WO2005085844A1 - 角層中の酸化タンパク質を指標とする角層の透明性・保水性を評価する方法 - Google Patents

角層中の酸化タンパク質を指標とする角層の透明性・保水性を評価する方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention provides a method for determining the transparency of the stratum corneum using the oxidized protein in the stratum corneum as an indicator.
  • a method for evaluating water retention a method for detecting the degree of oxidation of proteins in the stratum corneum based on the transparency and water retention of the stratum corneum, and a method for inhibiting the oxidation of proteins in the stratum corneum, This document relates to a method for maintaining and improving transparency of a layer.
  • the sebum on the skin surface is oxidized by free radicals and lipid peroxide is generated, which initiates protein oxidation.Once the lipid peroxide is generated, the oxidation proceeds in a chain. It is thought that it not only stimulates the skin surface but also penetrates deep into the stratum corneum and damages cells. Therefore, the properties of skin oxidized proteins, such as their abundance and distribution, are evaluated to understand the skin quality or skin condition.Then, the evaluation results are used to determine the policy of the skin care method and select cosmetics. It is expected that it can be used in some way. However, at present, although a vague relationship between oxidized proteins and skin damage is expected, it is not clear how corneal protein oxidation actually affects skin properties. Has not been elucidated. Disclosure of the invention
  • oxidized proteins present in the skin can be used to improve skin quality, etc., it is expected to be extremely beneficial in terms of dermatology and cosmetics. It can also be a powerful tool for providing counseling services for advice such as the skin care method.
  • the present inventor examined the effects of stratum corneum on skin properties.As the oxidation of stratum corneum progressed, the water retention and transparency of the stratum corneum were lost. I found something to go. It is expected that the water retentivity and transparency of the stratum corneum will be lost to some extent due to UV irradiation, drying, aging, etc. It is the first discovered fact that protein oxidation is involved, and elucidation of this fact is extremely significant from a dermatological and cosmetic point of view.
  • the detection of stratum corneum oxidized protein is performed by specifically labeling the carboxylate group of the oxidized protein in the stratum corneum sample collected from the skin with fluorescence and detecting the light emitted therefrom.
  • the fluorescent labeling of the oxidized protein with respect to the carbonyl group of the oxidized protein is preferably performed using a hydrazino group-containing fluorescent substance, such as fluorescein-5-thiosemicarbazide or Texas red hydrazide.
  • the present invention provides a method for detecting the degree of oxidation of a protein in a stratum corneum, which is based on the transparency and the water retention of the stratum corneum.
  • the present invention provides a method for maintaining and improving the transparency and Z or water retention of the stratum corneum by suppressing the oxidation of proteins in the stratum corneum.
  • Fig. 1 is a graph showing the decrease in the water holding power of the pig skin stratum corneum by acrolein treatment.
  • Fig. 2 is a graph showing the decrease in water retention of pig horny layer due to acrolein treatment.
  • Fig. 3 shows the horny water of pig skin caused by hypochlorous acid (20 mM, 1 hn): ⁇ low retention Dalaf showing below.
  • Fig. 4 is a graph showing the decrease in the water retention of the stratum corneum of the human arm by hypochlorous acid treatment.
  • Fig. 5 shows the decrease in transparency of the pig skin stratum corneum by acrolein treatment.
  • the present invention provides a method for evaluating the transparency and / or water retention of a horny layer using an oxidized protein in the horny layer as an index.
  • the skin will look as if it is transparent, and will have a very aesthetically pleasing appearance.
  • the skin with high “water retention” of the stratum corneum or skin has a fresh, moist and healthy state. Therefore, it is extremely important for cosmetology that the skin have transparency and water retention, and in general, the transparency and water retention of the stratum corneum and the skin are subjective aspects of beauty specialists such as beauty technicians.
  • the tests were carried out by sensory tests that depended on the skin, optical inspections and moisture tests of skin samples that required complicated operations and expensive equipment and facilities.
  • the present invention uses the oxidized protein in the stratum corneum as an index, and more specifically, detects the abundance and distribution state of the oxidized protein in the stratum corneum, thereby obtaining “transparency” of the stratum corneum and thus the skin. It is possible to check “water retention” by simpler and more objective means.
  • the method for detecting corneal oxidized protein is not particularly limited, and various methods known in the art can be used.
  • a stratum corneum oxidized protein described in JJ Thi eleet al. FEBS Letter, 1998 Feb 6, 422 (3), 403-406
  • an adhesive tape is applied to the skin surface and peeled off.
  • a tape with a stratum corneum (“tape stratum corneum”) is obtained by performing such a so-called tape stripping operation, and oxidized proteins are detected by ELISA.
  • tape stratum corneum a tape with a stratum corneum
  • the corneal oxidized protein is detected by specifically labeling the carbonyl group of the oxidized protein in the corneal sample collected from the skin with fluorescence and detecting the fluorescence.
  • detection can be performed under a fluorescence microscope.
  • the specific fluorescent labeling of the carbonyl group of the oxidized protein may be preferably performed using a hydrazino group-containing fluorescent substance, such as fluorescein-15-thiosemicarbazide or texas thread hydrazide, on the oxidized protein.
  • a hydrazino group-containing fluorescent substance such as fluorescein-15-thiosemicarbazide or texas thread hydrazide
  • the horny layer sample derived from the skin may be a sample derived from any part of the body, or may be a culture of such a sample (tissue or cell).
  • tissue or cell Typical examples of the body part or region from which the sample is derived include a facial color, forehead, back of hand, and trunk.
  • Such a sample may be obtained by an invasive method such as so-called surgical means, but especially for the purpose of evaluating skin quality, for simplicity. It is preferably obtained from the skin by a non-invasive method.
  • a non-invasive method tape stripping or abrasion method commonly used in the technical field can be used.
  • Tape stripping is particularly preferred in the present invention because a two-dimensional state of the skin can be directly transferred to the adhesive tape by applying and peeling an adhesive tape piece to the skin surface layer. . If the horny layer of the tape is collected by tape stripping, and the oxidized protein is specifically fluorescently stained without cutting, the two-dimensional oxidized protein corresponding to the actual two-dimensional properties of the skin can be obtained. Information will be obtained.
  • a preferred method of tape stripping is to first clean the surface layer of the skin with, for example, ethanol to remove sebum, dirt, etc., and cut a piece of adhesive tape cut to an appropriate size (for example, 5 x 5 cm) on the skin surface. This is done by applying light force on the tape, applying even force to the entire tape and pressing it flat, and then peeling off the adhesive tape with even force.
  • the adhesive tape may be a commercially available cellophane tape or the like, and, for example, a Scotch Superstressing Mailing Tape (manufactured by 3M) can be used.
  • the fluorescent substance that specifically fluorescently labels the carboxy group of the oxidized protein that can be used in the preferred embodiment of the present invention is a hydrazino group that can bind to the carbonyl group of the oxidized protein.
  • fluorescent materials include fluorescein-15-thiosemicarbazide, Texas red hydrazide, and the like.
  • the detection of the oxidized protein can be specifically performed, for example, as follows.
  • An appropriate buffer for example, 100 mM MES-Na buffer ( ⁇ 5.5)
  • biotin hydrazide For the specific fluorescent labeling of the oxidized protein, a combination of biotin hydrazide and fluorescently labeled avidin can be used. Since biotin hydrazide also has a hydrazino group, it can bind to the carbonyl group of proteins. In this case, biotin hydrazide is first bound to the oxidized protein, and then the fluorescently labeled avidin is bound to the biotin hydrazide via the biotin-avidin bond. As a result, the oxidized protein is fluorescently labeled. Piotin hydrazide is well known in the art, and for example, one manufactured and sold by Pierce can be used. As the fluorescent avidin, for example, fluorescein avidin can be used.
  • the detection of an oxide protein can be specifically performed, for example, as follows.
  • An appropriate buffer for example, 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)
  • the plate is sufficiently washed with an appropriate physiological solution (eg, a phosphate buffered saline solution (PBS)), and reacted with fluorescent-labeled avidin at room temperature for several hours (eg, 1 hour);
  • an appropriate physiological solution eg, a phosphate buffered saline solution (PBS)
  • Specific fluorescent labeling of the oxidized protein can also be carried out by allowing dinitrile phenylhydrazine to act on and bind to the carbonyl group of the oxidized protein, and labeling the dinitrophenol portion with a fluorescent dye. Therefore, in a further preferred embodiment of the present invention, the dinitrate phenol portion of the dinitrate phenylhydrazine bonded to the carbonyl group of the oxidized protein can be detected by a fluorescent immunoassay or the like.
  • detection of an oxidized protein can be specifically performed, for example, as follows:
  • a suitable buffer eg, dinitrophenylhydrazine (DNPH) in 100 mM MES-Na buffer (pH 5.5)
  • DNPH dinitrophenylhydrazine
  • the plate is sufficiently washed with an appropriate physiological solution (eg, a buffered phosphate buffered saline (PBS)), and then an anti-DNP antibody, for example, a heron DNP antibody (manufactured by ZYMED) is used. Reacting the solution at room temperature for several hours (eg, one hour);
  • an appropriate physiological solution eg, a buffered phosphate buffered saline (PBS)
  • PBS buffered phosphate buffered saline
  • an anti-DNP antibody for example, a heron DNP antibody (manufactured by ZYMED) is used. Reacting the solution at room temperature for several hours (eg, one hour);
  • the present invention provides a method for detecting the degree of oxidation of a protein in the stratum corneum using the transparency and / or water retention of the stratum corneum as an index.
  • oxidation of stratum corneum affects skin "transparency” and "water retention”, but oxidation of stratum corneum includes aging of skin on the skin. It may be affecting the various properties of the system. Therefore, it is possible to detect and deal with various other properties such as skin aging caused by oxidization of the stratum corneum, using the "transparency” and “water retention” of the stratum corneum as indicators. Get.
  • the “transparency” and “water retention” of the stratum corneum and skin are determined by sensory tests that rely on the subjectivity of beauty specialists such as beauty technicians, and by optical and moisture tests of skin samples. be able to.
  • the present invention also provides a method for maintaining the transparency and the water retention of the stratum corneum by suppressing the oxidation of proteins in the stratum corneum.
  • Suppression of corneal protein oxidation can be achieved by, for example, dissolving a known antioxidant, for example, a known compound such as ascorbic acid or vitamin E in a suitable solvent, and applying an appropriate amount to the skin.
  • Experiment 1 Evaluation of "water retention" of stratum corneum using corneal oxidized protein as an index (1) Dried pork skin (Aroask, Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) was immersed in water for 3 days. The pig skin was taken out and immersed in a 0, 1, 10, 100 mM acrolein (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) solution for 3 hours for oxidation treatment. Acrolein oxidizes by acting on proteins, producing aldehyde protein adducts. After the oxidation treatment, it was washed with water for 1 hour.
  • acrolein Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.
  • Figure 1 shows the results of the ice content of the stratum corneum as skin conductance values. As is evident from FIG. 1, a decrease in the water content depending on the oxidation treatment concentration due to acrolein was observed. In other words, a decrease in the horny layer water retention due to the oxidation treatment was observed.
  • the black pig skin was oxidized for 1 hour with a solution of 10 mM acrolein (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.). After washing with water for 1 hour, the water was thoroughly wiped off, and the change in the water content of the stratum corneum was measured over time using a mask 200. The results are shown in FIG. A decrease in stratum corneum water retention due to oxidation with acrolein was observed in pig skin.
  • Black pig skin was treated with 20 mM hypochlorous acid for 1 hour. After washing with water for 1 hour, the water was thoroughly wiped off, and the change in the water content of the stratum corneum was measured over time with a skicon.
  • Figure 3 shows the results. A decrease in the water content of the stratum corneum was also observed in pig skin by the oxidation treatment with hypochlorous acid.
  • Experiment 4 Evaluation of the “water retention” of the stratum corneum using the stratum corneum oxidized protein as an index (4)
  • the human arm skin was occluded with PBS or 20 mM hypochlorous acid for 1 hour. After washing with water for 1 hour, the water was thoroughly wiped off, and changes in the water content of the stratum corneum were measured over time using a skicon.
  • Fig. 4 shows the results. A decrease in horny layer water retention due to oxidation was also observed in human skin.
  • Dried pork skin (Arotesque, Taiho Pharmaceutical Co., Ltd.) was immersed in water for 3 days.
  • the pig skin was taken out and immersed in an acrolein (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) solution of 0, 1, 10 and lO O mM for 3 hours for oxidation treatment. After the oxidation treatment, it was washed with water for 1 hour. After washing, drying was started on the scaffold (humidity: 50%, temperature: 25 ° C) with the stratum corneum facing up, and the appearance of the pig skin dried for 24 hours was visually observed.
  • Figure 5 shows the results. As is evident from FIG. 5, the transparency of the pig skin not subjected to the oxidation treatment was high, while the transparency was reduced in a concentration-dependent manner when treated with the vaccum lane.

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Abstract

本発明は、角層中の酸化タンパク質を指標とした角層の透明性・保水性の評価方法を提供する。

Description

角層中の酸化タンパク質を指標とする角層の透明性 · 保水性を評価 する方法
技術分野
本発明は、 角層中の酸化タンパク質を指標と した角層の透明性 - 日ノ
保水性の評価方法、 角層の透明性 ·保水性を指標と した角層中のタ ンパク質の酸化度の検出方法、 さ らには角層中のタンパク質の酸化 を抑制することにより、 角層の透明性書 · 保水性を保持 · 向上させる 方法に関する。
背景技術
肌質 （または皮膚の状態） を的確に把握することは、 よ り健康な 皮膚を維持するための的確なスキンケア を行う上で重要である。 そ のため、 化粧品によるスキンケアを実施するに際し、 例えば、 美容 技術者による問診などを通じて、 化粧品の使用者の肌質が評価され てきた。 また、 肌質の客観的な評価を目 的と して、 各種の計測機器 を使用して、 観察又は測定されるパラメ一ターによ り、 皮膚の状態 または機能を評価することも行われている。
近年、 皮膚の加齢に伴う老化や光老化 との関係で、 角層酸化タン パク質の研究が盛んに行われている。 主な酸化タンパク質と して、 酸化を受けた結果カルボニル基の導入されたタンパク質があり、 一 般に、 タンパク質における Lys、 Arg、 Pr oといったアミ ノ酸残基の N H2基が直接酸化されてカルボニル基となった結果生成されたものと 、 脂質が酸化して過酸化脂質、 更には分解して反応性の高いアルデ ヒ ドとなり、 それがタンパク質と結合することで生成されたものと がある。 酸化タンパク質は老化関連での研究が豊富にされており、 加齢 （脳、 肝、 線維芽細胞） 、 アルツハイマー病、 早老症 （We rne r 症候群） 等において増加することが認められている。
皮膚においては、 皮膚表面の皮脂がフリ一ラジカルによって酸化 し、 過酸化脂質が生成することでタンパク質の酸化は開始され、 い つたん過酸化脂質が生成されると、 酸化は連鎖的に進行し、 肌表面 に刺激を与えるだけにと どまらず、 角質層の奥まで入り込んで細胞 にダメージを与えるものと考えられる。 従って、 皮膚の酸化タンパ ク質の性状、 例えば存在量、 分布状態等を評価し、 肌質または皮膚 の状態を把握し、 その後のスキンケア法の方針決定や化粧品の選定 のためにその評価結果を何らかの形で活用できるものと期待される 。 しかしながら、 現在のところ、 酸化タンパク質と皮膚のダメージ との間に漠然と した関係が存在すると予測されてはいるものの、 角 層タンパク質の酸化が皮膚の性状に実際にどのような影響を及ぼし ているかについては解明されるに至っていない。 発明の開示
皮膚に存在する酸化タンパク質の評価結果を肌質の改善などに活 用できれば、 皮膚学的 · 化粧学的側面において極めて有益であると 予測され、 例えば近年における化粧品業界などで行われている適切 なスキンケア法などのァ ドバイスを目的とするカウンセリ ングサ一 ビスの提供のための有力な手段ともなり得る。
本発明者は、 上記事実を鑑み、 角層タンパク質が皮膚の性状に及 ぼす影響を検討したところ、 角層タンパク質の酸化が進行するにつ れ角層の保水性及び透明性が失われていく ことを見出した。 紫外線 照射や乾燥、 老化などが原因で角層の保水性 · 透明性が失われるこ とはある程度予想されるが、 角層の保水性 · 透明性の低下に角層タ ンパク質の酸化が関与していることははじめて見出された事実であ り、 このような事実の解明は皮膚学的、 化粧品学的見地から極めて 有意義である。
従って、 上記事実の解明に基づき、 本発明は第一の観点において
、 角層中の酸化タンパク質を指標とする、 角層の透明'卜 及び Z又は 保水性を評価するための方法を提供する。 好適な態様 ^こおいて、 角 層酸化タンパク質の検出は、 皮膚から採取した角層試料中の酸化タ ンパク質のカルボ二ル基を特異的に蛍光標識し、 その達光を検出す ることで行う。 酸化タンパク質のカルポニル基の特異酌な蛍光標識 は、 好ましく は酸化タンパク質にヒ ドラジノ基含有蛍 物質、 例え ばフルォレセィ ンー 5 —チォセミカルバジ ド、 テキサスレッ ドヒ ド ラジドなどを用いて行う。
別の観点からすると、 本発明は、 角層の透明性及びノ又は保水性 を指標とする、 角層中のタンパク質の酸化度を検出するための方法 を提供する。
さらには、 本発明は角層中のタンパク質の酸化を抑讳 することに より、 角層の透明性及び Z又は保水性を保持 · 向上させる方法を提 供する。
角層タンパク質の酸化が及ぼす肌への影響の解明によ り、 角層酸 化タンパク質を指標と したスキンケア手段の提供が可售 となる。 図面の簡単な説明
図 1はァクロレイ ン処理による豚皮角層水分保持力 低下を示す グラフである。
図 2はァクロ レイ ン処理による豚皮角層水分保持力 低下を示す グラフである。
図 3は次亜塩素酸 （20mM、 1 hn) による豚皮角層水:^保持力の低 下を示すダラフである。
図 4は次亜塩素酸処理によるヒ ト腕皮膚角層水分保持力の低下を 示すダラフである。
図 5はァクロ レイ ン処理による豚皮角層透明性の低下を示す。 発明を実施するための最良の形態
第一の観点において、 本発明は、 角層中の酸化タンパク質を指標 とする、 角層の透明性及び/又は保水性を評価するための方法を提 供する。
角層又は肌の 「透明性」 が高いと、 あたかも肌が透き通ってみえ るような状態になり、 美容上きわめて好ましい外観を示すことにな る。 また、 角層又は肌の 「保水性」 が高い皮膚では肌がみずみずし く、 潤いのある健康な状態になる。 そのため肌が 「透明性」 · 「保 水性」 を有することは美容学上極めて重要であり、 一般に角層や肌 の 「透明性」 や 「保水性」 は美容技術者などの美容専門家の主観を 頼り とした官能テス トや、 面倒な操作、 高価な装置 · 設備を必要と する皮膚試料の光学的検査や水分検査などによ り行われていた。 本 発明は角層中の酸化タンパク質を指標とすることで、 より詳しくは 角層中の酸化タンパク質の存在量、 分布状態等を検出することで、 角層、 ひいては肌の 「透明性」 · 「保水性」 をよ り簡単かつ客観的 な手段で調べることを可能とする。
角層酸化タンパク質に関する研究が多々行われており、 その検出 方法にも様々なものが知られている。 本発明において、 角層酸化タ ンパク質の検出方法は特に制限されるものではなく、 当業界周知の 様々な方法を利用することができる。 例えば、 J. J. Thi e l e e t al . FEBS Le t t er 1998 Feb 6， 422 ( 3 ) , 403— 406に記載の角層酸ィ匕タン パク質の検出方法では、 粘着テープを皮膚表層に貼付け、 剥がすと いったいわゆるテープス ト リ ッビング操作を行う ことで角層の付着 したテープ （ 「テープ角層」 ） を獲得し、 酸化タンパク質を ELI SA にて検出する方法である。 J. J. Thie l e et al. J. Inves t. Dermato 1. 1999， Sep , 113 ( 3 )， 335- 359に記載の方法は、 テープ角層から タンパク質抽出を行い、 可溶性成分を DNPH標識し、 SDS- PAGEにかけ 、 抗 DNP抗体を用いてウェスタンプロ ッ トを行う ことで酸化タンパ ク質の検出を行っている。 S. Sander et al. J. Invest. Dermato 1. 2002 , Apr , 118 (4) , 618-625に記載の方法は、 ヒ ト皮膚組織切 片を DNPHで標識し、 抗 DNPで染色することで酸化タンパク質の検出 を行っている。
本発明の好適な態様において、 角層酸化タンパク質の検出は、 皮 膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボ二ル基を特異 的に蛍光標識し、 その蛍光を検出することで行う。 かかる検出は蛍 光顕微鏡下で行う ことができる。 酸化タンパク質のカルボニル基の 特異的な蛍光標識は、 好ましくは酸化タンパク質にヒ ドラジノ基含 有蛍光物質、 例えばフルォレセイ ン一 5—チォセミカルパジ ド、 テ キサスレッ ドヒ ドラジ ドなどを用いて行ってよい。 この方法によれ ば、 例えば蛍光顕微鏡によ り得た検出結果を画像化することで、 皮 膚角質層の酸化タンパク質の皮膚上での性状の二次元的な情報を簡 易に獲得し、 例えば化粧品等の販売の際の力ゥンセリ ングサービス におけるかかる酸化タンパク質の情報の活用を図ることが可能とな る。
本発明において、 皮膚由来の角層試料は、 身体のいずれの部分に 由来する試料でもよく、 また、 かような試料 （組織もしくは細胞） の培養物であってもよい。 該試料の由来する身体の部位または領域 の典型例と しては、 顔面の頰、 額、 手甲および体幹などを挙げるこ とができる。 このよ うな試料は、 所謂、 外科的手段等の侵襲的な方法により取 得されたものであってもよいが、 殊に肌質の評価を目的とする場合 には、 簡易さを理由に、 非侵襲的な方法により皮膚から取得される ものであることが好ましい。 非侵襲的な方法と しては、 当該技術分 野で常用されているテープス ト リ ッビングや擦過法等を拳げること ができる。
テープス ト リ ツビングは、 皮膚表層に粘着テープ片を貼付、 剥が すことを実施することで、 皮膚の二次元的状態をその粘着テープに そのまま転写させることができるため、 本発明において特に好まし い。 テープス ト リ ッピングによ りテープ角層を採取し、 裁断せずに そのままの状態で酸化タンパク質を特異的に蛍光染色すれば、 実際 の皮膚の二次元的性状に対応した酸化タンパク質の二次元的情報が 得られること となる。
テープス ト リ ッビングの好ましい方法は、 まず皮膚の表層を例え ばエタノールなどで浄化して皮脂、 汚れ等を取り除き、 適当なサイ ズ （例えば 5 X 5cm) に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載 せ、 テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、 その後均等 な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。 粘着テープは市販の セロファンテープなどであってよく、 例えば Sc o t ch Supers t rength Mai l ing Tape ( 3M社製） 等が使用できる。
本発明の好適な態様において利用できる酸化タンパク質のカルボ 二ル基を特異的に蛍光標識する蛍光物質は、 酸化タンパク質のカル ポニル基に結合できるヒ ドラジノ基
— N H N H 2
を有するものが好ましい。 そのよ うな蛍光物質の例には、 フルォ レセィ ン一 5 —チォセミカルバジ ド、 テキサスレッ ドヒ ドラジ ドな どが挙げられる。 このよ うなヒ ドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、 酸化タン パク質の検出は、 具体的には、 例えば以下のようにして実施できる
( 1 )角層試料を、 例えばテープス ト リ ツビングによ り、 採取する
(2 )これに適当な緩衝液 （例えば lOOmMの MES- Na緩衝液 （ρΗ5· 5)
) 中のヒ ドラジノ基含有蛍光物質を室温にて数時間 （例えば 1時間 ) 反応させる ；
( 3 )反応終了後に適当な生理溶液 （例えば緩衝液リ ン酸緩衝生理 食塩液 （PBS ) ) にて十分に洗浄した後、 蛍光顕微鏡にて酸化タンパ ク質を検出する ；
(4)任意的に、 蛍光顕微鏡撮影する。
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、 ピオチンヒ ドラジ ドと蛍 光標識アビジンとの組合わせを用いることもできる。 ビォチンヒ ド ラジドもヒ ドラジノ基を有するため、 タンパク質のカルボニル基に 結合できる。 この場合、 まず酸化タンパク質にビォチンヒ ドラジド を結合させ、 しかる後に蛍光標識アビジンをビォチン一アビジン結 合を介してピオチンヒ ドラジ ドに結合させ、 その結果酸化タンパク 質は蛍光標識される。 ピオチンヒ ドラジ ドは当業界においてよく知 られ、 例えばピアース社から製造販売されているものを使用するこ とができる。 また、 蛍光アビジンは、 例えばフルォレセインァビジ ンなどが使用できる。
このようなヒ ドラジノ基含有蛍光物質を使用する場合、 酸化タン パク質の検出は、 具体的には、 例えば以下のようにして実施できる
( 1 )角層試料を、 例えばテープス ト リ ツビングによ り、 採取する (2)これに適当な緩衝液 （例えば lOOmMの MES- Na緩衝液 （pH5.5)
) 中のピオチンヒ ドラジ ドを室温にて数時間 （例えば 1時間） 反応 させる ；
(3)反応終了後に適当な生理溶液 （例えば緩衝液リ ン酸緩衝生理 食塩液 （PBS)) にて十分に洗浄した後、 蛍光標識アビジンを室温に て数時間 （例えば 1時間） 反応させる ；
(4)蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する ；
(5)任意的に、 蛍光顕微鏡撮影する。
酸化タンパク質の特異的な蛍光標識は、 酸化タンパク質のカルボ ニル基にジニ ト口フエニルヒ ドラジンを作用 · 結合させ、 そのジニ トロフエノール部分を蛍光色素で標識することで行うこともできる 。 従って、 本発明の更なる好適な態様では、 酸化タンパク質のカル ボニル基に結合させたジニ ト 口フエニルヒ ドラジンのジニ ト 口 フエ ノール部分を蛍光免疫測定法等で検出するこ とができる。
このよ うなジニ ト ロフエニルヒ ドラジンを利用して蛍光標識する 場合、 酸化タンパク質の検出は、 具体的には、 例えば以下のように して実施できる ：
(1)角層試料を、 例えばテープス ト リ ッビングにより、 採取する
(2)これに適当な緩衝液 （例えば 100mMの MES- Na緩衝液 （pH5.5) 中のジニ トロフエニルヒ ドラジン （DNPH)を室温にて数時間 （例え ば 1時間） 反応させる ；
(3)反応終了後に適当な生理溶液 （例えば緩衝液リ ン酸緩衝生理 食塩液 （PBS)) にて十分に洗浄した後、 抗 DNP抗体、 例えばゥサギ D NP抗体 （ZYMED社製） の同生理溶液を室温にて数時間 （例えば 1時 間） 反応させる ；
( 反応終了後に同生理溶液にて十分に洗浄し、 上記抗 DNP抗体に 特異的な蛍光標識二次抗体、 例えばフルォレセィ ン標識抗ゥサギ I g (アマシャムフアルマシアバイオテク社製） 等を室温にて数時間 （ 例えば 1時間） 反応させる ；
( 5 )蛍光顕微鏡にて酸化タンパク質を検出する ；
( 6 )任意的に、 蛍光顕微鏡撮影する。
別の観点からすると、 本発明は、 角層の透明性及び/又は保水性 を指標とする、 角層中のタンパク質の酸化度を検出するための方法 を提供する。 上述のとおり、 本発明者は角層タンパク質の酸化が肌 の 「透明性」 · 「保水性」 に影響を及ぼすことを見出したが、 角層 タンパク質の酸化は皮膚に肌の老化を含むその他,の様々な性状に影 響を及ぼしている可能性もある。 従って、 角層の 「透明性」 · 「保 水性」 を指標に、 角層タンパク質の酸化が原因とする皮膚老化をは じめとする様々なその他の性状の早期発見 · 対処が可能と もなり得 る。 上述のとおり、 角層や肌の 「透明性」 や 「保水性」 は美容技術 者などの美容専門家の主観を頼り と した官能テス トや、 皮膚試料の 光学的検査や水分検査などにより行う ことができる。
本発明はまた、 角層中のタンパク質の酸化を抑制するこ とによ り 、 角層の透明性及びノ又は保水性を保持する方法を提供する。 角層 タンパク質の酸化の抑制は、 適当な抗酸化剤、 例えばァスコルビン 酸、 ビタミ ン Eなどの周知の化合物を適当な溶媒に溶解し、 肌に適 量適用するなどして達成可能である。
以下、 具体例を挙げて、 本発明を更に具体的に説明する。 なお、 本発明はこれにより限定されるものではない。 実施例
実験 1 ： 角層酸化タンパク質を指標とする角層の 「保水性」 の評価 ( 1 ) 乾燥豚皮 （ァロアスク、 大鵬薬品工業株式会社） を水に 3 日間浸 漬した。 豚皮を取り出し、 0、 1、 1 0、 l O O m Mのァク ロ レイ ン （東京化成工業株式会社） 溶液に 3時間浸漬して酸化処理した。 ァク ロ レインはタンパク質に作用することで酸化させ、 アルデヒ ド タンパク質付加体を生成する。 酸化処理後、 水で 1時間洗浄した。 洗浄後、 角層側を上に向けてシャーレ上で乾燥 （湿度 5 0 %、 温度 2 5 °C ) を開始し、 1 5分後の角層水分量をスキコン 2 0 0 (アイ • ビィ · エス株式会社） で測定した。 ，
角層氷分量の結果をスキンコンダクタンス値として、 図 1 に示す 。 図 1から明らかなとおり、 ァクロ レイ ンによる酸化処理濃度依存 的な水分量低下が観察された。 すなわち、 酸化処理による角層水分 保持力の低下が観察された。
実験 2 ： 角層酸化タンパク質を指標とする角層の 「保水性」 の評 価 （ 2 )
黒豚皮膚を 1 0 m Mァクロ レイ ン (東京化成工業株式会社） 溶液 で 1時間、 酸化処理した。 水で 1時間洗浄した後、 水分をよく拭き 取り、 角層水分量の変化をスキコ ン 2 0 0によって経時で測定した その結果を図 2に示す。 ァク ロレインでの酸化処理によ り角層水 分保持力の低下が豚皮膚で観察された。
実験 3 ： 角層酸化タンパク質を指標とする角層の 「保冰性」 の評 価 （ 3 )
黒豚皮膚を 2 0 m Mの次亜塩素酸で 1時間処理した。 水で 1時間 洗浄した後、 水分をよく拭き取り、 角層水分量の変化をスキコンに よって経時で測定した。
その結果を図 3に示す。 次亜塩素酸での酸化処理によつても角層 水分保持力の低下が豚皮膚で観察された。 実験 4 ： 角層酸化タンパク質を指標とする角層の 「保水性」 の評 価 （ 4)
ヒ ト腕皮膚を P B S又は 2 0 mMの次亜塩素酸で 1時間、 閉塞処 理した。 水で 1時間洗浄後、 水分をよく拭き取り、 角層水分量の変 化をスキコンによって経時で測定した。
その結果を図 4に示す。 酸化処理による角層水分保持力の低下が ヒ ト皮膚でも観察された。
実験 5 ： 角層酸化タンパク質を指標とする角層の 「透明性」 の評 価
乾燥豚皮 (ァロテスク、 大鵬薬品工業株式会社） を水に 3 日間浸 漬した。 豚皮を取り出し、 0、 1、 1 0、 l O O mMのァクロ レイ ン （東京化成工業株式会社） 溶液に 3時間浸漬して酸化処理した。 酸化処理後、 水で 1時間洗浄した。 洗浄後、 角層側を上に向けてシ ヤーレ上で乾燥 （湿度 5 0 %、 温度 2 5 °C) を開始し、 2 4時間か けて乾燥させた豚皮の外観を目視観察した。
その結果を図 5に示す。 図 5から明らかなとおり、 酸化処理を施 してない豚皮の透明度は高いのに対し、 ァク 口 レイ ンで処理すると 、 濃度依存的に透明度は低下した。

Claims

1 . 角層中の酸化タンパク質を指標とする、 角層の透明性及び/ 又は保水性を評価するための方法。
2 . 皮膚から採取した角層試料中の酸化タンパク質のカルボニル 基を特異的に蛍光標識し、 その蛍光を検出することで角層酸化タン 請
パク質の検出を行う、 請求項 1記載の角層の透明性及び Z又は保水 性を評価するための方法。
の
3 . 角層の透明性及び/又は保水性を指標とする、 角層中のタン パク質の酸化度を検出するための方法。 ，
4 . 角層中のタンパク質の酸化を抑制す囲ることによ り、 角層の透 明性及びノ又は保水性を保持 · 向上させる方法。
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