WO2006000008A1 - Verfahren zur herstellung von polymeren trägermaterialien auf basis von kohlenhydrat-bis- (meth)acrylamiden - Google Patents

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methyl
bis
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meth
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Thomas Verdianz
Heinrich Gruber
Simone Knaus
Alexander Poschalko
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Technische Universität Wien
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    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of novel polymeric support materials based on (meth) acrylamide-substituted carbohydrates and their use for affinity chromatography or solid-phase syntheses.
  • the morphology (pore diameter, internal surface area, particle size) is predetermined and can only be controlled to a very limited extent; moreover, their mechanical stability is usually insufficient for continuous column operation.
  • Sucrose methacrylate supports are obtained by precipitation polymerization and are only weakly cross-linked, resulting exclusively in gel types. Although is here because of the water solubility of the low-substituted monomer mixtures also given the possibility of inverse suspension polymerization, but the possibilities of reaction control are very limited with this method, since most water-compatible pore former for controlling the morphology strongly affect the solubility of the monomer mixtures and thus the degree of crosslinking not can be adjusted more. Even with glucose monomethacrylate supports, the hydrophilicity can only be varied within relatively narrow limits because of the small number of hydroxyl groups.
  • the object of the present invention is the provision of polymeric supports in the preparation of which morphology (particle size, porosity), degree of crosslinking, and swellability in aqueous and organic media can be tailored, whose reactive groups offer versatile possibilities for the immobilization of anchor and protective groups, and which are thermally and hydrolytically stable.
  • the invention relates to a process for the preparation of polymeric carriers based on polyacrylic or Polymethacrylklareamiden of monosaccharides, characterized in that acrylic or methacrylamide derivatives of carbohydrates with protected HO groups of the general formula I.
  • R is hydrogen or a CH 3 group, and at least one X is the group -CO-CH 3 , -CH 2 -C 6 H 5 , -Si (CH 3 ) 3 , or at least two groups X together for the rest
  • R 1 and R 2 independently of one another are hydrogen, an alkyl radical having 1 to 10 C atoms or an aromatic radical
  • R 3 is a cycloalkyl radical having 4 to 10 C atoms or a phenyl radical
  • the remaining X is hydrogen
  • Y is the radical -NH-, -CH 2 -NH-, or -CO-NR 4 -Z-NR 5 -
  • R 4 and R 5 are independently hydrogen, an alkyl radical having 1 to 10 carbon atoms or an aromatic radical polymerized - optionally in the presence of pore-forming additives - and then from the resulting crosslinked
  • Protected carbohydrate diamines whose protective groups can be split off under mild conditions, such as. eg 1, 6-diamino-1,6-dideoxy-2,3: 4,5-di-O-isopropylidene-galactitol, or 1,6-diamino-1,6-dideoxy- 2,3: 4,5-di-O-benzylidene-galactitol.
  • These diamines can be prepared according to US Pat. 3 463 790 (1969) are prepared from the corresponding 1,6-dichloro derivatives, although relatively low overall yields are achieved. According to a hitherto unknown synthetic route, these diamines are also prepared from the - also not yet described - dimethyl galactarate in 64% Total yield obtained.
  • new carbohydrate diamines which are prepared by reacting aldaric acid dialkyl esters with excess diamines.
  • galactaric acid dimethyl ester is first protected with 2,2-dimethoxypropane and the resulting 2,3: 4,5-di-O-isopropylidene-galactaric acid dimethyl ester with excess ethylenediamine to 2,3: 4,5-di-O-isopropylidene-galactaric acid reacted bis (2-aminoethyl) amide.
  • diamines used in this synthesis a large number of new carbohydrate diamines can be obtained easily and in high yields.
  • aliphatic diamines having 2 to 20 C atoms such as. B ethylenediamine, hexamethylenediamine, 1,12-diaminododecane, 1,2-bis (aminoethoxy) ethane or piperazine.
  • the properties of the resulting carbohydrate-diamine and thus of the polymer carrier can also be influenced. If, for example, in the synthesis of the carbohydrate diamine 1, 12-dodecanediamine, results after methacryloylation and polymerization, a carrier whose HO groups are more accessible due to low steric hindrance for further reactions. On the other hand, aromatic radicals increase the thermal stability of the polymeric carrier.
  • the aldaric acid alkyl ester may also be provided with other protecting groups known from the chemistry of carbohydrates, e.g. Acetate, trimethylsilyl, benzylidene or cyclohexylidene groups.
  • the reaction with diamines can also be carried out with unprotected aldaric acid alkyl esters.
  • the protected carbohydrate diamines are then reacted with (meth) acrylic acid derivatives to methacrylamides.
  • (meth) acrylic acid, its esters, (meth) acryloyl chloride or methacrylic anhydride can be used.
  • the carbohydrate diamine is used with the (meth) acrylic acid derivative at least in a molar ratio of 1: 2, lower molar ratios lead to mixtures of mono- and bis (meth) acrylamides, which however can also be used according to the invention for the polymerization.
  • the crosslinked polymeric support can be prepared from these monomers or monomer mixtures, for example, by suspension polymerization in aqueous media. Furthermore, the morphology can be controlled in a targeted manner by adding suitable pore formers (porogens). By varying the degree of crosslinking and / or the pore-forming agent, gel types, microporous or even macroporous carriers can be produced in this way.
  • suitable pore formers porogens
  • the monomer mixture is dissolved in a water-immiscible solvent, optionally a pore-forming agent, such as toluene or n-octanol added (the pore former may also act as a solvent for the monomer), and after addition of a radical initiator and a suspension stabilizer with stirring in aqueous suspension polyrnerinstrument.
  • the polymerization temperature is determined by the half-life of the initiator used.
  • the resulting polymer particles, whose size can be controlled by the stirring speed, are filtered off, washed several times with suitable solvents and dried.
  • the resulting polymers are hydrophobic because of the protective groups still contained and non-swellable in water.
  • the polymer particles are treated with suitable reagents, for example in the case of isopropylidene-protected monomers with trifluoroacetic acid or acetic acid, in the case of the acetylated monomers by mild alkaline treatment for selective cleavage of the acetyl groups (eg. With 0.02 N sodium Solution in methanol).
  • suitable reagents for example in the case of isopropylidene-protected monomers with trifluoroacetic acid or acetic acid, in the case of the acetylated monomers by mild alkaline treatment for selective cleavage of the acetyl groups (eg. With 0.02 N sodium Solution in methanol).
  • the polymerization of the monomers according to the invention can also be carried out in the presence of other monomers, such as.
  • (meth) acrylic acid For example, (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid esters, styrene, vinyl acetate, N-vinylpyrrolidone and other known monomers.
  • the invention thus also relates to polymeric carriers which, in addition to other monomer units, have structural elements of the formula II
  • the carriers of the invention can be activated via the HO groups by known methods. For example, high loading can be achieved for the solid phase synthesis of peptides by direct condensation of amino acids on the HO groups of the carriers. If in solid phase synthesis strong acids, e.g. Trifluoroacetic acid used, it may possibly lead to unwanted separation of the peptides from the polymer carrier. In this case, it is expedient to introduce amino groups into the carrier and to protect the remaining HO groups before coupling the first amino acid.
  • strong acids e.g. Trifluoroacetic acid used
  • peptide syntheses can also be carried out, for example, by the Fmoc "double-coupling" routine in dimethylformamide using Na-Fmoc-protected amino acids, benzotriazol-1-yl-oxytris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP ) and N-hydroxybenzotriazole (HOBt) can be used as condensation reagents and diisopropylethylamine (DIPEA) as the base Examples
  • aqueous phase 144 g of water 14.4 g of sodium chloride 0.23 g of hydroxyethylcellulose (Tylose) organic phase: 9.00 g of monomer (see 1d) porogen (type and amount, see Table 1) 0.1 g of azodiisobutyronitrile (AIBN)
  • Example 1e The procedure of Example 1e) is repeated, with the difference that the monomer 2b) is used. Depending on the porogen used, yields of 60 to 85% polymer are obtained, with BET surface areas of 0.5 to 70.6 m 2 / g.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von polymeren Trägermaterialien für Festphasensynthesen, insbesondere für Peptidsynthesen. Hierzu werden (Meth)acrylamid-Derivate auf Basis von Kohlenhydraten, die zusätzlich noch weitere Schutzgruppen enthalten können , durch Suspensionspolymerisation in wässriger Phase gegebenenfalls unter Zusatz von porenbildenden Additiven polymerisiert, und anschließend die Schutzgruppen ganz oder teilweise abgespalten. Auf diese Weise erhält man polymere Träger, deren Morphologie (Partikelgröße, Porosität), Vernetzungsgrad, sowie Quellbarkeit in wässrigen und organischen Medien gezielt eingestellt werden kann, und deren reaktive Gruppen vielseitige Möglichkeiten zur lmmobilisierung von Anker- und Schutzgruppen bieten. Die Hydroxylgruppen der polymeren Träger können nach den üblichen Methoden der Festphasensynthese aktiviert werden.

Description

Verfahren zur Herstellung von polymeren Trägermaterialien auf Basis von Kohlenhydrat-bis-(meth)acrylamiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen polymeren Trägermaterialien auf Basis von (Meth)acrylamid-substituierten Kohlenhydraten und ihre Verwendung für Affinitätschromatographie bzw. Festphasensynthesen.
Seit Einführung der Festphasensynthese durch R. B. Merrifield (R. B. Merrifield, J. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)) ist die automatisierte Festphasensynthese von Peptiden, Oligonucleotiden und Oligosacchariden in ständig zunehmendem Umfang angewendet worden. Die Einführung von Syntheserobotern zur simultanen, multiplen Synthese von Peptiden war der nächste Schritt in dieser Entwicklung. Weiters haben polymere Träger auch auf dem Gebiet der Affinitätschromatographie (P. Cuatrecasas el. al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 61 , 636 (1968)) und der Immobilisierung von Enzymen bzw. Zellen grOße Bedeutung erlangt.
In den letzten Jahren hat sich der Anwendungsbereich von polymeren Trägermaterialien durch Einführung des Konzeptes der kombinatorischen Chemie auch auf andere Gebiete erweitert. Die kombinatorische Synthese von Substanzbibliotheken an fester Phase ist heute eine Schlüsseltechnologie der pharmazeutischen Industrie bei der Entwicklung und Optimierung neuer Wirkstoffe. Dieses Syntheseprinzip ist inzwischen auch auf die Herstellung einer Vielzahl von organischen Substanzklassen ausgedehnt worden (Combinatorial Chemistry, Hrsg.: G. Jung, Wiley VCH, Weinheim 1999). Nahezu alle Standardreaktionen der organischen Chemie lassen sich an fester Phase mit geeigneten Trägermaterialien, Anker- und Schutzgruppen durchführen. Dies hat dazu geführt, dass kombinatorische Synthesen auch zunehmend in anderen Forschungsbereichen, wie bspw. Materialforschung und Katalysatorentwicklung eingesetzt werden.
Die Vorteile der Festphasensynthese liegen vor allem bei der Reaktionsdurchführung und bei der einfachen Aufarbeitung der Produkte, wodurch die Grundvoraussetzungen für automatisierbare Synthesen erfüllt sind.
Mit dieser enormen Ausweitung der Chemie an fester Phase hat auch der Bedarf an neuen, vielseitig einsetzbaren Trägermaterialien stark zugenommen. Die Struktur, Morphologie, Partikelgröße, hydrolytische und thermische Beständigkeit des polymeren Trägers ist bei allen Festphasensynthesen von entscheidender Bedeutung, da hierdurch die Kompatibilität mit dem organischen bzw. wässrigen Reaktionsmedium, aber auch die Zugänglichkeit der reaktiven Gruppen bestimmt wird. Somit ist die richtige Wahl der Trägermaterialien ausschlaggebend für den Erfolg einer Festphasensynthese. Im Bereich der Affinitätschromatographei bzw. Immobilisierung von bioaktiven Komponenten ist weiters die Bioverträglichkeit und Benetzbarkeit mit wässrigen Reaktionsmedien wichtig.
In den meisten Fällen werden Träger auf Basis von Styrol/Divinylbenzol verwendet, welche allerdings wegen der schlechten Quelleigenschaften beim Einsatz in wässrigen Medien gravierende Nachteile aufweisen (W. Tegge, R. Frank, J. Peptide Res. 49, 355 (1997)). Deshalb sind auch polare Träger entwickelt worden, wie z. B. mit Polyethylenglykol (PEG) modifiziertes Polystyrol/Divinylbenzol (E. Bayer, Angew. Chem. 103, 117 (1991), G. Barany et.al. US 5 235 028, WO 9204384 (1992)), Polyethylenglykol-bis-methacrylat vernetzte Träger (G. Barany US 5 656 707, M. P. Meldal US 5 352 756), sowie auch periförmige Träger auf Basis von Cellulose (D. R. Englebretsen, Int. J. Peptide Protein Res. 40, 487 (1992)) und Agarose (G. P. Vlasov et ai, Zh. Obsh. Khim. (Engl. Trans.) 56, 1450 (1987), CR. Nakaie PCT Int. Appl (2001) WO 0146216 A2 20010628). Weiters sind auch polare Träger auf Basis von Saccharosemethacrylat-Gemischen (H. Gruber, Monatsh. Chem. 112, 273-85 (1981)) und Glucose-monomethacrylat (T Rohr et ai, Ada Polym. 50, 286-292 (1999)) beschrieben
Alle diese Trägermaterialien weisen verschiedene Nachteile auf. So ist die Länge der Polyethylenglyko (PEG)-Ketten bei der Polystyrol-Modifizierung schwer kontrollierbar, es bilden sich zusätzliche Vernetzungsstellen und die Reaktionen an diesen PEG-PS- Harzen verlaufen mit steigendem Molekulargewicht des PEG sehr langsam.
Bei den auf natürlichen Kohlenhydraten wie Agarose oder Cellulose basierenden Trägern, ist die Morphologie (Porendurchmesser, Innere Oberfläche, Partikelgröße) vorgegeben und kann nur sehr eingeschränkt gesteuert werden, zudem ist ihre mechanische Stabilität meist unzureichend für kontinuierlichen Säulenbetrieb. Saccharosemethacrylat-Träger werden durch Fällungspolymerisation erhalten und sind nur schwach vernetzt, wodurch ausschließlich Gel-Typen resultieren. Zwar ist hier wegen der Wasserlöslichkeit der niedrig substituierten Monomergemische auch die Möglichkeit einer inversen Suspensionspolymerisation gegeben, jedoch sind mit dieser Methode die Möglichkeiten der Reaktionssteuerung sehr eingeschränkt, da sich die meisten wasserverträglichen Porenbildner zur Steuerung der Morphologie stark auf die Löslichkeit der Monomergemische auswirken und damit auch der Vernetzungsgrad nicht mehr eingestellt werden kann. Auch bei Glucosemonomethacrylat-Trägern lässt sich die Hydrophilie wegen der geringen Zahl der Hydoxylgruppen nur in relativ engen Grenzen variieren.
Ein weiterer gravierender Nachteil dieser Träger ist der Aufbau über Esterbindungen. Die hierdurch naturgemäß gegebene Hydrolyseanfälligkeit kann beim Einsatz in sauren oder basischen Medien zur Zerstörung des Trägers führen, wodurch speziell im Bereich der Festphasensynthesen die Anwendbarkeit stark eingeschränkt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von polymeren Trägern bei deren Herstellung Morphologie (Partikelgröße, Porosität), Vernetzungsgrad, sowie Quellbarkeit in wässrigen und organischen Medien gezielt eingestellt werden kann, deren reaktive Gruppen vielseitige Möglichkeiten zur Immobilisierung von Anker- und Schutzgruppen bieten, und die thermisch und hydrolytisch stabil sind.
Es wurde nun gefunden, dass diese Aufgabe mit (Meth)acrylamid-substituierten Kohlenhydrat-Derivaten gelöst werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von polymeren Trägern auf Basis von Polyacryl- bzw. Polymethacrylsäureamiden von Monosacchariden, dadurch gekennzeichnet, dass man Acryl- bzw. Methacrylamid-Derivate von Kohlenhydraten mit geschützten HO-Gruppen der allgemeinen Formel I
Figure imgf000005_0001
worin R für Wasserstoff oder eine CH3-Gruppe steht, und mindestens ein X für die Gruppe -CO-CH3, -CH2-C6H5, -Si(CH3)3 steht, bzw. mindestens zwei Gruppen X zusammen für den Rest
Figure imgf000005_0002
stehen, worin R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, einen Alkyl-Rest mit 1 bis 10 C-Atomen oder einen aromatischen Rest, R3 einen Cycloalkyl-Rest mit 4 bis 10 C- Atomen oder einen Phenyl-Rest, und die restlichen X Wasserstoff bedeuten, worin Y den Rest -NH-, -CH2-NH-, oder -CO-NR4-Z-NR5- bedeutet, worin Z einen Rest -(CH2)π- mit n=2-20, einen Rest -(CH2-CH2-O)x-CH2-CH2- mit x=1- 10, einen Cycloalkyliden-Rest mit 4-10 C-Atomen, oder einen aromatischen Rest mit 6 bis 30 C-Atomen, und worin R4 und R5 unabhängig voneinander für Wasserstoff, für einen Alkyl-Rest mit 1 bis 10 C-Atomen oder einen aromatischen Rest stehen, polymerisiert - gegebenenfalls in Gegenwart von porenbildenden Additiven - und anschließend aus dem so erhaltenen vernetzten Träger die Schutzgruppen teilweise oder vollständig abspaltet.
Ausgangsstoffe für die Herstellung der Bis-(meth)-acrylamide der Formel I sind z.B. bekannte Diamine auf Basis von Kohlenhydraten, wie 1 ,6-Diamino-1 ,6-dideoxy-2,4:3,5- di-O-methylen-glucitol, - mannitol oder -galactitol (US Pat. 3 463 790 (1969), Haworth et al. J. Chem. Soc. 155 (1944))
Erfindungsgemäß bevorzugt sind geschützte Kohlenhydrat-Diamine, deren Schutzgruppen unter milden Bedingungen abgespalten werden können, wie. z.B. 1 ,6- Diamino-1 ,6-dideoxy-2,3:4,5-di-O-isopropyliden-galactitol, oder 1 ,6-Diamino-1 ,6-dideoxy- 2,3:4,5-di-O-benzyliden-galactitol. Diese Diamine können nach US-Pat. 3 463 790 (1969) aus den entsprechenden 1 ,6-Dichlor-Derivaten hergestellt werden, wobei allerdings relativ niedrige Gesamtausbeuten erreicht werden Nach einem bisher noch nicht bekannten Syntheseweg werden diese Diamine aber auch aus dem - ebenfalls noch nicht beschriebenen - Galactarsäuredimethylester in 64% Gesamtausbeute erhalten.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind neue Kohlenhydrat-Diamine, die durch Umsetzung von Aldarsäuredialkylestem mit überschüssigen Diaminen hergestellt werden. Bspw. wird Galactarsäuredimethylester zunächst mit 2,2-Dimethoxypropan geschützt und der so erhaltene 2,3:4,5-Di-0-isopropyliden-galactarsäure-dimethylester mit überschüssigem Ethylendiamin zum 2,3:4,5-Di-O-isopropyliden-galactarsäure-bis-(2- aminoethyl)-amid umgesetzt. Durch Variation des bei dieser Synthese eingesetzten Diamines ist eine Vielzahl von neuen Kohlenhydrat-Diaminen einfach und in hohen Ausbeuten zugänglich. Bevorzugt sind aliphatische Diamine mit 2 bis 20 C-Atomen, wie z. B Ethylendiamin, Hexamethylendiamin, 1,12-Diaminododecan, 1 ,2-Bis- (aminoethoxy)ethan oder Piperazin. Durch geeignete Wahl des Diamines lassen sich auch die Eigenschaften des resultierenden Kohlenhydrat-Diamines und damit die des Polymeren Trägers beeinflussen. Setzt man bspw. bei der Synthese des Kohlenhydrat- Diamines 1 ,12-Dodecandiamin ein, resultiert nach Methacryloylierung und Polymerisation ein Träger, dessen HO-Gruppen aufgrund geringer sterischer Hinderung für weitere Reaktionen leichter zugänglich sind. Andererseits erhöhen aromatische Reste die thermische Stabilität des polymeren Trägers.
Anstelle von Galactarsäureestern könne auch andere bekannte Kohlenhydrat- basierende Ester engesetzt werden, wie z. B. Glucarsäureester Erfindungsgemäß kann der Aldarsäure-Alkylester auch mit anderen aus der Chemie der Kohlenhydrate bekannten Schutzgruppen versehen werden, wie z.B. Acetat-, Trimethylsilyl-, Benzyliden- oder Cyclohexyliden-Gruppen. Die Umsetzung mit Diaminen kann aber auch mit ungeschützten Aldarsäure-alkylestern durchgeführt werden.
Die geschützten Kohlenhydrat-Diamine werden anschließend mit (Meth)acrylsäurederivaten zu Methacrylamiden umgesetzt. Hierzu können (Meth)acrylsäure, deren Ester, (Meth)acrylsäurechlorid oder Methacrylsäureanhydrid engesetzt werden. Zur Herstellung von Bis-(meth)acrylamiden wird das Kohlenhydrat- Diamin mit dem (Meth)acrylsäurederivat mindestens im Molverhältnis 1 :2 eingesetzt, niedrigere Molverhältnisse führen zu Gemischen aus Mono- und Bis-(meth)acrylamiden, die aber erfindungsgemäß ebenso für die Polymerisation eingesetzt werden können.
Aus diesen Monomeren bzw. Monomer-Gemischen können bspw. durch Suspensionspolymerisation in wässrigen Medien die vernetzten polymeren Träger hergestellt werden. Weiters kann durch Zusatz von geeigneten Porenbildnern (Porogenen) die Morphologie gezielt gesteuert werden. Durch Variation von Vernetzungsgrad und/oder des Porenbildners können auf diese Weise Gel-Typen, mikro- bzw. auch makroporöse Träger hergestellt werden. Das Monomerengemisch wird in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel gelöst, gegebenenfalls ein Porenbildner, wie z.B. Toluol oder n-Octanol zugesetzt (wobei der Porenbildner auch gleichzeitig als Lösungsmittel für das Monomerengemisch fungieren kann), und nach Zusatz eines radikalischen Initiators und eines Suspensionsstabilisators unter Rühren in wässriger Suspension polyrnerisiert. Die Polymerisationstemperatur wird durch die Halbwertszeit des eingesetzten Initiators bestimmt. Die entstandenen Polymerpartikel, deren Größe durch die Rührgeschwindigkeit gesteuert werden kann, werden abfiltriert, mehrmals mit geeigneten Lösungsmitteln gewaschen und getrocknet. Die so erhaltenen Polymere sind wegen der noch enthaltenen Schutzgruppen hydrophob und in Wasser nicht quellbar. Zur Abspaltung der Schutzgruppen werden die Polymerpartikel mit geeigneten Reagenzien behandelt, bspw. im Fall Isopropyliden-geschützten Monomere mit Trifluoressigsäure oder Essigsäure, im Fall der acetylierten Monomere durch milde alkalische Behandlung zur selektiven Abspaltung der Acetyl-Gruppen (bspw. mit 0,02 n Natriummethylat-Lösung in Methanol). Dadurch erhält man polymere Träger mit Hydroxyl-Gruppen, welche die Verträglichkeit mit wässrigen Medien gewährleisten und als zudem als Ankergruppen für Festphasensynthesen dienen können. Die Polymerisation der erfindungsgemäßen Monomere kann auch in Gegenwart von anderen Monomeren durchgeführt werden, wie. z.B. (Meth)acrylsäure, (Meth)acrylsäureestern, Styrol, Vinylacetat, N-Vinylpyrrolidon und anderen bekannten Monomeren. Bevorzugt sind N-Methyl-N-((2,2-dimethyl-1 ,3-dioxolan-4-yl)methyl)acrylamid, N-Methyl- N-((2,2-dimethyl-1 ,3-dioxolan-4-yl)methyl)methacrylamid, 2-Hydroxyethyl-acrylat, 2- Hydroxyethylmethacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, Ethylenglycol-diacrylat, Diethylenglycolmonoacrylat, Diethylenglycolmonomethacrylat, Glycidyl-acrylat, Gylcidylmethacrylat, N,N-Dimethylaminoethylmethacrylat, Acrylamid, Methacrylamid, N- Methylolacrylamid, Itaconsäure, Pentaerythrittri-acrylat und -tetraacrylat.
Gegenstand der Erfindung sind somit auch polymere Träger, die neben anderen Monomerbausteinen Strukturelemente der Formel Il
Figure imgf000008_0001
enthalten, worin R, X und Y die in der Formel I angegebene Bedeutung haben.
Für die Verwendung in Festphasensynthesen können die erfindungsgemäßen Träger über die HO-Gruppen nach bekannten Methoden aktiviert werden. Beispielsweise lassen sich für die Festphasensynthese von Peptiden durch direkte Kondensation von Aminosäuren an die HO-Gruppen der Träger hohe Beladungen erzielen. Wenn bei der Festphasensynthese starke Säuren, wie z.B. Trifluoressigsäure, eingesetzt werden, kann es ggf. zur unerwünschten Abtrennung der Peptide vom Polymerträger kommen. In diesem Fall ist es zweckmäßig, vor Kopplung der ersten Aminosäure Amino-Gruppen in den Träger einzuführen und die restlichen HO-Gruppen zu schützen. Z. B. werden durch Aktivierung mit 1 ,1-Carbonyldiimidazol, Bromcyan bzw. Epichlorhydrin und anschließende Kopplung von 1 ,6-Diaminohexan Beladungen bis 550 bzw. 750 μmol/g erreicht. Analog erreicht man nach Aktivierung mittels Mitsunobu-Reaktion und anschließende Kopplung mit Glycin und ε-Aminocapronsäure einen Aminogruppen- Gehalt bis 550 μmol/g.
Mit den erfindungsgemäßen Polymerträgern lassen sich Peptidsynthesen bspw. auch nach der Fmoc-"double-coupling" Routine in Dimethylformamid unter Verwendung von N-a-Fmoc-geschützten Aminosäuren durchführen, wobei Benzotriazol-1-yl-oxy- tris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphat (BOP) und N-Hydroxybenzotriazol (HOBt) als Kondensationsreagenzien und Diisopropylethylamin (DIPEA) als Base eingesetzt werden können Beispiele
Beispiel 1
a) Herstellung von Galactarsäuredimethylester
Zu einer Suspension von 65 g Galactarsäure (0.31 mol) in 3800 ml Methanol werden unter heftigem Rühren 50 ml konzentrierter Schwefelsäure zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird während 30 Minuten zum Sieden erhitzt und für weitere 14 Stunden unter Rückfluss gerührt. Die entstandene klare gelbliche Lösung wird auf etwa 2000 ml eingeengt und anschließend auf 5°C abgekühlt wobei der Dimethylester als farbloser Feststoff kristallisiert. Nach Absaugen von Methanol, Waschen mit Diethylether und fünfstündigem Trocknen bei 5O0C werden 71.60 g (93 % d. Th.) reiner Galactarsäuredimethylester erhalten. MW: 238.20; Fp.197-199 0C; Rf 0.82 (MeOH / CHCI3 9:1); δH (200 MHz; DMSO-d6): 5.02- 4.69 (bs, 4H, OH), 4.29 (s, 2H, CH-CH-CO), 3.77 (s, 2H, CH-CH-CO), 3.63 (s, 6H, CH3); δc (200 MHz; DMSO-d6): 174.38 (2C, CO), 71.48 (2C, CH-CH-CO), 70.55 (2C, CH-CH- CO), 51.77 (2C1 CH3)
b) Herstellung von 2,3:4,5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäuredimethylester
70 g (0.29 mol) Galactarsäuredimethylester wird zusammen mit 2.76 g (14 mmol) wasserfreier p-Toluolsulfonsäure in 450 ml frisch destilliertem 2,2-Dimethoxypropan vorgelegt und unter mäßigem Rühren während 12 Stunden unter Rückfluss erhitzt, wobei sich das anfangs farblose Reaktionsgemisch zunehmend dunkelrot verfärbt. Anschließend wird zur Reaktionslösung 2 g wasserfreies Natriumcarbonat zugegeben, entstandener Methanol abdestilliert und 2,2-Dimethoxypropan destillativ rückgewonnen. Der Rückstand wird in 250 ml Diethylether aufgenommen und 2 mal mit jeweils 150 ml gesättigter NaCI-Lösung, sowie ein mal mit Wasser gewaschen. Die wässrigen Lösungen werden mit 100 ml Diethylether gewaschen, die vereinigter organischen Extrakte über Na2SO4 getrocknet und der Ether abgedampft. Nach Umkristallisieren aus 500 ml n-Hexan und Trocknen bei 50 0C werden 78.46 g (85 % d. Th.) reiner 2, 3:4, 5-Di- O-lsopropyliden-galactarsäuredimethylester erhalten. MW: 318.33; Fp. 90.2-90.7 0C; Rf 0.82 (n-Hexan / Ethylacetat 3:1); δH (200 MHz; CDCI3): 4.60-4.53 (m, 2H, CH-CH-CO). 4.49-4.40 (m, 2H, CH-CH-CO)1 3.76 (s, 6H, COO-CH3), 1.45 (s, 6H1 CH3), 1.39 (s, 6H, CH3); δc (200 MHz; CDCI3): 171.37 (2C, CO), 112.25 (2C, Cq), 78.94 (2C, CH-CH-CO), 75.72 (2C1 CH-CH-CO), 52.52 (2C1 COO-CH3), 26.91 , 25.87 (4C, CH3)
c) Herstellung von 2,3:4,5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-bis(2' aminoethyl)amid
92.7 g (0.29 mol) 2,3:4, 5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäuredimethylester wird in Methanol gelöst und 195 ml (2.9 mol, d = 0.895) frisch destilliertes Ethylendiamin unter Rühren während 5 Minuten zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird für 2 Stunden zur Siedehitze erwärmt, anschließend auf Raumtemperatur gekühlt und weitere 4 Stunden gerührt. Das entstandene Produktgemisch wird am Rotationsverdampfer von unumgesetztem Ethylendiamin und Methanol separiert. Der zähfließende gelbe ölige Rückstand wird unter starkem Rühren in 1500 ml kalten Diethylether überführt und für 2 Stunden gerührt. Das ungelöste pulvrige 2,3:4,5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-bis(2- aminoethyl)amid wird filtriert und in 3 Portionen mit jeweils 100 ml Ether gewaschen. Nach 4 Stunden Trocknen bei 500C wird das Reinprodukt in 92-protzentiger Ausbeute (100.3 g) erhalten. MW: 374.44; Rf 0.42 (CHCI3 / MeOH / NEt3 1 :3:0.2); δH (200 MHz; CDCI3): 7.10-6.91 (bs, 2H1 CONH), 4.72 (d, 2H, J=7.05, CH-CH-CO), 4.46 (d, 2H1 J=6.85 CH-CH-CO)1 3.35- 3.22 (dt, 4H, J=6.07, 5.87 CONH-CH2), 2.84-2.74 (t, 4H, J=5.87 CH2-NH2), 1.46 (s, 6H, CH3), 1.39 (S, 6H, CJH3), 1.25-1.15 (bs, 4H, NH2); (5b (200 MHz; CDCI3): 171.06 (2C, CO), 110.75 (2C, Cq), 78.65 (2C, CH-CH-CO), 74.97 (2C, CH-CH-CO), 41.65 (2C, CONH- CH2), 41.35 (2C1 (2C, CH2-NH2), 26.69, 25.94 (4C1 CH3)
d) Herstellung von 2,3:4,5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-N,N'-bis-[2-(2- methyl-acrylamino)-ethyl]-amid
Eine Lösung von 100 g Diamin 3 (0.27 mol), 242 mg (1.1 mmol) 2,6-di-tert-butyl-4- methylphenol in 800 ml wasserfreiem Pyridin wird unter Rühren auf 65°C erhitzt und Methacrylsäureanhydrid (92 g, 0.59 mol) langsam zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei 650C für weitere 4 Stunden gerührt, anschießend wird 300 ml Wasser rasch zugegeben und für weitere 10 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wird drei mal mit Ethylacetat extrahiert, die vereinigten organischen Phasen zwei mal mit einer gesättigten NaHCO3-Lösung und zwei mal mit Wasser gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Nach Ausfällen in 500 ml n-Hexan, Filtration, Waschen mit n-Hexan und vierstündigem Trocknen im Vakuum werden 113.1 g (82%) reines Dimethacrylamid erhalten. MW: 510.59; δH (200 MHz; CDCI3): 7.27-7.07 (bs, 2H, C(CH3)=CH2-CONH), 6.81-6.61 (bs, 2H, CH-CONH), 5.69, 5.29 (2s, 4H, C(CHa)=CH2), 4.66 (d, 2H, J = 7.04 Hz, CH-CH-CO), 4.37 (d, 2H, J = 7.05 Hz, CH-CH-CO), 3.53-3.34 (m, 8H, CH2), 1.90 (s, 6H, C(CH3)=CH2), 1.44, 1.38 (2s, 12H, CH3); δc (200 MHz; CDCI3): 172.15 (2C, CO- C(CH3)=CH2), 168.98 (2C, CO-CH), 139.41 (2C1 C(CH3)=CH2), 120.08 (2C1 C(CHa)=CH2), 111.00 (2C, Cq), 78.45 (2C, CH-CH-CO), 74.82 (2C, CH-CH-CO), 40.09 (2C, CH-CONH-CH2), 39.01 (2C, CH2-NHCO-C(CH3)=CH2), 26.63, 25.92 (4C, CH3), 18.50 (2C, C(CH3)=CH2)
e) Suspensionspolymerisation von 1d
Ansatz: wäßrige Phase: 144 g Wasser 14.4 g Natriumchlorid 0.23 g Hydroxyethylcellulose (Tylose) organische Phase: 9,00 g Monomer (vgl. 1d) Porogen (Art und Menge vgl. Tab. 1) 0.1 g Azodiisobutyronitril (AIBN)
Um gelösten Sauerstoff aus den Reaktionslösungen zu verdrängen, werden zunächst beide Phasen 10 Minuten mit Stickstoff durchspült und danach vereinigt. Die anschließende Polymerisation erfolgt bei 8O0C und einer Rührgeschwindigkeit von 350 U/min für 6 Stunden unter Stickstoffatmosphäre. Die erhaltenen Polymerpartikel werden abfiltriert, mit 1 I Wasser und 300 ml Methanol gewaschen, danach am Soxhletextraktor 12 Stunden mit 150 ml Methanol extrahiert und schliesslich am Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeuten u. Eigenschaften der Polymerpartikel vgl. Tabelle 1 f) Hydrolyse der Isopropyliden-Schutzgruppen
5 g Polymerpartikel aus 1e) werden in 65 ml 60%iger Essigsäure suspendiert, 4 Stunden bei 600C mechanisch gerührt, anschließend mit 300 ml Wasser sowie 300 ml Methanol gewaschen, am Soxhletextraktor 12 Stunden mit 150 ml Methanol extrahiert und schließlich am Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute: 5 g
Tabelle 1: Suspensionspolymerisationen von Monomer 1d
Polym Monomer BET- Durchschni BJH- er Porogen - Ausbeu Oberfläc ttl. Porenvolum Porogen te he [m2/g] Porenradiu en Verhältni [%] s [cm .33//g] s [nm] [g/g] P1 n-Butylacetat 1:2 59 3.2 0.014 P2 Methylisobutylket 1:2 61 0.2 C 0.003 on P3 Methylisobutylket 1 :1 76 66.28 27.7 0.494 on P4 1-Octanol 1 :1 73A 0.2 40.8 0.003 P5 Methylisobutylket 1 :1 82 10.3 5.6 0.001 on / 1-Octanol 7:3 P6 Methylisobutylket 1:1 74 41.0 31.5 0.364 on / n-Butylacetat 3:7 P8 Dibutylphtalate 1 :1 80B -
I i P9 Toluol 1 :2 65B A mehr als 30% der erhaltenen Partikel sind agglomeriert B mehr als 80% der erhaltenen Partikel sind agglomeriert - keine BET-Analytik durchgeführt c nicht analysierbar
Beispiel 2
a) 2,3:4,5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-bis(6-aminohexyl)amid 9.55 g (0.03 mol) in 100 ml Methanol gelöster 2,3:4, 5-Di-O-lsopropyliden- galactarsäuredimethylester (vgl. 1b) wird zu einer Lösung von 34.86 g (0.3 mol) 1,6- Diaminohexan in 150 ml Methanol bei Raumtemperatur unter Rühren schnell zugegeben und für 6 Stunden unter Rückfluss gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur gekühlt und zur Trockene eingedampft. Überschüssiges 1 ,6- Diaminohexan wird bei 62°C (103 mbar) abdestilliert. Das reine 2,3:4,5-Di-O- lsopropyliden-galactarsäure-bis(6-aminohexyl)amid wird als klarer blassgelber zähfließender Rückstand der Destillation mit 98 % d. Th. (14.3 g) gewonnen. MW: 486.66; Fp. 107-108 0C; Rf 0.35 (CHCI3 / MeOH / NEt3 1 :3:0.2); δH (200 MHz; CDCI3): 6.71-6.55 (bs, 2H, CONH), 4.68 (d, 2H, J=7.04, CH-CH-CO), 4.43 (d, 2H, J=6.84 CH-CH-CO), 3.27-3.14 (m, 4H, CONH-CH2), 2.61 (t, 4H, J=6.85 CJH2-NH2), 1.44 (s, 6H, CH3), 1.36 (s, 6H, CH3), 1.51-1.18 (m, 16H, CH2 / 4H, NH2); δc (200 MHz; CDCI3): 170.60 (2C, CO), 110.61 (2C, Cq), 78.60 (2C1 CH-CH-CO), 74.84 (2C1 CH-CH-CO), 41.98 (2C1 CjH2-NH2), 38.74 (2C1 (2C1 CONH-CH2), 33.50 (2C, CH2-CH2-NH2), 29.42 (2C1 CONH-CH2-CH2), 26.65, 25.88 (4C1 CH2), 26.60, 26.67 (4C1 CH3)
b) Herstellung von 2,3:4,5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-N,N'-bis-[6-(2- methyl-acrylamino)-hexyl]-amid
Eine Lösung von 10 g Diamin 3 (0.021 mol), 22 mg (0.1 mmol) 2,6-di-tert-butyl-4- methylphenol in 100 ml wasserfreiem Pyridin wird unter Rühren auf 65°C erhitzt und Methacrylsäureanhydrid (8.3 g, 0.053 mol) langsam zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei 650C für weitere 4 Stunden gerührt, anschießend werden 40 ml Wasser rasch zugegeben und das Reaktionsgemisch für weitere 14 Stunden gerührt. Die Reaktionslösung wird 3 mal mit Diethylether extrahiert, die vereinigten organischen Phasen zwei mal mit Wasser gewaschen, über Na2SO4 getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. 11.3 g (86%) reines Dimethacrylamid 11 wird nach Ausfällen in 200 ml n-Hexan, Filtration, Waschen mit n-Hexan und Trocknen bei Raumtemperatur erhalten. MW: 622.79; δH (200 MHz; CDCI3): 7.29-7.08 (bs, 2H, C(CH3)=CH2-CONH), 6.88-6.67 (bs, 2H, CH-CONH), 5.72, 5.32 (2s, 4H, C(CHs)=CH2), 4.62 (d, 2H, J = 7.09 Hz, CH-CH- CO), 4.37 (d, 2H, J = 7.09 Hz, CH-CH-CO), 3.35-3.05 (m, 8H, NH-CH2), 1.89 (s, 6H, C(CH3)=CH2), 1.64-1.51 (m, 8H, NH-CH2-CH2), 1.43, 1.38 (2s, 12H, CH3), 1.34-1.26 (m, 8H, CH2); δc (200 MHz; CDCI3): 172.12 (2C1 CO-C(CH3)=CH2), 168.95 (2C1 CO-CH). 140.31 (2C, C(CHa)=CH2), 121.58 (2C, C(CHa)=CH2), 110.83 (2C, Cq), 78.52 (2C, CH- CH-CO), 74.80 (2C, CH-CH-CO), 40.65 (2C, CH-CONH-CH2), 38.98 (2C, CH9-NHCO- C(CHs)=CH2), 30.23, 26.46 (4C, CH2), 18.50 (2C, C(CHs)=CH7)
c) Suspensionspolymerisation von 2b)
Die Vorgangsweise von Beispiel 1e) wird wiederholt, mit dem Unterschied, dass das Monomer 2b) eingesetzt wird. Je nach verwendetem Porogen werden Ausbeuten von 60 bis 85% Polymer erhalten, mit BET-Oberflächen von 0,5 bis 70,6 m2/g.
d) Hydrolyse der Isopropyliden-Schutzgruppen
8 g Polymerpartikel aus 2c) werden in 65 ml 60%iger Essigsäure suspendiert, 4 Stunden bei 600C mechanisch gerührt, anschließend mit 300 ml Wasser sowie 300 ml Methanol gewaschen, am Soxhletextraktor 12 Stunden mit 150 ml Methanol extrahiert und schließlich am Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute: 8 g

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von polymeren Trägern auf Basis von Polyacryl- bzw. Polymethacrylsäureamiden von Monosacchariden, dadurch gekennzeichnet, dass man Acryl- bzw. (Meth)acrylamid-Derivate von Kohlenhydraten der allgemeinen Formel I
Figure imgf000015_0001
worin R für Wasserstoff oder eine CH3-Gruppe steht, und mindestens ein X für die Gruppe -CO-CH3, -CH2-C6H5, -Si(CH3)3 steht, bzw. mindestens zwei Gruppen X zusammen für den Rest
Figure imgf000015_0002
stehen, worin R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, einen Alkyl-Rest mit 1 bis 10 C-Atomen oder einen aromatischen Rest, R3 einen Cycloalkyl-Rest mit 4 bis 10 C- Atomen oder einen Phenyl-Rest, und die restlichen X Wasserstoff bedeuten, worin Y den Rest -NH-, -CH2-NH-, oder -CO-NR4-Z-NR5- bedeutet, worin Z einen Rest -(CH2)n- mit n=2-20, einen Rest -(CH2-CH2-O)x-CH2-CH2- mit x=1- 10, einen Cycloalkyliden-Rest mit 4-10 C-Atomen, oder einen aromatischen Rest mit 6 bis 30 C-Atomen, und worin R4 und R5 unabhängig voneinander für Wasserstoff, für einen Alkyl-Rest mit 1 bis 10 C-Atomen oder einen aromatischen Rest stehen, polymerisiert - gegebenenfalls in Gegenwart von porenbildenden Additiven - und anschließend aus dem so erhaltenen vernetzten Träger die Schutzgruppen teilweise oder vollständig abspaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man als Methacrylamid-Derivat 2, 3:4, 5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-N, N'-bis-[2-(2-methyl- acrylamino)-ethyl]-amid einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man als Methacrylamid-Derivat 2, 3:4, 5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-N, N'-bis-[6-(2-methyl- acrylamino)-hexyl]-amid einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man als Methacrylamid-Derivat 2, 3:4, 5-Di-O-lsopropyliden-galactarsäure-bis[12-(2-methyl- acrylamino)-dodecyl]amid einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass man Gemische aus mono- und disubstituierten (Meth)acrylamid-Derivaten von Kohlenhydraten einsetzt
6. Verfahren nach Anspruch 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass man zusätzlich Comonomere einsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Comonomere Acrylamid, Methacrylamid, N-Methylolacrylamid, N-Methyl-N-((2,2- dimethyl-1 ,3-dioxolan-4-yl)methyl)acrylamid bzw. N-Methyl-N-((2,2-dimethyl-1 ,3- dioxolan-4-yl)methyl)methacrylamid einsetzt
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man als Comonomere 2-Hydroxyethyl-acrylat 2-Hydroxyethylmethacrylat, Ethylenglycol-diacrylat, Ethylenglycoldimethacrylat, Diethylenglycolmonoacrylat, Diethylenglycol- monomethacrylat, Glycidyl-acrylat, Gylcidylmethacrylat bzw. N1N- Dimethylaminoethylmethacrylat einsetzt.
9. Polymere Träger, die Strukturelemente der Formel
Figure imgf000017_0001
enthalten, worin R, X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
10. Verwendung des Polymeren Trägers gemäß Anspruch 9 in Festphasensynthesen.
11. Verwendung des Polymeren Trägers gemäß Anspruch 9 in Peptidsynthesen.
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