WO2006000464A2

WO2006000464A2 - Verfahren zum auffinden schmerzrelevanter substanzen unter verwendung schmerzrelevanter proteine

Info

Publication number: WO2006000464A2
Application number: PCT/EP2005/007087
Authority: WO
Inventors: Eberhard Weihe; Annete Bieller; Kay Hofmann; Stefan Tomiuk; Clemens Gillen; Matthias Dreger; Ferdinand Hucho; Joanna Mika; Martin-K.H. SCHÄFER
Original assignee: Grünenthal GmbH
Priority date: 2004-06-28
Filing date: 2005-06-28
Publication date: 2006-01-05
Also published as: DE102004031116A1; WO2006000464A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden schmerzrelevanter Substanzen unter Verwendung der Proteine KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1 /KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETM1, PID 12832121 /FLJ20420 und PGRL sowie die Verwendung der durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierter Verbindungen in Arzneimitteln und Diagnostika sowie in der Schmerztherapie. Die Erfindung betrifft ferner die neue Nukleinsäure- und Aminosäure-Gesamtsequenzen, des Maus BAB31214 Proteins sowie die Nukleinsäure- und Aminosäure-Teilsequenzen des humanen KIAA0378 Proteins und des Ratten PID12832121 Proteins.

Description

Anmelder: Grünenthal GmbH

Verfahren zum Auffinden schmerzrelevanter Substanzen unter Verwendung schmerz¬ relevanter Proteine

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Auffinden schtnerzrelevanter Substanzen unter Verwendung der Proteine KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LElMl, PID12832121/FLJ20420 und PGKL sowie die Verwendung der durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierter Verbindungen in Arzneimitteln und Diagnostika sowie in der Schmerztherapie. Die Erfindung betrifft ferner die neue Nuklein- säure- und Aminosäure Gesamtsequenz, des Maus BAB31214 Proteins sowie die Nukleinsäu¬ re- und Aminosäureteilsequenzen des humanen KIAA0378 Proteins und des Ratten PID12832121 Proteins.

Im Stand der Technik stehen zur Therapie von Schmerzen ^■unterschiedliche Arzneimittel, wie z.B. Acetylsalicylsäure, Paracetamol, Dipyrone, Tramadol, Morphin und Fentanyl, zur Verfü¬ gung. Daneben kommen auch Substanzen, wie Amitryptüin und Ketamin, zur Behandlung von Schmerzpatienten zum Einsatz. Die Therapie von Schmerzen gewinnt zunehmend an Bedeutung, sodass die Therapieschemata von Schmerzzuständen, insbesondere chronischen Schmerzzuständen, kontinuierlich verfeinert werden.

So brachte die Schmerzforschung der letzten Jahre die grundlegende Erkenntnis, dass der Entwicklung insbesondere chronischer Schmerzzustände plastische Veränderungen des Ner¬ vensystems, insbesondere in den nozizeptiven Neuronen der Hinterwurzelganglien und der Neurone im Bereich der Dorsalhörner des Rückenmarks, zugrunde liegen (als Überblick sie- he: Coderre et al. 1993; Zimmermann & Herdegen, 1996). Die neuronale Plastizität geht ein¬ her mit Veränderungen in der Expression bestimmter Gene und führt zur lang anhaltenden Veränderung des Phänotyps der betroffenen Neuronen. Das Konzept der neuronalen Plasti- zität wurde bisher vor allem auf Entwicklungs-, Lern- und Regenerationsprozesse angewandt. Neuere Befunde aus der Schmerzforschung zeigen allerdings, dass dieses Konzept auch bei pathophysiologischen Vorgängen greift (Tolle, 1997).

Die Chronifizierung des Schmerzes ist tierexperimentell auf phänomenologischer Ebene be¬ reits relativ gut charakterisiert. Die Induktion chronischer Schmerzzustände fuhrt insbesonde¬ re zu folgenden Veränderungen:

erhöhte Empfindlichkeit und verringerte Reizschwelle peripherer Nozizeptoren, Aktivierung so genannter stiller Nozizeptoren, - Reorganisation rezeptiver Felder, Erregbarkeitszunahme im Rückenmark.

In der Schmerzwahmehmung kommt neben den Nozizeptoren, als primäre sensorische Affe- renzen, auch den nachgeschalteten Neuronen im Dorsalhorn des Rückenmarks eine besonde- re Bedeutung zu. Eine Chronifizierung des Schmerzes erfolgt durch die Erregbarkeitszunah¬ me der nachgeschaltenen Neurone im Rückenmark. Diese Erregbarkeitszunahme wird auch als „zentrale Sensitivierung" bezeichnet. Ebenfalls wird die Übertragung von Signalen (elektri¬ schen Impulsen) von den Nozizeptoren auf die nachgeschaltete Neurone durch inhibitόrische oder exzitatorische Interneurone moduliert. Dieser veränderten Signalübertragung wird auch einen Anteil an der Chronifizierung bzw. dem Versagen herkömmlicher Analgetika zuge¬ schrieben.

Das dorsale Rückenmark stellt somit eine der wichtigsten Schaltstellen der nozizeptiven Neu- rotransmission dar. Hier werden nozizeptive Signale sowohl verarbeitet als auch moduliert. Das subzelluläre Kompartiment der beteiligten Neurone, das bei den oben aufgeführten Schmerz-assozierten Vorgängen die wichtigste Rolle spielt, stellt die prä- und postsynaptische Membran dar. Hier wird präsynaptisch die Transmitterauschüttung reguliert und es werden postsynaptisch die Neurotransmitter detektiert, was zu einer Aktivierung oder Inhibition des entsprechenden Neurons führt. Diese Funktionen werden in erster Linie von den synapti- sehen Membranproteinen der dorsalen Rückenmarksneuronen ausgeübt. Trotz zunehmend weiterentwickelter Therapien kann bei chronischen Schmerzzuständen jedoch oft keine dauerhafte Verbesserung für den Patienten erzielt werden. Unter anderem sind hierfür die dauerhaften Veränderungen beteiligter Nervenzellen ursächlich. In derartige dauerhafte Veränderungen von Nervenzellen sind Proteine, insbesondere die erwähnten sy- naptischen Membranproteine des dorsalen Rückenmarks, involviert, deren Identifizierung und Charakterisierung im Stand der Technik bislang unzureichend erfolgt ist. Solche Proteine spielen eine wichtige Rolle als molekulare Targets für die Entwicklung neuer Analgetika und insbesondere für entsprechende Screeningverfahren, d.h. für Verfahren, mit denen Substan¬ zen aufgefunden/identifiziert werden, die als Analgetika verwendet werden können.

Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, zum einen Proteine zu identi¬ fizieren, die eine Rolle bei chronischen Schmerzzuständen spielen, sowie zum anderen ein Verfahren bereitzustellen, mit welchem unter Verwendung dieser identifizierten Proteine po¬ tenziell schmerzregulierende Substanzen aufzufinden sind.

Zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe wurde daher zunächst unter Anwendung opti¬ mierter proteinchemischer Methoden eine selektive Analyse der in dem dorsalen Rücken¬ marksgewebe, genauer in den dorsalen Rückenmarksneuronen, lokalisierten synaptischen Membranproteine vorgenommen. Anhand nachfolgender Untersuchungen wurden diese als Proteine charakterisiert, die in die Schmerzregulierung involviert sind und somit neue An¬ griffspunkte zur Behandlung von Schmerzen, insbesondere chronischer Schmerzen, darstel¬ len. Im Detail wurde die Auftrennung subzellulärer Fraktionen (Myelin, synaptische Membranen, leichte Membranen etc.) mittels zweidimensionaler 16-BAC/SDS-PAGE als einem für integrale Membranproteine kompatiblen Trennsystem vorgenommen und anhand der Ergebnisse eine Proteomkarte des dorsalen Rückenmarks erstellt. Ausgehend von synaptischen Membranen konnten nach genannter Auftrennung im zweidimensionalen 16- BAC-SDS-PAGE insgesamt 55 Proteine identifiziert werden. Hiervon wurden insbesondere erfindungsgemäß relevante Proteine weitergehend charakterisiert.

Erfindungsgemäß können die derart identifizierten Proteine in einem Verfahren eingesetzt werden, mit dem schmerzregulierende Substanzen aufgefunden werden können, die in der Therapie von insbesondere chronischen Schmerzen appliziert werden können. Somit ist ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Auffinden schmerzregulierender Substanzen, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer Zelle und/odet einer Präparation aus einer solchen Zelle, die mindestens ein Protein ausge¬ wählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens ein Protein umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder min- destens ein Protein, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz ge¬ mäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/ oder ein Protein, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter sttin- genten Bedingungen mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines der vorgenannten Protein synthetisiert hat, (b) Messung der Bindung der Testsubstanz an das mindestens eine von der Zelle synthetisier¬ te Protein oder funktionelle Fragment oder funktionelle Derivat hiervon oder Messung mindestens eines der durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein oder funktionel- Ie Fragment oder funktionelle Derivat hiervon veränderten funktionellen Parameters.

Das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die potentielle schmerzregu¬ lierende Wirksamkeit einer Substanz über die Wechselwirkung dieser Substanz mit einem Schmerz-regulierten Protein oder einem Protein mit einer schmerzrelevanten Verteilung im zentralen Nervensystem (ZNS), wie sie erfindungsgemäß beschrieben werden, identifiziert werden kann.

„Schmerzregulierend" ist eine Substanz im Sinne dieser Erfindung dann, wenn sie einen po¬ tentiell regulierenden Einfluss auf das physiologische Schmerzgeschehen nimmt. Insbesonde- re stellt dieser regulierende Einfluss eine analgetische Wirkung dar. Unter einer „Substanz" wird erfindungsgemäß eine chemische Verbindung verstanden, die potentiell eine Wirkung im Körper entfalten kann, insbesondere jede als Arzneimittelwirkstoff geeignete Verbindung. Hierzu gehören beispielsweise niedermolekulare Wirkstoffe, Nukleinsäuren, Fette, Zucker, Peptide (Polypeptide) oder Proteine, Antikörper. „Niedermolekular" ist erfindungsgemäß ein Molekül mit einem Molekulargewicht < 2 kDa. Ein „Wirkstoff im Sinne der Erfindung ist eine Verbindung, die in einem Organismus, an den sie verabreicht wurde, eine Veränderung, insbesondere eine heilende Wirkung, hervorruft. Es handelt sich hierbei vorzugsweise um organisch-chemisch synthetisierte Moleküle, insbesondere um Moleküle, die an die Verfah¬ rens-Proteine und -Polypeptide (vorliegend die Bezeichnung für ein Protein bzw. Polypeptid, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann) binden.

Eine „zu testende Substanz" bzw. „Testsubstanz" gemäß der Erfindung ist eine wie vorste¬ hend definierte Substanz, für die eine potentielle schmerzregulierende Wirkung angenommen wird. Eine solche Testsubstanz wird mit einer erfindungsgemäßen Zelle bzw. einer Präparati¬ on aus solch einer Zelle unter geeigneten Bedingungen inkubiert, d.h. Testsubstanz und Zelle werden in einem wässrigen Medium für einen bestimmten Zeitraum (Inkubationszeit) zur Reaktion gebracht. Die Inkubationszeit ist abhängig von der Art der Substanz und der damit verbundenen Wechselwirkung mit einem Verfahrens-Protein. Sie kann wenige Sekunden bis mehrere Stunden betragen, bevorzugt beträgt sie zwischen 1 Minute und 60 Minuten. Das wässrige Medium kann vorzugsweise zwischen 4° C und 40° C temperiert werden, vorzugs¬ weise liegt die Temperatur bei Raumtemperatur oder bei 37° C. Eine solche Temperierung des wässrigen Mediums kann beispielsweise in einem Brutschrank oder Wasserbad erfolgen. Bevorzugt enthält das wässrige Medium geeignete Salze und/oder Puffersysteme, die das wässrige Medium bei einem gewünschten pH-Wert halten, welcher vorzugsweise zwischen pH 6 und pH 8, bevorzugt pH 7,0 und pH 7,5 liegt. Weitere Substanzen, wie z.B. Coenzyme und Nährstoffe, können dem wässrigen Medium zugefügt werden. Dem Fachmann sind sol- che geeigneten Inkubationsbedingungen und deren Variationsmöglichkeiten gut bekannt. Im allgemeinen handelt es sich hierbei um physiologische Bedingungen (beispielsweise 37° C, pH 7,2) oder um Bedingungen, die eine optimale Messung gemäß des erfindungsgemäßen Ver¬ fahren ermöglichen.

Unter einer erfindungsgemäßen „Zelle" wird eine Zelle verstanden, die ein Verfahrens- Protein oder ein erfindungsgemäßes Protein, wie es nachfolgend definiert wird, oder ein funk¬ tionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines solchen Proteins synthetisiert. Hier- bei kann es sich tun Zellen handeln, die ein Verfahrens-Protein oder erfindungsgemäßes Pro¬ tein endogen exprimieren oder aber um Zellen, die gentechnisch manipuliert wurden, und auf diese Weise ein Verfahrens-Protein oder erfindungsgemäßes Protein exprimieren. Erfin¬ dungsgemäße Zellen können sowohl aus immortalisierten Zelllinien oder aus nativem Gewe- be stammen. Die Zelle kann separat kultiviert werden oder einen Teil eines Gewebes, insbe¬ sondere eines Organs, darstellen, in dem die Zelle vereinzelt oder noch im Zellverband vor¬ liegt. Vorzugsweise wird eine solche Zelle jedoch aus dem Gewebe isoliert und der Zellver¬ band aufgelöst.

Eine „Präparation" aus einer erfindungsgemäßen Zelle stellt ein durch chemische, biologi¬ sche, mechanische oder physikalische Behandlung hergestelltes Präparat dar, wobei eine sol¬ che Behandlung die Zellstruktur verändert. Bei solchen Präparationen handelt es sich bei¬ spielsweise um Membranfragtnente, isolierte Kompartimente der Zelle, isoliertes Cytosol, aus Gewebe gewonnenes Homogenat oder eine Suspension isolierter Zellorganellen.

Bei einem in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren „Protein" handelt es sich um ein Protein, aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL aus¬ gewählt ist. Diese Proteine werden durch die aufgeführten Aminosäuren bzw. Nukleinsäuren codiert. Bei den vorgenannten Proteinen handelt es sich um Proteine, die als schmerzreguliert oder schmerzrelevant verteilt identifiziert wurden. Wie bereits erwähnt, wurde hierzu eine Proteomkarte des dorsalen Rückenmarks eines Tieres, insbesondere einer Ratte, durch die Auftrennung subzellulärer Fraktionen, wie Myelin, synaptische Membranen, leichte Membra¬ nen usw., gefolgt von der Identifizierung von Membranproteinen erstellt. Von insgesamt 55 identifizierten Proteinen wurden insbesondere die vorgenannten erfindungsgemäß relevanten Proteine näher analysiert. Hierzu wurde zunächst eine Veränderung der Expressionsmuster untersucht, indem die Expression der Proteine in einem Tier, in dem Schmerz ausgelöst wur¬ de, mit einem Kontroll-Tier, das keinen schmerzauslösenden Maßnahmen unterzogen wurde, verglichen wurde. Des weiteren wurden in in situ — Hybridisierungsexperimenten die zelluläre Lokalisation der mRNA-Transkripte der vorgenannten erfindungsgemäß relevanten Proteine untersucht. Aufgrund der vorgenommenen Untersuchungen wurde eine veränderte Expressi¬ on bzw. eine schmerzrelevante Verteilung der vorgenannten erfindungsgemäß relevanten Proteine iα schmerzinduzierten Tieren festgestellt. Die vorgenannten Proteine KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL werden nachfolgend als „in dem erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbare Proteine" oder „in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare Proteine" oder auch als „erfindungsgemäße Verfahrens-Proteine" bezeichnet. Für das erfin¬ dungsgemäße Verfahren ist es irrelevant, aus welcher Spezies die Verfahrens-Proteine stam¬ men, es ist jedoch bevorzugt, die humane, Maus- oder Ratten-Variante einzusetzen.

Nachfolgend werden die erfindungsgemäßen Verfahrens-Proteine näher beschrieben:

KIAA0378 Hierbei handelt es sich um das humane Protein KIAA0378, welches in der Datenbank als sp:O15083 bzw. embl:AB002376 registriert ist. Dieses Protein ist in der Datenbank uncharak- terisiert und mit einer unvollständigen Sequenz registriert. Erfindungsgemäß ist es gelungen, die fehlende N-terminale Aminosäuresequenz sowie die dazugehörige Nukleinsäuresequenz zu identifizieren. Die komplettierte Aminosäuresequenz enthält nunmehr 149 zusätzliche Aminosäurereste am N-Terminus (siehe Figur 11). Die entsprechende Nukleinsäuresequenz ist in Figur 12 dargestellt.

KIAA0378 besteht hauptsächlich aus einem ausgedehnten coiled-coil Bereich, der vermutlich eine Rolle bei der Oligomerisierung des Proteins spielt. Lediglich die ersten 140 Aminosäure¬ reste liegen nicht in einer coiled-coil Struktur vor. Das Protein weist weder eine Signal- noch eine Transmembran-Sequenz auf (siehe Fig. 11 und 12).

Erfindungsgemäß konnte ein spezifisches Expressionsmuster von KIAA0378 primärafferen- ten Neuronen, nicht aber im Rückenmark erstmals nachgewiesen werden (siehe Fig. 13). Es zeigt, dass das aus synaptischen Fraktionen des Flinterhorns isolierte KIAA0378 Protein zu¬ mindest zu einem grossen Teil, wenn nicht ausschliesslich, von primär sensorischen Neuro¬ nen stammt, die im Hinterhorn des Rückenmarks enden. Diese selektive Expression von KIAA0378 deutet eindeutig darauf hin, dass KIAA0378 in synaptischen Endigungen des Rückenmarks relevant für die sensorische Signalübertragung im dorsalen Hinterhorn ist. Es kann demnach davon ausgegangen werden, dass KIAA0378 eine wichtige präsynaptische Funktion bei der Neurotransmission von primärafferenten Neuronen auf Neurone im Hin- terhorn des Rückenmarks hat Da praktisch alle DRGs Neurone KIAA0378 exprimieren, ist weiterhin davon auszugehen, dass auch nozizeptive Neurone der C- und A-Delta Faser- Klasse KIAA0378 exprimieren, woraus die schmerzrelevante Rolle von KIAA0378 in nozi- zeptiven Neuronen abgeleitet werden kann. So könnte beispielsweise eine rückenmarksnahe Verabreichung von KIAA0378 Inhibitoren einen „circulus vitiosus" des spinalen Schmerzge¬ dächtnisses unterbrechen.

BAB31214/O9BU64 BAB31214 ist das murine Ortholog zu dem humanen Protein Q9BU64 (Accession Nummern für Protein- und cDNA-Eintrag lauten tr:Q9BU64 und embl:BC 002870). In der Datenbank ist das murine Ortholog zu diesem humanen Protein 8430427C 03RIK bzw. Q9BU64 als Protein Q9CXA4 (Accession Nr. tr:Q9CXA4) registriert. Die im Rahmen der Erfindung vor¬ genommenen Untersuchungen haben jedoch ergeben, dass sich die humane Sequenz deutlich von der murinen Sequenz unterscheidet; sie weicht am C-Terminus des Proteins stark von der Maus-Sequenz ab und führt zu einem deutlich längeren ORF. In der humanen Genomse¬ quenz (Accession-Nummern embLAC 013459 und embl:AC 012073) wurde kein Gegenstück zu der kürzeren Maus-spezifischen Sequenz gefunden. Anhand der Zusammensetzung von Maus EST-Sequenzen ist es erfindungsgemäß gelungen, eine Maus cDNA erhalten, die zwar von der in der Datenbank gespeicherten Sequenz abweicht, jedoch der humanen Sequenz deutlich eher entspricht. Daher ist die in der Datenbank unter der Accession-Nr. tr:Q9CXA4 gespeicherte Sequenz nicht korrekt. Die erfindungsgemäß erhaltene Aminosäure- bzw. Nuk- leinsäure-Sequenz ist in den Figuren 20 und 21 dargestellt. Vorliegend wird die Bezeichnung "BAB31214/Q9BU64" sowohl für das humane Protein als auch für das Maus-Protein ver- wendet, sofern keine spezielle Spezies aufgeführt wird.

BAB31214 enthält einen coiled-coil-Bereich am N-Terminus, Position 1 bis 110. Es ist anzu¬ nehmen, dass dieser Bereich eine Rolle bei der Oligomerisierung des Proteins spielt und zur Interaktion mit anderen coiled-coil-Proteinen dient. Die Untersuchungen des Expressions- musters in verschiedenen Geweben ergab eine Akkumulation der mRNA nur insbesondere im Gehirn und daneben in der Milz (siehe Figur 22). Es kann demnach von einer selektiven Expression von BAB31214 im Nervengewebe ausgegangen werden, so dass sich BAB31214 zur Entwicklung nebenswirkungsarmer Analgetika eignet. Bewältigt wird dies durch zelluläre Lokalisation des BAB31214 Transkriptes in der grauen Substanz des Rückenmarks in den Motoneuronen und im Gehirn.

OPA-I /KIAA0567 Hierbei handelt es sich um das humane Protein OPA-I /KIAA0567, das in der Datenbank mit O_060313 bezeichnet ist: Die orthologen Proteine aus der Ratte und der Maus sind in der Datenbank mit NP_598513 bzw. NP_598269 registriert. Vorliegend wird die Bezeichnung "OPA-I /KIAA0567" sowohl für das humane Protein als auch für die Maus- und Ratten- Proteine verwendet, sofern keine spezielle Spezies aufgeführt wird. OPA-I /KIAA0567 weist eine GTPase Domäne, eine zentrale Dynamin— Domäne und eine hoch-basische N-terminale Region, die für die mitochondriale Lokalisation verantwortlich ist (Delettre et al., 2000), auf. Es wurde von Olichon et al. (2003) angenommen, dass OPA-I /KIAA0567 als Bestandteil der mitochrontrialen Netzwerke ein wichtiger Organisator der inneren Mitochondrienmemb- ran ist, der für die Integrität der sog. Cristae verantwordich ist. Es wurde im Stand der Tech¬ nik festgestellt, dass eine Mutation im OPA-I /KIAAO567-Gen eine autosomal dominat ver¬ erbte Atrophie der Sehnerven (sog. Optic atrophy type 1) verursacht (Alexander et al., 2000), die zur Erblindung führt. Vermutet wurde daher, dass Mutationen im OPA-I /KIAA0567- Gen die mitochondriale Integrität stören und somit zu einer verringerten Energiegewinnung in den Nervenzellen des optischen Nervs führen. Es ist nämlich bekannt,, dass Nervenzellen aufgrund ihres hohen Energiebedarfs extrem empfindlich auf mitochondriale Störungen rea¬ gieren. Es gibt daneben jedoch auch Ansätze im Stand der Technik, die aufgrund einer nach¬ gewiesenen Expression des murinen Orthologs von OPA-I /KIAA0567 im Gehirn eine rein mitochondriale Lokalisation in Frage stellen (Misaka et al. 2002). Erfindungsgemäß wurde OPA-I /KIAA0567 nunmehr als Protein synaptischer Membranen des Dorsalhorns isoliert, dessen Expression hauptsächlich im Gehirn nachgewiesen werden konnte und für das eine ubiquitäre Expression, wie sie für mitochondriale Proteine typisch ist, nicht zu detektieren war. Diese erfindungsgemäßen Erkenntnisse und die Tatsache, dass OPA-I /KIAA0567 zu den mitochondrialen Proteinen gehört, die im nuklearen Genom codiert werden und somit im Gegensatz zu den im mitochondrialen Genom codierten Proteinen auch in anderen Orga¬ nellen vorkommen können, belegen, dass es sich bei OPA-I /KIAA0567 nicht um ein rein mitochondriales Protein handelt. Die der votliegenden Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen des Expressionsmusters in verschiedenen Geweben ergaben die stärkste Akkumulation des OPA-I /KIAA0567 Transkriptes im Gehirn (siehe Figur 33), gefolgt von der Plazenta und dem Uterus. In den weiteren untersuchten Geweben (Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Magen, Dünndarm, Thy¬ mus, Hoden, Skelettmuskel) wurde kein Transkript detektiert. Eine zelluläre Lokalisation von OPA-I /KIAA0567 in schmerzrelevantem Gewebe konnte in den DRGs und in der grauen Substanz des Rückenmarks, in den Motoneuronen und im Gehirn festgestellt werden (s. Fi¬ guren 34 bis 38). Aufgrund der nachgewiesenen relativ selektiven Expression von OPA- 1/KIAA0567 im Nervensystem ist davon auszugehen, dass sich OPA-I /KIAA0567 zur Entwicklung nebenswirkungsarmer Analgetika eignet.

CPG2/KIAA1756 Bei diesem Protein handelt es sich um das Cortical plasticity related protein 2 (CPG2), regist- riert unter der Accession-Nummer NP_062228. Es ist das Ratten-Orthologe zu dem huma¬ nen Protein KIAAl 756 (Accession-Nummer BAB21847) und dem murinen Protein NP_700448. Vorliegend wird die Bezeichnung "CPG2/KIAA 1756" synonym für das huma¬ ne sowie Maus- und Ratten-Proteine verwendet, sofern keine spezielle Spezies aufgeführt wird. Das Ratten-CPG2-Protein wurde als Protein synaptischer Membranen des Dorsalhorns isoliert und hat eine Länge von 491 Aminosäuren, enthält neun Spektrin-Domänen mit ca. 100 Aminosäuren Länge und ist damit ähnlich zu dem Duchenne Muskeldystrophie Protein Dystrophin mit insgesamt 25 Spektrin-Domänen. Weiterhin enthält das GPG2 einen Amino¬ säurenabschnitt von 14 Aminosäuren, von denen 11 Aminosäuren identisch zu einem ähnlich langen Abschnitt des Dystrophin-Poteins sind (Nedivi et al., 1996). Es konnte eine zelluläre Lokalisation von Dystrophin im Gehirn und zwar als Bestandteil der postsynaptischen Dichte (PSD) festgestellt werden (Lidov et al., 1990). PSD spielt eine wichtige Rolle bei der synapti¬ schen Plastizität. Auch CPG2 wurde im Hippocampus und im Kortex mit synaptischer Plas¬ tizität in Verbindung gebracht. Sowohl PSD als auch die synaptische Plastizität der Dorsal- horn-Neurone ist an der Chronifizierung des Schmerzgeschehens beteiligt. Neben der im Stand der Technik bekannten Tatsache, dass das mit CPG2 strukturell verwandte Protein Dystrophin im ZNS Bestandteil der PSD ist, wurde durch die erfindungsgemäßen Erkennt¬ nisse belegt, dass CPG2 sowohl im Dorsalhorn des Rückenmarks als auch in der PSD expri- miert wird und es damit an einet zentralen Stelle der Schmerzweiterleitung lokalisiert ist und zur Entwicklung nebenswirkungsarmer Analgetika geeignet ist.

LETMl Hierbei handelt es sich um das humane Leucin zipper/EF-hand containing transmembrane protein 1 (LETMl) Protein, das in der Datenbank mit NP_036450 bezeichnet ist: Die ortho- logen Proteine aus der Ratte und der Maus sind in der Datenbank mit NP_062668 bzw. XP_223541 registriert. Vorliegend wird die Bezeichnung "LETMl" synonym für das humane Protein sowie für die Proteine aus Maus und Ratte verwendet, sofern keine spezielle Spezies aufgeführt wird. Das humane LETMl Gen konnte durch FISH-Analyse auf Chromosom 4pl6.3 lokalisiert werden. Es handelt sich um ein 739 Aminosäuren langes Protein, enthält zwei Calcium-bindende „EF-Hand" Domänen, ein DNA-bindendes Leucin-Zipper-Motif, eine Transmembrandomäne und mehrere coiled-coil Domänen, die Protein-Protein- Interaktionen bewirken (Endele et al., 1999). Es wurde im Stand der Technik weiterhin fest¬ gestellt, dass das humane LETMl Gen bei fast allen Patienten mit Wolf-Hirschhorn Syndrom (WHS) (Endele et al., 1999), einer Erbkrankheit, die sich vor allem durch kraniofaziale Dys- tnorphien auszeichnet, aufgrund einer chromosomalen Deletion am Ende des kurzen Arms von Chromosom 4 fehlt. Bei dieser Krankheit liegt eine schwere psychomotorische Retatdie- rung vor, häufig begleitet von einer Muskelhypotonie und cerebralen Krampfanfällen. Es wird angenommen, dass das Fehlen von humanem LETMl insbesondere für die cerebralen Krampfanfälle der WHS-Patienten verantwortlich ist (Zollino et al., 2003). Aufgrund der er¬ findungsgemäßen Erkenntnis, dass LETMl als Protein synaptischer Membranen des Dorsal- horns isoliert wurde im Zusammenhang mit der Tatsache, dass humanes LETMl eine Rolle bei der intrazellulären Calcium-Homöostase spielt, deren intrazelluläre Modulation wiederum einen interessanten Angriffspunkt für die spinale Analgesie darstellt, belegt, dass humanes LETMl sowie LETMl im allgemeinen ein molekulares Zielprotein zur Entwicklung nebens¬ wirkungsarmer Analgetika ist.

PID12832121 /FLT20420 PID12832121/FLJ20420 wurde als Protein synaptischer Membranen des Dorsalhorns iso¬ liert. Es ist das Ratten-Orthologe des Maus-Proteins 0610041L09RIK, das in der Datenbank mit tir:Q9CRB9 und für die cDNA mit NMJ325336 verzeichnet ist: Das orthologe humane Protein ist in der Datenbank mit den Accession-Nummern für Protein und cDNA tr:Q9NX63 und embl:BC011596 registriert. Das Ratten-Orthologe ist in der Datenbank nicht registriert, es konnte jedoch erfindungsgemäß eine neue Teilsequenz der cDNA durch Zu- sammensetzung von EST Sequenzen erhalten werden. Vorliegend wird der Begriff "PID12832121/FLJ02420" synonym für das humane Protein und die Proteine aus Maus und Ratte verwendet, sofern keine spezielle Spezies aufgeführt wird. Das Maus-Protein sowie die hierzu engen Verwandten enthalten eine (bislang unpublizierte) Homologiedomäne Mito-C4, die aus der MEMOREC Profüsammlung stammt (ME00694). In der Aminosäuresequenz der Maus liegt diese Domäne im Bereich der Aminosäuren 180 bis 220. Die Mito-C4 Domäne ist bislang mit keiner speziellen Funktion assoziiert. Es handelt sich um eine kurze Homologie¬ domäne von etwa 40 Aminosäuren mit vier invarianten Cystein-Resten, die in vielen kleinen Proteinen vorkommt. Die meisten, wenn nicht alle Proteine, welche die Mito-C4 Domäne enthalten, sind im Mitochondrium lokalisiert, obwohl ihnen jeweils eine mitochondriale Tar- geting-Sequenz fehlt. Die Domäne besteht aus einer 'helical hairpin' Einheit, die durch zwei Disulfidbrücken stablilisiert ist. Dies erklärt u.a. die vier konservierten Cys-Reste. Außer die¬ ser Mito-C4 Domäne findet man im PID12832121/FLJ20420 Protein keine weiteren Homo¬ logiedomänen. Die Region von Aminosäure 50 bis 180 enthält einen putativen coiled-coil Bereich, der wie oben erwähnt ein strukturelles Motiv darstellt, das häufig der Interaktion mit anderen coiled-coil Proteinen dient, insbesondere in der Bildung von homo-Dimeren. Dieser coiled-coil Bereich ist nur gering konserviert zwischen PID12832121/FLJ20420 und seinen engeren Verwandten. Die N-terminale Region ist dagegen stärker konserviert, es wurde je¬ doch keine Ähnlichkeit zu Proteinen außerhalb dieser Subfamilie gefunden. Weiterhin liegen keine Signal- oder Transmembran-Sequenzen vor. Aufgrund der erfindungsgemäßen Er- kenntnis, dass PID 12832121/FLJ20420 als Protein postsynaptischer Membranen des Dorsal- horns isoliert wurde ergibt sich, dass PIDl 2832121 /FLJ20420 zur Entwicklung nebenswir- kungsarmer Analgetika geeignet ist.

PGRL Hierbei handelt es sich um das Prostaglandin regulatory like protein PGRL. Die orthologen PGRL Proteine aus Ratte, Maus und Mensch sind in der Datenbank für Protein und cDNA mit folgenden Accession-Nummern verzeichnet: Ratte: XP_222900 (Protein) und XM_222900 (cDNA), Maus: XP_110315 (Protein) und XM_110315 (cDNA), Mensch: NP_443100 (Protein) und NM_052868 (cDNA). Vorliegend wird der Begriff "PGRL" syn¬ onym für das humane Protein sowie die Proteine aus Maus und Ratte verwendet, sofern keine spezielle Spezies aufgeführt wird. PGRL besitzt eine Länge von 613 Aminosäuren und gehört zu der Ig Superfamilie. Es weist eine N-terminale Signalsequenz, vier Immunglobin- Domänen, drei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen, eine Transmembrandomäne und einen kurzen cytoplasmatischen Bereich auf. Immunpräzipitations- und Mutations-Analysen zeig¬ ten, dass PGRL mit dem Tetraspaninprotein CD81 interagiert (Clark et al., 2001). Die erfin¬ dungsgemäße Erkenntnis, dass PGRL-Transkripte am stärksten im Gehirn (gefolgt von Testis, Herz und Niere und jeweils weiter abnehmend in Leber, Milz, Lunge und Skelettmus¬ kel) nachzuweisen waren, belegt, dass PGRL in die Schmerzregulierung involviert ist und sich somit zur Entwicklung nebenwirkungsarmer Analgetika eignet.

Erfindungsgemäß ist ebenfalls ein Protein umfasst und kann in dem Verfahren der Erfindung eingesetzt werden (Verfahrens-Protein), das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert. „Hybridisierung" im Sinne der Erfindung bedeutet eine durch Basenpaarung erfolgte Ausbil¬ dung eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls aus zwei getrennten Einzelsträngen. „Stringente Bedingungen" bedeuten in diesem Zusammenhang, dass Voraussetzungen vor¬ liegen, bei denen lediglich genau basengepaarte Nukleinsäure-Stränge gebildet werden, die stabil bleiben. Unter einer "Antisense" Nukleinsäure ist eine natürliche oder modifizierte Nukleinsäure zu verstehen, deren Basenabfolge komplementär zur der Basenabfolge mindes¬ tens eines Teilbereichs einer in der Natur vorkommenden RNA ist. Anders ausgedrückt ist unter einer „Antisense Nukleinsäure" der nicht-codierende (antisense) Strang einer Nuklein¬ säure zu verstehen, der die komplementäre Basenabfolge zu dem codierenden (sense) Strang der Nukleinsäure aufweist.

Sofern in der vorliegenden Beschreibung Bezug auf die Verfahrens-Proteine genommen wird, sind ebenfalls die funktionellen Fragmente und funktionellen Varianten der Proteine mitum- fasst. Weiterhin werden erfindungsgemäß die Begriffe „Protein" und „Polypeptid" synonym verwendet. Ebenfalls von der Erfindung erfasst sind funktionelle Fragmente und funktionelle Varianten der Verfahrens-Protein bzw. der nachfolgend definierten erfindungsgemäßen Proteine. „Funktionell" im Sinne der Erfindung bedeutet, dass die Proteine, Fragmente, Varianten eine Rolle bei Schmerzzuständen in dem Organismus, in dem sie vorkommen, spielen, insbeson¬ dere bei der Schmerzregulierung. Dies kann z.B. eine antinozizeptive, antihyperalgetische oder antiallodynische Wirkung sein.

Ein erfindungsgemäßes Fragment bezieht sich sowohl auf Proteine als auch auf Polypeptide und Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung. Es kann sich hierbei um N-terminal, C- terminal oder intrasequenziell verkürzte Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresquenzen handeln. Die Herstellung solcher erfindungsgemäßer Fragmente ist im Stand der Technik gut bekannt und kann von einem Fachmann unter Anwendung von Standardverfahren durchgeführt wer¬ den (s. z.B. Sambrook et al. 2001). Im allgemeinen erfolgt die Herstellung solcher Fragmente durch Modifizieren der Nukleinsäuresequenz, die das native Protein bzw. Polypeptid codiert, gefolgt von einer Transformation dieser Nukleinsäuresequenz in einen geeigneten Wirt und Expression dieser modifizierten Nukleinsäuresequenz, unter der Voraussetzung, dass die Mo¬ difikation der Nukleinsäure die funktionelle Aktivitäten des Proteins bzw. Polypeptids nicht zerstören. Fragmente von Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung können beispielsweise durch Behandlung mit geeigneten Restriktionsenzymen hergestellt werden. Die Identifizie¬ rung erfindungsgemäßer Fragmente kann entweder über die Überprüfung ihrer Funktionalität durch die Messung ihrer biologischen Aktivität erfolgen oder auch anhand einer Sequenzie¬ rung der Fragmente und einem nachfolgenden Vergleich der erhaltenen Sequenz mit der na- tiven Sequenz. Verfahren zur Messung der biologischen Aktivität sowie Sequenzierungsver- fahren sind im Stand der Technik zahlreich und gut bekannt.

Varianten der Erfindung beziehen sich ebenfalls sowohl auf die Proteine als auf die Polypep¬ tide und die Nukleinsäuren gemäß der vorliegenden Erfindung. Als Varianten von Proteinen, Polypeptiden bzw. Nukleinsäuren oder Fragmenten hiervon, werden solche Proteine, PoIy- peptide, Nukleinsäuren oder Fragmente hiervon bezeichnet, die Sequenzunterschiede zu den entsprechenden nativen Sequenzen aufweisen. Bei diesen Sequenzabweichungen kann es sich um eine oder mehrere Insertionen), Deletion(en) und/oder Substitutionen) von Aminosäu- ren handeln, wobei eine Sequenzhomologie von mindestens 60 %, bevorzugt 70 %, stärket bevorzugt 80 %, ebenfalls stärker bevorzugt 85 %, noch stärker bevorzugt 90 % und am meisten bevorzugt 97 % vorliegt.

Um die prozentuale Identität zweier Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen zu bestim¬ men, können die Sequenzen abgeglichen werden, um nachfolgend die Übereinstimmungen bzw. Abweichungen in der Sequenz zu bestimmen. Hierfür können z. B. Lücken in die Se¬ quenz der ersten Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenz eingeführt werden und die Amino¬ säuren bzw. Nukleotide an der sprechenden Position der zweiten Aminosäure- bzw. Nuklein- säuresequenz verglichen werden. Wenn eine Position in der ersten Aminosäuresequenz mit der gleichen Aminosäure bzw. dem gleichen Nukleotid besetzt ist, wie es an einer anderen Position in der zweiten Sequenz der Fall ist, dann sind beide Sequenzen an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Sequenzen. Die Bestimmung der prozentualen Identi- tat zweier Sequenzen kann anhand eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, jedoch nicht beschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich zweier Sequenzen herangezogen werden kann, ist der Algorithmus von Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Ein solcher Algorithmus ist in dem NBLAST- Programm integriert, mit dem Sequenzen identifiziert werden können, die eine gewünschte Identität zu den Sequenzen der vorliegenden Erfindung besitzen. Um einen Lückeή-Abgleich (auch „gapped allignment") wie oben beschrieben, zu erhalten, kann das „Gapped BLAST"-' Programm verwendet werden, wie in Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 beschrieben.

Unter den Begriff Varianten fallen insbesondere auch solche Aminosäure- und Nukleinsäure- sequenzen, die gegenüber den physiologischen Sequenzen konservative Substitutionen auf¬ weisen. Als konservative Substitution werden solche Substitutionen bezeichnet, bei denen Aminosäuren gegeneinander ausgetauscht werden, die aus der gleichen Klasse stammen. Ins¬ besondere gibt es Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten, positiv oder negativ geladenen Seitenketten, aromatischen Gruppen in der Seitenkette oder Aminosäuren, deren Seitenketten Wasserstoffbrücken eingehen können, z.B. Seitenketten, die eine Hydroxyfunktion besitzen. Das bedeutet, dass beispielsweise eine Aminosäure mit einer polaren Seitenkette durch eine andere Aminosäure mit einet gleichfalls polaren Seitenkette ersetzt wird oder beispielsweise eine durch, eine hydrophobe Seitenkette gekennzeichnete Aminosäure durch eine andere A- minosäure mit gleichfalls hydrophober Seitenkette substituiert wird, z.B. Serin (Threonin), durch Threonin (Serin) bzw. Leuzin (Isoleuzin) durch Isoleuzin (Leuzin). Insertionen und Substitutionen sind insbesondere an solchen Sequenzpositionen möglich, die keine Verände¬ rung der dreidimensionalen Struktur durch Insertion(en) oder Deletion(en) herbeiführen, was beispielsweise mit Hilfe von CD-Spektren (Zirkulardichroismus-Spektren) leicht überprüfbar ist.

Geeignete Verfahren zur Herstellung von Varianten, die gegenüber den nativen Sequenzen Substitutionen aufweisen, werden beispielsweise in den Druckschriften US 4,737,462, US 4,588,585 und US 5,017,691 beschrieben. Die Herstellung von Varianten im allgemeinen wird insbesondere auch von Sambrook et al., 2001, beschrieben. Es können hierbei Codons weg¬ gelassen, ergänzt oder ausgetauscht werden. Varianten können insbesondere auch solche Pro- teine, Polypeptide oder Nukleinsäuren sein, die stabilisiert sind, um der physiologischen De¬ gradation zu entgegen, z.B. durch Stabilisierung des Proteinrückrats durch Substitution der amidartigen Bindung, z.B. auch durch den Einsatz von ß-Aminosäuren. Varianten im Sinne der Erfindung können ebenfalls hergestellt werden, in dem in die Nukleinsäuren, welche die Varianten codieren, Veränderungen eingeführt werden, wie beispielsweise Insertionen, DeIe- tionen und/oder Substitutionen einer oder mehrerer Nukleotide. Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren für derartige Veränderungen von Nukleinsäuresequenzen bekannt. Eine der meist verwendeten Techniken ist die Oligonukleotid-gerichtete ortsspezifische Mutagene- se. Bei dieser Technik wird ein Oligonukleotid synthetisiert, dessen Sequenz eine bestimmte Mutation aufweist. Dieses Oligonukleotid wird dann mit einem Template hybridisiert, dass die Wüdtyp-Nukleinsäuresec_juenz enthält. Bevorzugt wird bei dieser Technik ein einzelsträn- giges Template verwendet. Nach dem Annealing von Oligonukleotid und Template, wird eine DNA-abhängige DNA-Polymerase eingesetzt, um den zweiten Strang des Oligonukleotids, der komplementär zu dem Template-DNA-Strang ist, zu synthetisieren. Als Ergebnis wird ein Heteroduplex-Molekül erhalten, welches eine Fehlpaarung enthält, die durch die oben er- wähnte Mutation in dem Oligonukleotid entsteht. Die Oligonukleotid-DNA wird in geeigne¬ tes Plasmid eingeführt, dieses wird in eine (Wirts)-Zelle eingeführt, in dieser (Wirts)-Zelle wird die Oligonukleotid-DNA repliziert. Mit dieser Technik enthält man Nukleinsäurese- quenzen mit gezielten Veränderungen (Mutationen), welche für die Herstellung von Varian¬ ten gemäß der Erfindung verwendet werden können.

Erfindungsgemäß wird in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens bestimmt, ob es sich bei der in dem Verfahren eingesetzten Testsubstanz um eine schmerzregulierende Substanz handelt. Dies kann entweder über die erfolgte Bindung der Testsubstanz an das Protein, bei¬ spielsweise durch die Verdrängung eines bekannten Iiganden, oder durch die Bestimmung der Menge gebundener Substanz, oder durch die Bestimmung der Veränderung eines funkti¬ onellen Parameters als Folge der Wechselwirkung zwischen Testsubstanz und Protein erfol- gen.

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform erfolgt daher die Messung der Bindung einer Test¬ substanz an ein Verfahrens-Protein über die Verdrängung eines bekannten markierten Iigan¬ den des Proteins (oder des funktionellen Fragments oder der funktionellen Variante hiervon) und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz. Unter „Bin¬ dung" der Testsubstanz an das Protein ist eine Wechselwirkung zwischen Protein und Test¬ substanz zu verstehen, die zu einer Fixierung führt. Eine solche Wechselwirkung kann bei¬ spielsweise in der Regulation, Hemmung und/ oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanä¬ len und/oder Enzymen erfolgen. Unter „Verdrängung" eines bekannten markierten Iiganden ist ein vollständiges oder teilweises Entfernen dieses Iiganden von seiner Bindungsstelle zu verstehen. Der Iigand kann beispielsweise radioaktiv, fluoreszierend oder lumineszierend markiert werden. Durch eine solche Markierung ist der Iigand entsprechenden Nachweisre¬ aktionen (z.B. der Radioaktivität, Fluoreszenz oder Lumineszenz) zugänglich. Unter einem Iiganden ist jede Substanz zu verstehen, die hochspezifisch an ein Molekül bindet, das sich im Organismus, insbesondere auf der Oberfläche einer Zelle, befindet. Ein Beispiel hierfür ist ein Rezeptor. Dieser Iigand wird durch die ebenfalls an ein solches Molekül bindende Test¬ substanz aus seiner Bindungsstelle verdrängt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Messung eines durch die Bindung der Testsubstanz an ein Verfahrens-Protein veränderten Parameters. Unter „funktionellen Parametern" sind die Messgrößen eines Experiments zu verstehen, die mit der Funktion des Proteins in Zusammenhang stehen. Funktionelle Parameter können beispielsweise die Ge- nexpression, das Ionenmillieu, der pH-Wert, das Membranenpotential, die Enzymaktivität oder die Konzentration der 2^nd messenger sein. Vorzugsweise erfolgt die Messung mindestens eines durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parameter über eine Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder En- zymen, insbesondere über eine Messung der Veränderung der Genexpression, des Ionenmil- lieus, des pH, des Membranpotentials, der Enzymaktivität oder der Konzentration der 2" messenger. Erfindungsgemäß kann somit die Messung der Testsubstanz über ihren Einfluss auf Rezeptoren, Ionenkanäle und/oder Enzyme direkt erfolgen, sie kann jedoch auch indirekt erfolgen, in dem Zustände wie Genexpression, Ionmillieu, pH, Membranpotential, Enzymak- tivität oder Konzentration der 2^πd messenger gemessen werden. Unter „2^nd messenger" ist ein kleines Molekül zu verstehen, das als Folge eines extrazellulären Signals entweder im Cytosol gebildet wird oder in das Cytosol transportiert wird, um auf diese Weise Informationen an das Zellinnere weiterzuleiten (z.B. cAMP, IP₃). Beispiele für 2^nd messenger Botenstoffe des intra¬ zellulären Signalwegs sind cyklisches AMP (cAMP), Inositolüdphosphat (IP3) oder Diacylgly- cerol (DAG).

Eine Testsubstanz ist anhand der Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Messungen als schmerzregulierend zu charakterisieren, wenn sie durch ihr Eindringen in einen lebenden Organismus eine Verhaltensänderung bewirkt, die der Fachmann als schmerzhemmend (anti- nozizeptiv, antihyperalgetisch oder antiallodynisch) bezeichnet. In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine Substanz beispielsweise als schmerzregulierend bezeichnet werden, wenn eine stärkere Bindung oder die Auslösung einer Änderung eines funktionellen Parameters in einem stärkeren Ausmaß, (beispielsweise 100 %) erfolgt, als es im Vergleich mit dem Durch¬ schnitt der getesteten Substanzen erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Zelle, die ein Verfahrens- Protein synthetisiert, vorzugsweise vor dem Schritt (a) des Verfahrens der vorliegenden Er¬ findung gentechnisch manipuliert. Hierunter wird eine Veränderung von Zellen, Geweben oder Organismen verstanden, in dem genetisches Material in die Zelle eingebracht wird. Ins- besondere handelt es sich bei diesem genetischen Material um eine oder mehrere Nukleinsäu¬ ren. Es ist bevorzugt, dass die gentechnische Manipulation die Messung mindestens eines durch eine Testsubstanz veränderten funktionellen Parameters erlaubt. In diesem Fall kann durch die genetische Manipulation eine Veränderung eines funktionellen Parameters über¬ haupt oder auch verbessert gemessen werden. Besonders bevorzugt ist es hierbei, dass durch die genetische Manipulation die Zelle eine nichtendogen exprimierte Form eines G-Proteins (GTP-bindendes Protein) exprimiert oder dass in die Zelle ein Reportergen eingefügt wird. Bevorzugt wird daher ein G-Protein in die Zelle eingeführt, das entweder endogen nicht vor¬ handen ist, oder physiologisch nicht exprimiert wird. Hierbei kann es sich beispielsweise um ein chimäres G-Protein handeln, durch das eine Veränderung des Signalweges bewirkt wer¬ den kann, oder ein promiskuitives G-Protein, welches ein sehr bindungsfreudiges Protein darstellt. Der Begriff „G-Protein" stellt die international übliche Abkürzung für ein Guano- sintriphosphat (GTP)-bindendes Protein dar. Es wird als Signalprotein durch G-Protein ge¬ koppelte Rezeptoren aktiviert. Der Begriff „Reportergen" wird für Gene verwendet, deren Produkte sich anhand einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden einfach nachweisen lassen. Beispiele hierfür sind das Luziferase-Gen, die alkalische Phosphatase oder das Green Fluorescent Protein (GFP). „Endogen exprimiert" bedeutet, dass eine Zelle oder Zelllinie unter geeigneten Kulturbedingungen ein Protein exprimiert, ohne dass eine Expres¬ sion dieses Proteins (durch gentechnische Manipulation) induziert wurde. Die Einführung eines Reportergens in eine erfindungsgemäße Zelle erlaubt die Messung einer induzierten Expression des Genproduktes.

In einer ebenfalls bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird die gentechnisch mani¬ pulierte Zelle vor dem Schritt (a) des Verfahrens unter Bedingungen kultiviert, die eine Ex¬ pression erlauben, vorzugsweise unter Selektionsdruck. „Kultivieren" einer Zelle bedeutet, die Zelle unter Bedingungen zu halten, die ein Überleben dieser Zelle sowie der Nachfolgegene- ration(en) gewährleisten, d.h. insbesondere, unter Bedingungen, die eine Expression erlauben. Bedingungen, die eine Expression erlauben, sind von dem Protein abhängig, das es zu expre- mieren gilt. Solche Bedingungen beziehen sich beispielsweise auf die Temperatur, den pH- Wert, das verwendete Medium, in welchem eine Zelle kultiviert wird, den Zusatz von induzie¬ renden Substanzen, Nährstoffen und Co-Faktoren, Inkubationszeit und Sauerstoffgehalt. Eine Kultivierung unter „Selektionsdruck" bedeutet, dass nur ausgewählte Zellen weiter kul- tiviert werden. Hierdurch kann überprüft werden, ob die gentechnische Manipulation erfolg¬ reich verlaufen ist. Es wird hierzu vorzugsweise in Zellen, die gentechnisch manipuliert wer¬ den, ein bestimmtes Gen eingeführt, dessen Genprodukt, einem sog. Selektionsmarker, nur den Zellen ein Überleben untet den gewählten Kulturbedingungen ermöglicht, die dieses Gen enthalten. Ein Beispiel hierfür ist die Einfuhrung eines Antibiotikaresistenz-Gens.

Bei einer Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich vorzugsweise um eine Am- phibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine imortalisierte oder native Säu¬ getierzelle. Beispiele für Amphibienzellen sind Xenupus Oocyten, für Bakterienzellen E. coli, Baällus, Pseudomonas, Streptomjces, und Samonella, für Hefezellen Saccharomyces ceremsiae, Piώia P ^' astoris, für Insektenzellen SfP-Zellen, für immortalisierte Säugetierzellen Heia-Zellen und für native Säugetierzellen CHO-Zellen. und COS-Zellen. Diese Aufzählung ist allerdings keines- falls abschließend. Die Wahl einer in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzenden Zel¬ le ist von mehreren Faktoren abhängig, z.B. bei der Einführung eines Vektors in die Zelle insbesondere von dem verwendeten Vektor.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zelle gentechnisch so manipuliert, dass sie mindestens eine Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon enthält. Hierdurch kann erreicht werden, dass ein Verfahrens-Protein synthetisiert wird, dass in einer erfindungsgemäßen Zelle nicht endogen exprimiert wird. Hierbei ist es bevorzugt, dass die Nukleinsäure in einem rekombinanten DNA-Konstrukt, vorzugsweise einem Vektor, besonders bevorzugt einem Expressionsvektor, enthalten ist. Unter einem rekombinanten DNA-Konstrukt versteht man ein in vitro hergestelltes DNA-Molekül. Unter einem Vektor versteht man allgemein ein Nukleinsäuremolekül, das Fremd-Gene (Fremd- Nukleinsäure) enthält.

Bei sämtlichen in der vorliegenden Erfindung genannten Vektoren kann es sich um einen Expressionsvektor handeln, d.h. um einen Vektor, der die Fähigkeit zur Expression und/oder Amplifikation der enthaltenen Nukleinsäuren in einer prokaryontischen und/oder eukaryonti- schen Zelle besitzt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Plasmidvektoren, z.B. pBABEpuro, Phagen oder retrovirale Vektoren, insbesondere auch alle Vektorsysteme, die gentherapeutisch zur Anwendung kommen können, z.B. auch adenovirale und adenoviral- assoziierte Vektorsysteme. Erfindungsgemäße Vektoten weisen bevorzugt Konürollsequenzen auf, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure ermöglichen bzw. verstärken und die Transkription regulieren. Solche Kontrollsequenzen schließen bspw. Polyadenylierungssignale, Promotoren, z.B. natürliche oder synthetische Promotoren, Enhancer zur Bewirkung der Transkription, Operatorsequenzen zur Regulierung der Transkription, Silencer zur gewebsspezifischen Transkription, Sequenzen, die geeignete Ribosomen-Bindungsstellen auf der mRNA codie¬ ren, Sequenzen, welche die mRNA stabilisieren und Sequenzen, welche die Termination der Transkription und/oder Translation regulieren. Dies stellt lediglich eine beispielhafte Aufzäh¬ lung von möglichen Kontrollsequenzen dar. Weitere mögliche Konttollsequenzen sind im Stand der Technik gut bekannt und sind bspw. beschrieben von Goeddel, 1990. Die Kon¬ trollsequenzen können modifiziert werden, z.B. durch Deletion, Addition oder Substitution einer oder mehrerer Nukleinsäuren, um ihre Kontrollfunktion zu verstärken.

Es sind insbesondere zahlreiche verschiedene Promotoren für verschiedene Organismen be- kannt. Zum Beispiel ist ein bevorzugter Promoter für Vektoren, die in Bad/lus subtilis verwen¬ det werden, der AprE-Promoter, ein bevorzugter Vektor, verwendet in E. coli, ist der T7/Lac- Promotor, ein bevorzugter Promoter, verwendet in Sacώaromyces cereύάae ist PGKl, ein be¬ vorzugter Promotor, verwendet in Aspergillus niger ist glaA, ein bevorzugter Promotor, ver¬ wendet in Triώodema reesei (reesei) ist cbhl. Promotoren, die für die Verwendung in prokaryon- tischen (Wirts)-Zellen geeignet sind, schließen z.B. beta-Lactamase (Vektor pGX2907 [ATCC39344], enthält das Replicon und das beta-Lactamase Gen), Lactose-Promotor- Systeme (Chang et al. (1978), Nature (London, 275: 615); Goeddel et al. (1979), Nature (Lon¬ don), 281: 544), Alkalische Phosphatase, das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Vektor pATHl [ATCC37695]) und Hybridpromotoren, wie den tac-Promotor (isolierbar aus dem Plasmid pDR540 [ATCC37282]), ein. Jedoch auch andere bakterielle Promotoren, deren Nukleinsäuresequenzen allgemein bekannt sind, versetzen einen Fachmann in die Lage, die¬ sen mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu ligieren, wobei auch Linker oder Adapter verwendet werden können, um gewünschte Restriktionsstellen zu erzeugen. Bevorzugt ent¬ halten Promotoren, die in bakteriellen Systemen verwendet werden, ebenfalls eine Shine- Dalgarno-Sequenz, die funktionsfähig mit der Nukleinsäure verbunden ist. Geeignete Expressionsvektoren können bspw. aus Segmenten von chromosomaler, nicht¬ chromosomaler und synthetischer DNA bestehen. Hierfür sind zahlreiche Derivate von SV40 und Bakterienplasmiden bekannt. Beispiele sind Plasmide aus E, coli, wie col El, pBK, pCRl, pBR322, pMb9, pUC19 sowie deren Derivate, Plasmide, die für einen weiten Wirtsbereich verwendbar sind, wie RP4, und Phagen-DNAs, wie zahlreiche Derivate des Phagen-Lambda, z.B. NM989, sowie andere DNA-Phagen, z.B. M13, sowie fϊlamentöse einzelsträngige DNA- Phagen, Hefeplasmide, Vektoren, die für die Verwendung in eukaryontischen Zellen geeignet sind, sowie Vektoren, die aus einer Kombination von Plasmid- und Phagen-DNA bestehen. Im Stand der Technik sind zahlreiche Expressionstechniken zur Verwendung erfindungsge- mäßer Expressionsvektoren bekannt. Solche Techniken werden bspw. allgemein beschrieben in Sambrook et al., 2001.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Protein (vorliegend als „erfindungsgemä¬ ßes Protein" bezeichnet), welches eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 20 oder 54 oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon umfasst oder aus einet der genannten Aminosäuresequenzen besteht. Wie bereits oben beschrieben, wurde die Aminosäuresequenz gemäß Figur 11, codierend für humanes KIAA0378, gegenüber der in der Datenbank vorhandenen Aminosäuresequenz am N-Terminus um 149 Aminosäuren vervollständigt. Die Aminosäuresequenz gemäß der Figur 20, codierend für das murine BAB31214, sowie die Aminosäuresequenz gemäß Figur 54, codierend für das Protein PID12832121/FLJ20420 aus der Ratte wurden ebenfalls erfindungsgemäß erhalten. Auch diesbezüglich wird auf die obigen Ausführungen verwiesen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein (vorliegend als „erfindungsgemäßes Protein" bezeichnet), welches durch eine Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 codiert wird. Ein ebenfalls weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter striαgenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert. Die Nukleinsäuresequenzen der Figuren 12, 21 und 55 codieren das humane KIAA0378, das mu- rine BAB31214 bzw. Ratten PID12832121/FLJ20420. Von der Erfindung umfasst sind weiterhin sowohl die vorstehend beschriebenen erfindungs¬ gemäßen Proteine (humanes KIAA0378, murines BAB31214 und Ratten PID12832121/FLJ20420) als auch die Verfahrens-Proteine, die Modifikationen aufweisen. Hierbei können die Proteine beispielsweise posttranslational (nach der Translation) modifi- ziert sein, sie können z.B. glykosiliert, phosphoryliert, amidiert, methyliert, acetyliert, ADP- ribosyliert, hydroxyliert, mit einem Membrananker versehen, gespalten oder verkürzt vorlie¬ gen. Posttranslationale Modifikationen sind beispielsweise in Voet/Voet, Biochemistry, 1" Edition, 1990, S. 935-938 beschrieben.

Die Herstellung von Verfahrens-Proteinen und erfindungsgemäßen Proteinen kann anhand Standardverfahren erfolgen, die dem Fachmann gut bekannt sind. Beispielsweise kann ein solches Verfahren typischerweise die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer Zelle unter geeigneten Bedingungen, (b) Expression der/des Protein kodierenden Nukleinsäure bzw. Nukleinsäurekonstcukts unter geeigneten Bedingungen, und (c) Isolieren des Proteins aus den Zellen und/oder dem Kulturüberstand.

Geeignete Bedingungen zum Kultivieren einer Zelle wurden bereits oben beschrieben. Die Expression des Polypeptids kann typischerweise nach dem Stand der Technik in geeigneten Expressionssystemen erfolgen, vorzugsweise als sezerniertes Produkt stabiler Transfektanten, z.B. CHO-Zellen oder anderer tierischer Zellen, wie Cos7 oder SF9 (Insektenzellen), oder weiterer eukaryontischer Zellsysteme, beispielsweise Pichia pastoris. Vorzugsweise weisen die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine jeweilige zur Sekretion in dem Zellsystem geeigne¬ te Leadersequenzen auf. Daher werden zur Expression eingesetzte erfindungsgemäße Vekto¬ ren codierende Abschnitte enthalten, die für eine funktionelle Leadersequenz codieren, z.B. wie in Brocks et al. (Immunotechnology 3:173-184, 1997) für Säuger und Insektenzellen be¬ schrieben oder unter Verwendung von beispielsweise pPICZalpha-Vektoren (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland) zur Expression und Sekretion in der Hefe Pichia pastoris. Das Isolie¬ ren des erfindungsgemäßen Proteins aus der (Wϊrts-)Zelle kann durch Standardverfahren, wie Chromatographie- Verfahren, Präzipitationsverfahren usw., die zur Aufreinigung von PoIy- peptiden und Proteinen geeignet sind, erfolgen (s.a. Sambrook et al., 2001). Ein weitetet Gegenstand des Verfahrens ist eine Nukleinsäure, die für ein Protein, das aus der Gruppe bestehend aus humanem KIAA0378, murinem BAB31214 und Ratten PID12832121/FLJ20420 ausgewählt ist, oder ein funktionelles Fragment oder eine funktio¬ nelle Variante eines solchen Proteins, codiert. Eine solche Nukleinsäure wird vorliegend als „erfindungsgemäße Nukleinsäure" bezeichnet.

Ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, die aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 besteht, oder eine solche Nuk- leinsäuresequenz umfasst oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante einer solchen Nukleinsäure. Eine solche Nukleinsäure wird vorliegend als „erfiridungsgemäße Nukleinsäure" bezeichnet.

Bei allen in der vorliegenden Erfindung bezeichneten Nukleinsäuren kann es sich sowohl um DNA, genotnische DNA, synthetische DNA, insbesondere cDNA, als auch um RNA, insbe- sondere mRNA, handeln. Die Nukleinsäuremoleküle können doppel- oder einzelstängig vor¬ liegen. Einzelsträngige RNA oder DNA kann entweder der codierende (sense) oder der nicht- codierende (antisense) Strang sein.

Ebenfalls umfasst sind Nukleinsäuren, die als Nukleinsäurekonstrukte auftreten, also einen für eines der erfindungsgemäßen Proteine codierenden Sequenzabschnitt sowie einen oder mehrere weitere Sequenzabschnitt(e) enthalten. Solche weiteren Sequenzabschnitte können beispielsweise Sequenzen sein, die für ein Leitpeptid codieren, das als Signal für die Sekretion des Proteins gemäß der Erfindungen in eukaryontischen Zellen gibt. Weitere Sequenzen, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfasst sein können, sind ebenfalls nicht- codierende Sequenzen, wie nicht-codierende 3'- und 5'-Sequenzen einschließlich z.B. regula¬ torische Sequenzen.

Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls mit Nukleinsäure- sequenzen fusioniert sein, die bspw. für eine Markersequenz codieren oder für eine Sequenz codieren, die ein Polypeptid codiert, welches bspw. die Isolierung oder Aufreinigung des Po¬ lypeptids der Erfindung erleichtert. Repräsentative Sequenzen schließen bspw. solche ein, die ein Glutation-S-Transferase (GST) Fusionsprotein, ein Polyhistidin (z.B. HIS 6) Hämaggluti- nin oder HSV-Tag codieren. Diese Aufzählung ist jedoch keinesfalls beschränkend.

Die Nukleinsäuren gemäß der Erfindung können bevorzugt isoliert vorliegen. Dies bedeutet, dass das Nukleinsäuremolekül oder die Nukleinsäuresequenz nicht von Nukleinsäuresequen- zen flankiert wird, die normalerweise das Gen oder die Nukleinsäuresequenz flankieren (wie in genomischen Sequenzen) und/oder die vollständig oder teilweise aufgereinigt worden sind (wie bspw. in einer DNA- oder RNA-Bibliσthek). Bspw. kann eine isolierte Nukleinsäure der Erfindung in Bezug auf das zelluläre Milieu, in welchem es natürlicherweise vorkommt, iso- liert sein.

Erfindungsgemäß sind auch funktionelle Fragmente oder funktionelle Varianten der erfin¬ dungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäurekonsttukte umfasst, auf die obigen Ausfüh¬ rungen zu den Begriffen funktionell, Fragment und Variante entsprechende Anwendung fin- den.

Die Herstellung erfindungsgemäßer Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukten oder funktio¬ nellen Fragmenten oder funktionellen Varianten hiervon kann mittels Standardverfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z.B. Sambrook et al. 2001). Insbesondere Anwendung in diesem Zusammenhang findet die PCR-Technik. Eine Überprü¬ fung der Sequenz hergestellter Nukleinsäuren gemäß der Erfindung kann anhand Sequezie- rungs- oder Hybridisierungs- Verfahren erfolgen, welche dem Fachmann ebenfalls geläufig sind.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäu¬ ren. Bevorzugt codiert das Genprodukt ein Protein bzw. Polypeptid der in den Figutefl. 12, 21 oder 55 dargestellten Aminosequenzen. Ein Genprodukt der vorliegenden Erfindung be¬ trifft nicht lediglich das Transkript (mRNA) sondern auch Polypeptide oder Proteine, bevor¬ zugt in aufgereinigter Form. Ebenfalls umfasst sind Allele, funktionelle Fragmente oder funk- tionelle Varianten solcher Genprodukte. Für funktionelle Fragmente oder funktionelle Vari¬ anten der Genprodukte gelten die obigen Definitionen dieser Begriffe entsprechend. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Vektor, der mindestens eine Nukleinsäure enthält, die für ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanes KIAA0378, murines BAB31214 und Ratten PID12832121/FLJ20420, oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines solchen Proteins codiert und/oder eine Nukleinsäure enthält, die aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 besteht, oder eine solche Nukleinsäuresequenz umfasst oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante einer solchen Nukleinsäure und/oder eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA enthält, die eine Nukleinsäuresequenz auf- weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure zu binden, die eines der Proteine humanes KIAA0378, murines BAB31214 und Ratten PID12832121/FLJ20420 codiert bzw. spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß der Figuren 12, 21 oder 55 bindet. Bei einem solchen erfindungsgemäßen Vektor handelt es sich vorzugsweise um einen der oben beschriebenen Vektoren.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Zelle, die mindestens ein Protein enthält, das eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 20 oder 54 oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon umfasst oder aus einer der genannten Aminosäuresequenzen besteht und/oder - ein Protein enthält, das durch eine Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 codiert wird und/oder ein Protein enthält, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert und/oder - eine Nukleinsäure enthält, die für ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanes KIAA0378, murines BAB31214 und Ratten PID 12832121 /FLJ20420, oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines solchen Proteins codiert und/oder eine Nukleinsäure enthält, die aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 besteht, oder eine solche Nukleinsäuresequenz umfasst oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante einer solchen Nukleinsäure und/oder eine Aαtisense Nukleinsäure oder eine PNA enthält, die eine Nukleinsäuresequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure zu binden, die eines der Proteine humanes KIAA0378, murines BAB31214 und Ratten PID12832121/FLJ20420 codiert bzw. spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß der Figuren 12, 21 oder 55 bindet und/oder - einen Vektor enthält, der eine der vorgenannten Nukleinsäuren enthält.

Vorzugsweise handelt es sich bei einer solchen erfindungsgemäßen Zelle um eine Amphi¬ bienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine immortalisierte oder native Säuge¬ tierzelle. Beispiele für solche Zellen sind bereits oben beschrieben worden.

Die Herstellung erfindungsgemäßer Zellen kann anhand von Verfahren, die im Stand. der Technik gut bekannt sind (beispielsweise beschrieben bei Sambrook, 2001), erfolgen. Ein solches Verfahren kann die folgenden Schritte umfassen: (a) Herstellung einer/eines vorste¬ hend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder erfindungsgemäßen Vektors, (b) Einbringen der Nukleinsäure und/oder des Vektors gemäß Schritt (a) in eine Zelle. Das Her¬ stellen einer/eines vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. erfin¬ dungsgemäßen Vektors kann anhand dem Fachmann gut bekannter und nach den bereits oben beschriebenen Standardverfahren erfolgen. Das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. des erfindungsgemäßen Vektors in die Zelle kann unter Verwendung jeder geeigneter Standardverfahren erfolgen. Hierzu gehören bspw. Transformation, Elektroporati- on, Transfektion unter Verwendung von z.B. Kalziumchlorid, Iipofektion, Infektion, Trans¬ duktion etc. Diverse Standardverfahren sind bspw. in Sambrook et al., 2001, beschrieben.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper gegen eines der erfindungsgemä- ßen Proteine - humanes K1AA0378, murines BAB31214 und Ratten PID12832121/FLJ20420. Unter Antikörper versteht der Fachmann lösliche oder an Zell¬ membranen gebundene Moleküle, die durch ihre spezifische Wechselwirkung mit einem komplementären Zelloberflächenmolekül („Antigen") charakterisiert sind. Es handelt sich im allgemeinen um als Immunglobuline bezeichnete Proteine, die eine spezifische Bindungsstelle für Antigene aufweisen. Vorzugsweise handelt es sich um einen monoklonalen oder polyklo- nalen Antikörper. Monoklonale Antikörper sind selektiv gegen eine einzige antigene Deter¬ minante eines Antigens gerichtete Antikörper, während polyklonale Antikörper eine Mi- schtmg aus Antikörpern darstellen, die gegen mehrere Determinanten eines Antigens gerich¬ tet sind.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Antisense-Nukleinsäure, die eine Nukleinsäu- resequenz umfasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionel¬ le Variante einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu binden.

Unter einer Antisense-Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure zu verstehen, die komplementär zu einer codierenden (Sense-) Nukleinsäure ist. Eine Antisense-Nukleinsäure kann als DNA oder RNA vorliegen. Eine Antisense-Nukleinsäure kann beispielsweise für sog. Antisense- Strategien eingesetzt werden, durch welche die mRNA- oder Protein-Konzentration beein- flusst, insbesondere herabgesetzt, werden kann. Beispielsweise können, abgeleitet von der Nukleinsäuresequenz der vollständigen cDNA oder von Teilbereichen hiervon Konstrukte erstellt werden, z.B. Antisense-Oligonukleotide (DNA oder RNA), die beispielsweise unter Verwendung modifizierter Nukleotidbausteine (z.B. O-Allyl-Ribose) eine erhöhte Stabilität gegenüber Nukleasen aufweisen. Diese modifizierten Antisense-Oligonukleotide können dann beispielsweise an eine komplementäre mRNA binden und so deren Translation verhin¬ dern bzw. erschweren. Weiterhin sind hierzu Antisense-Konstrukte sinnvoll, die unter Ver- wendung nichttraditioneller Basen wie Inosine, Queosine oder Wybutosine sowohl wie Ace- tyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierte Formen von Adenin, Cytidin, Guanosin u, Thy- midin und Uridin nicht oder in geringerem Masse durch endogene Nukleasen abgebaut wer¬ den können. Eine Antisense Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise eine Länge von 15 bis 100 Nukleotiden, stärker bevorzugt von 15 bis 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt von 15 bis 30 Nukleotiden auf, am stärksten bevorzugt 18 bis 25 Nukleotide.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine PNA, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfindungs¬ gemäße Nukleinsäure oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionelle Variante einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu binden. PNA stellt hierbei die international übliche Ab¬ kürzung für Peptidic Nucleic Acid („peptidische Nukleinsäure") dar. Flierbei bilden pepdi- tisch verknüpfte Aminosäuren eine Kette, wobei die Aminosäuren als Seitenkette eine für die Hybridisierung mit einer DNA oder RNA geeignete Base aufweisen. PNAs können durch Austausch des Phosphatrückgrats in Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden. Eine PNA gemäß der voriiegenden Erfindung weist vorzugsweise eine Länge von 15 bis 100 Nukleoti¬ den, stärker bevorzugt von 15 bis 50 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von 15 bis 30 Nukleotiden auf.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Ribozym, das eine Nukleinsäuresequenz um- fasst, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein funktio- neues Fragment oder ein funktionelle Variante einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu binden. Ebenfalls kann eine erfindungsgemäße Nukleinsäure Teil eines Ribozyms oder eines sonstigen DNA-Enzyms oder einer katalytischen RNA oder DNA sein. Unter einem Ribo¬ zym ist eine katalytisch aktive Ribonukleinsäure zu verstehen, die als enzymatisch aktive RNA-Molekül eine spezifische Spaltung der RNA katalysiert. Hierzu gehören auch selbst- spleißende RNAs. Beispiele für Ribozyme sind z.B. selbst-spleißende Introns, Ribonuklease P (aus E. coli), das Hammerkopf-Ribozym, das Haarnadel-Ribozym oder tRNA^phe. Soche Ribo¬ zyme können Nukleinsäureabschnitte enthalten, die an komplemtäre Nukleinsäuren (Nuk¬ leinsäureabschnitte) binden und diese spalten. Die Funktion von selbstspleißender RNA ist beispielsweise, aus prä-rRNAs und prä-tRNAs Introns zu entfernen, um diese zu reifen rRNAs bzw. tRNAs zu führen. Die Spleißreaktion wird durch den Kontakt eines G- Nukleotids mit dem Intron der RNA initiiert. Die RNA wird gespalten, das durch diese Spal¬ tung erzeugte neue 3'-Ende der RNA, spaltet wierderum das andere Ende des Introns. Ein Ribozym gemäß der vorliegenden Erfindung weist weist vorzugsweise eine Länge von 20 bis 100 Nukleotiden, stärker bevorzugt von 40 bis 90 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von 50 bis 70 Nukleotiden auf.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine siRNA, die eine Nukleinsäuresequenz um- fasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfin¬ dungsgemäße Nukleinsäure oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionelle Variante einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu binden. siRNA steht für „short interference RNA". Sie stellt ein Zwischenprodukt des „RNA interference" (RNAi) Signalwegs dar. Hier¬ bei wird ein doppelsträngiges RNA-Molekül durch die Dicer Ribonuklease in kleine interfe- riefende RNAs (siRNAs) aufgebrochen. Einer der Stränge der siRNA, und zwar der zu einer Ziel-mRNA komplementäre Strang, bindet an diese mRNA, welche sodann durch die RDE-I Nuklease degradiert wird. Eine siRNA gemäß der vorliegenden Erfindung weist vorzugsweise eine Länge von 10 bis 50 Nukleotiden, stärker bevorzugt von 15 bis 40 Nukleotiden, stärker bevorzugt von 20 bis 25 Nukleotiden auf. Und am stärksten bevorzugt 21 bis 23 Nukleotide. Darüber hinaus stellen sogenannte sh (small hairpin) RNAs einen weiteren Erfindungsge¬ genstand im Rahmen der vorliegenden Erfindung dar. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um RNA-Sequenzen, von doppelter Länge, wie oben für siRNA beschrieben, die gleichfalls an eine erfindungsgemäße Nukleinsäure binden kann. Derartige shRNAs werden vorzugswei- se durch Transkription aus einem Plasmid bereitgestellt, wobei das fertige RNA-Transkript durch Rückfaltung eine doppelsträngige RNA mit einer hairpin-Loop bilden kann. Vorzugs¬ weise also weist eine derartige shRNA (eine besondere Form der siRNA) eine zu einem der Nukleinsäurestränge der erfindungsgemäßen Nukleinsäure komplementäre Sequenz auf, die als solche einen Doppelstrang mit einem hairpin-Loop bilden kann.

Derartige shRNA haben eine verlangsamte Dissoziationskinetik.

Vorzugsweise weisen erfindungsgemäße siRNAs die allgemeine Struktur 5'-(N₁₉.₂₅)-3', stärker 5'-(Ni₉_₂₄)-3', noch stärker bevorzugt 5'-(N_2U2^)-3' auf, wobei N irgendeine Base ist. Hierbei können zumindest 90%, vorzugsweise 99% und insbesondere 100% der Nukleotide einer erfindungsgemäßen dsRNA komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA-Sequenz einer erfindungsgemäßen Sequenz sein. 90% komplementär bedeutet hierbei, dass bei einer bspw. gegebenen Länge von 20 Nukleotiden einer erfindungsgemäßen siRNA diese nur für höchs¬ tens 2 Nukleotide nicht mit dem entsprechenden Abschnitt auf der (m)RNA komplementär ist. Die Sequenz der erfindungsgemäßen doppelsträngigen RNA ist mit ihrer allgemeinen Struktur vorzugsweise vollständig komplementär zu einem Abschnitt der (m)RNA einer er- findungsgemäßen Sequenz.

Weiterhin bevorzugt sind erfindungsgemäße siRNA, die die folgenden Sequenzmotive auf- weisen: AAN₁₉TT, NAN₁₉NN, NARN₁₇YNN und/oder NANN₁₇YNN, wobei N für ein beliebiges Nukleotid, A für Adenosin, T für Thymidin, R für Purine (A oder G) und Y für Pyrimidinbasen (C oder T) steht. Grundsätzlich kann eine erfindungsgemäße dsRNA zu jedem beliebigen Abschnitt auf der mRNA oder dem Primärtranskript eine erfindungsgemäße Sequenz komplementär sein.

In einer eukaryontischen Zelle wird für die Herstellung einer mRNA das Gen in seiner ge¬ samten Länge, sowohl Introns als auch Exons, in ein langes RNA-Molekül transkribiert, das Primärtranskript. Die Stabilität der mRNA erfolgt durch Prozessierung des Primärtranskripts am 5'-Ende mit einer Addition eines untypischen Nukleotids mit einem methylierten Guanin und einer Polyadenylierung am 3'-Ende. Bevor die RNA den Zellkern verlässt, werden durch RNA-Spleißen die Intronsequenzen entfernt und die Exons miteinander verbunden, insbe¬ sondere gegenüber der Spleißform, also der gereiften mRNA, ist eine erfindungsgemäße siR- NA komplementär.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform ist eine sh/siRNA, die einen GC-Gehalt von mindestens 30%, in einer stärker bevorzugten Ausführungsform von bis 30% bis 70% und in einer stärker bevorzugten Ausführungsart von 40% bis 60% oder noch stärker bevorzugt zwischen 45 und 55 % aufweist .

Eine weitere besonders bevorzugte Ausfuhrungsform für eine erfindungsgemäße si(sh)RNA ist eine Zielsequenz, die die gleiche Häufigkeit aller Nukleotide auf dem Antisense Strang enthält. Schließlich ist es besonders bevorzugt, wenn 2'-Deoxythymidin für den 2-nt 3'- Überhang bei einer erfindungsgemäßen siRNA auftritt, da diese hierdurch vor Exonuklease- Aktivität geschützt wird. Weiterhin bevorzugt ist es, wenn die Zielsequenz einer erfindungs¬ gemäßen si/shRNA nur einmal in den Targetgenen auftritt bzw. auch singulär für das jeweili- ge Genom der behandelten Zellen ist.

Vorzugsweise können die Enden der doppelsträngigen RNA (siRNA o. shRNA) modifiziert werden, um einem Abbau in der Zelle oder einer Dissoziation in die Einzelstränge entgegen- zuwirken, insbesondere um einen vorzeitigen Abbau durch Nukleasen zu umgehen. Eine fegelmäßig nicht gewünschte Dissoziation der Einzelstränge von si/shRNA tritt insbe¬ sondere bei Verwendung niedriger Konzentrationen oder kurzer Kettenlängen auf. Zur be¬ sonders wirksamen Hemmung der Dissoziation kann der durch die Nukleotidpaare bewirkte Zusammenhalt der doppelsträngigen Struktur von erfϊndungsgemäßer siRNA durch mindes- tens eine, vorzugsweise mehr chemische Verknüpfung/en erhöht werden. Eine erfindungs¬ gemäße siRNA, deren Dissoziation vermindert ist, weist eine höhere Stabilität gegen enzyma- tischen und chemischen Abbau in der Zelle bzw. im Organismus oder ex-vivo auf.

Die chemische Verknüpfung der Einzelstränge einer erfindungsgemäßen siRNA wird zweckmäßigerweise durch eine kovalente oder ionische Bindung, Wasserstoffbrückenbin¬ dung, hydrophobe Wechselwirkung, vorzugsweise van-der-Waals oder Stapelungswechselwir¬ kungen, oder durch Metall-ionenkoordination gebildet. Sie kann nach einem besonders vor¬ teilhaften Ausgestaltungsmerkmal an mindestens einem, vorzugsweise an beiden, Ende/n hergestellt werden. Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, dass die chemische Verknüp- fung mittels einer oder mehrerer Verbindungsgruppen gebildet wird, wobei die Verbindungs¬ gruppen vorzugsweise Poly-(oxyphosphinicooxy-l,3-propan-diol)- und/oder Polyethylengly- col-Ketten sind. Die chemische Verknüpfung kann auch durch in der doppelsträngigen Struk¬ tur anstelle von Purinen benutzte Purinanaloga gebildet werden. Vpn Vorteil ist es ferner, dass die chemische Verknüpfung durch in der doppelsträngigen Struktur eingeführte Azaben- zoleinheiten gebildet wird. Sie kann außerdem durch in der doppelsträngigen Struktur anstelle von Nukleotiden benutzte verzweigte Nukleotidanaloga gebildet werden.

Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, dass zur Herstellung der chemischen Verknüpfung mindestens eine der folgenden Gruppen benutzt wird: Methylblau; bifunktionelle Gruppen, vorzugsweise Bis-(2-chlorethyl)-amin; N-acetyl-N'-(p-glyoxybenzoyl)-cystamin; 4-Thiouracil; Psoralen. Ferner kann die chemische Verknüpfung durch an den Enden des doppelsträngigen Bereichs angebrachte Thiophosphoryl-Gruppen gebildet werden. Vorzugsweise wird die chemische Verknüpfung an den Enden des doppelsträngigen Bereichs durch Tripelhelrx- Bindungen hergestellt. Die chemische Verknüpfung kann zweckmäßigerweise durch ultravio- lettes Licht induziert werden.

Die Modifizierung der Nukleotide der dsRNA führt zu einer Deaktivierung einer an dop¬ pelsträngigen RNA abhängigen Proteinkinase (PKR), in der Zelle. Die PKR induziert Apop- tose. Vorteilhafterweise ist mindestens eine 2'-Hydroxygruppe der Nukleotide der siRNA in der doppelsttängigen Struktur durch eine chemische Gruppe, vorzugsweise eine 2'-Amino- oder eine 2'-Methylgruppe, ersetzt. Mindestens ein Nukleotid in mindestens einem Strang der doppelsträngigen Struktur kann auch ein sogenanntes „locked nucleotide" mit einem, vor- zugsweise durch eine 2'-O, 4'-C-Methylenbrücke, chemisch modifizierten Zuckerring sein. Vorteilshafterweise sind mehrere Nukleotide „locked nucleotides".

Modifizierungen der Nukleotide von erfindungsgemäßer si/shRNA betrifft vor allem die Dissoziation der Nukleotide durch Verstärkung der Wasserstoffbrückenbindung. Die Stabüi- tat der Nukleotide wird erhöht und gegen einen Angriff von RNAsen geschützt.

Darüber hinaus kann durch Modifizierung des Rückgrates von der erfindungsgemäßen si/shRNA ein vorzeitiger Abbau verhindert werden. Insbesondere bevorzugt ist dsRNA, die (Phosphorthioat, 2'-O-Methyl-RNA, LNA, LNA/DNA-Gapmeren) modifiziert ist und daher eine längere Halbwertszeit in-vivo aufweist.

Die si/shRNA wird nach dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt, dabei werden Nukleotide, insbesondere auch Oligonukleotide, beispielsweise nach Art der Merryfield- Synthese, an einem unlöslichen Träger (H.G. Gassen, Chemical and Enzymatic Synthesis of Genfragments (Verlag Chemie, Weinheim 1982)) oder auf andere Art synthetisiert (Bey¬ er/Walter, Lehrbuch der Organischen Chemie, 20. Auflage, (S. Hirzel Verlag, Stuttgart 1984), S. 816 ff.). Die Gewinnung der VGLUT-mRNA kann durch Hybridisierung mittels Genom- und cDNA-Datenbanken erreicht werden. Erfindungsgemäße si/shRNA-Moleküle können bspw. synthetisch hergestellt werden über verschiedenen Anbietern, bspw. IBA GmbH (Göt¬ tingen, Deutschland), bezogen werden.

Erfindungsgemäße doppelsträngige RNA, insbesondere si/shRNA, kann in micellare Struktu¬ ren eingeschlossen sein, die die Separation von Substanzgruppen in-vitro und ϊn-vivo beeinflus- sen. Hierbei liegt die si/shRNA vorzugsweise in Liposomen vor. Die Liposomen sind künst¬ liche, kugelig in sich geschlossene Membranen, aus Phospholipiden, in die sowohl hydrophile Substanzen in den wässrigen Innenraum verkapselt, als auch lipophile Substanzen in den In- nenbereich der Lipidtnembtan inkorporiert werden können. Die Voraussetzung für die Ver¬ wendung von Liposomen für experimentelle oder therapeutische Zwecke ist deren Verträg¬ lichkeit mit Zellen und Geweben. Die siKNA, die vorzugsweise in den Liposomen vorliegt, kann mit einer Peptidsequenz, vorzugsweise mit einer Lysin- und Atginin-reichen Sequenz, bspw. einer Sequenz aus dem vitalen TAT-Protein (bspw. enthaltend AS 49-57) modifiziert sein, um dann als Transporterpeptid die Zellmembran leichter zu überwinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Aptamer, das eine Nukleinsäuresequenz um- fasst oder aus einer Nukleinsäuresequenz besteht, die in der Lage ist, spezifisch an eine erfin- dungsgemäße Nukleinsäure oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionelle Variante einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zu binden. Unter einem Aptamer sind Nukleinsäuren oder Nukleinsäufragmente mit Protein-bindenden Eigenschaften zu verstehen. Dazu gehören auch sog. Spiegeknere, die durch Spiegelevolution gewonnene spiegelbildliche und damit sta¬ bile Oligonukleotide darstellen, die hochaffin und hochspezifisch ein Zielmolekül binden können (Klußmann et al., 1996). Ein Aptamer gemäß der vorliegenden Erfindung weist weist vorzugsweise eine Länge von 20 bis 100 Nukleotiden, stärker bevorzugt von 18 bis 80 Nukleotiden, am stärksten bevorzugt von 60 bis 80 Nukleotiden auf.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein transgenes nichthumanes Säugetier, das min- destens ein Protein enthält, das eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 20 oder 54 oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon umfasst oder aus einer der genannten Aminosäuresequenzen besteht und/oder ein Protein enthält, das durch eine Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 codiert wird und/ oder ein Protein enthält, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert und/oder eine Nukleinsäure enthält, die für ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanes KIAA0378, murines BAB31214 und Ratten PID 12832121 /FLJ20420, oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines solchen Proteins codiert und/oder eine Nukleinsäure enthält, die aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 besteht, oder eine solche Nukleinsäuresequenz utnfasst oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante einer solchen Nukleinsäure und/oder eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA enthält, die eine Nukleinsäuresequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure zu binden, die eines der Proteine humanes KIAA0378, murines BAB31214 und Ratten PID12832121/FLJ20420 codiert bzw. spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß der Figuren 12, 21 oder 55 bindet und/oder - einen Vektor enthält, der eine der vorgenannten Nukleinsäuren enthält und/oder eine Zelle enthält, die eines/eine der vorgenannten Proteine, Nukleinsäuren und/ oder den vorgenannten Vektor enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten Keim- und somatische Zellen des transge- nen nichthumanen Säugetiers eine der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren durch chro¬ mosomale Einbringung in das Genom des Tieres oder in das Genom eines der Vorfahren des genannten Tieres. Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäuren in das Genom eines Tieres sind dem Fachmann gut bekannt.

In einer weiteten bevorzugten Ausführungsform enthalten Keim- und somatische Zellen des transgenen nichthumanen Säugetiers eine der vorstehend beschriebenen Nukleinsäuren durch chromosomale Manipulation des Genoms des Tieres oder des Genoms eines der Vorfahren des genannten Tieres in nicht mehr exprimierbarer Form enthalten. Eine solche chromoso¬ male Manipulation, die verhindert, dass die genetische Information (Nukleinsäure) nicht transkribiert wird, obwohl sie im Genom vorhanden ist, kann beispielsweise durch regulatori¬ sche Sequenzen, die zusätzlich zu dem codierenden Bereich der Nukleinsäure enthalten sind, bewirkt werden. Ebenfalls können codierende Abschnitte der Nukleinsäure entfernt werden, vorzugsweise durch Schneiden der Nukleinsäure mittels geeigneter Restriktionsenzyme. Hier¬ für geeignete Restriktionsenzyme können von dem Fachmann anhand der Restriktions- Schnittstellen dieser Enzyme in Verbindung mit der Nukleinsäuresequenz leicht bestimmt werden. Es ist besonders bevorzugt, dass es sich bei dem tcansgenen nichthumanen Säugetier um ein Nagetier, insbesondere eine Ratte oder eine Maus, handelt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Verbindung, die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifizierbar ist. Bevorzugt ist die Verbindung als schmerzregulierende Substanz identifizierbar. Besonders bevorzugt handelt es sich hierbei um eine Substanz bzw. eine schmerzregulierende Substanz, wie sie bereits oben beschrieben worden ist. „Identifizierbar" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass das Ergebnis der Messung der Bindung in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine deutlich stärkere, vorzugsweise doppelt so starke, Bindung der Verbindung an das Protein aufweist als der Durchschnitt der zu testenden Sub¬ stanzen, oder dass das Ergebnis der Änderung eines funktionellen Parameters in der Art des funktionellen Parameters oder im Ausmaß der Veränderung deutlich vom Durchschnitt der zu testenden Substanzen abweicht.

In einer weiteren Ausfuhrungsform der Erfindung kommen die Proteine bzw. Polypeptide, ggf. aber auch Nukleinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren oder Zellen der Erfindung (hiernach unter dem Begriff „erfindungsgemäße Moleküle" zusatnmengefasst) als Arzneimit-. tel oder zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen oder als Di- agnostikum in Betracht.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Arzneimittel, das (a) mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens ein Protein umfas- send eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindestens ein Protein, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens ein Protein, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stritαgenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nuklein¬ säuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle ^"Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/ oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe- sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/ oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens einen Antikörper gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens eine Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindes- tens einen Antikörper gemäß (d) (f) mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/oder (g) mindestens einen Wirkstoff, der an mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet, sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.

Erfindungsgemäß wird auch eine Kombination erfindungsgemäßer Moleküle mit pharmazeu¬ tisch geeigneten Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen offenbart. Entsprechende Herstel¬ lungswege sind bei „Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980) offenbart, das Bestandteil der Offenbarung der vorliegenden Erfindung ist. Für die parenterale Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel und Kombinationen kom¬ men als Trägerstoffe bspw. steriles Wasser, sterile Kochsalzlösungen, Polyalkylenglykole, hyd- rogenierte Naphthalen und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lac- tid/Glycolidcopolymer oder Polyoxyethylen-/Polyoxypropylencopolytneie in Bettacht. Dar¬ über hinaus können erfindungsgemäße Arzneimittel Füllsubstanzen oder Substanzen, wie Lactose, Mannitol, Substanzen zur kovalenten Anknüpfung von Polymeren, wie z.B. PoIy- ethylenglykol an erfindungsgemäße Inhibitoren, Komplexierung mit Metallionen oder Einschluß von Materialien in oder auf besondere Präparationen von Polymerverbindung, wie z.B. Polylaktat, Polyglykolsäure, Hydrogel oder auf Liposomen, Mikroemulsion, Micellen, unilamelare oder multilamekre Vesikel, Erythrozyten-Fragmente oder Sphäroplasten, enthal¬ ten. Ebenfalls enthalten sein können Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Farbstoffe und/oder Bindemittel. Die jeweiligen Ausführungsformen der Arzneimittel sind in Abhängigkeit des physikalischen Verhaltens, beispielsweise in Hinblick auf die Löslichkeit, der Stabilität, Biö- verfügbarkeit oder Abbaubarkeit, zu wählen. Kontrollierte oder konstante Freisetzung der erfindungsgemäßen Wirkstoffkomponente in der Zusammensetzung schließt Formulierungen auf der Basis lipophiler Depots ein (z.B. Fettsäuren, Wachse oder Öle). Im Rahmen der vor¬ liegenden Erfindung werden auch Beschichtungen erfindungsgemäßer Moleküle oder Arz- neimittel, die erfindungsgemäße Moleküle enthalten, offenbart, insbesondere Beschichtungen mit Polymeren, z.B. Poloxamere oder Poloxamine. Weiterhin können erfindungsgemäße Mo¬ leküle oder erfindungsgemäßer Arzneimittel protektive Beschichtungen, z.B. Proteaseinhibi- toren oder Peαneabilitätsverstärker, aufweisen.

Die Wahl geeigneter Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffen sowie die Bestimmung der zu verabreichenden Dosis hängt davon von dem Verabreichungsweg des Arzneimittels ab. Ein erfindungsgemäßes Arzneimittel kann als flüssige Arzneiformen in Form von Injektionslö¬ sungen, Tropfen oder Säfte, als halbfeste Arzneiformen in Form von Granulaten, Tabletten, Pellets, Patches, Kapseln, Pflaster oder Aerosolen (z.B. Spray) verabreicht werden. Grund- sätzHch werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung für erfindungsgemäße Arzneimittel alle im Stand der Technik bekannten Verabreichungswege offenbart, z.B. parenteral, oral, peroral, intravenös, intraperitoneal, intradermal, intramuskulär, intranasal, buccaL rectal oder örtlich, zum Beispiel auf Infektionen an der Haut, der Schleimhäute und an den Augen. Be¬ vorzugt erfolgt die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Arzneimittels parenteral, d.h. beispielsweise subkutan, intramuskulär oder intravenös, oder oral oder intranasal. Für eine parenterale, topische oder inhalative Verabreichung eignen sich Lösungen, Suspensionen, leicht rekonstituierbare Trockenzubereitungen sowie Sprays. Für eine orale Applikation eig- nen sich Zubereitungen in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulaten, Tropfen, Säf¬ ten und Sirupen. Für eine perkutane Verabreichungen liegen die erfindungsgemäßen Molekü¬ le in einem Depot in gelöster Form oder in einem Pflaster, gegebenenfalls unter Zusatz von die Hautpenetration fördernden Mitteln, vor. Durch orale oder perkutane Verabreichung kann die Freisetzung der erfindungsgemäßen Moleküle verzögern werden. Die an den Patien¬ ten zu verabreichende Dosis ist von mehreren Faktoren abhängig, beispielsweise vom Ge¬ wicht des Patienten, von der Applikationsart, der Indikation und dem Grad der Erkrankung. Üblichweise werden 2 bis 500 mg/kg wenigstens eines erfindungsgemäßen Moleküls verab¬ reicht. Wenn das Arzneimittel zur Gentherapie verwendet werden soll, sind beispielsweise physiologische Kochsalzlösung, Stabilisatoren, Proteinase- und/oder DNAse-Inhibitoren geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum, das (a) mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens ein Protein umfas¬ send eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindestens ein Protein, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens ein Protein, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nuklein¬ säuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe¬ sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens einen Antikörper gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens eine Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindes¬ tens einen Antikörper gemäß (d) (f) mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/oder (g) mindestens einen Wirkstoff, der an mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet, sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.

Ein „Diagnostikum" im Sinne der Erfindung stellt ein Hilfsmittel zur Diagnose, beispielswei¬ se eines Krankheitsgeschehens, dar. Bevorzugt ist ein Diagnostikum, das eine Nukleinsäure enthält, bei der es sich um eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA handelt. Erfindungs¬ gemäße Moleküle können ebenfalls zur in «?#»-Diagnose verwendet werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung (a) mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LElMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens eines Proteins umfas¬ send eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindestens eines Proteins, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Fi- guren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nuk- leinsäutesequenz gemäß einet det Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert oder ei¬ nes funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante eines der vorge¬ nannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe¬ sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionel- les Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindestens einen Antikörper gemäß (e) (f) mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26

(g) mindestens eines Wirkstoffs, der an mindestens ein Protein oder ein funktio¬ nelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet zur Behandlung von Schmerz und als weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung der vorgenannten Moleküle (a) bis (g) zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz. Bevorzugt handelt es sich um chronischen, insbesondere neuropathischen oder entzündungsbedingten Schmerz. Bei der Verwendung erfindungsgemäßer Molekülen als Arzneimittel zur Behandlung von Schmerz wird dem zu behandelnden Patienten vorzugsweise rekombinant hergestelltes Pro¬ tein verabreicht. Alternativ werden dem Patienten zu transfizierende Zellen entnommen, die¬ se in vitro mit erfindungsgemäßen (Expressions-) Vektoren transfiziert, kultiviert und dann als Retransplantat in den Patienten überfuhrt. Die Transfektion wird vorzugsweise durch Nuk¬ leinsäuren, Nukleinsäurekonstrukte oder (Expressions-) Vektoren vorgenommen, die die Ex¬ pression an einen regulierbaren Promotor koppeln. Das transfizierte Eigentransplantat kann lokal bspw. injiziert werden — abhängig von der spezifischen Erkrankung und den spezifi¬ schen Zielzellen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung ι (a) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein fαnkti- onelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens ei¬ ne Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/ oder mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (b) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (a), und/oder (c) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens eine Nukleinsäure gemäß (a) oder mindestens einen Vektor gemäß Punkt (b) für die Gentherapie.

Erfindungsgemäß kann es sich hierbei um in vivo oder in vittv Gentherapie handeln. Unter "Gentherapie" ist eine Form der Therapie zu verstehen, bei der durch die Einführung von Nukleinsäuren in Zellen ein Effektorgen exprimiert wird. Hierdurch kann beispielsweise ein defektes Gen ersetzt werden oder ein zusätzliches Gen eingeführt werden. Erfindungsgemäß kann es sich hierbei um in vivo oder in vitro Gentherapie handeln. Bei der in vitro Gentherapie werden Zellen aus dem Organismus entfernt, ex vivo mit Vektoren transfiziert und anschlie- ßend wieder in denselben oder in einen anderen Organismus eingebracht zu werden. Bei der in vivo Gentherapie werden Vektoren, beispielsweise zur Bekämpfung von Tumoren, syste¬ misch (z.B. über die Blutbahn) oder direkt in das Zielgewebe (z.B. in einen Tumor) verab¬ reicht. Bevorzugt ist für den Einsatz in der Gentherapie die Verwendung einer Nukleinsäure, bei der es sich um eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA handelt, oder die Teil eines Ribozyms, sonstigen DNA-Enzyms oder katalytischen RNA oder DNA darstellt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung (a) mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens eines Proteins umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindes¬ tens eines Proteins, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäurese- quenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nuk¬ leinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Anti- sense Nukleinsäure hybridisiert oder eines funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe¬ sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf- weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionel- les Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindestens einen Antikörper gemäß (d) (f) mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/oder (g) mindestens eines Wickstoffs, der an mindestens ein Protein oder ein funktio¬ nelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet, für die Diagnostik und/oder für Wirksamkeitsuntersuchungen. Erfindungsgemäß ist unter „Diagnostik" die Analyse von Symptomen, die einem Krankheitsbild zugeordnetet sind, zu verstehen und unter „Wirksamkeitsuntersuchungen" die Untersuchung der Wirksamkeit, ins- besondere der medizinischen Wirksamkeit, von Testsubstanzen zu verstehen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung (a) mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPAl /KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens eines Proteins umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindes¬ tens eines Proteins, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäurese- quenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nuk¬ leinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Anti- sense Nukleinsäure hybridisiert oder eines funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe¬ sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), und/ oder (e) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionel¬ les Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindestens einen Antikörper gemäß (d) in einem Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen.

Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Figuren und Beispielen illustriert ohne jedoch auf diese beschränkt zu werden.

Figuren Figut 1 zeigt das Coomassie-gefärbte BAC/-SDS-PAGE-Gel der Auftrennung des Triton X-100-resistenten Proteinpellets aus synaptischen Membranen des dorsalen Rü¬ ckenmarks. Die Pfeile kennzeichnen die verschiedenen Proteinspots („Spot"). Die in Beispiel 3 beschriebene Auftrennung der Proteine führte zur Identifizierung der Proteine KIAA0378 (siehe Spot21) und PID12832121/FLJ20420 (siehe Spot 76).

Figur 2 zeigt den Peptidmassenfingerprint von KLAA0378. Dargestellt ist die Auswertung der Peptidmassen-Fingerprints unter Benutzung des Programms ProFound (http://129.85.19.192/profound bin/WebProFound.exe). Es wurde die NCBI non-redundant protein database (letzter Stand: November 2002) durchsucht. Das Genprodukt wurde gemäß der Signifikanz-Kriterien des Programms als positiv i- dentifiziert ausgewiesen. Die positiv zugeordneten Peptidmassen sind gezeigt.

Nachfolgend wird die Legende der Peptidmassen-Zuordnungstabellen aufgeführt, diese gilt für Figur 2 sowie für die nachfolgenden Figuren 3, 5, 6, 7, 9 und 10.

Measured Mass (M): gemessene Peptidmasse Computed Mass: berechnete Masse Error (ppm): Abweichung der gemessenen von der berechneten Masse in parts per mülion. Avg/Mono: gemittelte oder monoisotope Peptidmasse; für die Datenbanksuche wurden ausschließlich monoisotope Peptidmassen bestimmt (indiziert in der Aus¬ wertung durch M). Residues Start-To: Position der Aminosäurereste in der Proteinsequenz, die zu dem Peptid gehören, das einer gemessenen Peptidmasse innerhalb der gesetzten Fehlertoleranz entspricht. Missed Cut: von der Protease überlesene Spaltstellen Peptide Sequence: Sequenz des Peptides, dessen Masse mit einer gemessenen Masse übereinstimmt. (1)+O@M: Die gemessene Masse stimmt mit dem vorgeschlagenen Peptid dann überein, wenn der Methioninrest oxidiert vorliegt. Sequenzabdeckung: prozentualer Anteil der Gesamtsequenz des Kandidatenpro¬ teins, der mit den passenden gemessenen Peptidmassen abgedeckt wird.

Figur 3 zeigt den Peptidmassenfingerprint von PID12832121/FLJ20420 putative protein. Dargestellt ist die Auswertung der Peptidmassen-Fingerprints unter Benutzung des Programms ProFound (http://129.85.19.192/profound bin/WebProFound.exe). Es wurde die NCBI non-redundant protein database (letzter Stand: November 2002) durchsucht. Das Genprodukt wurde gemäß der Signifikanz-Kriterien des Programms als positiv identifiziert ausgewiesen. Die positiv zugeordneten Peptid¬ massen sind gezeigt. Figur 4 zeigt das Coomassie-gefärbte BAC/-SDS-PAGE-Gel der Auftrennung des Cha- ottop-resistenten Proteinpellets aus synaptischen Membranen des dorsalen Rü¬ ckenmarks. Die Pfeile kennzeichnen die verschiedenen Proteinspots. Die in Beispiel 3 beschriebene Auftrennung der Proteine führte zur Identifizierung der Proteine LETMl (siehe Spotl9), OPA-1/KIAA0567 (siehe Sρot22) und PGRL (siehe Spot23).

Figur 5 zeigt den Peptidmassenfingerprint von dem Transmembranprotein LETMl. Dar- gestellt ist die Auswertung der Peptidmassen-Fingerprints unter Benutzung des Programms ProFound (http://129.85.19.192/profound bin/WebProFound.exe). Es wurde die NCBI non-redundant protein database (letzter Stand: November 2002) durchsucht. Das Genprodukt wurde gemäß der Signifikanz-Kriterien des Programms als positiv identifiziert ausgewiesen. Die positiv zugeordneten Peptid- massen sind gezeigt.

Figur 6 zeigt den Peptidmassenfingerprint von OPA-1/KIAA0567. Dargestellt ist die Aus¬ wertung der Peptidmassen-Fingerprints unter Benutzung des Programms ProFound (http://129.85.19.192/profound bWWebProFoundexe). Es wurde die NCBI non-redundant protein database (letzter Stand: November 2002) durchsucht. Das Genprodukt wurde gemäß der Signifikanz-Kriterien des Programms als positiv i- dentifiziert ausgewiesen. Die positiv zugeordneten Peptidmassen sind gezeigt.

Figur 7 zeigt den Peptidmassenfingerprint des Immunoglobulin superfamily Rezeptors PGRL. Dargestellt ist die Auswertung der Peptidmassen-Fingerprints unter Benut¬ zung des Programms ProFound (http://129.85.19.192/profound bin/WebProFound.exe). Es wurde die NCBI non-redundant protein database (letzter Stand: November 2002) durchsucht. Das Genprodukt wurde gemäß der Signifikanz-Kriterien des Programms als positiv i- dentifiziert ausgewiesen. Die positiv zugeordneten Peptidmassen sind gezeigt. Figur 8 zeigt das Coomassie-gefärbte BAC/-SDS-PAGE-Gel der Auftrennung des Cha- otrop-resistenten Proteinpellets aus synaptischen Membranen des dorsalen Rü¬ ckenmarks aus Ratten/FormalinmodeU. Die Pfeile kennzeichnen die verschiedenen Proteinspots. Die in Beispiel 3 beschriebene Auftrennung der Proteine führte zur Identifizierung der Proteine CPG2 (siehe Spot29) und BAB31214/Q9BU64 (siehe Spot94).

Figur 9 zeigt den Peptidmassenfingerprint von CPG2/KIAA1756 (Skript:CPG2). Darge¬ stellt ist die Auswertung der Peptidmassen-Fingerprints unter Benutzung des Pro- gramms ProFourid (http://129.85.19.192/profound bin/WebProFound.exe). Es wurde die NCBI non-redundant protein database (letzter Stand: November 2002) durchsucht. Das Genprodukt wurde gemäß der Signifikanz-Kriterien des Pro¬ gramms als positiv identifiziert ausgewiesen. Die positiv zugeordneten Peptidmas¬ sen sind gezeigt.

Figur 10 zeigt den Peptidmassenfingerprint des putativen Proteins BAB31214. Dargestellt ist die Auswertung der Peptidmassen-Fingerprints unter Benutzung des Programms ProFound (http://129.85.19.192/profound bin/WebProFound.exe). Es wurde die NCBI non-redundant protein database (letzter Stand: November 2002) durchsucht. Das Genprodukt wurde gemäß der Signifikanz-Kriterien des Programms als positiv identifiziert ausgewiesen. Die positiv zugeordneten Peptidmassen sind gezeigt.

Die Figuren 11 bis 17 betreffen das Protein KIAA0378:

Figur 11 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen Proteins KIAA0378 Figur 12 zeigt die Nukleinsäuresequenz der humanen KIAA0378 mRNA

Figur 13 zeigt das Ergebnis der Northern Blot Analyse zur Expression der KIAA0378 mRNA in der adulten Ratte. Wie zu sehen ist, konnte nur im Gehirn eine Ex¬ pression der mRNA beobachtet werden. In der Niere wurde ein Transkript geringerer Größe detektiert, hierbei könnte es sich um ein alternatives Transkript oder eine nah verwandtes Gen handeln. In allen anderen unter¬ suchten Geweben (Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Magen, Dünndarm, Thymus, Skelettmuskel, Hoden, Gebärmutter, Placenta) wurde keine Expres- sion beobachtet. Diese Befunde sprechen für eine selektive Expression von KIAA0378 im Nervensystem und lassen die Verwendung des KIAA0378 zur Entwicklung nebenwirkungsarmer Analgetika als sehr interessant erscheinen.

Figur 14 zeigt die zelluläre Lokalisation des KIAA0378 mRNA-Transkripts in Spinal- ganglien der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung. Es ist ein starkes Sig¬ nal der KIAA0378 mRNA in den DRGs zu erkennen. Eine detaillierte Zu¬ ordnung zu einzelnen Zellpopulationen war nicht möglich.

Figur 15 zeigt die zelluläre Lokaüsation des KIAA0378 mRNA-Transkripts im Rü- ckenrnark der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung. Es ist zu erkennen, dass die KIAA0378 mRNA im Rückenmark nicht detektiert wurde.

Figuren 16 und 17 zeigen die zelluläre Lokalisation des KIAA0378 mRNA-Transkripts im Ge- hirn (Hippocampus) (Figur 16) und im Gesamtgehirn (Figur 17) der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung. Wie zu sehen ist, konnte die KIAA0378 mRNA konnte in folgenden Gehirnregionen detektiert werden: olfaktorischer Nukleus, Kortex, Hippocampus (CA3, Denate gyrus), Substantia nigra, Hirn- stammkerne (pontine nuclei), plexus chorioideus.

Die Figuren 18 bis 26 betreffen das Protein BAB31214/Q9BU64:

Figur 18 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen Proteins Q9BU64 Figur 19 zeigt die Nukleotidsequenz des humanen Q9BU64-Gens (Äccession-Nr. BC 002870) Figur 20 zeigt die Aminosäuresequenz des Maus-Orthologen BAB31214 zum humanen Protein Q9BU64 Figur 21 zeigt die Nukleotidsequenz des Maus-Orthologen BAB31214-Gens zum hu¬ manen Q9BU64-Gen Figut 22 zeigt die Northern Blot Analyse zur Expression der BAB31214/Q9BU64 mRNA in der adulten Ratte (Sonde BAB 21974), die das Ratten-Orthologe zum humanen Q9BU64 bzw. BAB31214 darstellt. Es ist zu erkennen, dass nur im Gehirn und in der Milz eine Expression der mRNA beobachtet wer¬ den, im Hoden wurde ein Transkript geringerer Größe detektiert, hierbei könnte es sich um ein alternatives Transkript oder eine nah verwandtes Gen handeln. In allen anderen untersuchten Geweben (Herz, Lunge, Leber, Niere, Magen, Dünndarm, Thymus, Skelettmuskel, Gebärmutter, Placenta) wurde keine Expression beobachtet. Diese Befunde sprechen für eine selektive Ex¬ pression von Q9BU64/BAB31214 im Nervensystem und lassen die Verwen¬ dung des BAB31214 zur Entwicklung nebenwkkungsarmer Analgetika als sehr interessant erscheinen.

Figur 23 zeigt die zelluläre Lokalisation des BAB31214/Q9BU64 mRNA-Transktipts in Spinalganglien der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung. Es ist zu er¬ kennen, dass die BAB31214/Q9BU64 mRNA ein sehr starkes Signal in den DRGs aufwies. Eine detaillierte Zuordnung zu einzelnen Zellpopulationen war in der vorliegenden Analyse nicht möglich.

Figur 24 zeigt die zelluläre Lokalisation des BAB31214/Q9BU64 mRNA-Transkripts im Rückenmark der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung. Im Ergebnis zeigte die BAB31214/Q9BU64 mRNA im Rückenmark ein sehr starkes Signal in der grauen Substanz, sowohl im tiefen Hinterhorn als auch im Vorderhorn. Motoneurone zeigen sehr starke Expression.

Figuren 25 und 26 zeigt die zelluläre Lokalisation des BAB31214/Q9BU64 mRNA-Transkripts im Gehirn (Figur 25) und Gesamtgehirn (Figur 26) der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung. Die BAB31214/Q9BU64 mRNA konnte in folgenden Gehknregionen detektiett werden: Olfaktorischer Nucleus, Kortex (cingular cortex), Hippocampus (CA1-3; DG dentate gyrus), Nucleus caudatus und pu- tatnen (Striatum), Ventral palidum, Thalamus (nucl. thal. mediodorsal, central medial und centrolateralis, dorsaler Cortex der Colliculi des Tectums), Hypo¬ thalamus (arcuate hypothal. Nucl., dorsomedial hypothal. Nucl.) Substantia ni¬ gra, Zona incerta, Hirnstammkerne (pontine nuclei, 7 facial Nuclei, reticular nuclei), plexus choroideus, Cerebellum.

Die Figuren 27 bis 37 betreffen das Protein OPA-1/KIAA0567:

Figur 27 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen OPA-I /KIAA0567 Proteins Figur 28 zeigt die Nukleotidsequenz der humanen OPA-I /KIAA0567 mRNA Figur 29 zeigt die Aminosäuresequenz des Maus OPA-I /KIAA0567 Proteins Figur 30 zeigt die Nukleotidsequenz der Maus OPA-I /KIAA0567 mRNA Figur 31 zeigt die Aminosäuresequenz des Ratten OPA-I /KIAA0567 Proteins Figur 32 zeigt die Nukleotidsequenz der Ratten OPA-I /KIAA0567 mRNA

Figur 33 zeigt die Northern Blot Analyse zur Expression der OPA-I /KIAA0567 mRNA in der adulten Ratte (Sonde BB617042). Es ist zu erkennen, das die stärkste Expression im Gehirn zu vorlag, gefolgt von der Placenta und dem Uterus. In allen anderen untersuchten Geweben (Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Magen, Dünndarm, Thymus, Hoden, Skelettmuskel) wurde keine Ex- pression beobachtet. Diese Befunde sprechen für eine relativ selektive Ex¬ pression von OPA-I /KIAA0567 im Nervensystem.

Figur 34 zeigt die zelluläre Lokalisation des OPA-I /KIAA0567 mRNA-Transkripts in Spinalganglien der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung (Sonde BB617042). Die OPA-1KIAA0567 mRNA wies ein relativ schwaches Signal in den DRGs auf. Eine detaillierte Zuordnung zu einzelnen Zellpopulationen war in der vorliegenden Analyse nicht möglich. Figur 35 2eigt die zelluläre Lokalisation des OPA-I /KIAA0567 mRNA-Transkripts im Rückenmark der adulten Ratte mittels in situ-Hybridisierung (Sonde BB617042). Die OPA-I /KIAA0567 mRNA zeigte im Rückenmark ein relativ schwaches Signal in der grauen Substanz mit stärkstem Signal im oberflächli¬ chen Hinterhom (DH) in den Laminae I/II. Zudem zeigten sich Signale in den Motoneuronen.

Figuren 36 und 37 zeigt die zelluläre Lokalisation des OPA-I /KIAA0567 mRNA-Transkripts Gehirn (Figur 37) und im Gesamtgehirn (Figur 38) der adulten Ratte mittels in situ-Hybάdisierung. Die OPA-I /KIAA0567 mRNA konnte in folgenden Ge¬ hirnregionen detektiert werden: Olfactory nu, Cortex, Dorsal cortex colliculus, Hippocampus (CA1-3; DG dentate gyms), Nucleus caudatus + putamen (Stti- atum), Hypothalamus, Amygdala, Cerebellum.

Die Figuren 38 bis 43 betreffen das Protein CPG2/KIAA1756:

Figur 38 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen KIAAl 756 Proteins Figur 39 zeigt die Nukleotidsequenz der humanen KIAAl 756 mRNA Figur 40 zeigt die Aminosäuresequenz des Maus CPG2 Proteins Figur 41 zeigt die Nukleotidsequenz der Maus CPG2 mRNA Figur 42 zeigt die Aminosäuresequenz des CPG2 Ratten-Proteins Figur 43 zeigt die Nukleotidsequenz der CPG2 Ratten mRNA

Die Figuren 44 bis 49 betreffen das Protein LETMl:

Figur 44 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen LETMl Proteins Figur 45 zeigt die Nukleotidsequenz der humanen LETMl mRNA Figur 46 zeigt die Aminosäuresequenz des Maus LETMl Proteins Figur 47 zeigt die Nukleotidsequenz der Maus LETMl mRNA Figur 48 zeigt die Aminosäuresequenz des Ratten LETMl Proteins Figur 49 zeigt die Nukleotidsequenz der Ratten LETMl mRNA

Die Figuren 50 bis 55 betreffen das Protein PID12832121/FLJ20420:

Figur 50 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen FLJ20420 Proteins Figur 51 zeigt die Nukleotidsequenz der humanen FLJ20420 mRNA Figur 52 zeigt die Aminosäuresequenz des Maus FLJ20420 Proteins Figur 53 zeigt die Nukleotidsequenz der Maus FLJ20420 mRNA Figur 54 zeigt die Aminosäuresequenz des Ratten PID12832121 Proteins Figur 55 zeigt die Nukleotidsequenz der Ratten PID12832121 mRNA

Die Figuren 56 bis 61 betreffen das Protein PGRL:

Figur 56 zeigt die Aminosäuresequenz des humanen PGRL Proteins Figur 57 zeigt die Nukleotidsequenz der humanen PGRL mRNA Figur 58 zeigt die Aminosäuresequenz des Maus PGRL Proteins Figur 59 zeigt die Nukleotidsequenz der Maus PGRL mRNA Figur 60 zeigt die Aminosäuresequenz des Ratten PGRL Proteins Figur 61 zeigt die Nukleotidsequenz der Ratten PGRL mRNA

Beispiele

Beispiel 1: Präparation synaptischer Membranen (nach Tom Dieck et aL, 1998)

Ausgangsmaterial waren dorsale Hälften aus dem Rückenmark von Ratten. Das Gewebe wurde zunächst in Präparationspuffer I (0.32 M Sucrose, 5 mM HEPES/NaOH pH 7.4, Pro- teaseinhibitoren) zu 10 ml pro Gramm Feuchtgewicht an Gewebe aufgenommen und in ei- nem Glas/Teflon-Homogenisator homogenisiert (12 Züge, 900 rpm). Das Homogenisat wurde für 10 min bei 1000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde für die Weiterverwendung aufgehoben, das Pellet nochmals in Puffer I aufgenommen. Die Homogenisierungsprozedur wurde wiederholt, nach Zentrifugation der Überstand mit dem ersten Überstand vereinigt (Überstände Sl). Die Sl-Fraktion wurde für 15 min bei 12000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde zur Weiterverarbeitung in Puffer I aufgenommen. Es erfolgte eine erneute Homogeni¬ sation (6 Züge, 900 rpm) und eine Zentrifugation bei 12000 x g für 20 Min. Das Pellet wurde zu 1,5 ml pro Gramm Feuchtgewicht an Ausgangsgewebe in Puffer II (0.32 M Sucrose, 5 roM Tris/HCl, pH 8,1, Proteaseinhibitoren) aufgenommen und auf einen diskontinuierlichen Suc- rosegradienten mit der Schichtung (von unten nach oben): 1,2 M Sucrose, 1 M Sucrose, 0,8 M Sucrose geladen. Es erfolgte eine Dichtegradientenzentrifugation für 2h bei 85000 x g. Die Synaptosomenfraktion konnte an der Phasengrenze 1,2M Sucrose/ IM Sucrose geerntet wer- den. Die Synaptosomen wurden einem osmotischen Schock ausgesetzt (fünffaches Volumen von 1 mM Tris/HCl, pH 8,1 unter Rühren bei O⁰C für 30 min). Die Synaptosomenmembra- nen wurden durch Zentrifugation bei 33000 x g für 30 min pellettiert.

Beispiel 2: Subfraktionierung der Synaptosomenmembranen (Strategie nach Dteger et al., 2001)

Nach Proteinbestimmung (Bradford-Methode, 1976: Bradford M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principles of pro- tein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254) wurden je 200 μg des Rohpräparates synapti¬ scher Membranen für die weitere Fraktionierung eingesetzt. Das Präparat wurde entweder (a) auf 0.5% (w/v) Triton X-100 eingestellt und 15 min bei 4⁰C geschüttelt, danach für 15 min in einer Tischzentrifuge abzentrifugiert, oder (b) 10 min in der Tischzentrifuge abzentrifugiert, und entsprechend dem Ausgangsvolumen in 4M Harnstoff/ 0.1M Na₂CO₃-Lösung aufge- nommen. Nach Resuspension wurde das Präparat für 30 min in einer Tisch-Ultrazentidfuge (Airfuge, Beckman-Coulter GmbH, Krefeld bei 2,8 psi) abzentrifugiert. Sowohl nach Proze¬ dur (a) als auch nach Prozedur (b) wurden die Pellet-Fraktionen weiterverarbeitet. Die Sub¬ fraktionierung führte zur Anreicherung unterschiedlicher Substrukturen synaptischer Memb¬ ranen und machte teilweise nicht-überlappende Proteinpopulationen der Analyse zugänglich. Beispiel 3: Separation der Proteine und Vorbereitung für die Massenspektrometrie

Die Proteine wurden in Probenpuffer für die lό-Benzyldimetiiyl-hexadecylammoni-urnchlorid (16-BAC)-Gelelektrophorese aufgenommen und auf 4-10% Acrylamid-Gradientengelen auf- getrennt. In einer zweiten Auftrennung wurden die Proteine dann in einer SDS-PAGE aufge¬ trennt. Es wurde die Methode nach Hartinger et al., 1996, bitte Literaturangabe nachrei¬ chen angewendet. Die Proteingele wurden mit Coomassie G-250 gefärbt. Alle unterscheidba¬ ren Proteinspots wurden manuell ausgeschnitten. Die Proteine wurden im Gel nach der Me¬ thode von Shevchenko et al. (1996) gespalten. Die Peptidmischungen wurden mittels Matrix- unterstützter Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) vermessen. Die Proteine wurden Datenbank-gestützt mittels der Programme ProFound und Mascot i- dentifiziert. In manchen Fällen wurden einzelne Peptide ausgewählt, um Fragmentio¬ nenspektrum zur Gewinnung partieller Sequenzinformation aufzunehmen.

Beispiel 4: Northern Blot Analysen zur Erstellung eines mRNA-Expressionsprofϊls in verschiedenen Geweben der adulten Ratte

Zur Erstellung eines mRNA-Expressionsprofils der identifizierten Proteine in verschiedenen Geweben der adulten Ratte wurden Northern Blot Analysen unter den folgenden Bedingun¬ gen durchgeführt:

Radioaktive Markierung des cDNA-Fragmentes (Ready-To Go-DNA-Labelling Kit, Fa. Amersham Pharmacia)

50ng cDNA in 45μl Wasser verdünnen 3 min bei 100⁰C denaturieren, auf Eis abschrecken zu dem DNA Labelling Bead hinzugeben - vorsichtig auf und ab pipettieren, bis sich das Bead vollständig aufgelöst hat - Zugabe von 5μl [α-³³P]dCTP lOmCi/ml [50μCη (Fa. Hartmann Analytics, Braun¬ schweig) nochmals vorsichtig auf und ab pipettieren - 1 h bei 37°C inkubieren 2 min auf Eis kurz herunterzentrifugieren - Sonde über ProbeQuant G-50 Micro Column (Fa. Amersham Pharmacia) aufreinigen: 3 Min. bei 2800 rpm zentrifugieren Sonden in der Mitte auftragen 3 Min. bei 2800 rpm zentrifugieren lμl in 15 ml Szintilatiorflüßigkeit geben: ³³P Messung am LKB Counter - Sollaktivität : 1-2 x 10⁶cpm / ml Hybridiserungslösung

Prähybridisierung der Filter 5ml Micro-Hyb™ Puffer (Fa. Invitrogen) zu den Filtern hinzugeben + 5 μg COT-I DNA (Fa. Invitrogen) (vorher 3 min bei 100°C denaturiert) + 5 μg PoIy dA (Fa. Roche) bei 42⁰C im Hybridisierungsofen für 2 Std prähybridisieren

Hybridisierung der Filter ³³P markiertes DNA-Fragment für 3 min bei 100°C denaturieren auf Eis abschrecken zur Prähybridisierungslösung hinzugeben (Soll: 1-2 x 10⁶cpm / ml Hybridisierungslösung) über Nacht bei 42⁰C hybridisieren (ca. 12-18 Std.)

Waschen der Filter 2 x 20 min mit 2 x SSC / 1 % SDS bei 50°C 1 x 15 min mit 0,5 x SSC / 1 % SDS bei 55°C

Auswertung der Filter Exposition für 2-7 Tage mit ImageScreen (Fa. Fuji) Vermessung der Sreens mit dem Stormlmager™ (Fa. Molecular Devices) Beispiel 5: In s/ϊα-Hybridisierung zur zellulären Lokalisation der mRNA- Transkripte im Nervengewebe der Ratte

Zur Analyse der zellulären Lokalisation der mRNA der identifizierten Proteine in schmerzre- levanten Geweben der adulten Ratte wurden in J7&-Hybridisierungsexperitnente unter folgen¬ den Bedingungen duchgeführt.

cRNA-Proben Spezifische Fragmente der untersuchtet cDNAs wurden in den Vektor pCRII-TOPO subkloniert und zur in vitro-Transktiption herangezogen. Die Transkription unter Verwen¬ dung von ³⁵S-UTP und die Aufreinigung der Transkripte wurde gemäß Schäfer et al. (1994) durchgeführt. Nach der Transkription wurden die Proben einer moderaten alkalischen Hyd¬ rolyse unterworfen wie von Angerer et al. (1987) beschrieben.

In J7/#-Hybridisierung Die in

Analyse wurde anhand eines bereits publizierten Protokolls durch¬ geführt (Schäfer et al., 1992, Schäfer & Day, 1995). Hierbei wurden Kryostat-Schnitte mit einer Dicke von 12μm in 4%iger Formaldehydlösung für eine Stunde fixiert und anschließend drei Mal für 10 Minuten mit 1OmM Phosphat-gepufferter Lösung (PBS), pH7.4 gewaschen. Ein abschließender Waschschritt erfolgte mit 1OmM PBS mit 0.4% Triton X-100. Die Schnit¬ te wurden kurz mit destilliertem Wasser abgespült und mit 0.1M Triethanolamin-Lösung pH 8.0 gewaschen gefolgt von einem Waschschritt mit 0.1M Triethanolamin pH 8.0 mit 0,25% (vol/vol) Essigsäureanhydrid für 10 min bei Raumtemperatur durchgeführt wurde. Nach Inkubation in einem 2 X SSC-Puffer wurden die Schnitte in einer aufsteigenden Alko- holreihe (50%, 70%) dehydriert und an der Luft getrocknet. Die radioaktiven Proben wurden in der Hybridisierungslösung (3 x SSC, 5OmM NaPO₄, 1OmM Dithiothreitol, 1 x Denhardt's Lösung, 0,25g/l Hefe tRNA, 10% Dextransulfat und 50% Formamid) zu einer finalen Kon¬ zentration von 5 x 10⁴ dpm/ul verdünnt. Es wurden 30-50μl dieser Lösung auf jeden Gewe¬ beschnitt gegeben, mit einem Coverslip abgedeckt und für 14 Stunden bei 60°C inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte in 2 x SSC und 1 x SSC für je 20 min gewaschen, gefolgt von einer Inkubation in einem RNase Puffer (1OmM Tris, pH 8,0; 0,5M NaCl; ImM EDTA) mit lU/ml RNaseTl und 20μg/ml RNaseA (Fa. Roche, Mannheim) für 30 min bei 37⁰C. Es folgten konsekutive Waschschritte in 1 x SSC, 0.5 x SSC , 0.2 x SSC und destilliertem Wasser. Die Schnitte wurden durch Inkubation in 50%igen und 70%igen Isopropanol dehydriert. Die Zusammensetzung und Herstellung der verwendeten Standardpuffer ist in Sambrook et al. (2001, Band 3, Appendix 1: A.1.2 - A 1.20) beschrieben.

Bildanalyse Die Autoradiographie der 35S-markierten Gewebeschnitte erfolgte durch Eintauchen in eine „NTB-2 Nuclear Emulsion" (Eastman Kodak, Rochester, NY). Die Expositionszeiten betru¬ gen zwischen 10 und 20 Tagen. Nach photographischer Entwicklung wurden die Autoradio- gramme mit einem Olympus AX_70 Mikroskop und der MCID M4 Bildanalyse-Software (Imaging Research Inc., Ontario, Kanada) analysiert. Eine Cresylviolett-Färbung wurde als Gegenfärbung durchgeführt.

Beispiel 6: mRNA-Regulation in Spinalganglien von Ratten aus chronischen Schmerzmodellen

Zur Analyse der Regulation der KIAA0378-mRNA in Tierschmerzmodellen (Ratten) wurde eine PIQOR™-cDNA-Array-Analyse durchgeführt. Hierzu werden aus Schmerz-behandelten Tieren und Kontroll-Tieren Spinalganglien entnommen und auf Genexpression hin analysiert. Die Vorgehensweise wird im Folgenden beschrieben:

6.1. PIQOR™ cDNA Arrays Es wurde eine Kollektion von cDNA-Fragmenten (Spezies Mensch, Maus, Ratte) speziell zur Herstellung von PIQOR™ cDNA Arrays erstellt. Um eine möglichst hohe Selektivität zu erreichen und falsch positive bzw. falsch negative Ergebnisse aufgrund von Kreuzhybridisie- rung zu vermeiden, wurden cDNA-Fragmente nach folgenden Kriterien hergestellt: keine repetitiven Elemente (z.B. Alu, Bl, MIRs, Mikrosatelliten) enthalten, Sequenzhomologie zu allen anderen bekannten cDNAs (öffentliche Datenbanken) < 85%, Die Fragmentlänge: 200 bis 400 Basenpaare (bp), ausgewähltes Fragment deckt jeweils alle alternativen. Spleiß- und Polyadenylierungsvari- anten ab.

6.2. Herstellung themenspezifischer PIQOR™ Arrays Es wurden PIQOR™ Arrays mit insgesamt 1241 cDNAs hergestellt. Bei 636 cDNAs handelt es sich um PIQOR™ Fragmente (Spezies Ratte, inkl. 64 Maus-Fragmenten), 583 cDNAs wurden im Rahmen einer subtraktiven Hybridisierung isoliert (GT-Klone) und 16 cDNAs stammten aus anderen Ansätzen. Als Positivkontrollen wurden auf den Arrays sechs "house- keeping"-Gene und vier DNA-Fragmente aus E.coli (CR: control RAM) aufgetragen. Letztere wurden in Form von in vitro transkribierter RNA zu der Ratten-RNA gegeben, um den Mar- kierungs- und Hybridisierungsprozess zu kontrollieren. Als Negativkontrollen wurden Lachs¬ sperma-DNA und Puffer aufgetragen. Von jedem klonierten cDNA-Fragment wurde eine Amplifikation des Inserts mit Vektor-Primern durchgeführt, die Amplifikate wurden im Aga- rosegel aufgetrennt und die Länge der Inserts kontrolliert. Die amplifizierten cDNAs wurden anschließend aufgereinigt und auf eine einheitliche Konzentration von ca. 100 ng/μl einge¬ stellt. Gleiche Mengen der PCR-Amplifikate der klonierten cDNA-Fragmente wurden mit einem Dispensiergerät auf die Oberfläche derivatisierter Objektträger aufgetropft. Zur Quali¬ tätskontrolle wurde die DNA der produzierten Charge mit einem fluoreszierenden Farbstoff angefärbt. Jede cDNA wurde vierfach aufgetragen, so dass insgesamt 4964 Spots je Array vorhanden waren.

6.3. Aufbereitung der Spinalganglien Es wurde eine Behandlung von fünf Tieren je Bedingung sowie die Entnahme der Spinal¬ ganglien durchgeführt. Für die Hybridisierung wurde amplifizierte RNA (aRNA) aus durch- geführten Präparationen der PIQOR™-Fragmente schockgefrorener Gewebe verwendet.

6.4. Hybridisierung der PIQOR™ cDNA Arrays Für die Bestimmung der Expressionsprofile wurden jeweils 2 μg aRNA aus der Versuchs¬ gruppe mit Cy5 und die gleiche Menge aRNA aus der Kontrollgruppe mit Cy3 markiert und gemeinsam auf einem PIQOR™ cDNA Array hybridisiert. Die Markierung wurde durch reverse Transkription unter Einbau fluoreszierender Nukleotide (Cy5-dCTP bzw. Cy3-dCTP) erreicht. Die Tabellen 1 und 2 geben eine Übersicht über die durchgeführten Hybridisierun¬ gen. Tabelle. 1: Zusammenfassung der ersten neun Hybridisierungen auf den PIQOR™ cDNA Arrays

Tabelle. 2: Zusammenfassung der weiteren fünf Hybridisierungen auf den PIQOR™ cDNA Arrays

Ergebnisse der cDNA-Array-Analysen Für das cDNA-Fragment des Proteins KIAA0378 wurde in dem Chung-Modell 7 Tage nach Operation eine Expression beobachtet, mit einem Quotienten von 1,01 war allerdings keine Regulation detektierbar. In allen anderen untersuchten Modellen (siehe Tabelle 1 und 2) war keine Expression zu detektieren.

Die Durchfuhrung des Experiments erfolgte anhand des PIQOR™ Array- Hybridisierungsprotokolls (s. im folgenden unter I. - VIL). Nachfolgend werden Auszüge aus dem PIQOR™ Array-Hybridisierungsprotokoll in aufgeführt:

I. mRNA Amplifikationsprotokoll

1.1 Erststrangsynthese

Die folgenden Substanzen wurden in einem 1,5 ml RNase-freien Mikrozentrifugen-"tube" miteinander kombiniert: 4 μl 5 x Erststrangpuffer (Gibco) 2 μl 0,1 M DTT (Gibco) 1 μl 100 μM T7-(T)24 Primer 1 μl 10 mM dNTPs 10 μl der Gesamt-RNA wurden hinzugefügt (wobei empfohlen wird, 2 μg der Gesamt- RNA als Startmaterial für die Amplifikation zu verwenden). Dann wurde (gegebenenfalls mit hoher Drehzahl) gemischt. Die Mischung wurde bei 65 °C für 5 Min. inkubiert. Darauf- hin wurde das Röhrchen ("tube") bei 42 °C für 2 Min. aufbewahrt. Schließlich wurden 2 μl SSII RT (400 U) (Gibco) hinzugefügt. Es musste sichergestellt werden, dass das Enzym in eine gut gemischte Reaktion hinzugefügt wurde. Die Inkubation wurde bei 42 ⁰C für 1 Stunde durchgeführt und danach das inkubierte Material auf Eis gesetzt.

1.2 Zweitstrangsynthese Alle Reagenzien und Strang"-tubes" wurden geeist. Es wurde zu den Strang-"tubes" hinzuge¬ fügt: 91.3 μl DEPC H2O 30 μl 5 x Zweitstrangpuffer (Gibco) 4 μl DNA Polymerase I (40 U) (Gibco) 3 μl 10 mM dNTPs 1 μl E.coli DNA Ligase (10 U) (Gibco) 0.7 μl RNase H (2 U) (Gibco) Es wurde stark gemixt (mit hoher Drehzahl). Bei 16 ⁰C wurde für 2 Stunden inkubiert und optional bei -20 °C gelagert.

1.3 Reinigung ("clean-up") der ds-cDNA (siehe auch QIAquick' Spin Handbook) Es wurden 750 μl des Puffers PB zum Strang-"tube" hinzugefügt. Eine QIAquick Spinsäu¬ le wurde in ein 2 ml "collection tube" gesetzt. Die Probe wurde auf die QIAquick-Säule aufgebracht. Es wurde für 1 Min. zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die QIAquick-Säule zurück in das gleiche "tube" gesetzt. 0.75 ml Puffer PE wurden zur QIA- quick-Säule hinzugefügt. Es wurde für 1 Min. zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die QIAquick-Säule zurück in das gleiche "tube" gesetzt. Der "tube" wurde für eine wei¬ tere Minute bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugiert. Die QIAquick-Spin-Säule wurde in ein steriles („clean") 1.5-ml "tube" gesetzt. Um die ds-cDNA zu eluieren, wurden 30 μl RNa- se-freie H₂O auf die Mitte der QIAquick Membran hinzugefügt. Es wurde 1 Min. bei Raum- temperatur inkubiert. Dann wurde bei einer maximalen Geschwindigkeit für 1 Min. zentrifu¬ giert und schließlich auf 8 μl konzentriert.

1.4 aRNA Synthese: T7 in vitro Transkription (Ambion) Es wurden alle Reagenzien aufgetaut und auf Raumtemperatur gebracht. Es sollte beachtet werden, dass Spermidin im Transkriptionspuffer zu einem Niederschlag der "template DNA" führen kann, wenn die Reaktion auf Eis stattfindet. Es wurde ein NTP-Mix (pro "tube") hergestellt: 2 μl ATP Lösung (75 mM) 2 μl GTP Lösung (75 mM) 2 μl CTP Lösung (75 mM) 2 μl UTP Lösung (75 mM) 2 μl 10 x Reaktionspuffer Dann wurde zum ds-cDNA "tube" (gereinigt) hinzugefügt: 10 ul NTP-Mk 2 μl Enzym-Mix (Ambion) Es wurde moderat gemischt (mit niedriger Drehzahl) und bei 37 °C für 6 Stunden inkubiert. Hierbei sollte beachtet werden, dass die IVT "tubes" in einem Wasserbad konstanter Tempe¬ ratur oder einem Thermocycler mit einem Heiz-"lid" (0.2-ml "tube") inkubiert werden sollte.

1.5 In Vitro Transkription "Clean-up" (siehe RNeasy' Mini Handbook) Es wurde in einem IVT Reaktions "tube" gemischt: 80 μl RNase-freie H2O 350 μl RLT Puffer Dann wurden 250 μl 100%ige EtOH hinzugefügt. Diese Probe wurde zur RNeasy Spinsäule transferiert. Es wurde für 15 Sek. bei maximaler Geschwindigkeit gedreht. Die Transferspin- säule wurde zu einem neuen "collection tube" transferiert. 500 μl RPE Puffer wurden hinzugefügt. Es wurde für 15 Sek. bei maximaler Geschwindigkeit gedreht. Die Spinsäule wurde zu einem neuen "collection tube" transferiert. Es wurden 500 μl RPE Puffer hinzugefugt. Es wurde für 2 Min. bei maximaler Geschwindigkeit gedreht. Die Spinsäule wurde zu einem wiederum neuen "collection tube" transferiert. Es wurden 50 μl RNase-freies H₂O zur Membran der Spinnsäule hinzugefugt und für 4 Min. inkubiert. Es wurde für 1 Min. bei maximaler Geschwindigkeit gedreht. Die Schritte 13-15 wurden unter Verwendung der Elution als Elution wiederholt. Daraufhin wurde die OD (1:50 Verdünnung) gemessen. Gegebenenfalls kann eine Lagerung bei —20 ⁰C erfolgen.

II. Markierungsreaktion Die folgenden Substanzen wurden in einem 1,5 ml RNase-freien Mikrozentrifu- gen-"tube" miteinander kombiniert:

Es wurden 15 μl der aRNA (2 μg) und jeweils 2 μl der Kontroll-RNA 1 und 2 hinzugefügt. Dann wurde gevortext, mit hoher Drehzahl. Bei 65⁰C wurde für 5 Min. inkubiert und danach wurde die Inkubationslösung auf 42 ⁰C gebracht. 1 μl (200 u) des SSII Enzyms, wobei sichergestellt sein soll, dass das Enzym gut gemixt ist, wurde der Reaktion hinzugegeben. Bei 42°C wurde für 30 Min. inkubiert. Dann wurden 2 μl des SSII Enzyms (wobei wiederum das Enzym gut gemixt der Reaktion hinzugefügt werden sollte) hinzugefügt, daraufhin bei 42⁰C für 30 Min. inkubiert, dann wurden 0.5 μl RNase H hinzugefügt. Bei 37°C wurde für 20 Min. inkubiert, um RNA zu hydrolisieren.

III. Proben "clean-up" (siehe QIAquick^" Spin Handbook) Cy3- und Cy5-markierte Proben wurden kombiniert und 400 μl Puffer PB hinzu¬ gefügt. Eine QlAquick-Spinnsäule wurde in eine 2-ml "collection tube" hinzuge- fügt. Die Probe wurde auf die QIAquick-Säule aufgebracht und für 30-60 Sek. zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Die QIAquick-Säule wurde in das gleiche "tube" zurückgegeben. Um zu waschen, wurden 0,75 ml Puffer PE zur QIAquick-Säule hinzugegeben und für 30-60 Sek. zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und die QIAquick-Säule zurück in das gleiche "tube" gestellt. Die Säule wurde für eine weitere Minute bei maximalet Geschwindigkeit zentrifu¬ giert. Die QIAquick-Säule wurde in ein steriles ("clean") 1,5 ml "microfuge tube" gesetzt. Um die DNA zu eluieren, wurden 30 μl H₂O pH 8 auf. die Mitte der QIA- quick-Membran hinzugefügt. Die Säule wurde für 1 Min. stehengelassen und dann für 1 Min. zentrifugiert. Es wurde in einem "SpeedVac" bei 45 ⁰C bis zu einem Volumen von ~ lOμl konzentriert, wobei darauf geachtet werden soll, dass die Probe nicht austrocknet. 10 μl 2 x Hybridisierungslösung, auf 42 ⁰C vorgewärmt, wurden hinzugefügt. Die Probe wurde bei Raumtemperatur im Dunkeln aufbe¬ wahrt, bis die Prä-Hybridisierung beendet war. IV. PIQOR™ Chip-Vorbehandlung Der PIQOR™-Chip wurde bei 98 °C in destilliertem Wasser für 2 Min. erhitzt. Der PIQOR™-Chip wurde in 96%igen Ethanol transferiert und durch Zentrifu- gation bei 500 x g für 3 Min. getrocknet und in eine staubfreie Kassette platziert.

V. Ptä-Hybridisierung Die PIQOR™ Prä-Hybridisierungslösung wurde bei 98°C für 2 Min. erhitzt, schnell gedreht und auf 42⁰C abgekühlt. Der PIQR™-Chip wurde auf das "Pat¬ tern Slide" gesetzt. 20 μl der PIQOR™ Prä-Hybridisierungslösung wurden auf das vorgegebene Rechteck des PIQOR™-Chips aufgebracht. Das Deckblättchen wurde auf den PIQOR™-Chip gesetzt und der Chip wurde in die befeuchtete Hybridisierungskassette (z.B. PIQOR™- HybChamb) eingefügt, die Hybridisie- rungskassette wurde verschlossen und bei 62°C für mindestens 30 Min. inkubiert.

VI. Hybridisierung Die Hybridisierungskassette wurde auf 25 ⁰C abgekühlt. Der PIQOR™-Chip wurde auf den "Pattern Slide" gesetzt. Das Deckblättchen wurde vorsichtig von dem PIQOR™-Chip entfernt. 20 μl der markierten Probe wurden auf das vorge¬ gebene Rechteck des PIQOR™ Chips aufgebracht. Das Deckblättchen wurde auf dem PIQOR™-Chip platziert (es sollte nicht das Deckblättchen der Prä- Hybridisierung wieder verwendet werden) und in die befeuchtete Hybridisie¬ rungskassette gesetzt und bei 62°C für mindestens 6 Stunden inkubiert.

VII. Waschen Der PIQOR™-Chip wurde aus der Hybridisierungskassette entfernt (Abkühlung sollte vermieden werden!) und sofort in eine Waschschale, gefüllt mit 1 x Wasch¬ puffer 1 für 5 Min. (Raumtemperatur 20 — 30 °C) gesetzt werden. Der Wasch- schritt wurde mit frischem 1 x Waschpuffer 1 wiederholt. Der Waschschritt wur¬ de mit 1 x Waschpuffer 2 wiederholt. Es wurde durch Zentrifugation bei 500 x g für 3 Min. getrocknet. Dann erfolgte eine Überführung in eine staubfreie Kasset¬ te. Literaturliste:

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zum Auffinden schmerzregulierender Substanzen umfassend die folgenden Schritte: (a) Inkubation einer zu testenden Substanz unter geeigneten Bedingungen mit einer Zel¬ le und/oder einer Präparation aus einer solchen Zelle, die mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens ein Protein umfassend eine Aminosäuresequenz ge¬ mäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindestens ein Protein, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder ein Protein, das durch eine Nuklein¬ säure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure um¬ fassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines der vorgenannten Protein synthetisiert hat, (b) Messung der Bindung der Testsubstanz an das mindestens eine von der Zelle syn¬ thetisierte Protein oder funktionelle Fragment oder funktionelle Derivat hiervon oder Messung mindestens eines durch die Bindung der Testsubstanz an das Protein oder funktionelle Fragment oder funktionelle Derivat hiervon veränderten funktio- nellen Parameters.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Bin¬ dung über die Verdrängung eines bekannten markierten Iiganden des Proteins oder ei¬ nes funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante hiervon und/oder über die daran gebundene Aktivität einer markierten Testsubstanz erfolgt.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung mindestens eines durch die Testsubstanz veränderten funktionellen Parame¬ ters über Messung der Regulation, Hemmung und/oder Aktivierung von Rezeptoren, Ionenkanälen und/oder Enzymen erfolgt, insbesondere über Messung der Verände- rung der Genexpression, des Ionenmilieus, des pH, des Membranpotentials, der En¬ zymaktivität oder der Konzentration der 2^nd messenger.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle vor dem Schritt (a) gentechnisch manipuliert wird.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die gentechnische Mani¬ pulation die Messung mindestens eines der durch die Testsubstanz veränderten funkti¬ onellen Parameters erlaubt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass durch die gentechnische Manipulation eine in der Zelle nicht endogen exprimierte Form eines G-Proteins expri- miert oder ein Reportergen eingeführt wird.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle gentechnisch so manipuliert wird, dass die Zelle mindestens eine Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon enthält.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure in ei- nem rekombinanten DNA-Konstrukt, vorzugsweise einem Vektor, besonders bevor¬ zugt einem Expressionsvektor, enthalten ist.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die gentechnisch manipulierte Zelle vor Schritt (a) gemäß Anspruch 1 unter Bedingungen, die eine Expression erlauben, kultiviert wird, vorzugsweise unter Selektionsdruck.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Amphibienzelle, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle, oder eine immortali- sierte oder native Säugetierzelle ist.

11. Protein umfassend oder bestehend aus einer Amiαosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 20 oder 54 oder einem funktionellen Fragment oder einer funktionellen Va¬ riante hiervon.

12. Protein, codiert durch eine Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55.

13. Protein, codiert durch eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 oder deren Antisense Nuklein¬ säure hybridisiert.

14. Nukleinsäure, codierend für ein Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanes KIAA0378, murines PID12832121 und Ratten BAB31214/Q9BU64 oder ei¬ nem funktioneEen Fragment oder einer funktionellen Variante hiervon.

15. Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 21 oder 55 oder einem funktionellen Fragment oder einer funktionel¬ len Variante hiervon.

16. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um DNA, insbesondere cDNA, oder RNA, insbesondere mRNA, handeln.

17. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um doppel- oder einzelstängige Nukleinsäure handelt.

18. Vektor endialtend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17.

19. Zelle enthaltend ein Protein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 18.

20. Zelle gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Amphibienzel¬ le, Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine knmortalisierte oder native Säuge¬ tierzelle ist.

21. Antikörper gegen ein Peptid oder Protein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13.

22. Antisense Nukleinsäure, umfassend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionelle Variante hiervon zu binden.

23. PNA, umfassend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder ein funkti¬ onelles Fragment oder ein funktionelle Variante hiervon zu binden.

24. Ribozym, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionelle Variante hiervon zu binden.

25. sIRNA, umfassend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17 oder ein funkti¬ onelles Fragment oder ein funktionelle Variante hiervon zu binden.

26. Aptamer, umfassend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist, spezifisch an ein Protein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13 oder ein funktionelles Fragment oder ein funktionelle Variante hiervon zu binden.

27. Transgenes nichthumanes Säugetier enthaltend mindestens ein Protein gemäß einem der Ansprüche 11 bis 13, mindestens eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, mindestens eines Vektors nach Anspruch 18 und/oder mindestens eine Zelle nach einem der Ansprüche 19 oder 20.

28. Transgenes nichthumanes Säugetier nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass dessen Keim- und somatische Zellen die Nukleinsäure durch chromosomale Einbrin¬ gung in das Genom des Tieres oder in das Genom eines der Vorfahren des genannten Tieres enthalten.

29. Transgenes nichthumanes Säugetier nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekenn¬ zeichnet, dass dessen Keim- und somatische Zellen die Nukleinsäure durch chromo¬ somale Manipulation des Genoms des Tieres oder des Genoms eines der Vorfahren des genannten Tieres in nicht mehr exprimierbarer Form enthalten.

30. Transgenes nichthumanes Säugetier gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Nagetier, insbesondere eine Ratte oder eine Maus, ist.

31. Verbindung identifizierbar durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

32. Verbindung gemäß Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 als schmerzregulierende Substanz identifizierbar ist.

33. Arzneimittel enthaltend mindestens (a) mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens ein Protein umfas¬ send eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindestens ein Protein, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens ein Protein, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nuklein- säuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LElMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe- sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens einen Antikörper gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens eine Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindes- tens einen Antikörper gemäß (d) (f) mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/oder (g) mindestens einen Wirkstoff, der an mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet, sowie gegebenenfalls geeignete Hilfs- und/oder Zusatzstoffe.

34. Diagnostikum enthaltend mindestens (a) mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens ein Protein umfas- send eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindestens ein Protein, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens ein Protein, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure umfassend ei¬ ne Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybri¬ disiert oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETTMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe- sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens einen Vektor enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens einen Antikörper gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens eine Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder min- destens einen Antikörper gemäß (d) (f) mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/oder (g) mindestens einen Wirkstoff, der an mindestens ein Protein oder ein funktio¬ nelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet, sowie gegebenenfalls geeignete Zusatzstoffe.

35. Verwendung (a) mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens eines Ptoteins umfassend eine Aminosäutesequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindes¬ tens eines Proteins, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäurese- quenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/ oder mindestens eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nuk¬ leinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Anti- sense Nukleinsäure hybridisiert oder eines funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGEL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe¬ sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA₅ welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionel¬ les Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektoϊ gemäß Punkt (c) oder mindestens einen Antikörper gemäß (e) (£) mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/oder (g) mindestens eines Wirkstoffs, der an mindestens ein Protein oder ein funktio¬ nelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet zur Behandlung von Schmerz.

36. Verwendung (a) mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens eines Proteins umfas¬ send eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindestens eines Proteins, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleiαsäuresequenz gemäß einer der Fi¬ guren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure umfassend eine Nuk- leinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Antisense Nukleinsäure hybridisiert oder ei¬ nes funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante eines der vorge¬ nannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe- sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment odet eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindes¬ tens einen Antikörper gemäß (d) (f) mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/ oder (g) mindestens eines Wirkstoffs, der an mindestens ein Protein oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Schmerz.

37. Verwendung gemäß Anspruch 35 oder 36, dadurch gekennzeichnet, dass die Behand¬ lung chronischen, insbesondere neuropathischen oder entzündungsbedingten Schmerz betrifft.

38. Verwendung (a) mindestens einer Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPAl /KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LElMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funkti¬ onelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/ oder mindestens ei¬ ne Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukletnsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbesondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz aufweist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (b) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (a), und/oder (c) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens eine Nukleinsäure gemäß (a) oder mindestens einen Vektor gemäß Punkt (b) für die Gentherapie.

39. Verwendung gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um in vivo oder in ήtro Gentherapie handelt.

40. Verwendung (a) mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens eines Proteins umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindes¬ tens eines Proteins, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäurese- quenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nuk¬ leinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Anti- sense Nukleinsäure hybridisiert oder eines funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KΪAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe¬ sondere eine Antisense Nukleinsäure oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), (e) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionel¬ les Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindestens einen Antikörper gemäß (d) (f) mindestens einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26 und/oder (g) mindestens eines Wirkstoffs, der an mindestens ein Protein oder ein funktio- nelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a) bindet, für die Diagnostik und/oder für Witksamkeitsuntersuchungen.

41. Verwendung (a) mindestens eines Proteins ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL und/oder mindestens eines Proteins umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß einer der Figuren 11, 18, 20, 27, 29, 31, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 und/oder mindes¬ tens eines Proteins, für das eine Nukleinsäure umfassend eine Nukleinsäurese- quenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 codiert, und/oder mindestens eines Proteins, das durch eine Nukleinsäure codiert wird, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nuk¬ leinsäure umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 oder deren Anti- sense Nukleinsäure hybridisiert oder eines funktionellen Fragments oder einer funktionellen Variante eines der vorgenannten Proteine, (b) mindestens eine Nukleinsäure codierend für mindestens ein Protein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus KIAA0378, BAB31214/Q9BU64, OPA1/KIAA0567, CPG2/KIAA1756, LETMl, PID12832121/FLJ20420 und PGRL oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon und/oder mindestens eine Nukleinsäure umfassend oder bestehend aus eine(r) Nukleinsäuresequenz gemäß einer der Figuren 12, 19, 21, 28, 30, 32, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61 und/oder mindestens eine Nukleinsäure, insbe¬ sondere eine Antisense Nukleinsäute oder eine PNA, welche eine Sequenz auf¬ weist, die in der Lage ist, spezifisch an eine der vorgenannten Nukleinsäuren zu binden und/ oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante der mindestens einen Nukleinsäure, (c) mindestens eines Vektors enthaltend eine Nukleinsäure gemäß (b), (d) mindestens eines Antikörpers gegen eines der Proteine oder ein funktionelles Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), und/oder (e) mindestens einer Zelle enthaltend mindestens ein Protein oder ein funktionel- les Fragment oder eine funktionelle Variante hiervon gemäß (a), mindestens eine Nukleinsäure gemäß (b), mindestens einen Vektor gemäß Punkt (c) oder mindestens einen Antikörper gemäß (d) in einem Verfahren zur Auffindung schmerzregulierender Substanzen.