WO2005105056A1 - Composición estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende nanopartículas a base de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico - Google Patents

Composición estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende nanopartículas a base de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico Download PDF

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Juan Manuel Irache Garreta
Carlos Gamazo De La Rasilla
María Luisa SANZ LARRUGA
Marta Ferrer Puga
Beatriz SAN ROMÁN ABERASTURI
Hesham H.A. Salman
Sara GÓMEZ MARTÍNEZ
Javier OCHOA REPÁRAZ
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Definitions

  • the invention relates to the use of nanoparticles based on a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride that, optionally, contain an allergen or an antigen and / or an immunostimulating agent, as adjuvants in immunotherapy and vaccines.
  • the invention also relates to immune response stimulating compositions comprising said nanoparticles.
  • Adjuvants An adjuvant is any substance that increases the immune response against an antigen with which it is mixed.
  • the adjuvants act fundamentally by means of three mechanisms: i) forming an antigen or allergen deposit at the place of application of the vaccine, from which the biologically active product is released for a variable period of time; ii) supplying the antigen or allergen to the antigen presenting cells; and iii) inducing interleukin secretion.
  • Some examples of classic adjuvants are: the aluminum salts (alhydrogel) and catecholamines, (which enhance a Th2 response), and the lipopolysaccharide of gram negative bacteria and certain CpG sequences (which enhance the Thl response).
  • nanocapsules are vesicular systems formed by an internal cavity that is surrounded by a polymeric membrane or wall. Nanospheres are matrix forms, formed by a three-dimensional polymeric network.
  • the molecules of the biologically active substance can be dissolved, trapped or bound in the macromolecular structure (in the nanospheres) or encapsulated by the polymeric membrane (in the nanocapsules), it can even be adsorbed on the surface of the nanoparticles.
  • the distribution of nanoparticles is, in general, dependent on their physico-chemical characteristics (mainly size and surface properties), which determine their interaction with the biological environment. Therefore, they are particularly interesting pharmaceutical forms as adjuvants in immunotherapy or in vaccines for the administration of antigens and / or allergens.
  • the most important potentials provided by these vectors of non-biological origin are the following [Couvreur & Inc. Adv. Drug Del.
  • microparticles are effective in inducing cellular and cytotoxic immune responses in mice [Nixon et al, Vaccine 14 (1996) 1523-1530; Maloy et al, Immunology 81 (1994) 661-667; Moore et al, Vaccine 13 (1995) 1741-1749].
  • oral immunization with microparticles induces potent mucosal and systemic immune responses against encapsulated antigens [Chalacombe et al, Immunology 176 (1992) 164-168; Eldridge et al, J Control Re ⁇ 11 (1990) 205-214; O ⁇ agan et al, Novel Delivery Systems for Oral Vaccines (1994) 175-205].
  • Allergic diseases are an emerging pathology caused by an adverse immune response (hypersensitivity reaction) to intrinsically harmless macromolecules, called allergens.
  • This hypersensitivity affects approximately 30% of the world's population, mainly in industrialized countries. He is responsible for diseases such as allergic rhinitis, extrinsic asthma, food allergies and allergies to drugs and insects [Settipane et al, Allergy Proc, 15 (1994) 21-25].
  • the prevalence of such diseases in the population aged 4 to 17 years is 13.3%; Among them, 6.4% manifest as bronchial asthma, with the death rate from asthma in our country being 1.5 / 100,000 inhabitants.
  • ThO immature T cells
  • IL-12 interleukin 12
  • IFN- ⁇ interleukin 18
  • IFN- ⁇ interleukin alfa
  • ThO cell is in an environment where interleukin 4 (IL-4) and prostaglandin E2 (PGE2) predominate, differentiation to Th2 will be induced, characterized by the synthesis of high amounts of IL-4, interleukin 5 (IL-5) and interleukin 13 (IL-13), and by the synthesis of IgG t and IgE, biotype directly involved in the triggering process [Hannah et al, Ann Rev Immunol, 21 (2003) 579-628] .
  • IL-4 interleukin 4
  • PGE2 prostaglandin E2
  • Th2 phenotype are the only ones capable of directly recognizing allergenic peptides and participating in the production of IgE by B lymphocytes, mast cell activation and production , maturation and activation of eosinophils [Cohn et al, Pharmacology and Therapeuiics, 88 (2000) 187-196]. Therefore, the Th2 functional predominance over Thl cells would lead to the allergic response, while the Thl functional predominance over Th2 cells would inhibit it [Mart ⁇ n et al, Alergol Inmunol Clin, 17 (2002) 104-110].
  • Th2 response could lead to the development of autoimmune diseases, so it would be more correct to boost an immune regulation of the Thl / Th2 balance, by increasing the population of regulatory T lymphocytes (Tr) and of IL-10 and T cell growth factor ⁇ (TGF- ⁇ ).
  • Tr regulatory T lymphocytes
  • TGF- ⁇ T cell growth factor ⁇
  • IL-10 may have important pathophysiological implications to counteract inflammatory diseases (Crohn's disease, rheumatoid arthritis, psoriasis, etc.), certain viral infections (hepatitis C, infections caused by the human immunodeficiency virus (HPV), etc.), or even inhibit the side effects of org transplant Therefore, the direct application of IL-10, or the use of adjuvants that stimulate the production of IL-10, could have a great impact on the treatment of these diseases [Asadullah et al, Pharmacol Rev, 55, ( 2003) 241-269].
  • allergen immunotherapy would be the most appropriate method of control.
  • Specific allergen immunotherapy has been defined as repeated administration of allergens to patients with IgE-mediated health disorders, with the purpose of providing protection against allergic symptoms and inflammatory reactions associated with natural exposure to these allergens [Jutel,
  • said adjuvants should be useful for use in oral immunization or immunotherapy without having to use very high doses of allergen or antigen.
  • oral immunization for therapeutic or prophylactic purposes has to face different obstacles, since the dose of immunogenic or allergenic active ingredient required for a beneficial clinical effect is extremely large due to a loss. of immunogen potency.
  • the doses should always be much higher (up to 200 times) than those normally used subcutaneously [Taudorf et al, J Allergy Clin Immunol (1987) 153-161; Cruticos et al, J Allergy Clin Immunol (1990) 165].
  • the gastrointestinal mucosa acts as a barrier very little permeable to the absorption of these macromolecules.
  • the methyl vinyl ether and maleic anhydride copolymer nanoparticles that, optionally, contain an allergen or an antigen and / or an immunostimulatory agent, have the ability to stimulate or enhance the immune response when administered to a subject, which allows its use in immunotherapy and vaccines.
  • Said nanoparticles are stable in oral administration, have good bioadhesive characteristics and, therefore, can be used in immunization or immunotherapy by different routes, including the oral route, without using allergen or antigen doses as high as those mentioned in the state. of technique
  • said nanoparticles are poorly toxic, biodegradable and easily produced.
  • PVM / MA methyl vinyl ether copolymer and maleic anhydride
  • Said PVM / MA copolymer is structurally composed of two distinct functional groups having different solubility characteristics: a hydrophobic ester group and another anhydride group.
  • the carboxylic group is a blistering sol, since it tends to dissolve the polymer when it is ionized, and the ester group is hydrophobic, since it delays water penetration into the polymer [Heller et al, J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009].
  • the synthetic PVM / MA copolymers have very diverse applications. Gantrez® AN is widely used as a thickener and flocculant, dental adhesive, oral tablet excipient, transdermal patch excipient, etc. On the other hand, the use of these copolymers for the controlled release of drugs has been described [Heller et al, J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009], and, in matrix forms, for the topical release of drugs in the eye [Finne et al, JPharm Sci, 80 (1991) 670-673; Finne et al, In ⁇ JPharm, 78 (1992) 237-241]. PVM / MA based nanoparticles have bioadhesive characteristics
  • PVM / MA-based nanoparticles are colloidal systems capable of retaining biologically active substances by: (i) solution or entrapment within the macromolecular structure or matrix; (ii) covalent binding of the drug with the anhydride groups of the copolymer; and (iii) adsorption processes mediated by links weak.
  • Patent application WO 02/069938 describes the use of said PVM / MA copolymer nanoparticles as a drug carrier, namely, 5-fluorouridine, ganciclovir and the ISIS 2922 antisense oligonucleotide.
  • the object of the present invention is to provide a composition that stimulates the immune response in a subject, useful as an adjuvant in immunotherapy and vaccines, stable when administered orally, with good bioadhesive characteristics for its interaction with mucous membranes, capable optionally transporting an allergen or an antigen and / or an immunostimulating agent and releasing said products in a controlled manner, useful, therefore, in immunization or immunotherapy by different routes, including the oral route.
  • the methyl vinyl ether and maleic anhydride copolymer nanoparticles that, optionally, contain an allergen or an antigen and / or an immunostimulatory agent, have the ability to stimulate or enhance the immune response when administered to a subject, which allows its use in immunotherapy and vaccines.
  • said nanoparticles are easy to produce, have good bioadhesive characteristics, are low toxic and biodegrad (that is, they dissolve or degrade in a period of time that is acceptable for the desired application, in this case therapy in alive, once exposed to a physiological solution of pH 6-9 and temperature between 25 ° C and 40 ° C).
  • the invention relates to an immune response stimulating composition, comprising nanoparticles based on a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride.
  • Said nanoparticles may also contain an allergen or an antigen and / or an immunostimulating agent, which may be contained within said nanoparticles and / or at least partially covering the surface of said nanoparticles.
  • said nanoparticles may contain a crosslinking agent.
  • said composition may be in the form of lyophilisate.
  • the invention relates to a vaccine or composition for immunotherapy comprising said immune response stimulating composition.
  • said vaccine or composition for immunotherapy is a formulation suitable for oral administration, while in another particular embodiment, said vaccine or composition for immunotherapy is a formulation suitable for administration parenterally.
  • the invention relates to the use of said immune response stimulating composition in the preparation of a vaccine or composition for immunotherapy.
  • the invention relates to the use of said immune response stimulating composition in the preparation of a pharmaceutical composition for selective stimulation of the Thl immune response, or in the preparation of a pharmaceutical composition for selective stimulation of the Th2 immune response, or in the elaboration of a pharmaceutical composition for the stimulation, in a balanced way, of the Thl and Th2 immune responses.
  • the invention relates to a process for the production of an immune response stimulating composition
  • an immune response stimulating composition comprising said nanoparticles based on PVM / MA and an allergen or an antigen and / or an immunostimulating agent comprising the addition of said allergen or antigen and / or immunostimulating agent to an organic solution comprising said PVM / MA copolymer before proceeding with its desolvation with a hydroalcoholic solution, or, alternatively, incubating said allergen or said antigen and / or with said immunostimulating agent with said PVM / MA nanoparticles.
  • Said process may further comprise additional stages of elimination of organic solvents and / or purification, as well as stabilization steps of the nanoparticles obtained through the use of crosslinking agents.
  • said process may comprise an additional lyophilization step.
  • Figure 1 is a graph representing the ovalbumin released (%) from the formulations NP-I, NP-II, NP-III and NP-IV with respect to time (days).
  • Figure 2 is a graph depicting the levels of specific anti-ovalbumin antibodies (IgG l5 IgG 2a ) after immunization of Balb / c mice intradermally via ovalbumin free solution (OVA), ovalbumin adsorbed in alhydrogel (OVA-Alum), empty nanoparticles (NP), NP-I, NP-II, NP-III and NP-IV over time.
  • OVA ovalbumin free solution
  • OVA-Alum ovalbumin adsorbed in alhydrogel
  • NP empty nanoparticles
  • Figure 3 is a graph representing the levels of specific anti-ovalbumin antibodies (IgG l5 IgG 2a ) after immunization of oral Balb / c mice of ovalbumin free solution (OVA), empty nanoparticles (NP), NP-I, NP-II, NP-III and NP-IV versus time.
  • Figure 4 is a graph representing the levels of specific anti-ovalbumin antibodies (IgGi, IgG 2a ) after immunization of oral Balb / c mice with different doses of encapsulated ovalbumin (NP-III25 and NP-III50) and empty nanoparticles ( NP) versus time.
  • Figure 5 is a graph depicting the levels of specific anti-ovalbumin antibodies (IgGj.) After immunization of Balb / c mice intradermally via ovalbumin solution (OVA), ovalbumin adsorbed in alhydrogel (OVA-Alum), empty nanoparticles ( NP), NP-I, NP-III, NP-V, NP-VI and NP-VII versus time.
  • OVA ovalbumin solution
  • OVA-Alum ovalbumin adsorbed in alhydrogel
  • NP empty nanoparticles
  • Figure 6 is a graph depicting the levels of specific anti-ovalbumin antibodies (IgG 2a ) after immunization of Balb / c mice intradermally via ovalbumin-free solution (OVA), ovalbumin adsorbed in alhydrogel (OVA-Alum), empty nanoparticles (NP), NP-I, NP-III, NP-VI, NP-VI and NP-VII versus time.
  • OVA ovalbumin-free solution
  • OVA-Alum ovalbumin adsorbed in alhydrogel
  • NP empty nanoparticles
  • Figure 7 is a graph depicting the concentration of serum IL-10 after immunization of Balb / c mice intradermally via ovalbumin-free solution (OVA), ovalbumin adsorbed on alhydrogel (OVA-Alum), empty nanoparticles (NP), NP-I, NP-III, NP-V, NP-VI and NP-VII against time.
  • Figure 8 is a graph depicting the levels of specific anti-ovalbumin antibodies (IgGj . , IgG 2a ) after immunization of Bald / c mice intradermally via ovalbumin adsorbed in alhydrogel (OVA-Alum), OVASAL and ovalbumin solution (OVA) ) versus time.
  • Figure 9 shows the result of separation by polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) of the HE extract and Coomassie staining for proteins (10 ⁇ g of extract per well).
  • Figure 10 shows the result of an immunoblotting analysis of the HE extract before (A) and after (B) encapsulation, using a mixture of sera from infected hens.
  • Figure 11 is a graph illustrating the results of a protection experiment of Balb / c mice intraperitoneally with a lethal dose of 10 2 colony forming units (CFU) of S. Enteritidis 3934.
  • CFU colony forming units
  • Figure 12 is a diagram of bars showing the release of IFN- ⁇ (A) and IL-4 (B) by splenic cells of Balb / c mice re-stimulated with HE extract.
  • Figure 13 is a bar chart showing the result of an indirect ELISA of sera from Balb / c mice against HE extract, using IgG antibodies ! and IgG 2a .
  • the methyl vinyl ether and maleic anhydride copolymer nanoparticles that, optionally, contain an allergen or an antigen and / or an immunostimulatory agent, have the ability to stimulate or enhance the response immune when administered to a subject, which allows its use in immunotherapy and vaccines.
  • subject as used herein includes any animal that possesses an immune system, preferably mammals, more preferably, the human being.
  • the invention relates to an immune response stimulating composition, hereinafter a composition of the invention, comprising nanoparticles based on a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride.
  • Said nanoparticles may also contain an allergen or an antigen and / or an immunostimulating agent, which may be contained within said nanoparticles and / or at least partially covering the surface of said nanoparticles.
  • said nanoparticles may contain a crosslinking agent.
  • the term "nanoparticles” is used to designate colloidal systems of solid particle type smaller than 1.0 micrometer, preferably of the order of 10 to 900 nanometers (nm), and includes matrix nanospheres and nanocapsules. vesicular In a particular embodiment, said nanoparticles have an average size equal to or less than 400 nm.
  • the nanoparticles present in the composition of the invention comprise a copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride, also called poly (methyl vinyl ether-co-maleic anhydride) or PVM / MA.
  • Said PVM / MA copolymer is a product It is known that it can be obtained by conventional methods, for example, by polymerization of acetylene with maleic anhydride or it can be purchased commercially. In this sense, the International Specialty Products (ISP) company produces PVM / MA copolymers of different molecular weight that it sells under the trademark Gantrez® AN].
  • ISP International Specialty Products
  • the molecular weight of said PVM / MA copolymer can vary within a wide range, preferably, between 100 and 2,400 kDa, more preferably between 200 and 2,000 KDa. In a variant of the invention a PVM / MA copolymer with a molecular weight between 180 and 250 kDa is preferred.
  • PVM / MA Due to the availability of functional groups in PVM / MA, the covalent binding of molecules with nucleophilic groups, such as hydroxyls or amines, takes place by simple incubation in an aqueous medium. Likewise, said nanoparticles of PVM / MA have bioadhesive properties [Arbós et al, Ini J Pharm, (2002) 129-136], so, when administered orally, they can interact with Peyer's plates, which contain 20% of total lymphocytes of the organism, and trigger an amplified immune response with respect to that of the antigens and / or allergens administered in aqueous solution.
  • the composition of the invention comprises nanoparticles based on PVM / MA that lack antigen or allergen and immunostimulating agent.
  • Said nanoparticles are referred to as "empty” nanoparticles in this description and can easily be obtained by a procedure such as that described in patent application WO 02/069938, the content of which is incorporated in its entirety, by reference, to this patent application.
  • said empty nanoparticles are easily prepared by desolvation with a hydroalcoholic phase of an acetone solution of a PVM / MA copolymer.
  • the formed nanoparticles can be left in a stable aqueous suspension or they can be lyophilized.
  • a crosslinking agent can be added.
  • Virtually any crosslinking agent containing one or more functional groups that can react with the anhydride groups of the PVM / MA copolymer can advantageously use a polyamine or a carbohydrate, such as an amino acid, a protein, a bear, an ossid, etc. ., for example, Usina, arginine, histidine, water-soluble proteins, poly-L-lysine, poly-L-arginine, etc., preferably, 1,3-diaminopropane.
  • Said empty nanoparticles can act as an adjuvant in vaccination or in immunotherapy when administered in conjunction with vaccines or compositions for immunotherapy (immunotherapeutic compositions) contain an antigen or an allergen, respectively, producing a stimulatory effect of the immune response after administration of the vaccine. or of the immunotherapeutic composition and the empty nanoparticles.
  • Figure 12 shows how the administration of empty nanoparticles induces the secretion of significant amounts of IFN- ⁇ .
  • the combined administration of a vaccine or of an immunotherapeutic composition and of the nanoparticles can be carried out simultaneously or sequentially, separated in time, in any order, that is, the vaccine or the immunotherapeutic composition can be administered first and then the nanoparticles or vice versa.
  • said vaccine or immunotherapeutic composition and said nanoparticles can be administered simultaneously.
  • the vaccine or immunotherapeutic composition and nanoparticles can be administered in the same composition or in different compositions.
  • the dose of empty nanoparticles to be administered may vary within a wide range, for example, between about 0.01 and about 10 mg per kg of body weight, preferably, between 0.1 and 2 mg per kg of body weight.
  • the composition of the invention comprises nanoparticles based on PVM / MA loaded with an allergen or an antigen and / or with an immunostimulating agent.
  • the composition of the invention comprises nanoparticles based on PVM / MA loaded with an allergen or with an antigen, wherein said nanoparticles based on PVM / MA comprise an allergen or an antigen.
  • allergen refers to a substance to which a subject is sensitive and causes an immune reaction, for example, allergenic extracts of pollens, allergenic extracts of insects, allergenic extracts of food or products. food, components present in saliva, tweezers or stingers of insects that induce a sensitivity reaction in a subject, components present in plants that induce a sensitivity reaction in a subject, etc.
  • protein extracts from pollens such as grass pollen (Lolium perenne, Poa pra ⁇ ense, Phleum architectureense, Cynodon dactylon, Festuca praiensis, Dac ⁇ ylis glomerata, Sécale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Trificum sativa), can be used. from other herbs (such as Ariemisia vulgaris, Chenopodium album, Planiago lanceolaia, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica), or from trees (such as European Olea, Plaianus sp., Cupresus sp.), etc.
  • grass pollen Limitia vulgaris, Chenopodium album, Planiago lanceolaia, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica
  • trees such as European Olea, Plaianus sp
  • Protein extracts of insects such as dust mites (such as Dermafophagoides Péronyssimus, Dermaiophagoides farinae, Acaros Siró, Blomia iropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus caerruc ⁇ or, Tyropegus pu ⁇ rescentia, etc.) can also be used.
  • Other allergenic extracts can be obtained from fungi and animal epithelia (Al ⁇ ernaria alierna ⁇ a, Cladosporium herbarum, dog epithelium, cat epithelium, horse epithelium, feather mixing, Penicillium noiaium, etc.), as well as food components, etc.
  • any allergen can be used in the preparation of the nanoparticles loaded with allergen of the composition of the invention; however, in a particular embodiment, said allergen is ovalbumin (OVA), a protein widely used as an experimental allergenic model.
  • OVA ovalbumin
  • the term "antigen” refers to an immunogenic, native or recombinant product, obtained from a higher organism or a microorganism, for example, a bacterium, a virus, a parasite, a protozoan, a fungus, etc., which contains one or more antigenic determinants, for example, structural components of said organisms; toxins, for example, exotoxins, etc.
  • any antigen can be used in the preparation of the nanoparticles loaded with antigen of the composition of the invention; however, in a particular embodiment, said antigen is the Salmonella Enteritidis HE extract.
  • Salmonella Enteritidis is the causative agent of human gastroenteritis most frequently detected in outbreaks of food toxinfection (60% of the cases in which the agent has been isolated). Poultry and products derived from them are recognized as the main reservoir of Salmonella, and the most important source of Salmonella Enteritidis infection in humans. The infection is a zoonosis that is transmitted by ingestion of contaminated food or water, and is currently a pandemic.
  • live vaccines In addition to their poor effectiveness, the great disadvantage of live vaccines is their potential virulence in immunosuppressed animals, as well as their possible reversibility to invasive states. In addition, they must be administered parenterally and interfere with traditional serological diagnostic tests. Inactivated bacteria (bacterins) have no risk of residual virulence, but they do not induce a cellular immune response, administration of some potent adjuvant is required and they need multiple doses of memory.
  • An alternative would be the use of subcellular vaccines that are capable of stimulating an adequate immune response against Salmonella Enteritidis infection.
  • the allergen or antigen present in this variant of the composition of the invention may be at least partially covering the surface of said nanoparticles and / or contained within said nanoparticles.
  • said allergen or antigen is coating all or part of the surface of said nanoparticles.
  • This embodiment is useful for selectively stimulating a Th2 response in the subject.
  • said allergen or antigen is encapsulated within said PVM / MA nanoparticles. This embodiment is useful for stimulating a balanced Thl and Th2 response, or with a predominance of Thl response.
  • PVM / MA nanoparticles loaded with an allergen or an antigen can be easily obtained by a procedure similar to that described in patent application WO 02/069938.
  • said allergen or antigen-charged nanoparticles can be easily prepared by desolvation with a liquid phase, for example, a hydroalcoholic phase, such as a liquid phase formed by ethanol and water, of a solution of a PVM / copolymer.
  • a liquid phase for example, a hydroalcoholic phase, such as a liquid phase formed by ethanol and water
  • MA in an organic solvent, such as a polar organic solvent, for example, acetone.
  • the formed nanoparticles are left in an aqueous suspension or lyophilized.
  • different formulations will be obtained with different arrangement thereof (see formulations identified as NP I, NP II, NP III, NP IV and NP HE 3934 in Examples 1 and 6 ).
  • the allergen or antigen when it is desired that the allergen or antigen be covering all or part of the surface of the nanoparticles, then said allergen or said antigen is incubated after evaporating the organic solvents. Also, when it is desired that the allergen or antigen is encapsulated within said nanoparticles, then said allergen or said antigen dispersed in a solvent, preferably the solvent in which the PVM / MA copolymer solution is found or miscible with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone, before adding said liquid phase used to desolvate the PVM / MA copolymer solution.
  • a solvent preferably the solvent in which the PVM / MA copolymer solution is found or miscible with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone
  • the invention relates to a process for the production of a composition of the invention comprising nanoparticles based on a PVM / MA copolymer charged with an allergen or with an antigen, wherein said nanoparticles based on the PVM / MA copolymer comprise an allergen or an antigen, said process comprising the steps of: a) desolvation of an organic solution of a PVM / MA copolymer dissolved in an organic solvent with a hydroalcoholic solution; b) removal of organic solvents to obtain nanoparticles, and c) addition of said allergen or said antigen to said organic solution of PVM / MA copolymer before effecting the desolvation of said organic solution of the PVM / MA copolymer or, alternatively, incubating said allergen or said antigen with said nanoparticles obtained in step b).
  • the organic solvent in which the PVM / MA copolymer is dissolved can be any solvent in which said copolymer is typically soluble, a polar solvent, such as a ketone, for example, acetone.
  • the liquid phase used to effect said desolvation can be any hydroalcoholic solution comprising an alcohol and water, for example, ethanol and water, for example, alcohol and pharmaceutical grade water (purified water or water for injection, depending on the application).
  • the ratio of copolymer solution: hydroalcoholic solution is between 1: 1 and 1:10, preferably 1: 4.
  • the organic solvents are then removed by any conventional method, for example, by evaporation under reduced pressure and the nanoparticles are instantly formed in the medium, under the appearance of a stable aqueous milky suspension.
  • the addition of the allergen or antigen to the organic PVM / MA copolymer solution prior to the desolvation of said organic solution of the PVM / MA copolymer allows to obtain nanoparticles in which the allergen or the antigen is contained within said nanoparticles.
  • said allergen or antigen is added dissolved or dispersed in the same organic solvent as that of the organic solution of the PVM / MA copolymer or miscible with said solvent, such as a polar organic solvent, for example, acetone.
  • a polar organic solvent for example, acetone.
  • the incubation of said allergen or said antigen with the nanoparticles obtained in the step b) allows obtaining nanoparticles in which the allergen or the antigen is covering all or part of the outer surface of said nanoparticles.
  • incubation of the allergen or antigen with the nanoparticles is performed in an aqueous medium.
  • a crosslinking agent can be added to improve the stability of the nanoparticles, as previously described in relation to the empty nanoparticles.
  • the nanoparticles loaded with allergen or antigen obtained can be purified by conventional means, for example, by centrifugation, ultracentrifugation, tangential filtration, or evaporation, including the use of vacuum.
  • nanoparticles loaded with allergen or antigen can be lyophilized for long-term storage and preservation.
  • usual cryoprotective agents can be used, preferably at a concentration between 0.1 and 10% by weight with respect to the total composition.
  • the nanoparticles loaded with allergen or antigen can act as an adjuvant in vaccination or in immunotherapy and produce a stimulatory effect of the immune response after administration to a subject, as is shown in Examples 3-6.
  • the dose of nanoparticles loaded with allergen or antigen to be administered may vary within a wide range, for example, between about 0.01 and about 10 mg per kg of body weight, preferably, between 0.1 and 2 mg per kg of weight. bodily.
  • the composition of the invention comprises nanoparticles based on PVM / MA loaded with an immunostimulating agent, wherein said nanoparticles based on PVM / MA comprise an immunostimulating agent.
  • the term "immunostimulatory agent” or “immunomodulator” refers to a product capable of specifically or nonspecifically potentiating the immune response, for example, proteins or peptides that function as natural adjuvants by stimulating the immune system response to allergen or antigen, bacterial lipolysaccharides, cell wall components of Gram positive bacteria (for example, muramyl dipeptide (MDP)) CpG DNA sequences, plant extracts, mainly saponins, etc.
  • MDP muramyl dipeptide
  • any immunostimulatory agent can be used in the preparation of nanoparticles loaded with immunostimulatory agent of the composition of the invention; however, in a particular embodiment, said immunostimulating agent is the rough lipopolysaccharide of Brucella Ovis. Said immunostimulating agent may be at least partially coating the surface of said nanoparticles and / or contained within said nanoparticles. In a particular embodiment, said immunostimulating agent is coating all or part of said PVM / MA nanoparticles, while in another particular embodiment, said immunostimulating agent is encapsulated within said PVM / MA nanoparticles.
  • PVM / MA nanoparticles loaded with immunostimulatory agent can be easily obtained by a procedure similar to that previously described in relation to the preparation of PVM / MA nanoparticles loaded with an allergen or with an antigen but replacing said allergen or antigen with the immunostimulating agent.
  • different formulations with different disposition thereof will be obtained (see Example 1 or 4).
  • said immunostimulatory agent is incubated after evaporating the organic solvents.
  • the immunostimulating agent when it is desired that the immunostimulating agent be encapsulated within said nanoparticles, then said dispersed or dissolved immunostimulating agent is incubated in a solvent, advantageously the solvent in which the PVM / MA or miscible copolymer solution is found with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone, before adding said liquid phase used to desolvate the PVM / MA copolymer solution.
  • a crosslinking agent can be added as previously mentioned in relation to the empty nanoparticles.
  • a crosslinking agent can be added to improve the stability of the nanoparticles, as previously described in relation to the empty nanoparticles.
  • the nanoparticles loaded with immunostimulating agent can be purified by conventional means as previously mentioned in relation to the nanoparticles loaded with allergen or antigen.
  • nanoparticles loaded with immunostimulating agent can be lyophilized using customary cryoprotective agents, preferably at a concentration between 0.1 and 10% by weight with respect to the total composition.
  • Nanoparticles loaded with immunostimulatory agent can act as an adjuvant in vaccination or immunotherapy and produce a stimulatory effect of the immune response after administration to a subject.
  • the dose of nanoparticles loaded with immunostimulating agent to be administered may vary within a wide range, for example, between about 0.01 and about 10 mg per kg of body weight, preferably, between 0.1 and 2 mg per kg of body weight.
  • the composition of the invention comprises nanoparticles based on PVM / MA loaded with an allergen or an antigen and with an immunostimulating agent, wherein said PVM / MA based nanoparticles comprise an allergen or an antigen and an immunostimulating agent.
  • the allergen or antigen as well as the stimulating agent present in this variant of the composition of the invention may be covering at least partially the surface of said nanoparticles and / or contained within said nanoparticles.
  • said allergen or antigen is coating all or part of the surface of said nanoparticles while the immunostimulating agent is contained within said nanoparticles, it being noted that this particular embodiment allows selectively stimulating a Th2 response in the subject .
  • said allergen or antigen is encapsulated within said PVM / MA nanoparticles while said stimulating agent is at least partially coating the surface of said nanoparticles. This embodiment is particularly interesting to stimulate a balanced Thl and Th2 response, or with a predominance of Thl response.
  • both the allergen or antigen and the immunostimulatory agent are encapsulated within said PVM / MA nanoparticles.
  • PVM / MA nanoparticles containing an allergen or an antigen and an immunostimulating agent can be easily obtained by a procedure similar to those previously described. Depending on the moment in which the allergen or the antigen and the immunostimulating agent are added, different formulations with different disposition of said products will be obtained. By way of illustration, when it is desired that the immunostimulatory agent be coating all or part of the surface of the nanoparticles, then said immunostimulatory agent is incubated after evaporating the organic solvents.
  • the immunostimulating agent when it is desired that the immunostimulating agent be encapsulated within said nanoparticles, then said dispersed or dissolved immunostimulating agent is incubated in a solvent, advantageously the solvent in which the PVM / MA or miscible copolymer solution is found with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone, before adding said liquid phase used to desolvate the PVM / MA copolymer solution.
  • a solvent advantageously the solvent in which the PVM / MA or miscible copolymer solution is found with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone, before adding said liquid phase used to desolvate the PVM / MA copolymer solution.
  • the allergen or antigen when it is desired that the allergen or antigen be covering all or part of the surface of the nanoparticles,
  • the allergen or antigen when it is desired that the allergen or antigen be encapsulated within said nanoparticles, then said allergen or antigen dispersed or dissolved in a solvent, advantageously the solvent in which the PVM / copolymer solution is found MA or miscible with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone, before adding said liquid phase used to desolvate the PVM / MA copolymer solution .
  • a solvent advantageously the solvent in which the PVM / copolymer solution is found MA or miscible with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone, before adding said liquid phase used to desolvate the PVM / MA copolymer solution .
  • the allergen or the antigen and the immunostimulating agent be encapsulated within said nanoparticles
  • said allergen or said antigen is incubated, optionally mixed with said immunostimulatory agent, dispersed or dissolved in a solvent, advantageously the solvent in which the PVM / MA copolymer solution is found or miscible with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone, before adding said liquid phase used to desolvate the PVM / MA copolymer solution.
  • a solvent advantageously the solvent in which the PVM / MA copolymer solution is found or miscible with said solvent, such as an organic solvent, preferably polar, or a solvent miscible with that of the polymer solution, for example, acetone
  • the invention relates to a process for the production of a composition of the invention comprising naiioparticles based on a PVM / MA copolymer charged with an allergen or with an antigen and with an immunostimulating agent.
  • said PVM / MA copolymer-based nanoparticles comprise an allergen or an antigen and an immunostimulating agent
  • said process comprising the steps of: a) desolvation of an organic solution of a PVM / MA copolymer dissolved in an organic solvent with a hydroalcoholic solution; b) elimination of organic solvents to obtain nanoparticles, and c) addition of said allergen or said antigen and / or said immunostimulatory agent to said organic PVM / MA copolymer solution before effecting the desolvation of said organic solution of the copolymer of PVM / MA or, alternatively, incubating said allergen or said antigen or said immunostimulating agent with said nanoparticles obtained in step b).
  • Steps a) and b) are performed in a similar manner as previously described in relation to the process for producing a composition of the invention comprising nanoparticles based on a PVM / MA copolymer charged with an allergen or with an antigen.
  • Step c) is carried out in a manner similar to that previously described in relation to said procedure but making the necessary modifications to add the immunostimulating agent, either to said organic PVM / MA copolymer solution before carrying out the desolvation of said solution.
  • organic of the PVM / MA copolymer optionally together with the allergen or antigen, or alternatively, incubating said immunostimulating agent with said nanoparticles obtained in step b), optionally partially coat with said allergen or antigen, as mentioned above.
  • a crosslinking agent can be added to improve the stability of the nanoparticles obtained.
  • the nanoparticles loaded with allergen or antigen and with immunostimulant agent obtained can be purified by conventional means, for example, by centrifugation, ultracentrifugation, tangential filtration, or evaporation, including the use of vacuum.
  • nanoparticles loaded with allergen or antigen can be lyophilized for long-term storage and preservation.
  • usual cryoprotective agents can be used, preferably at a concentration between 0.1 and 10% by weight with respect to the total composition.
  • the nanoparticles loaded with an allergen or with an antigen and with an immunostimulatory agent can act as an adjuvant in vaccination or in immunotherapy and produce a stimulatory effect of the immune response after administration to a subject, as shown in Examples 3 -6.
  • the dose of nanoparticles loaded with an allergen or an antigen and with an immunostimulating agent to be administered may vary within a wide range, for example, between about 0.01 and about 10 mg per kg of body weight, preferably, between 0.1 and 2 mg per kg body weight.
  • the composition of the invention if desired, can be in lyophilized form or in a form of administration suitable for oral or parenteral administration.
  • Lyophilization is carried out by conventional methods, optionally in the presence of conventional cryoprotective agents, for example, sucrose, mannitol, trehalose, glycerol, lactose, sorbitol, polyvinyl pyrridone, etc., preferably at a concentration between 0.1 and 10% by weight with respect to the total composition.
  • cryoprotective agents for example, sucrose, mannitol, trehalose, glycerol, lactose, sorbitol, polyvinyl pyrridone, etc.
  • acceptable excipients and vehicles suitable for the preparation of the desired administration form will be used. Information on said vehicles and excipients, as well as on said forms of administration suitable for administration of the composition of the invention orally or parenterally can be found in galenic pharmacy treaties.
  • the composition of the invention produces a stimulatory or potentiating effect of the immune response upon administration to a subject and can therefore be used as an adjuvant in vaccines or immunotherapy.
  • the composition of the invention has the ability to selectively stimulate one of the two immune response pathways (Thl or Th2) or both pathways simultaneously and in a balanced manner, so it can be used in vaccine or immunotherapeutic formulations depending on function. of the response you want to stimulate.
  • a stimulation of the Thl response is required ( intracellular, as in the case of Brucella, Salmonella, etc.) or Th2 response (extracellular, as in the case of S ⁇ aphylococcus, Escherichia coli, enterotoxigenic bacteria, etc.).
  • Thl response intracellular, as in the case of Brucella, Salmonella, etc.
  • Th2 response extracellular, as in the case of S ⁇ aphylococcus, Escherichia coli, enterotoxigenic bacteria, etc.
  • a tolerance induction is required for an immunotherapeutic formulation by the presence of the two types of response, that is, inducing Thl and Th2 responses in a balanced manner.
  • the formulations will contain nanoparticles of PVM / MA completely or partially coated by the allergen or antigen, while to stimulate a Thl and Th2 response in a balanced manner, or with a predominance of the Thl response,
  • the formulations will contain PVM / MA nanoparticles in which the antigen or allergen will be encapsulated and, advantageously, said nanoparticles will include a crosslinking agent.
  • the nanoparticles may include, if desired, an immunostimulating agent.
  • the invention relates to a vaccine or to a composition for immunotherapy comprising a therapeutically effective amount of an immune response stimulating composition (composition of the invention) together with a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • Said vaccine or composition for immunotherapy can be found in any pharmaceutical form of administration by any appropriate route, for example, oral, parenteral, rectal, etc.
  • said vaccine or composition for immunotherapy is in a pharmaceutical form of oral administration
  • said vaccine or composition for immunotherapy is in a pharmaceutical form of administration by oral route.
  • parenteral for example, intramuscularly (im), subcutaneously (sc), intravenously (iv), intraperitoneally (ip), intradermally (id), etc.
  • composition of the invention present in said vaccine or immunotherapy composition comprises nanoparticles based on PVM / MA.
  • Said nanoparticles may also contain an allergen or an antigen and / or an immunostimulating agent, which may be contained within said nanoparticles and / or at least partially covering the surface of said nanoparticles.
  • said nanoparticles may optionally contain a crosslinking agent.
  • the composition of the invention present in said vaccine or immunotherapy composition provided by this invention comprises empty nanoparticles based on PVM / MA which, optionally, incorporate a crosslinking agent.
  • the composition of the invention is administered in combination with vaccine or immunotherapeutic compositions containing an antigen or an allergen, respectively, producing a stimulatory effect of the immune response after administration of said vaccine or immunotherapeutic composition and the empty nanoparticles.
  • the combined administration of said vaccine or immunotherapeutic composition and of the empty nanoparticles can be carried out simultaneously or sequentially, separated in time, in any order, that is, the vaccine or immunotherapeutic composition can be administered first and, subsequently, the empty nanoparticles or vice versa.
  • said vaccine or immunotherapeutic composition and said empty nanoparticles can be administered simultaneously.
  • the vaccine or immunotherapeutic composition and the empty nanoparticles can be administered in the same composition or in different compositions.
  • the composition of the invention present in said vaccine or immunotherapy composition provided by this invention comprises PVM / MA based nanoparticles wherein said PVM / MA nanoparticles further comprise an allergen or an antigen, and , if desired, a crosslinking agent.
  • the composition of the invention present in said vaccine or immunotherapy composition provided by this invention comprises PVM / MA based nanoparticles wherein said PVM / MA nanoparticles further comprise an immunostimulating agent, and, if desired, a crosslinking agent.
  • the composition of the invention present in said vaccine or immunotherapy composition provided by this invention comprises PVM / MA based nanoparticles wherein said PVM / MA nanoparticles further comprise an allergen or an antigen and a immunostimulating agent, and, if desired, a crosslinking agent.
  • the vaccine or composition for immunotherapy provided by this invention comprises a composition of the invention in a therapeutically effective amount, that is, in an amount suitable to enhance or stimulate the immune response. Therefore, the amount of composition of the invention present in a vaccine or composition for immunotherapy provided by this invention may vary over a wide range depending, among other factors, on the type of nanoparticles (empty or loaded with allergen or antigens and / or with immunostimulating agent), etc.
  • the invention provides a vaccine or composition for immunotherapy comprising: Component% by weight with respect to the total PVM / MA nanoparticles 84-99,998% Crosslinking agent 0.001-1% Allergen or antigen 0.001-15%
  • said vaccine or composition for immunotherapy may contain cryoprotective agent in sufficient quantity to protect the nanoparticles during the lyophilization process.
  • said allergen comprises an allergenic pollen extract, an allergenic extract of an insect or an allergenic extract of a food product.
  • said antigen comprises an immunogenic extract from an organism, for example, a membrane extract of Salmonella spp.
  • the composition of the invention has the ability to produce a stimulatory or potentiating effect of the immune response upon administration to a subject, so it can be used as an adjuvant in vaccines or immunotherapy, and, in a manner more specifically, to selectively stimulate one of the two immune response pathways (Thl or Th2) or both pathways simultaneously and in a balanced manner. Therefore, in another aspect, the invention relates to the use of a composition of the invention in the preparation of a vaccine or composition for immunotherapy. In another aspect, the invention relates to the use of a composition of the invention in the preparation of a pharmaceutical composition for the selective or predominant stimulation or potentiation of the Thl immune response.
  • the invention relates to the use of a composition of the invention in the preparation of a pharmaceutical composition for the selective or predominant stimulation or potentiation of the Th2 immune response. In another aspect, the invention relates to the use of a composition of the invention in the preparation of a pharmaceutical composition for the stimulation or potentiation, in a balanced manner, of the Thl and Th2 immune responses.
  • composition of the invention for vaccination and immunotherapy has numerous advantages, since it comprises: - the use of biodegradable pharmaceutical forms, in the normal conditions of the organism, and manufactured from polymers and materials accepted in pharmaceutical and medical practice ; - the administration of a preparation for immunotherapy and vaccination, based on nanoparticles, which protects the encapsulated allergen or antigen against premature inactivation; .
  • - the preparation of a preparation for immunotherapy and vaccination, based on the use of nanoparticles, which has a sustained release over time; the period of time during which controlled release will occur will depend on the microenvironment conditions specific to the place of administration;
  • - The administration of a nanoparticulate adjuvant, based on nanoparticles, given its characteristics (safety, biodegradability, avirulence) can be susceptible of use in humans and animals for immunotherapy and vaccination purposes by different routes of administration; and - the administration of a nanoparticulate adjuvant, based on nanoparticles that, given its bioadhesive potential in the gastrointestinal tract, makes the oral route possible as a route of administration.
  • the following examples illustrate the invention and should not be considered limiting thereof.
  • the general procedure for producing the nanoparticles of PVM / MA comprises the dissolution of said copolymer in acetone followed by the addition of ethanol. A similar volume of water is added to the resulting solution so that nanoparticles are instantly formed in the medium, under the appearance of a milky suspension. The organic solvents (ethanol and acetone) are then removed by evaporation under reduced pressure, the particles being in a stable aqueous suspension [Arbos et al, J Control Re ⁇ , 83 (2002) 321-330]. Depending on the time at which the allergens or antigens and, where appropriate, the immunostimulatory agent are added, different formulations with different arrangement thereof will be obtained (see Examples 1, 5 and 6). By way of illustration:
  • NP I and NP VI formulations incubation with the allergen or antigen to be encapsulated is carried out after the organic solvents have evaporated.
  • formulations containing the allergen or antigen completely or partially covering the outer surface of the nanoparticles formulations NP II, NP III, NP IV, NP V, NP VII, OVASAL and NP HE: the allergen or antigen dispersed in acetone is incubated before adding ethanol and water.
  • the next step consists in the addition of the crosslinking agent which, in this case, has been 1,3-diaminopropane, to the formulations NP III, NP V, NP VII, OVASAL, NP HE (5 ⁇ g / mg polymer in all of them ) and NP IV (10 ⁇ g mg polymer).
  • the NP-V, NP-VI and NP-VII formulations contain an immunostimulating agent consisting of the rough lipopolysaccharide (LPS-R) of Brucilla Ovis.
  • LPS-R rough lipopolysaccharide
  • the incubation with said immunostimulating agent is carried out after evaporating the organic solvents, while in the case of the formulations NP VI and NP VII the LPS- is incubated R before adding ethanol and water (see Examples 1.4.2, 1.4.3 and 1.4.4).
  • the purification of the nanoparticles is carried out by ultracentrifugation. Finally, purified nanoparticles are lyophilized for long-term storage and conservation.
  • the encapsulated protein content (active ingredient) was determined by testing with microbicinconinic acid (Micro BCA, Pierce, USA). Brucella Ovis rough lipopolysaccharide (LPS-R) adsorbed or encapsulated in the nanoparticles was indirectly quantified by measuring one of its exclusive markers, KDO (3-deoxy-D-hand-oct-2-ulosonic acid), by the method of thiobarbituric acid [Warren, J Biol Chem, 243 (1959) 1971-1975].
  • KDO 3-deoxy-D-hand-oct-2-ulosonic acid
  • Serum anti-OVA antibodies were analyzed by ELISA with anti-IgGi and anti-IgG 2a conjugates (Sigma-Aldrich Chemie, Germany). Briefly, 96 well plates (EB, Thermo Labsystems, Vantaa, Finland) were used to perform this test, where 1 ⁇ g of ovalbumin was set per well at 4 ° C for 15 hours; subsequently 5 washes of 1 minute were made in an ELISA scrubber (Thermo Labsystems, Vantaa, Finland), the sera were added in serial dilutions starting at 1:40, they were incubated at 37 ° C for 4 hours and then 5 washes were performed of 1 minute; then, the peroxidase conjugate was incubated for 2 hours, another 5 washes of 1 minute were performed, the substrate [ABTS (2,2'-azino-bis (3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulphonic acid)
  • IL-10 was analyzed in sera from blood previously centrifuged at 800 x g for 10 minutes, using an ELISA kit (Biosource, USA).
  • SDS-PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis with sodium dodecyl sulfate
  • the protein profile of the samples was determined by SDS-PAGE [Laemmli, Naurete, 227 (1970) 680-685], at a concentration of 15% acrylamide: bisacrylamide 37 , 5: 1 (Biorad), in 125 mM Tris-HCl (pH 6.8) and 0.1% SDS in the gel.
  • the electrode buffer used contained 30 mM Tris-HCl (pH 8.3), 192 mM glycine and 0.1% SDS.
  • the sample was treated at 100 ° C for 10 minutes in 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8), 10% glycerol, 2% SDS, 5% ⁇ -mercaptoethanol and 0.002% bromophenol blue. Electrophoresis was performed on 8x7 cm gels with a constant intensity of 15 mA / gel. The gels were stained with Coomassie blue [King, Anal Biochem, 71 (1976) 223-230]. For this, they were incubated in 3% trichloroacetic acid in water for 1 hour for fixation.
  • Ovalbumin represents more than 50% of the protein content of egg white. It is a monomeric phosphoglycoprotein consisting of 385 amino acids, with a molecular weight of 43 to 45 kDa [Johnsen and Elsayed, Mol Immunol, 27 (1990) 821]. Ovalbumin is the protein in the egg that has the highest allergenic capacity, inducing an immediate hypersensitivity type I, mediated by IgE. The process described below is valid for the preparation of colloidal pharmaceutical forms of nanoparticle type that can be used for immunotherapy.
  • the empty nanoparticles (NP) obtained have an average size of less than 200 nm and a net surface charge of -45.1 mV (see Table 1).
  • NP I ovalbumin coated nanoparticles
  • 100 mg of the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (PVM / MA) [Gantrez® AN 119] are dissolved in 5 mL of acetone.
  • 10 mL of ethanol and 10 mL of deionized water are added.
  • the resulting mixture is allowed to homogenize for 5 minutes.
  • the nanoparticle suspension is evaporated under reduced pressure until both organic solvents are removed and the final volume is adjusted with water to 5 mL.
  • NP I nanoparticles obtained (NP I) have an average size of less than 300 nm, a net surface charge of -61.3 mV and an ovalbumin content of 54.7 ⁇ g / mg of polymer (see Table 1).
  • the resulting mixture is allowed to homogenize for 5 minutes. Then the nanoparticle suspension is evaporated under reduced pressure until both organic solvents are removed and the final volume is adjusted with water to 10 mL.
  • the nanoparticles obtained have encapsulated OVA (NP II).
  • the crosslinking agent would now be added: 0.05 mL and 0.1 mL of a 1% 1,3-diaminopropane solution respectively.
  • the mixture is subjected to purification by ultracentrifugation (20 minutes at 27,000 xg). The supernatants are removed and the residue is resuspended in water or in a 5% aqueous sucrose solution.
  • the resulting nanoparticle suspension is lyophilized, allowing to keep all its properties intact.
  • the nanoparticles obtained have an average size of less than 300 nm, a net surface charge of -41.4 mV in the case of NP-II, -50.8 mV in NP-III and -57.5 mV in NP IV , and an ovalbumin content close to 30 ⁇ g / mg of polymer (see Table 1).
  • the cells are then centrifuged (6,000 xg, 20 minutes, 4 ° C) and resuspended in acetone by stirring 12 h at 4 ° C in a closed container. Subsequently, the cells are recovered by centrifugation (6,000 xg, 20 minutes, 4 ° C), resuspended in ethyl ether and kept at room temperature for 3 to 4 hours with magnetic stirring. Then, they are centrifuged again (6,000 xg, 20 minutes, 4 ° C) and evaporated to dryness. To proceed with the extraction, the cells are mixed until homogenization with petroleum ether-chloroform-phenol in an 8: 5: 2 ratio respectively.
  • the mixture is centrifuged (8,000 xg, 15 minutes, room temperature) and the supernatant The sediment is re-extracted under the same conditions two more times. All supernatants are combined and the petroleum ether and chloroform evaporated in a rotary evaporator. The phenolic residue is precipitated with distilled water and centrifuged (8,000 xg, 30 minutes, room temperature). It is then washed twice more with phenol and three times with ethyl ether. After the last centrifugation, the remains of ethyl ether are removed in vacuo, the sediment is resuspended in deionized water and dialyzed.
  • the contents of the dialysis gut are centrifuged (100,000 xg, 6 hours, 4 ° C), the sediment is resuspended in deionized water and lyophilized.
  • the amount of LPS-R is determined indirectly by measuring one of its exclusive markers, the KDO, by the thiobarbituric acid method.
  • Nanoparticles with encapsulated ovalbumin and LPS-R from Brucella Ovis on the surface 100 mg of the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride [Gantrez® AN 119] are dissolved in 4 mL of acetone, while on the other 5 mg of ovalbumin is dispersed in 1 mL of acetone by ultrasonication (Microson TM) or ultrasonic bath for 1 minute under cooling. The ovalbumin dispersion is added to the copolymer suspension and stirred for 30 minutes at room temperature. Subsequently, on this phase and under magnetic stirring, 10 mL of ethanol and 10 mL of deionized water are added.
  • the resulting mixture is allowed to homogenize for 5 minutes. Then the nanoparticle suspension is evaporated under reduced pressure until both organic solvents are removed and the final volume is adjusted with water to 9 mL. This solution is incubated with 1 mL of an aqueous dispersion (previously ultrasound for one minute) containing 1 mg of Brucella Ovis LPS-R for 1 hour at room temperature. The mixture is subjected to purification by ultracentrifugation (20 minutes at 27,000 xg). The supernatants are removed and the residue is resuspended in water or in a 5% aqueous sucrose solution. Finally, the resulting nanoparticle suspension is lyophilized, allowing to keep all its properties intact.
  • the nanoparticles obtained (NP V) have an average size of less than 300 nm, a net surface charge of -46.1 mV, an ovalbumin content of 64.1 ⁇ g / mg of polymer and 15.2 ⁇ g of LPS-R / mg of polymer (see Table 1).
  • NP VI Nanoparticles with encapsulated Brucella Ovis LPS-R and ovalbumin on the surface (NP VI) 100 mg of the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride [Gantrez® AN
  • LPS-R from Brucella Ovis
  • 1 mg of LPS-R from Brucella Ovis is dispersed in 1 mL of acetone by ultraso ⁇ ication (Microson TM) or ultrasonic bath for 1 minute under cooling.
  • the LPS-R dispersion is added to the copolymer suspension and stirred for 30 minutes at room temperature.
  • the nanoparticles obtained have an average size of less than 300 nm and a net surface charge of -56.9 mV, an ovalbumin content of 68.5 ⁇ g / mg of polymer and 12.1 ⁇ g of LPS-R mg of polymer (see Table 1).
  • Nanoparticles with ovalbumin and encapsulated Brucella Ovis LPS-R 100 mg of the copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride [Gantrez® AN 119] are dissolved in 3 mL of acetone, while on the other hand they are dispersed 5 mg of ovalbumin in 1 mL of acetone by ultrasonication (Microson TM) or ultrasonic bath for 1 minute under cooling, and 1 mg of LPS-R from Brucella Ovis in 1 mL of acetone, also by ultrasonication under cooling.
  • the ovalbumin dispersion is added to the dispersion of LPS-R, and this mixture is added to the copolymer suspension and stirred for 30 minutes at room temperature. Subsequently, on this phase and under magnetic stirring, 10 mL of ethanol and 10 mL of deionized water are added. The resulting mixture is allowed to homogenize for 5 minutes. So, the Nanoparticle suspension is evaporated under reduced pressure until both organic solvents are removed and the final volume is adjusted with water to 10 mL. The mixture is subjected to purification by ultracentrifugation (20 minutes at 27,000 xg). The supernatants are removed and the residue is resuspended in water or in a 5% aqueous sucrose solution.
  • the nanoparticles obtained (NP VII) have an average size of less than 300 nm and a net surface charge of -46.1 mV, an ovalbumin content of 54.7 ⁇ g / mg of polymer and 13.8 ⁇ g of LPS-R / mg of polymer (see Table 1).
  • the manufacturing performance of the nanoparticles was approximately 70%.
  • EXAMPLE 2 In vitro ovalbumin release test from the nanoparticles To evaluate ovalbumin release in viral, the nanoparticles were incubated in 1 mL of PBS (Phosphate Buffer Saline, pH 7.4), in eppendorf tubes at an approximate concentration of 8 mg / mL The tubes were incubated in an oven at 37 ° C with rotation and at predetermined time intervals the samples were centrifuged at 26,500 xg for 20 minutes, collecting the supernatant for further analysis The released ovalbumin was measured in the supernatant by the bicinconinic acid method The ovalbumin release curve obtained is shown in Figure 1; it is observed that in the formulation NP I the ovalbumin is released more rapidly than in the formulations NP II, NP III and NP IV, which have a similar release profile.
  • PBS Phosphate Buffer Saline, pH 7.4
  • EXAMPLE 3 Quantification of the production of anti-OVA antibodies after immunization with ovoalbumine in BALB / c mice 65
  • BALB / c mice were immunized by dividing them into 13 groups according to their administration schedule.
  • the controls used were free ovalbumin solution (OVA) (10 ⁇ g intradermally and 25 ⁇ g orally), empty nanoparticles (NP) (intradermally and orally) and ovalbumin adsorbed in alhydrogel (OVA-Alum) (10 ⁇ g intradermally ), as a positive Th2 response inducing control, characterized by high IgGi titers [Faquim-Mauro et al, In ⁇ Immunol, 12 (2000) 1733-1740].
  • the rest of the groups were inoculated intradermally (10 ⁇ g OVA) or orally (25 ⁇ g OVA), the different treatments being: a) Ovalbumin solution (OVA) intradermally b) Ovalbumin solution (OVA) orally c) Ovalbumin adsorbed on alhydrogel (OVA-Alum) intradermally d) Empty nanoparticles (NP) intradermally e) Empty nanoparticles (NP) orally f) Ovalbumin coated nanoparticles (NP I) intradermally g) Ovalbumin coated nanoparticles (NP I) oral route h) Nanoparticles with encapsulated ovalbumin (NP II) intradermally i) Nanoparticles with encapsulated ovalbumin (NP II) orally j) Nanoparticles crosslinked with 1,3-diaminopropane with encapsulated ovalbumin (NP III and NP IV) intradermally k) Nanoparticles cross-linked with 1,3
  • a pool of sera from each group was made and frozen at -80 ° C for later analysis.
  • the levels of anti-OVA antibodies (IgGj. And IgG 2a ) in the different sera were determined by ELISA and the data collected in the Figures were obtained.
  • nanoparticle formulations are capable of increasing by 3 or
  • mice administered with OVA-Alum had no antibodies.
  • mice administered NP III reached with a title file 5120 on day 35 after immunization.
  • said NP formulations are capable of amplifying the antibody titers characteristic of both Thl and Th2 but, in particular, the NP III formulation is the more immunogenic
  • the titers of the mice of the NP III group are compared with those of the NP IV group, it can be seen that there is an optimal cross-linking (Example 2, last paragraph), since although they have similar IgGi curves , the IgG 2a titers for NP III are slightly higher than in the case of NP IV.
  • the following formulations were administered (orally) to the animals: a) Empty nanoparticles (NP) b) 25 ⁇ g of ovalbumin encapsulated with nanoparticles crosslinked with 1,3-diaminopropane with encapsulated ovalbumin (NP 111-25) c) 50 ⁇ g of ovalbumin encapsulated with nanoparticles crosslinked with 1,3-diaminopropane with encapsulated ovalbumin (NP 111-50) In this case, the results obtained ( Figure 4) show that the levels of
  • Serum anti-OVA IgG 2a were significantly higher when the dose was 50 ⁇ g.
  • EXAMPLE 4 Quantification of the production of anti-OVA and interleukin 10 antibodies (TL-
  • mice after administration of ovalbumin nanoparticles with Brucella Ovis lipopolysaccharide 40 BALB / c mice were immunized by dividing them into 8 groups according to their administration schedule. All groups were given intradermal treatment (10 ⁇ g of ovalbumin).
  • NP I was revealed much more effective than NP VI to induce a Thl response measured in serum IgG 2a titer.
  • IL-10 Figure 7 shows serum IL-10 levels, which were determined by an ELISA kit (Biosource, Camarillo, USA). In this case, controls were also unable to induce secretion of serum IL-10. However, all nanoparticle formulations, to a greater or lesser extent, induced the secretion of this cytokine. The formulation with ovalbumin adsorbed on the surface of NP (NP I) allowed the induction of a peak of IL-10 faster than other formulations. However, the association of LPS (NP VI) significantly delayed (14 days) the secretion of cytokine.
  • NP III was revealed as the most effective formulation to induce serum IL-10, resulting in levels twice as high as for NP I, although delayed in time one week.
  • the association of LPS-R in nanoparticles encapsulating OVA (NP V and NP VII) allowed the induction of more discrete levels of IL-10 but with a maximum at two weeks after administration.
  • EXAMPLE 5 Preparation, characterization and administration of nanoparticles with the ChE extract of Salmonella Enteritidis 5.1 Extraction of the ChE extract of Salmonella Enteritidis The bacterial extract ChE (chao ⁇ ropic extract) was obtained following a protocol previously described by Altman et al. (Alunan et al., Biochem J. (1982) 505-513). Inocula of Salmonella Enteritidis in its steady state were incubated in bottles containing 400 mL of BHI medium (Brain Heart Infusion, Difco Lab., Detroit, USA), at 37 ° C, 48 h, without shaking.
  • BHI medium Brain Heart Infusion, Difco Lab., Detroit, USA
  • the cells were centrifuged (7,000 xg, 30 minutes) and washed with PBS (phosphate buffered saline; 10 mM; pH 7.4).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the bacterial extract was obtained after treatment of the cell pellet in KSCN / PBS 3M with magnetic stirring (lh, room temperature), and subsequent centrifugation (35,000 xg, 30 minutes).
  • the supernatant, containing the ChE extract was collected and dialyzed first against PBS and then against deionized water. Finally, it was lyophilized and stored at 4 ° C until later use.
  • OASAL Salmonella Enteritidis
  • mice were immunized with 10 ⁇ g of ovalbumin intradermally and divided into 3 different groups according to the treatment received: a) Ovalbumin solution (OVA) ) b) Ovalbumin adsorbed in alhydrogel (OVA-Alum) c) Ovalbumin and ChE nanoparticles of Salmonella Enteritidis (OVASAL)
  • Ovalbumin solution Ovalbumin solution
  • OVA-Alum Ovalbumin adsorbed in alhydrogel
  • Ovalbumin and ChE nanoparticles of Salmonella Enteritidis Ovalbumin and ChE nanoparticles of Salmonella Enteritidis
  • EXAMPLE 6 Preparation and characterization of biodegradable nanoparticles with the Salmonella Enteritidis HE extract (NP HE 3934) 6.1 Extraction and characterization of the Salmonella Enteritidis 3934 HE antigen complex
  • the antigen used is a surface extract of S. Enteritidis called HE (Hot saline Extract) because in saline medium and with heat it releases the antigenic complex.
  • This HE contains phospholipids, surface proteins and smooth lipopolisácarido (LPS-S).
  • LPS-S smooth lipopolisácarido
  • the HE extract was obtained by a previously described method [Gamazo et al., Infected. Immun (1989) 1419-1426].
  • Salmonella Enteritidis 3934 in flasks containing soybean tripticase (TSB), the bacteria are centrifuged at 7,000 xg for 30 minutes and washed twice with saline. The living cells are resuspended in saline solution (10 g of wet cells in 100 mL) and heated at 100 ° C in flowing steam for 15 minutes. After centrifugation (12,000 xg, 10 min.), The supernatant is dialyzed for 5 days against several changes with deionized water.
  • TLB soybean tripticase
  • the dialyzed material is ultracentrifuged for 4 hours at 60,000 xg, and the sediment (HE) is resuspended in deionized water, lyophilized and stored at room temperature.
  • the characterization includes the determination of the percentage of proteins and lipopolysaccharide. The determination of the amount of proteins was carried out by the Lo ry method.
  • the antigenic extract of Salmonella Enteritidis 3934 contains approximately 31% protein.
  • the amount of LPS is determined indirectly by measuring one of its exclusive markers, the KDO, by the thiobarbituric acid method. By this method, 0.86% of KDO was obtained, representing 65% of LPS-S.
  • the nanoparticle suspension is evaporated under reduced pressure until both organic solvents are removed and the final volume is adjusted with water to 10 mL.
  • the suspension is subjected to purification by ultracentrifugation (10 minutes at 35,000 x g). The supernatants are removed and the residue is resuspended in a 5% w / v aqueous sucrose solution. Finally, the resulting nanoparticle suspension is lyophilized, allowing to keep all its properties intact.
  • the formula resulting from the suspension of nanoparticles before freeze-drying is: Copolymer of methyl vinyl ether and maleic anhydride (Gantrez® AN-119) 1.0% w / v 0.4% w / v antigenic extract
  • the nanoparticles obtained have an average size of less than 200 nm and a net negative surface charge (-20.1 + 3.2 mV).
  • the performance of the manufacturing process was obtained by determining its weight after the lyophilization process. Starting from 100 mg of copolymer, the amount transformed into nanoparticle at the end of the process, and expressed as a percentage with respect to the initial mass of the copolymer. The quantification and detection of the extract was carried out by the bicinconinic acid method.
  • the extract load is expressed as the amount of extract in ⁇ g per mg of nanoparticles and the encapsulation efficiency is determined by relating the total amount of encapsulated extract to the initial amount.
  • Table 2 shows the load of antigen extract in nanoparticles ( ⁇ g of extract / mg nanoparticle) and encapsulation efficiency (%).
  • the encapsulation efficiency refers to the percentage of encapsulated HE, it was calculated as the amount of encapsulated antigen extract per 100 between the initial amount
  • Figure 9 reflects the protein pattern of the S. Enteritidis HE, where the different components can be distinguished: porins (approximately 36 kDa), OmpA (34 kDa) and fimbriae SEF14 (14 kDa) and SEF21 (21 kDa).
  • EXAMPLE 7 Study of the protection conferred by the NP HE 3934 vaccine administered intraperitoneally in mice Batch BALB / c mice of 9 weeks of age were used, each consisting of 10 animals. Vaccination was carried out with the vaccine preparation of nanoparticles (NP HE 3934) described in Example 6 at a rate of 30 ⁇ g of extract per animal, also including as controls: i) the same amount of the corresponding empty nanoparticles; ii) 30 ⁇ g / animal of the free, non-encapsulated HE extract; iii) 200 ⁇ L of the commercial vaccine Salenvac ® (Intervet UK Limited, Walton, England); iv) saline solution.
  • Panel A shows the levels of IFN- ⁇ induced, indicating an increase in said production in mice immunized with the nanoparticles (NP HE 3934).
  • panel B shows how there is no significant increase in the production of IL-4 in mice immunized with the free HE extract (HE 3934) and those immunized with the NP HE 3934 nanoparticles.
  • Enteritidis 3934 in immunized mice was studied by indirect ELISA ( Figure 13). Mice not immunized, or immunized with empty nanoparticles (empty NP), did not produce IgG 2a or IgGj antibodies. vs. S. Enteritidis 3934 HE extract. The levels of IgG 2a detected were higher than those of IgG). in all sera of mice analyzed by ELISA. However, no increase in serological response was observed in mice immunized with nanoparticles with encapsulated HE extracts (NP HE 3934) versus the response shown by mice immunized with free HE extracts (HE 3934).
  • IgG 2a is a dominant antibody isotype in Thl immune responses, while IgG ! it is of the Th2 type, which would confirm the results obtained in the IFN- ⁇ and IL-4 release test, indicating that intraperitoneal administration of nanoparticles with HE extracts of S. Enteritidis induces a predominant immune response of type Thl.
  • This administration confers a degree of protection against salmonellosis similar to that observed when administering the free antigen.
  • the application of these non-encapsulated antigens through the mucous membranes would not grant these levels of protection observed in this experiment, due to the acidic and enzymatic degradation that they would suffer as they passed through the gastrointestinal tract of the animals. .

Abstract

La composición estimuladora de la respuesta inmunitaria en un sujeto comprende nanopartículas a base de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico. Dichas nanopartículas pueden contener, además, un alergeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, los cuales pueden estar contenidos en el interior de dichas nanopartículas y/o recubriendo al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas, y, opcionalmente, un agente reticulante. La composición estimuladora de la respuesta inmuntaria es útil como adyuvante en inmunoterapia y vacunas.

Description

COMPOSICIÓN ESTIMULADORA DE LA RESPUESTA T MUNITARIA QUE COMPRENDE NANOPARTÍCULAS A BASE DE UN COPOLÍMERO DE METIL VINIL ÉTER Y ANHÍDRIDO MALEICO
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el empleo de nanopartículas a base de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico que, opcionalmente, contienen un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, como adyuvantes en inmunoterapia y vacunas. La invención también se relaciona con composiciones estimuladoras de la respuesta inmunitaria que comprenden dichas nanopartículas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Como es conocido, existen antígenos altamente inmunogénicos que con capaces de inducir respuestas inmunitarias protectoras en un sujeto, mientras que existen otros antígenos que no inducen dicha respuesta protectora o bien que inducen una respuesta inmunitaria muy débil. En general, la respuesta inmunitaria del huésped frente a un antígeno débilmente inmunogénico puede ser estimulada mediante la administración conjunta de un adyuvante.
Adyuvantes Un adyuvante es cualquier sustancia que incrementa la respuesta inmune frente a un antígeno con el que se mezcla. Los adyuvantes actúan fundamentalmente mediante tres mecanismos: i) formando un depósito de antígeno o alérgeno en el lugar de aplicación de la vacuna, a partir del cual se va liberando el producto biológicamente activo durante un periodo de tiempo variable; ii) suministrando el antígeno o alérgeno a las células presentadoras de antígeno; e iii) induciendo la secreción de interleuquinas. Algunos ejemplos de adyuvantes clásicos son: las sales de aluminio (alhidrogel) y catecolaminas, (que potencian una respuesta Th2), y el lipopolisacárido de bacterias gram negativas y ciertas secuencias CpG (que potencian la respuesta Thl). Por otra parte, numerosos estudios demuestran que ciertos vectores no biológicos como las micropartículas (partículas esféricas de naturaleza polimérica que recubren alguna sustancia) o los liposomas (vesículas esféricas con una cavidad central acuosa envuelta por un número variable de láminas bimoleculares de fosfolípidos y colesterol) pueden también actuar como adyuvantes [Eldridge et al, Infecí Immun, 59 (1991) 2978-2986; OΗagan et al, Vaccine, 18 (2000) 1793-1801; Murillo et al, Vaccine, 30 (2001) 4099- 4106]. Otro tipo de vectores no biológicos que pueden ser considerados para su utilización como adyuvantes, son los sistemas coloidales de tipo partícula sólida de tamaño inferior al micrómetro, también llamadas nanopartículas, que se subdividen en nanosferas matriciales y nanocápsulas vesiculares [Orecchioni e Irache, Formes pharmaceutiques pour application lócale. Lavoisier Tech and Doc, París, (1996) 441- 457]. Las nanocápsulas son sistemas vesiculares formados por una cavidad interna que está rodeada por una membrana o pared polimérica. Las nanosferas son formas matriciales, formadas por una red tridimensional polimérica. En ambos casos, las moléculas de la sustancia biológicamente activa pueden estar disueltas, atrapadas o unidas en la estructura macromolecular (en las nanosferas) o encapsuladas por la membrana polimérica (en las nanocápsulas), incluso, puede quedar adsorbida en la superficie de las nanopartículas. En el organismo, la distribución de las nanopartículas es, en general, dependiente de sus características fisico-químicas (principalmente el tamaño y sus propiedades de superficie), que determinan su interacción con el medio biológico. Por ello, son formas farmacéuticas particularmente interesantes como adyuvantes en inmunoterapia o en vacunas para la administración de antígenos y/o alérgenos. En general, las potencialidades más importantes que aportan estos vectores de origen no biológico son las siguientes [Couvreur & Puisieux. Adv. Drug Del. Rev., 10 (1993) 141-162]: (i) protegen el material encapsulado de la inactivación química, enzimática o inmunológica en el lugar de administración y de acción; (ii) mejoran el transporte de la molécula biológicamente activa hasta lugares difíciles de alcanzar y de su penetración en la célula; (iii) prolongan el tiempo de residencia del fármaco en el organismo y controlan su liberación; (iv) aumentan la especificidad de acción por concentración selectiva, eficaz y regular del material encapsulado en el blanco celular y/o molecular; y (v) aumentan la estabilidad del material que incorporan durante la fabricación, transporte y almacenamiento del medicamento.
Uso de adyuvantes en vacunación El empleo de adyuvantes particulados en forma de emulsiones, micropartículas, ISCOMS o liposomas ha sido evaluado anteriormente por diversos grupos de investigación [revisión: Singh et al, Int J Parasitology 33 (2003) 469-478]. La captura de antígenos por "células presentadoras de antígenos" se incrementa cuando estos se asocian con partículas poliméricas o se incluyen dentro de ellas. Poliésteres biodegradables y biocompatibles se emplean en humanos y animales desde hace años como sistemas de liberación controlada de antígenos [Okada et al, J Pharm Sci, 12 (1995) 1-99; Putney et al, Nat Bitechnol, 16 (1998) 153-157]. En contraposición a los adyuvantes de aluminio, las micropartículas son efectivas en la inducción de respuestas inmunitarias celulares y citotóxicas en ratón [Nixon et al, Vaccine 14 (1996) 1523-1530; Maloy et al, Immunology 81 (1994) 661-667; Moore et al, Vaccine 13 (1995) 1741-1749]. En ratón, la inmunización oral con micropartículas induce potentes respuestas inmunitarias a nivel de mucosas y sistémicas frente a los antígenos encapsulados [Chalacombe et al, Immunology 176 (1992) 164-168; Eldridge et al, J Control Reí 11 (1990) 205-214; OΗagan et al, Novel Delivery Systems for Oral Vaccines (1994) 175-205]. Esta capacidad es consecuencia de su internalización por células especializadas del tejido linfoide de las mucosas [OΗagan, JAnat, 189 (1996) 477-482]. La inmunización por vía de las mucosas con diferentes sistemas particulados ha demostrado su eficacia frente a distintos patógenos, como Bordetella pertussis [Chaill et al, Vaccine 13 (1995) 455-462; Jones et al, Vaccine 15 (1997) 814-817; Shahin et al, Infecí Immun, 63 (1995) 1195-1200; Conway et al, Vaccine 19 (2001) 1940-1950], Chlamidia irachomaiis [Whittum-Hudson et al, Nal Med 2 (1996) 1116- 1121], Salmonella Typhimurium [Allaoui-Attarki et al, Infecí Immun 65 (1997) 853- 857] yBrucella [Murillo et al, Vaccine, 19 (2001) 4099-4106].
Uso de adyuvantes en inmunoterapia Las enfermedades alérgicas son una patología emergente causada por una respuesta inmune adversa (reacción de hipersensibilidad) a macromoléculas intrínsecamente inocuas, denominadas alérgenos. Esta hipersensibilidad afecta aproximadamente a un 30% de la población mundial, principalmente en los países industrializados. Es responsable de enfermedades tales como rinitis alérgica, asma extrínseco, alergias alimentarias y alergias a fármacos y a insectos [Settipane et al, Allergy Proc, 15 (1994) 21-25]. En España, la prevalencia de este tipo de enfermedades en la población de 4 a 17 años es de un 13,3%; de entre ellas, el 6,4% se manifiesta como asma bronquial, siendo la tasa de fallecimientos por asma en nuestro país de 1,5/100.000 habitantes. La teoría mecanicista de la causa de las enfermedades alérgicas argumenta que se dan por una alteración del equilibrio entre los dos tipos fundamentales de respuestas que se pueden originar tras la activación de los linfocitos T cooperadores: Thl y Th2. Las citoquinas presentes en el medio externo a la célula influyen de manera determinante en la diferenciación de las células T inmaduras (ThO), de tal modo que la presencia de interleuquina 12 (IL-12), interferón gamma (IFN-γ), interleuquina 18 (IL- 18) e interferon alfa (IFN-α), inducen la diferenciación hacia Thl, la cual se caracterizará principalmente por la producción de grandes cantidades de IFN-γ y, en menor medida, de interleuquina 2 (IL-2) e interferón beta (IFN-β). La posterior estimulación de linfocitos B, en este tipo de respuesta, dará lugar a la producción de IgG a, IgG2b e IgG3. Por otro lado, si la célula ThO se encuentra en un entorno donde predomina la interleuquina 4 (IL-4) y la prostaglandina E2 (PGE2), se inducirá la diferenciación hacia Th2, caracterizándose por la síntesis de elevadas cantidades de IL- 4, interleuquina 5 (IL-5) e interleuquina 13 (IL-13), y por la síntesis de IgGt e IgE, biotipo directamente implicado en el proceso desencadenante [Hannah et al, Ann Rev Immunol, 21 (2003) 579-628]. La importancia del predominio de una respuesta tipo Th2, alérgeno-específica, en las enfermedades alérgicas, ha sido corroborada por un elevado número de estudios [Romagnani, Ann Rev Immunol, 12 (1994) 227; Bousquet et al, Allergy, 53 (1998) 1-42; Majori et al, Clin Exp Allergy, 30 (2000) 341-347]. Se ha demostrado, tanto en modelos animales como en el hombre, que las células con un fenotipo Th2, son las únicas capaces de reconocer directamente péptidos alergénicos y participar en la producción de IgE por parte de linfocitos B, la activación de mastocitos y la producción, maduración y activación de eosinófilos [Cohn et al, Pharmacology and Therapeuiics, 88 (2000) 187- 196]. Por tanto, el predominio funcional Th2 sobre las células Thl conduciría a la respuesta alérgica, mientras que el predominio funcional Thl sobre las células Th2, la inhibiría [Martín et al, Alergol Inmunol Clin, 17 (2002) 104-110]. Otros estudios defienden que la inhibición de una respuesta Th2 con predominio Thl podría llevar al desarrollo de enfermedades autoinmunes, por lo que sería más correcto potenciar una regulación inmunitaria del balance Thl/Th2, mediante el aumento de la población de linfocitos T reguladores (Tr) y de IL-10 y factor β de crecimiento de células T (TGF-β). Esto conduciría a la síntesis de anticuerpos IgG e IgA (no mediadores de respuestas inflamatorias), y a la supresión de la producción de IgE por parte de las células B [Akdis et al, Immunology, 103 (2001) 131-136; Akdis et al, J Clin Invesí, 102 (1998) 98-106; Blaser et al, Iní Arch Allergy Immunol, 117 (1998) 1-10]. Estudios recientes reafirman la importancia de la IL-10 en la inactivación de las células Th2 (Grunig et al, J Exp Med, 185 (1997) 1089-1099; Adachi et al, Ini Arch Allergy Immunol, 118 (1999) 391-394], e incluso se ha encontrado que la administración in vivo de IL-10 tiene consecuencias beneficiosas en animales alérgicos [Zuany-Amorim et al, J Clin Invesí, 95 (1995) 2644-2651; Stampfli et al, Am J Respir CellMolBiol, 21 (1999) 586-596; Hall et al, Vaccine, 21 (2003) 549-561]. Esto permite suponer que la IL-10 tiene un importante papel regulador en la hiperreactividad de las células Th2 característica de pacientes alérgicos. La IL-10 puede tener importantes implicaciones fisiopatológicas para contrarrestar enfermedades inflamatorias (enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, psoriasis, etc.), ciertas infecciones víricas (hepatitis C, infecciones causadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (HPV), etc.), o incluso inhibir los efectos secundarios del transplante de órganos. Por ello, la aplicación directa de IL-10, o bien el empleo de adyuvantes que estimulen la producción de IL-10, podría tener un gran impacto en el tratamiento de estas enfermedades [Asadullah et al, Pharmacol Rev, 55, (2003) 241- 269]. Actualmente, se está estudiando como posible tratamiento en enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide [Feldman et al, Annu Rev Immunol (1996) 397- 440; Katsikis et al, J Exp Med (1994) 1517-1527; Chomarat et al, J Immunol (1995) 1432-1439]. El papel antiinflamatorio y regulador de la citoquina la hace esencial, por tanto en respuestas excesivas tanto Thl (enfermedades autoinmunes) como Th2 (alergia). El tratamiento de las enfermedades alérgicas puede abordarse fundamentalmente de tres maneras distintas: (i) evitando todo contacto con el alérgeno; (ii) utilizando fármacos antihistamínicos, y (iii) mediante inmunoterapia. Teniendo en cuenta que las dos primeras medidas son, en ocasiones, no aplicables, la inmunoterapia sería el método más adecuado de control. La inmunoterapia específica con alérgenos ha sido definida como la administración repetida de alérgenos a pacientes con trastornos de salud mediados por IgE, con el propósito de proveer protección contra los síntomas alérgicos y las reacciones inflamatorias asociadas con la exposición natural a estos alérgenos [Jutel,
M., JInmunol, 154 (1995) 4178-4194]. Esta alternativa de tratamiento está dirigida a potenciar un predominio funcional de la respuesta Thl respecto a la respuesta Th2, lo cual hará que se inhiba la sintomatología alérgica. Esta modulación hacia Thl es también aplicable en otros procesos como el control mediante vacunación frente a parásitos intracelulares bacterianos (como Brucella y Salmonella). Aunque se ha descrito el empleo de diversos vectores de origen no biológico, por ejemplo, nanopartículas, como adyuvantes en imnunoterapia o en vacunas para la administración de antígenos y/o alérgenos, sigue existiendo la necesidad de proporcionar adyuvantes alternativos a los existentes con el fin de aumentar el arsenal de posibilidades para la elaboración de vacunas y composiciones para inmunoterapia. Ventajosamente, dichos adyuvantes deberían ser útiles para su empleo en inmunización o inmunoterapia por vía oral sin necesidad de tener que utilizar dosis de alérgeno o antígeno muy elevadas. Como es conocido, a pesar de sus potenciales ventajas, la inmunización oral con fines terapéuticos o profilácticos tiene que hacer frente a diferentes obstáculos, ya que la dosis de principio activo inmunogénico o alergénico requerido para un efecto clínico beneficioso es extremadamente grande debido a una pérdida de potencia del inmunógeno. Así, debido a la, en general, poca estabilidad del alérgeno o del antígeno en el tracto gastrointestinal (condiciones de pH y presencia de enzimas hidrolíticas), las dosis deben ser siempre muy superiores (hasta 200 veces) a las utilizadas normalmente por vía subcutánea [Taudorf et al, J Allergy Clin Immunol (1987) 153-161; Créticos et al, J Allergy Clin Immunol (1990) 165]. Además, la mucosa gastrointestinal actúa como una barrera muy poco permeable a la absorción de estas macromoléculas . Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que las nanopartículas de copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico que, opcionalmente, contienen un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, tienen la capacidad de estimular o potenciar la respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto, lo que permite su empleo en inmunoterapia y vacunas. Dichas nanopartículas son estables en administración oral, presentan buenas características bioadhesivas y, por tanto, pueden ser utilizadas en inmunización o inmunoterapia por diferentes vías, incluyendo la vía oral, sin necesidad de utilizar dosis de alérgeno o antígeno tan elevadas como las mencionadas en el estado de la técnica. Además, dichas nanopartículas son poco tóxicas, biodegradables y de fácil producción.
Nanopartículas de copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico La solicitud de patente WO 02/069938, del mismo solicitante, describe unas nanopartículas de copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA), un procedimiento para su obtención y su empleo como vehículo de fármacos. Dicho copolímero de PVM/MA está compuesto estructuralmente por dos grupos funcionales diferenciados que tienen características de solubilidad diferentes: un grupo éster hidrofóbico y otro grupo anhídrido. El grupo carboxílico es un sol bilizante, ya que tiende a disolver el polímero cuando se ioniza, y el grupo éster es hidrofóbico, ya que retrasa la penetración del agua en el polímero [Heller et al, J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009]. Los copolímeros de PVM/MA sintéticos tienen aplicaciones muy diversas. El Gantrez® AN se utiliza ampliamente como espesante y floculante, adhesivo dental, excipiente en comprimidos bucales, excipiente en parches transdérmicos, etc. Por otra parte se ha descrito el uso de estos copolímeros para la liberación controlada de fármacos [Heller et al, J Appl Polym Sci, 22 (1978) 1991-2009], y, en formas matriciales, para la liberación tópica de fármacos en el ojo [Finne et al, JPharm Sci, 80 (1991) 670-673; Finne et al, Iní JPharm, 78 (1992) 237-241]. Las nanopartículas a base de PVM/MA tienen características bioadhesivas
[Arbós et al, Iní JPharm, (2002) 129-136] por lo que, cuando se administran por vía oral, pueden interaccionar con las placas de Peyer, que contienen el 20% de linfocitos totales del organismo, y desencadenen una respuesta inmune amplificada respecto a la de los antígenos y/o alérgenos administrados en solución acuosa. Las nanopartículas a base de PVM/MA son sistemas coloidales capaces de retener sustancias biológicamente activas mediante: (i) solución o atrapamiento dentro de la estructura macromolecular o matriz; (ii) unión covalente del fármaco con los grupos anhídrido del copolímero; y (iii) procesos de adsorción mediados por enlaces débiles. Asimismo, la extrema reactividad del copolímero de PVM/MA, debido a los grupos anhídridos cíclicos, contribuye a su capacidad para el atrapamiento de moléculas, fármacos u otras sustancias. En la solicitud de patente WO 02/069938 se describe el empleo de dichas nanopartículas de copolímero de PVM/MA como vehículo de fármacos, concretamente, 5-fluorouridina, ganciclovir y el oligonucleótido antisentido ISIS 2922.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN El objeto de la presente invención es proporcionar una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria en un sujeto, útil como adyuvante en inmunoterapia y vacunas, estable cuando se administra por vía oral, con buenas características bioadhesivas para su interacción con mucosas, capaz de transportar, opcionalmente, un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante y liberar dichos productos de forma controlada, útil, por tanto, en inmunización o imnunoterapia por diferentes vías, incluyendo la vía oral. Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que las nanopartículas de copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico que, opcionalmente, contienen un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, tienen la capacidad de estimular o potenciar la respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto, lo que permite su empleo en inmunoterapia y vacunas. Especialmente se ha encontrado que dichas nanopartículas son fáciles de producir, poseen buenas características bioadhesivas, son poco tóxicas y biodegrad bles (es decir, que se disuelven o degradan en un periodo de tiempo que es aceptable para la aplicación deseada, en este caso terapia in vivo, una vez que se exponen a una solución fisiológica de pH 6-9 y temperatura comprendida entre 25°C y 40°C). Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria, que comprende nanopartículas a base de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico. Dichas nanopartículas pueden contener, además, un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, los cuales pueden estar contenidos en el interior de dichas nanopartículas y/o recubriendo al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas. Asimismo, si se desea, dichas nanopartículas pueden contener un agente reticulante. Opcionalmente, dicha composición puede estar en forma de liofilizado. En otro aspecto, la invención se relaciona con una vacuna o composición para inmunoterapia que comprende dicha composición estimuladora de la respuesta inmunitaria. En una realización particular, dicha vacuna o composición para inmunoterapia es una formulación adecuada para su administración por vía oral, mientras que en otra realización particular, dicha vacuna o composición para inmunoterapia es una formulación adecuada para su administración por vía parenteral. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha composición estimuladora de la respuesta inmunitaria en la elaboración de una vacuna o composición para inmunoterapia. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha composición estimuladora de la respuesta inmunitaria en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación selectiva de la respuesta inmunitaria Thl, o en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación selectiva de la respuesta inmunitaria Th2, o en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación, de forma balanceada, de las respuestas inmunitarias Thl y Th2. En otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende dichas nanopartículas a base de PVM/MA y un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante que comprende la adición de dicho alérgeno o antígeno y/o agente inmunoestimulante a una solución orgánica que comprende dicho copolímero de PVM/MA antes de proceder a su desolvatación con una solución hidroalcohólica, o, alternativamente, incubar dicho alérgeno o dicho antígeno y/o con dicho agente inmunoestimulante con dichas nanopartículas de PVM/MA. Dicho procedimiento puede comprender, además, etapas adicionales de eliminación de los disolventes orgánicos y/o purificación, así como etapas de estabilización de las nanopartículas obtenidas mediante el uso de agentes reticulantes. Opcionalmente, dicho procedimiento puede comprender una etapa adicional de liofilización.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que representa la ovoalbúmina liberada (%) desde las formulaciones NP-I, NP-II, NP-III y NP-IV respecto al tiempo (días). La Figura 2 es una gráfica que representa los niveles de anticuerpos específicos anti-ovoalbúmina (IgGl5 IgG2a) tras inmunización de ratones Balb/c vía intradérmica de solución libre de ovoalbúmina (OVA), ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA- Alum), nanopartículas vacías (NP), NP-I, NP-II, NP-III y NP-IV frente al tiempo. La Figura 3 es una gráfica que representa los niveles de anticuerpos específicos anti-ovoalbúmina (IgGl5 IgG2a) tras inmunización de ratones Balb/c vía oral de solución libre de ovoalbúmina (OVA), nanopartículas vacías (NP), NP-I, NP-II, NP-III y NP-IV frente al tiempo. La Figura 4 es una gráfica que representa los niveles de anticuerpos específicos anti-ovoalbúmina (IgGi, IgG2a) tras inmunización de ratones Balb/c vía oral con distintas dosis de ovoalbúmina encapsulada (NP-III25 y NP-III50) y nanopartículas vacías (NP) frente al tiempo. La Figura 5 es una gráfica que representa los niveles de anticuerpos específicos anti-ovoalbúmina (IgGj.) tras inmunización de ratones Balb/c vía intradérmica de solución de ovoalbúmina (OVA), ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA-Alum), nanopartículas vacías (NP), NP-I, NP-III, NP-V, NP-VI y NP-VII frente al tiempo. La Figura 6 es una gráfica que representa los niveles de anticuerpos específicos anti-ovoalbúmina (IgG2a) tras inmunización de ratones Balb/c vía intradérmica de solución libre de ovoalbúmina (OVA), ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA- Alum), nanopartículas vacías (NP), NP-I, NP-III, NP-VI, NP-VI y NP-VII frente al tiempo. La Figura 7 es una gráfica que representa la concentración de IL-10 en suero tras inmunización de ratones Balb/c vía intradérmica de solución libre de ovoalbúmina (OVA), ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA-Alum), nanopartículas vacías (NP), NP-I, NP-III, NP-V, NP-VI y NP-VII frente al tiempo. La Figura 8 es una gráfica que representa los niveles de anticuerpos específicos anti-ovoalbúmina (IgGj., IgG2a) tras inmunización de ratones Balb/c vía intradérmica de ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA-Alum), OVASAL y solución de ovoalbúmina (OVA) frente al tiempo. La Figura 9 muestra el resultado de la separación mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) del extracto HE y tinción de Coomassie para proteínas (10 μg de extracto por pocilio). La Figura 10 muestra el resultado de un análisis por inmunoblotting del extracto HE antes (A) y después (B) de la encapsulación, empleando una mezcla de sueros de gallinas infectadas. La Figura 11 es una gráfica que ilustra los resultados de un experimento de protección de ratones Balb/c por vía intraperitoneal con una dosis letal de 102 unidades formadoras de colonia (UFC) de S. Enteritidis 3934. La Figura 12 es un diagrama de barras que muestra la liberación de IFN-γ (A) e IL-4 (B) por células esplénicas de ratones Balb/c re-estimuladas con extracto HE. La Figura 13 es un diagrama de barras que muestra el resultado de un ELISA indirecto de sueros de ratones Balb/c frente a extracto HE, empleando anticuerpos IgG! e IgG2a.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que las nanopartículas de copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico que, opcionalmente, contienen un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, tienen la capacidad de estimular o potenciar la respuesta inmunitaria cuando se administran a un sujeto, lo que permite su empleo en inmunoterapia y vacunas. El término "sujeto" tal como aquí se utiliza incluye a cualquier animal que posee sistema inmunitario, preferentemente, mamíferos, más preferentemente, el ser humano. En un aspecto, la invención se relaciona con una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria, en adelante composición de la invención, que comprende nanopartículas a base de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico. Dichas nanopartículas pueden contener, además, un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, los cuales pueden estar contenidos en el interior de dichas nanopartículas y/o recubriendo al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas. Asimismo, si se desea, dichas nanopartículas pueden contener un agente reticulante. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "nanopartículas" se utiliza para designar sistemas coloidales de tipo partícula sólida de tamaño inferior a 1,0 micrómetro, preferentemente del orden de 10 a 900 nanometros (nm), e incluye nanosferas matriciales y nanocápsulas vesiculares. En una realización particular, dichas nanopartículas tienen un tamaño medio igual o inferior a 400 nm. Las nanopartículas presentes en la composición de la invención comprenden un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico, también denominado poli(metil vinil eter-co-anhidrido maleico) o PVM/MA. Dicho copolímero de PVM/MA es un producto conocido que puede obtenerse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante polimerización de acetileno con anhídrido maleico o bien puede adquirirse comercialmente. En este sentido, la compañía Internacional Speciality Products (ISP) produce copolímeros de PVM/MA de diferente peso molecular que comercializa bajo la marca comercial Gantrez® AN]. En general, para la puesta en práctica de la presente invención, el peso molecular de dicho copolímero de PVM/MA puede variar dentro de un amplio intervalo, preferentemente, entre 100 y 2.400 kDa, más preferentemente entre 200 y 2.000 KDa. En una variante de la invención se prefiere un copolímero de PVM/MA con un peso molecular comprendido entre 180 y 250 kDa. El empleo de dicho copolímero PVM/MA resulta muy ventajoso ya que se utiliza ampliamente en tecnología farmacéutica debido a su baja toxicidad (DL 50 = 8-9 g/kg por vía oral) y su excelente biocompatibilidad. Además, es de fácil obtención y puede reaccionar con distintas sustancias hidrófilas, debido a sus grupos funcionales, sin tener que recurrir a los reactivos orgánicos usuales (glutaraldehido y derivados de carbodiimida) que poseen una toxicidad importante [Arbós et al, J. Conírolled Reí, 83 (2002) 321-330]. En un medio acuoso, el copolímero PVM/MA es insoluble, pero el grupo anhidrido presente en el mismo se hidroliza generándose grupos carboxílicos. La solución es lenta y depende de las condiciones en las que se produce. Debido a la disponibilidad de grupos funcionales en PVM/MA, la unión covalente de moléculas con grupos nucleofílicos, tales como hidroxilos o aminas tiene lugar por simple incubación en un medio acuoso. Asimismo, dichas nanopartículas de PVM/MA poseen propiedades bioadhesivas [Arbós et al, Ini J Pharm, (2002) 129-136], por lo que, administradas por vía oral, pueden interaccionar con las placas de Peyer, que contienen el 20% de linfocitos totales del organismo, y desencadener una respuesta inmune amplificada respecto a la de los antígenos y/o alérgenos administrados en solución acuosa. En una realización particular, la composición de la invención comprende nanopartículas a base de PVM/MA que carecen de antígeno o alérgeno y de agente inmunoestimulante. Dichas nanopartículas se denominan nanopartículas "vacías" en esta descripción y pueden obtenerse fácilmente mediante un procedimiento como el descrito en la solicitud de patente WO 02/069938, cuyo contenido se incorpora en su totalidad, por referencia, a esta solicitud de patente. A modo ilustrativo, dichas nanopartículas vacías se preparan fácilmente por desolvatación con una fase hidroalcohólica de una solución en acetona de un copolímero de PVM/MA. Las nanopartículas formadas se pueden dejar en una suspensión acuosa estable o bien se pueden liofilizar. Opcionalmente se puede adicionar un agente reticulante. Prácticamente cualquier agente reticulante que contenga uno o más grupos funcionales que puedan reaccionar con los grupos anhidrido del copolímero de PVM/MA puede utilizarse, ventajosamente, una poliamina o un glúcido, tal como un aminoácido, una proteína, una osa, un ósido, etc., por ejemplo, Usina, arginina, histidina, proteínas hidrosolubles, poli-L-lisina, poli-L-arginina, etc., preferentemente, 1,3-diaminopropano. Dichas nanopartículas vacias pueden actuar como adyuvante en vacunación o en inmunoterapia cuando se administran en conjunción con vacunas o composiciones para inmunoterapia (composiciones inmunoterapéuticas) contienen un antígeno o un alérgeno, respectivamente, produciéndose un efecto estimulador de la respuesta inmunitaria tras la administración de la vacuna o de la composición inmunoterapéutica y las nanopartículas vacías. La Figura 12 muestra cómo la administración de nanopartículas vacias induce la secreción de cantidades significativas de IFN-γ. La administración combinada de una vacuna o de una composición inmunoterapéutica y de las nanopartículas puede efectuarse de forma simultánea o secuencial, separada en el tiempo, en cualquier orden, es decir, puede administrarse primero la vacuna o la composición inmunoterapéutica y, a continuación, las nanopartículas o viceversa. Alternativamente, dicha vacuna o composición inmunoterapéutica y dichas nanopartículas pueden administrarse simultáneamente. Asimismo, la vacuna o composición inmunoterapéutica y las nanopartículas pueden administrarse en la misma composición o bien en composiciones diferentes. La dosis de nanopartículas vacías a administrar puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente, entre 0, 1 y 2 mg por kg de peso corporal. En otra realización particular, la composición de la invención comprende nanopartículas a base de PVM/MA cargadas con un alérgeno o un antígeno y/o con un agente inmunoestimulante. En una variante de esta invención, la composición de la invención comprende nanopartículas a base de PVM/MA cargadas con un alérgeno o con un antígeno, en donde dichas nanopartículas a base de PVM/MA comprenden un alérgeno o un antígeno. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "alérgeno" se refiere a una sustancia a la que un sujeto es sensible y provoca una reacción inmunitaria, por ejemplo, extractos alergénicos de pólenes, extractos alergénicos de insectos, extractos alergénicos de alimentos o productos alimenticios, componentes presentes en saliva, pinzas o aguijones de insectos que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, componentes presentes en plantas que inducen una reacción de sensibilidad en un sujeto, etc. Así, por ejemplo, pueden utilizarse extractos proteicos de pólenes, tal como el polen de gramíneas (Lolium perenne, Poa praíense, Phleum prafense, Cynodon dactylon, Festuca praiensis, Dacíylis glomerata, Sécale cereale, Hordeum vulgare, Avena sativa, Trificum sativa), de otras hierbas (tales como Aríemisia vulgaris, Chenopodium álbum, Planiago lanceolaia, Taraxacum vulgare, Parietaria judaica, Salsola kali, Urtica dioica), o de árboles (tales como Olea europea, Plaianus sp., Cupresus sp.), etc. Pueden utilizarse también extractos proteicos de insectos, tal como de ácaros del polvo (tales como Dermafophagoides píeronyssimus, Dermaiophagoides farinae, Acaros Siró, Blomia iropicalis, Euroglyphus maynei, Glyciphagus domesticus, Lepidoglyphus deslrucíor, Tyrophagus puírescentiae), etc. Otros extractos alergénicos pueden obtenerse de hongos y epitelios animales (Alíernaria aliernaía, Cladosporium herbarum, epitelio de perro, epitelio de gato, epitelio de caballo, mezcla de plumas, Penicillium noiaium, etc.), así como de componentes alimentarios, etc. Prácticamente cualquier alérgeno puede ser utilizado en la elaboración de las nanopartículas cargadas con alérgeno de la composición de la invención; no obstante, en una realización particular, dicho alérgeno es la ovoalbúmina (OVA), una proteína ampliamente utilizada como modelo alergénico experimental. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "antígeno" se refiere a un producto inmunogénico, nativo o recombinante, obtenido de un organismo superior o de un microorganismo, por ejemplo, una bacteria, un virus, un parásito, un protozoo, un hongo, etc., que contiene uno o más determinantes antigénicos, por ejemplo, componentes estructurales de dichos organismos; toxinas, por ejemplo, exotoxinas, etc. Prácticamente cualquier antígeno puede ser utilizado en la elaboración de las nanopartículas cargadas con antígeno de la composición de la invención; no obstante, en una realización particular, dicho antígeno es el extracto HE de Salmonella Enteritidis. Como es conocido, Salmonella Enteritidis es el agente causal de gastroenteritis humana más frecuentemente detectado en brotes de toxinfección alimentaria (el 60% de los casos en los que se ha conseguido aislar el agente). Las aves de corral y los productos derivados de ellos están reconocidos como el principal reservorio de Salmonella, y la más importante fuente de infección de Salmonella Enteritidis en humanos. La infección es una zoonosis que se transmite por la ingestión de alimentos o aguas contaminadas, y constituye actualmente una pandemia. Para controlar la salmonelosis, tanto la Organización Mundial de la Salud (OMS) como la Unión Europea han establecido unas pautas para la monitorización y erradicación de la infección por Salmonella Enteritidis en aves de corral, ya que los beneficios para la población humana serían evidentes. En el control de Salmonella en aves de corral se han empleado antibióticos, la exclusión competitiva, la selección genética de las aves y las vacunas, así como la mejora de las condiciones higiénicas de las explotaciones avícolas. De ellas, está ampliamente aceptado que la medida más práctica sería la vacunación, por ser la más fácil de aplicar y la menos costosa. Aunque en la actualidad, se están utilizando vacunas vivas atenuadas y vacunas muertas (bacterinas), ambas son poco eficaces en granjas avícolas (gallinas y otras aves de corral) [Zhang-Barber et al, Vaccine, 17 (1999) 2538-2545]. Además de su poca eficacia, la gran desventaja de las vacunas vivas es su potencial virulencia en animales inmunodeprimidos, así como su posible reversibilidad a estados invasivos. Además, han de administrarse parenteralmente e interfieren con las tradicionales pruebas de diagnóstico serológico. Las bacterias inactivadas (bacterinas) no tienen riesgos de virulencia residual, pero no inducen una respuesta inmune celular, se requiere la administración de algún potente adyuvante y necesitan múltiples dosis de recuerdo. Una alternativa sería la utilización de vacunas subcelulares que sean capaces de estimular una adecuada respuesta inmune frente a la infección por Salmonella Enteritidis. Aunque se han descrito para éstas un elevado grado de protección a nivel experimental, al igual que las bacterinas, requieren múltiples dosis de recuerdo para obtener un aceptable grado de protección [Powell, Pharm Res, 13 (1996) 1777-1785]. Por otra parte, si se administran por vía oral sufren desnaturalización y degradación en el tracto gastrointestinal [Langer et al, Adv Drug Deliv Rev, 28 (1997) 97-119], por lo que este tipo de vacunas debe administrarse por vía parenteral, con los consiguientes impedimentos logísticos y económicos que ello supone. Con objeto de solucionar esos inconvenientes, se pueden encapsular antígenos de Salmonella Enteritidis en las nanopartículas de PVM/MA descritas previamente. El alérgeno o antígeno presente en esta variante de la composición de la invención puede estar recubriendo, al menos, parcialmente la superficie de dichas nanopartículas y/o contenido en el interior de dichas nanopartículas. En una realización particular, dicho alérgeno o antígeno está recubriendo la totalidad o parte de la superficie de dichas nanopartículas. Esta realización es útil para estimular selectivamente una respuesta Th2 en el sujeto. En otra realización particular, dicho alérgeno o antígeno está encapsulado en el interior de dichas nanopartículas de PVM/MA. Esta realización es útil para estimular una respuesta Thl y Th2 balanceada, o bien con predominio de respuesta Thl . Las nanopartículas de PVM/MA cargadas con un alérgeno o un antígeno pueden obtenerse fácilmente mediante un procedimiento similar al descrito en la solicitud de patente WO 02/069938. A modo ilustrativo, dichas nanopartículas cargadas con alérgeno o con antígeno se pueden preparar fácilmente por desolvatación con una fase líquida, por ejemplo, una fase hidroalcohólica, tal como una fase líquida formada por etanol y agua, de una solución de un copolímero de PVM/MA en un disolvente orgánico, tal como un disolvente orgánico polar, por ejemplo, acetona. Las nanopartículas formadas se dejan en una suspensión acuosa o se liofilizan. Dependiendo del momento en el que se añada el alérgeno o el antígeno se obtendrán distintas formulaciones con diferente disposición de los mismos (véanse las formulaciones identificadas como NP I, NP II, NP III, NP IV y NP HE 3934 en los Ejemplos 1 y 6). A modo ilustrativo, cuando se desea que el alérgeno o el antígeno se encuentre recubriendo la totalidad o parte de la superficie de las nanopartículas, entonces se incuba dicho alérgeno o dicho antígeno después de haber evaporado los disolventes orgánicos. Asimismo, cuando se desea que el alérgeno o el antígeno se encuentre encapsulado en el interior de dichas nanopartículas, entonces se incuba dicho alérgeno o dicho antígeno disperso en un disolvente, preferentemente el disolvente en el que se encuentra la solución del copolímero de PVM/MA o miscible con dicho disolvente, tal como un disolvente orgánico, preferentemente polar, o un disolvente miscible con el de la solución del polímero, por ejemplo, acetona, antes de añadir dicha fase líquida utilizada para desolvatar la solución del copolímero de PVM/MA. Opcionalmente, si se desea, se puede adicionar un agente reticulante tal como se ha mencionado previamente en relación con las nanopartículas vacías. De forma más concreta, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de una composición de la invención que comprende nanopartículas a base de un copolímero de PVM/MA cargadas con un alérgeno o con un antígeno, en donde dichas nanopartículas a base de copolímero de PVM/MA comprenden un alérgeno o un antígeno, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) desolvatación de una solución orgánica de un copolímero de PVM/MA disuelto en un disolvente orgánico con una solución hidroalcohólica; b) eliminación de los disolventes orgánicos para obtener nanopartículas, y c) adición de dicho alérgeno o de dicho antígeno a dicha solución orgánica de copolímero de PVM/MA antes de efectuar la desolvatación de dicha solución orgánica del copolímero de PVM/MA o, alternativamente, incubar dicho alérgeno o dicho antígeno con dichas nanopartículas obtenidas en la etapa b). El disolvente orgánico en el que se disuelve el copolímero de PVM/MA puede ser cualquier disolvente en el que dicho copolímero sea soluble, típicamente, un disolvente polar, tal como una cetona, por ejemplo, acetona. La fase líquida utilizada para efectuar dicha desolvatación puede ser cualquier solución hidroalcohólica que comprende un alcohol y agua, por ejemplo, etanol y agua, por ejemplo, alcohol y agua de calidad farmacéutica (agua purificada o agua para inyectable, según la aplicación).
Ventajosamente, la relación solución de copolímero :solución hidroalcohólica está comprendida entre 1:1 y 1:10, preferentemente 1:4. A continuación, los disolventes orgánicos se eliminan por cualquier método convencional, por ejemplo, mediante evaporación a presión reducida y las nanopartículas se forman instantáneamente en el medio, bajo la apariencia de una suspensión lechosa acuosa estable. La adición del alérgeno o del antígeno a la solución orgánica de copolímero de PVM/MA antes de efectuar la desolvatación de dicha solución orgánica del copolímero de PVM/MA permite obtener nanopartículas en las que el alérgeno o el antígeno está contenido en el interior de dichas nanopartículas. Ventajosamente, dicho alérgeno o antígeno se adiciona disuelto o disperso en el mismo disolvente orgánico que el de la solución orgánica del copolímero de PVM/MA o bien miscible con dicho disolvente, tal como un disolvente orgánico polar, por ejemplo, acetona. Alternativamente, la incubación de dicho alérgeno o de dicho antígeno con las nanopartículas obtenidas en la etapa b) permite obtener nanopartículas en las que el alérgeno o el antígeno está recubriendo la totalidad o parte de la superficie exterior de dichas nanopartículas. En una realización particular, la incubación del alérgeno o del antígeno con las nanopartículas se realiza en un medio acuoso. Opcionalmente, si se desea, se puede añadir un agente reticulante para mejorar la estabilidad de las nanopartículas, tal como se describe previamente en relación con las nanopartículas vacías. Las nanopartículas cargadas con alérgeno o antígeno obtenidas se pueden purificar por medios convencionales, por ejemplo, mediante centrifugación, ultracentrifugación, filtración tangencial, o evaporación, incluyendo la utilización de vacío. Finalmente, si se desea, las nanopartículas cargadas con alérgeno o antígeno se pueden liofilizar para su almacenaje y conservación a largo plazo. Para facilitar la liofilización se pueden utilizar agentes crioprotectores habituales, preferentemente a una concentración comprendida entre el 0,1 y el 10% en peso respecto al total de la composición. Las nanopartículas cargadas con alérgeno o antígeno pueden actuar como adyuvante en vacunación o en inmunoterapia y producen un efecto estimulador de la respuesta inmunitaria tras su administración a un sujeto, tal como se pone de manifiesto en los Ejemplos 3-6. La dosis de nanopartículas cargadas con alérgeno o antígeno a administrar puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente, entre 0,1 y 2 mg por kg de peso corporal. En otra variante de esta invención, la composición de la invención comprende nanopartículas a base de PVM/MA cargadas con un agente inmunoestimulante, en donde dichas nanopartículas a base de PVM/MA comprenden un agente inmunoestimulante. Tal como se utiliza en esta descripción, el término "agente inmunoestimulante" o "inmunomodulador" se refiere a un producto capaz de potenciar, de forma específica o inespecífica, la respuesta inmunitaria, por ejemplo, proteínas o péptidos que funcionan como adyuvantes naturales estimulando la respuesta del sistema inmunitario frente al alérgeno o al antígeno, lipolisacáridos bacterianos, componentes de la pared celular de las bacterias Gram positivas (por ejemplo, muramil dipéptido (MDP)) secuencias CpG de ADN, extractos de plantas, principalmente saponinas, etc. Prácticamente cualquier agente inmunoestimulante puede ser utilizado en la elaboración de las nanopartículas cargadas con agente inmunoestimulante de la composición de la invención; no obstante, en una realización particular, dicho agente inmunoestimulante es el lipopolisacárido rugoso de Brucella Ovis. Dicho agente inmunoestimulante puede estar recubriendo, al menos, parcialmente la superficie de dichas nanopartículas y/o contenido en el interior de dichas nanopartículas. En una realización particular, dicho agente inmunoestimulante está recubriendo la totalidad o parte de dichas nanopartículas de PVM/MA, mientras que en otra realización particular, dicho agente inmunoestimulante está encapsulado en el interior de dichas nanopartículas de PVM/MA. Las nanopartículas de PVM/MA cargadas con agente inmunoestimulante pueden obtenerse fácilmente mediante un procedimiento similar al descrito previamente en relación con la elaboración de nanopartículas de PVM/MA cargadas con un alérgeno o con un antígeno pero reemplazando dicho alérgeno o antígeno por el agente inmunoestimulante. De este modo, dependiendo del momento en el que se añada el agente inmunoestimulante, se obtendrán distintas formulaciones con diferente disposición del mismo (véase el Ejemplo 1 ó 4). A modo ilustrativo, cuando se desea que el agente inmunoestimulante se encuentre recubriendo la totalidad o parte de la superficie de las nanopartículas, entonces se incuba dicho agente inmunoestimulante después de haber evaporado los disolventes orgánicos. Asimismo, cuando se desea que el agente inmunoestimulante se encuentre encapsulado en el interior de dichas nanopartículas, entonces se incuba dicho agente inmunoestimulante disperso o disuelto en un disolvente, ventajosamente el disolvente en el que se encuentra la solución del copolímero de PVM/MA o miscible con dicho disolvente, tal como un disolvente orgánico, preferentemente polar, o un disolvente miscible con el de la solución del polímero, por ejemplo, acetona, antes de añadir dicha fase líquida utilizada para desolvatar la solución del copolímero de PVM/MA. Opcionalmente, si se desea, se puede adicionar un agente reticulante tal como se ha mencionado previamente en relación con las nanopartículas vacías. Opcionalmente, si se desea, se puede añadir un agente reticulante para mejorar la estabilidad de las nanopartículas, tal como se describe previamente en relación con las nanopartículas vacías. Las nanopartículas cargadas con agente inmunoestimulante se pueden purificar por medios convencionales tal como se ha mencionado previamente en relación con las nanopartículas cargadas con alérgeno o antígeno. Asimismo, si se desea, las nanopartículas cargadas con agente inmonoestimulante se pueden liofilizar utilizando para ello agentes crioprotectores habituales, preferentemente a una concentración comprendida entre el 0,1 y el 10% en peso respecto al total de la composición. Las nanopartículas cargadas con agente inmunoestimulante pueden actuar como adyuvante en vacunación o en inmunoterapia y producen un efecto estimulador de la respuesta inmunitaria tras su administración a un sujeto. La dosis de nanopartículas cargadas con agente inmunoestimulante a administrar puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente, entre 0,1 y 2 mg por kg de peso corporal. En otra variante de esta invención, la composición de la invención comprende nanopartículas a base de PVM/MA cargadas con un alérgeno o un antígeno y con un agente inmunoestimulante, en donde dichas nanopartículas a base de PVM/MA comprenden un alérgeno o un antígeno y un agente inmunoestimulante. El alérgeno o antígeno así como el agente estimulante presentes en esta variante de la composición de la invención pueden estar recubriendo, al menos, parcialmente la superficie de dichas nanopartículas y/o contenidos en el interior de dichas nanopartículas. En una realización particular, dicho alérgeno o antígeno está recubriendo la totalidad o parte de la superficie de dichas nanopartículas mientras que el agente inmunoestimulante está contenido en el interior de dichas nanopartículas, habiéndose observado que esta realización particular permite estimular selectivamente una respuesta Th2 en el sujeto. En otra realización particular, dicho alérgeno o antígeno está encapsulado en el interior de dichas nanopartículas de PVM/MA mientras que dicho agente estimulante está recubriendo, al menos, parcialmente la superficie de dichas nanopartículas. Esta realización es particularmente interesante para estimular una respuesta Thl y Th2 balanceada, o bien con predominio de respuesta Thl . En otra realización particular, tanto el alérgeno o antígeno como el agente inmunoestimulante están encapsulados en el interior de dichas nanopartículas de PVM/MA. Las nanopartículas de PVM/MA que contienen un alérgeno o un antígeno y un agente inmunoestimulante pueden obtenerse fácilmente mediante un procedimiento similar a los descritos previamente. Dependiendo del momento en el que se añada el alérgeno o el antígeno y el agente inmunoestimulante, se obtendrán distintas formulaciones con diferente disposición de dichos productos. A modo ilustrativo, cuando se desea que el agente inmunoestimulante se encuentre recubriendo la totalidad o parte de la superficie de las nanopartículas, entonces se incuba dicho agente inmunoestimulante después de haber evaporado los disolventes orgánicos. Asimismo, cuando se desea que el agente inmunoestimulante se encuentre encapsulado en el interior de dichas nanopartículas, entonces se incuba dicho agente inmunoestimulante disperso o disuelto en un disolvente, ventajosamente el disolvente en el que se encuentra la solución del copolímero de PVM/MA o miscible con dicho disolvente, tal como un disolvente orgánico, preferentemente polar, o un disolvente miscible con el de la solución del polímero, por ejemplo, acetona, antes de añadir dicha fase líquida utilizada para desolvatar la solución del copolímero de PVM/MA. De forma similar, cuando se desea que el alérgeno o el antígeno se encuentre recubriendo la totalidad o parte de la superficie de las nanopartículas, entonces se incuba dicho alérgeno o dicho antígeno después de haber evaporado los disolventes orgánicos. Asimismo, cuando se desea que el alérgeno o el antígeno se encuentre encapsulado en el interior de dichas nanopartículas, entonces se incuba dicho alérgeno o antígeno disperso o disuelto en un disolvente, ventajosamente el disolvente en el que se encuentra la solución del copolímero de PVM/MA o miscible con dicho disolvente, tal como un disolvente orgánico, preferentemente polar, o un disolvente miscible con el de la solución del polímero, por ejemplo, acetona, antes de añadir dicha fase líquida utilizada para desolvatar la solución del copolímero de PVM/MA. Análogamente, cuando se desea que el alérgeno o el antígeno y el agente inmunoestimulante estén encapsulados en el interior de dichas nanopartículas, entonces se incuba dicho alérgeno o dicho antígeno, opcionalmente mezclado con dicho agente imnunoestimulante, disperso o disuelto en un disolvente, ventajosamente el disolvente en el que se encuentra la solución del copolímero de PVM/MA o miscible con dicho disolvente, tal como un disolvente orgánico, preferentemente polar, o un disolvente miscible con el de la solución del polímero, por ejemplo, acetona, antes de añadir dicha fase líquida utilizada para desolvatar la solución del copolímero de PVM/MA. En cualquier caso, si se desea, se puede adicionar, opcionalmente, un agente reticulante a las nanopartículas obtenidas, para mejorar su estabilidad, tal como se describe previamente en relación con las nanopartículas vacías. De forma más concreta, en otro aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de una composición de la invención que comprende naiiopartículas a base de un copolímero de PVM/MA cargadas con un alérgeno o con un antígeno y con un agente inmunoestimulante, en donde dichas nanopartículas a base de copolímero de PVM/MA comprenden un alérgeno o un antígeno y un agente inmunoestimulante, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) desolvatación de una solución orgánica de un copolímero de PVM/MA disuelto en un disolvente orgánico con una solución hidroalcohólica; b) eliminación de los disolventes orgánicos para obtener nanopartículas, y c) adición de dicho alérgeno o de dicho antígeno y/o de dicho agente inmunoestimulante a dicha solución orgánica de copolímero de PVM/MA antes de efectuar la desolvatación de dicha solución orgánica del copolímero de PVM/MA o, alternativamente, incubar dicho alérgeno o dicho antígeno o dicho agente inmunoestimulante con dichas nanopartículas obtenidas en la etapa b). Las etapas a) y b) se realizan de forma similar a como se ha descrito previamente en relación con el procedimiento para producir una composición de la invención que comprende nanopartículas a base de un copolímero de PVM/MA cargadas con un alérgeno o con un antígeno. La etapa c) se realiza de forma similar a como se ha descrito previamente en relación con dicho procedimiento pero efectuando las modificaciones debidas para adicionar el agente inmunoestimulante, bien a dicha solución orgánica de copolímero de PVM/MA antes de efectuar la desolvatación de dicha solución orgánica del copolímero de PVM/MA, opcionalmente junto con el alérgeno o el antígeno, o bien, alternativamente, incubando dicho agente inmunoestimulante con dichas nanopartículas obtenidas en la etapa b), opcionalmente recubirtas parcialmente con dicho alérgeno o antígeno, de acuerdo con lo mencionado más arriba. Opcionalmente, si se desea, se puede añadir un agente reticulante para mejorar la estabilidad de las nanopartículas obtenidas. Las nanopartículas cargadas con alérgeno o antígeno y con agente inmunoestimulante obtenidas se pueden purificar por medios convencionales, por ejemplo, mediante centrifugación, ultracentrifugación, filtración tangencial, o evaporación, incluyendo la utilización de vacío. Finalmente, si se desea, las nanopartículas cargadas con alérgeno o antígeno se pueden liofilizar para su almacenaje y conservación a largo plazo. Para facilitar la liofilización se pueden utilizar agentes crioprotectores habituales, preferentemente a una concentración comprendida entre el 0,1 y el 10% en peso respecto al total de la composición. Las nanopartículas cargadas con un alérgeno o con un antígeno y con un agente inmunoestimulante pueden actuar como adyuvante en vacunación o en inmunoterapia y producen un efecto estimulador de la respuesta inmunitaria tras su administración a un sujeto, tal como se pone de manifiesto en los Ejemplos 3-6. La dosis de nanopartículas cargadas con un alérgeno o un antígeno y con un agente inmunoestimulante a administrar puede variar dentro de un amplio intervalo, por ejemplo, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 10 mg por kg de peso corporal, preferentemente, entre 0,1 y 2 mg por kg de peso corporal. La composición de la invención, si se desea, puede encontrarse en forma liofilizada o bien en una forma de administración adecuada para su administración por vía oral o parenteral. La liofilización se lleva a cabo por métodos convencionales, opcionalmente en presencia de agentes crioprotectores convencionales, por ejemplo, sacarosa, manitol, trehalosa, glicerol, lactosa, sorbitol, polivinilpilorridona, etc., preferentemente a una concentración comprendida entre el 0,1 y el 10% en peso respecto al total de la composición. Para la elaboración de las distintas formas de administración adecuadas para su administración por vía oral o parenteral se utilizarán los excipientes y vehículos aceptables adecuados para la elaboración de la forma de administración deseada. Información sobre dichos vehículos y excipientes, así como sobre dichas formas de administración adecuadas para la administración de la composición de la invención por vía oral o parenteral puede encontrarse en tratados de farmacia galénica. Tal como se ha mencionado previamente, la composición de la invención produce un efecto estimulador o potenciador de la respuesta inmunitaria tras su administración a un sujeto por lo que puede ser utilizada como adyuvante en vacunas o en inmunoterapia. De hecho, la composición de la invención tiene la capacidad de estimular selectivamente una de las dos vías de respuesta inmunitaria (Thl o Th2) o bien ambas vías de forma simultánea y balanceada, por lo que puede utilizarse en formulaciones vacunales o inmunoterapéuticas dependiendo en función de la respuesta que se desee estimular. A modo ilustrativo, para una formulación vacunal, se requiere, en general, dependiendo de los mecanismos de patogenicidad del organismo del que procede el antígeno (intracelular o extracelular, toxina dependiente, flagelo dependiente, etc.), una estimulación de la respuesta Thl (intracelular, como en el caso de Brucella, Salmonella, etc.) o de respuesta Th2 (extracelular, como en el caso de Síaphylococcus, Escherichia coli, bacterias enterotoxigénicas, etc.). Asimismo, a modo ilustrativo, para una formulación inmunoterapéutica se requiere una inducción de tolerancia mediante la presencia de los dos tipos de respuesta, es decir, induciendo respuestas Thl y Th2 de forma balanceada. En general, para estimular una respuesta selectiva Th2, las formulaciones contendrán nanopartículas de PVM/MA recubiertas total o parcialmente por el alérgeno o el antígeno, mientras que para estimular una respuesta Thl y Th2 de forma balanceada, o con predominio de la respuesta Thl, las formulaciones contendrán nanopartículas de PVM/MA en las que el antígeno o el alérgeno irá encapsulado y, ventajosamente, dichas nanopartículas incluirán un agente reticulante. En cualquiera de los casos mencionados previamente, las nanopartículas pueden incluir, si se desea, un agente inmunoestimulante. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una vacuna o con una composición para inmunoterapia que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria (composición de la invención) junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Dicha vacuna o composición para inmunoterapia puede encontrarse en cualquier forma farmacéutica de administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, oral, parenteral, rectal, etc. En una realización particular, dicha vacuna o composición para inmunoterapia se encuentra en una forma farmacéutica de administración por vía oral, mientras que en otra realización particular, dicha vacuna o composición para inmunoterapia se encuentra en una forma farmacéutica de administración por vía parenteral, por ejemplo, por vía intramuscular (i.m.), subcutánea (s.c), intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intradérmica (i.d.), etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de fármacos, en general, y de sus procedimientos de preparación puede encontrarse en el libro "Tratado de Farmacia Galénica", de C. Faulí i Trillo, Ia Edición, 1993, Luzán 5, S.A. de Ediciones. La composición de la invención presente en dicha vacuna o composición para inmunoterapia proporcionada por esta invención comprende nanopartículas a base de PVM/MA. Dichas nanopartículas pueden contener, además, un alérgeno o un antígeno y/o un agente inmunoestimulante, los cuales pueden estar contenidos en el interior de dichas nanopartículas y/o recubriendo al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas. Asimismo, dichas nanopartículas pueden contener, opcionalmente, un agente reticulante. En una realización particular, la composición de la invención presente en dicha vacuna o composición para inmunoterapia proporcionada por esta invención comprende nanopartículas a base de PVM/MA vacías que, opcionalmente, incorporan un agente reticulante. En este caso, la composición de la invención se administra en combinación con composiciones vacunales o inmunoterapéuticas que contienen un antígeno o un alérgeno, respectivamente, produciéndose un efecto estimulador de la respuesta inmunitaria tras la administración de dicha composición vacunal o inmunoterapéutica y las nanopartículas vacías. La administración combinada de dicha composición vacunal o inmunoterapéutica y de las nanopartículas vacías puede efectuarse de forma simultánea o secuencial, separada en el tiempo, en cualquier orden, es decir, puede administrarse primero la composición vacunal o inmunoterapéutica y, posteriormente, las nanopartículas vacías o viceversa. Alternativamente, dicha composición vacunal o inmunoterapéutica y dichas nanopartículas vacías pueden administrarse simultáneamente. En este caso, la composición vacunal o inmunoterapéutica y las nanopartículas vacías pueden administrarse en la misma composición o bien en composiciones diferentes. En otra realización particular, la composición de la invención presente en dicha vacuna o composición para inmunoterapia proporcionada por esta invención comprende unas nanopartículas a base de PVM/MA en donde dichas nanopartículas de PVM/MA comprenden, además, un alérgeno o un antígeno, y, si se desea, un agente reticulante. En otra realización particular, la composición de la invención presente en dicha vacuna o composición para inmunoterapia proporcionada por esta invención comprende unas nanopartículas a base de PVM/MA en donde dichas nanopartículas de PVM/MA comprenden, además, un agente inmunoestimulante, y, si se desea, un agente reticulante. En otra realización particular, la composición de la invención presente en dicha vacuna o composición para inmunoterapia proporcionada por esta invención comprende unas nanopartículas a base de PVM/MA en donde dichas nanopartículas de PVM/MA comprenden, además, un alérgeno o un antígeno y un agente inmunoestimulante, y, si se desea, un agente reticulante. La vacuna o composición para inmunoterapia proporcionada por esta invención comprende una composición de la invención en una cantidad terapéuticamente eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para potenciar o estimular la respuesta inmunitaria. Por tanto, la cantidad de composición de la invención presente en una vacuna o composición para inmunoterapia proporcionada por esta invención puede variar dentro de un amplio intervalo dependiendo, entre otros factores, del tipo de nanopartículas (vacías o cargadas con alérgeno o antígenos y/o con agente inmunoestimulante), etc. No obstante, en una realización particular, la invención proporciona una vacuna o composición para inmunoterapia que comprende: Componente % en peso respecto al total Nanopartículas de PVM/MA 84-99,998% Agente reticulante 0,001-1% Alérgeno o antígeno 0,001-15% Opcionalmente, dicha vacuna o composición para inmunoterapia puede contener agente crioprotector en cantidad suficiente para proteger a las nanopartículas durante el proceso de liofilización. En una realización particular, dicho alérgeno comprende un extracto alergénico de polen, un extracto alergénico de un insecto o un extracto alergénico de un producto alimenticio. En otra realización particular, dicho antígeno comprende un extracto inmunogénico procedente de un organismo, por ejemplo, un extracto de membrana de Salmonella spp. Como se ha mencionado previamente, la composición de la invención tiene la capacidad de producir un efecto estimulador o potenciador de la respuesta inmunitaria tras su administración a un sujeto, por lo que puede ser utilizada como adyuvante en vacunas o en inmunoterapia, y, de forma más concreta, de estimular selectivamente una de las dos vías de respuesta inmunitaria (Thl o Th2) o bien ambas vías de forma simultánea y balanceada. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una composición de la invención en la elaboración de una vacuna o composición para inmunoterapia. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una composición de la invención en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación o potenciación selectiva o predominante de la respuesta inmunitaria Thl. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una composición de la invención en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación o potenciación selectiva o predominante de la respuesta inmunitaria Th2. En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de una composición de la invención en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación o potenciación, de forma balanceada, de las respuestas inmunitarias Thl y Th2. El empleo de la composición de la invención para vacunación e inmunoterapia presenta numerosas ventajas, ya que comprende: - la utilización de formas farmacéuticas biodegradables, en las condiciones normales del organismo, y fabricadas a partir de polímeros y materiales aceptados en la práctica farmacéutica y médica; - la administración de un preparado para inmunoterapia y vacunación, a base de nanopartículas, que protege el alérgeno o antígeno encapsulado contra su inactivación prematura; . - la elaboración de un preparado para inmunoterapia y vacunación, basado en la utilización de nanopartículas, que presenta una liberación sostenida en el tiempo; el periodo de tiempo durante el cual se producirá la liberación controlada dependerá de las condiciones del microentorno propias al lugar de administración; - la administración de un adyuvante nanoparticulado, a base de nanopartículas, dadas sus características (inocuidad, biodegradabilidad, avirulencia) puede ser susceptible de utilización en humanos y animales para fines de inmunoterapia y vacunación por diferentes vías de administración; y - la administración de un adyuvante nanoparticulado, a base de nanopartículas que, dado su potencial bioadhesivo en el tracto gastrointestinal, hace que sea posible la vía oral como ruta de administración. Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados limitativos de la misma.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen la producción de distintos tipos de nanopartículas a base de PVM/MA que, opcionalmente, contienen un alérgeno o una antígenos y/o un agente inmunoestimulante, y ponen de manifiesto la capacidad de dichas nanopartículas de actuar como adyuvante en inmunoterapia o vacuna.
Procedimiento general de producción de nanopartículas El procedimiento general de producción de las nanopartículas de PVM/MA comprende la disolución de dicho copolímero en acetona seguido de la adición de etanol. A la solución resultante se le añade un volumen similar de agua con lo que se forman instantáneamente en el medio las nanopartículas, bajo la apariencia de una suspensión lechosa. A continuación, se retiran los disolventes orgánicos (etanol y acetona) mediante evaporación bajo presión reducida, quedando las partículas en una suspensión acuosa estable [Arbos et al, J Control Reí, 83 (2002) 321-330]. Dependiendo del momento en el que se añadan los alérgenos o antígenos y, en su caso, el agente inmunoestimulante, se obtendrán distintas formulaciones con diferente disposición de los mismos (véanse los Ejemplos 1, 5 y 6). A modo ilustrativo:
A. Para obtener formulaciones que contienen el alérgeno o el antígeno encapsulado en el interior de las nanopartículas (formulaciones NP I y NP VI): la incubación con el alérgeno o antígeno a encapsular se lleva a cabo tras haber evaporado los disolventes orgánicos.
B. Para obtener formulaciones que contienen el alérgeno o el antígeno recubriendo total o parcialmente la superficie exterior de las nanopartículas (formulaciones NP II, NP III, NP IV, NP V, NP VII, OVASAL y NP HE): se incuba el alérgeno o antígeno disperso en acetona antes de añadir el etanol y el agua. El siguiente paso consiste en la adición del agente reticulante que, en este caso, ha sido el 1,3-diaminopropano, a las formulaciones NP III, NP V, NP VII, OVASAL, NP HE (5 μg/mg polímero en todas ellas) yNP IV (10 μg mg polímero). Las formulaciones NP-V, NP-VI y NP-VII contienen un agente inmunoestimulante consistente en el lipopolisacárido rugoso (LPS-R) de Brucilla Ovis. Brevemente, para su incorporación, en el caso de la formulación NP V, la incubación con dicho agente inmunoestimulante se lleva a cabo tras haber evaporado los disolventes orgánicos, mientras que en el caso de las formulaciones NP VI y NP VII se incuba el LPS-R antes de añadir el etanol y el agua (véanse los Ejemplos 1.4.2, 1.4.3 y 1.4.4). La purificación de las nanopartículas se lleva a cabo mediante ultracentrifugación. Finalmente, las nanopartículas purificadas se liofilizan para su almacenaje y conservación a largo plazo.
Caracterización de las nanopartículas El tamaño y potencial zeta de las nanopartículas se determinó en un Zetamaster
(Malvern Instruments/Optilas, España). El contenido proteico (principio activo) encapsulado se determinó mediante el ensayo con ácido microbicinconínico (Micro BCA, Pierce, EEUU). El lipopolisacárido rugoso de Brucella Ovis (LPS-R) adsorbido o encapsulado en las nanopartículas se cuantificó indirectamente midiendo uno de sus marcadores exclusivos, el KDO (ácido 3-deoxi-D-mano-oct-2-ulosónico), por el método del ácido tiobarbitúrico [Warren, J Biol Chem, 243 (1959) 1971-1975].
Determinación de anticuerpos anti-OVA, citoquinas e IL-10 Los anticuerpos anti-OVA en suero se analizaron mediante ELISA con conjugados anti-IgGi y anti-IgG2a (Sigma-Aldrich Chemie, Alemania). Brevemente, para la realización de este ensayo se utilizaron placas de 96 pocilios (EB, Thermo Labsystems, Vantaa, Finlandia), en donde se fijó 1 μg de ovoalbúmina por pocilio a 4°C durante 15 horas; posteriormente se hicieron 5 lavados de 1 minuto en un lavador de ELISAs (Thermo Labsystems, Vantaa, Finlandia), se añadieron los sueros en diluciones seriadas partiendo de 1:40, se incubaron a 37°C durante 4 horas y se realizaron posteriormente 5 lavados de 1 minuto; a continuación, se incubó durante 2 horas el conjugado con peroxidasa, se realizaron otros 5 lavados de 1 minuto, se añadió el sustrato [ABTS (ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzo-tiazolín-6-sulfónico) (Sigma-Aldrich Chemie, Alemania)] y se llevó a cabo la lectura a 405 nm en un lector de placas (iEMS Reader MF, Labsystems, Vantaa, Finlandia) tras 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Las citoquinas (IFN-γ, IL-4 se analizaron mediante kits de ELISA (Biosource,
EEUU) en los sobrenadantes procedentes de la reestimulación de las células esplénicas, de los ratones inmunizados previamente. La IL-10 se analizó en los sueros procedentes de la sangre previamente centrifugada a 800 x g durante 10 minutos, mediante un kit de ELISA (Biosource, EEUU).
Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) El perfil proteico de las muestras se determinó mediante SDS-PAGE [Laemmli, Naíure, 227 (1970) 680-685], a una concentración del 15% de acrilamida:bisacrilamída 37,5:1 (Biorad), en Tris-HCl 125 mM (pH 6,8) y SDS 0,1% en el gel. El búfer de electrodo empleado contenia Tris-HCl 30 mM (pH 8,3), glicina 192 mM y SDS 0,1%. La muestra se trató a 100°C durante 10 minutos en Tris-HCl 62,5 mM (pH 6,8), glicerol 10%, SDS 2%, β-mercaptoetanol 5% y azul de bromofenol 0,002%. La electroforesis se realizó en geles de 8x7 cm con una intensidad constante de 15 mA/gel. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie [King, Anal Biochem, 71 (1976) 223-230]. Para ello, se incubaron en ácido tricloroacético al 3% en agua durante 1 hora para su fijación. La tinción se realizó con una solución de Azul de Coomassie al 0,25% en metanol 50% y ácido acético 10% durante 1 h y se decoloró en metanol 50% y ácido acético 20% hasta que las muestras se hicieron visibles. Los pesos moleculares aparentes de los componentes de las muestras se determinaron comparando su movilidad electroforética con un marcador estándar de pesos moleculares (Rainbow, Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), que contiene miosina (220 kDa), fosforilasa b (97 kDa), albúmina sérica bovina (66 kDa), ovalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa) y lisozima (14,3 kDa).
Inmunoblotting El immunoblotting se realizó según un protocolo descrito anteriormente [To bin
& Staehelin, Proc Naíl Acad Sci USA, 16 (1979) 4350-4354]. Brevemente, tras someter las muestras a SDS-PAGE, los geles se tranfirieron a membranas de nitrocelulosa de 0,45 μm de diámetro de poro (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). La transferencia se realizó empleando el método semiseco mediante el sistema Trans-Blot® SD, Semy-Dry transfer Cell (Bio-Rad, Richmond, EEUU) a 200 mA, 5 V durante 30 minutos, en un búfer de transferencia de Tris-HCl 25 mM (pH 8,3), glicina 192 mM y metanol 10%.
EJEMPLO 1 Inmunoterapia Preparación y caracterización de nanopartículas de ovoalbúmina a base del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) La proteína elegida fue la ovoalbúmina (OVA) por ser actualmente ampliamente utilizada como modelo alergénico experimental. La ovoalbúmina representa más del 50% del contenido proteico de la clara del huevo. Es una fosfoglicoproteína monomérica que consta de 385 aminoácidos, con un peso molecular de 43 a 45 kDa [Johnsen y Elsayed, Mol Immunol, 27 (1990) 821]. La ovoalbúmina es la proteína del huevo que tiene mayor capacidad alergénica induciendo una hipersensibilidad inmediata tipo I, mediada por IgE. El proceso que se describe a continuación es válido para la preparación de formas farmacéuticas coloidales de tipo nanopartícula que pueden ser utilizadas para inmunoterapia.
1.1 Preparación de nanopartículas vacías (NP) 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA)
[Gantrez® AN 119] se disuelven en 5 mL de acetona. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan 10 mL de etanol y 10 mL de agua desionizada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 10 mL. La solución se somete a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes se liofiliza, permitiendo mantener todas sus propiedades intactas. Las nanopartículas vacías (NP) obtenidas tienen un tamaño medio inferior a los 200 nm y una carga neta superficial de -45,1 mV (ver Tabla 1). 1.2 Preparación de nanopartículas recubiertas de ovoalbúmina (NP I) 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] se disuelven en 5 mL de acetona. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan 10 mL de etanol y 10 mL de agua desionizada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 5 mL. Esta solución se incuba con 5 mL de una solución acuosa de ovoalbúmina que contenga 10 mg de proteína, durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se somete a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes se liofiliza, permitiendo mantener todas sus propiedades intactas. Las nanopartículas obtenidas (NP I) tienen un tamaño medio inferior a los 300 nm, una carga neta superficial de -61,3 mV y un contenido de ovoalbúmina de 54,7 μg/mg de polímero (ver Tabla 1).
1.3 Preparación de nanopartículas con ovoalbúmina encapsulada (NP II, NP III y NP IV) 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA) [Gantrez® AN 119] se disuelven en 4 mL de acetona, mientras que por otra parte se dispersan 5 mg de ovoalbúmina en 1 mL de acetona por ultrasonicación (Microson™) o baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento. La dispersión de ovoalbúmina se añade a la suspensión del polímero y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan 10 mL de etanol y 10 mL de agua desionizada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 10 mL. Las nanopartículas obtenidas tienen OVA encapsulada (NP II). En el caso de las formulaciones NP III y NP IV se añadiría ahora el agente reticulante: 0,05 mL y 0,1 mL de una solución de 1,3-diaminopropano al 1% respectivamente. La mezcla se somete a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes se liofiliza, permitiendo mantener todas sus propiedades intactas. Las nanopartículas obtenidas tienen un tamaño medio inferior a los 300 nm, una carga neta superficial de -41,4 mV en el caso de las NP-II, -50,8 mV en NP-III y -57,5 mV en NP IV, y un contenido de ovoalbúmina cercano a 30 μg/mg de polímero (ver Tabla 1).
1.4 Preparación de nanopartículas con ovoalbúmina y lipopolisacárido rugoso de Brucella Ovis (NP V, NP VI y NP VII) 1.4.1 Extracción y caracterización del complejo lipopolisacárido rugoso de Brucella Ovis El extracto utilizado es lipopolisacárido rugoso (LPS-R) de Brucella Ovis. El LPS-R se obtuvo por un método descrito previamente (Galanos et al, Eur. J. Biochem. (1969), 245-249). Tras el cultivo de la bacteria, Brucella Ovis, se resuspenden en etanol absoluto agitando a 4°C durante una noche en un recipiente cerrado. A continuación, se centrifugan las células (6.000 x g, 20 minutos, 4°C) y se resuspenden en acetona agitando 12 h a 4°C en un recipiente cerrado. Posteriormente, se recuperan las células por centrifugación (6.000 x g, 20 minutos, 4°C), se resuspenden en éter etílico y se mantienen a temperatura ambiente de 3 a 4 horas con agitación magnética. A continuación, se centrifugan de nuevo (6.000 x g, 20 minutos, 4°C) y se evaporan a sequedad. Para proceder a la extracción se mezclan las células hasta homogeneización con éter de petróleo-cloroformo-fenol en proporción 8:5:2 respectivamente. La mezcla se centrifuga (8.000 x g, 15 minutos, temperatura ambiente) y se recoge el sobrenadante. El sedimento se re-extrae en las mismas condiciones dos veces más. Se reúnen todos los sobrenadantes y se evapora el éter de petróleo y el cloroformo en un rotavapor. El residuo fenólico se precipita con agua destilada y se centrifuga (8.000 x g, 30 minutos, temperatura ambiente). A continuación se lava dos veces más con fenol y otras tres veces con éter etílico. Tras la última centrifugación se eliminan los restos de éter etílico a vacío, se resuspende el sedimento en agua desionizada y se dializa. Por último se centrifuga el contenido de la tripa de diálisis (100.000 x g, 6 horas, 4°C), se resuspende el sedimento en agua desionizada y se liofiliza. La cantidad de LPS-R se determina indirectamente midiendo uno de sus marcadores exclusivos, el KDO, por el método del ácido tiobarbitúrico.
1.4.2 Nanopartículas con ovoalbúmina encapsulada y LPS-R de Brucella Ovis en la superficie (NP V) 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico [Gantrez® AN 119] se disuelven en 4 mL de acetona, mientras que por otra parte se dispersan 5 mg de ovoalbúmina en 1 mL de acetona por ultrasonicación (Microson™) o baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento. La dispersión de ovoalbúmina se añade a la suspensión del copolímero y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan 10 mL de etanol y 10 mL de agua desionizada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 9 mL. Esta solución se incuba con 1 mL de una dispersión acuosa (previamente ultrasonicada durante un minuto) que contiene 1 mg de LPS-R de Brucella Ovis durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se somete a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes se liofiliza, permitiendo mantener todas sus propiedades intactas. Las nanopartículas obtenidas (NP V) tienen un tamaño medio inferior a los 300 nm, una carga neta superficial de -46,1 mV, un contenido de ovoalbúmina de 64,1 μg/mg de polímero y 15,2 μg de LPS-R/mg de polímero (ver Tabla 1). 1.4.3 Nanopartículas con LPS-R de Brucella Ovis encapsulado v ovoalbúmina en la superficie (NP VI) 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico [Gantrez® AN
119] se disuelven en 4 mL de acetona, mientras que por otra parte se dispersa 1 mg de LPS-R de Brucella Ovis en 1 mL de acetona por ultrasoñicación (Microson™) o baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento. La dispersión de LPS-R se añade a la suspensión del copolímero y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan 10 mL de etanol y 10 mL de agua desionizada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 5 mL. Esta solución se incuba con 5 mL de una solución acuosa que contenga 5 mg de de ovoalbúmina durante 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se somete a purificación por ultracentrífugación (20 minutos a 27.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes se liofiliza, permitiendo mantener todas sus propiedades intactas. Las nanopartículas obtenidas (NP VI) tienen un tamaño medio inferior a los 300 nm y una carga neta superficial de -56,9 mV, un contenido de ovoalbúmina de 68,5 μg/mg de polímero y 12,1 μg de LPS-R mg de polímero (ver Tabla 1).
1.4.4 Nanopartículas con ovoalbúmina y LPS-R de Brucella Ovis encapsulados (NP YII) 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico [Gantrez® AN 119] se disuelven en 3 mL de acetona, mientras que por otra parte se dispersan 5 mg de ovoalbúmina en 1 mL de acetona por ultrasonicación (Microson™) o baño de ultrasonidos durante 1 minuto bajo enfriamiento, y 1 mg de LPS-R de Brucella Ovis en 1 mL de acetona, también por ultrasonicación bajo enfriamiento. La dispersión de ovoalbúmina se añade a la dispersión del LPS-R, y esta mezcla a la suspensión del copolímero y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan 10 mL de etanol y 10 mL de agua desionizada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 10 mL. La mezcla se somete a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en agua o en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes se liofiliza, permitiendo mantener todas sus propiedades intactas. Las nanopartículas obtenidas (NP VII) tienen un tamaño medio inferior a los 300 nm y una carga neta superficial de -46,1 mV, un contenido de ovoalbúmina de 54,7 μg/mg de polímero y 13,8 μg de LPS-R/mg de polímero (ver Tabla 1).
1.5 Caracterización de las nanopartículas La caracterización físico-química de las distintas formulaciones se recoge en la Tabla 1. Según los resultados que se recogieron se observó que al estar las nanopartículas recubiertas por ovoalbúmina (NP I y NP VI) el tamaño aumenta y el potencial zeta se hace más negativo, mientras que si la ovoalbúmina está mayoritariamente en el interior de las nanopartículas (NP II, NP III, NP IV, NP V y NP VII), el tamaño, al igual que el potencial zeta, no varía tanto en comparación con las nanopartículas vacías (NP). Por otra parte se pudo observar que los tamaños de las nanopartículas aumentaban a medida que aumentaba la cantidad de agente reticulante añadido, y la cantidad de ovoalbúmina disminuía ligeramente. La presencia de LPS-R en la superficie de las nanopartículas hace que aumente la cantidad de ovoalbúmina encapsulada (NP V vs NP II), mientras que si el LPS-R está en mayoritariamente en el interior, la cantidad de ovoalbúmina adsorbida no varía (NP VI vs NP I).
Tabla 1 Caracterización físico-química de las distintas formulaciones (con datos expresados en media ± desviación típica, n=10)
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El rendimiento de fabricación de las nanopartículas fue del 70% aproximadamente.
EJEMPLO 2 Ensayo de liberación in vitro de ovoalbúmina desde las nanopartículas Para evaluar la liberación de ovoalbúmina in viíro, las nanopartículas se incubaron en 1 mL de PBS (Phosphate Buffer Saline, pH 7,4), en tubos "eppendorf a una concentración aproximada de 8 mg/mL. Se incubaron los tubos en una estufa a 37°C con rotación y a intervalos de tiempo predeterminados se centrifugaron las muestras a 26.500 x g durante 20 minutos, recogiendo el sobrenadante para su posterior análisis. La ovoalbúmina liberada se midió en el sobrenadante por el método del ácido bicinconínico. La curva de liberación de ovoalbúmina obtenida se muestra en la Figura 1 ; se observa que en la formulación NP I la ovoalbúmina se libera más rápidamente que en las formulaciones NP II, NP III y NP IV, que presentan un perfil de liberación similar. Esto se debe a que en la formulación NP I la ovoalbúmina está adsorbida en el exterior de las nanopartículas, con lo que la liberación inicial ("burst") que presenta es mucho más marcado que en el resto de las formulaciones, en las que parte de la ovoalbúmina está encapsulada (NP II, III y IV). Por otra parte se puede ver en los perfiles de liberación de NP II, NP III y NP IV que, a medida que aumenta la cantidad de agente reticulante, disminuye ligeramente el porcentaje de ovoalbúmina liberada.
EJEMPLO 3 Cuantificación de la producción de anticuerpos anti-OVA tras inmunización con ovoalbumina en ratones BALB/c Se inmunizaron 65 ratones BALB/c dividiéndolos en 13 grupos según su pauta de administración. Los controles utilizados fueron solución de ovoalbúmina (OVA) libre (10 μg vía intradérmica y 25 μg vía oral), nanopartículas vacías (NP) (vía intradérmica y vía oral) y ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA-Alum) (10 μg vía intradérmica), como control positivo inductor de respuesta Th2, caracterizada por títulos elevados de IgGi [Faquim-Mauro et al, Iní Immunol, 12 (2000) 1733-1740]. El resto de grupos fueron inoculados vía intradérmica (10 μg OVA) ó vía oral (25 μg OVA), siendo los distintos tratamientos: a) Solución de Ovoalbúmina (OVA) vía intradérmica b) Solución de Ovoalbúmina (OVA) vía oral c) Ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA-Alum) vía intradérmica d) Nanopartículas vacías (NP) vía intradérmica e) Nanopartículas vacías (NP) vía oral f) Nanopartículas recubiertas de ovoalbúmina (NP I) vía intradérmicac g) Nanopartículas recubiertas de ovoalbúmina (NP I) vía oral h) Nanopartículas con ovoalbúmina encapsulada (NP II) vía intradérmica i) Nanopartículas con ovoalbúmina encapsulada (NP II) vía oral j) Nanopartículas reticuladas con 1,3-diaminopropano con ovoalbúmina encapsulada (NP III y NP IV) vía intradérmica k) Nanopartículas reticuladas con 1,3-diaminopropano con ovoalbúmina encapsulada (NP III y NP IV) vi a oral Se realizaron sucesivas extracciones de sangre en los días 7, 14, 28 y 35 tras la inmunización. Se hizo un pool de los sueros de cada grupo y se congelaron a -80°C para su posterior análisis. Se determinaron los niveles de anticuerpos anti-OVA (IgGj. e IgG2a) en los distintos sueros mediante ELISA y se obtuvieron los datos que se recogen en las Figura
2 y 3. Se observó que las nanopartículas que contenían ovoalbúmina (NP I, NP II, NP
III y NP IV) bien recubriendo las nanopartículas o bien encapsulada incrementaban la respuesta inmune respecto de la ovoalbúmina en solución. A día 14 tras la administración, dichas formulaciones de nanopartículas son capaces de aumentar en 3 ó
6 unidades logarítmicas, según el tipo, el título de IgGt en los sueros de los ratones. Por otra parte, los ratones administrados con OVA-Alum tuvieron ausencia de anticuerpos
IgG a en suero a lo largo de todo el experimento, mientras que los ratones administrados con NP III llegaron a presentar un título de 5120 en el día 35 tras la inmunización. Esto indica que, en general, dichas formulaciones de NP (NP I, NP II, NP III y NP TV) son capaces de amplificar los títulos de anticuerpos característicos tanto de Thl como de Th2 pero, en particular, la formulación NP III es la más inmunogénica. Por otra parte, si se comparan los títulos de los ratones del grupo de NP III con los del grupo de NP IV, se puede observar que existe un óptimo de reticulación (Ejemplo 2, último párrafo), ya que aunque presentan curvas similares de IgGi, los títulos de IgG2a para NP III son ligeramente mayores que en el caso de NP IV. En cuanto a los resultados obtenidos en los ratones administrados por vía oral, se observó que la única formulación que indujo niveles cuantificables de anticuerpos IgGi e IgG2a fue NP III (Figura 3). Tras comprobar que, en estas condiciones experimentales, la formulación NP III fue la más eficaz, se hizo un estudio similar modificando las dosis de administración de NP III. En este caso se administraron (vía oral) a los animales las siguientes formulaciones: a) Nanopartículas vacías (NP) b) 25 μg de ovoalbúmina encapsulada con nanopartículas reticuladas con 1,3-diaminopropano con ovoalbúmina encapsulada (NP 111-25) c) 50 μg de ovoalbúmina encapsulada con nanopartículas reticuladas con 1,3-diaminopropano con ovoalbúmina encapsulada (NP 111-50) En este caso, los resultados obtenidos (Figura 4) muestran que los niveles de
IgG2a anti-OVA en suero eran significativamente mayores cuando la dosis era de 50 μg. EJEMPLO 4 Cuantificación de la producción de anticuerpos anti-OVA e interleuquina 10 (TL-
10) tras administración de nanopartículas de ovoalbúmina con lipopolisacárido de Brucella Ovis Se inmunizaron 40 ratones BALB/c dividiéndolos en 8 grupos según su pauta de administración. A todos los grupos se les administró el tratamiento vía intradérmica (10 μg de ovoalbúmina). En esta ocasión los distintos tratamientos fueron: a) Solución de Ovoalbúmina (OVA) b) Ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA-Alum) c) Nanopartículas vacías (NP) d) Nanopartículas recubiertas de ovoalbúmina (NP I) e) Nanopartículas reticuladas con 1,3-diaminopropano con ovoalbúmina encapsulada (NP III) f) Nanopartículas reticuladas con 1,3-diaminopropano con ovoalbúmina encapsulada y recubiertas por LPS-R de Brucella Ovis (NP V) g) Nanopartículas con LPS-R de Brucella Ovis encapsulado y recubiertas por ovoalbúmina (NP VI) h) Nanopartículas reticuladas con 1,3-diaminopropano con ovoalbúmina y LPS-R de Brucella Ovis encapsulado (NP VII) Como control positivo del experimento se tomó al grupo que se les había administrado ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel por vía intradérmica (OVA-Alum). Se realizaron sucesivas extracciones de sangre en los días 7, 14, 28, 35, 42 y 49 tras la inmunización. Se procesaron las muestras (ver Ejemplo 3) y se obtuvieron los resultados que se recogen en las Figuras 5 y 6. Respuesta IgGχ (Figura 5): Tanto NP III como NP V y NP VII indujeron altos niveles de IgGj. de manera mucho más rápida e intensa que la formulación control (OVA-Alum). Únicamente 49 días después de la administración, las formulaciones a base de nanopartículas y el control (OVA-Alum) muestran niveles similares. Por último, el LPS-R en la superficie de las nanopartículas no parece tener influencia en la inducción de niveles de IgGj.. Por otra parte, NP I también muestra un fuerte potencial para inducir la producción de anticuerpos IgG!. Además, como en el caso anterior, este fenómeno es más rápido e intenso que en la formulación control. Cuando se asocia LPS-R en el interior de nanopartículas recubiertas con OVA, sí se observa una reducción significativa en el título de IgGi en suero respecto a las formulaciones NP I y control. Respuesta I G^: La Figura 6 muestra los títulos de IgG2a obtenidos en los sueros de los ratones. En este caso ninguna de las formulaciones control (OVA, NP, OVA- Alum) induce títulos de anticuerpos. Sin embargo, las formulaciones con OVA encapsulada fueron capaces de proporcionar títulos elevados de IgG2a, principalmente cuando LPS-R estaba adsorbido en el exterior de las nanopartículas (formulación NP V). Por otra parte NP I se reveló mucho más efectiva que NP VI para inducir una respuesta Thl medida en título de IgG2a en suero. IL-10: La Figura 7 muestra los niveles de IL-10 en suero, que se determinaron mediante un kit de ELISA (Biosource, Camarillo, USA). En este caso, tampoco fueron capaces los controles de inducir la secreción de IL-10 en suero. Sin embargo, todas las formulaciones de nanopartículas, en mayor o menor medida, indujeron la secreción de esta citoquina. La formulación con ovoalbúmina adsorbida en la superficie de NP (NP I) permitía la inducción de un pico de IL-10 de forma más rápida que el resto de formulaciones. Sin embargo, la asociación de LPS (NP VI) retrasaba significativamente (14 días) la secreción de la citoquina. Por otra parte, NP III se reveló como la formulación más eficaz para inducir IL-10 en suero, dando lugar a niveles dos veces mayores que para NP I, aunque retrasados en el tiempo una semana. La asociación de LPS-R en nanopartículas encapsulando OVA (NP V y NP VII) permitía la inducción de niveles de IL-10 más discretos pero con un máximo a las dos semanas tras la administración. Esta potencialidad de las formulaciones para inducir niveles de IL-10 significativos sugiere su empleo como posibles tratamientos de enfermedades caracterizadas por desequilibrios en el balance Thl/Th2, debido al poder regulador de esta citoquina [Zuany-Amorim et al, J Clin Invesí, 95 (1995) 2644-2651; Stampfli et al, Am JRespir Cell Mol Biol, 21 (1999) 586-596; Hall et al, Vaccine, 21 (2003) 549-561].
EJEMPLO 5 Preparación, caracterización y administración de nanopartículas con el extracto ChE de Salmonella Enteritidis 5.1 Extracción del extracto ChE de Salmonella Enteritidis El extracto bacteriano ChE (chaoíropic extract) se obtuvo siguiendo un protocolo previamente descrito por Altman y colaboradores (Alunan et al., Biochem J. (1982) 505-513). Inóculos de Salmonella Enteritidis en su estado estacionario se incubaron en frascos conteniendo 400 mL de medio BHI (Brain Heart Infusión, Difco Lab., Detroit, USA), a 37°C, 48 h, sin agitación. Posteriormente, las células se centrifugaron (7.000 x g, 30 minutos) y se lavaron con PBS (tampón fosfato salino; 10 mM; pH 7,4). El extracto bacteriano se obtuvo después del tratamiento del sedimento celular en KSCN/PBS 3M con agitación magnética (lh, temperatura ambiente), y posterior centrifugación (35.000 x g, 30 minutos). El sobrenadante, conteniendo el extracto ChE, se recogió y dializó en primer lugar frente a PBS y posteriormente frente a agua desionizada. Finalmente se liofilizó y se conservó a 4°C hasta su posterior utilización.
5.2 Preparación de las nanopartículas con ovoalbúmina y ChE de Salmonella Enteritidis (OVASAL) 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico [Gantrez® AN 119] se disuelven en 3 mL de acetona, mientras que por otra parte se dispersan 5 mg de ovoalbúmina y 5 mg del extracto ChE en 2 mL de acetona por ultrasonicación
(Microson™) durante 1 minuto bajo enfriamiento. La dispersión de ovoalbúmina y ChE se añade a la suspensión del polímero y se agita durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, sobre esta fase y bajo agitación magnética, se adicionan 10 mL de etanol y 10 mL de agua desionizada. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 10 mL. A continuación se incuban con 0,1 mL de una solución de 1,3- diaminopropano al 1%. La mezcla se somete a purificación por ultracentrifugación (20 minutos a 27.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en una solución acuosa de sacarosa al 5%. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes es liofilizada.
5.3 Cuantificación de la producción de anticuerpos anti-OVA tras inmunización con OVASAL en ratones BALB/c Se inmunizaron con 10 μg de ovoalbúmina por vía intradérmica 15 ratones y se dividieron en 3 grupos distintos según el tratamiento recibido: a) Solución de ovoalbúmina (OVA) b) Ovoalbúmina adsorbida en alhidrogel (OVA-Alum) c) Nanopartículas de ovoalbúmina y ChE de Salmonella Enteritidis (OVASAL) Tras la administración de las distintas formulaciones se extrajo sangre del plexo retroorbital los días 7, 14, 28, 35, 42 y 49, y se procesaron las muestras como se indica en el Ejemplo 3. Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 8. Sorprendentemente, OVASAL aumentaba considerablemente el título de IgGl5 mientras que el título de IgG2a permanecía en niveles muy bajos. Esto indica que esta formulación es capaz de potenciar únicamente la respuesta Th2, la cual, además, era mucho más rápida e intensa que para la formulación control (OVA-Alum). Estos resultados llevan a pensar en la probable aplicación como adyuvante en vacunas donde interese obtener niveles altos de anticuerpos o frente a toxinas secretadas por microorganismos. Igualmente, podría tener aplicación en ciertas enfermedades autoinmunes caracterizadas por presentar una respuesta Thl descompensadamente elevada en fases agudas.
EJEMPLO 6 Preparación y caracterización de nanopartículas biodegradables con el extracto HE de Salmonella Enteritidis (NP HE 3934) 6.1 Extracción y caracterización del complejo antigénico HE de Salmonella Enteritidis 3934 El antígeno utilizado es un extracto superficial de S. Enteritidis denominado HE (Hot saline Extract) debido a que en medio salino y con calor libera el complejo antigénico. Este HE contiene fosfolípidos, proteínas de superficie y lipopolisácarido liso (LPS-S). El extracto HE se obtuvo por un método descrito previamente [Gamazo et al., Infecí. Immun. (1989) 1419-1426]. Tras el cultivo de la bacteria, Salmonella Enteritidis 3934, en matraces conteniendo tripticasa de soja (TSB), las bacterias se centrifugan a 7.000 x g durante 30 minutos y se lavan dos veces con solución salina. Las células vivas se resuspenden en solución salina (10 g de células en húmedo en 100 mL) y se calienta a 100°C en vapor fluyente durante 15 minutos. Tras su centrifugación (12.000 x g, 10 min.), el sobrenadante se dializa durante 5 días frente a varios cambios con agua desionizada. El material dializado se ultracentrifuga durante 4 horas a 60.000 x g, y el sedimento (HE) se resuspende en agua desionizada, se liofiliza y se almacena a temperatura ambiente. La caracterización incluye la determinación del porcentaje de proteínas y de lipopolisacárido. La determinación de la cantidad de proteínas se llevó a cabo por el método de Lo ry. El extracto antigénico de Salmonella Enteritidis 3934 contiene aproximadamente un 31% de proteínas. La cantidad de LPS se determina indirectamente midiendo uno de sus marcadores exclusivos, el KDO, por el método del ácido tiobarbitúrico. Por este método se obtuvo un 0,86 % de KDO que representa un 65% de LPS-S.
6.2 Fabricación y caracterización físico-química de las nanopartículas con el extracto HE de Salmonella Enteritidis 3934 (NP HE 3934) En primer lugar, 100 mg del copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico se disuelven en 5 mL de acetona; a esta solución se le añade el extracto antigénico HE (4 mg) también resuspendido en lmL de acetona y se mezcla bajo agitación magnética. Esta solución se deja incubando durante 15 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se añaden sobre esta fase 10 mL de etanol y finalmente el mismo volumen de agua. La mezcla resultante se deja homogeneizar durante 5 minutos. Entonces la suspensión de nanopartículas es evaporada bajo presión reducida hasta eliminar ambos disolventes orgánicos y el volumen final se ajusta con agua a 10 mL. La suspensión se somete a purificación por ultracentrifugación (10 minutos a 35.000 x g). Los sobrenadantes se eliminan y el residuo se resuspende en una solución acuosa de sacarosa al 5% p/v. Finalmente, la suspensión de nanopartículas resultantes se liofiliza, permitiendo mantener todas sus propiedades intactas. La fórmula resultante de la suspensión de nanopartículas antes de liofilizar es: Copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (Gantrez® AN- 119) 1 ,0 % p/v Extracto antigénico 0,4% p/v
Sacarosa 5,0% p/v
Aguap.i. c.s.p lO mL [p.i.: para inyección; c.s.p.: cantidad suficiente para] Previamente al proceso de liofilización se determina el tamaño y carga superficial de las nanopartículas. Las nanopartículas obtenidas tienen un tamaño medio inferior a los 200 nm y una carga neta superficial negativa (-20,1 + 3,2 mV). El rendimiento del proceso de fabricación se obtuvo mediante la determinación de su peso tras el proceso de liofilización. Partiendo de 100 mg de copolímero se determinó la cantidad transformada en nanopartícula al terminar el proceso, y se expresó como porcentaje respecto a la masa inicial del copolímero. La cuantificación y detección del extracto se llevó a cabo por el método del ácido bicinconínico. Para ello, antes de añadir el agente reticulante, se recoge una alícuota (1 mL) de la suspensión de nanopartículas. Las nanopartículas se rompen añadiéndoles NaOH 0,1N, esta mezcla se analiza por el método colorimétrico del ácido bicinconínico para proteínas previa validación del método. La validación se ha realizado con el extracto disuelto en nanopartículas vacías rotas en NaOH 0,1N. La solución de ácido bicinconínico junto con el sulfato cúprico al 5% en proporción 100:2, se añade sobre la muestra, la mezcla se mantiene a 37°C durante media hora y a continuación, se mide espectro-fotométricamente a 562 nm. La carga de extracto se expresa como la cantidad de extracto en μg por mg de nanopartículas y la eficacia de encapsulación se determina relacionando la cantidad total de extracto encapsulado con la cantidad inicial. En la Tabla 2 se refleja la carga de extracto antigénico en nanopartículas (μg de extracto/mg nanopartícula) y la eficacia de encapsulación (%).
Tabla 2 Características físico-químicas de las nanopartículas de Gantrez® AN 119 cargadas con el extracto antigénico Extracto Eficacia Formulación Tamaño (nm) encapsulado encapsulación3 (μg/mg) (%) NP 171,4+ 3,9
NP-HE S. Enteritidis 178 ± 55,4 18,1 + 6,6 45,2 ± 5,4 : La eficacia de encapsulación hace referencia al porcentaje de HE encapsulado, se calculó como la cantidad de extracto antigénico encapsulado por 100 entre la cantidad inicial. La Figura 9 refleja el patrón proteico del HE de S. Enteritidis, donde, se pueden diferenciar los distintos componentes: porinas (aproximadamente 36 kDa), OmpA (34 kDa) y las fimbrias SEF14 (14 kDa) y SEF21 (21 kDa). Se pudo constatar, mediante la realización de una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) e inmunoblotting, que el extracto encapsulado conservaba su integridad estructural y antigenicidad. En la Figura 10 se puede observar el perfil antigénico del extracto antes y después de su encapsulación.
EJEMPLO 7 Estudio de la protección conferida por la vacuna NP HE 3934 administrada vía intraperitoneal en ratones Se utilizaron lotes de ratones BALB/c de 9 semanas de edad, cada uno compuesto por 10 animales. La vacunación se realizó con la preparación vacunal de nanopartículas (NP HE 3934) descrita en el Ejemplo 6 a razón de 30 μg de extracto por animal, incluyendo además como controles: i) la misma cantidad de las correspondientes nanopartículas vacías; ii) 30 μg/animal del extracto HE libre, no encapsulado; iii) 200 μL de la vacuna comercial Salenvac® (Intervet UK Limited, Walton, Inglaterra); iv) solución salina. Diez días después de la vacunación, fueron inoculados por vía intraperitoneal con una dosis letal de 102 UFC de la cepa S. Enteritidis 3934, y se realizaron desde ese momento recuentos de los animales que morían por salmonelosis. Los resultados del experimento de protección demuestran que la preparación vacunal basada en nanopartículas (NP HE 3934) protegió frente a S. Enteritidis por vía subcutánea de una forma similar a la vacuna comercial Salenvac®, así como el extracto antigénico HE administrado de forma libre (HE Se 3934). Los resultados muestran que la encapsulación de los extractos HE en nanopartículas no incrementan los niveles de protección en los ratones. Por otro lado, la inmunización de ratones con nanopartículas vacías inducen una respuesta inmune inespecífica que confiere protección durante tres semanas. No obstante, hay que indicar que la vía de administración del antígeno HE tanto libre como encapsulado fue la intraperitoneal. Estudios previos sugieren que una administractión oral o intranasal de los antígenos no encapsulados provocaría su degradación antes de su llegada a los sitios de interacción con las células presentadoras de antígenos. Además, pasados 10 días de la vacunación, se realizaron en el momento de la infección experimental estudios de la imnunidad conferida por las nanopartículas, cuantificando los niveles de producción de IFN-γ e IL-4 (propias de respuestas inmunes de tipo Thl y Th2, respectivamente) por células de bazo de los ratones (Figura 12). También se determinó la producción de anticuerpos IgG2a e IgGj. (respuesta Thl y Th2, respectivamente) en sangre (Figura 13). Para estudiar el balance Thl/Th2 inmunitario inducido por los extractos HE libres y encapsulados en los ratones empleados en el estudio, se determinaron los niveles de IFN-γ y de IL-4 producidos por las células esplénicas de los animales inmunizados (Figura 12). El panel A muestra los niveles de IFN-γ inducidos, indicando un aumento de dicha producción en los ratones inmunizados con las nanopartículas (NP HE 3934). Por el contrario, el panel B muestra cómo no existe un incremento significativo en la producción de IL-4 en ratones inmunizados con el extracto HE libre (HE 3934) y los inmunizados con las nanopartículas NP HE 3934. A la vista de los resultados obntenidos, se puede afirmar que la encapsulación de los extractos HE en nanopartículas favorece un incremento de las respuestas de tipo Thl, reflejado por un incremento en la producción de IFN-γ, frente a Th2. La producción de anticuerpos específicos frente a los extractos HE de S.
Enteritidis 3934 en los ratones inmunizados se estudió mediante ELISA indirecto (Figura 13). Los ratones no inmunizados, o inmunizados con nanopartículas vacías (NP vacías), no produjeron anticuerpos IgG2a ni IgGj. frente al extracto HE de S. Enteritidis 3934. Los niveles de IgG2a detectados fueron mayores que los de IgG). en todos los sueros de ratones analizados por ELISA. No obstante, no se observó un incremento en la respuesta serológica en los ratones inmunizados con las nanopartículas con extractos HE encapsulados (NP HE 3934) frente a la respuesta mostrada por los ratones inmunizados con los extractos HE libres (HE 3934). IgG2a es un isotipo de anticuerpo dominante en las respuestas inmunes Thl, mientras que IgG! lo es de las de tipo Th2, lo cual confirmaría los resultados obtenidos en el ensayo de liberación de IFN-γ e IL-4, indicando que la administración por vía intraperitoneal de nanopartículas con extractos HE de S. Enteritidis induce una respuesta inmune predominante de tipo Thl . Esta administración confiere un grado de protección frente a la salmonelosis similar a la observada al administrar el antígeno libre. No obstante, como se comentó anteriormente, la aplicación de estos antígenos no encapsulados por vía de las mucosas no otorgaría estos niveles de protección observados en este experimento, debido a la degradación acida y enzimática que sufrirían a su paso por el tracto gastrointestinal de los animales.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria que comprende nanopartículas a base de un copolímero de metil vinil éter y anhídrido maleico (PVM/MA).
2. Composición según la reivindicación 1, en la que dichas nanopartículas a base de PVM/MA comprenden, además, un alérgeno o un antígeno.
3. Composición según la reivindicación 2, en la que dicho alérgeno o antígeno recubre al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas y/o está contenido en el interior de dichas nanopartículas.
4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichas nanopartículas a base de PVM/A comprenden, además, un agente inmunoestimulante.
5. Composición según la reivindicación 4, en la que dicho agente inmuno- estimulante recubre al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas y/o está contenido en el interior de dichas nanopartículas.
6. Composición según la reivindicación 1, en la que dichas nanopartículas a base de PVM/MA comprenden, además, un alérgeno o un antígeno y un agente inmunoestimulante.
7. Composición según la reivindicación 6, en la que dichos alérgeno o antígeno y agente inmunoestimulante recubren al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas y/o están contenidos en el interior de dichas nanopartículas.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dichas nanopartículas comprenden, además, un agente reticulante.
9. Composición según la reivindicación 8, en la que dicho agente reticulante comprende una poliamina o un glúcido.
10. Composición según la reivindicación 9, en la que dicho agente reticulante es 1,3-diaminopropano.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichas nanopartículas tienen un tamaño medio igual o inferior a 1,0 micrómetro, preferentemente entre 10 y 900 nm, más preferentemente, igual o inferior a 400 nm.
12. Composición según la reivindicación 1, en la que dicho copolímero de PVM/MA tiene un peso molecular comprendido entre 100 y 2.400 kDa, preferentemente entre 200 y 2.000 kDa, más preferentemente, entre 180 y 250 kDa.
13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en forma liofilizada.
14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en una forma de administración adecuada para su administración por vía oral o parenteral.
15. Una vacuna o una composición para inmunoterapia que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 junto con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 15, en forma liofilizada o en una forma de administración adecuada para su adminisfración por vía oral o parenteral.
17. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 15, en la que dicha composición estimuladora de la respuesta inmunitaria comprende nanopartículas a base de PVM/MA vacías y, si se desea, un agente reticulante, en combinación con una composición vacunal o inmunoterapéutica que comprende un antígeno o un alérgeno.
18. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 15, en la que dicha composición estimuladora de la respuesta inmunitaria comprende nanopartículas a base de PVM/MA que comprenden, además, un alérgeno o un antígeno, y, si se desea, un agente reticulante.
19. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 15, en la que dicha composición estimuladora de la respuesta inmunitaria comprende nanopartículas a base de PVM/MA que comprenden, además, un agente inmunoestimulante, y, si se desea, un agente reticulante.
20. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 15, en la que dicha composición estimuladora de la respuesta inmunitaria comprende nanopartículas a base de PVM/MA que comprenden, además, un alérgeno o un antígeno y un agente inmunoestimulante, y, si se desea, un agente reticulante.
21. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 15, que comprende: Componente % en peso respecto al total Nanopartículas de PVM/MA 84-99,998% Agente reticulante 0,001-1% Alérgeno o antígeno 0,001 - 15%
22. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 21, que comprende, además, un agente crioprotector.
23. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 21 ó 22, en la que dicho alérgeno comprende un extracto alergénico de polen, un extracto alergénico de un insecto, un extracto alergénico de un hongo, un extracto alergénico de un epitelio animal o un extracto alergénico de un producto alimenticio.
24. Vacuna o composición para inmunoterapia según la reivindicación 21 ó 22, en la que dicho antígeno comprende un extracto inmunogénico procedente de un organismo.
25. Empleo de una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la elaboración de una vacuna o composición para inmunoterapia.
26. Empleo de una composición estimuladora de la respuesta inmunitaria según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación selectiva de la respuesta inmunitaria Thl, o en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación selectiva de la respuesta inmunitaria Th2, o en la elaboración de una composición farmacéutica para la estimulación, de forma balanceada, de las respuestas inmunitarias Thl y Th2.
27. Un procedimiento para la producción de nanopartículas a base de un copolímero de PVM/MA que comprenden un alérgeno o un antígeno, en donde dicho alérgeno o antígeno recubre al menos parcialmente la superficie de dichas nanopartículas y/o está contenido en el interior de dichas nanopartículas, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: a) desolvatación de una solución orgánica de un copolímero de PVM/MA disuelto en un disolvente orgánico con una solución hidroalcohólica; b) eliminación de los disolventes orgánicos para obtener nanopartículas, y c) adición de dicho alérgeno o de dicho antígeno a dicha solución orgánica de copolímero de PVM/MA antes de efectuar la desolvatación de dicha solución orgánica del copolímero de PVM/MA o, alternativamente, incubar dicho alérgeno o dicho antígeno con dichas nanopartículas obtenidas en la etapa b).
28. Procedimiento según la reivindicación 27, que comprende, además, la incubación del producto resultante de la etapa a) con un agente inmunoestimulante, o alternativamente, la incubación de las nanopartículas resultantes de la etapa b) con un agente inmunoestimulante.
29. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, en el que dicho disolvente orgánico en el que se disuelve el copolímero de PVM/MA es acetona, dicha solución hidroalcohólica comprende etanol y agua, y la relación solución de copolímero: solución hidroalcohólica está comprendida entre 1 : 1 y 1 : 10.
30. Procedimiento según la reivindicación 29, en el que la relación solución de copolímero: solución hidroalcohólica es de 1:4.
31. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, que comprende una etapa adicional de incubación de las nanopartículas formadas con un agente reticulante.
32. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, que comprende una etapa adicional de purificación de las nanopartículas formadas.
33. Procedimiento según la reivindicación 27 ó 28, que comprende una etapa adicional de liofilización, opcionalmente en presencia de un agente crioprotector.
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