CN111432824A - 铺板肝细胞及其制备和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种在表面上包含铺板人肝细胞的产品，并且至少一些铺板肝细胞在饲养细胞上的一个或多个肝细胞簇中，所述饲养细胞附着至表面。还提供一种制备铺板人肝细胞的方法。该制备方法包含在存在饲养细胞的情况下将人肝细胞施加至表面，将施加的肝细胞与饲养细胞共培养，并通过在饲养细胞上共培养的肝细胞形成一个或多个肝细胞簇，所述饲养细胞附着至表面。铺板肝细胞可用于多种目的，包括制备乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝细胞培养模型和药物测试。

Description

铺板肝细胞及其制备和用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月22日提交的美国临时申请第62/562,127号的权益，其全部内容为了全部目的引入本文以作参考。
技术领域
本发明一般性地涉及铺板人肝细胞及其制备和用途。
背景技术
从供体分离的原代人肝细胞已用于2D体外培养系统中，以研究药物代谢或药物诱导的肝损伤。在2D体外培养系统中，将原代人肝细胞保存在培养基中并附着至表面(例如板)，以生成适合于测试药物代谢、毒性或病毒感染的单层肝细胞。对于2D体外培养系统，在很长一段时期内例如至少1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42或49天具有至少≥85％的可铺板性(plateability)的分离的原代人肝细胞是期望的，而具有小于60％的可铺板性的原代肝细胞一般认为是较不期望的并且不适用于长期实验。很大一部分冷冻保存的原代人类肝细胞批次(batch)属于后一类的不可铺板或可铺板性差的肝细胞，这限制了许多具有诸如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)等期望供体规格的批次对于诸如测试药物代谢、毒性或病毒感染等应用的可用性。需要改善原代人肝细胞的可铺板性，功能稳定性和培养寿命。
发明内容
本发明涉及铺板(plated)人肝细胞及其制备和用途。
提供一种产品，其在表面上包含铺板人肝细胞。至少70％的铺板肝细胞在饲养细胞上的一个或多个肝细胞簇中。所述饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞，并附着至表面。在所述产品中，一个或多个肝细胞簇中至少90％的铺板肝细胞可以是直接的肝细胞-肝细胞接触。一个或多个肝细胞簇可以覆盖至少50％的表面。所述表面可具有至少3mm的最短直径。
所述产品可以进一步包含培养基，并且至少90％的铺板肝细胞在表面上保留至少7天或42天。
所述铺板肝细胞可产生白蛋白和/或表达细胞色素P450。
所述内皮细胞可以是人细胞。例如，所述内皮细胞可以是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。所述内皮细胞可以不是肝细胞。所述内皮细胞可以不增殖。所述内皮细胞可以是原代细胞或最多培养7代。所述内皮细胞可以不是永生的。
所述成纤维细胞可以是人细胞。例如，所述成纤维细胞可以是人真皮成纤维细胞。所述成纤维细胞可以不是肝细胞。所述成纤维细胞可以不增殖。所述成纤维细胞可以是原代细胞或最多培养7代。所述成纤维细胞可以不是永生的。
在所述产品中，铺板肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞比例可以为3:1:1至24:1:1。
所述铺板肝细胞可从单个供体中获得。铺板肝细胞可从两个或多个供体中获得。每个供体可以已患有微脂肪变性(microsteatosis)和/或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
还提供一种制备铺板人肝细胞的方法。制备方法包括在存在饲养细胞的情况下，将人肝细胞施加至表面，所述饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞，在施加步骤之后，将所施加的肝细胞与饲养细胞共培养，并且通过饲养细胞上共培养的肝细胞形成一个或多个肝细胞簇，所述饲养细胞附着至表面。至少85％的共培养的肝细胞在一个或多个肝细胞簇中。在没有饲养细胞的情况下，所施加的肝细胞在所述表面上可具有小于60％的可铺板性。在没有饲养细胞的情况下，所施用的肝细胞在所述表面上可具有至少85％的可铺板性。一个或多个铺板肝细胞簇可以覆盖至少50％的表面。所述表面可具有至少3mm的最短直径。
根据所述制备方法，至少90％的铺板肝细胞可在表面上保留至少7天或42天。所述饲养细胞可在施加步骤之前或在共培养步骤中附着至表面。可以将所述肝细胞在施加步骤之前冷冻。
所述制备方法可以排除细胞外基质蛋白的添加。
对于各制备方法，提供根据所述方法制备的铺板肝细胞。
提供一种测试药物的方法。所述方法包括以有效改变铺板肝细胞特性的量向所述铺板肝细胞施用药物。所述铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。所述药物可以选自由以下组成的组：小分子、抗体、活病毒、病毒载体、寡核苷酸和细胞。
提供一种测试药物代谢的方法。所述方法包括将有效量的药物施用于铺板肝细胞，并测定所述铺板肝细胞中所述药物的量。所述铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。
提供一种测试药物转运的方法。所述方法包含将有效量的药物施用于所述铺板肝细胞，并确定所述药物在所述铺板肝细胞中的位置。所述铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。
提供一种测试药物毒性的方法。所述方法包含将有效量的药物施用于所述铺板肝细胞，并检测有活力的铺板肝细胞。所述铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。
提供一种制备乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝细胞培养模型的方法。所述方法包含用乙型肝炎病毒(HBV)接种所述铺板肝细胞，并孵育感染的铺板肝细胞至少14天。所述铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。
提供一种用于将肝细胞铺板的试剂盒。所述试剂盒包含：第一冷冻管，其包含原代肝细胞；第二冷冻管，其包含内皮细胞；第三冷冻管，其包含成纤维细胞；和根据本发明的方法用原代肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞制备铺板人肝细胞的说明书。第二冷冻管和第三冷冻管可以相同。第一冷冻管、第二冷冻管和第三冷冻管可以相同。
附图说明
图1显示根据本发明的一个实施方案的人肝细胞共培养的示意图#1(Schematic#1)。该示意图提供具有时间表(timeframe)的细胞培养和分析的制备工艺。根据示意图#1，通过在第0天将人肝细胞接种至预铺板的饲养细胞上来制备肝细胞共培养物，所述饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞。EC，内皮细胞；Fb，成纤维细胞；MG，基质胶(MATRIGEL)。
图2显示根据本发明另一个实施方案的人肝细胞共培养的示意图#2。该示意图提供具有时间表的细胞培养和分析的制备工艺。根据示意图#2，通过在第0天将人肝细胞与饲养细胞一起接种来制备肝细胞共培养物，所述饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞。EC，内皮细胞；Fb，成纤维细胞；MG，基质胶。
图3显示用于肝细胞共培养的人细胞的形态：单独的真皮成纤维细胞(左上)，单独的永生化肝窦内皮细胞(中上)，单独的原代肝细胞(右上)，成纤维细胞和内皮细胞的混合物(左下)，以及原代肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞的混合物(右下)。
图4显示铺板一周后通过qRT-PCR测定的在肝细胞单培养(单培养)、肝细胞与饲养细胞的共培养(共培养)或饲养细胞培养(饲养)中白蛋白、CyP450 1A2、CyP450 2B6和CyP450 3A4基因的表达水平。在共培养中，这四个基因中的每一个的表达水平均显著高于单培养。*，p<0.05；**，p<0.01。
图5显示在诱导前和诱导后铺板后7天，基于在单培养或共培养中的接种的肝细胞数目，归一化的CyP450 1A2、CyP450 2B6或CyP450 3A4活性。*，p<0.05；**，p<0.01。
图6显示在肝细胞培养2周内通过ELISA测定的白蛋白(ALB)和尿素的分泌。与单培养相比，共培养的肝细胞分泌的白蛋白和尿素的水平显著更高。Mono，单培养；Co，共培养；*，p<0.05；**，p<0.01。
图7显示在单培养(左)或与内皮细胞和成纤维细胞共培养(右)中悬浮级人原代肝细胞的显微观察。从接种后的第二天开始，单培养的肝细胞开始脱落，而在共培养中铺板的大多数肝细胞仍保持良好的附着状态。
图8显示与单培养中的可铺板级肝细胞相比，共培养中的悬浮级肝细胞表现出相似或更高的CyP450 1A2(上)和CyP450 3A4(下)表达水平。与单培养相比，可铺板级和悬浮级肝细胞在共培养中均显示出更高的代谢活性。Mono-U，单培养未诱导；Mono-I，单培养诱导；Co-U，共培养未诱导；Co-I，共培养诱导。
图9显示与单培养中的可铺板级的肝细胞相比，共培养中的悬浮级肝细胞表现出相似或更高的白蛋白(左)和尿素(右)分泌水平。与单培养相比，可铺板级和悬浮级肝细胞在共培养中均显示出更高的功能性白蛋白和尿素分泌。Mono-U，单培养未诱导；Mono-I，单培养诱导；Co-U，共培养未诱导；Co-I，共培养诱导。
图10显示在常规的夹心培养条件(单培养)下将人原代肝细胞维持约7天的培养。在培养的4周内观察六批肝细胞，包括三批可铺板级肝细胞和三批悬浮级肝细胞。大多数肝细胞在培养的第7天左右脱落。
图11显示在共培养中，铺板至内皮细胞和成纤维细胞混合物上的肝细胞维持长达6周。10倍放大。
图12显示铺板后共培养43天的肝细胞的免疫细胞化学染色。白蛋白(右下)和CD31(左下)的染色表明肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞的区域分布。
10倍放大。
图13显示在6周的培养内，与单培养的那些相比，在共培养中表现出更高的CyP4503A4活性水平的肝细胞。CyP450 3A4的活性水平在第3周达到峰值，在共培养中持续代谢活性达6周，而在单培养中则停止了代谢活性。**，p<0.01。
图14显示通过对FITC缀合的CDFDA流出(efflux)至胆小管的成像而观察的在共培养中人肝细胞的功能性胆汁分泌。10倍放大。
图15显示来自三个独立批次的肝细胞，并在共培养条件下合并这三个批次，维持长达6周。在接种至内皮细胞和成纤维细胞的混合物后，第二天将肝细胞用基质胶覆盖。10倍放大。
图16显示，在共培养中，从三个不同批次合并的肝细胞可以维持长达6周。肝细胞在内皮细胞和成纤维细胞的混合物上培养而没有覆盖的基质胶。10倍放大。
图17显示在不滴加基质胶的共培养的肝细胞中白蛋白(左)和尿素(右)的分泌水平与在滴加基质胶的共培养中的肝细胞中白蛋白和尿素的分泌水平相似。MG，滴加基质胶；无MG，不滴加基质胶；D4，第4天；D7，第7天。
图18显示在不滴加基质胶的共培养的肝细胞中CyP450 3A4的表达水平与滴加基质胶共培养长达6周的肝细胞中CyP450 3A4的表达水平相似。MG，滴加基质胶；无MG，不滴加基质胶。
图19显示来自三个不同批次的人原代肝细胞测定的CyP450 3A4代谢活性与来自共培养长达6周的三个不同批次的合并的肝细胞的CyP450 3A4代谢活性相似。
图20显示不同来源的内皮细胞支持肝细胞培养。永生化的肝窦内皮细胞(SEC)和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)都可支持肝细胞培养。
图21显示通过在永生化肝窦内皮细胞(SEC)或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上共培养的肝细胞的CyP450 1A2和CyP450 3A4的相似的表达水平。D4，第4天；D7，第7天。
图22显示永生化肝窦内皮细胞(SEC)或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上共培养的肝细胞的白蛋白和尿素的相似的分泌水平。D4，第4天；D7，第7天。
图23显示在不同细胞比例下共培养的肝细胞的形态。HH，人肝细胞；Fb，成纤维细胞；EC，内皮细胞。
图24显示以不同比例与内皮细胞和成纤维细胞共培养的肝细胞的CyP450 1A2和CyP450 3A4的表达水平。与其他比例的那些相比，肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞比例为12:1:1的细胞混合物显示出最高的CyP450 1A2和CyP450 3A4表达水平。CTRL，非诱导对照；Ind，诱导。
图25显示在共培养的肝细胞上作为乙型肝炎病毒(HBV)细胞受体的牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)在多个时间点的表达水平。
图26显示在共培养物中肝细胞和饲养细胞的区域分布。细胞核的大小在Image J软件上从整个图像视野(左)和肝细胞簇(右)中进行测量。
图27是根据本发明的一个实施方案的共培养系统的示意图。
具体实施方式
本发明提供铺板肝细胞及其制备和用途。本发明基于以下发现：将人肝细胞与内皮细胞和成纤维细胞共培养改善人肝细胞的可铺板性、功能稳定性和培养寿命。
本文所用的术语“铺板肝细胞”是指以直接和间接两者任一个附着至表面或饲养细胞层的人肝细胞。本文所用的术语“可铺板性”或“可铺板的”是指肝细胞附着至诸如塑料或经处理的表面(例如，培养皿或多孔板)的表面的能力，例如在预定时间段内(例如0.5、1、2、3、4、5、6或12小时)将肝细胞暴露至表面。肝细胞的可铺板性的特征在于能够在预定时间段内通过例如饲养细胞或非细胞物质(即不是细胞的物质)直接或间接附着至表面的细胞的百分比。
本文所用的术语“饲养细胞”是指除肝细胞以外的协助肝细胞保持活力和功能的细胞。饲养细胞的实例包括成纤维细胞和内皮细胞。非细胞物质可以是化合物和/或生物分子。非细胞物质的实例包括细胞外基质蛋白、血流动力学条件、旁分泌和自分泌因子、粘附蛋白和多糖。
例如，在预定的时间段内，如果至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞能够附着至表面，则可认为肝细胞是可铺板的。
例如，在预定的时间段内，如果有不超过70％、65％、60％、55％，50％、45％或40％的细胞能够附着至表面，则可认为肝细胞是非/弱可铺板性的。
本文所用的术语“肝细胞簇”是指3D结构中两个或多个肝细胞组。肝细胞中至少约70％、80％、90％、95％或99％的肝细胞可以是直接的肝细胞-肝细胞接触，这可以通过存在间隙连接蛋白(例如连接蛋白32)或紧密间隙连接相关蛋白(例如，闭合蛋白、ZO-1、连接蛋白-1和连接蛋白-4)来证明。
除了细胞-细胞相互作用和存在细胞连接以外，共培养系统中肝细胞的整体形状和3D结构保持它们的正常结构和功能，包括细胞信号通路和正常的基因表达程序。共培养系统会随着时间的推移维持肝细胞的整体3D结构和形状，从而增强它们细胞-细胞的相互作用，并防止细胞扩散和正常肝表型的丧失。相反，肝细胞保持为单培养物(mono-cultures)，尤其是在亚融汇条件下，会随着时间的推移丧失其细胞形状和结构，并开始扩散，并且在周围基质细胞及其支持性ECM因子缺失的情况下变得“更薄”(丧失其高度)。随着肝细胞广泛扩散，这种细胞形状的恶化开始显示出相应重要功能的减少和丧失、基因表达程序的改变以及对药物化合物反应的改变。
本文所用的术语“功能稳定性”或“功能稳定的”是指在预定时间段内肝细胞的一种或多种基本肝细胞功能的稳定性。基本的肝细胞功能包括白蛋白和尿素合成速率、细胞色素P450酶活性速率以及可诱导的细胞色素P450水平。肝细胞的功能稳定性的特征在于，在预定的时间段，例如随后的1、2、3、4、5或6天或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周(例如，最多28或42天)后，例如在从供体分离后的最初一段时间内，例如在最初的4至6天的期间在培养中维持的细胞最初的基本功能的百分比。在预定的时间段后，如果至少50％、60％、70％、80％，90％，95％或99％的细胞的基本肝细胞功能得以保留，例如，没有超过5％、10％、15％、20％或25％的偏差，则认为肝细胞功能是稳定的。
本文所用的术语“培养寿命”是指保持活力和功能的肝细胞的寿命。附着至表面的细胞也称为铺板细胞。至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的细胞在附着至表面一段预定的时间，例如1、2、3、4、5或6天或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周的同时可以保持活力。有活力的肝细胞通过例如产生白蛋白和尿素以及细胞色素P450的酶促活性来证明具有功能。
如本文所用，术语“肝细胞”是指已经从一个或多个供体中分离或获得并且尚未进行预定传代次数(例如0、1、2、3、4或5次传代)培养的原代肝细胞。如本文所用，术语“合并的肝细胞”是指从两个或多个供体中分离然后混合的原代肝细胞。基于某些基因分型信息可以将肝细胞从供体中进行选择。
本文使用的术语“供体”是指具有肝脏的活的哺乳动物。哺乳动物可以是人、牛、猪、狗、猫、非人灵长类动物、啮齿动物例如大鼠或小鼠、马、山羊、绵羊或鹿。供体可以是患有肝病或病症，例如微脂肪变性、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)或肝炎(例如，A、B、C、D和E)的人。来自NASH疾病肝脏的肝细胞可以表达如细胞角蛋白18等标志物。
本文所用的术语“内皮细胞”是指任何内皮细胞。内皮细胞可以是原代人细胞，例如人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。内皮细胞可以不是肝细胞。内皮细胞可从脐带、肝、肺、肾、脑、脾、淋巴结、心脏、肠或其他动脉、静脉或毛细血管中分离。内皮细胞可以不增殖。内皮细胞可以是原代细胞或培养最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12代的细胞。内皮细胞可以不是永生的。
本文所用的术语“成纤维细胞”是指任何成纤维细胞。成纤维细胞可以是原代人细胞，例如人真皮成纤维细胞。成纤维细胞可从皮肤、肺、膀胱、角膜或其它组织类型中分离。成纤维细胞可以不是肝细胞。成纤维细胞可以不增殖。成纤维细胞可以是原代细胞或培养最多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12代的细胞。成纤维细胞可以不是永生的。
饲养细胞可以通过在培养的第7代或之前将培养的真皮成纤维细胞和HUVEC失活和冷冻来制备。饲养细胞的失活可以用丝裂霉素C或γ射线照射完成，然后通过PCNA和BrdU两者任一个或细胞计数进行验证。可以将失活的饲养细胞冷冻，以每小瓶制备一个共培养板。可以将每批饲养细胞进行测试以确保质量标准，例如但不限于细胞数量、生存力、细胞倍增时间、无菌性和纯度。本文使用的成纤维细胞和内皮细胞对本文使用的肝细胞可没有干扰或具有低的干扰。本文所用的术语“干扰”是指肝细胞的典型特征，例如生物学活性。例如，成纤维细胞和内皮细胞可具有不超过约0％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、7％、10％、20％、30％或40％的白蛋白分泌、代谢清除、诱导、转运蛋白活性或共培养所用的肝细胞的其他生物活性。成纤维细胞和内皮细胞可具有约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的细胞活力。成纤维细胞与如HUVEC等内皮细胞的比例可在约1:10至约10:1，例如约1:1、1:2、2:1或任何其他所需比例的范围内，通过例如成纤维细胞标志物(例如，TE-7)和内皮标志物(例如，CD31)的表达来证明。饲养细胞可以不含支原体和内毒素。
如本文所用，术语“共培养”是指在培养基中包含两种或多种细胞类型的培养。如本文所用，术语“肝细胞共培养”是指在培养基中包含肝细胞和饲养细胞的培养，所述饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞。肝细胞和饲养细胞的细胞比例可以在约1:40至约40:1的范围内，而饲养细胞中成纤维细胞和内皮细胞的细胞比例可以在约1:10至约10:1的范围内。肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞的细胞比例可以为3:1:1、6:1:1、12:1:1至24:1:1。将肝细胞和饲养细胞的细胞比例以及饲养细胞中成纤维细胞和内皮细胞的细胞比例进行调节以改善共培养中的肝细胞的可铺板性或寿命。
提供一种在培养基中包含细胞的组合物。所述细胞可以由肝细胞(例如人肝细胞)和饲养细胞组成，所述饲养细胞可以包括内皮细胞和成纤维细胞。肝细胞可以是可铺板的。肝细胞可以是功能稳定的。肝细胞可以具有培养寿命。
细胞通常在发展为促进细胞的所需特性(例如，生长)的培养基中培养。肝细胞通常在期望的细胞浓度范围内在肝细胞铺板培养基中培养。成纤维细胞通常在期望的细胞浓度范围内在成纤维细胞培养基中培养。内皮细胞通常在期望的细胞浓度范围内在内皮细胞培养基中培养。当肝细胞与内皮细胞和成纤维细胞共培养时，肝细胞铺板培养基、成纤维细胞培养基和内皮细胞培养基将有助于形成用于铺板和/或共培养的细胞的共培养铺板培养基。
为了使肝细胞与内皮细胞和成纤维细胞达到期望的细胞比例，可以将共培养铺板培养基的组成进行调节。共培养铺板培养基可包含肝细胞铺板培养基、成纤维细胞培养基和内皮细胞培养基，其体积比为约(5-30):(1-5):(1-5)，例如约10:1:1至约20:1:1。在一个实施方案中，共培养铺板培养基的肝细胞培养基、内皮细胞培养基和成纤维细胞的比例可以为12:1:1，这意味着十二份肝细胞铺板培养基、一份内皮细胞培养基以及一份成纤维细胞培养基。
肝细胞铺板培养基可以是补充有10％热失活的FBS(Gibco 10082-147)、1×NEAA(非必需氨基酸，Sigma M7145)、1mM丙酮酸钠(Gibco11360-070)、5μg/mL胰岛素和5μM地塞米松的DMEM(杜尔贝克改良的伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)，Gibco21063-029)。肝细胞铺板培养基可以是补充有10mM HEPES(Fisher BP299100)、1×谷氨酰胺(Gibco 35050061)、1×ITS-A(Gibco 51300-044)和10μM地塞米松的WEM(威廉氏E培养基(William's E Media)，Gibco A1217601)。
内皮细胞培养基可以购自LifeLine。内皮细胞培养基可以是VasulLife基础培养基，5ng/mL rh-FGF-b、50μg/mL抗坏血酸、1μg/mL氢化可的松、2％FBS、10mM L-谷氨酰胺、15ng/mL rh IGF-1、5ng/mL rh EGF、5ng/mL rh VEGF和0.75U/mL肝素硫酸盐。
成纤维细胞培养基可以是补充有10％FBS的DMEM高葡萄糖(Gibco 11995-065)。
在一个实施方案中，在内皮细胞和成纤维细胞存在的情况下，至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少85％的肝细胞是可铺板的。在另一个实施方案中，在没有内皮细胞和成纤维细胞的情况下，少于100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％，例如少于60％的肝细胞是可铺板的。
可以将组合物中的肝细胞(例如，人肝细胞)铺板。至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，例如至少90％的铺板肝细胞在预定时间段，例如至少1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42或49天，例如至少7或42天附着至表面的同时可以保持活力和功能。
提供一种在表面上包含铺板肝细胞的产品。至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少70％的铺板肝细胞在饲养细胞上的一个或多个肝细胞簇中。饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞，并附着至表面。一个或多个肝细胞簇中至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少90％的铺板肝细胞可以是直接的肝细胞-肝细胞接触。一个或多个肝细胞簇可覆盖至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少50％的表面。表面可具有至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或100mm的最短直径。
产品可以进一步包含培养基。培养基可以是肝细胞铺板培养基、内皮细胞培养基和成纤维细胞培养基的混合物。至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少90％的铺板肝细胞在表面上保留至少3、4、5、6、7、14、21、28或42天。
铺板肝细胞可表现出肝细胞的一种或多种基本肝细胞功能。例如，铺板肝细胞可产生白蛋白和/或表达细胞色素P450。
内皮细胞可以是人细胞。例如，内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。内皮细胞可以不是肝细胞。内皮细胞可以不增殖。内皮细胞可以是原代细胞或最多培养3、4、5、6、7、8、9或10代，例如7代的细胞。内皮细胞可以不是永生的。
成纤维细胞可以是人细胞。成纤维细胞可以是人真皮成纤维细胞。成纤维细胞可以不是肝细胞。成纤维细成胞可以不增殖。成纤维细胞可以是原代细胞或最多培养3、4、5、6、7、8、9或10代，例如7代的细胞。成纤维细胞可以不是永生的。
在产品中，铺板肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞可具有任何可改善肝细胞可铺板性的细胞比例，例如从3:1:1、6:1:1、12:1:1至24:1:1。
铺板肝细胞可以从单个、两个或多个供体中获得。每个供体可患有肝疾病或病况，例如微脂肪变性或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
提供一种制备铺板人肝细胞的方法。制备方法包括：在存在饲养细胞的情况下，将人肝细胞施加于表面，其中饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞，在施加步骤之后，将所施加的肝细胞与饲养细胞共培养，并通过在饲养细胞上共培养的肝细胞形成一个或多个肝细胞簇，其中饲养细胞附着至表面。至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少70％的共培养的肝细胞在一个或多个肝细胞簇中。
在不存在饲养细胞的情况下，所施加的肝细胞在表面上可具有小于70％、65％、60％、55％、50％、45％或40％，例如小于60％的可铺板性。在不存在饲养细胞的情况下，所施加的肝细胞在表面上可具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，例如至少85％的可铺板性。
一个或多个肝细胞簇可以覆盖至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少50％的表面。表面可具有至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或100mm的最短直径。一个或多个肝细胞簇中至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100，例如至少90％的肝细胞可以是直接的肝细胞-肝细胞接触。
在存在内皮细胞和成纤维细胞的情况下在预定的时间段，例如至少1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35、42或49天，例如7或42天内至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％，例如至少90％的铺板肝细胞保持铺板，即附着至表面。肝细胞可以与内皮细胞和成纤维细胞共培养不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1天，例如不超过3天。
根据本发明的制备方法，内皮细胞和/或成纤维细胞可以在肝细胞附着至表面之前、附着至表面时或附着至表面之后附着至表面。可以在共培养步骤之前或共培养期间将内皮细胞和/或成纤维细胞附着至表面。
制备方法可以排除其他细胞外基质蛋白。其他的细胞外基质蛋白可以选自由以下组成的组：胶原蛋白基质，例如BioCoat，或大鼠尾部胶原蛋白、HuGentra基质、基质胶和HuBiogel。
制备方法可以进一步包含冷冻铺板肝细胞。
对于每种制备方法，提供制备的铺板肝细胞。
提供一种测试药物的方法。该方法包括以有效改变铺板肝细胞特性的量向铺板肝细胞施用药物。铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。药物可以选自由以下组成的组：小分子、抗体、活病毒(例如，乙型或丙型肝炎)、病毒载体、寡核苷酸和细胞。
提供一种测试药物代谢的方法。该方法包括将有效量的药物施用于铺板肝细胞。铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。如本文所用，术语“药物代谢”是指药物的转化或清除。该方法进一步包含确定铺板肝细胞中药物的量。
提供一种测试药物转运的方法。该方法包括将有效量的药物施用于铺板肝细胞。铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。该方法进一步包含确定铺板肝细胞中药物的细胞摄取和分布。
提供一种测试药物毒性的方法。该方法包括将有效量的药物施用于铺板肝细胞。铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。该方法进一步包括检测毒性事件。毒性事件的检测可以通过剩余有活力的铺板肝细胞的降低的百分比来证明。
提供一种制备乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝细胞培养模型的方法。该方法包括用乙型肝炎病毒(HBV)接种铺板肝细胞，并将感染的铺板肝细胞孵育至少7、14或21天，例如14天。HBV感染的肝细胞培养模型得以制备。铺板肝细胞可以在本发明的产品中或根据本发明的方法制备。该方法可进一步包括确定肝细胞的肝特异性胆汁酸转运蛋白，例如牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)的转录或表达水平，选择一批具有所需的NTCP转录或表达水平的肝细胞，在用乙型肝炎病毒(HBV)接种铺板肝细胞之前，根据本发明的方法铺板所选择的肝细胞批次。本发明可不需要蛋白质基质的覆盖物以增加病毒接种效率。具有所需的NTCP水平的悬浮级肝细胞批次可用于HBV接种，并适合长期培养研究。
提供根据本发明的用于将肝细胞铺板的试剂盒。该试剂盒包含：第一冷冻管，其包含原代肝细胞；第二冷冻管，其包含内皮细胞；第三冷冻管，其包含成纤维细胞；和根据本发明的方法用原代肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞制备铺板人肝细胞的说明书。第二冷冻管和第三冷冻管可以相同。第一冷冻管、第二冷冻管和第三冷冻管可以相同。该试剂盒可包含来自单个供体的肝细胞冷冻管，或来自多个供体的肝细胞冷冻管。该试剂盒包含肝细胞共培养系统的测试结果或分析证书(COA)。该试剂盒包含制备方法的用户指导方案。该试剂盒包含用于解冻、铺板和培养肝细胞、成纤维细胞和内皮细胞的培养基。
提供一种制备肝细胞共培养系统的方法。该方法包括从供体的肝脏中分离肝细胞，添加成纤维细胞和内皮细胞至分离的肝细胞，以及冷冻与成纤维细胞和内皮细胞混合的肝细胞。该方法可进一步包括在培养中生长细胞，其中所述细胞由肝细胞、成纤维细胞和内皮细胞组成。供体可以是动物，优选人。
提供一种即用型肝细胞共培养系统。该共培养肝细胞系统包含具有培养孔或带有或不带有ECM底物涂层的培养孔的组织培养板，附着至培养孔表面的成纤维细胞和内皮细胞层以及附着至成纤维细胞和内皮细胞上的肝细胞层或细胞层，形成肝细胞簇或肝细胞岛。肝细胞簇(也称为肝细胞岛)在接种至成纤维细胞和内皮细胞上或与成纤维细胞和内皮细胞一起接种后会自行组装。肝细胞簇或肝细胞岛内的肝细胞保持直接的肝细胞-肝细胞接触。肝细胞产生诸如钙黏着蛋白和连接蛋白等肝细胞-肝细胞粘附分子。共培养系统中高于70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的肝细胞将分布在肝细胞簇中，并保持直接的肝细胞-肝细胞接触。高于20％、25％、30％、40％，50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的培养孔表面由肝细胞簇覆盖。本文所用的肝细胞可以来自单个供体或来自多个供体。共培养系统中的内皮细胞可以在培养过程中形成血管样结构(图27)。
实施例1.共培养的人肝细胞
将与人真皮成纤维细胞和内皮细胞共培养的人原代肝细胞进行表征。在该实施例中，悬浮级肝细胞的可铺板性小于70％，而可铺板级肝细胞的可铺板性至少为70％。
1.方法
1.1人原代肝细胞的分离和冷冻保存
人原代肝细胞分离自人供体，然后将其储存在液氮中。
1.2人真皮成纤维细胞和内皮细胞的来源
人真皮成纤维细胞分离自成年皮肤，并以TE-7表达为特征。人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分离自脐带，并以CD31和血管内皮(VE)-钙黏着蛋白表达为特征。永生化肝窦内皮细胞(SEC)购自abm Inc。将第0代或第1代的真皮成纤维细胞和内皮细胞都冷冻在含有10％DMSO(Sigma)的冷冻培养基中。
1.3用于共培养的失活饲养细胞层的制备
成年真皮成纤维细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM(杜尔贝克改良的伊格尔培养基，Gibco)高葡萄糖中繁殖并生长至融汇。HUVEC和SEC都在购自Lonza的内皮细胞增殖培养基中生长至融汇。融汇后，将细胞通过用TrypLE(Gibco)或胰蛋白酶-EDTA(Gibco)的酶消化进行传代。两种酶的任一者用于从组织培养表面脱离细胞，并形成细胞悬浮液，其可以计数。然后，将悬浮液中的细胞通过增加细胞悬液的体积以较低密度接种，并将细胞悬浮液转移至具有比先前接种所用的组织培养塑料更大表面积的组织培养塑料上。将细胞以10,000至15,000个细胞/cm2的密度接种，并在细胞达到融汇后以约每5至7天进行传代。在使细胞有丝分裂失活和冷冻之前，使细胞最多传代五次。
因为丝裂霉素C或γ射线通过引起双链断裂而使细胞失活，所以丝裂霉素C用于失活融汇细胞和/或内皮细胞。失活的细胞是有丝分裂失活的，并且不增殖。简而言之，将细胞用杜尔贝克(Dulbecco's)磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Gibco,Paisley,UK)冲洗3次，与10μg/ml丝裂霉素C(Sigma)在37℃下孵育3小时，然后用DPBS冲洗3次。失活后，将成纤维细胞和内皮细胞立即用TrypLE解离以进行细胞计数，然后将其以1-2百万个细胞/ml的浓度重悬于低温保存培养基中。然后将细胞等分置于冷冻小管中，并在-80℃下保存过夜。在第二天，将细胞转移至液氮条件下进行长期保存。
1.4将悬浮级和可铺板级人肝细胞接种至失活的作为内皮细胞和成纤维细胞混合物的饲养细胞上
将由人真皮成纤维细胞和内皮细胞组成的饲养细胞解冻，并以25,000细胞/cm2的密度接种至胶原蛋白涂覆(BioCoat,Corning)或无基质涂覆两者任一个的普通组织培养塑料24孔或96孔板上。测试的饲养细胞密度为12,500细胞/cm2至100,000细胞/cm2)。
接种饲养细胞后30分钟，将原代人肝细胞以150,000个细胞/cm2的密度接种(示意图C1)。传统上，将肝细胞以250,000个细胞/cm2接种至胶原蛋白涂覆的组织培养板上。肝细胞密度可以在共培养系统中调节，以允许或多或少的肝细胞相互作用以及肝细胞的附着率的考虑。可选地，可以通过将饲养细胞和肝细胞混合至均匀的悬浮液中来进行饲养细胞和肝细胞的一起铺板，然后将饲养细胞和肝细胞一起接种至胶原蛋白涂覆的平板上(示意图#2)。接种肝细胞后4-6小时，更换培养基以去除未附着的细胞和细胞碎片。更换培养基之前的孵育时间或摇动条件可依所用培养板的类型(例如6孔、12孔、24孔、48孔、96孔或384孔板)而变化。
接种肝细胞后16-20小时，将如基质胶等细胞外基质滴加至培养物中以诱导肝细胞成熟。没有添加细胞外基质的培养平台是成功的。
1.5共培养条件下肝细胞的长期培养
传统的可铺板的肝细胞单培养模型允许长达7天的培养和分析高级别的肝细胞，这由于其细胞膜破裂而开始扩散并最终失去其功能。在共培养模型中，将可铺板级肝细胞和悬浮级肝细胞接种至饲养细胞上，以研究其直至6周的形态和功能。在整个培养期间每天更换培养基。肝细胞培养基含有威廉姆斯E培养基(Gibco)中的HEPES(Fisher)、GlutaMAX(Gibco)、ITS+(胰岛素、转铁蛋白、硒络合物、BSA和亚油酸、Gibco)、地塞米松(Sigma)和丙酮酸钠(Gibco)。
在研究肝细胞典型的立方体形态、胆小管的形成、CyP450酶活性以及白蛋白和尿素分泌中，在整个培养的6周中，将共培养的肝细胞每天用12:1:1的HHCM培养基饲喂，该培养基是肝细胞培养基、内皮细胞培养基和成纤维细胞培养基的体积比为12:1:1的混合物。
1.6合并多个供体的肝细胞消除供体之间的差异
肝细胞的附着率、形态、蛋白质表达和酶功能的变化主要归因于其供体。将来自无论是悬浮级还是可铺板级的多个供体中的肝细胞合并，以确定是否可以减少或消除其中的一些变异。将来自3-10个或更多个不同供体中的肝细胞分别解冻、计数并等量混合在一起。将合并的肝细胞以及来自每个供体中的肝细胞分别以150,000个细胞/cm2接种至成纤维细胞和内皮细胞的饲养层上。在冷冻肝细胞之前或之后，将肝细胞合并在一起。
1.7共培养条件下肝细胞的表征
将悬浮级或可铺板级的肝细胞以25,000个细胞/cm2接种至失活的饲养细胞上，共培养6周。在整个培养的六周中，它们典型的立方体和多核肝细胞形态通过胆小管中5-(-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(CDFDA,Invitrogen)的流出而可见。
1.8共培养的肝细胞的CyP450活性
按照制造商的说明，将共培养的肝细胞的CyP450 1A2、CyP450 2B6和CyP450 3A4活性在Promega的P450-GloTM分析中进行分析。对于CyP450 1A2，用100μM奥美普唑(Omeprezole)诱导样品48小时，对于CyP450 2B6，用100nM CITCO诱导样品48小时，对于CyP450 3A4，用25μM利福平诱导样品48小时。
经过数周的测试后，样品允许恢复五天，然后在分析前将培养基调换回诱导培养基以另外诱导48小时。对过去六周内诱导和未诱导样品中的活性水平进行分析。
1.9蛋白质和基因表达
将用过的培养基样品进行收集，并在整个培养的六周中评估来自共培养的肝细胞的白蛋白和尿素水平。在整个培养的六周中，对白蛋白、尿素、CyP450 1A2、CyP450 2B6和CyP450 3A4的基因表达水平每周进行评估。将共培养的肝细胞在培养1周、2周和6周后进行固定，并对白蛋白、CD31、CD90、CyP450 1A2、CyP450 2B6和CyP450 3A4染色。
1.10胆小管的形成
在共培养的肝细胞内，5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(CDFDA)的流出在荧光显微镜下可见。将共培养的肝细胞用DPBS(-Ca/-Mg)漂洗两次，然后在37℃下、5％的CO2中与3:1:1HHCM一起孵育10分钟，然后与含有5μM CDFDA的3:1:1HHCM在37℃下、5％的CO2中一起孵育进行20分钟。然后将细胞用DPBS(-Ca/-Mg)冲洗两次，然后在不含酚红的完全培养基中成像。
2.人肝细胞在内皮细胞和成纤维细胞混合物上共培养的示意图：具有时间表的细胞培养和分析。
2.1示意图#1
在示意图#1中，将人原代肝细胞接种至用作为饲养细胞的内皮细胞和成纤维细胞的混合物预先铺板的表面上(图1)。
接种饲养细胞后30-60分钟，将肝细胞添加到饲养细胞中，在肝细胞铺板培养基、内皮细胞培养基和成纤维细胞培养基的体积比为3:1:1的铺板培养基混合物(也称为3:1:1HHPM)中建立具有细胞比为3:1:1的肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞的肝细胞共培养。将共培养的细胞置于37℃、5％CO2下，并在肝细胞共培养的第一小时中以N-S和E-W方式每15分钟摇动四次。
在接种肝细胞后4-6小时，将铺板培养基混合物改变为内皮细胞培养基、成纤维细胞细胞培养基和肝细胞培养基的体积比为3:1:1的培养基混合物。
接种肝细胞后20-24小时，培养基混合物成为用过的培养基，并替换为新鲜的肝细胞平板培养基、内皮细胞培养基和成纤维细胞培养基的体积比3:1:1的混合物，也称为3:1:1HHCM。如果将细胞外基质如基质胶在培养基混合物中稀释并添加至细胞，则随后每天用新鲜的3:1:1HHCM替换培养基混合物。
在第4天和第7天两者任一天对细胞色素P450(CyP450)的水平通过Promega的P450GloTM测定法进行确定。
胆小管通过CDFDA的流出，在一周测定的第5天可见。该测定可以在整个扩展培养中重复多次。
蛋白表达通过免疫细胞化学(ICC)染色和ELISA进行检测。ELISA用于检测和定量白蛋白和尿素。将ELISA应用于培养24小时后收集的300μl用过的培养基。将未诱导和诱导的样品在第7天和整个长期培养的不同时间点固定以用于ICC。也将细胞样品在Trizol中速冻，以用于后续的RNA提取和qPCR分析。
2.2示意图#2
在示意图#2中，将人原代肝细胞、内皮细胞和成纤维细胞一起接种(图2)。示意图#2与示意图#1相同，不同之处在于，非增殖饲养细胞在冷冻前先与人肝细胞混合，然后同时复活、离心、重悬，以100,000细胞/cm2至775,000细胞/cm2的密度接种至胶原蛋白涂覆的组织培养塑料板上，所用密度取决于预期的应用和肝细胞的等级。
3.共培养的肝细胞与单培养的肝细胞
将人原代肝细胞接种至饲养细胞(内皮细胞和成纤维细胞的混合物)上，以按照示意图#1或#2建立共培养，或者在没有饲养细胞的情况下接种至表面上以建立单培养。按照示意图#1或#2下制备的共培养肝细胞的肝细胞特性(例如，形态或基因表达)没有显著差异。按照示意图#1或#2共培养的肝细胞显示出较单培养的肝细胞更好的肝细胞特性(例如，形态或基因表达)。
与单培养的肝细胞相比，共培养的肝细胞显示出更好的培养寿命和更多的肝细胞形态(图3)。
与单培养的肝细胞相比，共培养的肝细胞在第7天显示显著更高的CyP450 1A2、CyP450 2B6和CyP450 3A4基因表达(图4)。
共培养的肝细胞在第7天在48小时单培养的肝细胞诱导后，显示出更高的CyP4501A2活性和CyP450 2B6活性。此外，在第7天，共培养的肝细胞显示出与单培养的肝细胞相似的诱导的CyP450 3A4活性(图5)。
通过ELISA测定，2周培养的共培养的肝细胞与单培养的肝细胞相比分泌显著更高水平的白蛋白和尿素(图6)。
4.与单培养的可铺板级肝细胞相比，共培养的悬浮级人原代肝细胞的性能改善
表征为悬浮级的肝细胞无法维持融汇的单层达数天。通过添加更多的细胞来调节供体的附着率并不能改善肝细胞的附着和融汇。即使接种更多的肝细胞以调节特定供体的附着率，可以相信，额外的碎片也将阻止细胞附着。悬浮级肝细胞的这种无法附着阻止了典型肝细胞形态或功能的显示。在肝细胞共培养中添加由成纤维细胞和内皮细胞组成的饲养细胞层改善悬浮级肝细胞的附着、形态和功能(图7-9)。
到第4天，大多数共培养的悬浮级人原代肝细胞仍保持附着，而大多数单培养的悬浮级人原代肝细胞从未附着至表面或从表面脱离(图7)。
共培养的肝细胞比单培养的肝细胞也显示出细胞功能的改善。在第4天和第7天，共培养的悬浮级肝细胞也显示比单培养的悬浮级肝细胞改善的CyP450 1A2活性和CyP4503A4活性，并在第7天全天保持较高水平。在第4天和第7天，共培养的悬浮级肝细胞的CyP4501A2活性与单培养的可铺板级肝细胞的CyP450 1A2活性相似。在第4天和第7天，共培养的悬浮级肝细胞的CyP450 3A4活性高于可铺板级肝细胞的CyP450 3A4活性(图8)。通过ELISA检测，共培养的悬浮级肝细胞和可铺板级肝细胞显示出比单培养的悬浮级肝细胞和可铺板级肝细胞更高的和持续的白蛋白和尿素表达。在第4天和第7天，共培养的悬浮级肝细胞显示出比单培养的可铺板级肝细胞更高的白蛋白和尿素表达(图9)。
5.共培养的肝细胞形态的寿命、标志物表达、代谢活性和功能性胆汁分泌
大多数单培养的悬浮级人原代肝细胞没有附着至表面，而附着至表面的那些在最多培养一周后开始从表面脱离。可铺板级肝细胞最初以高效率附着至表面，但到培养的第7天开始从表面分离并失去其立方体形态。可铺板肝细胞在培养超过11天后仍未保持附着状态(图10)。
将共培养的悬浮级肝细胞维持6周或更长时间。立方体肝细胞形态明显得以维持，因为肝细胞在非增殖性成纤维细胞和内皮细胞饲养层的紧密岛上保持附着6周(图11)。没有测试更长的时间点。肝细胞和饲养细胞之间的相互作用通过白蛋白和CD31染色可见。将肝细胞整合至支持饲养层中作为复杂的细胞网络。如白蛋白和CyP450 3A4染色可见，肝细胞功能在该网络中得以维持(图12)。共培养的悬浮级肝细胞的CyP450 3A4活性维持6周。共培养的悬浮级肝细胞的高活性与夹心单培养所培养的相同肝细胞的CyP450 3A4的低活性相反(图13)。培养6周的共培养的悬浮级肝细胞发展并维持了胆小管的功能网络(图14)。
6.共培养的肝细胞的寿命：在存在或不存在基质胶的情况下，共培养中肝细胞的成熟诱导
共培养的肝细胞不需要基质胶或任何其他细胞外基质即可维持其形态、功能或寿命。在第1至6周中，具有或不具有基质胶的共培养悬浮级肝细胞的形态都非常相似(图15和16)。具有或不具有基质胶的肝细胞都与它们的饲养层形成了紧密的细胞岛和网络。培养6周后，饲养细胞和肝细胞之间的相互作用通过ICC可见，并且在整个6周中观察到胆小管(数据未显示)。在具有或不具有基质胶培养的情况下在肝细胞中均未观察到形态差异。基质胶的存在不影响共培养的肝细胞的功能。对于具有或不具有基质胶的共培养的肝细胞，在培养的6周内，白蛋白和尿素浓度以及CyP450 3A4活性保持恒定(图17和18)。
来自不同供体的单培养的和共培养的肝细胞在形态、蛋白质表达和酶活性方面显示出显著的变异。可以将来自多个供体的肝细胞合并在一起以标准化这些变异。共培养系统中来自三个供体的合并的肝细胞的附着率、融汇和脂质蓄积似乎已标准化(图15和16)。当与来自单个供体的肝细胞相比时，合并的肝细胞的CyP450 3A4酶活性似乎是平均水平或略高于平均水平(图19)。合并来自三个以上的供体的肝细胞的标准化作用对于体外测试应用是有用的。
饲养层可以由多种类型的内皮细胞和成纤维细胞组成。对含有窦内皮细胞或HUVEC的饲养细胞层上共培养的人肝细胞的形态和功能进行比较。在形态(图20)、CyP450活性(图21)或白蛋白和尿素的分泌(图22)方面未观察到显著差异。
7.共培养的肝细胞的最佳细胞混合比例
将12,500个细胞/cm2至100,000个细胞/cm2的饲养层密度在共培养系统中进行测试。尽管不同饲养细胞密度下的单个肝细胞形态看起来相似，但较低密度的饲养细胞允许更多的肝细胞-肝细胞相互作用(图23)。共培养的肝细胞在12,500个细胞/cm2(24:1:1)或25,000个细胞/cm2(12:1:1)的饲养细胞密度下比在50,000个细胞/cm2(6:1:1)或100,000个细胞/cm2(3:1:1)的较高密度下的那些显示出更高的CyP450 1A2活性和CyP450 3A4活性(图24)。
8.用于肝细胞共培养的多种培养板
在24孔和96孔板两者任一个中的内皮细胞和成纤维细胞上共培养的肝细胞表现出相似的特征，例如形态(图25，左和中图)、白蛋白分泌水平(图26)和生物标志物表达(图27)。与在胶原蛋白涂覆的BioCoat板上共培养的肝细胞相比，在没有胶原蛋白涂覆的普通组织培养塑料上共培养的肝细胞显示出相似的形态(图25，右图)和生物标志物的表达模式(图27)。
到目前为止，即使仅使悬浮级肝细胞共培养，也可以预期，可铺板级肝细胞将保持相似的高级形态和功能长达6周或更长时间。可以预料，更高级别的细胞甚至在彼此之间发展出更复杂的网络，并且与饲养细胞可以更快发展出更复杂的网络。
实施例2.HBV感染模型(NTCP表达)
NTCP(钠/牛磺胆酸盐共转运多肽)表达对于肝细胞摄取HBV是必需的。用免疫细胞化学检测发现共培养的肝细胞在第7、11、14、19和21天表达NTCP。固定细胞，使其通透，并与一抗SLC10A1(abcam 131084)以1:100的浓度在4℃下孵育过夜。将二抗Alexa Fluor 488山羊抗兔(Invitrogen A11008)在1:1000的浓度下于4C孵育1小时，以检测一抗。用Hoechst对细胞进行反染色。通过在BMG CLARIOstar上进行全孔荧光扫描对NTCP表达定量(图25)。因此，NTCP的表达通过三周共培养的肝细胞得以维持。
实施例3.细胞和培养基的最佳比例
对每平方厘米12,500、25,000、50,000和100,000个细胞的饲养细胞接种密度进行测试，以用于肝细胞的附着和簇形成。对每平方厘米150,000、250,000、375,000个细胞的肝细胞接种密度进行测试。也对肝细胞培养基、内皮细胞培养基和成纤维细胞培养基的培养基比例进行测试，以获得理想的细胞比例。每平方厘米12,500至25,000个细胞的饲养细胞比例和每平方厘米150,000个细胞的肝细胞接种密度显示最高的附着率、簇形成和肝细胞功能。还发现与细胞比例匹配的中等比例可以最大程度地支持肝细胞的形态和功能。
实施例4.肝细胞簇
接种饲养细胞后的最初几分钟内，一层由成纤维细胞和内皮细胞组成的饲养细胞附着至组织培养塑料表面。将饲养细胞以足够稀疏的密度接种，以允许饲养细胞扩散、迁移并覆盖组织培养塑料表面。然后，将肝细胞附着至饲养细胞的顶部上，并相互迁移形成成簇的肝细胞。根据肝细胞的特性，这种肝细胞迁移发生在最初的一个小时或最多48小时内。一旦肝细胞簇形成，相邻的肝细胞就形成功能性胆小管和紧密连接。从第4天开始，通过CDFDA的流出使胆小管可见。在第7天，使用免疫细胞化学使连接蛋白带状闭合蛋白1和连接蛋白32可见。簇中至少90％的肝细胞显示紧密的间隙连接，表明直接的肝细胞-肝细胞接触。
实施例5.簇测量
将可铺板的优质肝细胞通过分析与总细胞区域相比未被肝细胞簇占据的区域内的总面积和细胞核特征来进行评估。将悬浮的优质肝细胞通过与整个细胞培养面积相比分析簇所占的区域来进行评估。饲养细胞和肝细胞通过它们各自核的大小来区分。成纤维细胞和内皮细胞的平均核大小比肝细胞的平均核大小大。饲养细胞的平均核大小通过在共培养中单独测量饲养细胞的核大小得以确定。将平均饲养细胞面积的阈值加一个标准偏差用于区分肝细胞和饲养细胞。使用的阈值是小于345像素^2的肝细胞核面积。所有测量均使用ImageJ进行(图26)。
本文引用的所有文件、书籍、手册、论文、专利、公开的专利申请、指南、摘要和/或其他参考文献均通过引用全文并入本文。通过考虑本文公开的发明的说明书和实践，本发明的其他实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。说明书和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真实范围和精神由所附权利要求指示。

Claims (46)

1.一种产品，其在表面上包含铺板人肝细胞，其中至少70％的铺板肝细胞在饲养细胞上的一个或多个肝细胞簇中，其中所述饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞并附着至所述表面。
2.根据权利要求1所述的产品，其中所述一个或多个肝细胞簇中至少90％的所述铺板肝细胞是直接的肝细胞-肝细胞接触。
3.根据权利要求1所述的产品，其中所述一个或多个肝细胞簇覆盖至少50％的所述表面。
4.根据权利要求1所述的产品，其中所述表面具有至少3mm的最短直径。
5.根据权利要求1所述的产品，其进一步包含培养基，其中至少90％的所述铺板肝细胞在所述表面上保留至少7天。
6.根据权利要求1所述的产品，其进一步包含培养基，其中至少90％的所述铺板肝细胞在所述表面上保留至少42天。
7.根据权利要求1所述的产品，其中所述铺板肝细胞产生白蛋白。
8.根据权利要求1所述的产品，其中所述铺板肝细胞表达细胞色素P450。
9.根据权利要求1所述的产品，其中所述内皮细胞是人细胞。
10.根据权利要求1所述的产品，其中所述内皮细胞是人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。
11.根据权利要求1所述的产品，其中所述内皮细胞不是肝细胞。
12.根据权利要求1所述的产品，其中所述内皮细胞不增殖。
13.根据权利要求1所述的产品，其中所述内皮细胞是原代细胞或培养至多7代。
14.根据权利要求1所述的产品，其中所述内皮细胞不是永生的。
15.根据权利要求1所述的产品，其中所述成纤维细胞是人细胞。
16.根据权利要求1所述的产品，其中所述成纤维细胞是人真皮成纤维细胞。
17.根据权利要求1所述的产品，其中所述成纤维细胞不是肝细胞。
18.根据权利要求1所述的产品，其中所述成纤维细胞不增殖。
19.根据权利要求1所述的产品，其中所述成纤维细胞是原代细胞或培养至多7代。
20.根据权利要求1所述的产品，其中所述成纤维细胞不是永生的。
21.根据权利要求1所述的产品，其中所述铺板肝细胞、所述内皮细胞和所述成纤维细胞的细胞比例为3:1:1至24:1:1。
22.根据权利要求1所述的产品，其中所述铺板肝细胞获自单个供体。
23.根据权利要求22所述的产品，其中所述供体患有微脂肪变性。
24.根据权利要求22所述的产品，其中所述供体患有非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
25.根据权利要求1所述的产品，其中所述铺板肝细胞获自两个或多个供体。
26.一种制备铺板人肝细胞的方法，其包括：
(a)在存在饲养细胞的情况下将人肝细胞施加至表面，其中所述饲养细胞是内皮细胞和成纤维细胞，
(b)在步骤(a)之后，将施加的肝细胞与所述饲养细胞共培养，和
(c)通过在所述饲养细胞上的共培养的肝细胞形成一个或多个肝细胞簇，其中所述饲养细胞附着至所述表面，其中至少85％的所述共培养的肝细胞在所述一个或多个肝细胞簇中，从而制备铺板人肝细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中在不存在所述饲养细胞的情况下，步骤(a)中的施加的肝细胞在所述表面上的可铺板性小于60％。
28.根据权利要求26所述的方法，其中在不存在所述饲养细胞的情况下，步骤(a)中的施加的肝细胞在所述表面上的可铺板性为至少85％。
29.根据权利要求26所述的方法，其中一个或多个铺板肝细胞簇覆盖至少50％的所述表面。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述表面具有至少3mm的最短直径。
31.根据权利要求26所述的方法，其中至少90％的铺板肝细胞在所述表面上保留至少7天。
32.根据权利要求26所述的方法，其中至少90％的铺板肝细胞在所述表面上保留至少42天。
33.根据权利要求26所述的方法，其中在步骤(a)之前将所述饲养细胞附着至所述表面。
34.根据权利要求26所述的方法，其中在步骤(b)中将所述饲养细胞附着至所述表面。
35.根据权利要求26所述的方法，其中所述方法排除细胞外基质蛋白的添加。
36.根据权利要求26所述的方法，其中将所述肝细胞在步骤(a)之前冷冻。
37.铺板肝细胞，其根据权利要求26-36中任一项所述的方法制备。
38.一种测试药物的方法，其包含以有效改变铺板肝细胞特性的量向根据权利要求1-25中任一项所述的产品中的铺板肝细胞或根据权利要求37所述的铺板肝细胞施用药物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述药物选自由以下组成的组：小分子、抗体、活病毒、病毒载体、寡核苷酸和细胞。
40.一种测试药物代谢的方法，其包括将有效量的药物施用于根据权利要求1-25中任一项所述的产品中的铺板肝细胞或根据权利要求37所述的铺板肝细胞，并确定所述铺板肝细胞中所述药物的量。
41.一种测试药物转运的方法，其包括将有效量的药物施用于根据权利要求1-25中任一项所述的产品中的铺板肝细胞或根据权利要求37所述的铺板肝细胞，并确定所述铺板肝细胞中所述药物的位置。
42.一种测试药物毒性的方法，其包括将有效量的药物施用于根据权利要求1-25中任一项所述的产品中的铺板肝细胞或根据权利要求37所述的铺板肝细胞，并检测有活力的铺板肝细胞。
43.一种制备乙肝病毒(HBV)感染的肝细胞培养模型的方法，其包括
(a)用乙型肝炎病毒(HBV)接种根据权利要求1-25中任一项所述的产品中的铺板肝细胞或根据权利要求37所述的铺板肝细胞，和
(b)将感染的铺板肝细胞孵育至少14天，从而制备HBV感染的肝细胞培养模型。
44.一种用于将肝细胞铺板的试剂盒，其包含
(a)第一冷冻管，其包含原代肝细胞，
(b)第二冷冻管，其包含内皮细胞，
(c)第三冷冻管，其包含成纤维细胞，和
(d)根据权利要求26-36中任一项所述的方法用所述原代肝细胞、所述内皮细胞和所述成纤维细胞制备铺板人肝细胞的说明书。
45.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述第二冷冻管和所述第三冷冻管是相同的。
46.根据权利要求44所述的试剂盒，其中所述第一冷冻管、所述第二冷冻管和所述第三冷冻管是相同的。
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