾·号 2)
また GPDH用には以下のプライマーを使用した。
5 -accacagtccatgccatcac-ύ ' (酉己列番号 3)
5 -tccaccaccctgttgctgta-3 (酉己列番号 4)
PCRの条件は以下の通りである： 95°C： 15秒、 60°C： 30秒、 68°C： 1分、サイクル数 = 25
[0037] その結果、初代培養開始後、約 2〜3日後には顕著な CD44の発現が見られ、その 後さらに発現は増大して培養開始 3〜5日後にはほぼ最大に達すること、および増殖 中の小型肝細胞では CD44の発現レベルがほぼ維持されることが明らかになった（図 D oまた、この条件で培養した場合に小型肝細胞がある程度成熟する培養 40日後 には CD44の発現が低下することも示された（図 1)。
[0038] 2)小型肝細胞および成熟肝細胞における CD44の発現パターンの比較
WO 01/92481に記載した方法に従って凍結保存しておいた細胞（約 1.0〜1.5 x 105 細胞)を常法に従って溶解し、 2週間培養した細胞力 1)と同様な手順により total R NAを抽出した。成熟肝細胞からの RNA抽出は、灌流直後の細胞から同様な方法で 抽出した。得られた total RNA lOngを用いて、 1)と同様にして RT-PCRを行い、 CD44 の相対発現量を調べた。ただし、 PCRのサイクル数を 35とした。 PCR産物を電気泳動 し、得られた各バンドをデンシトメータで読み取り、 CD44のバンドの強度を GPDHのバ ンドの強度で除算し相対強度として小型肝細胞と成熟肝細胞における CD44の発現 を比較した（図 2)。
その結果、成熟肝細胞では一貫して CD44の発現はかなり低いことが明らかになつ た（図 1,図 2)。
[0039] 同様な結果はノーザンブロットによっても得られている（図 3)。この場合もハウスキ 一ビング遺伝子として GPDHを用いた。上述したように、得られた各バンドをデンシトメ ータで読み取り、 CD44のバンドの強度を GPDHのバンドの強度で除算し、小型肝細 胞と成熟肝細胞における CD44の発現を比較した。使用したプローブは、 CD44のコ ード領域全長である（配列番号 5)。プローブは、 Alkphos Directラベリングキット (Amer sham Biosciences)を用 ヽて標識し 7こ。
[0040] さらに、 WO 02/088332に記載された方法に従って、 Matrigelを培養中の小型肝細 胞に添加して小型肝細胞の成熟化を誘導し、 CD44発現の変化をノーザンプロット〖こ より調べた。 Matrigel添加後第 2日力も成熟化が開始することが分力つており（WO 02 /088332)、成熟化に伴って CD44の発現が低下することが示された（図 4)。
これらの結果は、 CD44の発現が小型肝細胞に特異的であることを示すと共に、肝 臓からの細胞画分の調製という傷害により、 CD44の発現が誘導され、肝臓を構成す る細胞群中に潜在的に存在していた小型肝細胞またはその前駆細胞が小型肝細胞 としての本来の性質を表すようになった可能性を示唆して 、る。
[0041] 実施例 3.ヒアルロン酸共存下における培養
lOmgZmlの濃度になるようにヒアルロン酸ストック溶液を PBS中で調製し、 37°Cに保 持した。使用したヒアルロン酸は Sigmaから購入した（Sigma Hyaluronic acid (ヒト臍帯； Human umbilical cords),カタログ番号 H-1504)。得られたヒアルロン酸ストック溶液の 適当量に PBSをカ卩えて、 1〜 10mgのヒアルロン酸を全体積 3ml中に含むようにヒアル口 ン酸希釈溶液を調製した。得られた各種濃度のヒアルロン酸溶液を、 60mmの無処理 ディッシュ（Kord-Valmark Co.)にカロえた。このディッシュをー晚 37°Cでインキュベート し、 PBSで洗浄後使用した。
このディッシュに 1)で調製した小型肝細胞を豊富に含む細胞分画を播!、た。最初 の 24時間は下記に示す培地を用い、その後前述の培地に 10% FBS(Hyclone Laborat ories, Ιι を加えた培地と交換した。培養は炭酸ガス培養器を使用し、基本的に二 日に一回 (週 3回）の割合で培地交換を行った。
[0042] 培地組成は以下の通りである：
Duibe cco s Modif i ed Eagl e Medi um ( G
+ 20 mM HEPES (Doj i ndo
+ 25 mM NaHC03 (Katayamaし nemi cal LO. )
+ 30 mg/1 プロ リ ン (Si gma Chemi cal υο. )
+ 0. 5 mg/1 インス リ ン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 10— 7 M デキサメタゾン (Si gma Chemi cal Co. )
+ 10 mM ュコチンアミ ド (Katayama Chemi cal Co. , )
+ 1 mM L-ァスコルビン酸 2リ ン酸塩 (Wako Pure Chemi cal Ind. )
+ 10 u g/1 EGF (Col l aborat i ve Re search Inc. )
+抗生物質
1% ジメチルスルホキシド（DMS0) (ALDR ICH )
(DMS0は培養 4日目の培地交換時より添加)
[0043] ヒアルロン酸 lmg、 5mg、 10mgを用いて 60mm培養皿をコーティングし、ヒアルロン酸 塗布培養皿上における小型肝細胞の増殖を 7、 14および 21日目に顕微鏡下で観察 した。結果を図 5に示す。
図 5から明らかなように、非付着細胞用の培養皿 (陰性対照)上の培養では小型肝 細胞はほとんどコロニーを形成せず、付着細胞培養用の培養皿（陽性対照)での培 養に比べるとヒアルロン酸塗布培養皿では小型肝細胞の面積が大き力つた。また培 養期間が長くなると小型肝細胞が増殖するかわりに小型肝細胞の分化、すなわち成 熟化が起こり、小型肝細胞コロニーの面積の増加率は低くなるが、ヒアルロン酸を塗 布しない場合に比較して少なくとも第 21日目までは依然として面積が大きいことが示 されている。また、顕微鏡観察によれば、増殖中の小型肝細胞の形態に変化は見ら れなかった。
[0044] 実施例 4.小型肝細胞の単離
a)ヒアル口-ダーゼ処理
ヒアルロン酸塗布培養皿で 6日間、および 3週間培養後、ヒアル口-ダーゼ（Sigma Chemical Co.)で処理した。培養皿力 培養液をぬいた後、 PBSで洗浄し、 ImM EDT A/PBSを lmlカ卩え、室温で 1分間インキュベートした。 ImM EDTA/PBSを除去後、予 め 37°Cに温めたヒアル口-ダーゼ（5mg/mほたは 10mg/ml)を lml加え、 37°Cの 5%炭 酸ガスインキュベーターで 2時間インキュベートした。その後、氷冷した培養液を lml 加え、軽くピペッティングした後、チューブに回収し、 50 X g、 5分間、遠心を行い、小 型肝細胞を回収した。
6日培養した小型肝細胞コロニーは、剥離可能で細胞を回収することができたが、 3 週間培養した細胞は、ヒアル口-ダーゼ単独では細胞を充分に剥離することができな かった。そのため、 b)で示すような分散液を使用した。
b)細胞解離溶液（Cell dissociation solution)による処理
ヒアルロン酸塗布培養皿で 3週間培養後、細胞解離溶液（Cell dissociation solution ) (Sigma Chemical Co.)を業者の推奨するプロトコルに従って用いて培養皿に付着し た細胞を処理した。
培養液を除去後、 PBSで洗浄し、 ImM EDTA/PBSを lmlカ卩え、室温で 1分間インキ ュペートした。 ImM EDTA/PBSを除去後、予め 37°Cに温めた Cell dissociation soluti onを lmlカ卩え、 37°Cの 5%炭酸ガスインキュベーターで 5- 15分間インキュベートした。 その後、氷冷した培養液を lml加え、チューブに回収し、 50 X g、 5分間の遠心を行い 、小型肝細胞を回収した。
[0045] 得られた細胞は形態学的に小型肝細胞と同等であり、 CD44陽性であった。この細 胞は増殖してコロニーを形成することができた。コロニーを形成した細胞は、アルブミ ンを分泌しており、さらに免疫染色によって解析した結果、非実質細胞マーカー [ED1 /2(クッパー細胞のマーカー)、 SE- 1 (類洞内皮細胞マーカー）、デスミン（desmin) (伊 東細胞のマーカー）、ビメンチン (vimentin) (肝上皮様細胞マーカー)]はすべて陰性 であった。従って、得られた細胞は小型肝細胞であることが確認された。 [0046] 実施例 5.成熟肝細胞の調製
成熟ラットの肝臓をコラゲナーゼを含む溶液で灌流し、得られた細胞懸濁液を 50xg 、 1分間、 4°Cで遠心し、沈殿を回収した。沈殿をノヽンタス緩衝液に懸濁し、 50xg、 1 分間、 4°Cで遠心、この操作を 3回繰り返した。
得られた細胞を 25mlのハンクス緩衝液に懸濁し、 21.6mlパーコール（Amersham)、 2.4mlの 10xノヽンタス緩衝液に加えて転倒混合した。 50xg、 15分間、 4°Cで遠心し、上 清を除いた。細胞を PBSで懸濁し、 50xg、 lmin、 4°Cで遠心、沈殿を回収して、成熟 肝細胞を得た。
[0047] 実施例 6.小型肝細胞及び成熟肝細胞のヒアルロン酸共存下における培養の比較 実施例 1及び 4の方法で調整した小型肝細胞及び成熟肝細胞を実施例 3の方法で 塗布したディッシュに播 、た。培養法は実施例 3と同様に行った。
最初の 24時間は下記に示した培地を使用し、その後 10%FBS (Hyclone laboratorie s, Inc.)を加えた培地と交換した。培養は炭酸ガス培養器を使用し、週三回の割合で 培地交換を行った。
Dulbecco s Modified Hagle Medium IBCO Laboratories )
+ 20 mM HEPES (Do jindo )
+ 25 mM NaHC03 (Katayama unemical uo. )
+ 30 mg/1 プロ リ ン (Sigma Chemical Co. )
+ 0.5 mg/1 インス リ ン (Sigma Chemical Co. )
+ 10— 7 M デキサメタゾン (Sigma Chemical Co. )
+ 10 mM ニコチンアミ ド (Katayama Chemical Co. , )
+ 1 mM L-ァスコルビン酸 2リ ン酸塩 (fako Pure Chemical Ind. )
+ 10 μ g/1 EGF (Collaborative Research Inc. )
+抗生物質
1% ジメチルスルホキシド（DMS0) (ALDRICH )
(DMS0は培養 4日目の培地交換時より添加)
[0048] 培養後 1日目及び 7日目でディッシュ上に生育して ヽる細胞数を数えた。 1日目の細 胞数を 1として 7日目における割合を示した（図 6)。成熟肝細胞は培養 7日目ではほと んど生育していないのに対し、小型肝細胞は 7日目では 1日目の約 7倍の細胞数に達 していた。
[0049] 本発明により、ヒトを含む哺乳動物の肝臓から、効率的に小型肝細胞を分離するこ とができる。また、本発明により、小型肝細胞を選択的に培養することができる。さらに 、本発明により、培養中に成熟化して小型肝細胞としての永続的増殖能を失った細 胞と小型肝細胞とを効率的に分離して培養することができる。
例えば、ヒアルロン酸をコーティングした培養皿で小型肝細胞および成熟肝細胞を それぞれ培養した場合、成熟肝細胞は培養 7日目ではほとんど生育していないのに 対し、小型肝細胞は 7日目では 1日目の約 7倍またはそれ以上の細胞数に達し得るの で、本発明により成熟肝細胞と区別して小型肝細胞を選択的に培養および分離する ことが出来る。
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図面の簡単な説明
[0051] [図 1]図 1は調製および培養開始後の各時点における CD44の mRNAレベルの発現を RT-PCRにより解析した結果である。縦軸は相対強度、横軸は培養日数を示す。
[図 2]図 2は、小型肝細胞および成熟肝細胞における CD44の mRNAレベルの発現を RT-PCRにより比較した結果である。 SH :小型肝細胞、 MH :成熟肝細胞。縦軸は相 対強度を示す。
[図 3]図 3は、小型肝細胞および成熟肝細胞における CD44の mRNAレベルの発現を ノーザンプロットにより比較した結果である。 SH :小型肝細胞、 MH :成熟肝細胞。縦 軸は相対強度を示す。また Upperは検出された mRNAのうちサイズの大きい RNA、 Lo werはサイズの小さ!/、RNAを表す。
[図 4]図 4は、 Matrigelによって成熟化を誘導した小型肝細胞における CD44発現をノ 一ザンブロットによって調べた結果である。 SH :小型肝細胞、 MH :成熟肝細胞。縦軸 は相対強度を示す。
[図 5]図 5は、種々の量のヒアルロン酸をコーティングした培養皿における小型肝細胞 コロニーの増殖の時間経過を示したものである。縦軸は mm2単位の面積 xlO— 3である。 陽性対照:付着細胞用の培養皿、陰性対照:非付着細胞用の培養皿、コラーゲン:コ ラーゲン塗布培養皿、 lmg HA、 5mg HA、 lOmg HA:それぞれ lmg、 5mg、 lOmgのヒ アルロン酸で処理した培養皿。
[図 6]図 6は、ヒアルロン酸塗布培養皿上における成熟肝細胞及び小型肝細胞の位 相差顕微鏡写真である。 A:成熟肝細胞培養第 1日目、 B :成熟肝細胞培養第 7日目 、 C :小型肝細胞培養第 1日目、 D :小型肝細胞培養第 7日目。ヒアルロン酸を塗布し た 60mm培養皿上に成熟肝細胞 (MH)及び小型肝細胞 (SH)を 3xl05細胞の濃度で播 種し、培養した。それぞれ 1日目、 7日目の細胞の成育状況を示す。小型肝細胞はコ 口-一を形成して増殖しているのに対して、成熟肝細胞は丸くなり剥がれ落ち、 7日 目にはほとんどの生着している細胞は無くなった。図中の線は、 200マイクロメーター を示す。
[図 7]図 7は、ヒアルロン酸塗布培養皿上における成熟肝細胞及び小型肝細胞の増 殖を示したグラフである。生着している細胞数を計測し、 1日目の細胞数を 1として、 7 日目の細胞数を相対的に示した。

Claims

請求の範囲
[1] 表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアルロン酸を主成分とする 担体の共存下で小型肝細胞を培養することを含む、小型肝細胞の培養方法。
[2] 表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアルロン酸を主成分とする 担体の共存下で小型肝細胞を培養すること、および、ヒアルロン酸に付着する細胞と ヒアルロン酸に付着しない細胞を分離すること、を含む、請求項 1記載の小型肝細胞 の培養方法。
[3] 以下の工程を含む、小型肝細胞の培養方法：
i)表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアルロン酸を主成分とする 担体の共存下で小型肝細胞を培養する工程；
ii) i)で得られる培養物にぉ ヽてヒアルロン酸に付着する細胞とヒアルロン酸に付着し ない細胞を分離する工程；
iii)工程 ii)で得られるヒアルロン酸に付着する小型肝細胞を前記ヒアルロン酸力 解 離させる工程;および、
iv)工程 iii)で得られた小型肝細胞について、工程 i)〜iii)を 1サイクル以上繰り返すェ 程。
[4] 担体が、多孔質、ガラス、セファロース、プラスチック、金属、セルロール力 なる群 より選ばれる、請求項 1〜3の!ヽずれか 1項記載の小型肝細胞の培養方法。
[5] 担体表面へのヒアルロン酸の付着が、担体表面に対して 10〜1000 μ g/cm2のヒアル ロン酸と担体とをインキュベーションすることによって行われる、請求項 1〜4のいずれ 力 1項記載の小型肝細胞の培養方法。
[6] 以下の工程を含む、小型肝細胞の分離方法：
i)表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアルロン酸を主成分とする 担体の共存下で哺乳動物肝臓由来の細胞を培養する工程；
ii) i)で得られる培養物カゝらヒアルロン酸に付着する細胞を回収する工程。
[7] 以下の工程を含む、請求項 6記載の小型肝細胞の分離方法：
i)表面にヒアルロン酸を付着させた担体および Zまたはヒアルロン酸を主成分とする 担体の共存下で哺乳動物肝臓由来の細胞を培養する工程； ii) i)で得られる培養物にぉ ヽてヒアルロン酸に付着する細胞とヒアルロン酸に付着し ない細胞を分離する工程；
iii)ヒアルロン酸に付着する細胞を前記ヒアルロン酸力 解離させる工程； iv)工程 i)〜iii)を 1サイクル以上繰り返す工程;および
V)前記ヒアルロン酸力 解離させた細胞を回収する工程。
[8] 担体が、多孔質、ガラス、セファロース、プラスチック、金属、セルロース力 なる群よ り選ばれる、請求項 6または 7記載の小型肝細胞の分離方法。
[9] 担体表面へのヒアルロン酸の付着が、担体表面に対して 10〜1000 μ g/cm2のヒアル ロン酸と担体とをインキュベーションすることによって行われる、請求項 6〜8のいずれ 力 1項記載の小型肝細胞の分離方法。
[10] 小型肝細胞をヒアルロン酸力 解離させる工程力 ヒアル口-ダーゼを作用させるこ とによって行われる、請求項 6〜9のいずれか 1項記載の小型肝細胞の分離方法。
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