DD289289A5 - Verfahren zur herstellung von hydrophilen polymeren traegern mit aminoxidgruppen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hydrophilen polymeren Traegern mit Aminoxidgruppen auf der Basis von vernetzten Acrylnitril-Vinylacetat-Copolymeren. Die Copolymeren werden mit Polyalkylendiaminen umgesetzt, wobei gleichzeitig der Polyvinylacetat-Anteil zum Polyvinylalkohol verseift wird. Die tertiaere Aminogruppe wird danach durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid zum Aminoxid oxydiert. Die Traeger koennen zur chromatographischen Trennung von biologischen Zellen oder Proteinen eingesetzt werden.{hydrophile polymere Traeger; Aminogruppen; Acrylnitril-Vinylacetat-Copolymeren; Polyalkylendiamine; chromatographische Trennung}

Description

Es wurde gefunden, daß die Aufgabe gelöst werden kann, wenn poröse Copolymerisate aus Acrylnitril und Vinylacetat sowie einem Vernetzer hergestellt werden, die dann mit einem Polyalkylondiamin der Formel

η = 2-8 "

R, = HoderAlkylgruppewieCHj-oderCjHB-

R₂ = Alkylgruppe

umgesetzt werden und das Reaktionsprodukt anschließend zum Aminoxid oxydiert wird. Die Umsetzung mit dem Polyalkylendiamin muß dabei so gesteuert werden, daß der Polyacrylnitrilanteil im Copolymerisat nur partiell mit dem Amin reagiert und der Polyvinylacetatanteil gleichzeitig zum Polyvinylalkohol verseift wird. Nach der Umsetzung mit Wasserstoffporoxid entsteht somit ein Träger mit den folgenden Strukturelementen (ohne Berücksichtigung des Vernetzers):

-CH₂-CH- -CH₂-PH- -CH₂-CH-

C ? ⁰^¹ (CH)$'^²0^{Q 0H}

Die Matrix des Trägers besitzt demnach ausgeprägte hydrophile Eigenschaften.

Ausgangspunkt für die erfindungsgemäße Lösung war die Feststellung, uaß geeignete poröse vernetzte Copolymerisate aus Acrylnitril und Vinylacetat, deren Polyvinylacetat-Anteil zum Polyvinylalkohol verseift wurde, kaum unspezifische Adsorption von Zellen und Proteinen aufweisen. Diese Eigenschaft bleibt erhalten, wenn der Acrylnitrilanteil partiell mit einem Polyalkylendiamin umgesetzt wird und das Reaktionsprodukt anschließend mit Wasserstoffperoxid zum Aminoxid oxydiert

Überraschenderweise wurde gefunden, daß selbst bei Einsatz eines polyvinylaromatischen Vernetzers wie Divinylbenzen der Träger keine erhöhte unspezifische Adsorption aufweist, obwohl beispielsweise Styren-Divinylbenzen-Copolymerisate ausgeprägte hydrophobe Wechselwirkung mit biologischen Makromolekülen zeigen, die ihrer Natur nach unspezifisch sind.

Als Vernetzer für die erfindungsgemäßen Polymeren können somit alle Polyvinylverbindungen eingesetzt werden, die mit Acrylnitril und Vinylacetat copolymerisieren. Neben den aromatischen Polyvinylverbindungen, wie Divinylbenzen, werden bevorzugt Derivate der Methacrylsäure wie Ethylenglykoldimethacrylat oder Trimethylolpropantrimethacrylat sowie Derivate der Acrylsäure wie Triacryolyl-S-trihydrotriazin angewendet. Es können jedoch auch Gemische dieser Vernetzer benutzt werden.

Der Vernetzeranteil kann in breiten Grenzen variiert werden. Bevorzugt werden 1-20Ma.-%, bezogen auf die polymerisationsfähige Phase, eingesetzt.

Die Porosität der Matrix kann in bekannter Weise durch Zusatz von Fäll- und/oder Quellmitteln bei der Polymerisation, die sich inert verhalten, erzeugt werden. Bewährt haben sich als Fällmittel aliphatische Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Benzingemische oder längerkettige Alkohole, wie z. B. n-Octylalkohol sowie als Quellmittel aromatische Kohlenwasserstoffe wie z. B. Toluen.

Die Menge des verwendeten Inertmittels beträgt bevorzugt 10 bis 60Ma.-%, bezogen auf die Gesamtölphase von Monomeren und Inertmittel. Die Porosität des Copolymerisates kann in weiten Grenzen durch Art und Menge des Inertmittels sowie durch den Vernetzeranteil gesteuert werden.

Durch die Anteile der eingesetzten Comonomeren Acrylnitril und Vinylacetat kann die Hydrophilie der Matrix sowie die Kapazität der fun' Onellen Aminoxidgruppen des Trägers variiert werden. Die polymerisationsfähige Phase enthält bevorzugt 20-89 Ma.-% Acrylnitril, 10-60Ma.-% Vinylacetat und 1-20Ma.-% Vernetzer. Im Falle des Einsatzes von technischem Divinylbenzen tritt als weiteres Comonomeres Ethylstyren auf. Die Polymerisation wird nach der Methode der Suspensionspolymerisation in bekannter Weise durchgeführt. Als Suspensionsstabilisatoren können beispielsweise Zellulosederivate eingesetzt werden. Das Polymerisationsverfahren wird so gesteuert, daß Polymerisatkugeln mit einem Durchmesser von 0,1-0,3 mm erhalten werden.

Als Polyalkylendiamine zur Umsetzung des Copolymerisates kommen bevorzugt die Verbindungen 2-Dimethylamino-1-ethylamin bzw.

2-Diethylamino-1-ethylamin oder

3-Dimethylamino-1-propylamin bzw.

3-Diethylamino-1 -propylamin zur Anwendung.

Als Reaktionstemperaturen werden bevorzugt 90-140°C eingestellt. Die Reaktionszeit liegt in Abhängigkeit von Porosität, Vernetzungsgrad und eingesetztem Amin bei 2-20 Stunden.

Reaktionstemperatur und Zeit werden so gewählt, daß der Acrylnitrilanteil im Copolymerisat maximal nur bis zu 95% umgesetzt wird, d. h. im Infrarotspektrum ist in jedem Falle die C=N-Valenzschwingung bei der Wellenzahl von ca. 2 200cm"¹ noch deutlich nachweisbar.

Zur Komplettierung der bei der Behandlung mit dem Polyalkylendiamin ablaufenden hydrolytischen Reaktionen wird das Harz ausgiebig mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen.

Die Umsetzung der ternären Aminogruppen des Harzes, das sich wie ein schwach basischer Ionenaustauscher verhält, zum Aminoxid erfolgt nach der in der PS DD 131.859 angegebenen Vorschrift. Hierbei wird das Harz bei Zimmertemperatur mit ca.

30%iger Wasserstoffperoxidlösung in Gegenwart von physiologischer Kochsalzlösung und Natronlauge behandelt.

Auf Grund der guten hydrodynamischen Eigenschaften in Trennsäulen und der äußerst geringen unspezifischen Adsorption von Proteinen und biologischen Zellen ermöglicht das erfindungsgemäße Polymer die Durchführung von Protein- und Zelltrennungen nach der Methode der Patentschrift DD 131.721 mit wesentlich erhöhter Selektivität und Ausbeute.

So gelingt es beispielsweise, vorgereinigte Glucoseoxidase aus Penicillium notatum mit einer spezifischen Aktivität von 180 bis

200 U/mg Protein mittels dieser Methode in Verbindung mit dem erflndungsgemäßen Polymer auf eine spezifische Aktivität von350 bis 400 U/mg Protein zu steigern und damit ein elektrophoretisch einheitliches Enzym zu gewinnen.

Es gelingt ebenfalls mit dieser Methode In Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Polymer, eine nach morphologischer Bewertung vollständige Auftrennung von Blastenzellen und Lymphozyten aus menschlichem Blut bei Chronisch Myeloischer Leukämie in Blastenstadium. In den folgenden Beispielen wird die Erfindung noch näher erläutert. Ausführungsbelsplele Beispiel 1 Polymerisation In einem Planschliffbecher werden 1,51 dest. H₂O vorgelegt und hierzu 2g M hylzellulose unter Rühren gelöst. Zur wäßrigen Phase wird die Ölphase, bestehend aus 170g Acrylnitril, 90g Vinylacetat, 40g techn. Divinylbenzen (ca. 50%ig), 1 g Porofor N und 200g Toluen hinzugefügt und durch Regelung der Rührgeschwindigkeit eine Tröpfchengröße von 0,1-0,3mm

eingestellt. Die Polymerisation wird bei 60⁰C durchgeführt und das Copolymerisat danach 8 Std. bei 85°C ausgehärtet.

Anschließend wird das Copolymerisat mit Wasser ausgewaschen und nach Austreiben des Inertmittels Toluen (durch Behandlung mit Wasserdampf) getrocknet.

Aminolyse

75g des getrockneten Copolymerisates werden in einem Sulfierkolben mit 600ml 3-Dimethylamino-1 -propylamin, 9E%ig, 8 Std.

bei 11C⁰C gerührt. Das überschüssige Amin wird anschließend abgesaugt und das Harz mit destilliertem Wasser bis zur

Neutralität gewaschen. Es werden 350ml schwach basischer Ionenaustauscher mit folgenden Kennwerten erhalten: Gesamtgewichtskapazität: 2,85 mmol/g trockenes Harz in der CT-Form Wassergehalt: 78,0Ma.-%. Ammoxidation

100ml des in physiologischer Kochsalzlösung gequollenen Harzes werden bei Raumtemperatur mit 100 ml physiologischer Kochsalzlösung und 100ml 30%iger Wasserstoffperoxidlösung verrührt und mit 0,1 N bis 0,2 N Natronlauge auf einen pH-Wert von etwa 11 titriert. Nach 25 Minuten wird der Überstand abgesaugt und die Umsetzung in gleicher Reihenfolge wiederholt. Anschließend wird das Harz mit destilliertem Wasser bis zur Neutralität gewaschen. Nach IR-spektroskopischen Befunden und Säure/Base-Titration wird das Harz nach dieser Vorschrift vollständig in die Aminoxidform überführt. Das Harzvolumen und die Anionenaustausch-Kapazität bleiben unverändert.

Beispiel 2 Zur wäßrigen Phase, hergestellt gemäß Beispiel 1, wird die Ölphase, bestehend aus Acrylnitril, Vinylacetat, Divinylbenzen, Ethylenglykoldimethacrylat und Benzingemisch sowie 1 g Porofor N hinzugefügt und nach den Angaben in Beispiel 1

polymerisiert. 25g des getrockneten Copolymerisates werden mit 200ml 3-Diethylamino-1-propylamin 8 Std. bei 130°C gerührt.

Es werden 100ml schwach basischer Anionenaustauscher mit folgenden Kennwerten erhalten: Gesamtgewichtskapazität: 2,73 mmol/g trockenes Harz in der Cl~-Form Wassergehalt: 72,5Ma.-% Die Aminoxidation erfolgt nach in Beispiel 1 angegebener Vorschrift. Beispiel 3 Aufreinigung von Glucoseoxidase (Penicillium notatum) Um die Eignung des erfindungsgemäßen Polymers mit Aminoxidgruppen nach Beispiel 1 für die Proteintrennung nach PS DD 131.721 zu demonstrieren, wurde eine vorgereinigte Enzymlösung von ca. 20000 Einheiten Glucoseoxidase auf eine Chromatographie-Säule (1,5cm x 20,0cm) mit dem erfindungsgemäßen Polymer aufgetragen und Fremdproteine bei einer Fließgeschwindigkeit von 30ml/h mit0,01 M Na-Acetatpuffer, pH 5,5, entfernt. Die Elution der Glucoseoxidase wurde mit 1OmM Phosphatpuffer, pH 7,5,0,3m NaCI vorgenommen. Die Glucoseoxidase erscheint als scharfer Peak im Eluat. Die spezifische Aktivität des Produktes erhöhte sich von 180 bis 200 U/mg Protein auf 350 bis 400 U/mg Protein. Die auf diese Weise gereinigte Glucoseoxidase ist elektrophoretisch einheitlich. Beispiele Auftrennung von Blastenzellen und Lymphozyton aus menschlichem Blut bei Chronisch Myeloischer Leukämie (CML) Im Blastenstadium Um die Eignung des erfindungsgemäßen Polymers mit Aminoxidgruppen nach Beispiel 1 für die Zelltrennung nach PS DD 131.721 zu demonstrieren, wurde die bisher klinisch noch unzureichend gelöste Aufgabe der Abtrennung von Blastenzellen aus Blut/Knochenmarkgemischen untersucht. Es wurden 5ml menschliches CML-Blut im Blastenstadium auf eine Chromatographie-Säule (3,5cm x 5,5cm) mit dem

erfindungsgemäßen Polymer aufgetragen und die Blastenzellen bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min mit 34 m M HEPES-gepuffertem Eagle-MEM-Medium, pH 5,6, entfornt. Die Elution der Lymphozyten wurde mit Medium gleicher

Zusammensetzung, aber pH 8,0 vorgenommen. Die cytomorphologische 3ewertung der aufgetrennten Zellfraktionen ergibt folgendes Bild:

Kontrolle I.Fraktion 2. Fraktion (%) (%) (%)

Myeloblasten 64 78 Lymphozyten 11 1 100

andere Zellen 35 21 -

(ohne Erythrozyten)

Die Ausbeute bezüglich der Lymphozyten (2. Fraktion) beträgt ca. b0%.

Claims (3)

1. Verehren zur Herstellung von hydrophilen polymeren Trägern mit Aminoxidgruppen, gekennzeichnet dadurch, daß aus Acrylnitril, Vinylacetat und einem Vernetzer in Gegenwart eines Fäll- und/oder Quellmittels für das Copolymere nach dem Verfahren der Suspensionspolymerisation ein Copolymerisat mit poröser Struktur und einer Korngröße von 0,1-0,3mm hergestellt wird, dieses Copolymerisat mit einem α,ω-Polyalkylendiamin der Formel

H ßo

\ / "= R₁ = HoderAlkylgruppe

^N"(^CH2^n"^N\ R₂=Alkylgruppe

_R/ R₂ η =2-8

bei Temperaturen von 90 bis 140⁰C behandelt und anschließend die tertiäre Aminogruppe des entstehenden schwach basischen Ionenaustauschers mit Wasserstoffperoxid zum Aminoxid oxydiert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Vernetzer Divinylbenzen oder Derivate der Acryl- bzw. Methylacrylsäure oder Gemische dieser Vernetzer eingesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß bei der Behandlung des Copolymerisates mit dem Polyalkylendiamin der Acrylnitrilanteil nur partiell, maximal bis zu 95 Ma.-%, aminolysiert und der Vinylacetatanteil gleichzeitig zum Polyvinylalkohol verseift wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von hydrophilen polymeren Trägern mit Aminoxidgruppen auf der Basis von vernetzten Copolymerisaten. Diese Träger können zur chromatographischen Trennung von biologischen Zellen oder Proteinen eingesetzt werden. Anwendungsgebiete sind die Fraktionierung von Blut- und Knochenmarkzellen in der klinischen Transplantologie und Transfusiologie, die Selektion von Zellen mit besonderen Stoffwechselleistungen und die Aufreinigung von Proteinen aus Zellkulturüberständen in der Biotechnologie.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

In der Patentschrift DD 131.859 ist die Herstellung von wasserunlöslichen polymeren Trägern mit N-Oxidgruppen auf der Basis von natürlichen Makromolekülen beschrieben. Der Begrii'f »natürliche Makromoleküle" umfaßt dabei Polysaccharide wie Zellulose oder Agarose, Polysaccharidderivate wie vernetzte Agarose bzw. Dextran θ, die mit Epichlorhydrin vernetzt wurden. Zur Einführung der Aminoxidgruppen müssen diese Makromoleküle tertiäre Aminogruppen tragen, beispielsweise Diethylaminogruppen, die dann durch Behandlung mit Wasserstoffperoxid zum Aminoxid oxidiert werden. Diese bekannten Träger besitzen jedoch eine Reihe ungünstiger Eigenschaften. So sind sie z. B. anfällig gegenüber mikrowellen-, und enzymatischem Abbau und besitzen bei der üblichen Anwendung im Säulenverfahren unbefriedigende hydrodynamische Eigenschaften. Als besonders ungünstig für eine effektive chromatographische Trennung von Zellen und Proteinen, die auf Wechselwirkung mit den funktioneilen Aminoxidgruppen der Träger basiert, hat sich jedoch die unspezifische Adsorption der zu trennenden Species an der Matrix der natürlichen Makromoleküle erwiesen. Unspezifische Adsorption der zu trennenden Zellen oder Proteine an der Matrix beeinträchtigen die Selektivität der Trennung und vermindern die erreichbare Ausbeute an getrennten Zellen oder Proteinen erheblich. In ähnlicher Weise wirken sich sogenannte Doppel- oder Tandemgruppen aus, die bei der Einführung tertiärer Aminogruppen in natürliche Makromoleküle unvermeidlich sind. Diese Folgereaktion einer tertiären Aminogruppe mit einer weiteren tertiären Aminogruppe setzt die erstere zu einer positiv geladenen quarternären Aminogruppe um, die mit den zu trennenden Zellen oder Proteinen unerwünschte lonenbeziehungen eingeht.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von solchen polymeren Trägern, die diese nachteiligen Eigenschaften nicht mehr aufweisen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines polymeren Trägers zu schaffen, indem man nicht von natürlichen Makromolekülen ausgeht, sondern durch Copolymerisation von geeigneten Vinylverbindungen nach der Methode der Suspensionspolymerisation eine Trägermatrix aufbaut. In diese Matrix sind tertiäre Aminogruppen einzuführen, die dann in bekannter Weise zum Aminoxid oxydiert werden.