JP5028594B2 - ＬＸＲα受容体特異的部分アゴニスト - Google Patents

Description

本発明は、ヒト肝臓Xレセプターα（liver X receptor α; LXRα）受容体特異的リガンドによる末梢細胞からのコレステロールの排出（HDL新生）促進に基づいた、アテローム硬化性心疾患およびその関連病態の進行を予防および治療する方法に関するものである。

動脈硬化とは、動脈の壁が厚くなって柔軟性を失う幾つかの疾患の総称である。これらの疾患のうち最も重要で最も多いのは、脂肪に富む物質が動脈壁の内層の下に蓄積するアテローム動脈硬化である。アテローム動脈硬化は、主に大動脈・頚動脈・冠状動脈で起こり、循環器病である脳卒中や心臓発作等の原因因子として認知されている。

アテローム動脈硬化は動脈内層の斑状の肥厚化を特徴とする病態で、肥厚化したプラーク部分（アテローム斑またはアテローム）は、コレステロールを多く含んでいる。これは、マクロファージが多量な酸化低密度リポ蛋白(酸化LDL)を取り込み、血管壁の内皮細胞の隙間に入り込んで、コレステロールを抱えたまま泡沫細胞となる事により形成される。

アテローム動脈硬化に冒された動脈は弾性を失い、アテロームが成長するにつれて動脈は狭くなる。次第に、アテロームにはカルシウム沈着物が集まり、もろくなったり破裂したりする。破裂したアテロームには血液が入り込み、アテロームを拡大させるため、動脈はさらに狭くなる。さらに、破裂したアテロームからは脂肪性の内容物が流出し、血塊（血栓）の形成を誘発することもある。血塊はその場所で動脈をさらに狭窄させたり、閉塞を引き起こしたりするほか、遊離して血流に沿って移動し、そこで閉塞を引き起こすこともある。

アテローム動脈硬化を予防するには、管理できる危険因子（血中コレステロール濃度の高値等）をなくす必要がある。このため、予防はコレステロール値の低下プログラム等の開始により行われている。

コレステロールのセンサー蛋白であるヒト肝臓Xレセプター（liver X receptor; LXR）は体内のコレステロールを胆汁酸に変換して排出できる肝臓で発見された。核内レセプターLXRにはα（NR1H3）とβ（NR1H2）が存在しており、αは主に肝臓や小腸において高く発現し、βは全身にユビキタスに存在している。このLXRには、コレステロール含量に比例して増加するコレステロール代謝物（オキシステロール類）が、内因性のアゴニストとして作用している。LXRαは胆汁酸を生成する為の律速酵素であるコレステロール7α−水酸化酵素(CYP7A1)の転写を促進する重要なレセプターである。LXRαノックアウトマウスでは高コレステロール餌を投与した野生型マウスに見られるCYP7A1の発現誘導が観察されなかった事から、LXRαは肝臓内のコレステロール含量を感知して、過剰コレステロールを胆汁酸に異化し減少させている事が明らかとなった。また、肝臓から胆汁へのコレステロール排出を担うATP結合カセット膜トランスポーターABCG5やABCG8の発現も、LXRαにより誘導される事が証明されている。

一方、CYP7Aが発現していない末梢細胞のマクロファージにおいては、コレステロール過剰蓄積の防止機構として、HDLの構成成分であるApoA1蛋白を介した細胞外への排出（HDL新生）により、細胞内コレステロール含量が制御されている。この制御にはABCA1蛋白が必須であり、その発現はLXRにより誘導される。したがって、LXRの制御がコレステロール排出の促進によるHDL新生を促し、動脈硬化改善に結びつくものと考えられる。実際、ABCA1の変異により家族性HDL欠損が発症し、ABCA1の過剰発現はマウスにおいて動脈硬化の進展を抑制する効果を持つ。

総合的に判断すると、LXRアゴニストは末梢組織からコレステロールを汲み上げ、それを肝臓へ戻して肝臓から排出する作用を有し、動脈硬化改善薬として十分に期待できる。しかしながら、幾つかのLXRアゴニストを動物に投与したところ、血清トリグリセリドの上昇等の副作用が認められた。このような副作用は, 肝臓でのLXRによるSREBP-1c等の過剰な発現誘導に起因するものと考えられる。したがって、アテローム動脈硬化の予防や治療を行うためには、LXRαへの過剰な刺激を抑制するとともに、適度なLXRα活性を保持できる部分アゴニストの利用が有効であると考えられる。

そこで本発明の課題は、動脈硬化に関連する疾患の予防及び治療に有用なLXRα特異的部分アゴニストを提供することにある。

本発明者らは、レポータージーンアッセイを用いてLXRα特異的アゴニストの探索を行った結果、下記式（２）に示す環状ビスベンジル化合物であるriccardin C（RC）に、LXRα特異的な部分アゴニスト活性が存在する事を見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち、第一の視点において、本発明による前記化合物の作用は、LXRα特異的部分アゴニストであることを特徴とする。

また別の視点において、ABCA1遺伝子を発現誘導する方法であって、そのような処置を必要とする患者の血清HDLレベルを増加させる段階を有する方法を提供する事にある。

更に他の視点において、アテローム性動脈硬化の予防法、並びにその疾患が臨床的に明らかになった場合の治療方法であって、アテローム性動脈硬化発症の危険性を有する患者または既に発症している患者に対して、適宜に投与する段階を有する方法を提供する事にある。

すなわち本発明は、以下の発明を包含する。

１．下記式（１）に示される環状ビスベンジル化合物又は薬学的に許容しうるその塩又は水和物を含む、LXRα関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物。

（式中、R₁、R₂及びR₃はそれぞれ独立して水素原子、アシル基、アルキル基及びアリール基からなる群から選ばれる基である。但し、R₁がメチル基であり、且つR₂及びR₃が水素原子である場合を除く。）
２．LXRα関連疾患が動脈硬化症である上記１．に記載の医薬組成物。

３．動脈硬化症がアテローム性動脈硬化症である上記２．に記載の医薬組成物。

本発明に係る医薬組成物はLXRαを選択的に活性化して、HDLの生産の増加、より具体的にはABCA1遺伝子の発現制御（発現の増加）を介したHDLの生産の増加を引き起こす。本発明に係る医薬組成物はかかるLXRα選択的活性化作用に基づいて、LXRα関連疾患の予防又は治療剤として働く。

本発明により、HDLレベルを上昇させるための有用な薬剤の調製が可能となる。さらに、本発明はアテローム性動脈硬化症等にかかわる疾患の発症リスクを減少させる、あるいは既に発症している患者への治療を目的とした有用な薬剤の調製に用いる事ができる。また、部分アゴニストである本明細書に記載の化合物には、副作用の低減という効果が期待できる。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2004-094177号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

CV-1細胞において、各種濃度の被験化合物によるLXRαレスポンスエレメントに対するレポータージーンアッセイの結果を示す図である。 CV-1細胞において、各種濃度の被験化合物によるLXRβレスポンスエレメントに対するレポータージーンアッセイの結果を示す図である。 被験化合物とLXRアゴニストTO901317とのLXRα受容体への結合に関して、競合能を試験したリガンド競合実験の結果を示す図である。 被験化合物とLXRアゴニストTO901317とのLXRβ受容体への結合に関して、競合能を試験したリガンド競合実験の結果を示す図である。 LXRアゴニストTO901317不存在下における、被験化合物のLXRα受容体への結合を試験した結果を示す図である。 被験化合物が及ぼす遺伝子発現の制御について、THP-1細胞のABCA1mRNAの発現レベルを定量的に測定した結果を示す図である。 THP-1細胞におけるコレステロール排出に対して、被験化合物が及ぼす影響を測定した結果をしめす図である。

本発明において「LXRα関連疾患」とは、LXRαを活性化することにより、好ましくはLXRαを選択的に活性化することにより改善され得る疾患を意味し、典型的には、LXRαアゴニスト、好ましくはLXRα選択的アゴニストの作用により改善され得る疾患を意味する。「LXRα関連疾患」としては、アテローム性動脈硬化症等の動脈硬化症、慢性関節リウマチ等の慢性炎症疾患、糖尿病等の代謝障害、肝硬変、胆石症、高リポ蛋白質血症、アルツハイマー病、貧血乳癌、大腸癌、前立腺癌および白血病などからなる群から選択される少なくとも一種の疾患が挙げられる。

血清HDLの増加を望むいずれの患者においても、この治療を用いることができる。そのような治療が好適な患者は、臨床で望まれるHDLレベル以下（約40mg/dl以下）の患者である。

本発明の治療方法において、上記のLXRα受容体特異的リガンドは、従来の無毒性で薬剤上許容される担体、補助剤および媒体を含む単位製剤で、経口投与、直腸投与、局所投与、非経口投与（皮下注射、静脈、筋肉、胸骨内での注射または注入法を含む）、点眼投与（眼薬）または吸入噴霧（肺または鼻腔投与）する事ができる。また、LXRα受容体特異的リガンドの投与量は、通常0.1〜150mg/体重kgであり、好ましくは1〜50mg/体重kgである。投与対象は、哺乳動物であり、通常ヒトである。

本明細書記載の有効成分を含む医薬組成物は、慣用医薬配合技術により製造する事ができる。例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ剤、水系または油系の懸濁液、硬もしくは軟カプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤として、経口用に適した形態とすることができる。経口用の組成物は製造業界の公知の方法に従って調製することができ、そのような経口剤形用組成物は、任意通常医薬媒体から選択される1以上の薬剤を含有させて製造する事ができる。錠剤には、錠剤の製造に適した無毒性で製薬上許容される賦形剤との混合で有効成分を含有させる。適当な賦形剤としては限定されるものではないが、例えば不活性希釈剤（リン酸二カルシウムなど）、崩壊剤（コーンスターチ・ジャガイモデンプン・アルギン酸など）、結合剤（トラガカントゴム・アカシア・トウモロコシデンプン・ゼラチンなど）、潤滑剤（ステアリン酸マグネシウムなど）、甘味剤（ショ糖・乳糖・サッカリンなど）等があり得る。

本明細書記載の化合物は、広義には下記式（１）の構造を持つ化合物類として示される。動脈硬化に関連する疾患の予防及び治療に好ましい態様において、薬学的に許容可能な塩又はこれらの水和物も含めた化合物を含む組成物も本発明の範囲に含まれる。

R₁、R₂、及びR₃はそれぞれ独立して水素原子、アシル基（例えばアセチル基、プロピオニル基、ベンゾイル基等）、炭素数1〜10の低級アルキル基（例えばメチル基、ブチル基等）、アリール基（例えばフェニル基、1−ナフチル基等）から選ばれる官能基であり、本化合物を水に溶解するために金属塩としても良い。但し、R₁がメチル基でR₂、R₃が水素原子の場合を除く。R₂及びR₃がともに水素原子である場合、R₁は水素原子、アシル基又はアリール基であることが好ましい。薬学的に許容しうる塩は、被投与体および投与環境に有害または不都合を及ぼさない有機または無機塩基との塩から選択しえる。このような塩は一価または多価イオンから生成され、特に好ましいものは、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の無機イオンである。

本発明は以下の実施例においてより具体的に説明される。実施例は、天然化合物ライブラリーからLXRαを特異的に活性化できる部分アゴニストとして見出したriccardin Cの作用について調べたものである。対象化合物として以下の構造式に示すriccardin Ｆ（RF）を用いてアッセイの比較を行った。Riccardin Ｆは本願におけるLXRα特異的部分アゴニストであるriccardin Cの14位の水酸基がメトキシル基に置換された下記の式（３）で示される化合物である。

（実施例1） レポータージーンアッセイによるLXRアゴニストの取得
アッセイはCV-1細胞の一過性トランスフェクションによって行い、天然化合物ライブラリーを探索源としてヒトLXRαおよびヒトLXRβアイソフォームを活性化する能力に関して試験した。細胞を、LXRα発現ベクターおよびヒトLXRβ発現ベクターのいずれか、そしてヒトLXR発現ベクター、LXREが結合したホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するレポーターコンストラクト、およびSV40が結合したLacZコンストラクトを有するコントロールプラスミドと一緒にトランスフェクトした。ポリフェクト(Polyfect; QIAGEN)を使用して細胞にトランスフェクトし、48ウェルプレートで3時間放置してから細胞をPBSで洗浄後、被験化合物を含む10％脱脂血清培地（20μＭ コンパクチン、10μＭ メバロン酸含有）を加えた。24時間インキュベーション後、細胞を回収し、LXRの活性化をプロメガ社製ルシフェラーゼアッセイシステムおよびクロロフェノールレッド−β−ガラクトピラノシド(CRPG)の加水分解によるβ−ガラクトシダーゼ活性により定量した。尚、転写活性は次のように定義して評価した。

（真のLXRE転写活性）＝（ルシフェラーゼ活性測定値）/（β−ガラクトシダーゼ活性測定値）
図１ＡおよびＢに示したように、riccardin CはLXRα選択的にアゴニストとして機能していることが分かる。一方、riccardin Fはα、β共に作用を示さず、14位の水酸基が本活性化において重要な役割を果たす事が示唆された。

（実施例２）ペプチドセンサーアッセイ
本アッセイでは、ヒトLXRαおよびヒトLXRβレセプターにリガンドが結合することによって引き起こされるLXXLLを有する合成ペプチドとの結合を、蛍光偏向法に基づいて解析する。ヒトLXRsリガンド結合領域(LBD)は、大腸菌BL21株にGST標識した融合蛋白として発現し調製した。TO901317との競合能を試験するため、様々な濃度の被験化合物およびTO901317（1μM）の存在下、ヒトLXRα-GSTまたはヒトLXRベータ-GST蛋白および蛍光標識ペプチドを、最終容量100μlの緩衝液（150mM 塩化ナトリウム, 10mM HEPES (pH7.9), 2mM 塩化マグネシウム, 5mM DTT）中で混和した。室温で1時間インキュベーション後、蛍光偏向（mP）を測定した。図２ＡはTO901317（1μM）の存在下における、様々な濃度の被験化合物（RFまたはRC）のヒトLXRα-GSTタンパク質の蛍光偏向度に対する影響を示す。図２ＢはTO901317（1μM）の存在下における、様々な濃度の被験化合物（RFまたはRC）のヒトLXRβ-GSTタンパク質の蛍光偏向度に対する影響を示す。図２ＣはTO901317不存在下における、様々な濃度の被験化合物（RFまたはRC）のヒトLXRα-GSTタンパク質の蛍光偏向度に対する影響を示す。

図２Ａに示すように、riccardin Fは単独ではLXRαに対する蛍光偏向度にほとんど影響せず、コアクチベーターのリクルートメント活性を示さない。しかし、riccardin CはLXRα受容体LBDと特異的に結合し、強力なLXR合成リガンドであるTO901317の作用を拮抗的に阻害した。なお、LXRβへのTO901317に対する拮抗阻害活性は示さず、本結果においてもriccardin CのLXRα特異性が示された。したがって、riccardin CはLXRα特異的部分アゴニストであることが明らかとなった。

（実施例３）定量的PCR
HDL新生に重要な役割を果たしているABCA1蛋白のmRNA発現量変化を、RT-PCRを用いて測定した。10％FCSを含むRPMI培地で培養したTHP-1細胞を、被験試薬を含む無血清培地（0.2％BSA）でインキュベートした。24時間後、RNAeasy(QIAGEN)を用いて細胞からmRNAを調製した。定量PCRは7700 Sequence Detector（ABI）およびTaqMan-mRNA定量システムを用いて実施した。略言すれば、約150ngのDNase処理mRNAを逆転写し、オリゴヌクレオチドプローブ(FAM-ACGAATAGCAGGCTCCAACCCTGACC-TAMURA)ならびにヒトABCA1プライマー(Fw;5'-AGGTTTGGAGATGGTTATACAATAGTTG-3', Rev;5'-CTTTTAGGACACTTCCCGGAAA-3')を用いるPCRによって、各試料中のmRNAを定量し、18sRNA量に対して正規化を行った。

薬剤未処理の細胞に対し、riccardin Cを処理した細胞では1.8倍程度のABCA1mRNAの増加が確認できた。（図３）したがって、riccardin Cは細胞からコレステロールを排出し、HDL新生を促進する作用を持つ事が推定される。そこで、HDLの構成成分であるApoA1を介したTHP-1細胞におけるコレステロールの排出量について測定を行った。

（実施例４）コレステロールの定量
10％FCS培地で培養したTHP-1細胞を、試験化合物を含む無血清培地（0.2％BSA）で24時間培養した。培地中に含まれるコレステロールは、培地を4倍量のクロロホルム/メタノール(2:1)で抽出し、有機溶媒層を等量の50％メタノールで洗浄して調製した。細胞内のコレステロールは、細胞をヘキサン/イソプロパノール(3 / 2)で抽出して調製した。得られた粗抽出物中のコレステロール値は、コレステロール酸化酵素法により生成したキノン系色素の定量（デタミナーLTCII；協和メデックス）により測定した。

図４は、riccardin Cの作用によるTHP-1細胞からのコレステロール排出が増加している事を示している。つまり、riccardin CはHDL産生を促進する作用を有しており、アテローム硬化性心疾患およびその関連病態の進行の予防または治療に対して有効である事が示唆される。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (3)

1. 下記式（２）に示される環状ビスベンジル化合物又は薬学的に許容しうるその塩又は水和物を含む、動脈硬化症、慢性炎症疾患、代謝障害、肝硬変、胆石症、高リポ蛋白質血症およびアルツハイマー病からなる群から選択されるLXRα関連疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
   
2. LXRα関連疾患が動脈硬化症である請求項１に記載の医薬組成物。
3. 動脈硬化症がアテローム性動脈硬化症である請求項２に記載の医薬組成物。