WO2005098397A1 - Verfahren und vorrichtung zur erfassung von prozessparametern von reaktionsflüssigkeiten in mehreren geschüttelten mikroreaktoren - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur erfassung von prozessparametern von reaktionsflüssigkeiten in mehreren geschüttelten mikroreaktoren Download PDF

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WO2005098397A1
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microreactors
sensor
microreactor
process parameters
optics
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PCT/EP2005/002928
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Jochen Büchs
Frank Kensy
Markus Samorski
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Rwth Aachen
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Definitions

  • the invention relates to a method and a device for detecting process parameters of reaction liquids in a plurality of microreactors, which are continuously shaken in all microreactors at least until the end of the reaction, the process parameters in the microreactors being recorded during the reaction with the aid of at least one sensor optic, which introduces electromagnetic radiation from a radiation source into the reaction liquid of a microreactor and detects electromagnetic radiation emanating from the reaction liquid of the microreactor with a sensor assigned to the radiation source.
  • the invention is particularly suitable for the automated detection of process parameters of microbial, biochemical, enzymatic and chemical reactions in reaction liquids which are shaken without interruption in all microreactors until the reaction is complete.
  • the aforementioned parameters are to be determined in microreactors with a size of 10 ⁇ l-5 ml in order to reduce the effort for chemical, biochemical, enzymatic and microbial optimization processes, also referred to as screening.
  • a screening comes for example
  • BESTATIGUNGSKOPIE when selecting stocks, media optimization and process control optimization.
  • the small volumes in the microreactors enable the high throughputs required in many areas of research and development, particularly in combinatorial chemistry and molecular biotechnology.
  • microtiter plate readers for detecting the absorption and fluorescence in microbial reaction liquids are known from the prior art.
  • the shaking movement of the microtiter plates must be interrupted for each acquisition of process parameters during the reaction.
  • Such an absorption microtiter plate reader for 200-well microtiter plates for monitoring microbial growth is offered, for example, by Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA.
  • the light absorption is recorded by the cells in the wells.
  • electromagnetic radiation from a radiation source is introduced into the reaction liquid in the wells and the electromagnetic radiation emanating from the reaction liquid of the microreactor is detected with a sensor.
  • the sensor signals depend on the irradiated layer thickness and the cell concentration.
  • a microtiter plate reader for detecting the absorption in microbial culture fluids is already known, in which the shaking movement of the microtiter plates for detecting the absorption does not have to be interrupted during the reaction.
  • the known device consists of, for example a 96-well microtiter plate which is taken up by a microreactor platform.
  • the individual wells have a volume between 100 ⁇ l and 250 ⁇ l.
  • At least one sensor optic with a sensor is located in a sub-platform arranged under the microreactor platform
  • Excitation source for example a light-emitting diode, and a detector which detects the absorption of the electromagnetic radiation from the excitation source in the reaction liquid of the microreactor (wells).
  • the change in the measured absorption indicates a change in the concentration of the analyte in the microreactor.
  • the LEDs and the detectors are moved from microreactor to microreactor by means of a robot.
  • at least one LED and one detector are assigned to each microreactor within the sub-platform.
  • the sub-platform with the sensor optics is in turn located on a shaking device which is attached to a positioning table. The shaker is custom made to integrate between the
  • the positioning table which can be moved in the XY axis direction, serves the purpose of moving individual microreactors under a dispenser.
  • a dispenser With this known device, for example, the growth conditions of the microorganisms in
  • a disadvantage is the complex structure of the device, in particular that of the shaker specially adapted to the device.
  • Another disadvantage is that the sensor optics (s) are also shaken in the sub-platform. Due to the high shaking frequencies and the associated centrifugal forces, problems and thus errors in the acquisition of the process parameters can occur require a repetition of the reaction. This can lead to undesirable delays, especially in the case of serial examinations of microbial culture fluids, enzymatic and chemical reactions.
  • the object of the invention is to provide a method for detecting process parameters of reaction liquids in several microreactors which are continuously shaken during the reaction and which works reliably. Furthermore, a device for carrying out the method is to be specified, which can largely be implemented with standard components and devices of biotechnology.
  • each sensor optic is not moved at least during the acquisition of the process parameters, so that the shaken microreactors move relative to each sensor optic and the electromagnetic radiation emanating from each sensor optic during the acquisition of the process parameters is introduced into this microreactor in one of the microreactors and the radiation emanating from the reaction liquid strikes only the sensor of the sensor optics.
  • the biomass concentration in one of the microreactors can be detected, for example, with the aid of scattered light striking the sensor of the sensor optics or the radiation emanating from the autofluorescence of the cells.
  • the substrate, product and by-product concentration can be monitored using IR or Raman spectroscopy.
  • Biotechnological substrates such as Glucose or glycerin are IR and Raman active and form a specific spectrum, which can also be detected in very complex media.
  • Substance metabolism by-products such as acetic acid and ethanol also have a characteristic spectrum. By transmitting the spectrum via optical fibers to an IR or Raman spectrometer, organic substrates can be detected in the microreactors. More detailed explanations are under Sivakesava S., Irudayaraj J., Ali D. (2001):
  • the reaction liquids in the microreactors have at least one chemical sensor material, such as in particular a fluorescent dye, which in particular can be immobilized on at least one inner wall of the microreactor.
  • a fluorescent dye react specifically to theirs Environmental conditions.
  • platinum porphyrins or ruthenium complexes react to the presence of oxygen by quenching their fluorescent properties.
  • Fluorescence indicator solutions are also sensitive to changes in the dissolved C0 2 concentration (pC0 2 ) and the pH by changing the fluorescence properties.
  • FIG. 1 A-C Three variants of preferred devices for performing the method according to the invention;
  • Fig. 2 A-C Different embodiments of a sensor optics for the device according to the invention;
  • Fig.3 A-B two schematic top views of a cylindrical microreactor that rotates with a fixed shaking diameter over a light beam from a flash lamp;
  • Fig. 4 is an illustration for explaining a first variant of the method according to the invention
  • Fig. 5 is an illustration for explaining a second variant of the method according to the invention
  • Fig. 6 is an illustration to explain a third variant of the method according to the invention using chemical sensors and Fig.7 measurement curves of a culture of Hansenula polymorpha
  • a microtiter plate (1) with an array of microreactors is placed in a receptacle of a tray (4) of a rotary Shaker (5, 6) used.
  • the rotary shaker (5,6) reaches a maximum shaking frequency of 500-2000 rpm, for example.
  • the shaker diameter of the rotary shaker is matched to the detection process.
  • electromagnetic radiation with a wavelength of 200nm-25 ⁇ m is introduced through the cutout (11) of the tray (4) into the radiation-permeable wells of the microtiter plate (1) and the radiation emanating from the wells from the sensor optics (17) recorded.
  • Figure 1A shows an embodiment with a standing rotary shaker (5), in which the partial surface of the tray (4) carrying the microtiter plate (1) protrudes beyond the drive. This ensures free access to an X / Y
  • Positioning unit (7) arranged sensor optics (17) to the microtiter plate (1) from the underside thereof.
  • FIG. 1 B shows an embodiment with a tray (4), which is driven by a hanging rotary shaker (6).
  • the part of the tray (4) carrying the microtiter plate (1) need only protrude beyond the rotary shaker (6) in this embodiment if the wells are also to be accessible from above
  • FIG 1 C shows an embodiment in which the microtiter plate (1) is received by a shaking frame (16) with a cutout (11).
  • the shaking frame (16) spaces the microtiter plate (1) in the vertical direction from the flat tray (4). Due to the laterally open design of the shaking frame (16), the sensor optics (17) can be moved freely from the side under each well in the microtiter plate using the X / Y positioning unit (7).
  • Figures 2A, 2B show devices in which the electromagnetic radiation from the radiation source and the radiation emanating from the reaction liquids are conducted via optical waveguides (2.25).
  • the variant according to Figure 2 A shows separate radiation guidance via two optical fibers (2).
  • the radiation is introduced via an optical waveguide (2) leading to the reactor and the radiation emanating from the microreactor is guided via one of the optical waveguide (2) leading to the reactor and the radiation emanating from the microreactor is guided via one of the optical waveguide (2) leading to the reactor and the radiation emanating from the microreactor is guided via one of the optical waveguide (2) leading to the reactor and the radiation emanating from the microreactor is guided via one of the
  • Microreactor leading optical fiber (2) A radiation source feeding the sensor optics and a sensor are located in a reader (3).
  • optical fibers (2) are combined in a Y optical fiber (25).
  • the optical fibers consist of individual optical fibers or also of optical fiber bundles.
  • the radiation source feeding the sensor optics and the sensor are located in the reader (3).
  • Figure 2 C shows sensor optics (17) without optical fibers.
  • the radiation source (12) and the sensor (15) are located directly in the sensor optics (17), which can additionally have filters 13, 14 in the beam path.
  • the excitation light of the radiation source (12) is aimed directly at each individual microreactor, while the reaction-dependent radiation emanating from the reaction liquid in the microreactor hits the sensor (15).
  • the sensor optics (17) are connected to an electronic circuit (9) via cables (26) for supplying the radiation source (12) and for signal transmission of the sensor signals.
  • the circuit (9) controls the radiation source (12) and is used to read out the sensor signals.
  • Data acquisition and evaluation takes over in all variants a data processing unit, for example a computer (8).
  • the functionality of the electronic circuit (9) is integrated in the variants according to Figures 2A, B in the reader (3).
  • the sensor optics (17) in all variants is attached to the arm of an XY positioning unit (7).
  • the XY positioning unit (7) is also controlled by the computer (8) with control software.
  • the emitted light can also be filtered via optical filters (14), diffraction gratings or prisms.
  • the shaking speed of the rotary shaker (5, 6) and the pulse frequency of the flash lamp are matched in such a way that no suspended states occur. Hovering states occur when the light flashes hit a few positions on the reactor floor and the positions move on the reactor floor due to the lack of synchronization of the shaker and flash frequency.
  • the microreactor shown in Figure 4 delimited by a circular cylindrical bottom (10) and a cylinder jacket (19), rotates with a fixed shaking diameter over a stationary light beam (18) of the sensor optics (17).
  • the light beam (18) describes a circular line (31) on the bottom (10) of the microreactor (see Figures 3A and 3B).
  • the choice of the shaking speed (n) and the flash frequency (f B ) of the flash lamp shows a state in which only 3 flashes are distributed over the circumference of the circular line (31).
  • f B 3 * n, so that only 3 flashes are triggered per revolution.
  • the flash frequency (f B ) is a natural multiple of the shaking speed (n)
  • floating states occur.
  • the flashes of light begin at the same positions (32) on the circular line (31). If the circular line (31) is insufficiently covered with flashes ( ⁇ 4 flashes / circular line) and the flash is not synchronized with the
  • Liquid movement in the reactor moves the positions (32) clockwise or counterclockwise on the circular line (31).
  • the angle (22) of the sensor optics (17) leads to variable intensities of the
  • a stable and homogeneous sensor signal can be obtained for recording the process parameters in the microreactor.
  • Another possibility to stabilize the sensor signal is to synchronize the flashes of the radiation source with the shaking drive and thus also the liquid movement in the microreactors.
  • a position sensor e.g. a light barrier
  • the position of the tray (4) to the sensor optics (17) can be determined at any time. Taking into account the position information, the light flashes of the flash lamp are triggered. The flash is preferably triggered when the reaction liquid sloshing in the centrifugal acceleration direction is located above the sensor optics (17). This prevents the light beam (18) from falling into zones of the microreactor in which there is temporarily little or no reaction liquid due to the centrifugal acceleration.
  • Figure 4 illustrates a method for sequential acquisition of the values of process parameters in each case in only one microreactor with subsequent method of the sensor optics (17) by means of the positioning unit (7).
  • the sensor optics (17) are aligned under a microreactor in such a way that the electromagnetic radiation with a wavelength between 200nm-25 ⁇ m in the form of the light beam (18) is introduced exclusively into this microreactor during the detection of individual measured values during the reaction.
  • the shaking diameter (27) of the rotary shaker (5 or 6) about the eccentric axis (21) is selected so that the light beam (18) of the sensor optics (17) only hits the bottom (10) of one of the microreactors.
  • the shaker diameter (27) must be selected to be smaller than or equal to the diameter (28) of the base (10).
  • the process parameters of the individual groups being recorded one after the other, but the process parameters in the microreactors of a group being recorded simultaneously by sensor optics (17) for each microreactor of the group become.
  • the sensor optics for simultaneous detection within a group are arranged on the positioning unit (7). After the simultaneous acquisition of the process parameters in the microreactors in one group, the sensor optics are moved to the next group.
  • the sensor optics for a group are aligned among the microreactors in the group in such a way that the electromagnetic radiation from each sensor optic is only introduced into the microreactor under which the sensor optic is located when individual measurement values are acquired.
  • each sensor optic is aligned with each microreactor in such a way that no electromagnetic radiation reflected from the walls, in particular the bottom (10), of the microreactor is directed onto the sensor meets.
  • the optical waveguide end serving as sensor optics (17) is placed at an acute angle (22) to an orthogonal one on the bottom (10) of the microreactor.
  • the process parameters in all microreactors simultaneously from one sensor optic for each microreactor.
  • the sensor optics are aligned under the microreactors in such a way that the electromagnetic radiation (200 nm-25 ⁇ m) in the form of the light beam (18) is only introduced into the microreactor assigned to the sensor optics during the acquisition of the measured values during the reaction.
  • Figure 5 illustrates a process for sequential acquisition of the process parameters in four microreactors arranged next to each other.
  • the process parameters of the microreactors are due to the circular relative movement to the non-moving
  • Sensor optics (17) successively captured by this sensor optics (17).
  • the electromagnetic radiation from the sensor optics (17) is introduced exclusively into this microreactor during the acquisition of the process parameters in one of the four microreactors.
  • the radiation emanating from the reaction liquid strikes only the sensor of the sensor optics (17). Simultaneous irradiation in two adjacent microreactors is avoided due to the arrangement of the sensor optics (17) to the bottom (10) of the microreactors.
  • the sensor optics (17) is aligned with one of the four microreactors. If, in the distribution of the microreactors on the tray (4), the shaker diameter is selected to be equal to the diagonal distance between the centers of the microreactors, then the 4 microreactors will rotate in succession over the light beam (18) of the sensor optics (17) during one revolution. The microreactors move in the sequence I-IV via the sensor optics (17), the light beam (18), which is stationary during the detection, describes a circular line (23). The sensor signals from the individual
  • Microreactors are caused with this not shown computer (8) recorded.
  • an assignment is made between the sensor signals and the microreactors, from which the electromagnetic radiation responsible for the sensor signals originates.
  • the information about the position of the microreactor required for the assignment can be recorded, for example, by means of a position sensor (for example a light barrier, an acceleration sensor or a Hall sensor) arranged on the rotary shaker (5, 6).
  • the sensor optics (17) After the process parameters of the first group of four microreactors have been recorded, are moved from the positioning unit (7) to a next, adjacent group of microreactors arranged in a mutually matching manner proceed with four microreactors.
  • An angle of attack of the sensor optics (17) with an angle (22) between 25 ° -40 ° to the bottoms (10) of the microreactors has also proven to be advantageous in this method.
  • the reaction liquids in the microreactors can have at least one chemical sensor material, which is preferably attached to at least one inner wall of the microreactor, for example the bottom (10).
  • chemical sensors are, for example, fluorescent dyes which act as indicators of process parameters such as pH, T, p0 2 , and pC0 2 act.
  • the fluorescent dyes can be used to determine the process parameters with the devices and methods described with reference to Figures 1-5. If the fluorescent dyes are immobilized on the inner walls as sensitive layers (38, 39), a special alignment of the sensor optics (17) is required, as is shown, for example, in Figure 6 AB for the measuring method according to Figure 4.
  • the length of a sensitive layer means the longest geometrical dimension of a sensitive layer (38, 39).
  • Positions 35, 36 and 37 below the bottom (10) of the microreactor moves to capture various process parameters.
  • Item 35 is used to record the inherent fluorescence or the scattered light of the reaction liquid, while the positions 36, 37 serve to detect the radiation from the different sensitive layers 38, 39.
  • the different process parameters are recorded in a microreactor without changing the position of the sensor optics between two recording processes.
  • the light beam (18) hits the sensitive layers (38, 39) immobilized on the ground one after the other on a circular path. Part of the floor area is free to allow direct radiation into the
  • reaction liquid which is necessary for the acquisition of certain process parameters, e.g. the scattered light intensity or self-fluorescence of the reaction liquid.
  • process parameters e.g. the scattered light intensity or self-fluorescence of the reaction liquid.
  • the assignment of the different sensor signals via the rotation of the microreactor takes place via a position sensor, not shown.
  • the sensitive layers (38, 39) are attached in the microreactors in such a way that several
  • Microreactors are successively captured by the light beam (18) during one rotation of the tray.
  • the area (40) swept by the sensor optics (17) detects four microreactors and different process parameters that must be assigned to the individual microreactors after the detection of the signals. This also happens here with a position encoder. If the microreactor array comprises more than the four microreactors shown, the sensor optics, after the process parameters of the first group of four microreactors have been recorded, are moved from the positioning unit (7) to further groups of microreactors arranged adjacent to one another, each with four microreactors.
  • microreactors for the cultivation of microorganisms
  • these preferably have an upper opening which is gas-permeable during operation Cover is covered, for example in the form of a self-adhesive membrane. This membrane allows monoseptic operation of the microreactors.
  • the reaction taking place in the reaction liquid is supplied with the necessary gaseous reaction component, but is not hindered by gaseous reaction products.
  • Figure 7 shows measurement curves of a culture of Hansenula polymorpha wt in 2xYP medium (Yeast-Peptone) with 10g / L glycerol at a temperature of 27 ° C as an example of recording process parameters which were determined with the method according to the invention.
  • the process parameters relative scattered light intensity (at 620nm) and the relative NADH fluorescence (excitation at 340nm, emission at 460nm) of the culture were observed over the duration of the reaction.
  • the acquisition of the individual process parameters was carried out with a Y optical fiber at an angle of incidence of 30 ° and a distance of 1 mm from the bottom of the microtiter plate.
  • the shaking frequency corresponded to 995 1 / min and the shaking diameter (27) was 3 mm.
  • reaction was carried out using a conventional 48-well microtiter plate (Greiner Bioone, Frickenhausen, Art. No .: 677 102) and 600 ⁇ l filling volume.
  • a gas-permeable adhesive film was used to cover the 48-well microtiter plate (Abgene, Hamburg, item no .: AB-0718).

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erfassung von Prozessparametern von Reaktionsflüssigkeiten in mehreren Mikroreaktoren, die zumindest bis zur Beendigung der Reaktion in sämtlichen Mikroreaktoren kontinuierlich geschüttelt werden. Die Prozessparameter in den Mikroreaktoren werden während der Reaktion mit Hilfe mindestens einer Sensoroptik erfasst. Um die Zuverlässigkeit des Verfahrens zu erhöhen, wird vorgeschlagen, dass die Sensoroptik während der Erfassung der Werte eines Prozessparameters, zum Beispiel bei der Erfassung eines momentanen Wertes der Eigenfluoreszenz der Reaktionsflüssigkeit, nicht bewegt wird. Die dabei auftretende Relativbewegung zwischen den geschüttelten Mikroreaktoren und jeder Sensoroptik ist unproblematisch wenn die elektromagnetische Strahlung jeder Sensoroptik während der Erfassung der Prozessparameter in einem der Mikroreaktoren ausschließlich in diesen Mikroreaktor eingeleitet wird und die von der Reaktionsflüssigkeit ausgehende Strahlung ausschließlich auf den Sensor der zugehörigen Sensoroptik trifft.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Erfassung von Prozessparametern von Reaktionsflüssigkeiten in mehreren geschüttelten Mikroreaktoren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Erfassung von Prozessparametern von Reaktionsflüssigkeiten in mehreren Mikroreaktoren, die zumindest bis zur Beendigung der Reaktion in sämtlichen Mikroreaktoren kontinuierlich geschüttelt werden, wobei die Prozessparameter in den Mikroreaktoren während der Reaktion mit Hilfe mindestens einer Sensoroptik erfasst werden, die elektromagnetische Strahlung von einer Strahlungsquelle in die Reaktions- flüssigkeit eines Mikroreaktors einleitet sowie von der Reaktionsflüssigkeit des Mikroreaktors ausgehende elektro- magnetische Strahlung mit einem der Strahlungsquelle zugeordneten Sensor erfasst.
Die Erfindung eignet sich insbesondere zur automatisierten Erfassung von Prozessparametern mikrobieller, biochemischer, enzymatischer und chemischer Reaktionen in Reaktionsflüssigkeiten, die bis zum Abschluss der Reaktion in sämtlichen Mikroreaktoren unterbrechungslos geschüttelt werden.
Als Parameter der Reaktionsflüssigkeiten können beispielsweise die Biomasse-, Substrat-, Produkt- und
Nebenproduktkonzentrationen, Eigenfluoreszenz vonZellen, Fluoreszenz von fluoreszierenden Proteinen oder Aminosäuren, pH-,T-, p02- und pC02-Werte, die Sauerstofftransferrate (OTR) und die Kohlendioxidtransferrate (CTR) erfasst werden.
Insbesondere sollen die vorgenannten Parameter in Mikroreaktoren mit einer Größe von 10μl-5ml bestimmt werden, um den Aufwand für chemische, biochemische, enzymatische und mikrobielle Optimierungsverfahren, auch als Screening bezeichnet, zu reduzieren. Ein Screening kommt beispielsweise
BESTATIGUNGSKOPIE bei der Stammselektion, Medienoptimierung und Optimierung der Prozessführung in Betracht. Die geringen Volumina in den Mikroreaktoren ermöglichen die geforderten hohen Durchsätze in vielen Bereichen der Forschung und Entwicklung, wie insbesondere in der kombinatorischen Chemie und der molekularen Biotechnologie .
Aus dem Stand der Technik sind sogenannte Mikrotiterplatten- Lesegeräte zur Erfassung der Absorption und Fluoreszenz in mikrobiellen Reaktionsflüssigkeiten bekannt. Die
Schüttelbewegung der Mikrotiterplatten muss für jede Erfassung von Prozessparametern während der Reaktion unterbrochen werden. Je mehr Prozessparameter über die ablaufenden Reaktionen gewonnen werden sollen, desto häufiger muss die Schüttelbewegung unterbrochen werden, wodurch die Misch- und Stofftransportvorgänge gestört werden. Dadurch kann es bei Kulturen zu anaeroben Bedingungen kommen, die die verschiedenen Mikroorganismen mehr oder minder stark schädigen. Ein derartiges Absorptions-Mikrotiterplatten- Lesegerät für 200-Well Mikrotiterplatten zur Überwachung des mikrobiellen Wachstums wird beispielsweise von der Firma Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA angeboten. Erfasst wird die Licht-Absorption durch die in den Wells befindlichen Zellen. Hierzu wird elektromagnetische Strahlung von einer Strahlungsquelle in die Reaktionsflüssigkeit in den Wells eingeleitet und die von der Reaktionsflüssigkeit des Mikroreaktors ausgehende elektromagnetische Strahlung mit einem Sensor erfasst. Die Sensorsignale hängen von der durchstrahlten Schichtdicke und der Zellkonzentration ab.
Aus der US 6,673,532 B2 ist darüber hinaus bereits ein Mikrotiterplatten-Lesegerät zur Erfassung der Absorption in mikrobiellen Kulturflüssigkeiten bekannt, bei dem die Schüttelbewegung der Mikrotiterplatten für die Erfassung der Absorption während der Reaktion nicht unterbrochen werden muss . Die bekannte Vorrichtung besteht beispielsweise aus einer 96 Wells aufweisenden Mikrotiterplatte, die von einer Mikroreaktor-Plattform aufgenommen wird. Die einzelnen Wells weisen ein Volumen zwischen 100 μl und 250 μl auf. In einer unter der Mikroreaktorplattform angeordneten Sub-Plattform befindet sich mindestens eine Sensoroptik mit einer
Anregungs-Quelle, beispielsweise einer Leuchtdiode, sowie einem Detektor, der die Absorption der elektromagnetischen Strahlung der Anregungsquelle in der Reaktionsflüssigkeit des Mikroreaktors (Wells) erfasst. Die Änderung der gemessenen Absorption indiziert eine Änderung der Konzentration des Analyten in dem Mikroreaktor. In einer Ausgestaltung des Lesegeräts ist es vorgesehen, dass die LED 's und die Detektoren mittels eines Robotters von Mikroreaktor zu Mikroreaktor bewegt werden. In einer anderen Ausgestaltung ist es vorgesehen, dass jedem Mikroreaktor mindestens eine LED und ein Detektor innerhalb der Subplattform zugeordnet ist. Die Subplattform mit der bzw. den Sensoroptiken befindet sich wiederum auf einer Schüttelvorrichtung, die auf einem Positioniertisch befestigt ist. Die Schüttelvorrichtung ist eine Spezialanfertigung, um deren Integration zwischen dem
Positioniertisch und der Subplattform zu ermöglichen. Der in XY-Achsrichtung verfahrbare Positioniertisch dient dem Zweck, einzelne Mikroreaktoren unter einen Dispenser zu verfahren. Mit dieser bekannten Vorrichtung lassen sich beispielsweise die Wachstumsbedingungen der Mikroorganismen in
Kulturflüssigkeiten aussagekräftig beurteilen, da die durch eine Unterbrechung der Schüttelbewegung auftretenden Probleme vermieden werden.
Nachteilig ist jedoch der aufwendige Aufbau der Vorrichtung, insbesondere der des speziell auf die Vorrichtung abgestimmten Schüttlers. Nachteilig ist weiter, dass die Sensoroptik (en) in der Sub-Plattfor mit geschüttelt werden. Aufgrund der hohen Schüttelfrequenzen und damit verbundenen Fliehkräften kann es zu Problemen und damit Fehlern bei der Erfassung der Prozessparameter kommen, die unter Umständen eine Wiederholung der Reaktion erforderlich machen. Hierdurch kann es zu unerwünschten Verzögerungen, insbesondere bei Reihenuntersuchungen mikrobieller Kulturflüssigkeiten, enzymatischer und chemischer Reaktionen kommen.
Ausgehend von diesem Stand der Technik liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Erfassung von Prozessparametern von Reaktionsflüssigkeiten in mehreren während der Reaktion kontinuierlich geschüttelten Mikroreaktoren anzugeben, das zuverlässig arbeitet. Des Weiteren soll eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens angegeben werden, die weitgehend mit Standard- Bauteilen und Vorrichtungen der Biotechnologie realisiert werden kann.
Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs erwähnten Art dadurch gelöst, das jede Sensoroptik zumindest während der Erfassung der Prozessparameter nicht bewegt wird, so dass die geschüttelten Mikroreaktoren sich relativ zu jeder Sensoroptik bewegen und die von jeder Sensoroptik ausgehende elektromagnetische Strahlung während der Erfassung der Prozessparameter in einem der Mikroreaktoren ausschließlich in diesen Mikroreaktor eingeleitet wird und die von der Reaktionsflüssigkeit ausgehende Strahlung ausschließlich auf den Sensor der Sensoroptik trifft.
Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf der Erkenntnis, dass eine kontinuierliche Erfassung der Prozessparameter auch dann möglich ist, wenn jede Sensoroptik während der Erfassung der Werte eines Prozessparameters, zum Beispiel bei der Erfassung eines momentanen Wertes der Eigenfluoreszenz während der andauernden Reaktion, nicht bewegt werden. Die dabei auftretende Relativbewegung zwischen den geschüttelten Mikroreaktoren und jeder Sensoroptik ist unproblematisch solange gewährleistet ist, dass die elektromagnetische Strahlung jeder Sensoroptik während der Erfassung der Prozessparameter in einem der Mikroreaktoren ausschließlich in diesen Mikroreaktor eingeleitet wird und die von der Reaktionsflüssigkeit ausgehende Strahlung ausschließlich auf den Sensor der zugehörigen Sensoroptik trifft.
Die Biomassekonzentration in einem der Mikroreaktoren kann beispielsweise mit Hilfe von auf den Sensor der Sensoroptik treffendes Streulicht oder die von der Eigenfluoreszenz der Zellen ausgehende Strahlung erfasst werden.
Die Substrat-, Produkt- und Nebenproduktkonzentration kann mit Hilfe der IR- oder Ramanspektroskopie verfolgt werden. Biotechnologische Substrate wie z.B. Glucose oder Glycerin sind IR- und Ramanaktiv und bilden ein spezifisches Spektrum aus, was auch in sehr komplexen Medien detektiert werden kann. StoffWechselnebenprodukte wie Essigsäure und Ethanol besitzen ebenfalls ein charakteristisches Spektrum. Durch Übertragung des Spektrums über Lichtwellenleiter an ein IR- oder Raman-Spektrometers können organische Substrate in den Mikroreaktoren detektiert werden. Detailliertere Ausführungen sind unter Sivakesava S., Irudayaraj J. , Ali D. (2001) :
Simultaneous determination of multiple components in lactic acid fermentation using FT-MIR, NIR, and FT-Raman spectroscopic techniques, Process Biochemistry 37, 371-378, zu finden.
In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung weisen die Reaktionsflüssigkeiten in den Mikroreaktoren wenigstens ein chemisches Sensormaterial, wie insbesondere einen Fluoreszenz-Farbstoff auf, der insbesondere an wenigstens einer Innenwand des Mikroreaktors immobilisiertsein kann. Fluoreszenz-Farbstoffe reagieren spezifisch auf ihre Umgebungsbedingungen. Beispielsweise reagieren Platinporphyrine oder Ruthenium-Komplexe auf die Anwesenheit von Sauerstoff mit der Löschung ihrer Fluoreszenzeigenschaften. Ebenso reagieren Fluoreszenz-Indikatorlδsungen empfindlich auf Veränderungen der gelöst C02-Konzentration (pC02) und des pH-Wertes, indem sie die Fluoreszenzeigenschaften verändern. Immobilisiert man diese Substanzen in einer porösen Polymermatrix oder löst oder suspendiert man diese in der Reaktionsflüssigkeit, so wirken sie als optische Sensoren (auch Optoden genannt) für pH-, T-, p02-, pC02-Werte (Liebsch (2000) : Time Resolved Luminescence Lifetime Imaging with Optical Chemical Sensors, Dissertation an der Uni Regensburg) . Es können jedoch auch normale gelöste pH- Indikatoren eingesetzt werden.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand der Figuren näher erläutert. Es zeigen:
Abb. 1 A-C Drei Varianten von bevorzugten Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens; Abb. 2 A-C Verschiedene Ausfuhrungsformen einer Sensoroptik für die erfindungsgemäße Vorrichtung; Abb.3 A-B zwei schematische Draufsichten auf einen zylindrischen Mikroreaktor, der mit einem festen Schütteldurchmesser über einen Lichtstrahl einer Blitzlampe rotiert;
Abb. 4 eine Darstellung zur Erläuterung einer ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens; Abb. 5 eine Darstellung zur Erläuterung einer zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens ; Abb. 6 eine Darstellung zur Erläuterung einer dritten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung chemischer Sensoren sowie Abb.7 Messkurven einer Kultur von Hansenula polymorpha
Ein Mikrotiterplatte (1) mit einem Array von Mikroreaktoren wird in eine Aufnahme eines Tablars (4) eines Rotations- Schüttler (5, 6) eingesetzt. Der Rotations-Schüttler (5,6) erreicht eine maximale Schüttelfrequenz von beispielsweise 500-2000 Upm. Der Schütteldurchmesser des Rotations- Schüttlers ist auf das Erfassungsverfahren abgestimmt.
Über eine Sensoroptik (17) wird elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge von 200nm-25μm durch den Ausschnitt (11) des Tablars (4) in die für die Strahlung durchlässigen Wells der Mikrotiterplatte (1) eingeleitet und die von den Wells ausgehende Strahlung von der Sensoroptik (17) erfasst.
Abbildung 1A zeigt eine Ausfuhrungsform mit einem stehenden Rotations-Schüttler (5) , bei dem die die Mikrotiterplatte (1) tragende Teilfläche des Tablars (4) über den Antrieb hinaus ragt. Damit wird ein freier Zugang der an einer X/Y-
Positioniereinheit (7) angeordneten Sensoroptik (17) zu der Mikrotiterplatte (1) von deren Unterseite gewährleistet.
/Abbildung 1 B zeigt eine Ausfuhrungsform mit einem Tablar (4) , das von einem hängenden Rotations-Schüttler (6) angetrieben wird. Der die Mikrotiterplatte (1) tragende Teil des Tablars (4) braucht bei dieser Ausfuhrungsform nur dann über den Rotations-Schüttler (6) hinausragen, wenn die Wells auch von oben zugänglich sein sollen
Abbildung 1 C zeigt eine Ausfuhrungsform bei der die Mikrotiterplatte (1) von einem Schüttelgestell (16) mit einem Ausschnitt (11) aufgenommen wird. Das Schüttelgestell (16) beabstandet die Mikrotiterplatte (1) in vertikaler Richtung von dem ebenen Tablar (4) . Aufgrund der seitlich offenen Ausführung des Schüttelgestells (16) kann die Sensoroptik (17) mittels der X/Y-Positioniereinheit (7) ungehindert von der Seite unter jedes Well in der Mikrotiterplatte verfahren werden. Abbildungen 2A, 2B zeigen Vorrichtungen, bei denen die elektromagnetische Strahlung der Strahlungsquelle und die von den Reaktionsflüssigkeiten ausgehende Strahlung über Lichtwellenleiter (2,25) geführt wird.
Die Variante nach Abbildung 2 A zeigt eine getrennte Strahlungsführung über zwei Lichtwellenleiter (2) . Die Einleitung der Strahlung erfolgt über ein zum Reaktor hin führenden Lichtwellenleiter (2) und die Führung der von dem Mikroreaktor ausgehenden Strahlung über einen vom
Mikroreaktor wegführenden Lichtwellenleiter (2) . In einem Lesegerät (3) befindet sich eine die Sensoroptik speisende Strahlungsquelle und ein Sensor.
Die Variante nach Abbildung 2 B unterscheidet sich von der
Variante nach Abbildung 2 A lediglich darin, dass die beiden Lichtwellenleiter (2) in einem Y-Lichtwellenleiter (25) vereint sind. Die Lichtwellenleiter bestehen aus einzelnen Lichtfasern oder aber auch aus Lichtfaserbündeln. In dem Lesegerät (3) befindet sich die die Sensoroptik speisende Strahlungsquelle und der Sensor.
Abbildung 2 C zeigt eine Sensoroptik (17) ohne Lichtwellenleiter. Die Strahlungsquelle (12) und der Sensor (15) befinden sich unmittelbar in der Sensoroptik (17) , die zusätzlich Filter 13, 14 im Strahlengang aufweisen kann. Das Anregungslicht der Strahlungsquelle (12) wird direkt auf jeden einzelnen Mikroreaktor ausgerichtet, während die reaktionsabhängige, von der Reaktionsflüssigkeit in dem Mikroreaktor ausgehende Strahlung auf den Sensor (15) trifft. Die Sensoroptik (17) ist über Kabel (26) zur Versorgung der Strahlungsquelle (12) sowie zur Signalübertragung der Sensorsignale mit einer elektronischen Schaltung (9) verbunden. Die Schaltung (9) steuert die Strahlungsquelle (12) und dient dem Auslesen der Sensorsignale. Die
Datenerfassung und Auswertung übernimmt in allen Varianten eine Datenverarbeitungseinheit, beispielsweise ein Computer (8) . Die Funktionalität der elektronischen Schaltung (9) ist bei den Varianten nach den Abbildungen 2 A, B in das Lesegerät (3) integriert. Die Sensoroptik (17) ist in allen Varianten an dem Arm einer X-Y-Positioniereinheit (7) befestigt. Die Ansteuerung der X-Y- Positioniereinheit (7) erfolgt ebenfalls durch den Computer (8) mit einer Steuer- Software.
Je nach Anforderung an die Messaufgabe ist es möglich elektromagnetische Strahlung mit eng eingegrenztem Wellenlängenbereich, beispielsweise erzeugt über optische Filter 13, Beugungsgitter, Prismen oder direkt durch eine Strahlungsquelle mit definiertem Spektrum, wie einem Laser oder einer LED, einzustrahlen und aus dem abgestrahlten Licht nur bestimmte Wellenlängen dem Sensor zuzuführen. Für diesen Zweck kann das abgestrahlte Licht ebenfalls über optische Filter (14) , Beugungsgitter oder Prismen gefiltert werden.
Bei der Verwendung einer Blitzlampe zur Anregung der Analyten in der Reaktionsflüssigkeit eines Mikroreaktors ist es vorteilhaft, wenn die Schütteldrehzahl des Rotations- Schüttlers (5,6) und die Pulsfrequenz der Blitzlampe so abgestimmt sind, dass keine Schwebezustände auftreten. Schwebzustände treten auf, wenn die Lichtblitze auf wenigen Positionen des Reaktorbodens auftreffen und die Positionen wegen fehlender Synchronisation von Schüttler- und Blitzfrequenz auf dem Reaktorboden wandern. Der in Abbildung 4 dargestellte, von einem kreiszylindrischen Boden (10) und einem Zylindermantel (19) begrenzte, Mikroreaktor rotiert mit einem festen Schütteldurchmesser über einem ortsfesten Lichtstrahl (18) der Sensoroptik (17) . Durch die Rotation des Mikroreaktors beschreibt der Lichtstrahl (18) eine Kreislinie (31) auf dem Boden (10) des Mikroreaktors (s. Abbildungen 3A und 3B) . In Abbildung 3A ist durch die Wahl der Schütteldrehzahl (n) und der Blitzfrequenz (fB) der Blitzlampe ein Zustand dargestellt, bei dem nur 3 Blitze über den Umfang der Kreislinie (31) verteilt sind. Hier ist fB =3*n, so dass nur 3 Blitze pro Umdrehung ausgelöst werden. Insbesondere, wenn die Blitzfrequenz (fB) ein natürliches Vielfaches der Schütteldrehzahl (n) ist, treten Schwebezustände auf. Dabei setzen die Lichtblitze zunächst an den gleichen Positionen (32) auf der Kreislinie (31) ein. Bei zu geringer Abdeckung der Kreislinie (31) mit Blitzen (<4 Blitze/Kreislinie) und nicht synchronisiertem Blitzeinsatz mit der
Flüssigkeitsbewegung im Reaktor wandern die Positionen (32) im Uhrzeigersinn oder Gegenuhrzeigersinn auf der Kreislinie (31) . Dadurch kommt es auf Grund des Winkels (22) der Sensoroptik (17) zu veränderlichen Intensitäten der vom
Mikroreaktor ausgestrahlten elektromagnetischen Strahlung und es kann daher zu unvorteilhaften Schwingungen des Mess- Signa1s kommen.
Zur Vermeidung von Schwebezuständen ist daher eine größere
Zahl von Lichtblitzen anzustreben, die gleichmäßig über die Kreislinie (31) verteilt sind. Dies lässt sich erreichen, wenn fB = N*n (mit N= natürliche Zahl) erfüllt ist. In Abbildung 3B ist hierfür ein Beispiel dargestellt. Über den Umfang der Kreislinie (31) sind 13 Lichtblitze abgebildet. Die Lichtblitze können bei einer, jedoch auch bei mehreren Umdrehungen des Rotations-Schüttlers abgestrahlt werden. Durch die Beziehung n=fB*P/U (mit P= Anzahl der Blitze auf der Kreislinie und U= Anzahl der Umdrehungen bis P erreicht wird) werden die Betriebsbedingungen so eingestellt, dass möglichst eine hohe Anzahl von Blitzen (P > 10) über den Umfang der Kreislinie verteilt wird. Somit lässt sich ein stabiles und homogenes Sensorsignal zur Erfassung der Prozessparameter in dem Mikroreaktor gewinnen. Eine weitere Möglichkeit das Sensorsignal zu stabilisieren besteht darin, die Blitze der Strahlungsquelle mit dem Schüttelantrieb und damit auch der Flüssigkeitsbewegung in den Mikroreaktoren zu synchronisieren. Mit Hilfe eines Positionsgebers (z.B. einer Lichtschranke, eines
Beschleunigungssensors oder eines Hallsensors) kann zu jeder Zeit die Position des Tablars (4) zur Sensoroptik (17) bestimmt werden. Unter Berücksichtigung der Positionsinformation werden die Lichtblitze der Blitzlampe ausgelöst. Der Blitz wird vorzugsweise dann ausgelöst, wenn die in Zentrifugalbeschleunigungsrichtung schwappende Reaktionsflüssigkeit sich oberhalb der Sensoroptik (17) befindet. Hierdurch wird verhindert, dass der Lichtstrahl (18) in Zonen des Mikroreaktors fällt, in denen sich zeitweilig aufgrund der Zentrifugalbeschleunigung keine oder sehr wenig Reaktionsflüssigkeit befindet.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Erfassung der Prozessparameter von Reaktionsflüssigkeiten in zwei unterschiedlichen Varianten mit einer Vorrichtung nach Abb. 2 näher erläutert .
Abbildung 4 illustriert ein Verfahren zur aufeinanderfolgenden Erfassung der Werte von Prozessparametern in jeweils lediglich einem Mikroreaktor mit anschließendem Verfahren der Sensoroptik (17) mittels der Positioniereinheit (7) .
Die Sensoroptik (17) wird unter einem Mikroreaktor derart ausgerichtet, dass die elektromagnetische Strahlung mit einer Wellenlänge zwischen 200nm-25μm in Form des Lichtstrahls (18) bei der Erfassung einzelner Messwerte während der Reaktion ausschließlich in diesen Mikroreaktor eingeleitet wird. Bei Verwendung eines zylindrischen Mikroreaktors mit kreiszylindrischem Boden (10) wird der Schütteldurchmesser (27) des Rotations-Schüttlers (5 oder 6) um die Exzenter- Achse (21) (siehe Abb. 4) so gewählt, dass der Lichtstrahl (18) der Sensoroptik (17) nur auf den Boden (10) eines der Mikroreaktoren auftrifft. Dazu muss der Schütteldurchmesser (27) kleiner oder gleich dem Durchmesser (28) des Bodens (10) gewählt werden.
Zur Beschleunigung der Erfassung ist es bei schnell ablaufenden Reaktionen möglich, Gruppen von Mikroreaktoren eines Mikroreaktorarrays zusammenzufassen, wobei die Prozessparameter der einzelnen Gruppen nacheinander erfasst werden, jedoch die Prozessparameter in den Mikroreaktoren einer Gruppe gleichzeitig von einer Sensoroptik (17) für jeden Mikroreaktor der Gruppe erfasst werden. Die Sensoroptiken zur gleichzeitigen Erfassung innerhalb einer Gruppe sind an der Positioniereinheit (7) angeordnet. Nach der gleichzeitigen Erfassung der Prozessparameter in den Mikroreaktoren einer Gruppe werden die Sensoroptiken zur nächsten Gruppe verfahren. Die Sensoroptiken für eine Gruppe werden unter den Mikroreaktoren der Gruppe derart ausgerichtet, dass die elektromagnetische Strahlung jeder Sensoroptik bei der Erfassung einzelner Messwerte ausschließlich in den Mikroreaktor eingeleitet wird, unter dem sich die Sensoroptik gerade befindet.
Um Signalüberflutung des Sensors, beispielsweise eines Photodetektors, durch Lichtreflexionen des Anregungslichts am Boden (10) zu vermeiden, wird jede Sensoroptik derart zu jedem Mikroreaktor ausgerichtet, dass keine von den Wänden, insbesondere dem Boden (10) des Mikroreaktors reflektierte elektromagnetische Strahlung auf den Sensor trifft. Zu diesem Zweck wird das als Sensoroptik (17) dienende Lichtwellenleiterende in einem spitzen Winkel (22) zur einer Orthogonalen auf dem Boden (10) des Mikroreaktors angestellt. Abhängig von der Numerischen Appertur des Lichtwellenleiters ergeben sich unterschiedliche optimale Anstellwinkel (22) , die vorzugsweise zwischen 25° bis 40° liegen. Anstelle der aufeinanderfolgenden Erfassung der Prozessparameter ist es jedoch auch möglich, die Prozessparameter in sämtlichen Mikroreaktoren gleichzeitig von einer Sensoroptik für jeden Mikroreaktor zu erfassen. Die Sensoroptiken werden unter den Mikroreaktoren derart ausgerichtet, dass die elektromagnetische Strahlung (200nm- 25μm) in Form des Lichtstrahls (18) bei der Erfassung der Messwerte während der Reaktion ausschließlich in den der Sensoroptik zugeordneten Mikroreaktor eingeleitet wird.
Abbildung 5 illustriert ein Verfahren zur aufeinanderfolgenden Erfassung der Prozessparameter in vier benachbart zueinander angeordneten Mikroreaktoren. Die Prozessparameter der Mikroreaktoren werden aufgrund der kreisförmigen Relativbewegung zu der nicht bewegten
Sensoroptik (17) nacheinander von dieser Sensoroptik (17) erfasst . Die elektromagnetische Strahlung der Sensoroptik (17) wird während der Erfassung der Prozessparameter in einem der vier Mikroreaktoren ausschließlich in diesen Mikroreaktor eingeleitet. Die von der Reaktionsflüssigkeit ausgehende Strahlung trifft ausschließlich auf den Sensor der Sensoroptik (17) . Eine gleichzeitige Einstrahlung in zwei benachbarte Mikroreaktoren wird aufgrund der Anordnung der Sensoroptik (17) zum Boden (10) der Mikroreaktoren vermieden.
Die Sensoroptik (17) ist auf einen der vier Mikroreaktoren ausgerichtet. Wählt man bei der dargestellten Verteilung der Mikroreaktoren auf dem Tablar (4) den Schütteldurchmesser gleich dem diagonalen Abstand der Mittelpunkte der Mikroreaktoren, so kreisen die 4 Mikroreaktoren während einer Umdrehung nacheinander über den Lichtstrahl (18) der Sensoroptik (17) . Die Mikroreaktoren bewegen sich in der Reihenfolge I-IV über die Sensoroptik (17) , wobei der während der Erfassung ortsfeste Lichtstrahl (18) eine Kreislinie (23) beschreibt. Die Sensorsignale, die von den einzelnen
Mikroreaktoren hervorgerufen werden, werden mit dem hier nicht dargestellten Computer (8) aufgezeichnet. Im Rahmen der Auswertung der Sensorsignale erfolgt eine Zuordnung zwischen den Sensorsignalen und den Mikroreaktoren, von denen die für die Sensorsignale verantwortliche elektromagnetische Strahlung ausgeht . Die für die Zuordnung erforderliche Information über die Position des Mikroreaktors kann beispielsweise mittels eines an dem Rotations-Schüttler (5,6) angeordneten Positionsgebers (z.B. einer Lichtschranke, eines Beschleunigungssensors oder eines Hallsensors) erfasst werden.
Umfasst die Mikrotiterplatte (1) mehr als die vier in Abb. 5 dargestellten Mikroreaktoren, wird die Sensoroptik (17) nach der Erfassung der Prozessparameter der ersten Gruppe von vier Mikroreaktoren von der Positioniereinheit (7) zu einer nächsten, benachbarten Gruppe übereinstimmend zueinander angeordneter Mikroreaktoren mit vier Mikroreaktoren verfahren. Eine Anstellungswinkel der Sensoroptik (17) mit einem Winkel (22) zwischen 25°-40° zu den Böden (10) der Mikroreaktoren erweist sich auch bei diesem Verfahren als vorteilhaft .
Mit dem prinzipiell an Hand von Abb. 5 erläuterten Verfahren ist es jedoch auch möglich die Prozessparameter einer höheren Anzahl (>4) von Mikroreaktoren je Gruppe zu erfassen. Der Schütteldurchmesser (27) ist dann so zu wählen, dass die Mikroreaktoren einen Kreis über die ortsfeste Sensoroptik beschreiben, bei dem während einer Umdrehung mehr als vier Mikroreaktoren nacheinander erfasst werden.
Zur Beschleunigung der Erfassung, ist es bei einem Verfahren nach Abb. 5 oder Abb. 6 C möglich, die Prozessparameter mehrerer Gruppen benachbart zueinander angeordneter Mikroreaktoren mit jeweils einer Sensoroptik für jede Gruppe parallel zu erfassen. Erfindungsgemäß können die Reaktionsflüssigkeiten in den Mikroreaktoren wenigstens ein chemisches Sensormaterial aufweisen, das vorzugsweise an wenigstens einer Innenwand des Mikroreaktors, beispielsweise dem Boden (10) angebracht ist Derartige chemische Sensoren sind beispielsweise Fluoreszenz- Farbstoffe, die als Indikatoren von Prozessparametern wie pH, T, p02, und pC02 fungieren. In gelöster Form können die Fluoreszenz-Farbstoffe zur Bestimmung der Prozessparameter mit den anhand der Abbildungen 1-5 beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren verwendet werden. Werden die Fluoreszenz-Farbstoffe an den Innenwänden als sensitive Schichten (38,39) immobilisiert, bedarf es einer speziellen Ausrichtung der Sensoroptik (17) , wie sie beispielhaft in Abbildung 6 A-B für das Messverfahren nach Abb. 4 dargestellt ist.
Dabei können mehrere sensitive Schichten (38, 39) so am Boden (10) des Mikroreaktors angeordnet werden, dass unterschiedliche Prozessparameter erfasst werden können. Ein Ausschnitt des transparenten Bodens (10) wird frei gelassen, damit der Lichtstrahl (18) auch ungehindert in das
Flüssigkeitsvolumen eintreten kann. Nach Abb. 6 A ist die
Ausrichtung der Sensoroptik' (17) und der Schütteldurchmesser (27) so zu bestimmen, dass der Lichtstrahl (18) bei einer Umdrehung des Tablars (4) stets auf die sensitive Schicht 38,
39 oder den Auschnitt zwischen diesen trifft (Schütteldurchmesser (27) < [Reaktordurchmesser (28) / (Anzahl der sensitiven Schichten (N)+l) - Länge einer sensitiven Schicht (41) ] ) . Mit der Länge einer sensitiven Schicht ist hier, wie in 41 dargestellt, gemeint, das längste geometrische Abmaß eines sensitiven Schicht (38, 39) Daraus folgt für die Erfassung der Messwerte, dass die Sensoroptik (17) mit Hilfe der XY-Positioniereinheit (7) unterschiedliche
Positionen 35, 36 und 37 unterhalb des Bodens (10) des Mikroreaktors anfährt, um verschiedene Prozessparameter zu erfassen. Pos. 35 dient der Erfassung der Eigenfluoreszenz oder des Streulichts der Reaktionsflüssigkeit, während die Positionen 36, 37 der Erfassung der Abstrahlung von den unterschiedlichen sensitiven Schichten 38, 39 dienen.
In der Variante nach Abb. 6 B werden die unterschiedlichen Prozessparameter in einem Mikroreaktor erfasst, ohne die Position der Sensoroptik zwischen zwei Erfassungsvorgangen zu verändern. Hierbei trifft der Lichtstrahl (18) auf einer Kreisbahn nacheinander auf die am Boden immobilisierten sensitiven Schichten (38,39). Ein Teil der Bodenfläche ist frei, um eine direkte Einstrahlung in die
Reaktionsflüssigkeit zu ermöglichen, die für die Erfassung bestimmter Prozessparameter erforderlich ist, wie z.B. die Streulicht-Intensität oder Eigen-Fluoreszenz der Reaktionsflüssigkeit. Die Zuordnung der unterschiedlichen Sensorsignale über die Rotation des Mikroreaktors erfolgt über einen nicht dargestellten Positionsgeber.
In der Variante nach Abb. 6 C sind die sensitiven Schichten (38,39) in den Mikroreaktoren so angebracht, dass mehrere
Mikroreaktoren während einer Umdrehung des Tablars von dem Lichtstrahl (18) nacheinander erfasst werden. Die von der Sensoroptik (17) überstrichenen Fläche (40) erfasst vier Mikroreaktoren und unterschiedliche Prozessparameter, die nach der Erfassung der Signale den einzelnen Mikroreaktoren zugeordnet werden müssen. Dieses geschieht auch hier mit einem Positionsgeber. Umfasst das Mikroreaktorarray mehr als die vier dargestellten Mikroreaktoren, wird die Sensoroptik nach der Erfassung der Prozessparameter der ersten Gruppe von vier Mikroreaktoren von der Positioniereinheit (7) zu weiteren Gruppen benachbart zueinander angeordneter Mikroreaktoren mit jeweils vier Mikroreaktoren verfahren.
Beim Einsatz von Mikroreaktoren zur Kultivierung von Mikroorganismen weisen diese vorzugsweise eine obere Öffnung auf, die während des Betriebs mit einer gasdurchlässigen Abdeckung abgedeckt ist, beispielsweise in Form einer selbstklebenden Membran. Diese Membran erlaubt einen monoseptisehen Betrieb der Mikroreaktoren. Die in der Reaktionsflüssigkeit ablaufende Reaktion wird mit der nötigen gasförmigen Reaktionskomponente versorgt, jedoch nicht durch gasförmige Reaktionsprodukte behindert.
Als Beispiel einer Erfassung von Prozessparametern, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ermittelt wurden, sind in Abbildung 7 Messkurven einer Kultur von Hansenula polymorpha wt in 2xYP-Medium (Yeast-Peptone) mit lOg/L Glycerin bei einer Temperatur von 27°C dargestellt. Beobachtet wurden die Prozessparameter relative Streulicht-Intensität (bei 620nm) und die relative NADH-Fluoreszenz (Anregung bei 340nm, Emission bei 460nm) der Kultur über die Dauer der Reaktion. Die Erfassung der einzelnen Prozessparameter wurde mit einem Y-Lichtwellenleiter bei einem Anstellwinkel von 30° und 1 mm Abstand vom Mikrotiterplattenboden durchgeführt. Die Schüttelfrequenz entsprach dabei 995 1/min und der Schütteldurchmesser (27) war 3 mm. Die Reaktion wurde mit einer konventionellen 48-Well Mikrotiterplatte (Greiner Bio- one, Frickenhausen, Art. -Nr.: 677 102) und 600 μl Füllvolumen durchgeführt. Zur Abdeckung der 48-Well Mikrotiterplatte diente eine gasdurchlässige Klebefolie als Abdeckung (Abgene, Hamburg, Art. -Nr.: AB-0718) .
Bezugszeichenliste
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Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Erfassung von Prozessparametern von Reaktions lüssigkeiten in mehreren Mikroreaktoren (10,19), die zumindest bis zur Beendigung der Reaktion in sämtlichen Mikroreaktoren kontinuierlich geschüttelt werden, wobei die Prozessparameter in den Mikroreaktoren während der Reaktion unter kontinuierlichem Schütteln mit Hilfe mindestens einer Sensoroptik (17) erfasst werden, die jeweils einem Sensor (15) und eine Strahlungsquelle (12) aufweist, wobei elektromagnetische Strahlung von der <_, Strahlungsquelle (12) nacheinander in die Reaktionsflüssigkeit der Mikroreaktoren eingeleitet wird und der der Strahlungsquelle zugeordnete Sensor (15) von der Reaktionsflüssigkeit des Mikroreaktors ausgehende elektromagnetische Strahlung erfasst, wobei jede Sensoroptik (17) zumindest während der Erfassung der Prozessparameter nicht bewegt wird, so dass die geschüttelten Mikroreaktoren (10, 19) sich relativ zu jeder Sensoroptik bewegen, und wobei die von jedem Mikroreaktor in Folge der eingeleiteten elektromagnetischen Strahlung ausgehende elektromagnetische Strahlung ausschließlich von dem der einleitenden Strahlungsquelle (12) zugeordneten Sensor (15) der Sensoroptik (17) erfasst wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessparameter in den einzelnen Mikroreaktoren (10, 19) nacheinander von einer an einer Positioniereinheit (7) angeordneten Sensoroptik (17) erfasst werden und die Sensoroptik nach der Erfassung der Prozessparameter in einem der Mikroreaktoren von der Positioniereinheit (7) zu einem anderen Mikroreaktor verfahren wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessparameter in mehreren Mikroreaktoren (10, 19) mit mehreren Sensoroptiken (17) gleichzeitig erfasst werden .
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3 , dadurch gekennzeichnet dass - das ein Mikroreaktorarray (1) mehrere Gruppen von Mikroreaktoren (10, 19) aufweist, wobei die Prozessparameter der Gruppen nacheinander erfasst werden, während die Prozessparameter in den Mikroreaktoren einer Gruppe gleichzeitig von einer Sensoroptik (17) für jeden Mikroreaktor der Gruppe erfasst werden und die an einer Positioniereinheit (17) angeordneten Sensoroptiken nach der gleichzeitigen Erfassung der Prozessparameter in den Mikroreaktoren einer Gruppe von der Positioniereinheit zu einer anderen Gruppe verfahren werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessparameter mindestens einer Gruppe benachbart zueinander angeordneter Mikroreaktoren aufgrund deren Relativbewegung (23) zu einer nicht bewegten Sensoroptik (17) nacheinander von dieser Sensoroptik erfasst werden im Rahmen einer Auswertung der Sensorsignale eine Zuordnung zwischen den Sensorsignalen und den Mikroreaktoren (10, 19) erfolgt, von denen die elektromagnetische Strahlung ausgeht und - die Sensoroptik (17) nach der Erfassung der Prozessparameter einer Gruppe (I - IV) von Mikroreaktoren gegebenenfalls von einer Positioniereinheit (7) zu weiteren Gruppen (I- IV) benachbart zueinander angeordneten Mikroreaktoren (10, 19) erfahren wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Prozessparameter mehrerer Gruppen benachbart zueinander angeordneter Mikroreaktoren mit jeweils einer Sensoroptik für jede Gruppe parallel erfasst werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Strahlungsquelle (12) der Sensoroptik (17) eine Blitzlampe verwendet wird, deren Pulsfrequenz auf die Schüttelbewegung (27) derart abgestimmt wird, dass die Lichtblitze an mindestens vier unterschiedlichen Stellen (32) auf den Mikroreaktor (10, 19) treffen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Strahlungsquelle (12) der Sensoroptik (17) eine Blitzlampe verwendet wird, deren Pulsfrequenz auf die Schüttelbewegung (27) derart abgestimmt wird, dass die Lichtblitze während der Schüttelbewegung stets an derselben Stelle auf den Mikroreaktor (10, 19) treffen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Strahlung jeder Strahlungsquelle (12) und/oder die von den Reaktionsflüssigkeiten ausgehende Strahlung über Lichtwellenleiter (2, 25) geführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das jede Sensoroptik (17) derart zu jedem Mikroreaktor (10, 19) ausgerichtet wird, dass keine von den Wänden des Mikroreaktors reflektierte elektromagnetische Strahlung auf den Sensor (15) trifft.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsflüssigkeiten in den Mikroreaktoren wenigstens ein chemisches Sensormaterial aufweisen.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das chemische Sensormaterial (38, 39) an wenigstens einer Innenfläche (10) des Mikroreaktors angebracht ist.
13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch - eine mit einer Schütteleinrichtung (5, 6) verbundene Mikroreaktor-Plattform (4) mit mindestens zwei Mikroreaktoren (10, 19) , die zumindest teilweise durchlässig für elektromagnetische Strahlung sind, mindestens eine von der Schüttelbewegung (27) der Mikroreaktor-Plattform (4) entkoppelte Sensqroptik (17) , die jeweils einem Sensor (15) und eine Strahlungsquelle (12) aufweist, wobei die Strahlungsquelle (12) elektromagnetische Strahlung in die Reaktionsflüssigkeit der Mikroreaktoren einleitet und der der Strahlungsquelle zugeordnete Sensor (15) von der Reaktionsflüssigkeit der Mikroreaktoren ausgehende elektromagnetische Strahlung erfasst sowie eine Datenverarbeitungseinheit (8, 9) zur Erfassung und Auswertung der Sensorsignale.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass jede Sensoroptik (17) an einer Positioniereinheit (7) befestigt ist, die gegenüber der Mikroreaktor- Plattform (4) ortsfest gelagert ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14 , dadurch gekennzeichnet, dass - die ebene Mikroreaktor-Plattform (4) im Bereich der Bodenflächen (10) der Mikroreaktoren (10, 19) zumindest teilweise durchlässig für elektromagnetische Strahlung ist und jede Sensoroptik (17) mittels der Positioniereinheit (7) unter die Bodenflächen (10) der Mikroreaktoren verfahrbar ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13-15, dadurch gekennzeichnet, dass die Schüttelvorrichtung (5,6) ein Rotations-Schüttler ist und die ebene Mikroreaktor- Plattform (4) ein Tablar mit einer Aufnahme ist, in die ein Mikroreaktorarray (1) eingesetzt ist.
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