WO2005108570A1 - 核酸酵素複合体 - Google Patents

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Masato Katahira
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    • C12N2310/12—Type of nucleic acid catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes
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    • C12N2310/30—Chemical structure
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    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid enzyme complex capable of cleaving target RNA and controlling the cleavage, and a method of cleaving target RNA using this complex under control.
  • RNA is a mediator in the conversion of genetic information into proteins, but since the discovery of the catalytically active RNA ribozyme (Nature vol. 334, 585-591, 1988), specific genes have been identified. It has attracted attention because it can inhibit the expression of offspring.
  • Deoxyribozyme having catalytic activity, which has recently been discovered, is superior to ribozyme in that it is chemically more stable and easier to prepare and handle.
  • DNA enzymes that have the ability to cleave RNAs that have a specific sequence are considered to be useful as a tool for gene therapy that cleaves mRNAs of harmful genes.
  • ribozymes and deoxyribozymes have been attempted to be used as RNA-cleaving agents for viruses and pathogenic genes, sensor chips, and the like (Patent Documents 1 and 2 and the like).
  • GGAGGAGGAGGA is one of the triplet repeats regulating the expression level of the gene at the transcription level and the translation level (when N in SEQ ID NO: 1 is A, hereinafter referred to as “GGA12 -mer ”, and for convenience, the sequence of SEQ ID NO: 1 is sometimes referred to as“ GGA12-mer ”.
  • Structural analysis by NMR was performed on these GGA repeats, and DNA with a lithium ion concentration of approximately Sl40 mM. It has been found that a specific intramolecular parallel quadruplex structure is formed under such physiological conditions as in (Non-patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 1 JP-A-7-231784
  • Patent Document 2 JP-A-2003-265168
  • Non-Patent Document 1 J. Mol. Biol. (2001) 313, 255-269
  • Non-Patent Document 2 J. Biol. Chem. Vol.278, No.30, 28147-28153, 2003
  • An object of the present invention is to provide a means for controlling the cleavage of target RNA by a nucleic acid enzyme.
  • nucleic acid enzymes ie, ribozyme and deoxybozyme
  • these complexes were designed using a GGA 12-mer (Non-Patent Document 1) in which the single-chain force also greatly changes to a quadruplex. That is, a nucleic acid enzyme complex was constructed by dividing the nucleic acid enzyme into two subunits and connecting them with a GGA 12-mer.
  • the two subunits of the nucleic acid enzyme are separated because the GGA 12-mer does not form a quadruplex, and the catalytic site of the nucleic acid enzyme Cannot have an active structure, and does not produce cleavage activity, or has weak cleavage activity.
  • the GGA 12-mer which was present in a single-stranded extended state, changed to a compact quadruplex structure, The two separated subunits of the nucleic acid enzyme are attracted to each other and come close to each other, and an active structure is formed, resulting in strong cleavage activity.
  • the present invention uses a nucleic acid enzyme complex in which a nucleic acid enzyme is combined with a GGA 12-mer to control the concentration of monovalent metal ions to control the RNA cleavage activity of the nucleic acid enzyme or to control the intensity of the activity. Enabled.
  • the present invention relates to a nucleic acid-enzyme complex
  • a nucleic acid enzyme ie, ribozyme and deoxybozyme
  • the substrate binding site is complementary to the binding site of the target RNA, and the sequence (5′GGAGGAGGAGGN3 ′) or a sequence having a linker at at least one of both ends of the sequence is the RNA cleavage reaction catalytic site.
  • nucleic acid-enzyme complex that is inserted into The nucleic acid enzyme complex preferably has two substrate binding sites, and the two substrate binding sites preferably have a structure sandwiching the RNA cleavage reaction catalytic site. Further, the present invention provides a nucleic acid-enzyme complex, a component necessary for the nucleic acid enzyme from which the nucleic acid-enzyme complex is derived to have an activity, a target RNA, and a monovalent metal ion.
  • a method for controlling the cleavage of target RNA comprising a step of increasing the concentration to lOmmolZL or more and a step of decreasing the concentration of the -valent metal ion to less than lOmmolZL.
  • the present invention also provides a method for introducing a nucleic acid enzyme complex into cells. This is a method for cleaving target RNA in cells consisting of:
  • the present invention relates to a cell into which the nucleic acid enzyme complex has been introduced.
  • the catalytic activity increases as compared with the case where the monovalent metal ion falls below the predetermined concentration. Therefore, ON / OFF or strength of RNA cleavage activity can be controlled by adjusting the concentration of the monovalent metal ion. Since the cleavage site of the RNA by this nucleic acid-enzyme complex is the same as the cleavage site of the DNA enzyme before the fragmentation, the active structure of the nucleic acid enzyme was reconstructed by the attraction of subunits by the formation of quadruplexes. It is considered.
  • the nucleic acid-enzyme complex of the present invention is constituted by inserting a GGA12-mer into an RNA cleavage reaction catalytic site of a nucleic acid enzyme.
  • nucleic acid enzymes include ribozymes and dexoximes.
  • Nucleic acid enzymes that can be used in the present invention include, for example, enzymes as shown in FIG. 1 (doxibozyme) and FIG. 2 (ribozyme). Arrows in the figure indicate the cleavage sites of the target RNA.
  • a) is a 10-23 deoxyribozyme (SEQ ID NO: 7) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 1997, 4262-4266), which will be described in detail later.
  • the substrate binding site is at positions 1 to 8 and 24 to 31 of this sequence, and the catalytic site for RNA cleavage reaction is at positions 9 to 23.
  • the substrate binding site is bases 1-8 and 24-31 of this sequence, and the catalytic site for RNA cleavage is bases 9-23.
  • c) is a deoxyribozyme in which four specific consecutive residues in the catalytic site of 10-23 deoxyribozyme have been deleted (J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 1999, 1381-1386) ( SEQ ID NO: 9).
  • the substrate binding site is at positions 1-8 and 20-27 of this sequence, and the catalytic site for RNA cleavage reaction is at positions 9-19. Produces cleavage activity depending on calcium ions.
  • the substrate binding site is positions 1 to 7 and 21 to 27 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic site is positions 8 to 20.e) indicates Bipartite dexriboribozyme (J. Mol. Biol. 313, 2001). , 283-294) (SEQ ID NO: 11).
  • the substrate binding site is at positions 1 to 7 and 28 to 33 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic site is at positions 8 to 27.
  • D is E6 Deoxyribozyme. It has a secondary structure similar to the 8-17 deoxyribozyme but variable GAA (SEQ ID NO: 12).
  • the substrate binding site is at positions 1-6 and 31-36 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic site is at positions 7-30.
  • HD3 dexoxiribozyme (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1998, 6027-6031) (SEQ ID NO: 13).
  • the substrate binding site is at positions 1-8 and 32-39 of this sequence, and the catalytic site for RNA cleavage reaction is at positions 9-31.
  • HD3 Deoxyribozyme is a modification of HD1 and HD2 Deoxyribozymes.
  • the relationship between HD1 and HD2 is that OA is G, ⁇ C is G, and T is added to the (1) part is the HD2 deoxyribozyme.
  • HD1 Deoxyribozyme is the one with T in the part. Histidine is required for cleavage. Substrate can be cleaved with histidine at a low concentration in the order of HD3, HD2, and HD1.
  • h) shows a class oxyribozyme that acts on cis and a modified deoxyribozyme that acts on rans (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1998, 2233-2237) (SEQ ID NO: 14).
  • the substrate binding sites are positions 1-6, 13-16 and 20-23 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic site is positions 7-18.
  • TTCT represents the polypyrimidine region, which can be modified if it is rich in pyrimidine bases (ex.CTTT). However, the part surrounded by the dotted line performs triple-helix interaction.
  • i) shows 16.2-11 enzyme (J. Am. Chem. Soc. 122, 2000, 2433-2439) (SEQ ID NO: 15).
  • the substrate binding site is at positions 1-9 and 20-26 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic site is at positions 10-19.
  • [0011] j) shows a hammerhead ribozyme (SEQ ID NO: 16).
  • the substrate binding site is at positions 1-8 and 31-39 of this sequence, and the catalytic site for RNA cleavage reaction is at positions 9-30.
  • k shows a ribozyme obtained by miniaturizing a hammerhead ribozyme (SEQ ID NO: 17).
  • the substrate binding site is at positions 1 to 8 and 23 to 31 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic site is at positions 9 to 30.
  • the substrate binding site is bases 1-6 and 12-14 of this sequence, and the catalytic site for RNA cleavage is bases 15-50.
  • m indicates a lead ribozyme (SEQ ID NO: 19).
  • the substrate binding site is at positions 1-4 and 7-10 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic site is at positions 4-7.
  • n indicates HDV ribozyme (derived from genomic strand) (SEQ ID NO: 20).
  • the substrate binding site is at positions 21-27 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic sites are at positions 1-20 and 28-74.
  • HDV ribozyme (derived from the antisense strand) (SEQ ID NO: 21).
  • the substrate binding sites are positions 18-24 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic sites are positions 1-17 and 25-69.
  • P) indicates an HDV ribozyme mutant designed using n) and 0) (SEQ ID NO: 22).
  • the substrate binding site is at positions 20-26 of this sequence, and the RNA cleavage reaction catalytic sites are at positions 1-19 and 27-52.
  • a sequence having a linker at at least one of both ends of the GGA 12-mer, preferably at both ends, may be used.
  • the linker an oligonucleotide consisting of about 1 to 4 nucleotides, a divalent hydrocarbon group having about 2 to: L0 carbon atoms, and a peptide having about 1 to 4 amino acids can be used.
  • the oligonucleotide may be of a random sequence.
  • this peptide has a simple amino acid structure such as glycine.
  • a 10-23 type deoxyribozyme is shown in Fig. 3 (SEQ ID NO: 4).
  • positions 1-8 and 24-31 are substrate binding sites
  • positions 9-23 are R NA cleavage reaction catalytic site.
  • This enzyme is derived from the 23rd clone obtained after 10 selections in an in vitro selection method (Proc. Natl. Acid. Sci. USA (1997) 94, 4262-4266). Is higher than that of other endonucleases of nucleic acids and proteins, considering that the catalytic mechanism of 10-23 type deoxyribozyme is that of hammerhead ribozyme. Suggested to be similar to
  • the nucleic acid enzyme used in the present invention comprises an RNA cleavage reaction catalytic site and a substrate binding site, and preferably comprises an RNA cleavage reaction catalytic site and two substrate binding sites complementary to the target RNA sandwiching the catalytic site.
  • the substrate binding site of the nucleic acid-enzyme complex may be freely modified so as to have a complementary relationship with the target RNA. By doing so, the desired RNA can be targeted.
  • the number of bases in the substrate binding site is preferably independently 8 ⁇ 4, more preferably 8 to 2, and the target RNA is ARB (where A and B represent the binding site and are adjacent to R in B).
  • R represents adenosine or guanosine
  • R represents adenosine or guanosine.
  • RNA cleavage reaction catalytic site is a portion determined by the nucleic acid enzyme from which the GGA12-mer is inserted.
  • “Indispensable components for the activity of the nucleic acid enzyme from which the nucleic acid enzyme complex is derived” include Mg2 + , Ca2 + , Mn2 + , Pb2 + , Cd2 + , Sr2 + , Ba2 + These need to be present in the medium at a concentration of about l to 500 mM.
  • FIG. 4 (A) schematically shows the structure of GGA 12-mer. As a whole, it has a homodimer structure in which a GGA 12-mer molecule is associated with a molecule. Each monomer is composed of a structure in which four guanine bases G2, G5, G8 and Gil are located on one plane and are connected to each other by hydrogen bonding ( G: G: G: G tetrad, Fig.
  • the nucleic acid that forms this quadruplex structure is a monovalent metal ion such as K + or a low force, which is a single-stranded extended state.
  • the structure changes (Fig. 4 (A)).
  • the nucleic acid-enzyme complex configured as described above is usually used in a medium such as a phosphate buffer (50 mM, pH 7.9) and Mg 2+ (25 mM).
  • a medium such as a phosphate buffer (50 mM, pH 7.9) and Mg 2+ (25 mM).
  • Such monovalent metal ions include K +, Na + and the like.
  • the quadruplex structure is more stable in the presence of K + than in the presence of Na +.
  • the concentration of the monovalent metal ion is less than 10 mmol / l, preferably 5 mmol / l or less, and most preferably 0 mmol / l, the structure of the GGA 12-mer becomes a single-stranded state and the RNA cleavage activity of the nucleic acid enzyme is increased. Becomes off or weak.
  • the concentration of the monovalent metal ion is 10 mmol / l or more, preferably 30 mmol / l or more, and most preferably 30 to 200 mmol / l
  • the structure of the GGA 12-mer becomes a quadruplex structure and the nucleic acid enzyme 2
  • the arrangement is such that two subunits function, and the RNA cleavage activity is on or strong. Become.
  • potassium ion which is a monovalent metal ion inside and outside the cell, which is about 140 mM inside the cell and about 5 mM outside the cell.
  • the switching or strength of the cleavage activity is controlled in response to such a difference in potassium ion concentration, so that the nucleic acid enzyme complex of the present invention can be applied to various uses.
  • the nucleic acid-enzyme complex of the present invention By introducing the nucleic acid-enzyme complex of the present invention into a cell, the activity is suppressed low outside the cell (the concentration of potassium ion, which is a monovalent metal ion, is low), and the activity is reduced intracellularly (a monovalent metal ion (Potassium ion concentration is high) to exert the enzyme activity and suppress the expression of the pathogenic protein. Under normal conditions, the nucleic acid-enzyme complex of the present invention exerts its enzymatic activity extracellularly and does not hurt the human body.
  • the nucleic acid-enzyme complex of the present invention can cleave in vitro the mRNA of a pathogenic gene or the mRNA of an oncogene derived from a virus that causes a disease such as HIV or influenza virus and inactivate it. .
  • Methods for introducing the nucleic acid-enzyme complex of the present invention into cells include the following methods.
  • a specific cell is taken out of a living body, a nucleic acid / enzyme complex is introduced with a gene gun, and then returned to the living body.
  • the specific cells are taken out of the living body, the nucleic acid / enzyme complex is introduced by electoporation, and then returned to the living body. These methods are effective for bone marrow cells and the like.
  • nucleic acid enzyme complex When the nucleic acid enzyme complex binds to a cationic (cationic) lipid to form a ribosome-nucleic acid complex and is brought into contact with the cell, it fuses with the cell membrane to efficiently convert the deoxyribozyme complex to the cell. Can be introduced.
  • a 10-23 type deoxyribozyme was used as a nucleic acid enzyme.
  • a GGA 12-mer linked to two subunits of a 10-23 type deoxyribozyme cleaved at position E10 (see Fig. 6) (SEQ ID NO: 3) was synthesized (hereinafter, referred to as " GGA12E10 ”t)
  • the reaction volume was 10 ⁇ L, 10 M GGA12E10, KC10 or 100 mM, 50 mM buffer was mixed, heated at 95 ° C for 5 minutes, and then annealed by cooling slowly. .
  • the substrate RNA obtained in Production Example 1 was added to 1 ⁇ , and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Thereafter, the reaction was started by squeezing MgCl to 25 mM. Reaction temperature is 37 ° C
  • Fig. 7 shows the results.
  • the cleavage ratio was 12.2% with potassium ion and 3.5% without potassium ion in 168 hours.
  • the action of potassium ion formed a quadruplex structure by its action, and the two subunits were attracted, and the active type structure of the catalytic site of deoxyribozyme could be reconstructed, resulting in cleavage. It is considered that the activity increased.
  • Example 2 The same operation as in Example 1 was performed using NaCl instead of KC1.
  • Fig. 8 shows the results. Cleavage activity was also observed when Na + was used. However, the rate of cleavage when using potassium ions is higher than when using sodium ions.
  • the cleavage ratio was 12.2% with potassium ion and 5.5% with sodium ion at 168 hours. This is because, as described above, when the potassium ion is used as compared with the sodium ion, the quadruplex structure formed by the GGA-12mer is more stable. It is considered that the cleavage activity of oxyribozyme became stronger.
  • Example 2 The same operation as in Example 1 was performed using a wild-type 10-23 type deoxyribozyme (SEQ ID NO: 4) instead of GGA12E10.
  • the pH was 8.0 (Tris-HC1).
  • Figure 9 shows the results.
  • the wild type has cleavage activity with or without potassium ions. Difference in cleavage activity at each time with and without potassium ion was less than 1%
  • FIG. 1 is a diagram showing an example of a deoxyribozyme that can be used in the present invention.
  • the upper sequence represents the substrate RNA
  • the lower sequence represents the deoxyribozyme.
  • N is A, C, G or T
  • R is a purine base (G or ⁇ )
  • ⁇ is a pyrimidine base (C or U)
  • an arrow is a cleavage site
  • b) a catalyst for 10-23 deoxyribozyme It has a mutation at the site.
  • M represents A or C
  • H represents A, C or T
  • D represents G, ⁇ or ⁇ .
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a ribozyme that can be used in the present invention.
  • j shows a hammerhead ribozyme.
  • N A, G, C, or U;
  • X A, C, or U k) shows a miniaturized hammerhead ribozyme.
  • N A, G, C, or U;
  • X A, C, or U 1) indicates a hairpin ribozyme.
  • N A, G, C, or Un
  • o) indicates HDV ribozyme (derived from antisense strand).
  • p) indicates the HDV ribozyme mutant designed using n) and 0).
  • FIG. 3 is a view showing a 10-23 type deoxyribozyme used in Examples.
  • N represents A, C, G or T or U
  • Y represents U or C
  • R represents A or G.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing the structure of a GGA 12-mer in the presence of a monovalent metal.
  • (A) shows the G: G: G: G tetrad, and (C) shows the entire structure of GGA 12-mer.
  • FIG. 6 is a view showing a position where a GGA 12-mer is inserted into a 10-23 type deoxyribozyme.
  • FIG. 7 is an electrophoretogram showing the difference in the cleavage activity of “GGA12E10” depending on the presence or absence of potassium ions (Example 1).
  • FIG. 8 is an electrophoretogram showing the cleavage activity of “GGA12E10” in the presence of sodium ions (Example 2).
  • FIG. 9 is an electrophoretogram showing a cleavage reaction by wild-type 10-23 type deoxyribozyme (Comparative Example 1).

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Abstract

　【課題】　　デオキシリボザイムによる標的ＲＮＡの切断を制御する手段を提供する。 　【解決手段】　　既知のデオキシボザイムと発明者らの研究室で見出された一価金属イオンの有無により構造が大きく変化するGGA 12-mer(非特許文献１)を利用して、これらの複合体を設計した。本発明は、標的ＲＮＡの塩基配列と基質結合部位及びＲＮＡ切断反応触媒部位とから成るデオキシリボザイム及び配列（５’ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡ３’（配列番号１））から成り、この配列が該ＲＮＡ切断反応触媒部位に挿入されて成るデオキシリボザイム複合体である。 　

Description

明 細 書
核酸酵素複合体
技術分野
[0001] この発明は、標的 RNAを切断し、かつその切断を制御することのできる核酸酵素 の複合体及びこの複合体を用いて標的 RNAを制御下で切断する方法に関する。 背景技術
[0002] RNAは遺伝情報をタンパク質に変換する際の仲介物質であるが、触媒活性を持つ た RNAであるリボザィムが発見されて以来（Nature vol.334, 585-591, 1988)、特定遺 伝子の発現を阻害することができるため注目を集めている。
また近年見出された触媒活性を有するデォキシリボザィム (DNA酵素)はリボザィム よりも化学的に安定で、調製しやすく扱いやすいという点で優れている。特定の配列 力もなる RNAを切断する活性を持つ DNA酵素は、有害遺伝子の mRNAを切断する遺 伝子治療のツールなどとして利用できるものと考えられている。
このようなリボザィム及びデォキシリボザィムは、ウィルスや病原遺伝子などの RNA 切断剤やセンサーチップなどへの利用が試みられている (特許文献 1、 2等)。
一方、発明者らは、遺伝子の発現量を転写レベル及び翻訳レベルで調節している トリプレットリピートの一つである d(GGAGGAGGAGGA) (配列番号 1の Nが Aである場 合、以下「GGA 12- mer」といい、便宜上配列番号 1の配列を「GGA 12- mer」という場 合もある。）について NMRによる構造解析を行い、これらの GGAリピート DNA力 力リウ ムイオン濃度力 Sl40mM程度である細胞内のような生理的条件下で特異な分子内平 行型四重鎖構造を形成することを見出している (非特許文献 1、 2)。
[0003] 特許文献 1：特開平 7-231784
特許文献 2：特開 2003-265168
非特許文献 1 :J. Mol. Biol. (2001) 313, 255-269
非特許文献 2 : J. Biol. Chem. vol.278, No.30, 28147-28153, 2003
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0004] 従来核酸酵素を用いて RNAを切断する際にはその活性をスイッチングすること又 はその活性の強弱を制御することができなかったため、標的 RNAを所望のタイミング で切断することができず、その利用が制限されて ヽた。
本発明は、核酸酵素による標的 RNAの切断を制御する手段を提供することを目的 とする。
課題を解決するための手段
[0005] このような課題を解決するために、発明者らは既知の核酸酵素 (即ち、リボザィム及 びデォキシボザィム）と発明者らの研究室で見出された一価金属イオンの有無により 構造が一重鎖力も四重鎖に大きく変化する GGA 12-mer (非特許文献 1)を利用して、 これらの複合体を設計した。即ち、核酸酵素を 2つのサブユニットに分断し、その間を GGA 12-merで繋ぐことにより、核酸酵素複合体を構築した。
この複合体では、一価金属イオンのない状態又はその濃度が低い状態では、 GGA 12-merが四重鎖を形成しないため核酸酵素の 2つのサブユニットは離れて存在し、 核酸酵素の触媒部位は活性型の構造をとることができず、切断活性が生じな 、又は 切断活性が弱い。しかし、その系に一価金属イオンを添加しその濃度を上げることに より、一重鎖の伸びた状態で存在していた GGA 12-merがコンパクトな四重鎖構造へ と変化し、それに伴って核酸酵素の分断されていた 2つのサブユニットが互いに引き 寄せられ接近し、活性型の構造が形成されて切断活性が強く生じるようになる。 本発明は、核酸酵素に GGA 12-merを組み合わせた核酸酵素複合体を用いて、一 価金属イオン濃度を制御することにより核酸酵素の RNA切断活性をスイッチング又 はその活性の強弱を制御することを可能にした。
[0006] 即ち、本発明は、核酸酵素（即ち、リボザィム及びデォキシボザィム）の RNA切断 反応触媒部位及び基質結合部位並びに配列（5 ' GGAGGAGGAGGN3 ' (配列番 号 1) )から成る核酸酵素複合体であって、該基質結合部位が標的 RNAの結合部位 と相補的関係にあり、該配列（5' GGAGGAGGAGGN3' )又は該配列の両端の少 なくとも一方にリンカ一を有する配列が該 RNA切断反応触媒部位に挿入されて成る 核酸酵素複合体である。この核酸酵素複合体は、基質結合部位を 2つ有しこの 2つ の基質結合部位が前記 RNA切断反応触媒部位を挟む構造であることが好ましい。 また本発明は、この核酸酵素複合体、該核酸酵素複合体が由来する核酸酵素が 活性を持っために必要な成分、標的 RNA、及び一価金属イオンを含む系において 、該ー価金属イオンの濃度を lOmmolZL以上とする段階と該ー価金属イオンの濃 度を lOmmolZL未満とする段階とから成る標的 RNAの切断を制御する方法である また本発明は、核酸酵素複合体を細胞へ導入することから成る細胞内の標的 RNA を切断する方法である。
更に本発明は、この核酸酵素複合体が導入された細胞である。
発明の効果
[0007] 本発明の核酸酵素複合体は、一価金属イオンが所定濃度を上回る時、所定濃度を 下回る場合に比べ触媒活性が上昇する。そのため、この一価金属イオン濃度を調節 することにより RNA切断活性の ON/OFF又は強弱を制御することができる。この核酸 酵素複合体による RNAの切断箇所は、分断前の DNA酵素による切断箇所と同一で あるため、四重鎖の形成によってサブユニットが引き寄せられることで、核酸酵素の 活性構造が再構成されたものと考えられる。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 本発明の核酸酵素複合体は、核酸酵素の RNA切断反応触媒部位に GGA 12-mer を挿入することにより構成される。
本発明にお 、て、核酸酵素とはリボザィム及びデォキシボザィムを 、う。 本発明に用いることのできる核酸酵素として、例えば、図 1 (デォキシボザィム)及び 図 2 (リボザィム）に示すような酵素が挙げられる。図中の矢印は標的 RNAの切断個 所を示す。
a)は 10-23デォキシリボザィム（配列番号 7)であり（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 1997, 4262-4266)、詳細は後述する。基質結合部位はこの配列の 1〜8及び 24〜3 1番目、 RNA切断反応触媒部位は 9〜23番目である。
b)は 10-23デォキシリボザィムの触媒部位に変異をカ卩えたものを示す (J. Biol.
Chem. 277, 2002, 40617-40622) (配列番号 8)。基質結合部位はこの配列の 1〜8及 び 24〜31番目、 RNA切断反応触媒部位は 9〜23番目である。 c)は 10- 23デォキシリボザィムの触媒部位の特定の連続した 4残基を削除したデォ キシリボザィムである（J. Chem. Soc.Perkin Trans. 2, 1999, 1381-1386) (配列番号 9 )。基質結合部位はこの配列の 1〜8及び 20〜27番目、 RNA切断反応触媒部位は 9〜19番目である。カルシウムイオンに依存して切断活性を生じる。
[0009] d)は 8- 17デォキシリボザィムを示す（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 1997,
4262-4266; J. Biol. Chem. 275, 2000, 11693-11697) (配列番号 10)。基質結合部位 はこの配列の 1〜7及び 21〜27番目、 RNA切断反応触媒部位は 8〜20番目である e)は Bipartiteデォキシリボザィムを示す (J. Mol. Biol. 313, 2001, 283-294) (配列 番号 11)。基質結合部位はこの配列の 1〜7及び 28〜33番目、 RNA切断反応触媒 部位は 8〜27番目である。
Dは E6デォキシリボザィム。 8-17デォキシリボザィムに類似した二次構造であるが GAAは可変である（配列番号 12)。基質結合部位はこの配列の 1〜6及び 31〜36番 目、 RNA切断反応触媒部位は 7〜30番目である。
g)は HD3デォキシリボザィムを示す（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1998, 6027-6031) (配列番号 13)。基質結合部位はこの配列の 1〜8及び 32〜39番目、 R NA切断反応触媒部位は 9〜31番目である。 HD3デォキシリボザィムは HD1,HD2と いうデォキシリボザィムを改変したものである。 HD1,HD2との関係は、 OAを G、〇Cを Gとし、（1)の部分に Tをカ卩えたものが HD2デォキシリボザィムであり、 HD2デォキシリボ ザィムにさらに (2)の部分に Tをカ卩えたものが HD1デォキシリボザィムである。切断に 際してヒスチジンを必要とする。 HD3、 HD2、 HD1の順に低濃度のヒスチジンで基質を 切断可能である。
[0010] h)は cisに働く classllデォキシリボザィム ransに働くように改変したデォキシリボザ ィムを示す（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 1998, 2233-2237) (配列番号 14)。基質 結合部位はこの配列の 1〜6、 13〜16及び 20〜23番目、 RNA切断反応触媒部位 は 7〜18番目である。 TTCTはポリピリミジン領域を表し、ピリミジン塩基に富んでいれ ば変更可能である (ex.CTTT)。但し、点線で囲った部分は triple-helix相互作用をす る。 i)は 16.2- 11 enzyme (J. Am. Chem. Soc. 122, 2000, 2433- 2439)を示す（配列番号 15)。基質結合部位はこの配列の 1〜9及び 20〜26番目、 RNA切断反応触媒部位 は 10〜19番目である。
[0011] j)はハンマーヘッド型リボザィムを示す (配列番号 16)。基質結合部位はこの配列の 1〜8及び 31〜39番目、 RNA切断反応触媒部位は 9〜30番目である。
k)はハンマーヘッド型リボザィムを小型化したリボザィムを示す (配列番号 17)。基 質結合部位はこの配列の 1〜8及び 23〜31番目、 RNA切断反応触媒部位は 9〜3 0番目である。
1)はヘアピン型リボザィムを示す (配列番号 18)。基質結合部位はこの配列の 1〜6 及び 12〜14番目、 RNA切断反応触媒部位は 15〜50番目である。
m)は鉛リボザィムを示す (配列番号 19)。基質結合部位はこの配列の 1〜4及び 7 〜10番目、 RNA切断反応触媒部位は 4〜7番目である。
n)は HDVリボザィム (ゲノム鎖由来）を示す (配列番号 20)。基質結合部位はこの配 列の 21〜27番目、 RNA切断反応触媒部位は 1〜20及び 28〜74番目である。
0)は HDVリボザィム (アンチセンス鎖由来）を示す (配列番号 21)。基質結合部位は この配列の 18〜24番目、 RNA切断反応触媒部位は 1〜17及び 25〜69番目であ る。
P)は n)と 0)を用いてデザインされた HDVリボザィム変異体を示す (配列番号 22)。 基質結合部位はこの配列の 20〜26番目、 RNA切断反応触媒部位は 1〜19及び 2 7〜 52番目である。
[0012] なお、 GGA 12- merの代わりに、この GGA 12- merの両端の少なくとも一方、好ましく は両端にリンカ一を有する配列を用いてもよい。リンカ一としては、約 1〜4個のヌクレ ォチドからなるオリゴヌクレオチド、炭素数約 2〜： L0の 2価炭化水素基、約 1〜4個の アミノ酸力もなるペプチドを用いることができる。このオリゴヌクレオチドはランダムな配 列のものでよい。この炭化水素基は好ましくは—（CH CH ) 一（n=約 1
2 2 n 〜5)で表さ れる。このペプチドはグリシン等の構造の簡単なアミノ酸力もなるものが好まし 、。
[0013] このような核酸酵素の好ましい例として 10-23型デォキシリボザィムを図 3に示す（ 配列番号 4)。この配列の 1〜8及び 24〜31番目は基質結合部位、 9〜23番目は R N A切断反応触媒部位である。この酵素は、 in vitro選択法において 10回のセレクシ ヨン後に得られた 23番目のクローンに由来する（Proc. Natl. Acid. Sci. USA (1997) 94, 4262-4266) oこの酵素の反応速度は他の核酸やタンパクのエンドリボヌクレア一 ゼのものよりも高ぐ速度論的な面力 考えると、 10-23型デォキシリボザィムの触媒 のメカニズムはハンマーヘッドリボザィムのものと類似するということが示唆されている
(Biochemistry 37, 13330-13342, 1998)。 15個の残基からなる RNA切断反応触媒部 位の配列は高く保存されており、図 3に示すように〇で囲まれた残基は特に保存性が 高ぐ点線で囲んだ領域が RNA切断反応触媒部位を形成するのに直接関与してい るものと考えられている（J. Biol. Chem.,277, 40617-40622, 2002) 0
[0014] 本発明で用いる核酸酵素は、 RNA切断反応触媒部位及び基質結合部位から成り 、好ましくは RNA切断反応触媒部位とこれを挟む標的 RNAに相補的な 2つの基質 結合部位力 成る。
核酸酵素複合体にぉ 、てこの基質結合部位は標的 RNAと相補的関係となるように 自由に改変すればよい。そうすることにより所望の RNAを標的とすることができる。基 質結合部位の塩基数は好ましくはそれぞれ独立に 8 ±4、より好ましくは 8士 2である また、標的 RNAが ARB (式中、 A及び Bは前記結合部位を表し、 Bの Rに隣接する ヌクレオチド残基がゥリジン又はシチジンを表し、 Rがアデノシン又はグアノシンを表 す。）で表されることが好ましい。
一方、 RNA切断反応触媒部位は由来する核酸酵素によって定まる部分であり、こ こに GGA 12- merを挿入する。
「核酸酵素複合体が由来する核酸酵素が活性を持っために必須の成分」とは、 Mg 2+、 Ca2+、 Mn2+、 Pb2+、 Cd2+、 Sr2+、 Ba2+等であり、これらは媒体中で l〜500m M程度の濃度で存在することを要する。
[0015] RNA切断反応触媒部位に配列 d(GGAGGAGGAGGA)(GGA 12-mer)を挿入する 。図 4(A)に GGA 12- merの構造を模式的に示す。全体としては、 GGA 12- mer力 ¾分 子会合したホモダイマー構造をとつている。個々のモノマーは、 G2、 G5、 G8及び Gil の 4つのグァニン塩基が一平面上に位置して、互いに水素結合で結ばれた構造体（ G:G:G:Gテトラッド、図 4(B))と、 Gl、 G4、 G7及び G10の 4つのグァニン塩基と、 A3、 A6 及び A9の 3つのアデニン塩基の合計 7つの塩基力 1平面上に位置して、互いに水素 結合で結ばれた構造体 (G (： A):G (： A):G (： A):Gヘプタッド、図 4(C))を形成している。 G 塩基に富んだ配列力 なる DNAは、 in vitroで生理的条件下にすると、四重鎖構造を 形成するが、テトラッドはその際にも形成される。一方ヘプタッドは、テトラッドをコアに しつつ、そのまわりにアデニンが 3つ sheared型と!/、われる G:A塩基対によって配置さ れたものである。モノマー内において、テトラッドとヘプタッドはスタツキング相互作用 をしており構造の安定ィ匕に寄与している。又、末端の A12はテトラッド中の G11とスタツ キングしている。（図 4(A))
この四重鎖構造を形成する核酸は、 K+等の一価金属イオンのな 、又は低 、状態 では一本鎖で伸びた状態である力 所定濃度の一価金属イオンを加えることで四重 鎖構造 (図 4(A))へと変化する。
核酸酵素の RNA切断反応触媒部位を分断した 2つのサブユニットを、それぞれ GGA 12-merの G1と A12に 5'→3'の方向性を維持しながら結合する。結合した様 子を図 5に示す。
上記のように構成された核酸酵素複合体は、通常、リン酸緩衝液 (50mM, pH7.9)、 Mg2+(25mM)等の媒体中で用いられる。
この媒体中で、一価金属イオンの濃度を変化させることにより、上記の GGA 12-mer の構造変化を促し、その結果核酸酵素の RNA切断活性を ON/OFF又は強弱の制 御をすることができる（図 5)。
このような一価金属イオンとして、 K+、 Na+等が挙げられる。四重鎖構造は Na+存 在下に比べ K+存在下でより安定ィ匕する。
この一価金属イオン濃度が、 10mmol/l未満、好ましくは 5mmol/l以下、最も好ましく は 0mmol/l場合には GGA 12-merの構造が一重鎖が伸びた状態となり核酸酵素の R NA切断活性が offに又は弱くなる。
一方、この一価金属イオン濃度が、 10mmol/l以上、好ましくは 30mmol/l以上、最も 好ましくは 30〜200mmol/lの場合には GGA 12-merの構造が四重鎖構造となり核酸 酵素の 2つのサブユニットが機能するような配置となり、 RNA切断活性が onに又は強 くなる。
特に、細胞内外における一価金属イオンであるカリウムイオン濃度には大きな差が あり、細胞内では 140 mM程度であるのに対し、細胞外では 5 mM程度である。このよ うなカリウムイオンの濃度差に反応して切断活性がスイッチング又は強弱が制御され るため、本発明の核酸酵素複合体は様々な用途への応用が可能である。
[0017] 本発明の核酸酵素複合体を細胞に導入することにより、活性を細胞外 (一価金属ィ オンであるカリウムイオンの濃度が低い）で低く抑え、細胞内（一価金属イオンである カリウムイオンの濃度が高い)で酵素活性を発揮して病因タンパク質の発現を抑える ことができる。本発明の核酸酵素複合体は通常の条件下では、細胞外で酵素活性を 発揮して人体を傷つけることがな!、。
例えば、本発明の核酸酵素複合体は HIVやインフルエンザウイルス等の疾患を引 き起こすウィルス由来の病因遺伝子の mRNAや癌遺伝子の mRNAを細胞内にお いて切断し、不活性ィ匕することができる。
[0018] 本発明の核酸酵素複合体を細胞へ導入する方法として以下のような方法が挙げら れる。
1)核酸酵素複合体を特定の細胞に導入する方法：
A)特定の細胞を生体外に取り出し、核酸酵素複合体を遺伝子銃で導入し、その後 生体に戻す。
B)特定の細胞を生体外に取り出し、核酸酵素複合体をエレクト口ポレーシヨンで導 入し、その後生体に戻す。これらの方法は、骨髄細胞等で有効である。
2)核酸酵素複合体を不特定の細胞に導入する方法：
核酸酵素複合体を、カチオン (陽イオン)性の脂質と結合させリボソーム '核酸複合 体を形成させ、細胞と接触させると、細胞膜と融合してデォキシリボザィム複合体を 効率よく細胞に導入することができる。
[0019] 以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは ない。
本実施例では核酸酵素として 10-23型デォキシリボザィムを用いた。
列 1 ターゲット (基質 RNA)として、インフルエンザウイルスの RNAポリメラーゼのサブュ- ットである PB2の mRNAの開始コドン AUGを含む部位（配列番号 2) (FEBS Lett. 481 113-116 (2000))をホスホロアミダイト法により DNA/RNA合成機で化学合成した。その 際 5'端の残基には、ケィ光色素 (Cy-5)を導入した。
実施例 1
[0020] GGA 12-merに、 E10の位置（図 6参照）で切断した 10-23型デォキシリボザィムの 2 つのサブユニットを連結したもの（配列番号 3)を合成した (以下「GGA12E10」 t 、う。） 反応容積を 10 μ Lとして、 10 M GGA12E10, KC1 0又は 100mM、 50mM緩衝液を 混合し、 95°Cで 5分間加熱した後ゆっくりと冷却することでアニーリングを行った。製 造例 1で得た基質 RNAを 1 μ Μとなるように加え、 37°Cで 30分間インキュベートした。 その後、 25mMとなるように MgClをカ卩えることで反応を開始させた。反応温度は 37°C
2
とした。 0、 24、 48、 96、 168時間で溶液の一部を分取し、反応停止溶液を十分量加え ることで反応を停止させ冷凍庫に保存した。全ての時間にお！ヽて反応を停止させた 後、 20%変性ポリアクリルアミドゲルにて 15mAの一定の電流で電気泳動を行い、バイ ォイメージングアナライザー (FLA-2000、（株)富士フィルム製)で 5'末端を Cy5ラベルし た RNAを検出し、切断活性を観測した。 pHは 7.9(リン酸緩衝液)とした。
結果を図 7に示す。切断割合は 168時間でカリウムイオン有り 12.2%、カリウムイオン 無し 3.5%であった。カリウムイオンをカ卩えたものはその作用により、四重鎖構造を形成 し、二つのサブユニットが引き寄せられることで、デォキシリボザィムの触媒部位の活 性型構造が再構築できたため切断活性が上昇したと考えられる。
実施例 2
[0021] KC1の代わりに NaClを用いて実施例 1と同様の操作を行った。
結果を図 8に示す。 Na+を用いた場合にも切断活性が認められた。しかし、カリウム イオンを用いた時の切断割合がナトリウムイオンを用いた場合よりも高い。
図 7と図 8を定量した結果、切断割合は 168時間でカリウムイオン有り 12.2%、ナトリウ ムイオン有り 5.5%であった。これは先に述べたようにナトリウムイオンに比べ、カリウム イオンを用いた場合には、 GGA-12merが形成する四重鎖構造が安定であるため、デ ォキシリボザィムの切断活性がより強くなつたものと考えられる。
[0022] 比較例 1
GGA12E10の代わりに野生型 10-23型デォキシリボザィム（配列番号 4)を用いて実 施例 1と同様の操作を行った。 pHは 8.0 (Tris- HC1)とした。
その結果を図 9に示す。野生型はカリウムイオンの有無に係わらず切断活性を有し ている。カリウムイオンの有無による各々の時間での切断活性の差は 1%未満であった 図面の簡単な説明
[0023] [図 1]本発明で用いることのできるデォキシリボザィムの例を示す図である。図中、上 の配列は基質 RNAを表し、下の配列はデォキシリボザィムを表す。 a)10-23デォキシ リボザィム。 Nは A, C, G又は T、 Rはプリン塩基 (G又は Α)、 Υはピリミジン塩基 (C又は U) を表し、矢印は切断部位、 b)10-23デォキシリボザィムの触媒部位に変異をカ卩えたも の。 Mは A又は C、 Hは A, C又は T、 Dは G, Α又は Τを表す。 c) 10-23デォキシリボザィ ムの触媒部位の特定の連続した 4残基を削除したデォキシリボザィム。 d)8-l 7デォキ シリボザィム。 e)Bipartiteデォキシリボザィム。 Xは G以外の塩基を表す。 0内は削除 可能である。 DE6デォキシリボザィム。 g)HD3デォキシリボザィム。 h)cis〖こ働く classll デォキシリボザィム ransに働くように改変したデォキシリボザィム。 0 16.2-11 enzymeG
[図 2]本発明で用いることのできるリボザィムの例を示す図である。 j)はハンマーヘッド 型リボザィムを示す N=A,G,C,or U; X=A,C,or U k)はハンマーヘッド型リボザィムを 小型化したリボザィムを示す。 N=A,G,C,or U; X=A,C,or U 1)はヘアピン型リボザィム を示す。 N=A,G,C,or U (基質部分 B=G,C,or U) m)は鉛リボザィムを示す。
N=A,G,C,or U n)は HDVリボザィム（ゲノム鎖由来）を示す。 o)は HDVリボザィム（アン チセンス鎖由来）を示す。 p)は n)と 0)を用いてデザインされた HDVリボザィム変異体 を示す。
[図 3]実施例で用いた 10-23型デォキシリボザィムを示す図である。 Nは A、 C、 G又 は T若しくは U、 Yは U又は C、 Rは A又は Gを表す。
[図 4]一価金属存在下での GGA 12-merの構造を模式的に示す図である。（A)は GGA 12-merの全体構造を示し、（B)は G:G:G:Gテトラッド、 (C)は
G (： A):G (： A):G (： A):Gヘプタッドを示す。
[図 5]デォキシリボザィムと GGA 12- merとの結合の様子と、この GGA 12- merが四重 鎖構造へと変化することにより離れていたサブユニット同士が近くに引き寄せられる 様子を示す図である。
[図 6] 10-23型デォキシリボザィムへの GGA 12-merの挿入位置を示す図である。
[図 7]「GGA12E10」におけるカリウムイオンの有無による切断活性の違 ヽを示す電気 泳動図である（実施例 1)。
[図 8]「GGA12E10」によるナトリウムイオン存在下での切断活性を示す電気泳動図で ある（実施例 2)。
[図 9]野生型 10-23型デォキシリボザィムによる切断反応を示す電気泳動図である（ 比較例 1)。

Claims

請求の範囲
[1] 核酸酵素の RNA切断反応触媒部位及び基質結合部位並びに配列（5 ' GGAGGA GGAGGN3' )から成る核酸酵素複合体であって、該基質結合部位が標的 RNAの 結合部位と相補的関係にあり、該配列（5' GGAGGAGGAGGN3' )又は該配列の 両端の少なくとも一方にリンカ一を有する配列が該 RNA切断反応触媒部位に挿入さ れて成る核酸酵素複合体。
[2] 前記核酸酵素がリボザィム又はデォキシボザィムである請求項 1に記載の核酸酵素 複合体。
[3] 前記基質結合部位を 2つ有し、該 2つの基質結合部位が前記 RNA切断反応触媒部 位を挟む請求項 1又は 2に記載の核酸酵素複合体。
[4] 基質結合部位の塩基数がそれぞれ 8 ±4である請求項 1〜3のいずれか一項に記載 の核酸酵素複合体。
[5] 前記核酸酵素が 10- 23デォキシリボザィムであり、前記標的 RN Aが ARB (式中、 A及 び Bは前記結合部位を表し、 Bの Rに隣接するヌクレオチド残基がゥリジン又はシチ ジンを表し、 Rがアデノシン又はグアノシンを表す。）で表される請求項 4に記載の核 酸酵素複合体。
[6] 請求項 1〜5のいずれか一項に記載の核酸酵素複合体、該核酸酵素複合体が由来 する核酸酵素が活性を持っために必要な成分、標的 RNA、及び一価金属イオンを 含む系にお 、て、該ー価金属イオンの濃度を lOmmolZL以上とする段階と該ー価 金属イオンの濃度を lOmmolZL未満とする段階とから成る標的 RNAの切断を制御 する方法。
[7] 前記一価金属イオンがカリウムイオンである請求項 6に記載の方法。
[8] 下記 、ずれかの方法で核酸酵素複合体を細胞へ導入することから成る細胞内の標 的 RNAを切断する方法。
A)生体外に取り出した特定の細胞に、遺伝子銃を用いて又はエレクト口ポレーショ ンにより、請求項 1〜5のいずれか一項に記載の核酸酵素複合体を導入する。
B)請求項 1〜5のいずれか一項に記載の核酸酵素複合体を、カチオン（陽イオン） 性の脂質と結合させリボソーム '核酸複合体を形成させ、細胞と接触させる。 [9] 請求項 1〜5のいずれか一項に記載の核酸酵素複合体が導入された細胞。
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