WO2005092323A1 - LXRα受容体特異的部分アゴニスト - Google Patents

LXRα受容体特異的部分アゴニスト Download PDF

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lxr
receptor
cholesterol
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lxrα
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Kazuhide Inoue
Tomoko Mogami
Yoshinori Asakawa
Toshihiro Hashimoto
Norimasa Tamehiro
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Japan Health Sciences Foundation
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Definitions

  • LXR a receptor specific partial agonist
  • the present invention relates to an atherosclerotic heart based on the promotion of cholesterol excretion (HDL regeneration) from peripheral cells by human liver X receptor a (LXR ⁇ ) receptor-specific ligand.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating the progress of a disease and its related conditions.
  • Atherosclerosis is a general term for several diseases in which the wall of an artery becomes thick and loses flexibility. The most important and most common of these diseases is atherosclerosis, in which fat-rich substances accumulate below the lining of the arterial wall. Atherosclerosis occurs mainly in the aorta, carotid artery, and coronary artery, and is recognized as a causative factor for cardiovascular diseases such as stroke and heart attack.
  • Atherosclerosis is a pathological condition characterized by patchy thickening of the inner lining of arteries, and the thickened plaque portion (atheroma plaque or atheroma) contains a large amount of cholesterol. It is formed when macrophages take up a large amount of oxidized low-density lipoprotein (oxidized LDL), enter the gaps between endothelial cells in the blood vessel wall, and form foam cells with cholesterol.
  • oxidized LDL oxidized low-density lipoprotein
  • Arteries affected by atherosclerosis lose elasticity, and the arteries narrow as the atherosclerosis grows. Over time, calcium deposits accumulate in the atheroma and become brittle or rupture. The ruptured atheroma is engulfed by blood and causes the atheroma to expand, making the arteries even smaller. In addition, the ruptured atheroma can shed fatty content and trigger the formation of blood clots (thrombus). Blood clots can further narrow the artery or cause occlusion at that location, and can loosen and travel along the bloodstream where they can cause occlusion.
  • Preventing atherosclerosis requires eliminating manageable risk factors (such as high blood cholesterol levels). For this reason, prevention is a cholesterol-lowering product This is done by the start of a program.
  • LXR Human liver X receptor
  • a cholesterol sensor protein was found in the liver, which can convert cholesterol in the body into bile acids and excrete it.
  • the nuclear receptor LXR contains spleen (NR1H3) and j3 (NR1H2), which are highly expressed mainly in the liver and small intestine, and ⁇ is ubiquitously present throughout the body.
  • This LXR acts as an endogenous agonist for cholesterol metabolites (oxesterols) which increase in proportion to cholesterol content.
  • LXR monument cholesterol 7 alpha is the rate-limiting enzyme for producing a bile acid - Ru important receptors der to promote transcription of the hydroxylase (CYP7A1).
  • LXRa knockout mice In LXR a knockout mice, the induction of CYP7A1 expression observed in wild-type mice fed a high cholesterol diet was not observed, and LXR senses the cholesterol content in the liver to reduce excess cholesterol. It was clarified that bile acids were catabolized and reduced. It has also been demonstrated that the expression of ATP-binding cassette membrane transporters ABCG5 and ABCG8, which are responsible for cholesterol excretion from the liver to bile, is induced by LXRa.
  • LXR agonists have the effect of pumping cholesterol from peripheral tissues, returning it to the liver and excreting it from the liver, and can be expected to be an arteriosclerosis improving drug.
  • side effects such as elevated serum triglycerides were observed.
  • an object of the present invention is to provide an LXR useful for prevention and treatment of diseases related to arteriosclerosis.
  • the present inventors conducted a search for LXR-specific agonists using the reporter Gene Atssay and found that riccardin C (RC), which is a cyclic bisbenzyl compound represented by the following formula (2), The present inventors have found that specific partial agonist activity exists, and completed the present invention based on this finding.
  • RC riccardin C
  • the action of the compound according to the present invention is characterized in that it is a LXR-specific partial agonist.
  • an object of the present invention is to provide a method for inducing the expression of the ABCA1 gene, the method including a step of increasing the serum HDL level of a patient requiring such treatment.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating an LXRct-related disease comprising a cyclic bisbenzyl compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt or hydrate thereof.
  • R 1, R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom, an acyl group, an alkyl group,
  • R is a methyl group, and R and R are
  • the pharmaceutical composition of the present invention selectively activates LXRa to increase HDL production, and more specifically, to increase HDL production through regulation of ABCA1 gene expression (increase in expression). causess an increase.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention acts as a preventive or therapeutic agent for LXR-associated diseases based on a potent LXRa selective activating effect.
  • the present invention enables the preparation of a drug useful for increasing HDL levels. Furthermore, the present invention can be used for preparing a useful drug for reducing the risk of developing a disease related to atherosclerosis or the like or for treating a patient who has already developed the disease.
  • the compound described in the present specification which is a partial agonist, can be expected to have an effect of reducing side effects.
  • FIG. 1A is a view showing the results of a reporter gene assay on LXR response elements with various concentrations of a test compound in CV_1 cells.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of reporter gene attestation for a report.
  • FIG. 2A shows the results of a ligand competition experiment in which a test compound and LXR agonist TO901317 were tested for their ability to compete with the LXR a receptor for binding.
  • FIG. 2B is a view showing the results of a ligand competition experiment in which a test compound and LXR agonist TO901317 were tested for their ability to compete with the LXR ⁇ receptor for binding.
  • FIG. 2C is a view showing the results of a test on the binding of a test compound to an LXR ⁇ receptor in the absence of LXR agonist TO901317.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the effect of test compounds on cholesterol excretion in THP_1 cells.
  • LXRa-related disease means a disease that can be improved by activating LXRa, preferably by selectively activating LXRa, and typically includes LXR agonist, preferably a disease which can be ameliorated by the action of an LXR a selective agonist.
  • LXR spleen-related diseases include arteriosclerosis such as atherosclerosis, chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis, metabolic disorders such as diabetes, cirrhosis, cholelithiasis, hyperlipoproteinemia, Alzheimer's disease, and anemia. It includes at least one disease selected from the group consisting of breast cancer, colorectal cancer, prostate cancer, leukemia and the like.
  • This treatment can be used in any patient who desires an increase in serum HDL.
  • Patients amenable to such treatment are those with HDL levels below the clinically desired level (less than about 40 mg / dl).
  • the LXR receptor-specific ligand is a unit preparation containing a conventional non-toxic pharmaceutically acceptable carrier, adjuvant, and vehicle, and is orally administered, rectally administered, It can be administered topically, parenterally (including subcutaneous injection, intravenous, intramuscular, intrasternal injection or infusion), ophthalmic administration (eye drops) or inhalation spray (pulmonary or nasal administration).
  • the dose of the LXRa receptor-specific ligand is usually 0.1 to 150 mg / kg of body weight, preferably 1 to 50 mg / kg of body weight.
  • the administration subject is a mammal, usually a human.
  • the pharmaceutical composition containing the active ingredient described in the present specification can be produced by a conventional pharmaceutical compounding technique.
  • tablets, troches, lozenges, aqueous or oily suspensions, hard or soft capsules, or syrups or elixirs can be in a form suitable for oral use.
  • Oral compositions can be prepared according to methods known in the art of manufacture, and such compositions for oral dosage form should be prepared to contain one or more drugs, usually selected from pharmaceutical media.
  • Can be. Tablets contain the active ingredient in admixture with non-toxic pharmaceutically acceptable excipients which are suitable for the manufacture of tablets.
  • Suitable excipients include, but are not limited to, for example, inert diluents (such as dicalcium phosphate), disintegrants (such as corn starch, potato starch, and alginic acid), and binders (such as tragacanth gum acacia).
  • inert diluents such as dicalcium phosphate
  • disintegrants such as corn starch, potato starch, and alginic acid
  • binders such as tragacanth gum acacia.
  • lubricants magnesium stearate etc.
  • sweeteners saccharin etc.
  • compositions containing a compound including a pharmaceutically acceptable salt or a hydrate thereof are also included in the scope of the present invention.
  • R, R, and R each independently represent a hydrogen atom, an acyl group (eg, an acetyl group,
  • a metal salt may be used to dissolve the compound in water.
  • R is a hydrogen atom.
  • R and R are both hydrogen atoms, R is a hydrogen atom
  • salts can be administered The choice may be made of salts with organic or inorganic bases which do not harm or inconvenience the body and the environment of administration. Such salts are formed from monovalent or polyvalent ions, particularly preferred are inorganic ions such as sodium, potassium, magnesium, calcium and the like.
  • riccardin C which was found as a partial agonist capable of specifically activating LXR from a natural compound library
  • Atsusei was compared using riccardin F (RF) shown in the following structural formula as a target compound.
  • Riccardin F is a compound represented by the following formula (3), which is substituted with a hydroxyl catalyl group at the 14-position of riccardin C, which is an LXRa-specific partial agonist in the present application.
  • Atsey was performed by transient transfection of CV-1 cells and tested for its ability to activate human LXRa and human LXR beta isoforms using the natural compound library as a search source.
  • Cells were transformed with an LXRa expression vector and a human LXR ⁇ expression vector, a control plasmid containing a human LXR expression vector, a reporter construct having a firefly luciferase gene linked to LXRE, and a LacZ construct linked to SV40. We transfeeted together.
  • riccardin C functions as an agonist selectively over LXR.
  • riccardin F had no effect on both ⁇ and ⁇ , suggesting that the hydroxyl group at position 14 plays an important role in this activation.
  • the binding to the synthetic peptide having LXXLL caused by the ligand binding to human LXR and human LXR / 3 receptor is analyzed based on the fluorescence deflection method.
  • the human LXRs ligand binding domain (LBD) was expressed and prepared as a GST-labeled fusion protein in E. coli BL21.
  • FIG. 2A shows the effect of various concentrations of a test compound (RF or RC) on the fluorescence polarization of human LXR a -GST protein in the presence of TO901317 (1 ⁇ M).
  • FIG. 2B shows the effect of various concentrations of the test compound (RF or RC) on the fluorescence polarization of human LXR ⁇ -GST protein in the presence of TO901317 (1 ⁇ M).
  • Figure 2C in the absence TO901317, showing the effect against the fluorescence polarization of the human LXR alpha -GST proteins of the test compound at various concentrations (RF or RC).
  • riccardin F alone had little effect on the degree of fluorescence deflection to LXR, and did not show the recruitment activity of coactivator.
  • Riccardin C specifically bound to the LXR receptor LBD and antagonistically inhibited the action of the potent LXR synthetic ligand TO901317.
  • the antagonistic activity against LXR / 3 against TO901317 was not shown, and the results also showed the specificity of riccardin C for LXR. Therefore, it was revealed that riccardin C is a specific partial agonist for LXR.
  • THP-1 cells cultured in RPMI medium containing 10% FCS were incubated in serum-free medium (0.2% BSA) containing the test reagent. 24 hours later,
  • RNAeasy QIAGEN
  • Quantitative PCR was performed using a 7700 Sequence Detector (ABI) and a TaqMan-mRNA quantification system. In short, about 150 ng of DNase-treated mRNA is reverse transcribed and the oligonucleotide probe
  • the cells treated with riccardin C are about 1.8 times higher than the cells not treated with the drug.
  • THP-1 cells cultured in 10% FCS medium were cultured in a serum-free medium (0.2% BSA) containing the test compound for 24 hours.
  • Cholesterol contained in the medium was prepared by extracting the medium with 4 times the volume of chloroform / methanol (2: 1) and washing the organic solvent layer with an equal amount of 50% methanol.
  • Intracellular cholesterol was prepared by extracting cells with hexane / isopropanol (3I2). The cholesterol level in the obtained crude extract was measured by quantification of a quinone dye produced by the cholesterol oxidase method (Determina LTCII; Kyowa Medettas).
  • FIG. 4 shows that cholesterol excretion from THP-1 cells due to the action of riccardin C is increased.
  • riccardin C has an effect of promoting HDL production, suggesting that it is effective for preventing or treating the progression of atherosclerotic heart disease and its related conditions.

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Abstract

　核内レセプターであるヒト肝臓Xレセプターα（liver X receptor α; LXRα）の特異的リガンドとして受容体に結合して抹消細胞のHDL産生を促進する、動脈硬化に関連する疾患の予防及び治療に有用な化合物を提供することを課題とする。 　下記の式（１）で示される環状ビスベンジル化合物又は薬学的に許容しうる塩またはそれらの水和物等のLXRα選択的アゴニストを含む、LXRα関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物。 （式中、R1、R2及びR3はそれぞれ独立して水素原子、アシル基、アルキル基及びアリール基からなる群から選ばれる基である。但し、R1がメチル基であり、且つR2及びR3が水素原子である場合を除く。）

Description

明 細 書
LXR a受容体特異的部分ァゴニスト
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト肝臓 Xレセプターひ (liver X receptor a； LXR α )受容体特異的リガ ンドによる末梢細胞からのコレステロールの排出（HDL新生)促進に基づいた、ァテロ ーム硬化性心疾患およびその関連病態の進行を予防および治療する方法に関する ものである。
背景技術
[0002] 動脈硬化とは、動脈の壁が厚くなつて柔軟性を失う幾つかの疾患の総称である。こ れらの疾患のうち最も重要で最も多いのは、脂肪に富む物質が動脈壁の内層の下に 蓄積するァテローム動脈硬化である。ァテローム動脈硬化は、主に大動脈'頸動脈 · 冠状動脈で起こり、循環器病である脳卒中や心臓発作等の原因因子として認知され ている。
[0003] ァテローム動脈硬化は動脈内層の斑状の肥厚化を特徴とする病態で、肥厚化した プラーク部分（ァテローム斑またはァテローム）は、コレステロールを多く含んでいる。 これは、マクロファージが多量な酸化低密度リポ蛋白 (酸化 LDL)を取り込み、血管壁 の内皮細胞の隙間に入り込んで、コレステロールを抱えたまま泡沫細胞となる事によ り形成される。
[0004] ァテローム動脈硬化に冒された動脈は弾性を失レ、、ァテロームが成長するにつれ て動脈は狭くなる。次第に、ァテロームにはカルシウム沈着物が集まり、もろくなつたり 破裂したりする。破裂したァテロームには血液が入り込み、ァテロームを拡大させるた め、動脈はさらに狭くなる。さらに、破裂したァテロームからは脂肪性の内容物が流出 し、血塊（血栓）の形成を誘発することもある。血塊はその場所で動脈をさらに狭窄さ せたり、閉塞を引き起こしたりするほか、遊離して血流に沿って移動し、そこで閉塞を 引き起こすこともある。
[0005] ァテローム動脈硬化を予防するには、管理できる危険因子（血中コレステロール濃 度の高値等）をなくす必要がある。このため、予防はコレステロール値の低下プロダラ ム等の開始により行われている。
[0006] コレステロールのセンサー蛋白であるヒト肝臓 Xレセプター（liver X receptor; LXR) は体内のコレステロールを胆汁酸に変換して排出できる肝臓で発見された。核内レ セプター LXRにはひ （NR1H3)と j3 (NR1H2)が存在しており、 ひは主に肝臓や小腸に おいて高く発現し、 βは全身にュビキタスに存在している。この LXRには、コレステロ ール含量に比例して増加するコレステロール代謝物（ォキシステロール類）力 内因 性のァゴニストとして作用している。 LXRひは胆汁酸を生成する為の律速酵素である コレステロール 7 α—水酸化酵素 (CYP7A1)の転写を促進する重要なレセプターであ る。 LXR aノックアウトマウスでは高コレステロール餌を投与した野生型マウスに見ら れる CYP7A1の発現誘導が観察されな力、つた事から、 LXRひは肝臓内のコレステロ一 ノレ含量を感知して、過剰コレステロールを胆汁酸に異化し減少させている事が明らか となった。また、肝臓から胆汁へのコレステロール排出を担う ATP結合カセット膜トラン スポーター ABCG5や ABCG8の発現も、 LXR aにより誘導される事が証明されている
[0007] 一方、 CYP7Aが発現していない末梢細胞のマクロファージにおいては、コレステロ ール過剰蓄積の防止機構として、 HDLの構成成分である ApoAl蛋白を介した細胞外 への排出（HDL新生）により、細胞内コレステロール含量が制御されている。この制御 には ABCA1蛋白が必須であり、その発現は LXRにより誘導される。したがって、 LXR の制御がコレステロール排出の促進による HDL新生を促し、動脈硬化改善に結びつ くものと考えられる。実際、 ABCA1の変異により家族性 HDL欠損が発症し、 ABCA1の 過剰発現はマウスにおいて動脈硬化の進展を抑制する効果を持つ。
[0008] 総合的に判断すると、 LXRァゴニストは末梢組織からコレステロールを汲み上げ、そ れを肝臓へ戻して肝臓から排出する作用を有し、動脈硬化改善薬として十分に期待 できる。し力、しながら、幾つかの LXRァゴニストを動物に投与したところ、血清トリグリセ リドの上昇等の副作用が認められた。このような副作用は，肝臓での LXRによる
SREBP-lc等の過剰な発現誘導に起因するものと考えられる。したがって、ァテローム 動脈硬化の予防や治療を行うためには、 LXRひへの過剰な刺激を抑制するとともに 、適度な LXR a活性を保持できる部分ァゴニストの利用が有効であると考えられる。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] そこで本発明の課題は、動脈硬化に関連する疾患の予防及び治療に有用な LXR
a特異的部分ァゴニストを提供することにある。
課題を解決するための手段
[0010] 本発明者らは、レポータージーンアツセィを用いて LXRひ特異的ァゴニストの探索 を行った結果、下記式（2)に示す環状ビスべンジル化合物である riccardin C (RC)に 、 LXRひ特異的な部分ァゴニスト活性が存在する事を見出し、この知見に基づいて 本発明を完成した。
[化 1]
Figure imgf000005_0001
[0011] すなわち、第一の視点において、本発明による前記化合物の作用は、 LXRひ特異 的部分ァゴニストであることを特徴とする。
[0012] また別の視点において、 ABCA1遺伝子を発現誘導する方法であって、そのような 処置を必要とする患者の血清 HDLレベルを増加させる段階を有する方法を提供する 事にある。
[0013] 更に他の視点において、ァテローム性動脈硬化の予防法、並びにその疾患が臨床 的に明らかになった場合の治療方法であって、ァテローム性動脈硬化発症の危険性 を有する患者または既に発症してレ、る患者に対して、適宜に投与する段階を有する 方法を提供する事にある。
[0014] すなわち本発明は、以下の発明を包含する。
[0015] 1.下記式（1)に示される環状ビスべンジル化合物又は薬学的に許容しうるその塩又 は水和物を含む、 LXR ct関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物。 [化 2]
Figure imgf000006_0001
[0016] (式中、 R 、 R及び Rはそれぞれ独立して水素原子、ァシル基、アルキル基及びァリ
1 2 3
ール基からなる群から選ばれる基である。但し、 Rカ チル基であり、且つ R及び Rが
1 2 3 水素原子である場合を除く。 )
2. LXR a関連疾患が動脈硬化症である上記 1.に記載の医薬組成物。
[0017] 3.動脈硬化症がァテローム性動脈硬化症である上記 2.に記載の医薬組成物。
[0018] 本発明に係る医薬組成物は LXR aを選択的に活性化して、 HDLの生産の増加、よ り具体的には ABCA1遺伝子の発現制御 (発現の増加）を介した HDLの生産の増加を 引き起こす。本発明に係る医薬組成物は力かる LXR a選択的活性化作用に基づレヽ て、 LXRひ関連疾患の予防又は治療剤として働く。
発明の効果
[0019] 本発明により、 HDLレベルを上昇させるための有用な薬剤の調製が可能となる。さ らに、本発明はァテローム性動脈硬化症等にかかわる疾患の発症リスクを減少させる 、あるいは既に発症している患者への治療を目的とした有用な薬剤の調製に用いる 事ができる。また、部分ァゴニストである本明細書に記載の化合物には、副作用の低 減という効果が期待できる。
[0020] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-094177号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1A]CV_1細胞において、各種濃度の被験化合物による LXRひレスポンスエレメン トに対するレポータージーンアツセィの結果を示す図である。
[図 1B]CV_1細胞において、各種濃度の被験化合物による LXR j3レスポンスエレメン トに対するレポータージーンアツセィの結果を示す図である。
[図 2A]被験化合物と LXRァゴニスト TO901317との LXR a受容体への結合に関して、 競合能を試験したリガンド競合実験の結果を示す図である。
[図 2B]被験化合物と LXRァゴニスト TO901317との LXR β受容体への結合に関して、 競合能を試験したリガンド競合実験の結果を示す図である。
[図 2C]LXRァゴニスト TO901317不存在下における、被験化合物の LXR α受容体へ の結合を試験した結果を示す図である。
[図 3]被験化合物が及ぼす遺伝子発現の制御について、 THP-1細胞の
ABCAlmRNAの発現レベルを定量的に測定した結果を示す図である。
[図 4]THP_1細胞におけるコレステロール排出に対して、被験化合物が及ぼす影響を 測定した結果をしめす図である。
発明を実施するための最良の形態
[0022] 本発明において「LXR a関連疾患」とは、 LXR aを活性化することにより、好ましくは LXR aを選択的に活性化することにより改善され得る疾患を意味し、典型的には、 LXR aァゴニスト、好ましくは LXR a選択的ァゴニストの作用により改善され得る疾患 を意味する。 「LXRひ関連疾患」としては、ァテローム性動脈硬化症等の動脈硬化症 、慢性関節リウマチ等の慢性炎症疾患、糖尿病等の代謝障害、肝硬変、胆石症、高 リポ蛋白質血症、アルツハイマー病、貧血乳癌、大腸癌、前立腺癌および白血病な どからなる群から選択される少なくとも一種の疾患が挙げられる。
[0023] 血清 HDLの増加を望むいずれの患者においても、この治療を用いることができる。
そのような治療が好適な患者は、臨床で望まれる HDLレベル以下 (約 40mg/dl以下） の患者である。
[0024] 本発明の治療方法において、上記の LXRひ受容体特異的リガンドは、従来の無毒 性で薬剤上許容される担体、補助剤および媒体を含む単位製剤で、経口投与、直 腸投与、局所投与、非経口投与 (皮下注射、静脈、筋肉、胸骨内での注射または注 入法を含む）、点眼投与（眼薬)または吸入噴霧 (肺または鼻腔投与)する事ができる 。また、 LXR a受容体特異的リガンドの投与量は、通常 0.1— 150mg/体重 kgであり、 好ましくは 1一 50mg/体重 kgである。投与対象は、哺乳動物であり、通常ヒトである。 [0025] 本明細書記載の有効成分を含む医薬組成物は、慣用医薬配合技術により製造す る事ができる。例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ剤、水系または油系の懸濁液、硬もし くは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤として、経口用に適した形態とす ること力 Sできる。経口用の組成物は製造業界の公知の方法に従って調製することが でき、そのような経口剤形用組成物は、任意通常医薬媒体から選択される 1以上の薬 剤を含有させて製造する事ができる。錠剤には、錠剤の製造に適した無毒性で製薬 上許容される賦形剤との混合で有効成分を含有させる。適当な賦形剤としては限定 されるものではないが、例えば不活性希釈剤（リン酸二カルシウムなど）、崩壊剤（コ ーンスターチ'ジャガイモデンプン 'アルギン酸など）、結合剤（トラガカントゴム'ァカ シァ'トウモロコシデンプン 'ゼラチンなど）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムなど）、 甘味剤 (ショ糖 ·乳糖 'サッカリンなど)等があり得る。
[0026] 本明細書記載の化合物は、広義には下記式（1)の構造を持つ化合物類として示さ れる。動脈硬化に関連する疾患の予防及び治療に好ましい態様において、薬学的 に許容可能な塩又はこれらの水和物も含めた化合物を含む組成物も本発明の範囲 に含まれる。
[化 3]
Figure imgf000008_0001
R、 R、及び Rはそれぞれ独立して水素原子、アシノレ基（例えばァセチル基、プロ
1 2 3
ピオニル基、ベンゾィル基等）、炭素数 1一 10の低級アルキル基（例えばメチル基、ブ チル基等）、ァリール基（例えばフエニル基、 1一ナフチル基等）から選ばれる官能基 であり、本化合物を水に溶解するために金属塩としても良い。但し、 Rカ チル基で R
1
、 Rが水素原子の場合を除く。 R及び Rがともに水素原子である場合、 Rは水素原
2 3 2 3 1 子、ァシル基又はァリール基であることが好ましい。薬学的に許容しうる塩は、被投与 体および投与環境に有害または不都合を及ぼさない有機または無機塩基との塩から 選択しえる。このような塩は一価または多価イオンから生成され、特に好ましいものは 、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の無機イオンである。
実施例
本発明は以下の実施例においてより具体的に説明される。実施例は、天然化合物 ライブラリーから LXRひを特異的に活性化できる部分ァゴニストとして見出した riccardin Cの作用について調べたものである。対象化合物として以下の構造式に示 す riccardin F (RF)を用いてアツセィの比較を行った。 Riccardin Fは本願における LXR a特異的部分ァゴニストである riccardin Cの 14位の水酸基カ トキシル基に置換 された下記の式（3)で示される化合物である。
[化 4]
Figure imgf000009_0001
(実施例 1) レポータージーンアツセィによる LXRァゴニストの取得
アツセィは CV-1細胞の一過性トランスフエクシヨンによって行い、天然化合物ライブ ラリーを探索源としてヒト LXR aおよびヒト LXR βァイソフォームを活性ィ匕する能力に 関して試験した。細胞を、 LXR a発現ベクターおよびヒト LXR β発現ベクターのレ、ず れカ そしてヒト LXR発現ベクター、 LXREが結合したホタルルシフェラーゼ遺伝子を 有するレポーターコンストラクト、および SV40が結合した LacZコンストラクトを有するコ ントロールプラスミドと一緒にトランスフエタトした。ポリフエタト (Polyfect; QIAGEN)を使 用して細胞にトランスフエタトし、 48ゥエルプレートで 3時間放置してから細胞を PBSで 洗浄後、被験化合物を含む 10%脱脂血清培地（20 /i Mコンパクチン、 10 μ Mメバロ ン酸含有）を加えた。 24時間インキュベーション後、細胞を回収し、 LXRの活性化をプ 口メガ社製ルシフェラーゼアツセィシステムおよびクロ口フエノールレッド— β—ガラタト ピラノシド (CRPG)の加水分解による 一ガラクトシダーゼ活性により定量した。尚、転 写活性は次のように定義して評価した。
[0030] (真の LXRE転写活性） = (ルシフェラーゼ活性測定値) I ( β -ガラタトシダーゼ活性 測定値）
図 1Aおよび Βに示したように、 riccardin Cは LXRひ選択的にァゴニストとして機能し ていることが分かる。一方、 riccardin Fはひ、 β共に作用を示さず、 14位の水酸基が 本活性化において重要な役割を果たす事が示唆された。
[0031] (実施例 2)ペプチドセンサーアツセィ
本アツセィでは、ヒト LXRひおよびヒト LXR /3レセプターにリガンドが結合することに よって引き起こされる LXXLLを有する合成ペプチドとの結合を、蛍光偏向法に基づ いて解析する。ヒト LXRsリガンド結合領域 (LBD)は、大腸菌 BL21株に GST標識した融 合蛋白として発現し調製した。 TO901317との競合能を試験するため、様々な濃度の 被験化合物および TO901317 ( 1 μ Μ)の存在下、ヒト LXR a -GSTまたはヒト LXRベー タ -GST蛋白および蛍光標識ペプチドを、最終容量 100 /i 1の緩衝液（150mM塩化ナ トリウム， lOmM HEPES (pH7.9), 2mM塩化マグネシウム， 5mM DTT)中で混和した。 室温で 1時間インキュベーション後、蛍光偏向（mP)を測定した。図 2Aは TO901317 ( 1 μ Μ)の存在下における、様々な濃度の被験化合物（RFまたは RC)のヒト LXR a -GSTタンパク質の蛍光偏向度に対する影響を示す。図 2Bは TO901317 ( 1 μ Μ)の存 在下における、様々な濃度の被験化合物（RFまたは RC)のヒト LXR β -GSTタンパク 質の蛍光偏向度に対する影響を示す。図 2Cは TO901317不存在下における、様々 な濃度の被験化合物（RFまたは RC)のヒト LXR α -GSTタンパク質の蛍光偏向度に対 する影響を示す。
[0032] 図 2Αに示すように、 riccardin Fは単独では LXRひに対する蛍光偏向度にほとんど 影響せず、コアクチベータ一のリクルートメント活性を示さなレ、。し力、し、 riccardin Cは LXRひ受容体 LBDと特異的に結合し、強力な LXR合成リガンドである TO901317の作 用を拮抗的に阻害した。なお、 LXR /3への TO901317に対する拮抗阻害活性は示さ ず、本結果においても riccardin Cの LXRひ特異性が示された。したがって、 riccardin Cは LXRひ特異的部分ァゴニストであることが明らかとなった。
[0033] (実施例 3)定量的 PCR HDL新生に重要な役割を果たしている ABCA1蛋白の mRNA発現量変化を、
RT-PCRを用レ、て測定した。 10%FCSを含む RPMI培地で培養した THP-1細胞を、被 験試薬を含む無血清培地 (0.2%BSA)でインキュベートした。 24時間後、
RNAeasy(QIAGEN)を用いて細胞力 mRNAを調製した。定量 PCRは 7700 Sequence Detector (ABI)および TaqMan-mRNA定量システムを用いて実施した。略言すれば 、約 150ngの DNase処理 mRNAを逆転写し、オリゴヌクレオチドプローブ
(FAM-ACGAATAGCAGGCTCCAACCCTGACC— TAMURA)ならびにヒト ABCA1プ ライマー (Fw;5，-AGGTTTGGAGATGGTTATACAATAGTTG_3，，
Rev;5，_CTTTTAGGACACTTCCCGGAAA-3，)を用いる PCRによって、各試料中の mRNAを定量し、 18sRNA量に対して正規化を行った。
[0034] 薬剤未処理の細胞に対し、 riccardin Cを処理した細胞では 1.8倍程度の
ABCAlmRNAの増加が確認できた。 （図 3)したがって、 riccardin Cは細胞力、らコレス テロールを排出し、 HDL新生を促進する作用を持つ事が推定される。そこで、 HDLの 構成成分である ApoAlを介した THP-1細胞におけるコレステロールの排出量につい て測定を行った。
[0035] (実施例 4)コレステロールの定量
10%FCS培地で培養した THP-1細胞を、試験化合物を含む無血清培地（0.2% BSA)で 24時間培養した。培地中に含まれるコレステロールは、培地を 4倍量のクロ口 ホルム/メタノール (2:1)で抽出し、有機溶媒層を等量の 50%メタノールで洗浄して調 製した。細胞内のコレステロールは、細胞をへキサン/イソプロパノール (3 I 2)で抽出 して調製した。得られた粗抽出物中のコレステロール値は、コレステロール酸化酵素 法により生成したキノン系色素の定量 (デタミナ一 LTCII ;協和メデッタス）により測定し た。
[0036] 図 4は、 riccardin Cの作用による THP-1細胞からのコレステロール排出が増加して レヽる事を示している。つまり、 riccardin Cは HDL産生を促進する作用を有しており、ァ テローム硬化性心疾患およびその関連病態の進行の予防または治療に対して有効 である事が示唆される。
[0037] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本

Claims

請求の範囲 下記式（1)に示される環状ビスべンジル化合物又は薬学的に許容しうるその塩又 は水和物を含む、 LXRひ関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
[化 1]
Figure imgf000013_0001
(式中、 R、 R及び Rはそれぞれ独立して水素原子、ァシル基、アルキル基及びァリ
1 2 3
ール基からなる群から選ばれる基である。但し、 R力 Sメチル基であり、且つ R及び Rが
1 2 3 水素原子である場合を除く。 )
[2] LXR a関連疾患が動脈硬化症である請求項 1に記載の医薬組成物。
[3] 動脈硬化症がァテローム性動脈硬化症である請求項 2に記載の医薬組成物。
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