WO2005094570A1 - 不飽和脂肪酸含量の増加したトランスジェニック魚類 - Google Patents

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desaturase gene
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Toshiro Takeuchi
Shuichi Sato
Viswanath Kiron
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Definitions

  • the present invention relates to fish whose unsaturated fatty acid content has been increased by introducing a fatty acid desaturase gene, and a method of producing these fish having an increased unsaturated fatty acid content.
  • n-3 polyunsaturated fatty acids (HUFA), especially eicosapentaenoic acid ( ⁇ , 20: 5 ⁇ -3), and docosahexaenoic acid (DHA, 22: 6 ⁇ -3) )
  • HUFA n-3 polyunsaturated fatty acids
  • ⁇ , 20: 5 ⁇ -3 eicosapentaenoic acid
  • DHA docosahexaenoic acid
  • transgenic fish can be produced by methods such as particle cancer irradiation (see, for example, Non-Patent Document 29). While all of these methods have facilitated transgene delivery in some fish species, appropriate methods must be selected for each species (see, eg, Non-Patent Document 22). In order to improve the growth rate, disease resistance, and adaptability to extreme environmental conditions, the application of transgenic technology has been established by fish species (for example, see Non-Patent Documents 21 and 30).
  • Non-Patent Document 32 The function of rHKII and hGluTl No direct evidence has been observed (eg, see Non-Patent Document 32).
  • a ⁇ 6-unsaturated enzyme-like gene isolated from yamame salmon (Oncorhynchus masou) was introduced into zebrafish to modify the fatty acid biosynthetic pathway.
  • This ⁇ 6 desaturase gene is generally considered to be the rate-limiting step in HUFA biosynthesis, so it was reported that it was the first target, and only ⁇ (eg, non- See Patent Documents 33 and 34).
  • Non-Patent Document 1 Am. J. Clin. Nutr., 54: 438-463, 1991
  • Non-Patent Document 2 Nutrition, 16: 143-145, 2000
  • Non-Patent Document 3 Nutrition, 16: 680-684, 2000
  • Non-Patent Document 4 Prog. Lipid Res, 40: 1-94, 2001
  • Non-Patent Document 5 Nutrition, 18: 178-188, 2002.
  • Non-Patent Document 6 Proc.Nutr. Soc, 58: 377-383, 1999
  • Non-Patent Document 7 Aquaculture (In Press). 2002
  • Non-Patent Document 8 J. World Aquacult.Soc, 24: 152-161, 1993
  • Non-Patent Document 9 J. Appl.IchthyoL, 11: 183-198, 1995
  • Non-Patent Document 10 Aquaculture, 179: 217-229, 1999
  • Non-patent literature ll Aquaculture, 200: 203-222, 2001
  • Non-Patent Document 12 Biochim.Biophys.Acta, 1299: 235-244, 1996.
  • Non-Patent Document 13 Prog.Lipid Res., 37: 73-117, 1998.
  • Non-Patent Document 14 Biochim.Biophys.Acta, 1486: 219-231, 2000
  • Non-Patent Document 15 Biochem.Physiol, 116B: 263-267, 1997
  • Non-Patent Document 16 FEBS Letters, 431: 1-6, 1998
  • Non-Patent Document 17 Biochim.Biophys.Acta, 1486: 219-231, 2000.
  • Non-Patent Document 18 J. Biol. Chem., 276: 31561-31566
  • Non-Patent Document 19 Transgenic Res., 9: 305-320, 2000.
  • Non-Patent Document 20 Biochemistry and molecular biology of fishes, vol.2., Pp:
  • Non-Patent Document 21 Aquaculture, 197: 191-204, 2001
  • Non-Patent Document 22 Suisanzoshoku, 49: 137-142, 2001
  • Non-Patent Document 23 Cell Differen., 19: 237-244, 1986.
  • Non-Patent Document 24 Aquaculture, 51: 143-150, 1986
  • Non-Patent Document 25 Mol.Mar.Biol.BiotechnoL, 1: 301-308, 1992
  • Non-Patent Document 26 Aquaculture, 173: 297-307, 1999
  • Non-Patent Document 27 Science, 265: 666-668, 1994a
  • Non-patent Document 28 Pro Natl.Acad.Sci. USA., 93: 7777-7782, 1996.
  • Non-Patent Document 29 FEBS Letters, 287: 118-120, 1991.
  • Non-patent document 30 Aquaculture, 204: 255-269, 2002
  • Non-Patent Document 31 Biochem.Biophys.Res.Commun., 223: 650-653, 1996.
  • Non-patent document 32 Aquaculture, 173: 319-332, 1999a
  • Non-Patent Document 33 Prog.Lipid Res., 20: 13-22, 1981.
  • Non-Patent Document 34 J. Biol. Chem., 274: 471-477, 1999
  • transgenic animals having an increased amount of unsaturated fatty acid in the animals for example, see Patent Document 1
  • Anacystis genus that desaturates the ⁇ 9 position of fatty acids bound to lipids A method for producing a higher plant cell into which a gene encoding a ⁇ 9 desaturase derived from an animal has been introduced (for example, see Patent Document 2), a ⁇ 5-fatty acid desaturase derived from an isolated animal and a functional part thereof ( For example, see Patent Document 3) and a method for producing stearidonic acid in plant seeds, the method comprising adding a promoter functional in plant seed cells, ⁇ 6-unsaturated to the plant genome.
  • Growing a plant that incorporates a DNA sequence that encodes the enzyme and a first DNA construct that contains a functional transcription termination region in the plant seed in the 5 ′ ⁇ 3 ′ transcription direction; Eg, see Patent Document 4).
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-245070
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 11 332408
  • Patent Document 3 JP-T-Hei 14 508932
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 14-517255
  • An object of the present invention is to modify the fatty acid metabolic pathway of fish to reduce the cost of using a fish oil containing EPA or DHA in a compound feed for marine fish. It can be used as a vegetable oil or tallow, which is easy to control in quality, and it can be used as a judge, which greatly contributes to the reduction of cost and labor at the seed and seedling production site, and has a high vitality, such as fish showing handling resistance, low temperature resistance, It is an object of the present invention to provide a production method, a fish containing a high level of DHA as a functional food, and a production method.
  • the present invention provides a method for producing a fish in which the content of unsaturated fatty acids is increased!], Which is encoded by a foreign gene to introduce a phenotype! Efficient transcription is one of the important factors (Hacket, 1993; Houdebine, 2000), so the first step is to select an appropriate construct that allows expression of the ⁇ 6 desaturase-like gene. did.
  • Danio rerio (Westerfield, 1995; Gong, 1999) is a teleostean zebrafish that has several advantages, including a relatively short generation time of a few months, a large number of eggs, and easy breeding. ) was selected as a model fish.
  • the present invention relates to (1) transgenic fish having an increased unsaturated fatty acid content due to expression of the fatty acid desaturase gene into which the fatty acid desaturase gene has been introduced, and (2) fatty acids.
  • the transgenic fish described in (1) or (2) above, wherein (4) the fatty acid desaturase gene is one of the following (A)-(F): The transgenic fish according to any one of (1) to (3) above, which is a gene having a nucleotide sequence.
  • (A) a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • (C) a base sequence consisting of an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding a protein having a fatty acid desaturase activity;
  • the present invention relates to the transgenic fish according to any one of the above (1) to (5).
  • the present invention not only can greatly contribute to the reduction of cost and labor at a seed and seedling production site, but also can produce larvae and larvae exhibiting high vigor, drowning resistance, and low temperature resistance.
  • fish oil containing EPA and DHA as a compound feed for vegetation, and vegetable oils or tallow, which are cheaper and easier to control in quality, can be used.
  • fish produced according to the present invention contain more DHA than normal individuals, the production of fish with added value as a health food using a closed-circulation onshore aquaculture system is carried out.
  • it has become a very useful research tool for elucidating the mechanism of fatty acid metabolism in fish at the molecular level, and has made an extremely significant contribution to the field. High,.
  • the transgenic fish of the present invention are particularly limited as long as they have a fatty acid desaturase gene introduced therein and have an increased unsaturated fatty acid content due to the expression of the fatty acid desaturase gene.
  • the origin of the above-mentioned fatty acid desaturase gene is not particularly limited, for example, animal origin, plant origin, etc., but ⁇ 4 fatty acid desaturase gene, ⁇ 5 fatty acid desaturase gene, ⁇ 6 fatty acid unsaturated gene
  • Fatty acid desaturase genes such as an enzyme gene can be suitably exemplified, and these can be used alone or in multiples.
  • the powerful ⁇ 4 fatty acid desaturase gene, ⁇ 5 fatty acid desaturase gene, and ⁇ 6 fatty acid desaturase gene also count the carbon (delta-end) power of the terminal carboxyl group of fatty acids, These unsaturated fatty acid desaturase genes, derived from freshwater fish and plankton, have an adverse effect on the normal development and function of fish.
  • a microalga-derived ⁇ 4 fatty acid desaturase gene (Tonon, ⁇ ., Harvey, D., Larson, ⁇ .R., and Graham, IA Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acid) acid ⁇ 4—desaturase from the microalga Pavlova lutheri.FEBS Lett. 553, 440-444 (2003).), and ⁇ 5 fatty acid desaturation from Atlantic salmon
  • the ⁇ 6 fatty acid desaturase gene that can be preferably used includes ( ⁇ ) a base encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (the amino acid sequence of legume-derived ⁇ 6 fatty acid desaturase). Sequence; ( ⁇ ) a base sequence comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and encoding the amino acid sequence having fatty acid desaturase activity (C) a base sequence encoding an amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and encoding an amino acid sequence having a fatty acid desaturase activity; No.
  • nucleotide sequence encoding a protein having fatty acid desaturase activity is not particularly limited as long as it is a gene consisting of any of the following nucleotide sequences; here, the “nucleotide sequence encoding a protein having a fatty acid desaturase activity” , A nucleotide sequence that encodes a protein that is involved in some way in the production of unsaturated fatty acids in fish, and the specific mechanism of action is not particularly limited.
  • amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added is, for example, 110, preferably 115, more preferably 110, and still more preferably 110 115 means an amino acid sequence in which an arbitrary number of 15 amino acids have been deleted, substituted or added.
  • base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added is, for example, 120, preferably 115, more preferably 110, and still more preferably 110. It means a nucleotide sequence in which an arbitrary number of 15 bases has been deleted, substituted or added.
  • a DNA (mutated DNA) comprising a base sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added is known to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering techniques, and mutagenesis.
  • Site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering techniques, is a technique that can introduce a specific mutation at a specific position, and is a powerful technique.
  • Molecular Cloning A laboratory Mannuai, 2nd Ed., Old Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.
  • amino acid sequence having at least 60% homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 means that the homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is 60% or more. Not particularly limited, for example, 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more. Means that.
  • the "base sequence that hybridizes under stringent conditions” refers to a nucleic acid such as DNA or RNA as a probe, which can be obtained by colony 'hybridization method, plaque hybridization method, Alternatively, it refers to a base sequence obtained by using the Southern blot hybridization method or the like.Specifically, it is determined by using a filter on which DNA derived from colonies or plaques or a fragment of the DNA is immobilized. 7-1. After performing the hybridization at 65 ° C in the presence of OM NaCl, 0.1 to 2 times the SSC solution (The composition of the 1x concentration SSC solution is 150 mM salt. And DNA that can be identified by washing the filter under the conditions of 65 ° C. using a sodium chloride solution (15 mM sodium citrate). Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, etc.
  • DNAs that can hybridize under stringent conditions include DNAs having a certain degree of homology with the base sequence of the DNA used as a probe, for example, 60% or more, preferably Is preferably 70% or more, more preferably 80% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, and most preferably 98% or more homologous DNA.
  • the method for obtaining or preparing the gene of the present invention is not particularly limited, and an appropriate probe based on the amino acid sequence or base sequence information shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 disclosed herein.
  • a primer can be prepared, and the target gene can be isolated by screening a cDNA library in which the gene is predicted to be present using the primer or primer, or can be prepared by chemical synthesis according to a conventional method.
  • a cDNA library is prepared from the beans from which the gene of the present invention has been isolated in accordance with a conventional method, and then an appropriate probe specific to the gene of the present invention is prepared from this library.
  • an appropriate probe specific to the gene of the present invention is prepared from this library.
  • the desired clone to obtain the gene of the present invention. it can.
  • the source of the above-mentioned cDNA include various cells or tissues derived from the above-mentioned plants, isolation of total RNA from these cells or tissues, isolation and purification of mRNA, acquisition of cDNA and its closing, etc. Can be carried out according to a conventional method.
  • Methods for screening the gene of the present invention as much as possible in a cDNA library include, for example, methods commonly used by those skilled in the art, such as the method described in Molecular Cloning, 2nd edition.
  • the mutant gene or homologous gene of the present invention comprising the base sequence shown in any of the above is the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof.
  • the DNA fragment can be isolated from other organisms or the like by screening the homologue of the DNA under appropriate conditions. Alternatively, it can be prepared by the above-described method for producing a mutant DNA.
  • the unsaturated fatty acid produced by the fatty acid desaturase expressed in the fish body varies depending on the type of the fatty acid desaturase used and the type of the fatty acid substrate, but docosahexaenoic acid ( DHA) and eicosapentaenoic acid (EPA) can be suitably exemplified.
  • DHA docosahexaenoic acid
  • EPA eicosapentaenoic acid
  • DHA 22: 6n-3) ⁇ EPA (20: 5n-3), LNA (18: 3n-3), OTA ( 18: 4n -3), ETA (20: 4n-3), DPA (22: 5n-3), TPA (24: 5n-3), THA (24: 6n-3), linoleic acid (18: 2n-3) 6), ⁇ -linolenic acid (18: 3n-6), eicosatrienoic acid (20: 3n-6), arachidonic acid (20: 4 ⁇ -6), docosapentaenoic acid (22: 5 ⁇ -6) and the like.
  • the fish of the present invention having an increased unsaturated fatty acid content may be any fish that expresses the introduced fatty acid desaturase gene and thereby increases the unsaturated fatty acid content in the body. It may have the fatty acid desaturase gene or may not have it at all, but it can be used in edible parts such as fish, muscle tissue, etc., which are targeted for aquaculture!
  • the preferred types of fish are those that preferentially increase the content of unsaturated fatty acids and those that stably express the fatty acid desaturase gene even in their offspring, such as teleost fish.
  • fish belonging to Cyprinidae, ichiidae, Salmonidae, Clariaae, bilundae ⁇ Ictaluridae are preferred.
  • yellowtail Seriola quinqueradiata
  • Maddy Pagrus major
  • Hyfume Paralichthys olivaceus
  • Tohnog Teakifugu ruonpes
  • Hyfuma Seriola aureovittata Penaeus shrimp (Penaeus japonicus)
  • Rainbow trout Oncorhyncus mykiss
  • Amberjack Seriola dumerili
  • Simaan Pseudocaranx dentex
  • Manota Epinephelus septemfasciatus, Thunnus thynnus fish, etc.
  • carp for example, Cyprinus carpio
  • zebrafish for example, zebrafish (Danino rerio), African catfish (Clarias ganepinus), Arahi (Oreochronis niloticus), and Pacific salmon (3 ⁇ 4aimo 3 ⁇ 4alar metastatic power (Oryzias latipes))
  • Arahi Oreochronis niloticus
  • Pacific salmon 3 ⁇ 4aimo 3 ⁇ 4alar metastatic power (Oryzias latipes)
  • promoters include the ⁇ -actin-mouth motor, adipocyteP2 (aP2) promoter, Mylz2 (Danio rerio myosin light polypeptide 2 skeletal muscle mylz2) promoter, UCP promoter, SV40 promoter, cytomegavirus promoter, and EF1 ⁇ promoter. Among them, medaka j8-actin promoter and mylz2 promoter are preferable in terms of expression efficiency.
  • a polyadenylase sequence such as a pest growth hormone polyadenylation sequence downstream of the fatty acid desaturase gene.
  • an intron sequence or a gene sequence that enhances the expression of a gene, or a sequence of a terminator that directs the termination of transcription can be used.
  • the constructed expression vector can be introduced into fish by microinjection into an oocyte or a fertilized egg, a virus vector infection method, a particle gun method, or an electoral poration method.
  • the transgenic fish of the present invention include, for convenience, an adult fish into which the fatty acid desaturase gene has been introduced, its progeny, a fertilized egg cell, a fish embryo cell, and the like.
  • ⁇ 6 desaturase-like cDNA was also isolated from pig bean liver power by PCR.
  • the two modified primers are forward and reverse, respectively.
  • PCR amplification was performed under the following conditions. 3 cycles of 94 ° C for 3 minutes, followed by 30 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 62 ° C for 30 seconds, 72. 1.5 minutes at C. Thereafter, the 1680 bp PCR amplification product was subcloned into a pGEM-T Easy vector (Promega).
  • the transgene was expressed using the 8.5 kb plasmid pActD6 (FIG. 1). That is, pGc / RSV (manufactured by Invitrogen) was treated with Xhol, and the pepsin growth hormone polyadenylation (BGH poly (A)) sequence was ligated to pBluescriptSK (+/-) (manufactured by Clontech). did. 3.
  • PCR amplification product was cloned into a pGEM-T Easy vector (Promega) and treated with Sail to obtain a ⁇ 6 desaturase-like gene fragment, which was used as a medaka ⁇ -actin promoter (m ⁇ - Actin) and BGHpoly (A) sequence to prepare pActD6 construct.
  • the cyclic DNA obtained in Example 3 was diluted to a concentration of 30 g / ml in a 0.1 M KC1Z0.15% tetramethyl-rhodamine dextran solution. Filter the DNA solution with an ultra-MC centrifugal filter. 22 u rn (MILLIPORE3 ⁇ 4: 3 ⁇ 4) T ⁇ 4. C for 5 minutes at 5000 rpm in a microfuge to remove contaminating particles. The 3— DNA was transferred to a clean coverslip and covered with a few drops of mineral oil to prevent evaporation.
  • the mold was placed on a 90 mm Petri dish, and about 30 ml of warm water, 3% agarose (prepared with distilled water) was poured into the plate. After the agarose had solidified at room temperature, the mold was removed and twelve grooves were created to support the embryo when the microinjection needle penetrated. The used plate was covered with plastic wrap and stored at 4 ° C until use.
  • Microinjection-One dollar was made from a micropipette puller (Narishige) (Fig. 2A) using a fine glass microinjection cab. Microphone mouth injection-The tip of a dollar was about 5-8 ⁇ m. The needle was mounted on the holder, and the needle was filled with mineral oil from the syringe by turning the micromanipulator clockwise through a fluoroplastic tube.
  • Example 7
  • the microinjection was carried out using a stereochemical microscope, a microinjector prepared in Example 6 during the microinjection process-a micromanipulator for controlling one dollar, and a magnetic stand (narishige company) attached to the micromanipulator for DNA loading. ), A plastic two-way stopper, a tube made of fluororesin (Narishige) and a microinjection plate.
  • a micromanipulator for DNA loading with a needle holder was attached to a magnetic stand fixed to a metal surface, the syringe was filled with 3 ml of mineral oil, and lmm fluorine was attached to a microinjection-dollar holder. ⁇ Directly attached to a two-way stopper fixed to a section of about 40 cm of the resin tube.
  • Example 4 On the day of the microinjection, at least 15 minutes before the lamp was turned on, 3 zos of zebrafish of Example 1 and 2 females were transferred from the aquarium to a 3 L rearing tank. Eggs were collected in petri dishes approximately 5 minutes after laying. The one-cell stage embryo was transferred to the groove of the microinjection plate prepared in Example 5 using a pipette. The scutellum was required to face $ 21 microinjection.
  • the DNA solution obtained in Example 4 was microinjected into the cytoplasm of a 1-cell embryo on a microinjection plate using the microinjection system of Example 7. Embryos into which DNA had been injected were stored at 28 ⁇ 1 ° C. Unfertilized and deformed eggs were removed 5-6 hours after fertilization. The next day, dead or deformed embryos were removed and healthy embryos were transferred to new U, Petri dishes.
  • PCR analysis was performed using 201 10X Ex Taq buffer, 200 ⁇ M dNTP, 0.125 U Ex Taq polymerase (Takara), 2 ⁇ l cDNA as template, and lpmol each as follows. It was performed under the conditions. 3 minutes at 94 ° C, then 30 seconds at 94 ° C, 6
  • Omar (5 and AGGACTGGCTCACCATGCAGTTGAGT-3 ′; SEQ ID NO: 8) was used as a forward primer for desaturylase, and the des-Omar (SEQ ID NO: 4) was used as a reverse primer.
  • ⁇ -actin gene expression was analyzed as an internal standard for the same amount of RNA load.
  • (5′-ACTACCTCATGAAGATCCTG-3 ′; SEQ ID NO: 9) was used as a forma primer of the j8-actin gene
  • reaction solution 21 of the reaction solution was isolated by electrophoresis on a 0.7% agarose gel, stained with a bromide solution, and photographed with ultraviolet irradiation.
  • the fluorescence intensity of each band was quantitatively determined by Densitograg ATTO). The construct showing the strongest expression was used to create a stable line.
  • F1 and F2 desaturase gene expression was analyzed by the method used for F0.
  • Total RNA was extracted from fins, liver, and muscle of one DNA-positive fish to identify foreign gene expression in F1.
  • F2 generation total RNA was also extracted for muscle and liver strength of at least 20 2-day-old fry and at least 10 adult fish.
  • DNA positive F0 was bred to adulthood. Mature F0 was crossed with non-transgenic zebrafish and at least 20 2-day-old juveniles obtained from the cross were accumulated to screen for germ-line transmitting fish. The germline-positive F0 was then used to create the F1 and F2 generations. The production and screening procedures for F1 and F2 are the same as those used for F0.
  • Total lipids were extracted from non-transgenic and transgenic fish containing the pig bean ⁇ 6 desaturase gene.
  • Non-transgenic and transgenic fish were kept in the same aquarium, and total fatty acids were extracted from the whole fish.
  • the extracted fatty acids were separated using a gas chromatography (Shimadzu 14B: Shimadzu) equipped with a hydrogen flame ionization detector and a capillary ram 30m X 0.32mm X 0.25m (Supelco).
  • Fatty acid methyl esters (FAME) were prepared from fatty acids by the method described in the literature (cited reference). Fatty acid methyl ester peaks were identified by gas chromatography measurements comparing the retention time with the appropriate FAME standard (Supelco).
  • Transient foreign gene expression was analyzed 8 hours after fertilization, and the transient expression of the foreign gene was analyzed using the cDNA synthesized from the injected embryo and extracted RNA.
  • the results showing the transient expression are shown in FIG. Figure 3 shows the results of identification of foreign gene expression in F1 extracted from fins, liver, and muscle of DNA-positive fish.
  • FIG. 3 also shows the results obtained under the same conditions except that the Mylz2 promoter was used instead of the medaka j8-actin promoter.
  • the medaka ⁇ -actin promoter and Expression of foreign genes was observed in fins and muscles using any of the Mylz2 promoters.
  • Transgenic individuals were screened by PCR amplification using genomic DNA from which fin force was also extracted using primers specific for the pig bean desaturase gene.
  • DNA-positive and non-transgenic fish were crossed, and the results are shown in Table 1 and FIG.
  • Table 1 109 out of 400 embryos injected with DNA became adult fish, of which 4 had the pActD6 gene construct in the embryo cells. These fish were used to create the F1 and F2 generations.
  • the transmission rate of foreign genes to the F1 generation varied between 4.2% and 44.1%, as shown in Table 2.
  • the F2 generation was created using F1 transgenic strains with higher mRNA transcript levels analyzed by RT-PCR.
  • Figure 5 shows the expression of a typical foreign gene in F1 fish. The transfer of the transgene to the F2 generation followed Mendelian segregation patterns. These results confirmed that each F1 transgenic line contained all diploid cell force transgenes.
  • Fatty acid methyl esters were prepared from the whole body of both non-transgenic and transgenic fish and analyzed by gas chromatography (GC). Table 3 shows the composition of n-3 fatty acids in the transgenic fish.
  • the production of EPA and DHA in transgenic fish expressing the pigeon desaturase gene is 1.4 ⁇ 0.1 times that of the corresponding non-transgenic fish, 86 ⁇ 0.03 mgZg vs 1.32 ⁇ 0.05 mgZg. ) And 2.1 ⁇ 0.2 times (4.62 ⁇ 0.22 mgZg vs 2.22 ⁇ 0.08 mg / g) (p ⁇ 0.05).
  • EPA and DHA production in edible parts is 75% and 78% of the total fish, respectively.
  • the numbers in parentheses indicate the ratio of each fatty acid in the total fatty acids.
  • Non-transgenic and transgenic fish were kept in the same aquarium. Total fatty acids were extracted from the whole fish with fatty acid methyl esters analyzed and quantified by GC. The numbers after the construct indicate individual transgenic strains.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of a desaturylase gene construct inserted into an expression vector used for producing fish having an increased unsaturated fatty acid content according to the present invention.
  • FIG. 2 is a RT-PCR diagram showing the results of transient expression of the desaturylase gene.
  • FIG. 3 is an RT-PCR diagram showing the expression results of the desaturylase gene in the fin, liver, and muscle of F1 generation cDNA.
  • FIG. 4 Accumulated fry power.
  • RT-PCR diagram showing a typical example of the results of screening for germline transmitters by PCR analysis using an extracted DNA template.
  • DNA was extracted from approximately 20 2-day-old juveniles obtained by crossing the DNA positive FO with non-transgenic individuals.
  • Lanes 16 PCR amplification products using genomic DNA samples from transgenic F0 individuals.
  • Lane C PCR amplification product using non-transgenic fish
  • Lane N PCR amplification product using no DNA template
  • Lane P Amplified pActD6 plasmid DNA (0.6 pg).
  • FIG. 5 is a diagram of PT-PCR showing the results of detecting transgene expression in different F1 generations. Total RNA also extracted tail fin tissue power. The numbers after the construct indicate individual transgenic lines.
  • Fig. 6 is a graph showing the content of unsaturated products in fishes of the present invention having increased unsaturated fatty acid content.

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Abstract

　種苗生産現場に於ける、コスト、労力の軽減に大きく貢献できるのみならず、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す仔稚魚を生産することができ、養殖海産魚用の配合飼料としてＥＰＡ、ＤＨＡを含む魚油を用いることを不要とし、より安価で品質管理も容易な植物性油脂を利用することができるようにするものである。脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されることにより、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現した不飽和脂肪酸含量の増加した魚類であり、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、△４脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、△５脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及び△６脂肪酸不飽和化酵素遺伝子から選ばれるいずれか１又は２以上であり、これらは淡水魚由来のものが好ましく、淡水魚由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターにより発現が促進されるものであることが好ましい。                                                                         

Description

m 細 書
不飽和脂肪酸含量の増加したトランスジヱニック魚類
技術分野
[0001] 本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入することにより不飽和脂肪酸含量の 増加した魚や、これにこれら不飽和脂肪酸含量増加魚の生産方法に関する。
背景技術
[0002] ヒトの健康及ぴ発達における、 n— 3高度不飽和脂肪酸 (HUFA)、特にエイコサぺ ンタエン酸 (ΕΡΑ、 20 : 5η— 3)、及びドコサへキサェン酸（DHA、 22 : 6η— 3)の優 れた効果は、広範囲にわたって研究されてきた（例えば、非特許文献 1、 2、 3、 4、 5 参照）。ヒトにおいてはこれらの脂肪酸は、主として海水魚やその抽出物の魚油等か ら接種している力 近年、海洋で捕獲する魚の数の減少に伴レ、、 ΕΡΑ及ぴ DHAの 生産に必要な原料の安定供給が脅力されている (例えば、非特許文献 6参照)。さら に、 2005年から 2010年の間には、これらの供給が危機的になると推測されている（ 例えば、非特許文献 7参照)。養殖により魚の生産量を増加させ、捕獲魚からの ΕΡΑ 及び DHAの供給量の減少による影響を潜在的になくすことが考えられる。しかし、魚 類の不飽和脂肪酸合成は魚類力 S持つ脂肪酸代謝酵素の種類およびその活性によ つて左右され、淡水魚にお 1、てはリノレン酸を ΕΡ Αや DHAに代謝する酵素を持つ 力 海水魚においてはその成長及び通常の発達に必要である (例えば、非特許文献 8、 9、 10、 11参照）が、リノレン酸を EP Aや DHAに代謝する酵素を持たないため、 餌から摂取している。いわゆる青魚の EPAや DHAはプランクトン由来の EPAや DH Aであり、これらの魚の養殖にぉレヽては EPA及ぴ DHAを高レベルで含む飼料が必 要である (例えば、非特許文献 9、 1 1参照)）。このため、魚の養殖現場においてコス ト面で不利な EPA及び DHAを含む飼料を与えることに対する、海水魚中に含まれる と同程度又はそれ以上の EPA及び; DHAを生産するバイオテクノロジーの適用等の 代替方法が模索されてきた。
[0003] このような代替方法に関する数多くの研究において、魚を含む脊椎動物における E PAの生合成が、 Δ 6及び Δ 5不飽和化と鎖伸長反応とを組み合わせることにより、食
羞骥ぇ用毅 rn 餌した α リノレン酸（18 : 3n— 3)が転換されて起きることが明らかにされている（例え ば、非特許文献参照 12、 13、 14参照）。さらに、 DHAは、 22 : 5η— 3まで、そこ力ら 2 4 : 5η— 3まで順次、鎖を伸長することによって ΕΡΑから合成され、さらに、 24 : 6η— 3 までの Δ 6不飽和化、最後に、 j8—酸ィ匕を経てペルォキシソームによって、逆転換（ retroconverted)し産生されること（例えば、非特許文献 12、 15、 16、 17参照）や、海 洋生物の 22： 5n— 3の Δ 4不飽和化によって直接転換する DHAの一工程による合 成方法等が報告されている (例えば、非特許文献 18参照)。
[0004] 近年のトランスジエニック技術の発達により、ヒトの健康に有益な外来タンパク質を 有する動物を作出することが可能になった (例えば、非特許文献 19参照)。この技術 力 水産養殖にも適用され (例えば、非特許文献 20、 21、 22参照）、卵母細胞の胚 胞 (例えば、非特許文献 23参照）、又は 1細胞期胚の細胞質 (例えば、非特許文献 2 4参照）へのマイクロインジェクション、初期胚 (例えば、非特許文献 25参照）又は精 子 (例えば、非特許文献 26参照）を用いたエレクト口ポレーシヨン、レトロウイルス感染 (例えば、非特許文献 27、 28参照)及び粒子ガン照射 (例えば、非特許文献 29参照 )などの方法により、トランスジエニック魚を産生することができることが明らかにされて いる。これらの全ての方法は、いくつかの魚種における、導入遺伝子のデリバリーを 容易にしたが、それぞれの種に適切な方法を選択しなければならず (例えば、非特 許文献 22参照）、また、成長率、耐病性、極限環境条件への適応性の改善において も、トランスジエニック技術の適用が魚種により構築されている（例えば、非特許文献 2 1、 30参照)。
[0005] し力しながら、トランスジエニック技術を用いて魚類の代謝経路を改変することをタ 一ゲットとした研究はほとんど行われていな力 た。かかる研究として、魚類における ビタミン C生合成の欠如を補うための遺伝子導入の可能性について報告されている（ 例えば、非特許文献 31参照)。この研究は、ビタミン Cの末端反応に触媒として作用 する L ダルノー y ラタトンォキシダーゼ (rGLO)遺伝子の導入に関するものである 力 ビタミン Cの生成は観察されていない。また、ヒトグルコース輸送タンパク質 (hGlu T)及びラットへキソキナーゼ II (rHKII) cDNAを含むコンストラクトの同時注入による 、 -ジマスの炭水化物の代謝の改善が試みられた力 rHKII及び hGluTlの機能に 関する直接的な証拠は観察されていない (例えば、非特許文献 32参照)。この実験 で、 yamame salmon (Oncorhynchus masou)から単離した Δ 6不飽和ィ匕酵素様遺伝 子が、脂肪酸生合成経路を改変するためにゼブラフィッシュに導入された。この Δ6 不飽和化酵素遺伝子は、一般的に HUFA生合成において、律速段階であると考え られて 、るので最初のターゲットとされたことが報告されて 、るに過ぎな、ヽ（例えば、 非特許文献 33、 34参照)。
非特許文献 1: Am. J. Clin. Nutr., 54:438-463, 1991
非特許文献 2: Nutrition, 16:143-145, 2000
非特許文献 3: Nutrition, 16:680-684, 2000
非特許文献 4: Prog. Lipid Res, 40:1-94, 2001
非特許文献 5: Nutrition, 18:178-188, 2002.
非特許文献 6:Proc. Nutr. Soc, 58:377-383, 1999
非特許文献 7:Aquaculture (In Press).2002
非特許文献 8:J. World Aquacult. Soc, 24:152-161, 1993
非特許文献 9:J. Appl. IchthyoL, 11:183-198, 1995
非特許文献 10:Aquaculture, 179:217-229, 1999
非特許文献 ll:Aquaculture, 200:203-222, 2001
非特許文献 12:Biochim. Biophys. Acta, 1299: 235-244, 1996.
非特許文献 13: Prog. Lipid Res., 37:73-117, 1998.
非特許文献 14:Biochim. Biophys. Acta, 1486:219-231, 2000
非特許文献 15:Biochem. Physiol, 116B:263- 267, 1997
非特許文献 16:FEBS Letters, 431:1-6, 1998
非特許文献 17:Biochim. Biophys. Acta, 1486:219-231, 2000.
非特許文献 18: J. Biol. Chem., 276: 31561-31566
非特許文献 19: Transgenic Res., 9: 305-320, 2000.
非特許文献 20: Biochemistry and molecular biology of fishes, vol.2., pp:
207-240, 1993.
非特許文献 21:Aquaculture, 197:191-204, 2001 非特許文献 22 : Suisanzoshoku, 49:137-142, 2001
非特許文献 23 : Cell Differen., 19:237-244, 1986.
非特許文献 24 :Aquaculture, 51:143-150, 1986
非特許文献 25 : Mol. Mar. Biol. BiotechnoL, 1:301-308, 1992
非特許文献 26 :Aquaculture, 173:297-307, 1999
非特許文献 27 : Science, 265:666-668, 1994a
非特許文献 28 : Pro Natl. Acad. Sci. USA., 93:7777-7782, 1996
非特許文献 29 : FEBS Letters, 287:118-120, 1991.
非特許文献 30 :Aquaculture, 204:255-269, 2002
非特許文献 31 : Biochem. Biophys. Res. Commun., 223:650-653, 1996.
非特許文献 32 :Aquaculture, 173:319-332, 1999a
非特許文献 33 : Prog. Lipid Res., 20:13-22, 1981.
非特許文献 34 :J. Biol. Chem., 274:471-477, 1999
[0007] また、脂肪酸不飽和化酵素を発現させる遺伝子に関する技術としては、脂肪酸不 飽和化酵素遺伝子を動物に導入して当該動物を形質転換し、当該脂肪酸不飽和化 酵素遺伝子を当該動物において発現させることにより、前記動物において不飽和脂 肪酸の含量が増カロしている形質転換動物 (例えば、特許文献 1参照)や、脂質に結 合した脂肪酸の Δ 9位を不飽和化する Anacystis属由来の Δ 9不飽和化酵素をコード する遺伝子を導入した高等植物細胞の作出方法 (例えば、特許文献 2参照)や、単 離された動物由来の Δ 5—脂肪酸デサチユラーゼおよびその機能しうる部分 (例えば 、特許文献 3参照）や、植物の種子中でのステアリドン酸の産生方法であって、前記 方法が、植物のゲノムに、植物種子細胞中で機能的なプロモーター、 Δ 6—不飽和化 酵素をコードする DNA配列、及び植物種子中で機能的な転写終止領域を 5' →3 ' の転写方向で含む第 1の DNA構築物を組込んだ植物を生長させる工程と、植物 を Δ 6不飽和化酵素が発現する条件下で生させる工程とを含む方法 (例えば、特許 文献 4参照)等が提案さて ヽる。
[0008] 特許文献 1：特開 2003— 245070号公報
特許文献 2：特開平 11 332408号公報 特許文献 3：特表平 14 508932号公報
特許文献 4 :特表平 14— 517255号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明の課題は、魚類の脂肪酸代謝経路を改変することにより、従来、海産魚用の 配合飼料には、 EPAや DHAを含む魚油を用いることが必要とされていた力 より安 価で品質管理も容易な植物性油脂、あるいは獣脂^!司料とすることを可能とし、種苗 生産現場におけるコスト、労力の軽減に大きく貢献し、活力が高ぐハンドリング耐性 、低温耐性を示す魚や、その生産方法を提供することや、機能性食品として DHAを 高レベルで含有する魚類や、その生産方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明は、不飽和脂肪酸含量が増力!]した魚を作出するため、外来遺伝子によって コードされて!/、る新 、表現型の導入にお!、て、宿主個体への外来遺伝子の効率的 な転写は重要な要因の 1つである（Hacket, 1993; Houdebine, 2000)ところから、最初 の段階として、 Δ 6不飽和化酵素様遺伝子の発現を可能とする適切なコンストラクトを 選択した。まず、 2— 3ヶ月という比較的短い世代時間、卵の数の多さ、飼育の簡便さ などの複数の利点を有する硬骨ゼブラフィッシュ（Teleostean zebrafish)である Danio rerio (Westerfield, 1995; Gong, 1999)をモデル魚として選択した。ャマメ（masou salmon) (Oncorhynchus masou)由来の Δ 6不飽和化酵素様 cDNAを、メダカ（ Oryzias latipes) j8—ァクチンプロモーターの制御下で、ゼブラフィッシュに導入したと ころ、主に筋肉で発現し、 EPA及び DHAの含量が増加することを見い出し、上記 Δ 6不飽和化酵素様遺伝子が Δ 6不飽和化酵素活性を実際に有する遺伝子であること を確認し、本発明を完成するに至った。
[0011] すなわち本発明は、（1)脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不 飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加したトランスジエニック魚 類や、（2)脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来の βーァクチンプロモーターの 下流に連結されていることを特徴とする上記（1)記載のトランスジヱニック魚類や、（3 )脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、ゥシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に連 結されて!、ることを特徴とする上記（1)又は（2)記載のトランスジ ニック魚類や、（4) 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、以下の (A)— (F)の何れかの塩基配列からなる遺 伝子であることを特徴とする上記（1)一（3)のいずれか記載のトランスジエニック魚類
(A)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列；
(B)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有す るタンパク質をコードする塩基配列；
(C)配列番号 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩 基配列；
(D)配列番号 1に示される塩基配列；
(E)配列番号 1に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若 しくは付加された塩基配列力もなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク 質をコードする塩基配列；
(F)配列番号 1に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、か つ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;や、（5)不飽 和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸 (EPA)、又はドコサへキサェン酸 (DHA)である ことを特徴とする上記（1)一（4)のいずれか記載のトランスジエニック魚類や、（6)養 殖魚であることを特徴とする上記（1)一（5)のいずれか記載のトランスジエニック魚類 に関する。
発明の効果
本発明は、種苗生産現場に於ける、コスト、労力の軽減に大きく貢献できるのみなら ず、活力が高ぐノ、ンドリング耐性、低温耐性を示す仔稚魚を生産することができ、養 殖海産魚用の配合飼料として EPA、 DHAを含む魚油を用いることを不要とし、より 安価で品質管理も容易な植物性油脂、あるいは獣脂を利用することができる。また、 本発明により生産された魚類は通常の個体より多くの DHAを含有するため、閉鎖循 環式陸上養殖システムを用いて健康食品としての付加価値を有する魚類生産の実 現も可能となり、さらに、水産養殖における直接的な利用にとどまらず、魚類の脂肪 酸代謝の機構を分子レベルで明らかにする際の極めて有用な研究ツールとして、か 力る分野に対する貢献度は極めて高 、。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明のトランスジエニック魚類としては、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され 、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加した魚 類であれば特に制限されるものではなぐ上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては 動物由来、植物由来などその由来は特に制限されないが、 Δ 4脂肪酸不飽和化酵 素遺伝子、 Δ 5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、 Δ 6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子等の 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を好適に例示することができ、これらは単独で又は多重 に用いることができる。力かる Δ 4脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、 Δ 5脂肪酸不飽和化 酵素遺伝子、 Δ 6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、脂肪酸の末端カルボキシル基の 炭素（デルタエンド)力も数えて、それぞれ 4番目、 5番目、 6番目の炭素にぉ 、て不 飽和結合を形成するものであり、これらの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、淡水 魚由来やプランクトン由来のものが魚類の正常な発育や機能に悪影響を及ぼさない ため好ましぐ例えば、微細藻類由来の Δ 4脂肪酸不飽和化酵素遺伝子 (Tonon, Τ., Harvey, D., Larson, Ί . R., and Graham, I. A. Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acid Δ 4— desaturase from the microalga Pavlova lutheri.FEBS Lett.553,440-444(2003).)や、大西洋産サケ由来の Δ 5脂肪酸不飽和化
酵素遺伝子 (ジーンバンク： AF478472)や、ャマメ由来の Δ 6脂肪酸不飽和化酵素遺 伝子（ジーンバンク： ΑΒ074149,ΑΒ070444)を具体的に挙げることができる。
[0014] 好ましく用いることができる Δ 6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、（Α)配列番 号 2に示されるアミノ酸配列（ャマメ由来の Δ 6脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列） をコードする塩基配列；（Β)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは 数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不 飽和化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列； (C)配列番号 2に示さ れるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するアミノ酸配列力 なり、かつ 脂肪酸不飽和化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列； (D)配列番 号 1に示される塩基配列 (ャマメ由来の Δ 6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の塩基配列 )； (Ε)配列番号 1に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換 若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタン パク質をコードする塩基配列；又は (F)配列番号 1に示される塩基配列とストリンジ ントな条件下でハイブリダィズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質 をコードする塩基配列；の何れかの塩基配列からなる遺伝子であれば特に制限され ず、ここで「脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列」とは 、魚類体内で不飽和脂肪酸の生成に何らかの形で関与するタンパク質をコードする 塩基配列を意味し、その具体的な作用機構は特に限定されな 、。
[0015] 上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは 、例えば 1一 20個、好ましくは 1一 15個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1 一 5個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味す る。また、上記「1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」と は、例えば 1一 20個、好ましくは 1一 15個、より好ましくは 1一 10個、さらに好ましくは 1一 5個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
[0016] 例えば、これら 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列か らなる DNA (変異 DNA)は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの 当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号 1に 示される塩基配列からなる DNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、 紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これら DNAに変異を導 入することにより、変異 DNAを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つであ る部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であること 力ら 用であり、 Molecular Cloning: A laboratory Mannuai, 2nd Ed.,し old Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.以後 "モレキュラークロー-ング 弟 2版 と略す)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1一 38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異 DNA を適切な発現系を用いて発現させることにより、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置 換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなるタンパク質を得ることができる。 [0017] 上記「配列番号 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するァ ミノ酸配列」とは、配列番号 2に示されるアミノ酸配列との相同性が 60%以上であれ ば特に制限されるものではなぐ例えば、 60%以上、好ましくは 70%以上、より好まし くは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上、最も好ましく は 98%以上であることを意味する。
[0018] 上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列」とは、 DNA又は RN Aなどの核酸をプローブとして使用し、コロニ一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用い ることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来 の DNAまたは該 DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、 0. 7—1. OMの Na C1存在下、 65°Cでノ、イブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1— 2倍程度の SSC溶液（ 1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMクェン酸ナトリウム） を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄することにより同定できる DNAをあげること ができる。ハイブリダィゼーシヨンは、モレキュラークローユング第 2版等に記載されて V、る方法に準じて行うことができる。
[0019] 例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズすることができる DNAとしては、 プローブとして使用する DNAの塩基配列と一定以上の相同性を有する DNAが挙げ ることができ、例えば 60%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さら に好ましくは 90%以上、特に好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98%以上の相同 性を有する DNAを好適に例示することができる。
[0020] 本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなぐ本明細書中 に開示した配列番号 1又は配列番号 2に示されるアミノ酸配列又は塩基配列情報に 基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在 することが予測される cDNAライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子 を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
[0021] 具体的には、本発明の遺伝子が単離されたャマメより、常法に従って cDNAライブ ラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプロ ーブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することが できる。上記 cDNAの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示 することができ、また、これらの細胞又は組織からの全 RNAの分離、 mRNAの分離 や精製、 cDNAの取得とそのクローユングなどはいずれも常法に従って実施すること ができる。本発明の遺伝子を cDNAライブラリ一力もスクリーニングする方法は、例え ば、モレキュラークローユング第 2版に記載の方法等、当業者により常用される方法 を挙げることができる。
[0022] また、上記 (B)— (F)の 、ずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝 子又は相同遺伝子遺伝子としては、配列番号 1に示される塩基配列又はその一部を 有する DNA断片を利用し、他の生物体等より、該 DNAのホモログを適当な条件下 でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異 DNAの作 製方法により調製することもできる。
[0023] 次に、魚体内で発現する脂肪酸不飽和化酵素により生成される不飽和脂肪酸とし ては、用いる脂肪酸不飽和化酵素の種類や脂肪酸基質の種類によって異なるが、ド コサへキサェン酸 (DHA)やエイコサペンタエン酸 (EPA)を好適に例示することがで き、 DHA(22 : 6n—3)ゃEPA (20 : 5n—3)の他、 LNA(18 : 3n— 3)、 OTA (18 :4n -3)、 ETA (20： 4n— 3)、 DPA (22： 5n— 3)、 TPA (24： 5n— 3)、 THA (24： 6n— 3) 、リノール酸（18 : 2n— 6)、 γ—リノレン酸（18 : 3n— 6)、エイコサトリェン酸（20 : 3n— 6 )、ァラキドン酸（20 :4η— 6)、ドコサペンタエン酸（22 : 5η— 6)等を挙げることができる
[0024] 本発明の不飽和脂肪酸含量増加される魚類としては、導入される脂肪酸不飽和化 酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する魚類であ れば、本来、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を有するものであっても、あるいは全く有し ないものであってもよいが、養殖の対象とされている魚類、筋肉組織等の可食部分に お！、て選択的に不飽和脂肪酸含量が高まる魚類や、子孫にまで安定的に脂肪酸不 飽和化酵素遺伝子が発現する魚類等が好ましぐ魚の種類としては硬骨魚類が好ま し \、 ¾S骨魚類の中でもで、 Cyprinidae、し ichiidae、 Salmonidae、 Clariaae、 bilundae^ Ictaluridaeに属する魚類が好ましい。具体的には、ブリ（Seriola quinqueradiata),マダ ィ (Pagrus major)、ヒフメ (Paralichthys olivaceus)、トフノグ (Takifugu ruonpes)、ヒフマ サ (Seriola aureovittata)、クノレマエビ (Penaeus japonicus)、ニジマス (Oncorhyncus mykiss)、カンノヽチ (Seriola dumerili)、シマ ン (Pseudocaranx dentex)、マノヽタ、 Epinephelus septemfasciatus)、クロマグロ (Thunnus thynnus)等の養殖魚の他、コィ（ 例えば Cyprinus carpio)、ゼブラフィッシュ (Danino rerio)、アフリカナマズ (Clarias ganepinus)、ァラヒ (Oreochronis niloticus)、タィセィヨウサケ (¾aimo ¾alar入メタ力 (Oryzias latipes)等を好適に例示することができる。
[0025] 魚類に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入する発現ベクターを構築する場合、脂 肪酸不飽和化酵素遺伝子を魚類細胞で効率よく発現するプロモーターの下流に連 結した発現ベクターを作製することが好ましい。かかるプロモーターとしては、 β—了ク チンフ—口モーター、 adipocyteP2(aP2)プロモーター、 Mylz2 (Danio rerio myosin light polypeptide 2 skeletal muscle mylz2)プロモーター、 UCPプロモーター、 SV40プロモ 一ター、サイトメガウィルスプロモーター、 EF1 αプロモーター、メタ口チォネインプロ モーター、熱ショックプロモーター等を例示することができる力 中でもメダカ j8—ァク チンプロモーターや、 mylz2プロモーターが発現効率の点で好ましい。また、 mRNA を安定化させるために、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の下流にゥシ成長ホルモンポリ アデニル化配列等のポリアデ-ルイ匕配列を連結することが好まし。その他必要に応じ て、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列やェンノヽンサ一配列、転写 終結を指令するターミネータ一配列を用いることもできる。構築した発現ベクターの魚 類への導入は、卵母細胞又は受精卵へのマイクロインジェクション法、ウィルスベクタ 一感染法、パーティクルガン法、エレクト口ポレーシヨン法によって行うことができる。
[0026] 本発明のトランスジエニック魚類には、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された魚 成体、その子孫の他、魚受精卵細胞、魚胚細胞なども便宜上含まれる。
[0027] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこ れらの例示に限定されるものではない。
実施例 1
[0028] [ゼブラフィッシュの飼育と食餌]
AB株のゼブラフィッシュ（walker et al.， 1999)を用い、 Westerfield(1995)の概要に いくつかの修正を行い、魚に産卵させ、飼育した。親魚（broodstock)を、 40リットルの 水槽で、明 14時間、暗 10時間の光周期で 28 ± 1°Cで飼育した。魚に、市販の餌オト ヒメ（otohime) (商品名： Nisshin社製）及び Artemia (Salt Creek社製）ノーブ リウス幼生を、一日おきにそれぞれ給餌した。一日に 2回のマイクロインジェクションを 可能とするため、 4つの水槽にそれぞれに親魚としてメス 12匹とォス 8匹を入れた。こ れらの水槽を、 2つのグループに分け、 1つのグループは、 10 : 30amに産卵させ、他 方は、 14 : 00pmに産卵させた。
実施例 2
[0029] [ Δ 6不飽和化酵素 cDNAのクローユング]
GenBank database (AB070444)に基づく 2つの変性プライマーを用いて、 P CRにより Δ 6不飽和化酵素様 cDNAをャマメの肝臓力も単離した。 2つの変性プライ マーは、フォーワード及びリバースで、それぞれ、
(5 -TACTCCATGGTTCAGCAAATGAATTGAACA-3'；配列番号 3)及び（
5'- TCGTCCATGGCCATTCACTGCTGACAAGGA- 3'；配列番号 4)であり、発現べ クタ一へのクロー-ングを容易にするため、それぞれ Ncol部位（下線部）を含んで!/ヽ た。 PCR増幅を下記の条件で行った。 94°Cで 3分間、続いて 94°Cで 30秒、 62°Cで 30秒を 30サイクル、 72。Cで 1. 5分。その後、 1680bpの PCR増幅産物を、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）にサブクローユングした。
実施例 3
[0030] [導入遺伝子発現の構築]
8. 5kbのプラスミド pActD6 (図 1)を用いて導入遺伝子を発現させた。すなわち、 pRc/RSV (Invitrogen社製）を Xholで処理して取り出したゥシ成長ホルモンポリアデ- ル化（BGH poly(A))配列を、 pBluescriptSK(+/- ) (Clontech社製）に結紮した。 3. 7kbのメダカ 13ーァクチンプロモーター（m β -Actin)を PCRによって、 pOBA-109から 修飾し（Takagi et al.， 1994)、 BGHpoly (A)を含む pBluescriptSK (+/-)への結紮の ための EcoRI部位を付与した。実施例 2で得られた 1477kbのャマメ（0. masau)の Δ 6不飽和化酵素様遺伝子（D6D)を、 GenBank database (AB070444)に基づ!/、た 2つのオリゴヌクレオチドプライマーとして、 Sail認識部位（下線部）を含むフォーワード プライマー Salト desF3 (5し TTGTCGACGGTCTGAGTGGAGCAGAGAGAA- 3'；配列 番号 5)と、リバースプライマー des— OmaR (
5'- ATCCAGGAAATGTCCTCTCTGTTCGCA- 3'；配列番号 6)を用い、 94°Cで 3分 、続いて 94°Cで 30秒、 62°Cで 30秒を 30サイクル、 72°Cで 1. 5分の条件で PCR増 幅を行った。 PCR増幅産物を、 pGEM- T Easyベクター（Promega社製）にクローニン グし、 Sailで処理して、 Δ 6不飽和化酵素様遺伝子断片を得、これをメダカ β—ァクチ ンプロモーター（m β -Actin)と BGHpoly (A)配列との間に挿入し、 pActD6コンストラ タトを調製した。
実施例 4
[0031] [マイクロインジェクション用の DNAの調製]
実施例 3で得られた環状 DN Aを、 0. 1Mの KC1Z0. 125%のテトラメチルー ローダミンデキストラン溶液に、 30 g/mlの濃度で希釈した。 DNA溶液を、超 M C遠心分離濾過機。. 22 u rn (MILLIPORE¾:¾) T\ 4。Cで 5分間、 5000rpmで 微量遠心機で回転し、混入している粒子を取り除いた。 3— の DNAを、清潔な カバーガラスに移し、蒸発を防ぐために数滴のミネラルオイルで覆った。
実施例 5
[0032] [マイクロインジェクションプレートの調製]
マイクロインジェクションプレートを作製するために、モールドを 90mmのペトリ皿上 に置き、約 30mlの暖カ 、3%ァガロース (蒸留水にて調製)を、プレートに注いだ。ァ ガロースを室温で凝固した後、モールドを取り除き、マイクロインジェクションの針が貫 通したときに胚を支えるための 12個の溝を作製した。使用したプレートを、プラスチッ ク製ラップで覆い、使用するまで 4°Cで保管した。
実施例 6
[0033] [マイクロインジェクション-一ドルの配置]
マイクロインジェクション-一ドルを、微細なガラスのマイクロインジェクションキヤビラ リーを用いて、マイクロピペットプーラ一（ナリシゲ社製）（図 2A)から作製した。マイク 口インジェクション-一ドルの先端は、約 5— 8 μ mであった。ニードルはホルダーに 取りつけられ、シリンジから、マイクロマニピュレーターを右に回しフッ素榭脂製の管を 通じて、針のなかにミネラルオイルを充填した。 実施例 7
[0034] [マイクロインジェクションのセットアップ]
マイクロインジェクションは、立体化学マイクロスコープ、マイクロインジェクションェ 程中に実施例 6で調製されたマイクロインジェクション-一ドルを制御するマイクロマ -ピュレーター、 DNA負荷用のマイクロマニピュレーターに付属するマタネチックスタ ンド (ナリシゲ社製）、プラスチック製のツーウェイストッパー、フッ素榭脂製の管（ナリ シゲ社製)及びマイクロインジェクションプレートで構成されたシステムを用いて行った 。ニードルホルダーを取り付けた DNA負荷用のマイクロマニピュレーターを、金属面 に固定されたマグネチックスタンドに取り付け、シリンジを、 3mlのミネラルオイルで充 填し、マイクロインジェクション-一ドルホルダーに取り付けられた lmmのフッ素榭脂 製の管の約 40cmの部分に固定されたツーウェイストッパーに直接に取り付けた。 実施例 8
[0035] [卵の回収及びマイクロインジェクション]
マイクロインジェクションの当日、ランプの作動する少なくとも 15分前に、実施例 1の ゼブラフィッシュのォス 3匹とメス 2匹を水槽から、 3Lの飼育タンクに移した。産卵の約 5分後に卵をペトリ皿に回収した。 1細胞期胚を、ピペットを用いて、実施例 5で調製し たマイクロインジェクションプレートの溝に移した。胚盤は、マイクロインジェクション二 一ドルに面していることが要求された。実施例 4で得られた DNA溶液を、マイクロイン ジ工クシヨンプレート上の 1細胞期胚の細胞質内に実施例 7のマイクロインゼクシヨン システムを用いてマイクロインジェクションを行った。 DNAが注入された胚を、 28 ± 1 °Cで保存した。非受精卵及び変形した卵を、受精 5— 6時間後に取り除いた。翌日、 死亡又は変形した胚を取り除き、健康な胚を新 U、ペトリ皿に移した。
実施例 9
[0036] [RNA単離及び半定量的 RT— PCR]
mRNAを単離するために、 20個の胚のサンプルを受精 8時間後に取り出し、転写 レベルを定量した。全 RNAは ISOGEN (Nippon Gene社製）で、製造者からの指示に 従って単離した。微量の DNAを、 RQ1 RNase- free Dnase (Promega社製） 2U/ μ g で、 30分、 37°Cで分解した。フエノールークロロホルム抽出及びエタノール沈殿後、 ペレットをジェチルピロカルボネート（DEPC)で処理した水に溶解した。 1本鎖 cDN Aを、 Ready— to— (JO You— Prime First— Strand Beads (Amersham Pnarmacia Biotech社 製)で、 2— 3 gの全 RNAから、製造者の指示に従って合成した。この反応におい て、 dT3RACE- VECTプライマー
-3' ;配列番号 7)を用いた。
7
[0037] 外来不飽和化酵素遺伝子の転写レベルを定量するために、半定量的 RT— PCRを 行った。 PCR分析を、 20 1の 10 X Ex Taq緩衝液、 200 μ Μの dNTP、 0. 125Uの Ex Taqポリメラーゼ（Takara社製）、 2 μ 1の cDNAをテンプレートとして、及びそれぞ れ lpmolを下記の条件下で行った。 94°Cで 3分間、続いて 94°Cで 30秒、 6
2°Cで 30秒を 24サイクル、 72°Cで 1. 5分。デサチユラーゼ用のフォーワードプライマ 一として Omar (5し AGGACTGGCTCACCATGCAGTTGAGT- 3'；配列番号 8)を、リ バースプライマーとして前記 des-Omar (配列番号 4)を用いた。 β -ァクチン遺伝子発 現を、同量の RNA負荷の内部標準として分析した。 j8 -ァクチン遺伝子のフォーヮー ドプライマ一として（5'- ACTACCTCATGAAGATCCTG- 3'；配列番号 9)を、リバース プライマーとして（5 '- TTGCTGATCCACATCTGCTG- 3 '；配列番号 10)を用いた。反 応液の 2 1を、 0. 7%ァガロースゲルで電気泳動して単離し、臭化工チジゥムで染 色し、紫外線照射で撮影した。各バンドの蛍光強度を、 Densitograg ATTO社製）に より定量ィ匕した。もっとも強い発現を示すコンストラクトを、安定した系統を作出するた めに使用した。
[0038] F1及び F2の不飽和化酵素遺伝子発現を、 F0に使用した方法で分析した。全 RN Aを、一匹の DNA陽性の魚のヒレ、肝臓、筋肉から抽出し、 F1における外来遺伝子 の発現を同定した。 F2世代の全 RNAを、少なくとも 20匹の 2日齢の稚魚及び、少な くとも 10匹の成魚の筋肉及び肝臓力も抽出した。
実施例 10
[0039] [DNA単離及び PCR増幅]
トランスジェニック個体の同定は、 PCRにより尾ヒレ組織力 抽出した DNAテンプレ ートで行った。 DNAを、 DNA陽性 F0と非トランスジエニック魚を交配して生産した 2 日齢の保存した稚魚力 抽出し、生殖系列伝達物質を同定した。ゲノム DNAの単離 は、 DNA Isolation Kit (Puregene製）を用いて、製造者の指示に従って行った。 PCR 反応及び使用したプライマーは、 RT— PCRに使用した方法と同じものを使用した。 実施例 11
[0040] [安定した株の調製]
DNA陽性 F0を、成魚になるまで飼育した。成熟した F0を、非トランスジエニックゼ ブラフィッシュと交配し、生殖系列を伝達している魚をスクリーニングするために、交 配によって得た少なくとも 20匹の 2日齢の稚魚を蓄積した。 次に生殖系列が陽性な F0を用いて、 F1及び F2世代を作出した。 F1及び F2の作出及びスクリーニングのェ 程は、 F0に用いた方法と同じである。
実施例 12
[0041] [脂肪酸分析]
全脂質は、ャマメ Δ 6不飽和化酵素遺伝子を含む非トランスジ ニック魚及びトラン スジエニック魚から抽出した。非トランスジエニック魚及びトランスジエニック魚は、同じ 水槽で飼育し、全脂肪酸は魚全体より抽出した。抽出した脂肪酸は水素フレームィ オン化検知器及びキヤビラリ一力ラム 30m X 0. 32mm X 0. 25 m (Supelco社製） を装備したガスクロマトグラフィー（Shimadzu 14B : Shimadzu社製）を用いて分離し、 脂肪酸から脂肪酸メチルエステル (FAME)を、文献 (引用文献)記載の方法で調製 した。上記ガスクロマトグラフィーの測定により、脂肪酸メチルエステルピークを、保持 時間と適切な FAME標準 (Supelco社製）とを比較して同定した。
実施例 13
[0042] [安定した系統の調製;結果]
トランジェントな外来遺伝子発現を、受精 8時間後に、注入した胚カゝら抽出した RN Aカゝら合成した cDNAで、外来遺伝子のトランジェントな発現を分析した。トランジェ ントな発現を示す結果を図 2に示す。また、 DNA陽性の魚のヒレ、肝臓、筋肉から抽 出し、 F1における外来遺伝子の発現を同定した結果を図 3に示す。図 3には、メダカ j8—ァクチンプロモーターに代えて Mylz2プロモーターを用いる以外は同条件で行つ た結果も記載されている。図 3からわ力るように、メダカ β—ァクチンプロモーターと Mylz2プロモーターのいずれのプロモーターを使用しても、ヒレと筋肉に外来遺伝子 の発現を認めた。
[0043] トランスジエニック個体は、ャマメ不飽和化酵素遺伝子に特異的なプライマーを使 用してヒレ力も抽出したゲノム DNAによる PCR増幅によってスクリーニングした。生殖 系列を伝達している魚をスクリーニングするために、 DNA陽性魚と非トランスジェ-ッ ク魚とを交配し、結果を表 1及び図 4に示す。表 1に示すように、 DNAを注入した胚 4 00個のうち 109匹力成魚となり、このうち 4匹が胚細胞に pActD6遺伝子コンストラクト を保有していた。これらの魚を用いて、 F1及び F2世代を作出した。外来遺伝子の F1 世代への伝達率は、表 2に示すように、 4.2%から 44.1%の間で変化した。これら の結果により、トランスジエニック FO魚がモザイクであることを確認した。 RT— PCRに よって分析したより高い mRNA転写レベルを有する F1トランスジエニック株を用いて 、 F2世代を作出した。 F1魚の代表的な外来遺伝子の発現を図 5に示す。導入遺伝 子の F2世代への伝達は、メンデルの分離パターンの通りだった。これらの結果は、 各 F1のトランスジエニック系統の全てのディプロイド細胞力 トランスジーンを含有し ていることを裏付けていた。
[0044] [表 1]
Figure imgf000018_0001
[0045] [表 2] 細胞株 （F 0) 外来遺伝子の遺伝
F 1世代 F 2世代
10 39. 1 % (9/23) 46. 4% (45/97)
44. 4 % (55/ 1 24)
1 2 44. 1 % (1 5/34) n.a.
1 3 20. 0% (20/ 1 00) n.a.
1 5 4. 2% (5/1 20) 56. 7 % (1 7/30)
50. 0 % ( 1 9/30)
60. 0 % ( 1 8/30) 実施例 14
[0046] [トランスジエニック魚における脂肪酸組成]
脂肪酸メチルエステル (FAME)は、非トランスジエニック及びトランスジエニック両 方の魚の全身から調製し、ガスクロマトグラフィー（GC)で分析した。トランスジェ-ッ ク魚の n - 3脂肪酸構成組成を表 3に示す。ャマメ不飽和化酵素遺伝子を発現するト ランスジェニック魚における EPA及び DHAの生産は、対応する非トランスジエニック 魚の 1. 4±0. 1倍 . 86±0. 03mgZg対 1. 32±0. 05mgZg)及び 2. 1 ±0. 2 倍（4. 62 ±0. 22mgZg対 2. 22 ±0. 08mg/g) (pく 0. 05)であった。し力 、卜ラ ンスジエニック系統間の EPA及び DHA生産の量にかなり高い割合の相違があった。 可食部における EPA及び DHA生産量は、全魚体中のそれぞれ 75%及び 78%で めつに。
[0047] [表 3]
Figure imgf000019_0001
表 3に示された結果は、 3回の実験の平均値士標準偏差 (SD)である。 SD = 0. 0 で、 SD< 0. 005を示す。括弧内の数値は、全脂肪酸の内、各脂肪酸の比率を示す 。非トランスジエニック及びトランスジエニック魚は、同じ水槽で飼育した。全脂肪酸は 、 GCで分析、定量した脂肪酸メチルエステルで魚全体より抽出した。構築物の後ろ の数字は、個別のトランスジエニック株を示す。
導入した遺伝子が、 Δ 6又は Δ 5不飽和化酵素のどちらである力確認するために、 不飽和化の基質以外の脂肪酸を合計した。トランスジエニック魚の Δ 6及び Δ 5不飽 和化生成物は、図 6に示すように、非トランスジエニック魚より高力つた (pく 0. 05)。 導入遺伝子を示す Δ 6不飽和化脂肪酸生成物のより高 、値は、外来の Δ 6デサチュ ラーゼに起因している。
図面の簡単な説明
圆 1]本発明の不飽和脂肪酸含量の増加した魚類の作出に使用した発現ベクターに 挿入されたデサチユラーゼ遺伝子構築物の概要を示す図である。
[図 2]デサチユラーゼ遺伝子のトランジェントな発現結果を示す RT— PCRの図である
[図 3]F1世代の cDNAにおけるデサチユラーゼ遺伝子のヒレ、肝臓、筋肉における発 現結果を示す RT - PCRの図である。
[図 4]蓄積した稚魚力 抽出した DNAテンプレートを用いた PCR分析により、生殖系 列の伝達物質をスクリーニングした結果の代表例を示す RT— PCRの図である。 DN A陽性 FOと非トランスジエニックの個体とを交配して得た約 20匹の 2日齢の稚魚から DNAを抽出した。レーン 1一 6；トランスジエニック F0個体からのゲノム DNAサンプル を用いた PCR増幅産物。レーン C；非トランスジエニック魚を用いた PCR増幅産物、 レーン N； DNAテンプレートなしのを用いた PCR増幅産物、レーン P；増幅した pActD6プラスミド DNA(0. 6pg)。
[図 5]異なる F1世代における導入遺伝子発現の検出結果を示す PT— PCRの図であ る。全 RNAは尾ヒレ組織力も抽出した。構築物の後の数字は、個別のトランスジェ- ック系統を示す。
圆 6]本発明の不飽和脂肪酸含量の増加した魚類における不飽和化生成物の含量 を示す図である。

Claims

請求の範囲
[1] 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現 により、不飽和脂肪酸含量の増カロしたトランスジエニック魚類。
[2] 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来の βーァクチンプロモーターの下流に連 結されていることを特徴とする請求項 1記載のトランスジエニック魚類。
[3] 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、ゥシ成長ホルモンポリアデニルイ匕配列の上流に連 結されていることを特徴とする請求項 1又は 2記載のトランスジエニック魚類。
[4] 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、以下の (Α)— (F)の何れかの塩基配列からなる遺 伝子であることを特徴とする請求項 1一 3のいずれか記載のトランスジエニック魚類。 (Α)配列番号 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列； (Β)配列番号 2に示されるアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列力もなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有す るタンパク質をコードする塩基配列；
(C)配列番号 2に示されるアミノ酸配列と少なくとも 60%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩 基配列；
(D)配列番号 1に示される塩基配列；
(Ε)配列番号 1に示される塩基配列において、 1若しくは数個の塩基が欠失、置換若 しくは付加された塩基配列力もなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク 質をコードする塩基配列；
(F)配列番号 1に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし、か つ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
[5] 不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸 (ΕΡΑ)、又はドコサへキサェン酸 (DHA)で あることを特徴とする請求項 1一 4のいずれか記載のトランスジエニック魚類。
[6] 養殖魚であることを特徴とする請求項 1一 5記載の 、ずれか記載のトランスジエニック 魚類。
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