JP2001091514A - コーニファイドエンベロップの評価 - Google Patents
コーニファイドエンベロップの評価Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 皮膚の肌質の評価方法に関する。
【解決手段】 皮膚由来の角層試料におけるコーニファ
イドエンベロップを疎水性領域染色色素で染色し、該コ
ーニファイドエンベロツプの染色性を評価の指標とする
こと、及び、該コーニファイドエンベロップ構成タンパ
ク質の抗原性を抗ヒトインボルクリン抗体を使用して検
出し、検出された抗原性を評価の指標とすることにより
皮膚の角層を構成するコーニファイドエンベロップの性
状を評価し、延いては肌質を評価する方法。
イドエンベロップを疎水性領域染色色素で染色し、該コ
ーニファイドエンベロツプの染色性を評価の指標とする
こと、及び、該コーニファイドエンベロップ構成タンパ
ク質の抗原性を抗ヒトインボルクリン抗体を使用して検
出し、検出された抗原性を評価の指標とすることにより
皮膚の角層を構成するコーニファイドエンベロップの性
状を評価し、延いては肌質を評価する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、皮膚の角層を構成
するコーニファイドエンベロップ（cornified envelop
e：角質肥厚膜；以下、「ＣＥ」ともいう）の性状の評
価方法、延いては肌質の評価方法、ならびに該評価方法
に用いるキットに関する。
するコーニファイドエンベロップ（cornified envelop
e：角質肥厚膜；以下、「ＣＥ」ともいう）の性状の評
価方法、延いては肌質の評価方法、ならびに該評価方法
に用いるキットに関する。
【０００２】
【発明の背景】肌質（または皮膚の状態）を的確に把握
することは、より健康な皮膚を維持するための的確なス
キンケアをするうえで重要である。そのため、化粧品に
よるスキンケアを実施するに際し、例えば、美容技術者
による問診などを通じて、化粧品の使用者の肌質が評価
されてきた。また、肌質の客観的な評価を目的として、
各種の計測機器を使用して、観察または測定されるパラ
メーターにより、皮膚の状態または機能を評価すること
も行われている。
することは、より健康な皮膚を維持するための的確なス
キンケアをするうえで重要である。そのため、化粧品に
よるスキンケアを実施するに際し、例えば、美容技術者
による問診などを通じて、化粧品の使用者の肌質が評価
されてきた。また、肌質の客観的な評価を目的として、
各種の計測機器を使用して、観察または測定されるパラ
メーターにより、皮膚の状態または機能を評価すること
も行われている。
【０００３】このようなパラメーターの代表的なものと
しては、皮膚表面のレプリカを拡大して皮溝や皮丘を観
察する皮膚表面形態、角層の伝導度（コンダクタンス）
測定による角層水分量、経表皮水分喪失量（transepide
rmal water loss；ＴＥＷＬ）の測定による角層バリア
ー機能などが挙げられる。
しては、皮膚表面のレプリカを拡大して皮溝や皮丘を観
察する皮膚表面形態、角層の伝導度（コンダクタンス）
測定による角層水分量、経表皮水分喪失量（transepide
rmal water loss；ＴＥＷＬ）の測定による角層バリア
ー機能などが挙げられる。
【０００４】また、角層の保湿能の指標として天然保湿
因子（natural moisturizing factor；ＮＭＦ、具体的
には種々の遊離アミノ酸など）を定量したり、角層中の
サイトカインの定量により肌質を評価する方法も応用さ
れつつある。 角層は、表皮角化細胞が終末分化して形
成された角質細胞と、それをとりまく細胞間脂質から構
成される。細胞間脂質は、セラミド、コレステロール、
脂肪酸などを成分としてラメラ構造を形成し、角層バリ
アー機能において重要な役割を演じていることが明らか
になってきている。これは、角層バリアー機能が低下す
る種々の皮膚疾患や、肌荒れなどの皮膚トラブルを伴う
場合において、細胞間脂質が形態的にまた組成的にも乱
れていることにより裏付けられている。
因子（natural moisturizing factor；ＮＭＦ、具体的
には種々の遊離アミノ酸など）を定量したり、角層中の
サイトカインの定量により肌質を評価する方法も応用さ
れつつある。 角層は、表皮角化細胞が終末分化して形
成された角質細胞と、それをとりまく細胞間脂質から構
成される。細胞間脂質は、セラミド、コレステロール、
脂肪酸などを成分としてラメラ構造を形成し、角層バリ
アー機能において重要な役割を演じていることが明らか
になってきている。これは、角層バリアー機能が低下す
る種々の皮膚疾患や、肌荒れなどの皮膚トラブルを伴う
場合において、細胞間脂質が形態的にまた組成的にも乱
れていることにより裏付けられている。
【０００５】一方、角質細胞は、ケラチン線維を主成分
とし、それを包むＣＥから構成される。ＣＥは、表皮角
化細胞が分化するにしたがって産生される複数のＣＥ前
駆体タンパクが、酵素トランスグルタミナーゼにより架
橋され不溶化して形成される。さらに、その一部には、
セラミドなどが共有結合し、疎水的な構造をとること
で、前述した細胞間脂質のラメラ構造の土台を供給し角
層バリアー機能の基礎を形成することが示唆されてい
る。
とし、それを包むＣＥから構成される。ＣＥは、表皮角
化細胞が分化するにしたがって産生される複数のＣＥ前
駆体タンパクが、酵素トランスグルタミナーゼにより架
橋され不溶化して形成される。さらに、その一部には、
セラミドなどが共有結合し、疎水的な構造をとること
で、前述した細胞間脂質のラメラ構造の土台を供給し角
層バリアー機能の基礎を形成することが示唆されてい
る。
【０００６】ＣＥは、皮膚組織または培養皮膚細胞など
を、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤およびメ
ルカプトエタノールなどの還元剤を含む溶液中で煮沸
し、遠心分離などの手段により可溶性成分を除去した不
溶性画分を得ることにより調製できる。これを顕微鏡で
形態観察することにより、その性状を評価することがで
きる。Michel らは、角層の最外層に比較して角層の深
部においては、脆弱な構造のＣＥが多いことを報告して
いる（J. Invest. Dermatol ９１：１１−１５，１９８
８）。
を、ドデシル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤およびメ
ルカプトエタノールなどの還元剤を含む溶液中で煮沸
し、遠心分離などの手段により可溶性成分を除去した不
溶性画分を得ることにより調製できる。これを顕微鏡で
形態観察することにより、その性状を評価することがで
きる。Michel らは、角層の最外層に比較して角層の深
部においては、脆弱な構造のＣＥが多いことを報告して
いる（J. Invest. Dermatol ９１：１１−１５，１９８
８）。
【０００７】一方、乾癬や葉状魚鱗癬などでは最外層に
おいても脆弱なＣＥが認められるとしている（Br. J. D
ermatol. １２２：１５−２１，１９９０）。
おいても脆弱なＣＥが認められるとしている（Br. J. D
ermatol. １２２：１５−２１，１９９０）。
【０００８】
【発明の構成】本発明者らは、角層バリアー機能、殊
に、体内からの水分の蒸散や外界からの異物の混入を防
ぐ機能の主体をなすと考えられている脂質とＣＥとの関
連性、あるいはＣＥの性状に注目して研究してきた。そ
の結果、従来の顕微鏡によるＣＥの形態観察の結果のみ
ならず、一定の色素によるＣＥの染色性やＣＥの構成タ
ンパク質の抗原性はＣＥの性状に応じて変動することが
確認された。本発明はこのような知見に基づき完成され
たものである。
に、体内からの水分の蒸散や外界からの異物の混入を防
ぐ機能の主体をなすと考えられている脂質とＣＥとの関
連性、あるいはＣＥの性状に注目して研究してきた。そ
の結果、従来の顕微鏡によるＣＥの形態観察の結果のみ
ならず、一定の色素によるＣＥの染色性やＣＥの構成タ
ンパク質の抗原性はＣＥの性状に応じて変動することが
確認された。本発明はこのような知見に基づき完成され
たものである。
【０００９】したがって、本発明は、皮膚由来の角層試
料におけるコーニファイドエンベロップを、疎水性領域
を特異的に染色できる色素で染色し、該コーニファイド
エンベロップの染色性を評価の指標とすることを特徴と
する該コーニファイドエンベロップの性状の評価方法な
らびに／または皮膚由来の角層試料におけるコーニファ
イドエンベロップを、該コーニファイドエベロップの構
成タンパク質の抗原性を検出し、検出された抗原性を評
価の指標とすることを特徴とする該コーニファイドエベ
ロップの性状の評価方法、に関する。
料におけるコーニファイドエンベロップを、疎水性領域
を特異的に染色できる色素で染色し、該コーニファイド
エンベロップの染色性を評価の指標とすることを特徴と
する該コーニファイドエンベロップの性状の評価方法な
らびに／または皮膚由来の角層試料におけるコーニファ
イドエンベロップを、該コーニファイドエベロップの構
成タンパク質の抗原性を検出し、検出された抗原性を評
価の指標とすることを特徴とする該コーニファイドエベ
ロップの性状の評価方法、に関する。
【００１０】さらには、本発明は、上記評価方法により
得られるＣＥの性状を、角層試料の提供者の肌質の指標
とすることを特徴とする肌質の評価方法にも関する。
得られるＣＥの性状を、角層試料の提供者の肌質の指標
とすることを特徴とする肌質の評価方法にも関する。
【００１１】また、本発明は、上記評価方法で使用され
る試薬類を含んでなる肌質を評価するためのキットにも
関する。
る試薬類を含んでなる肌質を評価するためのキットにも
関する。
【００１２】本発明に従って、ＣＥの性状が評価される
皮膚由来の角層試料は、身体のいずれの部分に由来する
試料でもよく、また、かような試料（組織もしくは細
胞）の培養物であってもよい。該試料の由来する身体の
部位または領域の典型例としては、顔面の頬、額、手甲
および体幹などを挙げることができる。
皮膚由来の角層試料は、身体のいずれの部分に由来する
試料でもよく、また、かような試料（組織もしくは細
胞）の培養物であってもよい。該試料の由来する身体の
部位または領域の典型例としては、顔面の頬、額、手甲
および体幹などを挙げることができる。
【００１３】このような試料は、所謂、外科的手段等の
侵襲的な方法により取得されたものであってもよいが、
殊に肌質の評価を目的とする場合には、非侵襲的な方法
により皮膚から取得されるものであることが好ましい。
非侵襲的な方法としては、当該技術分野で常用されてい
るテープストリッピングや擦過法等を挙げることができ
る。
侵襲的な方法により取得されたものであってもよいが、
殊に肌質の評価を目的とする場合には、非侵襲的な方法
により皮膚から取得されるものであることが好ましい。
非侵襲的な方法としては、当該技術分野で常用されてい
るテープストリッピングや擦過法等を挙げることができ
る。
【００１４】疎水性領域（特に、生物組織における）を
選択的に染色できる色素としては、各種疎水性領域の染
色に使用されている色素であって、本発明の目的に沿う
ものであれば、いずれも使用することができる。このよ
うな色素の具体的なものとしては、ナイルレッド（Nile
Red）、オイルレッドＯ（Oil Red Ｏ）、スダンIII（S
udan III）を挙げることができる。特にナイルレッドを
好適に使用することができる。ナイルレッドは、その還
元型であるナイルブルーとの混合物であってもよい。こ
のような混合物には、ナイルブルーの水溶液中でナイル
ブルーの一部が自然に酸化されてナイルレッドに転化し
ている状態のものも包含される。
選択的に染色できる色素としては、各種疎水性領域の染
色に使用されている色素であって、本発明の目的に沿う
ものであれば、いずれも使用することができる。このよ
うな色素の具体的なものとしては、ナイルレッド（Nile
Red）、オイルレッドＯ（Oil Red Ｏ）、スダンIII（S
udan III）を挙げることができる。特にナイルレッドを
好適に使用することができる。ナイルレッドは、その還
元型であるナイルブルーとの混合物であってもよい。こ
のような混合物には、ナイルブルーの水溶液中でナイル
ブルーの一部が自然に酸化されてナイルレッドに転化し
ている状態のものも包含される。
【００１５】ＣＥの構成タンパク質の抗原性を検出する
ための対象となるタンパク質としては、インボルクリ
ン、ロリクリンなどの脂質が共有結合しうるタンパク質
やタンパク質間の架橋結合であるイソペプチド、シュウ
ドイソペプチドを挙げることができる。これらの抗原性
は、これらのタンパク質またはペプチドに対する抗体を
使用して検出することができる。検出方法は、上記タン
パク質またはペプチドへの抗体の結合を検出できる方法
であれば、いかなる方法であってもよいが、組織標本中
の酵素、構造タンパク質などの抗原物質を標識または染
色するのに使用されている蛍光抗体法、酵素抗体法が好
適である。抗体の蛍光標識としては、例えば、フルオレ
セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などを使
用するのがよい。例えば、上記二種の蛍光標識は、蛍光
波長が異なるので、二重染色により二種の抗原物質の抗
原性を同じ試料中で同時に検出するのに使用することも
できる。本発明に従う抗原性の検出には、かような二重
染色による場合も包含される。
ための対象となるタンパク質としては、インボルクリ
ン、ロリクリンなどの脂質が共有結合しうるタンパク質
やタンパク質間の架橋結合であるイソペプチド、シュウ
ドイソペプチドを挙げることができる。これらの抗原性
は、これらのタンパク質またはペプチドに対する抗体を
使用して検出することができる。検出方法は、上記タン
パク質またはペプチドへの抗体の結合を検出できる方法
であれば、いかなる方法であってもよいが、組織標本中
の酵素、構造タンパク質などの抗原物質を標識または染
色するのに使用されている蛍光抗体法、酵素抗体法が好
適である。抗体の蛍光標識としては、例えば、フルオレ
セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチル
ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などを使
用するのがよい。例えば、上記二種の蛍光標識は、蛍光
波長が異なるので、二重染色により二種の抗原物質の抗
原性を同じ試料中で同時に検出するのに使用することも
できる。本発明に従う抗原性の検出には、かような二重
染色による場合も包含される。
【００１６】蛍光抗体法では、検出すべき抗原に対する
抗体を直接蛍光標識したものを使用してもよいが、特
に、抗原に対する抗体に対する抗体、すなわち第二抗体
が蛍光標識された、所謂、間接法によるのが検出感度が
高いとの観点から好ましい。
抗体を直接蛍光標識したものを使用してもよいが、特
に、抗原に対する抗体に対する抗体、すなわち第二抗体
が蛍光標識された、所謂、間接法によるのが検出感度が
高いとの観点から好ましい。
【００１７】本発明に従うＣＥの性状の評価方法によれ
ば、例えば、抗原性の検出方法により角層試料における
ＣＥのインボルクリンが有意に検出できる場合は、有意
量（または識別可能な程度）までには、脂質がインボル
クリンに共有結合していないか、あるいは架橋反応が十
分でなく抗原性を保持していることを意味し、角層試料
におけるＣＥは未熟な状態にあると評価できる。逆に、
例えば、インボルクリンが有意には検出できない場合に
は、脂質のインボルクリンへの共有結合がかなり生じて
いるか、あるいは架橋反応が十分に進み抗原性が消失し
ており、ＣＥは成熟した状態にあると評価できる。ま
た、例えば、ナイルレッドで強陽性に染色されるＣＥが
角層試料中に検出（または観察）される場合には、ＣＥ
は強靭な状態であると評価できる。逆に、ナイルレッド
による染色性に多様性が認められる場合には、ＣＥ形成
過程にばらつきがあると評価できる。以上の評価は培養
した表皮角化細胞におけるＣＥ形成過程にも同様に適用
できる。
ば、例えば、抗原性の検出方法により角層試料における
ＣＥのインボルクリンが有意に検出できる場合は、有意
量（または識別可能な程度）までには、脂質がインボル
クリンに共有結合していないか、あるいは架橋反応が十
分でなく抗原性を保持していることを意味し、角層試料
におけるＣＥは未熟な状態にあると評価できる。逆に、
例えば、インボルクリンが有意には検出できない場合に
は、脂質のインボルクリンへの共有結合がかなり生じて
いるか、あるいは架橋反応が十分に進み抗原性が消失し
ており、ＣＥは成熟した状態にあると評価できる。ま
た、例えば、ナイルレッドで強陽性に染色されるＣＥが
角層試料中に検出（または観察）される場合には、ＣＥ
は強靭な状態であると評価できる。逆に、ナイルレッド
による染色性に多様性が認められる場合には、ＣＥ形成
過程にばらつきがあると評価できる。以上の評価は培養
した表皮角化細胞におけるＣＥ形成過程にも同様に適用
できる。
【００１８】上記評価結果は、被検試料が由来する（す
なわち、被験者の）皮膚の肌質とも相関性があることが
認められた。例えば、抗原性を検出した結果、角層試料
中にインボルクリン陽性ＣＥが検出できる場合には、被
験者の検出対象部位の角層バリアー機能は低く、肌荒れ
が生じているものと評価できる。
なわち、被験者の）皮膚の肌質とも相関性があることが
認められた。例えば、抗原性を検出した結果、角層試料
中にインボルクリン陽性ＣＥが検出できる場合には、被
験者の検出対象部位の角層バリアー機能は低く、肌荒れ
が生じているものと評価できる。
【００１９】一方、ナイルレッドで強陽性に染色される
ＣＥが検出される場合には、被験者の角層バリアー機能
は十分であるが、角層が堅牢な状態であると評価でき
る。また、ナイルレッド染色性に多様性が認められる場
合には、角層形成過程にばらつきがあり、肌荒れ状態に
あると評価できる。
ＣＥが検出される場合には、被験者の角層バリアー機能
は十分であるが、角層が堅牢な状態であると評価でき
る。また、ナイルレッド染色性に多様性が認められる場
合には、角層形成過程にばらつきがあり、肌荒れ状態に
あると評価できる。
【００２０】さらに付言すれば、評価対象部位の角層試
料から得られたＣＥ中に、上述の異常なＣＥを認めた場
合には、肌荒れなどの皮膚トラブルを有すると評価でき
る。異常なＣＥの出現頻度は、目視により判定すること
もできるが、その数をカウントしたり、画像解析により
数値化してもよい。このようにして評価した異常なＣＥ
の検出頻度を、健常な皮膚を有することが知られている
ヒトの対応するＣＥと比較する。
料から得られたＣＥ中に、上述の異常なＣＥを認めた場
合には、肌荒れなどの皮膚トラブルを有すると評価でき
る。異常なＣＥの出現頻度は、目視により判定すること
もできるが、その数をカウントしたり、画像解析により
数値化してもよい。このようにして評価した異常なＣＥ
の検出頻度を、健常な皮膚を有することが知られている
ヒトの対応するＣＥと比較する。
【００２１】加えて、同一人において、一定のスキンケ
ア手段が施される前後の皮膚に由来するＣＥにおける異
常ＣＥの検出頻度との比較を行なうこともできる。この
場合、例えば、スキンケア手段が施された後の異常ＣＥ
の検出頻度が、それ以前の異常ＣＥの検出頻度よりも有
意に小さいときは、当該スキンケア手段は肌質の改善に
有効であるものと評価できる。したがって、本発明によ
れば、皮膚に対して施されたスキンケア手段の評価方法
も包含される。かかるスキンケア手段としては、スキン
ケアクリーム、スキンケアローションなどの皮膚への施
用を具体的なものとして挙げることができるが、それら
に限定されない。
ア手段が施される前後の皮膚に由来するＣＥにおける異
常ＣＥの検出頻度との比較を行なうこともできる。この
場合、例えば、スキンケア手段が施された後の異常ＣＥ
の検出頻度が、それ以前の異常ＣＥの検出頻度よりも有
意に小さいときは、当該スキンケア手段は肌質の改善に
有効であるものと評価できる。したがって、本発明によ
れば、皮膚に対して施されたスキンケア手段の評価方法
も包含される。かかるスキンケア手段としては、スキン
ケアクリーム、スキンケアローションなどの皮膚への施
用を具体的なものとして挙げることができるが、それら
に限定されない。
【００２２】本発明に従う、肌質の評価方法のより具体
的な態様を示せば、以下の工程を含んでなる。
的な態様を示せば、以下の工程を含んでなる。
【００２３】（Ａ）被験者の評価対象部位の皮膚由来の
角層試料を用意する工程、（Ｂ）用意した角層試料から
コーニファイドエンベロップを調製する工程、（Ｃ）コ
ーニファイドエンベロップの性状を疎水性領域を染色で
きる色素により染色して、染色の程度を判定する工程、
（Ｄ）コーニファイドエンベロップにおける構成タンパ
ク質の抗原性を該タンパク質に対する抗体により免疫染
色して染色の程度を判定する工程、（Ｅ）前記（Ｃ）
（Ｄ）で得られた判定結果を、被験者以外の対応する角
層試料について工程（Ａ）〜（Ｄ）と同様の工程を介し
て得られた判定結果と比較する工程。
角層試料を用意する工程、（Ｂ）用意した角層試料から
コーニファイドエンベロップを調製する工程、（Ｃ）コ
ーニファイドエンベロップの性状を疎水性領域を染色で
きる色素により染色して、染色の程度を判定する工程、
（Ｄ）コーニファイドエンベロップにおける構成タンパ
ク質の抗原性を該タンパク質に対する抗体により免疫染
色して染色の程度を判定する工程、（Ｅ）前記（Ｃ）
（Ｄ）で得られた判定結果を、被験者以外の対応する角
層試料について工程（Ａ）〜（Ｄ）と同様の工程を介し
て得られた判定結果と比較する工程。
【００２４】本発明によれば、肌質を評価するためのキ
ットも提供される。
ットも提供される。
【００２５】該キットには、皮膚由来の角層試料におけ
るコーニファイドエンベロップの疎水性領域を特異的に
染色できる色素および該コーニファイドエンベロップの
構成タンパク質に対する抗体からなる群より選ばれる少
なくとも１種の試薬が含まれる。
るコーニファイドエンベロップの疎水性領域を特異的に
染色できる色素および該コーニファイドエンベロップの
構成タンパク質に対する抗体からなる群より選ばれる少
なくとも１種の試薬が含まれる。
【００２６】典型的には、上記色素としては、ナイルレ
ッドが、そして上記抗体としてはインボルクリンおよび
ロリクリンに対する抗体の少なくとも一種および、これ
らの各抗体に対する蛍光標識（それぞれＦＩＴＣおよび
ＴＲＩＴＣによる）抗体の少なくとも一種が含められ
る。これらの色素および各抗体は市販されているものを
そのまま使用することができる。
ッドが、そして上記抗体としてはインボルクリンおよび
ロリクリンに対する抗体の少なくとも一種および、これ
らの各抗体に対する蛍光標識（それぞれＦＩＴＣおよび
ＴＲＩＴＣによる）抗体の少なくとも一種が含められ
る。これらの色素および各抗体は市販されているものを
そのまま使用することができる。
【００２７】場合により、本発明に従うキットには、角
層試料を用意するための粘着性テープ、角層試料からＣ
Ｅを調製するための試薬類（後述する実施例を参照のこ
と）および操作説明書等を含めることもできる。
層試料を用意するための粘着性テープ、角層試料からＣ
Ｅを調製するための試薬類（後述する実施例を参照のこ
と）および操作説明書等を含めることもできる。
【００２８】こうして、本発明によれば、特に、非侵襲
的な方法により採取できる角層試料を使用して、ＣＥの
性状を評価し、延いては被験者の肌の状態（または質）
を客観的かつ正確に評価できる。
的な方法により採取できる角層試料を使用して、ＣＥの
性状を評価し、延いては被験者の肌の状態（または質）
を客観的かつ正確に評価できる。
【００２９】
【実施例】以下、実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明する。 実施例１：皮膚から直接取得した角層試料の評価 （角層試料の用意およびＣＥの調製）肌荒れなどの皮膚
トラブルを有する被験者の顔面（頬）および上腕に、セ
ロハンテープを貼付して直ちに剥離した。テープに付着
した角層に、ジチオスレイトール、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を含むトリス塩酸緩衝液を加えて、１０
０℃にて１０分間加熱した。不溶物を、４０００ｇ１０
分間の遠心により集めた。さらに溶出液添加と加熱を３
回繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去した。こうし
て得られた不溶物をＣＥとした。 （ＣＥ染色例）上述の方法で調製した被験者の上腕内側
（無処置群）、ＳＤＳ惹起肌荒れ群およびテープストリ
ッピング肌荒れ群由来の角層試料における各ＣＥをそれ
ぞれスライドグラスに滴下し、風乾させた後、冷アセト
ン中で固定した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液に
て水和させた後、マウス抗ヒトインボルクリン抗体（NO
VOCASTRA 社）を１次抗体として反応させた。余剰の抗
体を洗浄により除去した後に、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を２次抗体として反応させ
た。余剰の抗体を洗浄により除去した後に、ナイルレッ
ド染色液を反応させ、封入し、蛍光顕微鏡にて観察し
た。観察画像をＣＣＤカメラを介してコンピュータに取
り込み、印刷するとともに、画像解析ソフト（Mac Scop
e）を用いて、インボルクリン陽性ＣＥ、ナイルレッド
陽性ＣＥなどを鑑別した。 肌荒れに悩む人の顔面由来
のＣＥに上述の染色を施した結果を図１（図面代用写
真）に、皮膚トラブルを有していない健常な上腕内側に
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処置あるいはテープ
ストリッピングにより実験的肌荒れを惹起した角層由来
のＣＥに染色を施した結果を図２（図面代用写真）に示
す。
に説明する。 実施例１：皮膚から直接取得した角層試料の評価 （角層試料の用意およびＣＥの調製）肌荒れなどの皮膚
トラブルを有する被験者の顔面（頬）および上腕に、セ
ロハンテープを貼付して直ちに剥離した。テープに付着
した角層に、ジチオスレイトール、ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）を含むトリス塩酸緩衝液を加えて、１０
０℃にて１０分間加熱した。不溶物を、４０００ｇ１０
分間の遠心により集めた。さらに溶出液添加と加熱を３
回繰り返して、可溶性成分を徹底的に除去した。こうし
て得られた不溶物をＣＥとした。 （ＣＥ染色例）上述の方法で調製した被験者の上腕内側
（無処置群）、ＳＤＳ惹起肌荒れ群およびテープストリ
ッピング肌荒れ群由来の角層試料における各ＣＥをそれ
ぞれスライドグラスに滴下し、風乾させた後、冷アセト
ン中で固定した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液に
て水和させた後、マウス抗ヒトインボルクリン抗体（NO
VOCASTRA 社）を１次抗体として反応させた。余剰の抗
体を洗浄により除去した後に、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗マ
ウスイムノグロブリン抗体を２次抗体として反応させ
た。余剰の抗体を洗浄により除去した後に、ナイルレッ
ド染色液を反応させ、封入し、蛍光顕微鏡にて観察し
た。観察画像をＣＣＤカメラを介してコンピュータに取
り込み、印刷するとともに、画像解析ソフト（Mac Scop
e）を用いて、インボルクリン陽性ＣＥ、ナイルレッド
陽性ＣＥなどを鑑別した。 肌荒れに悩む人の顔面由来
のＣＥに上述の染色を施した結果を図１（図面代用写
真）に、皮膚トラブルを有していない健常な上腕内側に
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処置あるいはテープ
ストリッピングにより実験的肌荒れを惹起した角層由来
のＣＥに染色を施した結果を図２（図面代用写真）に示
す。
【００３０】また、上記実験的肌荒れのＳＤＳ処置群お
よびテープストリッピング群）を無処置群（それぞれ３
ないし４検体）におけるインボルクリン陽性ＣＥの割合
を対比して表１に示す。
よびテープストリッピング群）を無処置群（それぞれ３
ないし４検体）におけるインボルクリン陽性ＣＥの割合
を対比して表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】実施例２：培養角化細胞の評価 （ＣＥ形成促進効果）ヒト表皮角化細胞を、Ｒｈｅｉｎ
ｗａｌｄ ＆ Ｇｒｅｅｎ の方法（Ｃｅｌｌ：６：３
３１−３３４，１９７５）にしたがって、培養した。増
殖培地（１０％ウシ胎児血清、ヒドロコルチゾン０．５
μｇ／ｍｌ、インスリン５μｇ／ｍｌ、コレラトキシン
１０-10Ｍ、上皮増殖因子１０ｎｇ／ｍｌ、アデニン
１．８ｘ１０-4Ｍを含むＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓＦ１２
（３：１））にて培養しコンフルエントに達した後に、
ケラチノサイトの分化を促しバリアー形成を促進するこ
とが知られているオレイン酸、あるいはリノール酸（Ｈ
ａｎｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １００：７０５−７１
２，１９９７、Ｋｏｍｕｖｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏ
ｇｙ １１１：４２９−４３３、１９９８）を含む培養
液（０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭ）に置換
して、さらに１週間培養を続けた。培養終了後に、ジチ
オスレイトール、ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス
塩酸緩衝液を加えて、１００℃にて１０分間加熱した。
不溶物を、４０００ｇ１０分間の遠心により集めた。さ
らに溶出液添加と加熱を繰り返して、可溶性成分を徹底
的に除去した。こうして得られた不溶物をＣＥとした。
得られたＣＥを、前述の例に記載した方法により、抗ヒ
トインボルクリン抗体処理およびナイルレッド染色を行
った。その結果を表２に示す。
ｗａｌｄ ＆ Ｇｒｅｅｎ の方法（Ｃｅｌｌ：６：３
３１−３３４，１９７５）にしたがって、培養した。増
殖培地（１０％ウシ胎児血清、ヒドロコルチゾン０．５
μｇ／ｍｌ、インスリン５μｇ／ｍｌ、コレラトキシン
１０-10Ｍ、上皮増殖因子１０ｎｇ／ｍｌ、アデニン
１．８ｘ１０-4Ｍを含むＤＭＥＭ−Ｈａｍ’ｓＦ１２
（３：１））にて培養しコンフルエントに達した後に、
ケラチノサイトの分化を促しバリアー形成を促進するこ
とが知られているオレイン酸、あるいはリノール酸（Ｈ
ａｎｌｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １００：７０５−７１
２，１９９７、Ｋｏｍｕｖｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏ
ｇｙ １１１：４２９−４３３、１９９８）を含む培養
液（０．１％ウシ血清アルブミンを含むＭＥＭ）に置換
して、さらに１週間培養を続けた。培養終了後に、ジチ
オスレイトール、ドデシル硫酸ナトリウムを含むトリス
塩酸緩衝液を加えて、１００℃にて１０分間加熱した。
不溶物を、４０００ｇ１０分間の遠心により集めた。さ
らに溶出液添加と加熱を繰り返して、可溶性成分を徹底
的に除去した。こうして得られた不溶物をＣＥとした。
得られたＣＥを、前述の例に記載した方法により、抗ヒ
トインボルクリン抗体処理およびナイルレッド染色を行
った。その結果を表２に示す。
【００３３】
【表２】
【図１】肌荒れに悩む人の顔面から調製したＣＥにイン
ボルクリン免疫染色（ＦＩＴＣ標識）およびナイルレッ
ド染色を施した組織細胞の状態を示す図面に代わる蛍光
顕微鏡にて観察した写真（Ａ）および位相差観察像
（Ｂ）である。白枠三角の指示する部位がインボルクリ
ン陽性の未熟ＣＥを示し、白塗り三角の指示する部位が
ナイルレッド陽性の成熟ＣＥを示す。
ボルクリン免疫染色（ＦＩＴＣ標識）およびナイルレッ
ド染色を施した組織細胞の状態を示す図面に代わる蛍光
顕微鏡にて観察した写真（Ａ）および位相差観察像
（Ｂ）である。白枠三角の指示する部位がインボルクリ
ン陽性の未熟ＣＥを示し、白塗り三角の指示する部位が
ナイルレッド陽性の成熟ＣＥを示す。
【図２】健常人の上腕内側にＳＤＳ処置または繰り返し
テープストリッピング置換により実験的肌荒れを惹起
し、こうして調製したＣＥにインボルクリン免疫染色
（ＦＩＴＣと標識）およびナイルレッド染色を施した組
織細胞の状態を示す図面に代わる蛍光顕微鏡にて観察し
た写真である。（Ａ）は、対象部位で、（Ｂ）はＳＤＳ
による肌荒れ部位で、そして（Ｃ）はテープストリッピ
ングによる肌荒れ部位の観察結果である。白枠三角の指
示する部位がインボルクリン陽性の未熟ＣＥを示す。健
常部位においては認められなかった未熟ＣＥが肌荒れ部
位では出現している。
テープストリッピング置換により実験的肌荒れを惹起
し、こうして調製したＣＥにインボルクリン免疫染色
（ＦＩＴＣと標識）およびナイルレッド染色を施した組
織細胞の状態を示す図面に代わる蛍光顕微鏡にて観察し
た写真である。（Ａ）は、対象部位で、（Ｂ）はＳＤＳ
による肌荒れ部位で、そして（Ｃ）はテープストリッピ
ングによる肌荒れ部位の観察結果である。白枠三角の指
示する部位がインボルクリン陽性の未熟ＣＥを示す。健
常部位においては認められなかった未熟ＣＥが肌荒れ部
位では出現している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 高橋 元次 神奈川県横浜市金沢区福浦２−12−１ 株 式会社資生堂第二リサーチセンター内 Ｆターム(参考） 2G045 AA24 AA40 BA13 BB20 BB25 CB09 DA36 FA11 FB03 GC12 4C038 VA04 VB22 VC05 VC20
Claims (9)
- 【請求項１】 皮膚由来の角層試料におけるコーニファ
イドエンベロップを、疎水性領域を選択的に染色できる
色素で染色し、該コーニファイドエンベロップの染色性
を評価の指標とすることを特徴とする該コーニファイド
エンベロップの性状の評価方法。 - 【請求項２】 色素がナイルレッドである請求項１記載
の評価方法。 - 【請求項３】 皮膚由来の角層試料におけるコーニファ
イドエンベロップを、該コーニファイドエンベロップの
構成タンパク質の抗原性を検出し、検出された抗原性を
評価の指標とすることを特徴とする該コーニファイドエ
ンベロップの性状の評価方法。 - 【請求項４】 抗原性が抗ヒトインボルクリン抗体を使
用して検出される請求項３記載の評価方法。 - 【請求項５】 請求項１または２および請求項３または
４に記載の評価方法が、組み合わせて用いられる皮膚由
来の角層試料におけるコーニファイドエンベロップの性
状の評価方法。 - 【請求項６】 皮膚由来の角層試料が非侵襲的な方法に
より皮膚から取得されたものである請求項１〜５のいず
れかに記載の評価方法。 - 【請求項７】 皮膚由来の角層試料が培養された表皮角
化細胞に由来するものである請求項１〜５のいずれかに
記載の評価方法。 - 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載の評価方
法により得られるコーニファイドエンベロップの性状を
肌質の指標とすることを特徴とする肌質の評価方法。 - 【請求項９】 皮膚由来の角層試料におけるコーニファ
イドエンベロップの疎水性領域を特異的に染色できる色
素および該コーニファイドエンベロップの構成タンパク
質に対する抗体からなる群より選ばれる少なくとも１種
の試薬を含んでなる肌質を評価するためのキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000098211A JP3878787B2 (ja) | 1999-07-22 | 2000-03-31 | コーニファイドエンベロップの評価 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-207890 | 1999-07-22 | ||
| JP20789099 | 1999-07-22 | ||
| JP2000098211A JP3878787B2 (ja) | 1999-07-22 | 2000-03-31 | コーニファイドエンベロップの評価 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001091514A true JP2001091514A (ja) | 2001-04-06 |
| JP3878787B2 JP3878787B2 (ja) | 2007-02-07 |
Family
ID=26516531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000098211A Expired - Lifetime JP3878787B2 (ja) | 1999-07-22 | 2000-03-31 | コーニファイドエンベロップの評価 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3878787B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001074326A1 (fr) * | 2000-03-31 | 2001-10-11 | Shiseido Company, Ltd. | Agents ameliorant la fonction de barriere cutanee |
| WO2002072041A1 (fr) * | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Shiseido Company, Ltd. | Cosmetiques et methode de traitement servant a promouvoir la maturation de couches de keratine |
| WO2005085844A1 (ja) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Shiseido Company, Ltd. | 角層中の酸化タンパク質を指標とする角層の透明性・保水性を評価する方法 |
| JP2009174867A (ja) * | 2008-01-21 | 2009-08-06 | Shiseido Co Ltd | 角層タンパク質の可溶性タンパク質の量比を指標とした肌質の評価方法 |
-
2000
- 2000-03-31 JP JP2000098211A patent/JP3878787B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001074326A1 (fr) * | 2000-03-31 | 2001-10-11 | Shiseido Company, Ltd. | Agents ameliorant la fonction de barriere cutanee |
| WO2002072041A1 (fr) * | 2001-03-13 | 2002-09-19 | Shiseido Company, Ltd. | Cosmetiques et methode de traitement servant a promouvoir la maturation de couches de keratine |
| WO2005085844A1 (ja) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Shiseido Company, Ltd. | 角層中の酸化タンパク質を指標とする角層の透明性・保水性を評価する方法 |
| US7632633B2 (en) | 2004-03-05 | 2009-12-15 | Shiseido Company, Ltd. | Method for determining the degree of protein oxidation in a skin sample using oxidized protein in stratum corneum as an indicator |
| JP2009174867A (ja) * | 2008-01-21 | 2009-08-06 | Shiseido Co Ltd | 角層タンパク質の可溶性タンパク質の量比を指標とした肌質の評価方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3878787B2 (ja) | 2007-02-07 |
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