JP2005287424A - 不和脂肪酸含量の増加したトランスジェニック魚類 - Google Patents
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Abstract
【課題】脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、不飽和脂肪酸含量の増加した魚類の提供。
【解決手段】脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されることにより、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現した不飽和脂肪酸含量の増加した魚類であり、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、△4脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、△5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及び△6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子から選ばれるいずれか1又は2以上であり、これらは淡水魚由来のものが好ましく、淡水魚由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターにより発現が促進されるものであることが好ましい。
【効果】コスト、労力の軽減に貢献できるのみならず、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す仔稚魚を生産することができ、養殖海産魚用の配合飼料としてEPA、DHAを含む魚油を用いることを不要とし、より安価で品質管理も容易な植物性油脂を利用することができる。
【選択図】なし
【解決手段】脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入されることにより、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現した不飽和脂肪酸含量の増加した魚類であり、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、△4脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、△5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及び△6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子から選ばれるいずれか1又は2以上であり、これらは淡水魚由来のものが好ましく、淡水魚由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターにより発現が促進されるものであることが好ましい。
【効果】コスト、労力の軽減に貢献できるのみならず、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す仔稚魚を生産することができ、養殖海産魚用の配合飼料としてEPA、DHAを含む魚油を用いることを不要とし、より安価で品質管理も容易な植物性油脂を利用することができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入することにより不飽和脂肪酸含量の増加した魚や、これにこれら不飽和脂肪酸含量増加魚の生産方法に関する。
ヒトの健康及び発達における、n−3高度不飽和脂肪酸(HUFA)、特にエイコサペンタエン酸(EPA、20:5n−3)、及びドコサヘキサエン酸(DHA、22:6n−3)の優れた効果は、広範囲にわたって研究されてきた(例えば、非特許文献1、2、3、4、5参照)。ヒトにおいてはこれらの脂肪酸は、主として海水魚やその抽出物の魚油等から接種しているが、近年、海洋で捕獲する魚の数の減少に伴い、EPA及びDHAの生産に必要な原料の安定供給が脅かされている(例えば、非特許文献6参照)。さらに、2005年から2010年の間には、これらの供給が危機的になると推測されている(例えば、非特許文献7参照)。養殖により魚の生産量を増加させ、捕獲魚からのEPA及びDHAの供給量の減少による影響を潜在的になくすことが考えられる。しかし、魚類の不飽和脂肪酸合成は魚類が持つ脂肪酸代謝酵素の種類およびその活性によって左右され、淡水魚においてはリノレン酸をEPAやDHAに代謝する酵素を持つが、海水魚においてはその成長及び通常の発達に必要である(例えば、非特許文献8、9、10、11参照)が、リノレン酸をEPAやDHAに代謝する酵素を持たないため、餌から摂取している。いわゆる青魚のEPAやDHAはプランクトン由来のEPAやDHAであり、これらの魚の養殖においてはEPA及びDHAを高レベルで含む飼料が必要である(例えば、非特許文献9、11参照))。このため、魚の養殖現場においてコスト面で不利なEPA及びDHAを含む飼料を与えることに対する、海水魚中に含まれると同程度又はそれ以上のEPA及びDHAを生産するバイオテクノロジーの適用等の代替方法が模索されてきた。
このような代替方法に関する数多くの研究において、魚を含む脊椎動物におけるEPAの生合成が、Δ6及びΔ5不飽和化と鎖伸長反応とを組み合わせることにより、食餌したα−リノレン酸(18:3n−3)が転換されて起きることが明らかにされている(例えば、非特許文献参照12、13、14参照)。さらに、DHAは、22:5n−3まで、そこから24:5n−3まで順次、鎖を伸長することによってEPAから合成され、さらに、24:6n−3までのΔ6不飽和化、最後に、β−酸化を経てペルオキシソームによって、逆転換(retroconverted)し産生されること(例えば、非特許文献12、15、16、17参照)や、海洋生物の22:5n−3のΔ4不飽和化によって直接転換するDHAの一工程による合成方法等が報告されている(例えば、非特許文献18参照)。
近年のトランスジェニック技術の発達により、ヒトの健康に有益な外来タンパク質を有する動物を作出することが可能になった(例えば、非特許文献19参照)。この技術が、水産養殖にも適用され(例えば、非特許文献20、21、22参照)、卵母細胞の胚胞(例えば、非特許文献23参照)、又は1細胞期胚の細胞質(例えば、非特許文献24参照)へのマイクロインジェクション、初期胚(例えば、非特許文献25参照)又は精子(例えば、非特許文献26参照)を用いたエレクトロポレーション、レトロウイルス感染(例えば、非特許文献27、28参照)及び粒子ガン照射(例えば、非特許文献29参照)などの方法により、トランスジェニック魚を産生することができることが明らかにされている。これらの全ての方法は、いくつかの魚種における、導入遺伝子のデリバリーを容易にしたが、それぞれの種に適切な方法を選択しなければならず(例えば、非特許文献22参照)、また、成長率、耐病性、極限環境条件への適応性の改善においても、トランスジェニック技術の適用が魚種により構築されている(例えば、非特許文献21、30参照)。
しかしながら、トランスジェニック技術を用いて魚類の代謝経路を改変することをターゲットとした研究はほとんど行われていなかった。かかる研究として、魚類におけるビタミンC生合成の欠如を補うための遺伝子導入の可能性について報告されている(例えば、非特許文献31参照)。この研究は、ビタミンCの末端反応に触媒として作用するL−グルノ−γ−ラクトンオキシダーゼ(rGLO)遺伝子の導入に関するものであるが、ビタミンCの生成は観察されていない。また、ヒトグルコース輸送タンパク質(hGluT)及びラットヘキソキナーゼII(rHKII)cDNAを含むコンストラクトの同時注入による、ニジマスの炭水化物の代謝の改善が試みられたが、rHKII及びhGluT1の機能に関する直接的な証拠は観察されていない(例えば、非特許文献32参照)。この実験で、yamame salmon (Oncorhynchus masou)から単離したΔ6不飽和化酵素様遺伝子が、脂肪酸生合成経路を改変するためにゼブラフィッシュに導入された。このΔ6不飽和化酵素遺伝子は、一般的にHUFA生合成において、律速段階であると考えられているので最初のターゲットとされたことが報告されているに過ぎない(例えば、非特許文献33、34参照)。
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特開平11−332408号公報
特表平14−508932号公報
特表平14−517255号公報
Am. J. Clin. Nutr., 54:438-463, 1991 Nutrition, 16:143-145, 2000 Nutrition, 16:680-684, 2000 Prog. Lipid Res, 40:1-94, 2001 Nutrition, 18:178-188, 2002. Proc. Nutr. Soc., 58:377-383, 1999 Aquaculture (In Press). 2002 J. World Aquacult. Soc., 24:152-161, 1993 J. Appl. Ichthyol., 11:183-198, 1995 Aquaculture, 179:217-229, 1999 Aquaculture, 200:203-222, 2001 Biochim. Biophys. Acta, 1299: 235-244, 1996. Prog. Lipid Res., 37:73-117, 1998. Biochim. Biophys. Acta, 1486:219-231, 2000 Biochem. Physiol, 116B:263-267, 1997 FEBS Letters, 431:1-6, 1998 Biochim. Biophys. Acta, 1486:219-231, 2000. J. Biol. Chem., 276: 31561-31566 Transgenic Res., 9: 305-320, 2000. Biochemistry and molecular biology of fishes, vol. 2., pp: 207-240, 1993. Aquaculture, 197:191-204, 2001 Suisanzoshoku, 49:137-142, 2001 Cell Differen., 19:237-244, 1986. Aquaculture, 51:143-150, 1986 Mol. Mar. Biol. Biotechnol., 1:301-308, 1992 Aquaculture, 173:297-307, 1999 Science, 265:666-668, 1994a Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93:7777-7782, 1996 FEBS Letters, 287:118-120, 1991. Aquaculture, 204:255-269, 2002 Biochem. Biophys. Res. Commun., 223:650-653, 1996. Aquaculture, 173:319-332, 1999a Prog. Lipid Res., 20:13-22, 1981. J. Biol. Chem., 274:471-477, 1999 また、脂肪酸不飽和化酵素を発現させる遺伝子に関する技術としては、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を動物に導入して当該動物を形質転換し、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を当該動物において発現させることにより、前記動物において不飽和脂肪酸の含量が増加している形質転換動物(例えば、特許文献1参照)や、脂質に結合した脂肪酸のΔ9位を不飽和化するAnacystis属由来のΔ9不飽和化酵素をコードする遺伝子を導入した高等植物細胞の作出方法(例えば、特許文献2参照)や、単離された動物由来のΔ5−脂肪酸デサチュラーゼおよびその機能しうる部分(例えば、特許文献3参照)や、植物の種子中でのステアリドン酸の産生方法であって、前記方法が、植物のゲノムに、植物種子細胞中で機能的なプロモーター、Δ6−不飽和化酵素をコードするDNA配列、及び植物種子中で機能的な転写終止領域を5′→3′の転写方向で含む第1のDNA構築物を組込んだ植物を生長させる工程と、植物をΔ6不飽和化酵素が発現する条件下で生長させる工程とを含む方法(例えば、特許文献4参照)等が提案さている。
本発明の課題は、魚類の脂肪酸代謝経路を改変することにより、従来、海産魚用の配合飼料には、EPAやDHAを含む魚油を用いることが必要とされていたが、より安価で品質管理も容易な植物性油脂、あるいは獣脂を飼料とすることを可能とし、種苗生産現場におけるコスト、労力の軽減に大きく貢献し、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す魚や、その生産方法を提供することや、機能性食品としてDHAを高レベルで含有する魚類や、その生産方法を提供することにある。
本発明は、不飽和脂肪酸含量が増加した魚を作出するため、外来遺伝子によってコードされている新しい表現型の導入において、宿主個体への外来遺伝子の効率的な転写は重要な要因の1つである(Hacket, 1993; Houdebine, 2000)ところから、最初の段階として、Δ6不飽和化酵素様遺伝子の発現を可能とする適切なコンストラクトを選択した。まず、2〜3ヶ月という比較的短い世代時間、卵の数の多さ、飼育の簡便さなどの複数の利点を有する硬骨ゼブラフィッシュ(Teleostean zebrafish)であるDanio rerio(Westerfield, 1995; Gong, 1999)をモデル魚として選択した。ヤマメ(masou salmon)(Oncorhynchus masou)由来のΔ6不飽和化酵素様cDNAを、メダカ(Oryzias latipes)β−アクチンプロモーターの制御下で、ゼブラフィッシュに導入したところ、主に筋肉で発現し、EPA及びDHAの含量が増加することを見い出し、上記Δ6不飽和化酵素様遺伝子がΔ6不飽和化酵素活性を実際に有する遺伝子であることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加したトランスジェニック魚類(請求項1)や、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする請求項1記載のトランスジェニック魚類(請求項2)や、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に連結されていることを特徴とする請求項1又は2記載のトランスジェニック魚類(請求項3)や、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、以下の(A)〜(F)の何れかの塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
(A)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列;
(B)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(C)配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(D)配列番号1に示される塩基配列;
(E)配列番号1に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(F)配列番号1に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;(請求項4)や、不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸(EPA)、又はドコサヘキサエン酸(DHA)であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のトランスジェニック魚類(請求項5)や、養殖魚であることを特徴とする請求項1〜5記載のいずれか記載のトランスジェニック魚類(請求項6)に関する。
(A)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列;
(B)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(C)配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(D)配列番号1に示される塩基配列;
(E)配列番号1に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(F)配列番号1に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;(請求項4)や、不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸(EPA)、又はドコサヘキサエン酸(DHA)であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のトランスジェニック魚類(請求項5)や、養殖魚であることを特徴とする請求項1〜5記載のいずれか記載のトランスジェニック魚類(請求項6)に関する。
本発明は、種苗生産現場に於ける、コスト、労力の軽減に大きく貢献できるのみならず、活力が高く、ハンドリング耐性、低温耐性を示す仔稚魚を生産することができ、養殖海産魚用の配合飼料としてEPA、DHAを含む魚油を用いることを不要とし、より安価で品質管理も容易な植物性油脂、あるいは獣脂を利用することができる。また、本発明により生産された魚類は通常の個体より多くのDHAを含有するため、閉鎖循環式陸上養殖システムを用いて健康食品としての付加価値を有する魚類生産の実現も可能となり、さらに、水産養殖における直接的な利用にとどまらず、魚類の脂肪酸代謝の機構を分子レベルで明らかにする際の極めて有用な研究ツールとして、かかる分野に対する貢献度は極めて高い。
本発明のトランスジェニック魚類としては、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加した魚類であれば特に制限されるものではなく、上記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては動物由来、植物由来などその由来は特に制限されないが、Δ4脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子等の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を好適に例示することができ、これらは単独で又は多重に用いることができる。かかるΔ4脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子は、脂肪酸の末端カルボキシル基の炭素(デルタエンド)から数えて、それぞれ4番目、5番目、6番目の炭素において不飽和結合を形成するものであり、これらの脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、淡水魚由来やプランクトン由来のものが魚類の正常な発育や機能に悪影響を及ぼさないため好ましく、例えば、微細藻類由来のΔ4脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(Tonon, T., Harvey, D., Larson, T. R., and Graham, I. A. Identification of a very long chain polyunsaturated fatty acidΔ4-desaturase from the microalga Pavlova lutheri.FEBS Lett.553,440-444(2003).)や、大西洋産サケ由来のΔ5脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(ジーンバンク:AF478472)や、ヤマメ由来のΔ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(ジーンバンク:AB074149,AB070444)を具体的に挙げることができる。
好ましく用いることができるΔ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子としては、(A)配列番号2に示されるアミノ酸配列(ヤマメ由来のΔ6脂肪酸不飽和化酵素のアミノ酸配列)をコードする塩基配列;(B)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列;(C)配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列;(D)配列番号1に示される塩基配列(ヤマメ由来のΔ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の塩基配列);(E)配列番号1に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;又は(F)配列番号1に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;の何れかの塩基配列からなる遺伝子であれば特に制限されず、ここで「脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列」とは、魚類体内で不飽和脂肪酸の生成に何らかの形で関与するタンパク質をコードする塩基配列を意味し、その具体的な作用機構は特に限定されない。
上記「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、例えば1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を意味する。また、上記「1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列」とは、例えば1〜20個、好ましくは1〜15個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個の任意の数の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を意味する。
例えば、これら1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなるDNA(変異DNA)は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号1に示される塩基配列からなるDNAに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらDNAに変異を導入することにより、変異DNAを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.以後 "モレキュラークローニング第2版" と略す)、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38,John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異DNAを適切な発現系を用いて発現させることにより、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
上記「配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号2に示されるアミノ酸配列との相同性が60%以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上であることを意味する。
上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、DNA又はRNAなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られる塩基配列を意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAまたは該DNAの断片を固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0.1〜2倍程度のSSC溶液(1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム)を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるDNAをあげることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第2版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるDNAとしては、プローブとして使用するDNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAが挙げることができ、例えば60%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有するDNAを好適に例示することができる。
本発明の遺伝子の取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列番号1又は配列番号2に示されるアミノ酸配列又は塩基配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該遺伝子が存在することが予測されるcDNAライブラリーをスクリーニングすることにより目的の遺伝子を単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
具体的には、本発明の遺伝子が単離されたヤマメより、常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子に特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子を取得することができる。上記cDNAの起源としては、上記植物由来の各種の細胞または組織を例示することができ、また、これらの細胞又は組織からの全RNAの分離、mRNAの分離や精製、cDNAの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明の遺伝子をcDNAライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第2版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
また、上記(B)〜(F)のいずれかに示される塩基配列からなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子遺伝子としては、配列番号1に示される塩基配列又はその一部を有するDNA断片を利用し、他の生物体等より、該DNAのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異DNAの作製方法により調製することもできる。
次に、魚体内で発現する脂肪酸不飽和化酵素により生成される不飽和脂肪酸としては、用いる脂肪酸不飽和化酵素の種類や脂肪酸基質の種類によって異なるが、ドコサヘキサエン酸(DHA)やエイコサペンタエン酸(EPA)を好適に例示することができ、DHA(22:6n−3)やEPA(20:5n−3)の他、LNA(18:3n−3)、OTA(18:4n−3)、ETA(20:4n−3)、DPA(22:5n−3)、TPA(24:5n−3)、THA(24:6n−3)、リノール酸(18:2n−6)、γ−リノレン酸(18:3n−6)、エイコサトリエン酸(20:3n−6)、アラキドン酸(20:4n−6)、ドコサペンタエン酸(22:5n−6)等を挙げることができる。
本発明の不飽和脂肪酸含量増加される魚類としては、導入される脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現し、これによりその体内の不飽和脂肪酸含量が増加する魚類であれば、本来、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を有するものであっても、あるいは全く有しないものであってもよいが、養殖の対象とされている魚類、筋肉組織等の可食部分において選択的に不飽和脂肪酸含量が高まる魚類や、子孫にまで安定的に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が発現する魚類等が好ましく、魚の種類としては硬骨魚類が好ましく、硬骨魚類の中でもで、Cyprinidae、Cichlidae、Salmonidae、Claridae、Siluridae、Ictaluridaeに属する魚類が好ましい。具体的には、ブリ(Seriola quinqueradiata)、マダイ(Pagrus major)、ヒラメ(Paralichthys olivaceus)、トラフグ(Takifugu rubripes)、ヒラマサ(Seriola aureovittata)、クルマエビ(Penaeus japonicus)、ニジマス(Oncorhyncus mykiss)、カンパチ(Seriola dumerili)、シマアジ(Pseudocaranx dentex)、マハタ(Epinephelus septemfasciatus)、クロマグロ(Thunnus thynnus)等の養殖魚の他、コイ(例えばCyprinus carpio)、ゼブラフィッシュ(Danino rerio)、アフリカナマズ(Clarias gariepinus)、テラピア(Oreochronis niloticus)、タイセイヨウサケ(Salmo Salar)、メダカ(Oryzias latipes)等を好適に例示することができる。
魚類に脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を導入する発現ベクターを構築する場合、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を魚類細胞で効率よく発現するプロモーターの下流に連結した発現ベクターを作製することが好ましい。かかるプロモーターとしては、β−アクチンプロモーター、adipocyteP2(aP2)プロモーター、Mylz2 (Danio rerio myosin light polypeptide 2 skeletal muscle mylz2) プロモーター、UCP プロモーター、SV40プロモーター、サイトメガウイルスプロモーター、EF1 αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター等を例示することができるが、中でもメダカβ−アクチンプロモーターや、mylz2プロモーターが発現効率の点で好ましい。また、mRNAを安定化させるために、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の下流にウシ成長ホルモンポリアデニル化配列等のポリアデニル化配列を連結することが好まし。その他必要に応じて、遺伝子の発現を増強させる機能を持つイントロン配列やエンハンサー配列、転写終結を指令するターミネーター配列を用いることもできる。構築した発現ベクターの魚類への導入は、卵母細胞又は受精卵へのマイクロインジェクション法、ウイルスベクター感染法、パーティクルガン法、エレクトロポレーション法によって行うことができる。
本発明のトランスジェニック魚類には、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入された魚成体、その子孫の他、魚受精卵細胞、魚胚細胞なども便宜上含まれる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
[ゼブラフィッシュの飼育と食餌]
AB株のゼブラフィッシュ(walker et al., 1999)を用い、Westerfield(1995)の概要にいくつかの修正を行い、魚に産卵させ、飼育した。親魚(broodstock)を、40リットルの水槽で、明14時間、暗10時間の光周期で28±1℃で飼育した。魚に、市販の餌オトヒメ(otohime)(商品名:Nisshin 社製)及びArtemia(Salt Creek 社製)ノープリウス幼生を、一日おきにそれぞれ給餌した。一日に2回のマイクロインジェクションを可能とするため、4つの水槽にそれぞれに親魚としてメス12匹とオス8匹を入れた。これらの水槽を、2つのグループに分け、1つのグループは、10:30amに産卵させ、他方は、14:00pmに産卵させた。
AB株のゼブラフィッシュ(walker et al., 1999)を用い、Westerfield(1995)の概要にいくつかの修正を行い、魚に産卵させ、飼育した。親魚(broodstock)を、40リットルの水槽で、明14時間、暗10時間の光周期で28±1℃で飼育した。魚に、市販の餌オトヒメ(otohime)(商品名:Nisshin 社製)及びArtemia(Salt Creek 社製)ノープリウス幼生を、一日おきにそれぞれ給餌した。一日に2回のマイクロインジェクションを可能とするため、4つの水槽にそれぞれに親魚としてメス12匹とオス8匹を入れた。これらの水槽を、2つのグループに分け、1つのグループは、10:30amに産卵させ、他方は、14:00pmに産卵させた。
[Δ6不飽和化酵素cDNAのクローニング]
GenBank database (AB070444)に基づく2つの変性プライマーを用いて、PCRによりΔ6不飽和化酵素様cDNAをヤマメの肝臓から単離した。2つの変性プライマーは、フォーワード及びリバースで、それぞれ、(5'-TACTCCATGGTTCAGCAAATGAATTGAACA-3';配列番号3)及び(5'-TCGTCCATGGCCATTCACTGCTGACAAGGA-3';配列番号4)であり、発現ベクターへのクローニングを容易にするため、それぞれNcoI部位(下線部)を含んでいた。PCR増幅を下記の条件で行った。94℃で3分間、続いて94℃で30秒、62℃で30秒を30サイクル、72℃で1.5分。その後、1680bpのPCR増幅産物を、pGEM-T Easy ベクター(Promega社製)にサブクローニングした。
GenBank database (AB070444)に基づく2つの変性プライマーを用いて、PCRによりΔ6不飽和化酵素様cDNAをヤマメの肝臓から単離した。2つの変性プライマーは、フォーワード及びリバースで、それぞれ、(5'-TACTCCATGGTTCAGCAAATGAATTGAACA-3';配列番号3)及び(5'-TCGTCCATGGCCATTCACTGCTGACAAGGA-3';配列番号4)であり、発現ベクターへのクローニングを容易にするため、それぞれNcoI部位(下線部)を含んでいた。PCR増幅を下記の条件で行った。94℃で3分間、続いて94℃で30秒、62℃で30秒を30サイクル、72℃で1.5分。その後、1680bpのPCR増幅産物を、pGEM-T Easy ベクター(Promega社製)にサブクローニングした。
[導入遺伝子発現の構築]
8.5kbのプラスミドpActD6(図1)を用いて導入遺伝子を発現させた。すなわち、pRc/RSV (Invitrogen社製)をXhoIで処理して取り出したウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGH poly(A))配列を、pBluescriptSK(+/-) (Clontech社製)に結紮した。3.7kbのメダカβ−アクチンプロモーター(mβ-Actin)をPCRによって、pOBA-109から修飾し(Takagi et al., 1994)、BGHpoly(A)を含むpBluescriptSK(+/-)への結紮のためのEcoRI部位を付与した。実施例2で得られた1477kbのヤマメ(O. masau)のΔ6不飽和化酵素様遺伝子(D6D)を、GenBank database(AB070444)に基づいた2つのオリゴヌクレオチドプライマーとして、SalI認識部位(下線部)を含むフォーワードプライマーSalI-desF3(5'-TTGTCGACGGTCTGAGTGGAGCAGAGAGAA-3';配列番号5)と、リバースプライマーdes-OmaR(5'-ATCCAGGAAATGTCCTCTCTGTTCGCA-3';配列番号6)を用い、94℃で3分、続いて94℃で30秒、62℃で30秒を30サイクル、72℃で1.5分の条件でPCR増幅を行った。PCR増幅産物を、pGEM-T Easy ベクター(Promega社製)にクローニングし、SalIで処理して、Δ6不飽和化酵素様遺伝子断片を得、これをメダカβ−アクチンプロモーター(mβ-Actin)とBGHpoly(A)配列との間に挿入し、pActD6コンストラクトを調製した。
8.5kbのプラスミドpActD6(図1)を用いて導入遺伝子を発現させた。すなわち、pRc/RSV (Invitrogen社製)をXhoIで処理して取り出したウシ成長ホルモンポリアデニル化(BGH poly(A))配列を、pBluescriptSK(+/-) (Clontech社製)に結紮した。3.7kbのメダカβ−アクチンプロモーター(mβ-Actin)をPCRによって、pOBA-109から修飾し(Takagi et al., 1994)、BGHpoly(A)を含むpBluescriptSK(+/-)への結紮のためのEcoRI部位を付与した。実施例2で得られた1477kbのヤマメ(O. masau)のΔ6不飽和化酵素様遺伝子(D6D)を、GenBank database(AB070444)に基づいた2つのオリゴヌクレオチドプライマーとして、SalI認識部位(下線部)を含むフォーワードプライマーSalI-desF3(5'-TTGTCGACGGTCTGAGTGGAGCAGAGAGAA-3';配列番号5)と、リバースプライマーdes-OmaR(5'-ATCCAGGAAATGTCCTCTCTGTTCGCA-3';配列番号6)を用い、94℃で3分、続いて94℃で30秒、62℃で30秒を30サイクル、72℃で1.5分の条件でPCR増幅を行った。PCR増幅産物を、pGEM-T Easy ベクター(Promega社製)にクローニングし、SalIで処理して、Δ6不飽和化酵素様遺伝子断片を得、これをメダカβ−アクチンプロモーター(mβ-Actin)とBGHpoly(A)配列との間に挿入し、pActD6コンストラクトを調製した。
[マイクロインジェクション用のDNAの調製]
実施例3で得られた環状DNAを、0.1MのKCl/0.125%のテトラメチル−ローダミンデキストラン溶液に、30μg/mlの濃度で希釈した。DNA溶液を、超MC遠心分離濾過機0.22μm(MILLIPORE社製)で、4℃で5分間、5000rpmで微量遠心機で回転し、混入している粒子を取り除いた。3〜4μLのDNAを、清潔なカバーガラスに移し、蒸発を防ぐために数滴のミネラルオイルで覆った。
実施例3で得られた環状DNAを、0.1MのKCl/0.125%のテトラメチル−ローダミンデキストラン溶液に、30μg/mlの濃度で希釈した。DNA溶液を、超MC遠心分離濾過機0.22μm(MILLIPORE社製)で、4℃で5分間、5000rpmで微量遠心機で回転し、混入している粒子を取り除いた。3〜4μLのDNAを、清潔なカバーガラスに移し、蒸発を防ぐために数滴のミネラルオイルで覆った。
[マイクロインジェクションプレートの調製]
マイクロインジェクションプレートを作製するために、モールドを90mmのペトリ皿上に置き、約30mlの暖かい3%アガロース(蒸留水にて調製)を、プレートに注いだ。アガロースを室温で凝固した後、モールドを取り除き、マイクロインジェクションの針が貫通したときに胚を支えるための12個の溝を作製した。使用したプレートを、プラスチック製ラップで覆い、使用するまで4℃で保管した。
マイクロインジェクションプレートを作製するために、モールドを90mmのペトリ皿上に置き、約30mlの暖かい3%アガロース(蒸留水にて調製)を、プレートに注いだ。アガロースを室温で凝固した後、モールドを取り除き、マイクロインジェクションの針が貫通したときに胚を支えるための12個の溝を作製した。使用したプレートを、プラスチック製ラップで覆い、使用するまで4℃で保管した。
[マイクロインジェクションニードルの配置]
マイクロインジェクションニードルを、微細なガラスのマイクロインジェクションキャピラリーを用いて、マイクロピペットプーラー(ナリシゲ社製)(図2A)から作製した。マイクロインジェクションニードルの先端は、約5〜8μmであった。ニードルはホルダーに取りつけられ、シリンジから、マイクロマニピュレーターを右に回しフッ素樹脂製の管を通じて、針のなかにミネラルオイルを充填した。
マイクロインジェクションニードルを、微細なガラスのマイクロインジェクションキャピラリーを用いて、マイクロピペットプーラー(ナリシゲ社製)(図2A)から作製した。マイクロインジェクションニードルの先端は、約5〜8μmであった。ニードルはホルダーに取りつけられ、シリンジから、マイクロマニピュレーターを右に回しフッ素樹脂製の管を通じて、針のなかにミネラルオイルを充填した。
[マイクロインジェクションのセットアップ]
マイクロインジェクションは、立体化学マイクロスコープ、マイクロインジェクション工程中に実施例6で調製されたマイクロインジェクションニードルを制御するマイクロマニピュレーター、DNA負荷用のマイクロマニピュレーターに付属するマクネチックスタンド(ナリシゲ社製)、プラスチック製のツーウェイストッパー、フッ素樹脂製の管(ナリシゲ社製)及びマイクロインジェクションプレートで構成されたシステムを用いて行った。ニードルホルダーを取り付けたDNA負荷用のマイクロマニピュレーターを、金属面に固定されたマグネチックスタンドに取り付け、シリンジを、3mlのミネラルオイルで充填し、マイクロインジェクションニードルホルダーに取り付けられた1mmのフッ素樹脂製の管の約40cmの部分に固定されたツーウエィストッパーに直接に取り付けた。
マイクロインジェクションは、立体化学マイクロスコープ、マイクロインジェクション工程中に実施例6で調製されたマイクロインジェクションニードルを制御するマイクロマニピュレーター、DNA負荷用のマイクロマニピュレーターに付属するマクネチックスタンド(ナリシゲ社製)、プラスチック製のツーウェイストッパー、フッ素樹脂製の管(ナリシゲ社製)及びマイクロインジェクションプレートで構成されたシステムを用いて行った。ニードルホルダーを取り付けたDNA負荷用のマイクロマニピュレーターを、金属面に固定されたマグネチックスタンドに取り付け、シリンジを、3mlのミネラルオイルで充填し、マイクロインジェクションニードルホルダーに取り付けられた1mmのフッ素樹脂製の管の約40cmの部分に固定されたツーウエィストッパーに直接に取り付けた。
[卵の回収及びマイクロインジェクション]
マイクロインジェクションの当日、ランプの作動する少なくとも15分前に、実施例1のゼブラフィッシュのオス3匹とメス2匹を水槽から、3Lの飼育タンクに移した。産卵の約5分後に卵をペトリ皿に回収した。1細胞期胚を、ピペットを用いて、実施例5で調製したマイクロインジェクションプレートの溝に移した。胚盤は、マイクロインジェクションニードルに面していることが要求された。実施例4で得られたDNA溶液を、マイクロインジェクションプレート上の1細胞期胚の細胞質内に実施例7のマイクロインゼクションシステムを用いてマイクロインジェクションを行った。DNAが注入された胚を、28±1℃で保存した。非受精卵及び変形した卵を、受精5〜6時間後に取り除いた。翌日、死亡又は変形した胚を取り除き、健康な胚を新しいペトリ皿に移した。
マイクロインジェクションの当日、ランプの作動する少なくとも15分前に、実施例1のゼブラフィッシュのオス3匹とメス2匹を水槽から、3Lの飼育タンクに移した。産卵の約5分後に卵をペトリ皿に回収した。1細胞期胚を、ピペットを用いて、実施例5で調製したマイクロインジェクションプレートの溝に移した。胚盤は、マイクロインジェクションニードルに面していることが要求された。実施例4で得られたDNA溶液を、マイクロインジェクションプレート上の1細胞期胚の細胞質内に実施例7のマイクロインゼクションシステムを用いてマイクロインジェクションを行った。DNAが注入された胚を、28±1℃で保存した。非受精卵及び変形した卵を、受精5〜6時間後に取り除いた。翌日、死亡又は変形した胚を取り除き、健康な胚を新しいペトリ皿に移した。
[RNA単離及び半定量的RT−PCR]
mRNAを単離するために、20個の胚のサンプルを受精8時間後に取り出し、転写レベルを定量した。全RNAはISOGEN(Nippon Gene社製)で、製造者からの指示に従って単離した。微量のDNAを、RQ1 RNase-free Dnase(Promega社製)2U/μgで、30分、37℃で分解した。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿後、ペレットをジエチルピロカルボネート(DEPC)で処理した水に溶解した。1本鎖cDNAを、Ready-to-Go You-Prime First-Strand Beads(Amersham Pharmacia Biotech社製)で、2〜3μgの全RNAから、製造者の指示に従って合成した。この反応において、dT3RACE-VECTプライマー(5'-GTAATACGAATAACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGG(T)17-3';配列番号7)を用いた。
mRNAを単離するために、20個の胚のサンプルを受精8時間後に取り出し、転写レベルを定量した。全RNAはISOGEN(Nippon Gene社製)で、製造者からの指示に従って単離した。微量のDNAを、RQ1 RNase-free Dnase(Promega社製)2U/μgで、30分、37℃で分解した。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿後、ペレットをジエチルピロカルボネート(DEPC)で処理した水に溶解した。1本鎖cDNAを、Ready-to-Go You-Prime First-Strand Beads(Amersham Pharmacia Biotech社製)で、2〜3μgの全RNAから、製造者の指示に従って合成した。この反応において、dT3RACE-VECTプライマー(5'-GTAATACGAATAACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGG(T)17-3';配列番号7)を用いた。
外来不飽和化酵素遺伝子の転写レベルを定量するために、半定量的RT−PCRを行った。PCR分析を、20μlの10×Ex Taq緩衝液、200μMのdNTP、0.125UのEx Taqポリメラーゼ(Takara社製)、2μlのcDNAをテンプレートとして、及びそれぞれ1pmolを下記の条件下で行った。94℃で3分間、続いて94℃で30秒、62℃で30秒を24サイクル、72℃で1.5分。デサチュラーゼ用のフォーワードプライマーとしてOmar(5'-AGGACTGGCTCACCATGCAGTTGAGT-3';配列番号8)を、リバースプライマーとして前記des-Omar(配列番号4)を用いた。β‐アクチン遺伝子発現を、同量のRNA負荷の内部標準として分析した。β‐アクチン遺伝子のフォーワードプライマーとして(5'-ACTACCTCATGAAGATCCTG-3';配列番号9)を、リバースプライマーとして(5'-TTGCTGATCCACATCTGCTG-3';配列番号10)を用いた。反応液の2μlを、0.7%アガロースゲルで電気泳動して単離し、臭化エチジウムで染色し、紫外線照射で撮影した。各バンドの蛍光強度を、Densitogragh(ATTO社製)により定量化した。もっとも強い発現を示すコンストラクトを、安定した系統を作出するために使用した。
F1及びF2の不飽和化酵素遺伝子発現を、F0に使用した方法で分析した。全RNAを、一匹のDNA陽性の魚のヒレ、肝臓、筋肉から抽出し、F1における外来遺伝子の発現を同定した。F2世代の全RNAを、少なくとも20匹の2日齢の稚魚及び、少なくとも10匹の成魚の筋肉及び肝臓から抽出した。
[DNA単離及びPCR増幅]
トランスジェニック個体の同定は、PCRにより尾ヒレ組織から抽出したDNAテンプレートで行った。DNAを、DNA陽性F0と非トランスジェニック魚を交配して生産した2日齢の保存した稚魚から抽出し、生殖系列伝達物質を同定した。ゲノムDNAの単離は、DNA Isolation Kit(Puregene製)を用いて、製造者の指示に従って行った。PCR反応及び使用したプライマーは、RT−PCRに使用した方法と同じものを使用した。
トランスジェニック個体の同定は、PCRにより尾ヒレ組織から抽出したDNAテンプレートで行った。DNAを、DNA陽性F0と非トランスジェニック魚を交配して生産した2日齢の保存した稚魚から抽出し、生殖系列伝達物質を同定した。ゲノムDNAの単離は、DNA Isolation Kit(Puregene製)を用いて、製造者の指示に従って行った。PCR反応及び使用したプライマーは、RT−PCRに使用した方法と同じものを使用した。
[安定した株の調製]
DNA陽性F0を、成魚になるまで飼育した。成熟したF0を、非トランスジェニックゼブラフィッシュと交配し、生殖系列を伝達している魚をスクリーニングするために、交配によって得た少なくとも20匹の2日齢の稚魚を蓄積した。 次に生殖系列が陽性なF0を用いて、F1及びF2世代を作出した。F1及びF2の作出及びスクリーニングの工程は、F0に用いた方法と同じである。
DNA陽性F0を、成魚になるまで飼育した。成熟したF0を、非トランスジェニックゼブラフィッシュと交配し、生殖系列を伝達している魚をスクリーニングするために、交配によって得た少なくとも20匹の2日齢の稚魚を蓄積した。 次に生殖系列が陽性なF0を用いて、F1及びF2世代を作出した。F1及びF2の作出及びスクリーニングの工程は、F0に用いた方法と同じである。
[脂肪酸分析]
全脂質は、ヤマメΔ6不飽和化酵素遺伝子を含む非トランスジェニック魚及びトランスジェニック魚から抽出した。非トランスジェニック魚及びトランスジェニック魚は、同じ水槽で飼育し、全脂肪酸は魚全体より抽出した。抽出した脂肪酸は水素フレームイオン化検知器及びキャピラリーカラム30m×0.32mm×0.25μm(Supelco社製)を装備したガスクロマトグラフィー(Shimadzu 14B: Shimadzu 社製)を用いて分離し、脂肪酸から脂肪酸メチルエステル(FAME)を、文献(引用文献)記載の方法で調製した。上記ガスクロマトグラフィーの測定により、脂肪酸メチルエステルピークを、保持時間と適切なFAME標準(Supelco社製)とを比較して同定した。
全脂質は、ヤマメΔ6不飽和化酵素遺伝子を含む非トランスジェニック魚及びトランスジェニック魚から抽出した。非トランスジェニック魚及びトランスジェニック魚は、同じ水槽で飼育し、全脂肪酸は魚全体より抽出した。抽出した脂肪酸は水素フレームイオン化検知器及びキャピラリーカラム30m×0.32mm×0.25μm(Supelco社製)を装備したガスクロマトグラフィー(Shimadzu 14B: Shimadzu 社製)を用いて分離し、脂肪酸から脂肪酸メチルエステル(FAME)を、文献(引用文献)記載の方法で調製した。上記ガスクロマトグラフィーの測定により、脂肪酸メチルエステルピークを、保持時間と適切なFAME標準(Supelco社製)とを比較して同定した。
[安定した系統の調製;結果]
トランジェントな外来遺伝子発現を、受精8時間後に、注入した胚から抽出したRNAから合成したcDNAで、外来遺伝子のトランジェントな発現を分析した。トランジェントな発現を示す結果を図2に示す。また、DNA陽性の魚のヒレ、肝臓、筋肉から抽出し、F1における外来遺伝子の発現を同定した結果を図3に示す。図3には、メダカβ−アクチンプロモーターに代えてMylz2プロモーターを用いる以外は同条件で行った結果も記載されている。図3からわかるように、メダカβ−アクチンプロモーターとMylz2プロモーターのいずれのプロモーターを使用しても、ヒレと筋肉に外来遺伝子の発現を認めた。
トランジェントな外来遺伝子発現を、受精8時間後に、注入した胚から抽出したRNAから合成したcDNAで、外来遺伝子のトランジェントな発現を分析した。トランジェントな発現を示す結果を図2に示す。また、DNA陽性の魚のヒレ、肝臓、筋肉から抽出し、F1における外来遺伝子の発現を同定した結果を図3に示す。図3には、メダカβ−アクチンプロモーターに代えてMylz2プロモーターを用いる以外は同条件で行った結果も記載されている。図3からわかるように、メダカβ−アクチンプロモーターとMylz2プロモーターのいずれのプロモーターを使用しても、ヒレと筋肉に外来遺伝子の発現を認めた。
トランスジェニック個体は、ヤマメ不飽和化酵素遺伝子に特異的なプライマーを使用してヒレから抽出したゲノムDNAによるPCR増幅によってスクリーニングした。生殖系列を伝達している魚をスクリーニングするために、DNA陽性魚と非トランスジェニック魚とを交配し、結果を表1及び図4に示す。表1に示すように、DNAを注入した胚400個のうち109匹が成魚となり、このうち4匹が胚細胞にpActD6遺伝子コンストラクトを保有していた。これらの魚を用いて、F1及びF2世代を作出した。外来遺伝子のF1世代への伝達率は、表2に示すように、4.2%から44.1%の間で変化した。これらの結果により、トランスジェニックF0魚がモザイクであることを確認した。RT−PCRによって分析したより高いmRNA転写レベルを有するF1トランスジェニック株を用いて、F2世代を作出した。F1魚の代表的な外来遺伝子の発現を図5に示す。導入遺伝子のF2世代への伝達は、メンデルの分離パターンの通りだった。これらの結果は、各F1のトランスジェニック系統の全てのディプロイド細胞が、トランスジーンを含有していることを裏付けていた。
[トランスジェニック魚における脂肪酸組成]
脂肪酸メチルエステル(FAME)は、非トランスジェニック及びトランスジェニック両方の魚の全身から調製し、ガスクロマトグラフィー(GC)で分析した。トランスジェニック魚のn−3脂肪酸構成組成を表3に示す。ヤマメ不飽和化酵素遺伝子を発現するトランスジェニック魚におけるEPA及びDHAの生産は、対応する非トランスジェニック魚の1.4±0.1倍(1.86±0.03mg/g対1.32±0.05mg/g)及び2.1±0.2倍(4.62±0.22mg/g対2.22±0.08mg/g)(p<0.05)であった。しかし、トランスジェニック系統間のEPA及びDHA生産の量にかなり高い割合の相違があった。可食部におけるEPA及びDHA生産量は、全魚体中のそれぞれ75%及び78%であった。
脂肪酸メチルエステル(FAME)は、非トランスジェニック及びトランスジェニック両方の魚の全身から調製し、ガスクロマトグラフィー(GC)で分析した。トランスジェニック魚のn−3脂肪酸構成組成を表3に示す。ヤマメ不飽和化酵素遺伝子を発現するトランスジェニック魚におけるEPA及びDHAの生産は、対応する非トランスジェニック魚の1.4±0.1倍(1.86±0.03mg/g対1.32±0.05mg/g)及び2.1±0.2倍(4.62±0.22mg/g対2.22±0.08mg/g)(p<0.05)であった。しかし、トランスジェニック系統間のEPA及びDHA生産の量にかなり高い割合の相違があった。可食部におけるEPA及びDHA生産量は、全魚体中のそれぞれ75%及び78%であった。
導入した遺伝子が、Δ6又はΔ5不飽和化酵素のどちらであるか確認するために、不飽和化の基質以外の脂肪酸を合計した。トランスジェニック魚のΔ6及びΔ5不飽和化生成物は、図6に示すように、非トランスジェニック魚より高かった(p<0.05)。導入遺伝子を示すΔ6不飽和化脂肪酸生成物のより高い値は、外来のΔ6デサチュラーゼに起因している。
Claims (6)
- 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が導入され、当該脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現により、不飽和脂肪酸含量の増加したトランスジェニック魚類。
- 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、メダカ由来のβ−アクチンプロモーターの下流に連結されていることを特徴とする請求項1記載のトランスジェニック魚類。
- 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の上流に連結されていることを特徴とする請求項1又は2記載のトランスジェニック魚類。
- 脂肪酸不飽和化酵素遺伝子が、以下の(A)〜(F)の何れかの塩基配列からなる遺伝子であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
(A)配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列;
(B)配列番号2に示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(C)配列番号2に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(D)配列番号1に示される塩基配列;
(E)配列番号1に示される塩基配列において、1若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(F)配列番号1に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ脂肪酸不飽和化酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列; - 不飽和脂肪酸が、エイコサペンタエン酸(EPA)、又はドコサヘキサエン酸(DHA)であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
- 養殖魚であることを特徴とする請求項1〜5記載のいずれか記載のトランスジェニック魚類。
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NO20064420L (no) | 2007-01-02 |
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