TW201435343A - 角質層狀態之評價方法及關於化粧料之角質層改善效果之評價方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題係關於提供一種更簡便地評價角質層狀態之方法。使水溶性染料之溶液接觸角質層片，測定染色強度或螢光強度，藉此，可簡便地進行角質層狀態之評價。藉由應用本發明之使用水溶性染料之角質層狀態之評價方法，進而提供一種對化粧料或美容處理之角質層改善效果進行評價之方法。
Description
本發明係關於一種角質層狀態之評價方法。又，本發明亦關於一種對化粧料或美容處理之角質層改善效果進行評價之方法。
於選擇化粧料上，準確地知曉皮膚之狀態非常重要，為了保持更佳之皮膚狀態，必須根據皮膚狀態選擇化粧料或美容方法。對於皮膚狀態之評價，業界一直進行使用彈性纖維組織測定儀(Reviscometer)或皮膚彈性測定儀(Cutometer)等測定皮膚之柔軟性、皮膚水分蒸發量(TEWL)之測定、藉由顯微鏡之肌理之測定、或藉由膠帶條之角質層評價等(非專利文獻1、2、3、專利文獻1)。其中，認為藉由膠帶條之角質層評價可容易地採取，對適當評價肌膚狀態較為有效，並揭示有藉由角質細胞之形狀、面積、有無核，以及使用可將β片層結構染色之剛果紅將角質層染色進行觀察，從而鑑別皮膚之柔軟性之方法(專利文獻2)。
由β片層結構之多少所表示之皮膚柔軟性為角質層狀態之1個指標，除柔軟性以外，亦有表示角質層狀態之各種特性，例如透明度或角質層細胞間脂質之結構、角質層屏障功能等。然而，關於根據經膠帶條獲取之角質層對該等資訊簡便地進行測定之方法並未進行充分之研究，又，亦未確立可簡便地鑑別皮膚粗糙狀態之方法。
[專利文獻1]日本專利特開2007-033201號公報
[專利文獻2]日本專利特開2007-263655號公報
[非專利文獻1]小山內宰等人：抗衰老系列皮膚之抗老化最前線，第150頁~第161頁
[非專利文獻2]高橋元次等人：抗衰老系列皮膚之抗老化最前線，第114頁~第133頁
[非專利文獻3]Integral股份有限公司：Fragrance Journal, 35 (2), 67頁~69頁(2007年)
本發明之課題在於提供一種更簡便地評價角質層狀態之方法。進而，本發明之課題在於提供一種使用簡便地評價角質層狀態之方法，而對關於角質層改善效果之候補化粧料或美容處理進行評價之方法。
關於粗糙之角質層，已知有角質層透明性較低，屏障功能亦較低，細胞間脂質雜亂。雖可使用該等指標評價角質層狀態，但為了測定該等指標，分別需要特殊之裝置。因此，本發明者等人為了提供更簡便地評價角質層狀態之方法而進行努力研究。結果發現，若利用螢光素或孟加拉玫瑰紅將角質層片染色，則於粗糙之角質層之情形時染色強度提高(圖1及圖2)，並且發現，使用螢光素或孟加拉玫瑰紅之染色如對於即便看似為健康之皮膚而亦可識別其狀態之程度般感度優異(圖3)，可評價角質層片之角質層狀態。進而，提供一種藉由使用該角質層狀態之評價法，而對關於角質層改善效果之候補化粧料或美容
處理進行評價之方法。
更具體而言，本發明係關於以下發明：
[1]一種角質層狀態之評價方法，其包括以下步驟：使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料之水溶液接觸角質層片之步驟；清洗上述染料之步驟；及測定角質層片中之上述染料之染色強度之步驟。
[2]如項目[1]之評價方法，其中上述角質層狀態之評價係對角質層透明度、角質層細胞間脂質之結構及角質層之水分含量進行評價。
[3]如項目[1]或[2]之評價方法，其中上述評價係基於與來自標本之染色強度之比較、或與比色表之比較而進行。
[4]如技術方案1至3中任一項之方法，其中上述角質層片係藉由膠帶條製備者。
[5]一種關於角質層改善效果之候補化粧料之評價方法，其包括以下步驟：對角質層片應用候補化粧料之步驟；對角質層片進行乾燥之步驟；使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料之水溶液接觸角質層片之步驟；清洗上述染料之步驟；及測定角質層片中之上述染料之染色強度之步驟。
[6]如項目[5]之方法，其中上述角質層片為培養角質層片。
[7]一種關於角質層改善效果之美容處理之評價方法，其包括以下步驟：使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料之水溶液與對皮膚進行美容處理後所獲取之製備角質層片接觸之步
驟；清洗上述染料之步驟；及測定上述角質層片中之上述染料之染色強度或螢光強度之步驟。
[8]如項目[7]之評價方法，其中上述評價係基於對美容處理前之藉由膠帶條獲取之角質層片利用染料進行染色，並針對於美容處理前後之角質層片比較螢光強度。
[9]如項目[8]之方法，其中上述美容處理為化粧料之塗抹、蒸汽之應用或按摩。
根據本發明，可使用選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料評價角質層片之角質層狀態。因可評價角質層狀態，而對應用候補化粧料或美容處理前後之角質層狀態進行評價，藉此可確認角質層改善效果。
圖1表示對將利用水濕潤之培養角質層片緩慢乾燥而獲得之健康角質層模型、及進行冷凍乾燥而獲得之皮膚粗糙角質層模型進行螢光素染色並拍攝而獲得之圖像。
圖2表示對藉由膠帶條自進行10%SDS處理而誘發皮膚粗糙之皮膚獲取之皮膚粗糙角質層片、及自未進行SDS處理之部位之皮膚獲取之健康角質層片進行螢光素之結果。表示皮膚狀態(圖2A)、及揭示螢光素染色時之螢光亮度之圖表(圖2B)。
圖3表示揭示對藉由膠帶條自上臂內側之皮膚獲取之角質層片、及自臉頰之皮膚獲取之角質層片進行螢光素染色後之螢光亮度之圖表。
圖4表示對在活體內使皮膚濕潤，繼而以低濕度(10%)或高濕度
(90%)乾燥後藉由膠帶條所獲取之角質層片進行螢光素染色並拍攝而獲得之圖像(圖4A)，以及揭示於該圖像中選擇12視野所測得之螢光亮度之圖表(圖4B)。
圖5表示揭示於利用水將藉由膠帶條自皮膚獲取之角質層浸潤並以濕度90%緩慢乾燥之情形、及使用矽膠快速乾燥之情形時，利用各種染料進行染色而獲得之染色強度之圖表。作為染料，使用(A)螢光素、(B)孟加拉玫瑰紅、(C)番紅、(D)剛果紅。
圖6表示揭示於將角質層片浸漬於水、3%赤藻糖醇(ER)及3%POE(14)POP(7)二甲醚後，於裝有矽膠之密閉容器中以濕度0%進行乾燥之情形時之藉由螢光素染色之螢光亮度之圖表。作為對照，亦揭示針對於水以濕度90%進行乾燥之情形之結果。
圖7表示揭示於將角質層片浸漬於0%、0.1%、1%、3%、10%之POE(14)POP(7)二甲醚後，於裝有矽膠之密閉容器中以濕度0%進行乾燥之情形時之藉由螢光素染色之螢光亮度之圖表。作為對照，揭示將利用水浸潤角質層片後以濕度90%進行乾燥之情形設為100。
本發明係關於一種角質層狀態之評價方法，其包括：使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料水溶液接觸角質層片之步驟；清洗染料之步驟；及測定角質層片中之染料之染色強度之步驟。角質層狀態可由選自由角質層透明度、角質層細胞間脂質之結構化程度及角質層含水量所組成之群中之至少1種或其任意之組合而表示。本發明係基於發現於利用選自螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料將角質層片染色之情形時，染色強度成為角質層狀態、即選自由角質層透明度、角質層細胞間脂質之結構化之程度及角質層含水量所組成之群中之至少1種或其任意之組合之指標。因此，角質層狀態可根據角質層片之染色強度而評價，染色越
強，角質層狀態越差，評價為粗糙狀態，並判定為發生角質層透明度之降低、角質層細胞間脂質之結構之雜亂以及角質層含水量之減少。角質層狀態之評價可藉由與比色表或染色強度之基準值之比較、或者與成為對照之標準品之染色強度之比較而進行。成為對照之標準品例如可為藉由對健康之角質層片塗抹SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)等皮膚粗糙誘發劑之溶液之稀釋系列，培養一定時間而製成之誘發了皮膚粗糙之角質層片，或可為藉由塗抹含有一定濃度之皮膚粗糙誘發劑之溶液，花費時間培養而製成之誘發了皮膚粗糙之角質層片。
於本說明書中，所謂角質層片，只要含有角質層則可為任意者，係指使用膠帶條等之方法由活體之皮膚製備之角質層片(以下，稱為製備角質層片)或由細胞培養物獲得之角質層片(以下，稱為培養角質層片)等。角質層狀態之評價方法或美容處理之評價方法中所使用之角質層片較佳為製備角質層片，更佳為藉由膠帶條採集之製備角質層片。藉由膠帶條採集之製備角質層片亦有時僅指藉由膠帶條製備之角質層或角質層細胞。關於用於候補化粧料之評價方法之角質層片，就大規模且均勻地進行篩選之觀點而言，較佳為培養角質層片。培養角質層片可藉由進行皮膚之三維模型培養而獲取，亦可為自市售之培養表皮例如由Japan Tissue Engineering股份有限公司銷售之培養表皮所獲取之角質層片。
本發明者等人發現，於溶液中潤濕角質層片後使之快速乾燥之情形時，角質層之透明度降低，屏障功能降低，並且細胞間脂質之結構雜亂(日本專利特願第2011-283045號)，而可將快速乾燥後之角質層片設為皮膚粗糙角質層之模型。本發明係基於發現如下情況：於利用水溶性染料將在溶液中潤濕後經快速乾燥之皮膚粗糙模型之角質層片染色之情形時發現染色強度顯著較高，染色強度成為皮膚粗糙即角質
層之透明度、屏障功能及細胞間脂質之結構之指標。
於本說明書中，所謂染料，只要為用於角質層狀態之評價之染料，則可為任意者，亦可使用天然染料、合成染料或螢光染料中之任一者。所謂螢光染料，係指發出螢光之染料，所謂螢光，係指自藉由電磁波激發之物質所發出之特定波長之光。可認為藉由將本發明之角質層狀態之評價所使用之染料溶解於水，而浸透於易滲入水之結構、例如因皮膚粗糙而角質層之屏障功能較低之細胞中，藉此，皮膚粗糙角質層被較強地染色，但並不意圖限定於該機制。另一方面，已知剛果紅等染料雖具有水溶性但會將角質纖維染色(專利文獻2)，而無法用於角質層狀態之評價。如此，於存在根據染料種類之染色特異性之情形時，無法用於角質層狀態之評價，故而期待染色特異性較低。進而，就用於活體之角質層之觀點而言，當然期待較高之安全性。對於本發明之角質層狀態之評價所使用之染料，要求安全性、水溶性及較低之染色特異性，作為螢光染料，就滿足該等性質之1個以上之觀點而言，例如可列舉螢光素或該等之鹽，進而該等之衍生物，作為螢光染料以外之染料，可列舉孟加拉玫瑰紅或該等之鹽，進而該等之衍生物。作為染料之鹽，可使用任意之鹽，就滿足安全性、水溶性及較低之染色特異性中之1個以上之性質之觀點而言，較佳為鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽等。
於本發明中，關於使染料水溶液接觸角質層片之步驟，只要使角質層片與染料水溶液接觸，則可藉由任意之形式進行，例如可藉由將角質層片浸漬於染料水溶液中而進行，或亦可藉由對角質層片滴下或塗抹染料水溶液而進行。
水溶性染料之清洗步驟通常為藉由水等溶劑沖洗染料之步驟，但並不僅限於溶劑，亦可使用溶液，例如水溶液。清洗亦可進行任意次，較佳為進行1~3次，亦可進行其以上之次數。
染色強度之測定通常可藉由使用光學顯微鏡等觀察經染料染色之角質層片，使用市售之圖像處理軟體將觀察圖像數值化而進行。另一方面，於使用螢光染料進行染色之情形時，可藉由測定螢光亮度而測定染色強度。螢光亮度之測定通常係藉由對經螢光染料染色之角質層片照射包含紫外線之電磁波而產生螢光，並測定該螢光而進行，藉由照度計或螢光顯微鏡等螢光測定器進行測定。另一方面，由於太陽光或螢光燈之光中通常含有紫外線，而於可見光下亦可確認螢光，故而亦可於可見光下藉由目視對螢光強度進行分類，螢光之確認時，較佳為使用黑光燈等紫外線產生器。於使用螢光顯微鏡測定螢光強度之情形時，由於存在發出螢光之部位與不發出螢光之部位，故而必須隨機選擇複數個視野測定螢光量，此種處理亦可使用螢光顯微鏡所附帶之圖像處理軟體而進行。
於本發明之另一態樣中，本發明亦關於一種應用角質層狀態之評價方法之關於角質層改善效果之候補化粧料之評價方法。更具體而言，候補化粧料之評價方法包括以下步驟：對角質層片應用候補化粧料之步驟；對角質層片進行乾燥之步驟；使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料之水溶液接觸角質層片之步驟；清洗染料之步驟；及測定角質層片中之染料之染色強度之步驟。藉由該評價方法，可對各種候補化粧料是否具有角質層改善效果進行製品評價篩選。又，根據乾燥條件之設定，而判定化粧料是否適合於使用環境，可使製品開發變得容易。
於本說明書中，所謂角質層改善效果，係指於角質層中引起角質層透明度之改善、角質層細胞間脂質之結構之整序化、或角質層含水量之降低中之任1個或2個以上之組合。藉由對候補化粧料判定是否具有此種角質層改善效果，可對候補化粧料是否有助於更美麗且健康之肌膚進行判定。
上述候補化粧料之評價方法中之對角質層片應用候補化粧料之步驟可藉由將角質層片浸漬於候補化粧料中而進行，或亦可藉由對角質層片以外用方式進行之方法，例如藉由滴下或塗抹候補化粧料或者藉由貼附或塗敷而進行。
上述候補化粧料之評價方法中之角質層片之乾燥步驟之條件可根據使用候補化粧料之環境而適當選擇。本發明者等人發現，在水中潤濕之角質層根據乾燥之過程而角質層狀態發生變化(日本專利特願第2011-283045號)，可認為藉由對濕潤之角質層緩慢乾燥，而產生角質層透明度之改善、細胞間脂質之整序化。因此，可根據環境而選擇乾燥條件，例如對即將在乾燥地區銷售之化粧料選擇低濕度，對即將在高溫多濕地區銷售之化粧料選擇高濕度及高溫條件，藉此，於該地區亦可選擇具有角質層改善效果之化粧料。又，應用化粧料之環境視銷售地區之季節亦較大地變化。因此，於本發明之更佳實施態樣中，可對化粧料根據銷售地區之各季節例如旱季或雨季、或春夏秋冬等季節而是否適合使用進行評價。為了篩選出具有更優異之角質層改善效果之候補化粧料，亦可選擇嚴峻之條件例如高溫低濕度條件，又，亦有時考慮體溫而選擇溫度。作為所選擇之溫度之範圍，例如為10℃~45℃，更佳為選擇作為下限值為選自10℃、15℃及20℃且作為上限值為選自20℃、25℃、30℃、35℃、37℃及40℃之溫度範圍。關於濕度，可選擇任意濕度，例如亦可選擇50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、100%。關於乾燥時間，並無特別限定，可選擇使候補化粧料之液體消失所需之充分時間，亦可適當選擇一定時間，例如1分鐘、2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時。
於本發明之另一態樣中，本發明亦關於一種使用角質層狀態之評價方法之關於角質層改善效果之美容處理之評價方法。更具體而
言，美容處理之評價方法係關於一種關於角質層改善效果之美容處理之評價方法，其包括以下步驟：使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料與對皮膚進行美容處理後藉由膠帶條獲取之角質層片接觸之步驟；清洗染料之步驟；及測定上述角質層片中之上述染料之染色強度之步驟。藉由該評價方法，可對所應用之美容處理是否有助於角質層狀態，尤其是角質層透明度或細胞間脂質之結構之整序化及/或角質層含水量之降低進行評價。較佳為亦可藉由將美容處理前藉由膠帶條獲取之角質層片之染色強度與美容處理後藉由膠帶條獲取之角質層片之染色強度加以比較而進行評價。於此情形時，於染色強度減小之情形，較佳為減小5%以上、更佳為減小10%以上、進而較佳為減小20%以上之情形時，可判定美容處理具有角質層改善效果。
作為美容處理，並無特別限定，例如包含化粧料之塗抹、按摩之應用、蒸汽之應用等認為對美容有效之任意之處理。美容處理可為處理一次，或亦可為持續數天至數週進行之持續性處理。美容處理可個人進行，或亦可於美容院或化粧品之銷售店、美容沙龍等進行，另外美容處理之評價方法亦可於美容院或化粧品之銷售店、美容沙龍等進行。
於本說明書中，所謂化粧料，係指應用於皮膚之化粧料，例如係指化粧水、乳液、美容液、乳霜、粉餅等，但並不限定於該等。即，本發明之化粧料不以皮膚之改善作為直接之目的，意圖包含所有塗抹於皮膚者，例如設為亦包含防曬霜、驅蟲劑、脫毛劑、生髪劑、剃鬚液、剃鬚後乳液等者。化粧料所含有之成分中，含有水、乙醇、甘油、聚乙二醇等醇類作為基劑，含有甘胺酸、甜菜鹼、吡咯啶酮羧酸鈉等胺基酸類，果糖、麥芽糖醇、甘露醇、海藻糖等糖類作為保濕劑，進而含有玻尿酸、膠原蛋白、腦醯胺等作為有效成分，並且含有
檸檬酸鈉、檸檬酸、乳酸鈉作為賦形劑，含有苯甲酸鹽、山梨酸等作為防腐劑，但並不限定於該等。
於本說明書中，所謂候補化粧料，係指對角質改善效果進行調查之化粧料，除作為製品銷售之化粧料以外，亦包含開發階段之化粧料，進而，亦可為化粧料之開發中選擇為化粧料用之溶液。例如，為了研究化粧料所使用之某物質之角質改善效果，亦可為僅含有該物質之水溶液。於本說明書之實施例中，使用Aqua-in-pool(註冊商標)、赤藻糖醇之水溶液，但不應限定於該等水溶液，亦可使用糖類、多元醇、胺基酸類、有機酸，例如海藻糖、甘露醇、甘油、聚乙二醇、玻尿酸、硫酸軟骨素、葡萄糖胺等作為保濕劑、增黏劑或者緩衝劑而含有之成分、或者有效成分等之任意水溶液，或亦可使用含有水以外者作為溶劑之溶液。POE(14)POP(7)二甲醚為聚氧乙烯聚氧丙烯無規共聚物二甲醚，具有既溶解於水亦溶解於油分之性質，故而為既可作為水性基劑亦可作為油性基劑而使用之物質。POE POP二甲醚之通式如下述般：
本發明所使用之POE(14)POP(7)二甲醚為m=14、n=7，但m、n亦可使用任意之整數。
於本發明中，皮膚屏障功能藉由經皮水分蒸發量(TEWL)而評價。TEWL意指經由角質層之水之蒸發量，TEWL越低，角質層之皮膚屏障功能越高，隨著TEWL升高，角質層之皮膚屏障功能降低。皮
膚屏障功能與皮膚粗糙之關係記載於專利文獻2中。
以下，列舉具體例進一步具體地說明本發明，但本發明並不限定於下述實施例。
由三維培養皮膚LabCyte EPI-MODEL(Japan Tissue Engineering股份有限公司)製備培養角質層片，利用水使培養角質層片濕潤後，使用恆溫槽(MTH-2200)，將培養角質層片於濕度60%、32℃下培養8小時，藉此使之乾燥，製成健康角質層模型。另一方面，利用水潤濕後，使用冷凍乾燥裝置(VD-80，TAITEC製造)冷凍至-20℃，利用同一裝置進行2小時冷凍乾燥，製成皮膚粗糙角質層模型。針對於乾燥後之培養角質層片，將其於0.2w/v%螢光素鈉(螢光素/鈉)溶液(和光純藥工業股份有限公司)中浸漬5分鐘，水洗後，照射藍色光(TANDA PROFESSIONAL CLEAR製造，光療法(Light therepy treatment))，並拍攝照片(圖1)。利用圖像處理軟體(ImageJ)對所獲得之圖像提取綠色成分而表示。
對上臂屈側部，進行2天使用浸於10%十二烷基硫酸鈉(SDS)之2.5×2.5cm之不織布之1小時被覆(occlusion)塗抹，引起皮膚粗糙(圖2A)。於其7天後，藉由膠帶條將角質層片剝離，固定於載玻片上。另一方面，將未經SDS處理之部位亦同樣地剝離，固定於載玻片上。利用0.2w/v%螢光素鈉溶液(和光純藥工業股份有限公司)將被固定之角質層片浸漬5分鐘，水洗後，利用螢光顯微鏡(Olympus BX51)觀察螢光亮度，取入圖像。使用分析軟體對取入之圖像實施偏斜修正，實施二值化，計算螢光亮度。將對12視野之資料進行平均所得之圖表示於
圖2B。關於自皮膚粗糙部位獲取之角質層片，螢光亮度顯著較高(p<0.001)。
利用膠帶條自4名男性之臉頰部及上臂內側部剝離角質層片，固定於載玻片上。利用0.2w/v%螢光素鈉溶液(和光純藥工業股份有限公司)將其浸漬5分鐘，水洗後，利用螢光顯微鏡(Olympus BX51)觀察螢光亮度，取入圖像。使用分析軟體對取入之圖像實施偏斜修正，實施二值化，計算螢光亮度。將對各自6視野之資料進行平均所得之圖表示於圖3。臉頰部及上臂內側部雖均未產生皮膚粗糙，但認為日常生活中暴露於外部氣體或紫外線之臉頰相較於上臂內側部，角質層狀態惡化。自臉頰部獲取之角質層片相較於上臂內側部，螢光亮度顯著更高(p<0.05)，明確得知根據本發明之方法，不僅能夠鑑別可見之皮膚粗糙狀態，亦可鑑別不可見之程度之皮膚粗糙之狀態。
將浸於水之2.5×2.5cm之不織布對上臂屈側部(兩臂)被覆塗抹2小時。取下不織布，將上臂屈側部送入濕度10%、溫度22℃之恆溫室，將一隻手臂自肩部放入裝有硝酸鉀之過飽和鹽之塑膠袋中，滯留1小時。裝有硝酸鉀之過飽和鹽之塑膠袋之內部濕度約為90%。其後，送回實驗室(濕度25%)並滯留1小時後，利用角質層剝離膠帶自兩臂之處理部位剝離角質層片，固定於載玻片上。利用0.2w/v%螢光素鈉溶液(和光純藥工業股份有有限公司)將所固定之角質層片浸漬5分鐘，水洗後，利用螢光顯微鏡(Olympus BX51)觀察螢光亮度，取入圖像(圖4A)。使用分析軟體對取入之圖像實施偏斜修正，實施二值化，計算螢光亮度。將對各自12視野之資料進行平均所得之圖表示於圖4B。
以低濕度(10%)乾燥之皮膚角質層比以高濕度(90%)乾燥之皮膚角質層螢光亮度顯著更高(P<0.01)。
使用角質層剝離膠帶自前臂屈側部採集2片角質層片，固定於載玻片上。將該等於水中浸漬1小時，其後將一片於裝有硝酸鉀之過飽和鹽之密閉容器中乾燥2小時。該情形之濕度約為90%。將另一片於乾燥之裝有矽膠之密閉容器中乾燥2小時。該情形之濕度為0%。利用0.2w/v%螢光素鈉溶液(和光純藥工業股份有限公司)將該等角質層片浸漬5分鐘，水洗後，利用螢光顯微鏡(Olympus BX51)觀察螢光亮度，取入圖像。使用分析軟體對取入之圖像實施偏斜修正，實施二值化，計算螢光亮度。將對各自12視野之資料進行平均所得之圖表示於圖5A)。將藉由膠帶條獲取之角質層片浸漬於水，使用矽膠進行快速乾燥，藉此，可製成皮膚粗糙角質層片模型，於該情形時，可測定螢光亮度之變化。利用矽膠乾燥之角質層比以高濕度乾燥之角質層螢光亮度顯著更高(P<0.001)。
分別使用其他染料即使用0.2w/v%孟加拉玫瑰紅溶液(和光純藥工業)、0.2w/v%番紅花水溶液(和光純藥工業)、0.2w/v%剛果紅水溶液(和光純藥工業)進行同樣之實驗。將利用上述方法製成之角質層片於各染料水溶液中浸漬5分鐘，水洗後，利用光學顯微鏡(Olympus BX40)進行觀察，取入其圖像。利用圖像分析軟體將所取入之圖像二值化，計算色強度。將對各自12視野之資料進行平均所得之圖表示於圖5B)、C)、D)。確認出於孟加拉玫瑰紅染色時，利用矽膠乾燥之角質層比以高濕度乾燥之角質層染色強度更高之傾向(p<0.1)。另一方面，於番紅染色、剛果紅染色時，無法評價乾燥引起之差異。
將使用角質層剝離膠帶自前臂屈側部獲取之角質層片固定於載玻片上，將所固定之各角質層片浸漬於作為對照之水(2片)、作為候補化粧料之3%赤藻糖醇水溶液(ER)及3%Aqua-in-pool 1407水溶液(AQ)中1小時。其後，將浸漬於水之1片角質層片於濕度0%、室溫下進行乾燥，將另1片於濕度90%、室溫下乾燥2小時。將浸漬於ER及AQ之角質層片於濕度0%、室溫下乾燥2小時。利用0.2w/v%螢光素鈉溶液(和光純藥工業股份有限公司)將該等角質層片浸漬5分鐘，水洗後，利用螢光顯微鏡(Olympus BX51)觀察螢光亮度，取入圖像。使用分析軟體對取入之圖像實施偏斜修正，實施二值化，計算螢光亮度。將對各自12視野之資料進行平均所得之圖表示於圖6。關於浸漬於ER之角質層片，螢光亮度與水中浸漬之角質層片(以濕度0%乾燥)程度相同，另一方面，關於浸漬於AQ之角質層片，螢光亮度比水中浸漬之角質層片(以濕度0%乾燥)顯著降低，其螢光亮度之值接近水中浸漬並以濕度90%緩慢乾燥之角質層片之值。藉由該實驗，得知3%Aqua-in-pool 1407水溶液具有角質層改善效果，揭示出藉由本實驗體系可篩選候補化粧料。
將使用角質層剝離膠帶自前臂屈側部獲取之角質層片固定於載玻片上，將所固定之各角質層片浸漬於作為對照之水、以及作為候補化粧料之使Aqua-in-pool 1407(AQ)之濃度成為0%、0.1%、1%、3%及10%之濃度之水溶液中1小時。其後，將浸漬於水之角質層片於濕度90%、室溫下乾燥2小時。將浸漬於AQ之角質層片於裝有矽膠之密閉容器內(濕度0%)乾燥2小時。利用0.2w/v%螢光素鈉溶液(和光純藥工業股份有限公司)將該等角質層片浸漬5分鐘，水洗後，利用螢光顯微鏡(Olympus BX51)觀察螢光亮度，取入圖像。使用分析軟體對取入之圖像實施偏斜修正，實施二值化，計算螢光亮度。對各自12視野之資
料進行平均，將浸漬於水並以濕度10%乾燥之角質層片之螢光亮度設為100，示於圖7。揭示出Aqua-in-pool 1407可濃度相關性地降低螢光亮度，於3%及10%時，相對於0%(即利用水浸潤，以濕度0%乾燥)顯著降低。就濃度相關性地降低螢光亮度而言，揭示出如下方面：Aqua-in-pool 1407確實具有角質層改善效果，可用作具有角質層改善效果之化粧料。
Claims (9)
- 一種角質層狀態之評價方法，其包括：使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料之水溶液接觸角質層片之步驟；清洗上述染料之步驟；及測定角質層片中之上述染料之染色強度之步驟。
- 如請求項1之評價方法，其中上述角質層狀態之評價係對角質層透明度、角質層細胞間脂質之結構及角質層之水分含量綜合進行評價。
- 如請求項1或2之評價方法，其中上述評價係基於與來自標本之染色強度之比較、或與比色表之比較而進行。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中上述角質層片係藉由膠帶條製備者。
- 一種關於角質層改善效果之美容處理之評價方法，其包括：使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料與對皮膚進行美容處理後藉由膠帶條獲取之角質層片接觸之步驟；清洗上述染料之步驟；及測定上述角質層片中之上述染料之染色強度之步驟。
- 如請求項5之評價方法，其中上述評價係基於對美容處理前之藉由膠帶條獲取之角質層片利用染料進行染色，並針對於美容處理前後之角質層片比較染色強度。
- 如請求項5或6之方法，其中上述美容處理為化粧料之塗抹。
- 一種關於角質層改善效果之候補化粧料之評價方法，其包括：對角質層片應用候補化粧料之步驟； 對角質層片進行乾燥之步驟；使選自由螢光素、孟加拉玫瑰紅及該等之鹽所組成之群中之染料之水溶液接觸角質層片之步驟；清洗上述染料之步驟；及測定角質層片中之上述染料之染色強度之步驟。
- 如請求項8之方法，其中上述角質層片為培養角質層片。
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