JP7024003B2 - 角層の水分保持能評価方法 - Google Patents

Description

本発明は角層の水分保持能評価方法に関する。

皮膚の最外層である角層は、水分の蒸発や微生物、毒物などに対する主要な保護バリアである。角層において、水分は角層の物質透過性、可塑性などの物理的性質や、皮膚表層の角層細胞の落屑に重要な作用を有する酵素の活性を制御することが知られており（非特許文献１）、角層が水分を保持することは皮膚にとって重要である。

このように角層が水分を保持する能力は角層水分保持能と呼ばれる。表皮の正常な分化・増殖に伴う水分保持成分の生成やバリアの形成が角層水分保持能の維持には重要であるが加齢や皮膚トラブルにより、劣化する（非特許文献２）ため、角層水分保持能の維持や向上を目的とする研究が盛んに行われている 。角層水分保持能の指標としては、角層水分量や経皮水分蒸散量が存在する。

角層水分保持能の評価は、上述のように、角層水分量を計測することで評価が行われてきた。角層水分量を計測する方法は、これまで種々の方法が考案されている。例えば、角層の電気伝導率や静電容量、誘電率などの電気的性質が、角層中の水分量によって変化するということに着目し、電気的性質の測定値から相対的な角層水分量を知ろうとする装置が提案されている（特許文献１、非特許文献３、非特許文献４）。また、経表皮水分蒸散量を計測する方法には、開放系と閉鎖系の二つがあるが、どちらも皮膚表面の空間中の水分を観測するものである（非特許文献５）。

これらの装置は皮膚を傷つけることなく、迅速かつ簡便に角層水分量や経表皮水分蒸散量を知ることができる点で有益であった。しかし、上記のような角層水分量を測定する方法では、発熱や発汗等、測定時の皮膚状態によるブレが大きかったり、適用したスキンケア化粧品の成分や、その洗浄後の残存物などによって測定値が変動するなど、測定結果が角層外部の要因に影響を受けてしまっており、直接的に測定した角層水分量を角層水分保持能とみなすことはできず、例えば、被験者が健康状態の時に、洗顔、馴化などにより、被験者全員の測定条件を統一して外部要因の影響をできる限り小さくして測定、比較する必要があり、被験者への負担や手間が生じており、日常的に行える方法ではなかった。また、経皮水分蒸散量も、体温や皮膚付着物等の影響を受けやすいのに加え、そもそも角層中の水分を測定対象とするものではなく、角層水分保持能を反映した測定量ではなかった。したがって、発汗や化粧品塗布などによる一時的・過渡的な角層水分量の変化に左右されない、被験者の角層が本来安定的に備えている水分保持能、すなわち真の角層水分量を、簡便に知る方法が求められていた。

一方で、皮膚にはニトロ化タンパク質が存在し、ニトロ化タンパク質は主にペルオキシナイトライトにより生成されることが知られる。角層におけるニトロ化タンパク質の生成は、肌の黄ぐすみの原因になることが分かっており（特許文献２）、さらにペルオキシナイトライトは皮膚のしわやたるみ、色素沈着などの皮膚の老化に関与すると報告されている（特許文献３）。しかしながら、皮膚中のペルオキシナイトライトあるいはニトロ化タンパク質と、角層水分保持能との関係は全く明らかにされていなかった。

特公昭６３－１９０１６号公報 特開２０１７－１８１４２３号公報 特開２００２－２６５３８７号公報

Ｒａｗｌｉｎｇｓ Ａ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｅｒｏｌ ａｎｄ Ｈｕｍｉｄｉｔｙ ｏｎ ｄｅｓｍｏｓｏｍｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒａｔｕｍ ｃｏｒｎｅｕｍ．， Ａｒｃｈ Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｒｅｓ， ２８７， ４５７－６４， １９９５． 正木仁 ｅｔ ａｌ．， 加齢によって表皮細胞および角層細胞にみられた変化．， 日本皮膚科学会雑誌， ９６（３）， １８９－， １９８６． Ｔａｇａｍｉ Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｈｙｄｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．，Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ, ７５, ５００－７, １９８０． 橋本久美子 ｅｔ ａｌ．， 角層水分量測定における高周波伝導度測定装置及びＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒの比較．， 香粧会誌， １１， ２５２－８， １９８７． 丸善株式会社．， 化粧品事典 日本化粧品技術者会編．，４３９，２００３

本発明の課題は、評価時の皮膚状態や角層外部の要因（水分等）に左右されずに、角層の水分保持能を評価する方法を提供することである。

前記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、十分な洗浄および安静・馴化後に測定した角層水分量（角層水分保持能）が、角層中のニトロ化タンパク質量と正の相関があることを発見した。
本現象について培養表皮細胞を用いて更に検討の結果、ペルオキシナイトライトによるニトロ化タンパク質生成が促進されるほど、表皮細胞の細胞分化・増殖能、および角層のバリア機能が高くなることを突き止めた。
従来タンパク質のニトロ化は、肌にとって悪影響をもたらすと考えられてきたが、本知見に基づけば、角層中のニトロ化タンパク質が多い皮膚では、分化の過程で、ペルオキシナイトライトによるタンパク質のニトロ化反応が活発であると言えることから、角層中のニトロ化タンパク質量が多いほど、言い換えるとペルオキシナイトライトによるタンパク質以外の生体内因子への反応が阻害されるほど、角層水分保持能が高いと評価できる。
加えて、角層のバリア機能、表皮細胞の分化・増殖能、表皮細胞のペルオキシナイトライト活性阻害能は、ニトロ化タンパク質量と連動しているとの発見に基づき、角層のニトロ化タンパク質量を指標として把握することにより、角層のバリア機能、表皮細胞の分化・増殖能、表皮細胞のペルオキシナイトライト活性阻害能を把握することができるとの発明に至った。
つまり、角層のニトロ化タンパク質量を測定することで、角層水分保持能と、角層水分保持能に寄与する要素である角層のバリア機能、表皮細胞の分化・増殖能、ペルオキシナイトライト活性阻害能を評価できるとの結論に至り、本発明の完成に至った。
即ち、本発明は、角層のニトロ化タンパク質量を指標にすることにより、上記課題を解決した。

本発明の評価方法を用いることで、評価時の皮膚状態に影響されず、角層水分保持能を評価することができる。

図１は頬部の角層水分保持能とニトロ化タンパク質量の関係を示す図である 図２はペルオキシナイトライトを培養表皮細胞に添加して生成したニトロ化タンパク質の量を示す図である。 図３はペルオキシナイトライトを培養表皮細胞に添加して変化した遺伝子発現を示す図である。 図４はｐＨが異なる条件での、ペルオキシナイトライトによるタンパク質のニトロ化量を示す図である。 図５はｐＨを酸性に近づけた際に、ペルオキシナイトライトを培養表皮細胞に添加して生成したニトロ化タンパク質の量を示す図である。 図６はｐＨが異なる条件での、ペルオキシナイトライトを培養表皮細胞に添加して変化した遺伝子発現を比較した図である。 図７はペルオキシナイトライトを三次元皮膚モデルに添加して変化した角層のバリア機能を比較した図である。

本発明の「角層のニトロ化タンパク質量を指標とする」とは、任意の方法を用いて角層中のニトロ化タンパク質の存在量を効果判定の基準にするという趣旨である。

本発明でニトロ化タンパク質量測定に用いる角層採取の方法は特に限定されず、例えばテープストリッピングや、コットンによる皮膚の塗擦等により採取することができる。採取時に毛髪など、角層以外が含まれていた場合であっても、測定に影響がない範囲であれば問題ない。

ニトロ化タンパク質の量は直接的に測定してもよいし、間接的に測定してもよい。例えば採取した角層を加水分解処理や酵素処理等にて分解し、得られた単離ニトロ基の量や単離ニトロ化アミノ酸残基の量を測定したものをニトロ化タンパク質量とすることもできる。たとえば、ニトロ化アミノ酸としてはニトロチロシンや３，５－ジニトロチロシン、ニトロトリプトファン、ニトロフェニルアラニン、２,４-ジニトロフェニルアラニン等、ニトロ化タンパク質を構成するアミノ酸残基となりうる化合物が含まれる。またニトロ化されたタンパク質としては前述のアミノ酸残基となりうる化合物を構成物中に含むタンパク質が含まれる。さらに、ニトロ化タンパク質が生じることにより発生する、生体物質の量、生体反応の大きさを数値化し、ニトロ化タンパク質量として把握することもできる。

ニトロ化タンパク質量の測定は、公知の方法で行うことができる。例えば、吸光度法、免疫染色法、ウエスタンブロッティング、放射免疫測定 （Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＬＩＳＡ、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量分析法、ＮＭＲ法、自家蛍光等を用いて測定することができる。

本発明における評価方法では、ニトロ化タンパク質量が多いほど、角層の水分保持能、角層のバリア機能、表皮細胞の分化・増殖能、又はペルオキシナイトライト活性阻害能が高いと判断する。例えば、被験者の平均値、中央値などの基準値を定め、ニトロ化タンパク質量が基準値以上であれば、角層の水分保持能、角層のバリア機能、表皮細胞の分化・増殖能、ペルオキシナイトライト活性阻害能が高いと評価することができる。

ニトロ化タンパク質量を測定することによって、角層水分保持能を数値化する場合は、あらかじめ、複数人のニトロ化タンパク質量と角層水分保持能としての角層水分量を母集団データとして測定し、散布図から回帰曲線を求めることで、被験者のニトロ化タンパク質量から数値として角層水分保持能を求めることができる。簡易には回帰曲線を検量線として使用し、測定したニトロ化タンパク質量に応じて角層水分保持能を推定することも可能であるし、より正確には分位点回帰分析を行うことで、ニトロ化タンパク質量から、推定される角層水分保持能の範囲とその範囲から外れる確率を求めることができる。

一般に角層水分量とは、角層中に含まれる水分量のことである。角層水分量は化粧水を塗布した状態や、濡れた状態では上がり、低湿度下などでは下がってしまい、環境や皮膚状態に大きく左右される。このように角層水分量が角層の測定時の水分量であり、保湿時や濡れている場合は高い値が出るなど、外部環境や一時的な皮膚状態の影響を受けてしまっていた。一方、本発明においては、角層水分保持能をこれと相関する角層のニトロ化タンパク質量に置き換えて把握することで、皮膚に対する塗布物の有無、身体の安静の程度など、角層外部の要因による影響を受けることなく、本来の角層水分量、つまり角層が本来持つ水分を維持する能力を評価することができる。

本発明において角層水分保持能の指標とする角層のニトロ化タンパク質量は、ペルオキシナイトライトなどによる特定の反応においてのみ増減するため、発熱や発汗等の評価時の皮膚状態、水分やスキンケア化粧品等、角層水分量に対する一時的な変動を与える角層外部の要因に左右されずに水分保持能を評価するための指標として用いることができる。

本発明におけるペルオキシナイトライト活性は、核酸・脂質・ならびにその他タンパク質以外の生体内分子に対する、ペルオキシナイトライトによる酸化・ニトロ化反応性のことであり、本発明では表皮細胞のペルオキシナイトライト活性が表皮細胞の分化・増殖能、角層のバリア機能、角層の水分保持能を低下させることを明らかにした。

本発明における、ペルオキシナイトライト活性阻害能評価においては、ニトロ化タンパク質量を指標としており、ニトロ化タンパク質が多いほど、ペルオキシナイトライトのタンパク質以外との反応性が低く、結果としてペルオキシナイトライトの活性を阻害できていると判断する。

以下の実施例により、本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。

＜実施例１：角層中のニトロ化タンパク質量と角層水分保持能との関係＞
日本在住の２０～４０代の健康な男女１６名を被験者とした。各被験者は、測定前に洗顔料を用いた洗顔、および２２℃、湿度５０％の室内で２０分間安静にすることで、頬の水分状態を一定にした。各被験者の頬の角層水分量をＳＫＩＣＯＮ（ヤヨイ）で５回測定した。測定部の水分状態を被験者間で一定にすることで、角層水分量は角層水分保持能とみなすことができる。テープを用いて被験部位から角層を採取した。この際、テープを頬部にあて、テープの上から５回指で優しくこすり、テープをはがした。テープを用いた角層の採取は、同一部位を３度繰り返した。角層が付着したテープは１．５ｍＬチューブに入れた。６Ｎ塩酸を１ｍＬ加え、３７℃で４８時間 インキュベートした。水酸化ナトリウムを混合することで中和し、角層抽出物とした。

常法に従い、ＢＣＡ法にて角層抽出物中の総タンパク質量（ｇ／ｍＬ）を求めた。さらに角層抽出物をＮｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ ）に供し、ニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を算出した。同被験者から採取した角層が付着した、３枚のテープそれぞれのニトロチロシン量を総タンパク質量で割り、各テープのタンパク質一定量あたりのニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｇ）を求めた。被験者ごとに、３枚のテープのタンパク質量あたりのニトロチロシン量を平均し、被験者ごとのタンパク質量あたりのニトロチロシン量を求めた。

測定した５点の角層水分量の平均と、求めたタンパク質量あたりのニトロチロシン量の関係について、ピアソンの相関関係の検定を行ったところ、これらが正の相関関係にあることが明らかとなった（図１）。角層水分量測定は、被験者が健康状態の時に、洗顔、馴化などにより、被験者全員の皮膚状態を一定にすることで角層水分保持能として評価されているため、この結果より、角層にニトロ化タンパク質が多いほど、頬部の角層水分保持能が増加することが示された。また、図１は、ニトロ化タンパク質量を測定することで角層水分保持能を間接的に把握することができることを示し、当該ニトロ化タンパク質量を角層水分保持能として評価できるといえる。

＜実施例２：ペルオキシナイトライトの表皮細胞に対する作用の検証＞
抗菌剤含有Ｈｕｍｅｄｉａ ＫＧ２（ＫＵＲＡＢＯ）に分散した新生児由来正常ヒト表皮ケラチノサイト（ＫＵＲＡＢＯ）５．０×１０４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５００μＬずつ播種した。３７℃、５%ＣＯ２下で３日間インキュベートした。０．１Ｍ水酸化ナトリウムで２ｍＭ（終濃度１００μＭ）、１ｍＭ（終濃度５０μＭ：ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ＋）、０．５ｍＭ（終濃度２５μＭ）に薄めたペルオキシナイトライトを２５μＬ添加した。コントロール（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ－）としては０．１Ｍ水酸化ナトリウムを２５μＬ添加した。３７℃、５%ＣＯ２下で２４ ｈｒインキュベートした。

Ｎｉｔｒｏ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ付属のＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを５０μＬ加えた。冷蔵庫で３０分放置し、上清を回収し抽出タンパク質とした。常法に従い、ＢＣＡ法にて抽出タンパク質の総タンパク質量（ｇ／ｍＬ）を求めた。さらに抽出タンパク質をＮｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔに供し、ニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を算出した。各抽出タンパク質一定量あたりのニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｇ）を求めた。条件ごとに、タンパク質一定量あたりのニトロチロシン量を平均し、条件ごとのタンパク質量あたりのニトロチロシン量を求めた。

Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＪｅｎａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、各ｗｅｌｌの細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ) を用い、逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲを行い、比較Ｃｔ法により、ｐ２１、ケラチン５（ＫＲＴ５）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、ケラチン１（ＫＲＴ１）、ケラチン１０（ＫＲＴ１０）、インボルクリン（ＩＮＶ）、ロリクリン（ＬＯＲ）の遺伝子発現について、ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ－を１とした場合の、ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ＋の遺伝子発現量を、「ペルオキシナイトライトによる発現変化量１」として求めた。なお、ハウスキーピング遺伝子としては、ＧＡＰＤＨを用いた。

本方法において、ニトロ化タンパク質の生成は起こらなかった（図２）。一方で、遺伝子発現には変化が見られ、ペルオキシナイトライトを添加することで、ｐ２１の発現増加、ケラチン１、ケラチン１０、ロリクリンの発現低下が見られた（図３）。これらの結果より、ペルオキシナイトライトはニトロ化タンパク質を生成しない条件の場合、タンパク質以外の生体内物質に作用して、細胞増殖や細胞分化を抑制していることが分かった。

＜実施例３：ｐＨによるニトロ化タンパク質生成への影響検証＞
抗菌剤含有Ｈｕｍｅｄｉａ ＫＧ２に分散した新生児由来正常ヒト表皮ケラチノサイト５．０×１０４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５００μＬずつ播種した。３７℃、５%ＣＯ２下で３日間インキュベートした。ｐＨ４．５、５．５、６．５、７．５に調製したマッキルベイン緩衝液１００μＬに置換した。１０ｍＭ（終濃度１ｍＭ）に薄めたペルオキシナイトライトを１０μＬ添加した。３７℃、５%ＣＯ２下で１０ｍｉｎインキュベートした。

Ｎｉｔｒｏ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ付属のＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを５０μＬ加えた。冷蔵庫で３０分放置し、上清を回収し抽出タンパク質とした。常法に従い、ＢＣＡ法にて抽出タンパク質の総タンパク質量（ｇ／ｍＬ）を求めた。さらに抽出タンパク質をＮｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔに供し、ニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を算出した。各抽出タンパク質一定量あたりのニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｇ）を求めた。条件ごとに、タンパク質一定量あたりのニトロチロシン量を平均し、条件ごとのタンパク質量あたりのニトロチロシン量を求めた。

ｐＨ７．５の条件と比較して、ｐＨ４．５～６．５ではニトロチロシンがより多く生成された（図４）この結果より、ペルオキシナイトライトはｐＨが中性条件よりも酸性条件で、よりニトロ化タンパク質を生成することが明らかとなった。

＜実施例４：ペルオキシナイトライトの表皮細胞に対する作用の検証２＞
抗菌剤含有Ｈｕｍｅｄｉａ ＫＧ２に分散した新生児由来正常ヒト表皮ケラチノサイト５．０×１０４ Ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに５００μＬずつ播種した。３７℃、５%ＣＯ２下で３日間インキュベートした。０．２Ｍ塩酸（終濃度１０ｍＭ）または蒸留水を２５μＬ加えた。１ｍＭ（終濃度５０μＭ）に薄めたペルオキシナイトライトを２５μＬ添加した（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ＋）。コントロールとしては０．１Ｍ水酸化ナトリウムを２５μＬ添加した（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ－）。３７℃、５%ＣＯ２下で２４ ｈｒインキュベートした。

Ｎｉｔｒｏ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ付属のＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを５０μＬ加えた。冷蔵庫で３０分放置し、上清を回収し抽出タンパク質とした。常法に従い、ＢＣＡ法にて抽出タンパク質の総タンパク質量（ｇ／ｍＬ）を求めた。さらに抽出タンパク質をＮｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔに供し、ニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を算出した。各抽出タンパク質一定量あたりのニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｇ）を求めた。条件ごとに、タンパク質一定量あたりのニトロチロシン量を平均し、条件ごとのタンパク質量あたりのニトロチロシン量を求めた。

Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用し、各ｗｅｌｌの細胞からＴｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔを用い、逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲを行い、比較Ｃｔ法により、ｐ２１、ケラチン５（ＫＲＴ５）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、ケラチン１（ＫＲＴ１）、ケラチン１０（ＫＲＴ１０）、インボルクリン（ＩＮＶ）、ロリクリン（ＬＯＲ）の遺伝子発現について、ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ－を１とした場合の、ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ＋の遺伝子発現量を、「ペルオキシナイトライトによる発現変化量２」として求めた。実施例２で示した「ペルオキシナイトライトによる発現変化量１」を１とした場合の、本実施例における「ペルオキシナイトライトによる発現変化量２」の発現増加率を求め、図６に示した。なお、ハウスキーピング遺伝子としては、ＧＡＰＤＨを用いた。

培養表皮細胞に０．２Ｍ塩酸を加えた後にペルオキシナイトライトを添加することで、コントロールに比較して、ニトロ化タンパク質が約１．３６倍生成した（図５）。さらに、遺伝子発現の変化もあり、ニトロ化タンパク質が生成しなかった条件と比較して、ｐ２１、ケラチン５、ケラチン１４が発現低下、インボルクリン、ロリクリンが発現増加した（図６）。これらの結果より、表皮細胞において、ニトロ化タンパク質が生成しやすい条件では、ペルオキシナイトライトによる細胞増殖・分化の抑制が緩和されることが分かった。これは、ペルオキシナイトライトがタンパク質との反応を起こすことで、その他生体内物質への酸化・ニトロ化反応が減少するためであると考察される。また、ニトロ化タンパク質は生体内では分解されづらいため、角層のニトロ化タンパク質量は表皮全体のペルオキシナイトライト活性阻害力を示すと判断できる。さらに、実施例１と合わせて考えると、角層ニトロ化タンパク質量が多い皮膚では、分化の過程で発生したペルオキシナイトライトを、タンパク質のニトロ化を介してより効率的に活性阻害することで、細胞分化・増殖の抑制を抑え、結果として角層水分保持能が増加していると考えられる。

＜実施例５：ペルオキシナイトライトの角層バリア機能に対する作用の検証＞
三次元皮膚モデルＬａｂＣｙｔｅ ＥＰＩ―ＭＯＤＥＬ ６Ｄ（Ｊ－ＴＥＣ）を３７℃、５％ＣＯ２下で７日間インキュベートした。７日間の培養期間中、次の処理を３回実施した。０．２Ｍ塩酸（ＨＣｌ＋）または蒸留水を２５μＬ加えた培地に交換した。１ｍＭ（終濃度５０μＭ）に薄めたペルオキシナイトライト／０．１Ｍ水酸化ナトリウムを２５μＬ添加した（ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ＋）。コントロールとしては０．１Ｍ水酸化ナトリウムを２５μＬ添加した（ｃｏｎｔｒｏｌ）。３７℃、５％ＣＯ２下で１時間インキュベートし、通常の培地に置換した。

７日間のインキュベート終了後、０．１％Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（ＦＬＵＫＡ）水溶液を２００μＬ添加し、２時間常温でインキュベートした。メスで組織を分離し、ティシュー・テック Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（サクラファインテックジャパン) 中に包埋し凍結した。クリオスタット (Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ) を使用して５μｍ厚の切片を作成し、蛍光顕微鏡にて撮影した。

ペルオキシナイトライトを添加すると蛍光物質の浸透が促進した一方、塩酸を添加して弱酸性条件にした培地にペルオキシナイトライトを添加すると浸透が抑制された（図７）。この結果より、ペルオキシナイトライトは角層のバリア機能を低下させ、角層への外因物質の浸透を促進させるが、弱酸性条件にすることで、ペルオキシナイトライトのタンパク質との反応性が向上し、その他生体内因子との反応を阻害することで、角層のバリア機能の低下を抑制できることが明らかとなった。

＜実施例６：角層ニトロ化タンパク質量を求めることによる角層水分保持能の評価＞
日本在住の２０～４０代の健康な男女１６名を被験者とした。各被験者は、測定前に洗顔料を用いた洗顔、および２２℃、湿度５０％の室内で２０分間安静にすることで、頬の水分状態を一定にした。各被験者の頬の角層水分量をＳＫＩＣＯＮ（ヤヨイ）で５回測定した。テープを用いて被験部位から角層を採取した。この際、テープを頬部にあて、テープの上から５回指で優しくこすり、テープをはがした。テープを用いた角層の採取は、同一部位を３度繰り返した。角層が付着したテープは１．５ｍＬチューブに入れた。６Ｎ塩酸を１ｍＬ加え、３７℃で４８時間 インキュベートした。水酸化ナトリウムを混合することで中和し、角層抽出物とした。

常法に従い、ＢＣＡ法にて角層抽出物中の総タンパク質量（ｇ／ｍＬ）を求めた。さらに角層抽出物をＮｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ａｂｃａｍ ）に供し、ニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を算出した。同被験者から採取した角層が付着した、３枚のテープそれぞれのニトロチロシン量を総タンパク質量で割り、各テープのタンパク質一定量あたりのニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｇ）を求めた。被験者ごとに、３枚のテープのタンパク質量あたりのニトロチロシン量を平均し、被験者ごとのタンパク質量あたりのニトロチロシン量を求めた。

ニトロチロシン量（ｎｍｏｌ／ｇ）と角層水分保持能（μS）の散布図から、回帰曲線の式を求めた。回帰曲線の式にニトロチロシン量を当てはめて求めた推定の角層水分保持能と、実際の角層水分保持能の差を求めた。

８１．２５％の被験者では、角層水分保持能が回帰曲線の推定値±７１μＳであった。この結果より、例えば採取した角層のニトロチロシン量が１０００ｎｍｏｌ／ｇの場合、回帰曲線にあてはめると推定角層水分保持能が１８５μＳとなり、８１．２５％の確率で角層水分保持能は１１４～２５６μＳである。

Claims (5)

1. 被験部位から採取した角層中のニトロ化タンパク質量を指標とする、角層の水分保持能評価方法。
2. 前記ニトロ化タンパク質量を指標とし、ニトロ化タンパク質量が多いほど角層の水分保持能が高いと評価する、角層の水分保持能評価方法。
3. 前記ニトロ化タンパク質量が、ニトロ化タンパク質を構成するニトロチロシン量である、請求項１又は２に記載の評価方法。
4. 前記ニトロ化タンパク質量が、加水分解させた角層のニトロ化タンパク質量である、請求項１～３のいずれか一項に記載の評価方法。
5. 予め請求項１～４のいずれか一項に記載の評価方法で評価した複数の被験者の皮膚状態データを母集団データとし、当該母集団データと任意の被験者の皮膚データとの対比により被験者の肌状態を評価する方法。

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