WO2005084694A1 - インフルエンザウイルス感染抑制剤 - Google Patents

インフルエンザウイルス感染抑制剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2005084694A1
WO2005084694A1 PCT/JP2004/003031 JP2004003031W WO2005084694A1 WO 2005084694 A1 WO2005084694 A1 WO 2005084694A1 JP 2004003031 W JP2004003031 W JP 2004003031W WO 2005084694 A1 WO2005084694 A1 WO 2005084694A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
peptide
influenza virus
binding
phage
influenza
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/003031
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshinori Sato
Original Assignee
Glycomedics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Glycomedics, Inc. filed Critical Glycomedics, Inc.
Priority to PCT/JP2004/003031 priority Critical patent/WO2005084694A1/ja
Priority to JP2006510604A priority patent/JPWO2005084694A1/ja
Priority to US10/592,253 priority patent/US20090098195A1/en
Priority to CA002559067A priority patent/CA2559067A1/en
Priority to EP04718765A priority patent/EP1728515A4/en
Priority to CNA2004800427656A priority patent/CN1938041A/zh
Publication of WO2005084694A1 publication Critical patent/WO2005084694A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to an influenza virus infection inhibitor comprising a sialylgalactose group-binding peptide, for example, a gandaliside GM3-binding peptide as an active ingredient.
  • Oligosaccharides of glycoconjugates such as glycolipids, glycoproteins and proteodalicans on the cell surface are target molecules for the recognition of extracellular molecules and are involved in cell-specific binding processes (1). ), (2)).
  • the sialylgalactose (NeuAc-Gal) structure is well known as a receptor for bacterial toxins, viruses, endothelial cells and the like (References (3)-(5)).
  • Daricosphingolipids with sialic acid, so-called gandariosides have been implicated in important biological functions, which depend on their carbohydrate moieties (6)-(8).
  • glycosphingolipids were extracted from cells as detergent-insoluble membranes together with signaling molecules (13)-(15). Glycolipid-rich subfractions have been found to be modified by cell stimulation and signaling.
  • the glycolipid-containing membrane was reconstituted as an air-water interface monolayer (Refs. (16)-(18)). Sato et al. Reported that the mode of lectin binding depends on the distribution of glycosphingolipids in lipid monolayers (References (19)-(22)).
  • glycolipid-rich microdomains in cell membranes will help define the biological role of sugar chains on the cell surface.
  • a biological selection system (phage display library) was developed to select peptides that specifically bind to target molecules (Refs. (25), (26)).
  • Various sugar conjugates, monosaccharides (References (27), (28)), tumor-associated saccharide antigens (References (29)-(32)), Cyaryl Lewis x (References (33), (34)), Glycosui It was performed on Ngoi lipids (Refs. (35), (36)), proteodalican (Refs. (37)-(39)), and polysaccharides (Refs. (40), (41)).
  • the present inventors selected a gandarioside GMl (Gal j3 l ⁇ 3GalNAc ⁇ 1 ⁇ 4 (NeuAc 2 ⁇ 3) Gal ⁇ l ⁇ 4Glc / 3 1 ⁇ 1 ′ Cer) binding peptide. (Ref. (35)). It was shown that the selected peptide sequence specifically bound to GM1 and inhibited the binding of cholera toxin to GM1.
  • Influenza virus membranes contain two types of glycoproteins, hemagglutinin (HA) and sialidase (neuraminidase), which are important for the establishment of virus infection and budding of virus from host cells, respectively. Plays a role. Hemagglutinin recognizes a sialic acid-containing sugar chain present on the cell membrane of an animal host as a receptor, specifically binds, and leads to endocytosis of influenza virus into cells.
  • Sialidase is a receptor-destroying enzyme that cleaves sialic acid residues from itself or on host cell membranes when virus particles germinate or release from host cells.
  • sialidase inhibitors are thought to inhibit the influenza virus from growing outside the cell and then releasing it out of the cell. Yes. Therefore, sialidase inhibitors had no effect as prophylactics, and had to be administered 1 to 2 days after infection with the influenza virus, and their application was limited.
  • influenza virus binds to hemagglutinin and a sialic acid-containing sugar chain present in a host cell during infection with the influenza virus
  • the present inventor has previously described HA (hemagglutinin) binding using the phage display library method described above. And reported that the peptide inhibits influenza infection by preventing influenza virus from invading cells (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-284798, W00 / 59932). It has been shown that peptides can be used to prevent infection with influenza virus. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to an agent for suppressing infection with influenza virgils, which comprises, as an active ingredient, a sialylgalactose group-binding peptide that binds to a sialylgalactose group (a group having a sialic acid-galactose structure).
  • influenza virus is infected by the hemagglutinin of the viral membrane that recognizes and binds to sialic acid-containing sugar chains of the host cell.
  • An object of the present invention is to block a receptor for hemagglutinin present in a host cell and to suppress influenza virus infection. Specifically, the purpose is to inhibit influenza virus infection by blocking the binding of influenza virus to host cells using a peptide that binds to sialylgalactose groups present on the cell surface. I do.
  • hemagglutinin-binding peptides that bind to influenza virus hemagglutinin can suppress influenza virus infection.
  • the peptide binds to the hemagglutinin present on the membrane of the influenza virus, and thereby binds to the influenza virus. Inhibits virus binding to host cells.
  • Hemagglutinin-binding peptides can act against influenza virus to prevent infection, but are premised on the presence of influenza virus. Therefore, when it is actually used in clinical practice, it is considered effective to confirm the influenza virus infection as well as the sialidase inhibitor before administration, and it is more effective as a therapeutic drug than as a preventive drug. The effect is expected.
  • the present inventors believe that a compound that acts on a living body can be administered regardless of influenza infection and exerts a great preventive effect.Thus, the present inventors have conducted intensive studies on a method for suppressing infection with influenza virus. It was thought that by blocking the receptor of host cells to which hemagglutinin present in the membrane of influenza virus binds, infection with influenza virus can be suppressed.
  • the present inventors focused on the structure of sialyl galactose, which is a receptor on the surface of influenza virus host cells, and found that gandariosides GM3 (NeAc2 ⁇ 3Gal ⁇ l ⁇ 4GlcjS We examined the effect of a peptide with more than 10 amino acid residues that binds to 1 ⁇ ⁇ Cer).
  • the present inventors obtained a peptide that binds to gandarioside GM3 by using a mouse B16 melanoma cell that highly expresses gandarioside GM3 on the cell surface by a phage display method using a random peptide library.
  • the present inventors have obtained the gandarioside GM3 linkage.
  • the present inventors have conducted intensive studies on PT / JP2004 / 003031 sex peptides, and have surprisingly found that the peptides alone prevent influenza from binding to receptors on the cell surface and preventing influenza from entering the cells. It was completed.
  • the present invention is as follows.
  • influenza virus infection inhibitor which comprises the following sialylgalactose group-binding peptide (a) or (b) as an active ingredient:
  • [4] The influenza virus infection inhibitor according to any one of [1] to [3], wherein the sialylgalactose group-binding peptide is alkylated or lipidated,
  • influenza virus infection according to any one of [1] to [3], wherein the peptide having a sialylgalactose group-binding peptide is contained in the ribosome; [6] the influenza virus is influenza A, influenza B and C [1] any of the agents for controlling influenza virus infection according to any of [1],
  • influenza virus is avian influenza or swine influenza; [1] the influenza virus infection inhibitor according to any of [5];
  • influenza virus infection inhibitor according to any of [1] to [7], further comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • [10] a method of preventing or treating influenza according to [9], wherein the non-human animal is a bird or a pig;
  • [11] A method for preventing or treating influenza, comprising preparing the inhibitor of influenza virus according to any one of [8] and administering the inhibitor to a subject.
  • [1 2] The method of preventing or treating influenza according to [1 1], wherein the subject is selected from the group consisting of human, bird and bush,
  • a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and which has ganglioside GM3 binding activity;
  • FIG. 1 is a diagram showing the time course of phage binding to a gandarioside GM3 monolayer immobilized on a quartz crystal microbalance.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of an examination of the binding selectivity of a phage clone to the NeuAc-Gal structure.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of examination of binding of a phage clone to mouse B16 melanoma cells by flow cytometry.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of examination of recognition of sialyl oligosaccharides by cOl phage.
  • Figure 5 shows the amount of synthetic peptide bound to GM3 as a function of peptide concentration.
  • FIG. 6 shows inhibition of influenza virus infection of MDCK cells by peptide-containing ribosomes.
  • FIG. 7 is a diagram showing inhibition of infection of influenza virus into MDCK cells by ganglioside GM3-binding peptide-containing ribosome and hemagglutinin-binding peptide-containing ribosome.
  • the present invention is an infection-suppressing agent containing a sialylgalactose group, for example, a ganglioside GM3-binding peptide as an active ingredient, which can be used for prevention and treatment of influenza virus infection.
  • a sialylgalactose group for example, a ganglioside GM3-binding peptide as an active ingredient, which can be used for prevention and treatment of influenza virus infection.
  • a sialylgalactose group having a structure in which sialic acid and galactose are bound serves as a receptor for hemagglutinin when the influenza virus enters the cell. By preventing binding to the cell via the cell group, influenza can be prevented from infecting the cell.
  • the compound having a sialylgalactose group includes, for example, ganglioside GM3, and the sialylgalactose group-binding peptide of the present invention includes a gandarioside GM3-binding peptide.
  • the peptide of the present invention is not limited as long as it binds to the sialylgalactose group.Therefore, if the sialylgalactose group is expressed on the surface of the cell, even if the ganglioside GM3 is not expressed on the surface. Infection of the cells with the influenza virus can be suppressed.
  • the influenza virus which suppresses infection with the infection suppressant of the present invention is a globular RNA virus having a diameter of about 100 nm belonging to the family Orsomicsviridae, and its type is not limited. Since the influenza virus inhibitor of the present invention blocks the receptor recognized by influenza in cells, it can suppress infection regardless of the type of influenza virus.
  • Influe PT / JP2004 / 003031 A type of virus (H2N2, H3N2, H1N1, etc.), B type, C type, human isolated type, avian isolated type (avian influenza virus (H5N1, H7N2, H7N7, etc.)) It can widely suppress infection with influenza viruses such as swine isolates (Buyu influenza virus) and other mammalian isolates such as horses. Depending on the flu types of hemagglutinin and sialidase (neuraminidase), many subtypes exist depending on the influenza virus, but the influenza virus infection inhibitor of the present invention can be used in any type or subtype. However, infection with the influenza virus can be suppressed.
  • influenza virus inhibitor of the present invention can be used for any animal that can be infected with an influenza virus, and can suppress infection of humans, birds, busines, etc. with the influenza virus. Can be.
  • the sialylgalactose group-binding peptide of the present invention can be selected by a phage display library method using a known phage display library as follows.
  • the phage display library method can be performed by, for example, the method of Scott and Smith (Scott, JM and Smith, GP, Science, 249. 386-390 (1990); Smith, GP and Scott, JK, Method s in Enzymology, 217, 228-257 (1993)). Further, it can be carried out according to the description in JP-A-2000-253900 and JP-A-2002-284798.
  • a commercially available phage display library can be used.
  • a phage is constructed by inserting a random DNA sequence into a known phage display library so that a peptide having a random amino acid sequence can be expressed on the outer surface of the phage.
  • a peptide having random 15 amino acids on the surface of the phage shell, in which random DNA has been inserted into the phage coat protein piII gene is expressed.
  • display phage constructed as 2004/003031 Yes By using the display phage, the phage can be obtained that expressed the about 108 kinds of peptidase flop tides respectively.
  • the phage that randomly expresses the peptide is panned using gandarioside GM3.
  • a monolayer of gandarioside GM3 may be prepared on a suitable substrate (Gandarioside GM3 monolayer cumulative substrate), and phages that bind to the monolayer may be selected.
  • the selected phages are infected with Escherichia coli and cultured in large quantities, separated and purified to obtain peptide-expressing phages that bind to gandariosides GM3.
  • a phage capable of expressing a peptide capable of specifically binding to gandarioside GM3 can be selected and concentrated.
  • a peptide that specifically binds to the sialylgalactose group expressed by the phage can be obtained.
  • the DNA sequence may be determined by the known Maxam-Gilbert method or the like, and a commercially available sequencer may be used.
  • a monomolecular film when used, only a sugar chain protrudes from the surface, so that a peptide having a sialylgalactose group-binding property can be efficiently selected.
  • a crystal oscillator known as microbalance can be used.
  • a change in weight of the surface of the quartz oscillator gold electrode caused by the binding of the phage can be detected as a change in frequency.
  • a method using a crystal oscillator is described, for example, in Bioch im. Biophys.
  • a sialylgalactose group-binding peptide is a gandarioside GM3-binding peptide consisting of 15 amino acids shown in SEQ ID NOS: 1 and 2.
  • the present invention also relates to a peptide comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and which can bind to gandaliside GM3. It can be used as an active ingredient of the influenza virus inhibitor of the present invention.
  • the “one or several” is preferably one or ten, more preferably one or five, one or four, one or three, one or two or one.
  • Peptides that bind to ganglioside GM3 can also be used as an active ingredient of the influenza virus inhibitor of the present invention.
  • the stringent condition means, for example, that after performing hybridization at 68 ° C in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA is immobilized, 0.1 A condition that can be identified by washing at 68 ° C using a ⁇ 2x concentration SSC solution (1x concentration SSC is composed of 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate).
  • a peptide comprising an amino acid sequence encoded by a degenerate mutant of DNA encoding the peptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, which binds to gandarioside GM3. It can be used as an active ingredient of the influenza virus inhibitor of the present invention.
  • Whether or not the peptide binds to gandarioside GM3 can be determined by using, for example, the above-described quartz resonator to which the ganglioside monomolecular film is attached.
  • the above-mentioned peptide can be synthesized by a known liquid phase method and solid phase method peptide synthesis method. It can also be prepared using the selected phage and E. coli.
  • the peptide thus obtained is a known peptide Can be purified by using the purification method described above.
  • a peptide obtained by modifying the ganglioside GM3-binding peptide can also be used.
  • the peptide modification increases hydrophilicity, increases blood half-life, and can increase cell affinity and tissue affinity. Therefore, the effect as an inhibitor of influenza infection can be expected.
  • by modifying the peptide into a polymer by modification the binding of influenza virus to gandarioside GM3 is sterically hindered, and the effect as an inhibitor can be expected.
  • Examples of the peptide modification include binding of a water-soluble polymer such as alkylation, lipidation, and PEGylation.
  • the binding of the alkyl group can be carried out by a known method.
  • an alkylamine may be bound to the C-terminal carboxyl group of the gandarioside GM3-binding peptide, or a fatty acid may be bound to the N-terminal amino group.
  • the binding of the alkylamine to the terminal lipoxyl group or the binding of the fatty acid to the terminal amino group can be carried out by an amide bond forming reaction.
  • the alkyl group to be bonded is not limited, but includes an alkyl group having 2 to 20 carbon atoms, for example, an alkyl group having 18 carbon atoms.
  • the fatty acid used for binding the fatty acid is not limited, but a fatty acid existing in the living body can be suitably used, and specifically, a saturated fatty acid such as lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, and araquinic acid.
  • Lipidation of the ganglioside GM3-binding peptide can also be performed by a known method. For example, New Current, 11 (3), 15-20 (2000); Biochemica et Biophysica Acta., 1128, 44-49 (1992); FEBSLetters, 413, 177-180 (1997); J. Biol. Chem., 257. , 286-288 (1982).
  • a ganglioside GM3-binding peptide can be bound via the 2-position hydroxyl group or the 3-position phosphate group of various phospholipids. This At the time of 4 003031, they may be linked via an appropriate spacer.
  • Various condensation methods can be employed for the reaction.
  • an amino acid sequence containing about several cysteines of an appropriate length is bound to the N-terminal or C-terminal of the ganglioside GM3-binding peptide, and a reactive SH group is used.
  • the phospholipid used is not limited, and examples thereof include phosphatidic acid, phosphatidylcholine (lecithin), phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, and the like.
  • a lipidated peptide is called a lipopeptide.
  • water-soluble polymer examples include polyethylene glycol, monomethoxypolyethylene dalicol, dextran, poly (N-vinylpyrrolidone) polyethylene glycol, and propylene glycol homopolymer. Propylene oxide / ethylene oxide copolymer, polyvinyl alcohol and the like. These polymers can be covalently linked to the N-terminal ⁇ -amino group of the protein and the ⁇ -amino group of lysine via a reactive group such as an aldehyde. Among them, PEG is preferable, and the molecular weight of PEG is preferably 6 kDa to 50 kDa.
  • dendrimerization is one of the methods for polymerizing the gandarioside GM3-binding peptide.
  • a ribosome preparation containing a ganglioside GM3-binding peptide can also be used as the inhibitor of influenza infection of the present invention.
  • “Liposome” means a membrane-like closed vesicle composed of a lipid layer and a water layer in the membrane.
  • the ribosome preparation of the present invention can be prepared by adding a ganglioside GM3-binding peptide to the ribosome.
  • Ribosomes include liposomes containing acidic phospholipids as membrane components or liposomes containing neutral phospholipids and acidic phospholipids as membrane components.
  • acidic phospholipids as membrane constituents include dilauroyl phos P2004 / 003031 Fatidylglycerol (DLPG), dimyris doylphosphatidylglycerol (DMPG), dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), distearoylphosphatidylglycerol (DSPG), dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), yolk phosphatidyl Natural or synthetic phosphatidyl glycerols (PG) such as glycerol (egg yolk PG), hydrogenated yolk phosphatidyl glycerol, and dilauryl phosphatidylinositol (DLPI); dimyristyl phosphatidylinositol (DMPI); (DPP 1), distearoyl phosphatidylinositol (DSPI), dioleoyl phosphatidylinosito
  • the neutral phospholipids include soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine, hydrogenated soybean phosphatidylcholine, hydrogenated egg yolk phosphatidylcholine, dimyristoytylphosphatidylcholine (DMP C), dipalmitylphosphatidylcholine (DPPC), Dilauroyl phosphatidyl choline (DLPC), distearoyl phosphatidyl choline (DSPC), myristyl palmitoyl phosphatidyl choline (MPPC), palmitoyl stearoyl phosphatidyl choline (PSPC), dioleoyl phosphatidyl choline (DOPC), etc.
  • DMP C dimyristoytylphosphatidylcholine
  • DPPC dipalmitylphosphatidylcholine
  • DLPC Dilauroyl phosphatidyl choline
  • DSPC distea
  • Natural or synthetic phosphatidylcholines PC
  • soy phosphatidylethanolamine egg yolk phosphatidylethanolamine, hydrogenated soybean phosphatidylethanolamine, hydrogenated yolk phosphatidylethanolamine , Jimi squirrel toyl phosphatidylethanolamine ⁇ Min (DMP E), Jiparumi toyl phosphatidylethanolamine no Ruamin (DPPE), dilauroyl phosphatidylethanolamine ⁇ Min (DLPE), distearoylphosphatidylethanolamine ⁇ Min (DSPE), Natural or synthetic phosphatidylethanolamines (PE) such as myristoyl palmitoylphosphatidylethanolamine (MPPE), palmitoylstearoylphosphatidylethanolamine (PSPE), and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE); No. These constituents may be used alone or in a combination of two or more.
  • MPPE myristoyl palmitoylphosphati
  • Ribosomes containing the ganglioside GM3-binding peptide can be prepared according to a known method using the above phospholipids.
  • the ratio of the acidic phospholipid is about 0.1 to 100 mol%, preferably about 1 to 90 mol%, more preferably about 10 to 50 mol% in the ribosome membrane component. It is better to do.
  • cholesterol and the like may be further added.
  • cholesterol By adding cholesterol, the fluidity of the phospholipids can be adjusted to make the preparation of ribosomes easier.
  • Cholesterol is usually added and blended in an amount equivalent to the phospholipid, preferably in an amount of 0.5 to 1 equivalent.
  • the mixing ratio of the ganglioside GM3-binding peptide and the acidic phospholipid in the liposomal dispersion is about 0.5 to 100 equivalents, preferably about 1 to 60 equivalents of the acidic phospholipid to the peptide. And more preferably about 1.5 to 20 equivalents.
  • the proportion of the ganglioside GM3-binding peptide contained in the ribosome is about several mol% to several tens mol%, preferably about 5 to 30 mol%, and more preferably about 5 to 10 mol% of the total lipid. It is.
  • the ribosome preparation of the present invention containing the ganglioside GM3-binding peptide can be produced by a known method.
  • a multilayer ribosome is prepared as follows. First, after dissolving the lipid in an organic solvent (such as black form and ether), put it in a round-bottom flask, remove the organic solvent under a nitrogen stream or under reduced pressure, and remove Create a thin film of lipid on the bottom. In this case, it is possible to completely remove the organic solvent by leaving the mixture under desiccation overnight. Next, an emulsion-colored ribosome suspension is obtained by adding a drug solution onto a lipid thin film to hydrate the lipid.
  • an organic solvent such as black form and ether
  • L UV Large single-walled ribosomes
  • Ca "to small single-walled ribosomes of phosphatidylserine fusing them into a cylindrical sheet, and adding EDTA, a chelating agent.
  • Method for removing Ca 2+ (Biochim. Biophys. Acta 394, 483-491, 1975) Injecting lipid dissolved in a polyester into an aqueous solution at about 60 ° C and evaporating ether (Biochim. Biophys. Biophys. Acta 443, 629-634, 1976).
  • a method for preparing ribosomes by the reverse phase method devised by Szoka et al. can be used.
  • a WZO emulsion is prepared by adding a drug solution to a phospholipid ether solution and subjecting the solution to ultrasonic treatment. After removing the ether from the WZO emulsion under reduced pressure using an evaporator, then adding a buffer solution and stirring with a Portex mixer, the WZO emulsion was converted into an ozw emulsion, and the remaining organic solvent was further removed. By removing it, ribosomes can be created.
  • liposomes with a small particle size can be prepared by the French press method (FEBS lett. 99. 210-214, 1979).
  • the freeze-drying method (Chem. Pharm. Bull. 31, 2442-2445, 1984) and the freeze-thaw method (Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-) with high retention efficiency to liposomes reported by Osawa et al. 2923, 1985) can also be used.
  • the ribosomes prepared in this manner can be used for the dialysis method U. Pharm. Sci. II, 806-812, 1982) or the filtration method using a polycarbonate membrane (Biochim. Biophys. Acta 557, 9-23, 1979; Biochim. Biophys. Acta L 559-571, 1980) can keep the particle size constant.
  • dialysis Method, gel filtration method, and centrifugation method can be used (ribosome. "Lipid Chemistry” [edited by Biochemical Society of Japan, Biochemistry Experiment Course 3], Tokyo Chemical Dojin, 1974). It is also possible to concentrate ribosomes using a dialysis membrane.
  • the ribosome dispersion prepared in this manner contains various additives such as preservatives, isotonic agents, buffers, stabilizers, solubilizers, absorption promoters, etc., which are required as additives in the formulation design. Can be appropriately compounded, and if necessary, can be diluted with a liquid or water containing these additives.
  • additives include preservatives that are effective against fungi and bacteria such as benzalkonium chloride, benzethonium chloride, black hexidine, parabens (methylparaben, ethylparaben, etc.), thimerosal, etc.
  • agent examples include polyhydric alcohols such as D-mannitol, D-sorbitol, D-xylitol, glycerin, glucose, maltose, sucrose, propylene glycol, and electrolytes such as sodium chloride, and a stabilizer such as tocopherol. Butylhydroxyanisole, butylhydroxytoluene, ethylenediaminetetraacetate (EDTA), cysteine, etc., respectively.
  • polyhydric alcohols such as D-mannitol, D-sorbitol, D-xylitol, glycerin, glucose, maltose, sucrose, propylene glycol, and electrolytes such as sodium chloride, and a stabilizer such as tocopherol.
  • Butylhydroxyanisole, butylhydroxytoluene, ethylenediaminetetraacetate (EDTA), cysteine, etc. respectively.
  • ribosome comprising the HA-binding peptide of the present invention
  • another drug such as an antiviral agent can be further encapsulated, and similarly, a ribosome preparation can be obtained.
  • liposome preparations are specifically described in, for example, Woodre et al. (Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M. Woodle, G. Storm, Eds: Springer-Verlag Berlin (1998))
  • Woodre et al. Long Circulating Liposomes: old drugs, New therapeutics., M. Woodle, G. Storm, Eds: Springer-Verlag Berlin (1998)
  • it can be prepared according to the method described in Liposomal applications to cancer therapy, Y. Naniba, N. Oku, J. Bioact. Compat. Polymers, 8, 158-177 (1993).
  • the above-described alkylated peptide-lipidated peptide can be used as a lipid component.
  • the amount of the GM3-binding peptide is not limited, and is appropriately selected depending on the subject to be administered. Usually, the amount is about 0.002 to 0.2 (w / V%) in the composition, preferably about 0 0.01 to 0.1 (wZv%).
  • the influenza virus infection inhibitor of the present invention can prevent influenza virus infection when administered to a subject not infected with influenza virus, and can be administered to a subject already infected with influenza virus. Inhibits influenza virus from infecting other cells, and can be used as a therapeutic agent for influenza virus.
  • the inhibitor of influenza infection of the present invention contains a ganglioside GM3-binding peptide as an active ingredient, and may further contain a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and excipient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier diluent and excipient.
  • purified water sterile water
  • a physiological buffer an isotonic solution, or the like
  • injectable organic esters such as glycol, glycerol and olive oil can also be used. Gelling agents, lactose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for tablets.
  • the inhibitor of influenza virus infection of the present invention can be administered in various forms as a pharmaceutical composition.
  • administration forms include oral administration by tablets, capsules, granules, powders, syrups and the like, or parenteral administration by injections, drops, suppositories and the like. It can also be administered as a spray.
  • a solution containing the influenza virus inhibitor of the present invention may be sprayed orally or nasally onto a subject, and can be efficiently administered to domestic animals such as birds and bush. It is.
  • Such a composition is produced by a known method and is usually used in the field of pharmaceuticals.
  • the administration route of the inhibitor of influenza virus infection of the present invention is not limited, and includes oral administration, intravenous injection, intramuscular injection, intradermal injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, spray, and the like.
  • influenza virus inhibitor of the present invention is avian, It can also be administered by mixing with water, feed, etc., which are consumed by livestock such as pigs.
  • the dose can be appropriately determined depending on the severity of the disease and the like, but a pharmaceutically effective amount of the composition of the present invention is administered to the patient.
  • administering a pharmaceutically effective amount refers to administering to a patient a drug at an appropriate level for treating various diseases.
  • the frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is appropriately selected according to the patient's condition.
  • the amount can be generally selected from the range of about 0.001 to 10 Omg per adult day, in terms of the amount of ganglioside GM3-binding peptide.
  • the formulation can be administered not only once a day but also several times. When administering to domestic animals such as birds and bush, the dose can be determined appropriately considering the weight and the like.
  • influenza virus infection inhibitor of the present invention may contain a compound capable of suppressing infection of another influenza virus as an active ingredient.
  • Other compounds include, for example, influenza virus and hemagglutinin-binding peptides described in JP-A-2002-284798, and specifically, for example, JP-A-2002-284798 and 00/59932 There are peptides described. Inclusion of gandarioside GM3-binding peptide and influenza virus-hemagglutinin-binding peptide in influenza virus inhibitors binds to the influenza virus's own cell-binding part and to the cell's influenza virus. Both parts are blocked, and greater influenza virus suppression can be expected.
  • influenza virus / hemadaltinin-binding peptide one having a part of amino acids mutated or modified as in the above-mentioned gandarioside GM3-binding peptide can be used. Further, it may be contained in the ribosome.
  • the influenza virus infection inhibitor of the present invention is a ribosome preparation
  • the ribosome may contain both a gandarioside GM3-binding peptide and an influenza virus / hemagglutinin-binding peptide.
  • Gandarioside GM3 (NeuAca 2 ⁇ 3Gal ⁇ l ⁇ 4Glc) 31 ⁇ ⁇ Cer) was obtained from Snow Brand Milk Products (Japan).
  • 6 ′ GM3 (NeuAc 2 ⁇ 6Gal j81 ⁇ 4G1C J31 ⁇ ⁇ Cer) which is a synthetic GM3 analog was prepared by the method described in the literature (42).
  • Lactosyl ceramide (LacCer), galactosyl ceramide (GalCer) and darcocerebuloside (GlcCer) were purchased from Sigma (St Louis, MO, USA).
  • Yolk phosphatidylcholine (egg PC) and cholesterol were obtained from N0F and nacalai tesQiie (Japan), respectively.
  • the phage display 15-mer random peptide library (10 8 diversity) was obtained as described in reference (43).
  • the 15-mer peptide amide (peptide-NH 2 ) and N-stearoyl (octadecanoyl) peptide amide (C 17 H 35 C0-peptide-NH 2 ) were obtained from Advanced Chemtech using standard Fmoc methods. Automated peptide synthesizer ACT357.
  • Peptideamide and N-stearoyl peptide amide were purified by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Next, purity and expected structure were confirmed by MALDI-TOF / MS.
  • Mouse B16 melanoma cells were obtained from RIKEN Cell Bank (Japan).
  • Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells and influenza A / Puerto Rico / 8/34 virus strain (H1N1) were provided by K. Nagata (Tsukuba University, Japan).
  • TBS Tris buffered salt solution
  • p-A Surface pressure
  • GM3 The monolayer is compressed at a constant rate (10 cm 2 min— and a crystal microbalance (QCM: 9 MHz, AT-cut, diameter 4.5 band, area 15.9 mm) at a surface pressure of 30 mN m- 1. It was transferred horizontally to the gold surface of the bandit 2 ) (Reference (21)) QCM was transferred to a handmade plastic tube filled with 1 ml of TBS, and the buffer temperature was maintained at 20 with stirring. Round 6.1-87 x 10 transduction units) were injected into the cuvette. Phage binding to the monolayer (AF, Hz) was followed over time to determine the incubation time.
  • QCM 9 MHz, AT-cut, diameter 4.5 band, area 15.9 mm
  • the phage clones were isolated, amplified, and precipitated with polyethylene daricol / NaCl (PEG # 6000) [26]
  • the DNA of each phage clone was purified using the QIAprep Spin in M13 kit (QIAGEN). It was used as a type I sequence for estimating amino acid alignment.
  • Polystyrene multiwell plates were pre-blocked with 1% BSA / TBS and washed three times.
  • a plastic plate (13.5 mm in diameter, Sumitomo BeiKit, Japan) was horizontally bonded to the Gandarioside GM3 or 6 'GM3 monolayer prepared as described above. Phage clones (0.01-10 nM in 2001 TBS) were incubated with the monolayer at 4 for 30 minutes. The other side of the plastic plate was blocked by adding 0.5% BSA / TBS, and then washed twice with 0.5% BSA / TBS.
  • Bound phages were incubated with l: 2000 (v / v) diluted anti-id pacteriophage (Sigma) at 4 h for 1 hour, followed by l: 2000 (v / v) diluted anti-peregis immunoglobulin G peroxidida Using one zekkondigate 4 Labeled for 1 hour. Color was developed with o-phenylenediamine and detected at 492 nm. Each experiment was performed three times. The increase in absorbance ( ⁇ A at 492 nm) shows a simple saturation curve against phage concentration, which has a linear relationship as a plot between [phage] / ⁇ and [phage] as in the following equation: showed that.
  • the maximum absorbance ( ⁇ Amax) and dissociation constant (K d ) were calculated from the slope and intercept of the equation, respectively. K d was in the range from 0.018 to 0.09 InM.
  • the AAmax of the control phage was also evaluated each time, and the relative binding affinity ( ⁇ Amax / ⁇ Aax, control) was evaluated (Table 1). The wild type of phage was used as control. '
  • Mouse B16 melanoma was obtained from Dulbecco's modified Eagle's medium (ICN Biomedicals) supplemented with 10% fetal serum (Life Technologies, Inc.), 100 units / ml of penicillin G, and 100 units / ml of streptomycin. ) 37 ° C in, were grown under conditions of 53 ⁇ 4C0 2> 95% air.
  • Glycolipids (GM3, 6'GM3, LacCer, GalCer, or GlcCer) monolayer are prepared on the rung Muir type aquarium, QCM (27MHz, AT- cut, diameter 2.5 thigh, the plane product 4.9 Yuzuru 2) It was taken horizontally above.
  • the 27-MHz QCM has higher sensitivity than 9-MHz (about 10 times) (Refs. (44)-(46)).
  • Peptide solutions of 0.1 mM, lmM and lOmM in TBS were added to the cell cuvette of the QCM instrument and the decrease in QCM frequency (AF, Hz) in response to peptide addition was followed over time. Each experiment was performed 2-6 times.
  • the peptide sequence that binds to the sugar chain of GM3 was selected by one method of a phage library bound to a lipid monolayer as described in reference (35).
  • a GM3 monolayer was prepared at the air-water interface and used for affinity selection.
  • GM3-specific phage increased during the four affinity selection process.
  • the relative yield of recovered phage increased from 0.2 to 15 ⁇ 10 6 through four rounds of biopanning (data not shown).
  • the binding affinity of the selected phage to the GM3 monolayer was confirmed by 9 MHz quartz crystal microbalance (QCM) (References (21)-(22)) o Tris-buffered saline ( ⁇ 50 ⁇ ).
  • QCM quartz crystal microbalance
  • the frequency decrease (mass increase) of QCM in response to the addition of phage (10 lfl TU / mL) in tris-HCK 150 mM NaCK pH 7.5 was followed over time (FIG. 1).
  • FIG. 1 shows the results of the fourth round of phage clones (black circles) for affinity selection using the phage library (open circles) or GM3 monolayer.
  • the GM3 monolayer was attached to a 9 MHz QCM gold surface, and the QCM was immersed in 1 ml of Tris-buffered saline at pH 7.5.
  • a phage solution containing 6 ⁇ 10 1 ⁇ conversion units was injected into the buffer and the frequency decrease in response to phage binding was plotted against time. From this result, it was found that the final phage concentration was 2 ⁇ .
  • the change in frequency indicated that the binding of the selected phage (26 Hz) was 6.5 times that of the original library (4 Hz).
  • cOl sequence selected in this study was the same sequence as one of the GM1 binding peptides (GM1 / peptide 2). This is due to the limitations of the diversity of the library, since the same phage library was used. These results suggest that the cOl sequence has a broad affinity for sialic acid-containing glycolipids.
  • the ratio of C ⁇ Amax / ⁇ Amax, control D-binding of the phage clone to GM3 was evaluated by ELISA.
  • the N-terminal sequence of the control phage clone (wild type) is AETVESCLAKPHTEN.
  • the binding affinity of the isolated phage clone to GM3 was assessed by ELISA.
  • a GM3 monolayer was prepared at the air-water interface and transferred to a plastic plate. The plastic plate was transferred to a 24-well multiplate and incubated with the phage clone for 30 minutes.
  • a saturation curve was obtained by plotting the color development by the enzyme versus the phage concentration, and the maximum absorbance (AAmax) was calculated from Equation I above.
  • C01> c03> cl5> c30> c07> c21 cll.
  • the relative binding affinity, ie, ( ⁇ of selected phage) Z was between 1.1 and 2.1 (Table 1). The most frequently occurring (15/27) phage clone cOl showed the highest affinity for GM3.
  • the binding affinity of the two phage clones cOl and c03 was further examined by ELISA.
  • the binding affinity of these clones was determined using GM3 containing NeuAc 2 ⁇ 3Gal linkage and synthetic 6 ′ GM3 containing NeuAc 2 ⁇ 6Gal linkage.
  • the cOl clone bound to both GM3 and 6 'GM3 at a magnification of 2.1 and 1.6, respectively, as compared to the control clone ( Figure 2).
  • the isolated cOl and c03 phage clones were serially diluted. (0.05-10nM), interacting with GM3 (NeuAc 2 ⁇ 3Gal ⁇ 1 ⁇ 4Glc ⁇ l ⁇ V Cer) or 6 ′ GM3 (NeuAc 2 ⁇ 6Gal j3 l ⁇ 4Glc ⁇ 1 ⁇ ⁇ Cer) monolayer
  • GM3 Neurogenase 2 ⁇ 3Gal ⁇ 1 ⁇ 4Glc ⁇ l ⁇ V Cer
  • 6 ′ GM3 NeuroAc 2 ⁇ 6Gal j3 l l ⁇ 4Glc ⁇ 1 ⁇ ⁇ Cer
  • the amount of bound phage clones was assessed by ELISA.
  • the relative binding affinity ( ⁇ Amax / ⁇ Amax control ) indicates the maximum absorbance of the phage clone ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Amax) It was obtained by dividing by the maximum absorbance.
  • the cOl phage clone was shown to bind to any NeuAc-Gal bond.
  • the c03 clone specifically bound to GM3 at a magnification of 1.8 compared to the control clone.
  • the c03 phage clone showed a different binding affinity between spliced 2 ⁇ 3 and spliced 2 ⁇ 6 sialic acid to galactose.
  • the binding affinity of the phage clones selected for animal cells was examined.
  • the B16 cell line mainly expresses GM3, and hardly expresses other gandariosides (13), (15), (49) _ (51).
  • Cells were incubated with phage clones and binding clones and labeled with fluorescein-conjugated antibodies. The fluorescence of the cells was measured using a flow cytometer, and the observed fluorescence intensity was plotted as a function of phage concentration ( Figure 3).
  • B16 cells were incubated with cOl phadic clone (closed circle), c03 phage clone (open circle) or control phage clone (wild type, closed triangle) in BSA / PBS for 1 hour at 0 ° C. Bound phage clones were labeled with an anti-phage primary antibody and a FITC-conjugated secondary antibody. The amount of phage clone bound to the cells was determined by flow cytometry overnight.
  • cOl phage clones are transferred to B16 cells at phage concentrations ranging from 1 to 10 ⁇ . Joined. However, no significant binding was observed for c03 and control phage clones.
  • FIG. 4A shows the inhibition of binding between the cOl phage clone and B16 cells by monosaccharides.
  • B16 cells (2 ⁇ 10 5 cells) were incubated with phage clones ( ⁇ ) in the absence (-) or presence of NeuAc, Glc or GlcU (lmM).
  • GlcU glucuronic acid
  • a slight inhibition was observed. Since GlcU is an acidic sugar, like NeuAc, it is likely that carboxylic acids were partially involved in the interaction between phage and sugar chains. On the other hand, depending on the amount of glucose added, the inhibition was unbearable.
  • Neuraminidase (sialidase) from the Arthrobacter ureaf aciens et al. Preferentiallyzes the terminal ⁇ 2 ⁇ 3 and ⁇ 2 ⁇ 6 linked sialic acids of glycoconjugates (relative activity is ⁇ 2 ⁇ 6> ⁇ 2 ⁇ 3> ⁇ 2 ⁇ 8) (Reference (52)).
  • FIG. 4B shows the effect of neuraminidase treatment on phage binding of B16 cells.
  • B16 cells (2 ⁇ 10 5 cells) were incubated with 0.05 units of neuraminidase (pH 6.5) at 37 ° (:, 90 minutes, in 1% BSA / PBS, and further incubated with phage clones.
  • Asterisk means p ⁇ 0.05.
  • H-GWWYKGRARPVSAVA-NH 2 ( cOl peptide, SEQ ID NO: 1) of the 15-mer peptidyl Puchido preliminary H- RAVWRHSVATPSHSV- negation 2 ( The c03 peptide, SEQ ID NO: 2) was synthesized. Attachment of these peptides to glycolipids was analyzed by the 27-MHz QCM method (27-MHz QCM is about 10 times more sensitive than 9-MHz) (Refs. (44)-(46)). Monolayers of glycolipids (GM3, 6'GM3, LacCer, GalCer or GlcCer) were prepared at the air-water interface and transferred to a QCM gold surface.
  • the phage library selection method is used to determine the glycolipid binding peptide sequence in combination with a lipid monolayer at the air-water interface. (Reference (35)).
  • glycolipid molecules are highly oriented at a surface pressure of 30 mN m- 1 (0.4 nm 2 mol ecu le, so that only sugar chains are exposed to the aqueous phase.
  • GM3 was used as a target molecule for affinity selection because GM3 has a sialylgalactose residue, which is the major oligosaccharide present on the cell surface.
  • the GM3-binding phage pool was enriched by four rounds of affinity selection, which was detected by quartz crystal microbalance in each round (data not shown) and ultimately 6. A 5-fold increase in mass was detected (Figure 1) The QCM frequency decrease (26 Hz) observed in the fourth round was thought to correspond to the saturation binding of phage on the QCM electrode.
  • the amide group of the peptide further acts as a hydrogen bond donor
  • the carbonyl group or carboxylic acid group of the peptide and NeuAc act as a hydrogen bond
  • the B-face of the galactopyranose ring and the methyl group of NeuAc correspond to Trp and Phe.
  • the consensus motif of the GM3-binding peptide was composed of sugar-binding amino acids. Therefore, these peptides ⁇ defend the NeuAc-Gal moiety by hydrogen bonding and Vander-Pellus interaction.
  • the sialylgalactose (NeuAc-Gal) structure is the terminal sugar sequence in glycoproteins and glycolipids.
  • B16 cells were used to determine affinity with GM3 on the cell surface of selected phages, since mouse B16 melanoma cells primarily express GM3 and few other gandariosides. (References (13), (15), (49)-(50)). When B16 cells were incubated with the selected phage clones, only the cOl phage clone bound to the cells ( Figure 3). Detachment of sialic acid from the cells and addition of free N-acetyl neuraminic acid resulted in inhibition of phage binding to cells.
  • influenza virus infection was determined by plaque assay on MDCK cells.
  • the MDCK cells in the 6-well plate Alternatively, the influenza A / PR / 8/34 virus solution containing peptide-containing ribosomes (100-200 pfu, pfu is a plaque-forming unit) was 0.2 mL and incubated. After 5% 37 ° C, 30 min fin incubation under C0 2, the supernatant was removed, cells were washed with PBS. 0.6% Agarosu (0.01% 0-Jefferies chill aminoethyl cellulose de kiss Trang, 0.
  • Inhibition of influenza virus infection of MDCK cells by peptide-containing liposomes was determined by plaque assay. Peptides were acylated at the N-terminus using a steer group and incorporated into PC / cholesterol ribosomes (peptide-containing liposomes). Since both the synthetic cOl and c03 peptide had affinity for the NeuAc 2 ⁇ 3Gal and NeuAc 2 ⁇ 6Gal structures, the peptide-containing ribosomes could bind to sialyligosaccharides on MDCK cells. In the presence of the peptide-containing liposome, infection of the MDCK cells with the influenza A / PR / 8/34 virus (H1N1) was inhibited (FIG. 6).
  • MDCK cells were incubated with influenza A / PR / 8/34 virus for 30 minutes in the presence of ribosomes containing cOl peptide (closed circles), ribosomes containing c03 peptide (open circles) or ribosomes alone (closed triangles). Cells were washed and incubated for 2 days. The live cells were then stained and the number of blacks counted. IC 5Q values of peptides containing ribosomes cOl and c03 were respectively 0.36 and 0.37 mM (Table 3). The control peptide sequence showed no inhibition. The cO 1 and c03 phage clones did not have an affinity for influenza virus (data not shown).
  • pill peptide liposome 20 10: 3 C 17 H 3 sCO-AETVESCI, AKPHTEN- NH 2 > 10
  • Ribosome 20 10: 0-> 10
  • Similar experiments also included the gandarioside GM3-binding peptides cOl ⁇ peptide and c03 ⁇ peptide and influenza hemagglutinin binding peptide A-1 (ARLSPTMVHPNGAQP (SEQ ID NO: 8)). This was performed using a liposome.
  • Figure 7 shows the results. In FIG. 7, the horizontal axis shows the concentration (mM) of eggPC in the ribosome, and the vertical axis shows the infection inhibition rate (%). The infection inhibition rate was expressed as a reduction ratio of the number of plaques when the peptide-containing ribosome was added to the number of plaques when the peptide-free ribosome was added.
  • peptide-containing ribosomes inhibited influenza virus (H1N1 type) infection of MDCK cells (FIG. 6).
  • the hemagglutinin serotype HI of influenza type A virus A / PR / 8/34 (HIN 1) is specific for NeuAc a ⁇ 3Gal binding.
  • MDCK cells have both ⁇ 2 ⁇ 3 and ⁇ 2 ⁇ 6 linked sialic acids on the cell surface (Reference (59)).
  • Peptide ribosomes bound to the sialylgalactose portion of MDCK cells and inhibited the binding of influenza virus to the sialylgalactose receptor on MDCK cells. Recently, Takikawa et al.
  • a 15mer peptide sequence recognizing the sialylgalactose moiety was obtained by one phage library selection.
  • the resulting peptide had affinity not only for the sugar chains of the glycolipid monolayer, but also for the glycoprotein on the cell surface. Binding of the peptide to the cell surface significantly inhibited influenza virus infection.
  • the peptides selected in the present invention can be used as inhibitors of influenza virus. The following is a list of documents referred to in the present invention. When the following documents are referred to in this specification, the document numbers are indicated.
  • an influenza virus that inhibits binding of an influenza virus to a host cell by blocking a receptor of the host cell.
  • An agent for suppressing lus infection is provided.
  • the inhibitor of influenza virus infection of the present invention is effective because it blocks the receptor of host cells and can suppress subsequent influenza virus infection even if administered to a subject before influenza virus infection. It can be used as an effective infection preventive agent.
  • influenza virus infection inhibitor of the present invention blocks the receptor recognized by influenza virus in cells, so that it can suppress infection regardless of the type of influenza virus, and can suppress influenza virus. It can be used not only for influenza virus isolated from type B humans, but also for infection control of influenza viruses isolated from birds. Furthermore, even after infection with influenza virus, it is possible to suppress the influenza virus that grew by budding from infecting cells again, so that it can be used effectively as a therapeutic agent for influenza virus.
  • the active ingredient of the influenza virus inhibitor of the present invention is a peptide consisting of dozens of amino acids, it can be easily synthesized and formulated, and can be used as various forms of pharmaceutical compositions.
  • All publications cited herein are incorporated by reference in their entirety. Further, it is easily understood by those skilled in the art that various modifications and alterations of the present invention are possible without departing from the technical concept and the scope of the invention described in the appended claims. Would. The present invention is intended to cover such modifications and variations.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本発明は、シアリルガラクトース基結合性ペプチド、例えばガングリオシドGM3結合性ペプチドを有効成分として含むインフルエンザウイルス感染抑制剤の提供を目的とし、具体的には、以下の(a)又は(b)のシアリルガラクトース基結合性ペプチドを有効成分として含有するインフルエンザウイルス感染抑制剤を提供する。(a)　配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列からなるペプチド(b)　配列番号１または２で表わされるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつシアリルガラクトース基結合活性を有するペプチド

Description

明細書
ィンフルェンザウィルス感染抑制剤 技術分野
本発明は、 シァリルガラク トース基結合性ペプチド、 例えばガンダリ オシド GM3結合性べプチドを有効成分として含むインフルエンザウィル ス感染抑制剤に関する。 背景技術
細胞表面上の糖脂質、 糖タンパク質およびプロテオダリカンのような 糖コンジユゲー卜のオリゴ糖は、 細胞外の分子の認識用の標的分子で、 細胞特異的な結合プロセスと関係がある （文献（1)， （2) )。 シァリルガラク ト一ス （NeuAc- Ga l)構造は細菌毒素、 ウィルスおよび内皮細胞等の受容体 としてよく知られている （文献（3) - (5) )。シアル酸を有するダリコスフィ ンゴイ リピド、 いわゆるガンダリオシドは、 重要な生物学の機能と関係 があり、 それらはそれらの炭水化物部分に依存している （文献（6) - (8) )。 最近の十年間で、 脂質、 糖脂質および他のコンポーネントなどの膜コン ポーネン卜の局在および分布に関する研究は、 それらの特性と機能の関 係に集中している（文献（9) - ( 12) )。 ほとんどのグリコスフインゴィ リ ピ ドは、 シグナル伝達分子とともに界面活性剤不溶性膜として細胞から抽 出された（文献（13) - ( 15) )。糖脂質を豊富に含むサブフラクションが細胞 刺激およびシグナリングで修正されることが見出されている。 糖脂質を 含んでいる膜は、 空気-水界面単分子膜と して再構成された （文献 (16) - ( 18) )。 佐藤らは、 レクチンの結合様式が脂質単分子膜中のグリコ スフイ ンゴイ リピドの分布に依存すると報告した（文献（19) - (22) )。細胞 膜中の糖脂質に富んだ微小ドメインの構造および機能の関する情報が、 細胞表面上の糖鎖の生物学の役割を明確にすることを助けるであろう。 レクチンと抗体のような多数の糖結合タンパク質は糖コンジユゲー卜を ラベルするために利用され、 炭水化物に関連する疾患の治療に適用され てきた（文献（23) , (24))。
生物学的選択システム（ファージディスプレイライブラリー）は標的分 子に特異的に結合するペプチドを選択するために開発された （文献 (25) , (26)) このシステムの使用によって、 多くの選択が様々な糖コン ジュゲート、 単糖（文献（27)， （28))、 腫瘍関連糖抗原（文献（29)- (32))、 シァリル Lewisx(文献（33)， (34))、 グリ コスフイ ンゴイ リ ピ ド （文献 (35), (36)) 、 プロテオダリ カ ン （文献 （37)- (39)) および多糖 （文献 (40), (41))に対してなされた。 本発明者らは先の論文で、 ガンダリオシ ド GMl (Gal j3 l→3GalNAc^ 1→4 (NeuAc 2→3) Gal β l→4Glc/3 1→1' Cer) 結合べプチドの選択を行なった（文献（35))。 選択されたべプチド配列が GM1 に特異的に結合し、 GM1へのコレラ毒素の結合を阻害したことが示さ れた。
インフルエンザウイルスの膜には、 へマグルチニン （HA)及びシァリダ ーゼ （ノイラミニダーゼ） の 2種類の糖タンパク質が存在しており、 そ れぞれウィルスの感染成立及びウィルスの宿主細胞からの出芽に重要な 役割を果たしている。 へマグルチニンは、 動物である宿主の細胞膜上に 存在するシアル酸含有糖鎖を受容体として認識し、 特異的に結合し、 ィ ンフルェンザウィルスの細胞内へのエンドサイ ト一シスを導く。 また、 シァリダ一ゼは、 受容体破壊酵素であり、 宿主細胞からウィルス粒子が 出芽または遊離する際に、 みずからのまたは宿主細胞膜上のシアル酸残 基を切断する。
現在ィンフルェンザウィルス感染の予防薬または治療薬の選択肢は少 ない。 予防はワクチンにより行われているが、 注射による投与が必要な ためその使用は限られている。 また、 治療薬としてはインフルエンザゥ ィルスの膜タンパク質であるシァリダーゼの阻害剤が最近、 臨床におい て用いられている。 シァリダ一ゼの阻寄剤は、 インフルエンザウイルス が細胞内で増殖した後に、 細胞外に放出するのを抑制すると考えられて いる。 従って、 シァリダーゼ阻害剤は、 予防薬としての効果はなく、 ま たインフルエンザウイルスに感染後 1 日から 2 日の早い時間に投与する 必要があり、 その適用は限られていた。
本発明者は、 ィンフルェンザウィルスが感染する際にへマグルチニン と宿主細胞に存在するシアル酸含有糖鎖と結合することに鑑み、 先に上 述のファージディスプレイライブラリー方法で HA (へマグルチニン） 結 合性べプチドをスクリ一ニングし、 該ぺプチドがィンフルェンザウィル スが細胞内へ侵入するのを防ぐことによりィンフルェンザ感染を抑制し うることを報告し （特開 2002 - 284798 号公報、 W00/59932)、 インフルェ ンザウィルスの感染防止にぺプチドを用い得ることを示した。 発明の開示
本発明は、 シァリルガラク トース基 （シアル酸-ガラク トースの構造を 有する基） に結合するシァリルガラク トース基結合性ペプチド、 例えば ガンダリオシド GM3結合性ぺプチドを有効成分とするィンフルェンザゥ ィルスの感染抑制剤に関する。
上述のように、 インフルエンザウイルスはウィルスの膜のへマグルチ ニンが宿主細胞のシアル酸含有糖鎖を認識し結合し感染する。 本発明に おいては、 宿主細胞に存在するへマグルチニンの受容体をプロックし、 インフルエンザウイルスの感染を抑制することを目的とする。 具体的に は、 細胞の表面に存在するシァリルガラク トース基に結合性のぺプチド を用いて、 ィンフルェンザウィルスが宿主細胞に結合するのをブロック することにより、 インフルエンザウイルスの感染を抑制することを目的 とする。
本発明者は、 先にインフルエンザウイルスのへマグルチニンに結合す るへマグルチニン結合性べプチドがインフルエンザウイルスの感染を抑 制し得ることを見出していた。 該ペプチドは、 インフルエンザウイルス の膜に存在するへマグルチニンに結合することによりインフルエンザゥ ィルスが宿主細胞に結合することを阻害する。
へマグルチニン結合性べプチドは、 ィンフルェンザウィルスに作用し て感染を防止し得るが、 インフルエンザウイルスの存在を前提とする。 従って、 実際に臨床の現場で用いるときは、 シァリダ一ゼの阻害剤と同 様インフルエンザウイルスの感染を確認してから投与するのが効果的と 考えられ、 予防薬としてよりは、 治療薬としての効果が期待される。 本 発明者等は、 生体に作用する化合物ならば、 インフルエンザの感染の有 無に関わらず投与でき、 大きな予防的効果を発揮し得ると考え、 インフ ルェンザウィルスの感染を抑制する方法について鋭意検討を行い、 ィン フルェンザウィルスの膜に存在するへマグルチニンが結合する宿主細胞 の受容体をブロックすることにより、 インフルエンザウイルスの感染を 抑制し得ると考えた。 この場合、 例え被験体中にインフルエンザウィル スが感染していなくても、 宿主細胞の受容体を予めプロックすることに よりインフルエンザウイルス感染の予防的効果が期待できると考えられ る。 また、 生体への適合性、 半減期、 製造容易性等を考慮し、 分子量の それほど大きくない化合物が適するとも考えられた。 しかし、 インフル ェンザウィルスが動物の細胞に感染する場合、 シァリルガラク 卜ースが 受容体として機能することはわかっていたが、 シァリルガラク トースに 作用してィンフルェンザウィルスの感染を阻害し得る化合物は従来報告 されておらず、 単独の化合物で受容体をブロックすることは困難である と考えられていた。 本発明者らは、 インフルエンザウイルスの宿主細胞 表面の受容体であるシァリルガラク ト一スの構造に着目し、 該構造に関 与しているガンダリオシド GM3 (Ne uAc 2→3Ga l β l→4G l c jS 1→Γ Ce r)に 結合する、 アミノ酸残基数が十数個のぺプチドの効果について検討を行 つた。 本発明者らは、 ランダムペプチドライブラリーを用いたファージ ディスプレイ法によりガンダリオシド GM3 を細胞表面に高発現している マウス B 1 6 メラノーマ細胞を夕一ゲッ トとしてガンダリオシド GM3 に結 合するぺプチドを得た。 本発明者らは得られたガンダリオシド GM3結合 P T/JP2004/003031 性ぺプチドについて鋭意検討を行い、 意外にも該ぺプチドが単独でィン フルェンザが細胞表面の受容体に結合し細胞内に侵入するのを防止する ことを見出し本発明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は以下のとおりである。
[1 ] シァリルガラク トース基結合性べプチドを有効成分として含有す るィンフルェンザウィルス感染抑制剤、
[2 ] シァリルガラク トース基結合性べプチドがガンダリオシド GM3 結 合性ぺプチドである、 [1 ]のィンフルェンザウィルス感染抑制剤、
[3] 以下の（a)又は（b)のシァリルガラク トース基結合性ペプチドを有 効成分として含有する [1 ]のィンフルェンザウィルス感染抑制剤、
(a) 配列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列からなるぺプチド
(b) 配列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列において 1 若しく は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつガンダリオシド GM3結合活性を有するぺプチド
[4] シァリルガラク トース基結合性べプチドがアルキル化または脂質 化されている [1 ]から [3]のいずれかのインフルエンザウイルス感染抑 制剤、
[5 ] シァリルガラク トース基結合性ペプチドがリボソームに含有され ている [1 ]から [3 ]のいずれかのィンフルェンザウィルス感染抑制剤、 [6 ] インフルエンザウイルスが、 A型インフルエンザ、 B型インフルェ ンザおよび C型インフルエンザからなる群から選択される [1 ]カゝら [5] のいずれかのィンフルェンザウィルス感染抑制剤、
[7 ] インフルエンザウイルスが、 トリインフルエンザまたはブタイン フルェンザである [ 1 ]力 ら [5 ]のいずれかのィンスルェンザウィルス感 染抑制剤、
[8] さらに医薬的に許容できる担体を含む、 [1 ]から [7 ]のいずれか のインフルエンザウイルス感染抑制剤、
[9] [1 ]から [8]のいずれかのィンフルェンザウィルス抑制剤を非ヒ ト動物に投与することを含む、 インフルエンザを予防または治療する方 法、
[1 0] 非ヒト動物が、 トリまたはブタである [9]のインフルエンザを 予防または治療する方法、
[1 1 ] [1 ]カゝら [8]のいずれかのィンフルェンザウィルス抑制剤を調 製し、 該抑制剤を被験体に投与することを含む、 インフルエンザを予防 または治療する方法、
[1 2 ] 被験体がヒ ト、 トリおよびブ夕からなる群から選択される [1 1 ]のィンフルェンザを予防または治療する方法、
[1 3 ] [1 ]力 ら [8]のいずれかのィンフルェンザウィルス抑制剤のィ ンフルェンザの予防または治療への使用、 ならびに
[1 4] 以下の（a)又は（b)のガンダリオシド GM3 結合性べプチドのィン フルェンザウィルス抑制剤の製造への使用。
(a) 配列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列からなるぺプチド
(b) 配列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列において 1 若しく は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつガングリオシド GM3結合活性を有するぺプチド 図面の簡単な説明
図 1 は、水晶発振子マイクロバランス上に固定したガンダリオシド GM3 単分子膜に結合するファージのタイムコースを示す図である。
図 2は、 NeuAc- Gal 構造へのファージクローンの結合選択性の検討の 結果を示す図である。
図 3は、 フローサイ トメ一ターによるマウス B16 メラノーマ細胞への ファージクローンの結合の検討の結果を示す図である。
図 4は、 cOl ファージによるシァリルオリゴサッカライ ドの認識の検 討の結果を示す図である。
図 5は、 ぺプチド濃度の関数としての GM3への合成べプチドの結合量 を示す図である。
図 6は、 ペプチド含有リボソームによるインフルエンザウイルスの MDCK細胞への感染の阻害を示す図である。
図 7は、 ガングリオシド GM3結合性べプチド含有リボソームおよびへ マグルチニン結合性ペプチド含有リボソームによるインフルエンザウイ ルスの MDCK細胞への感染の阻害を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明は、 シァリルガラク トース基、 例えばガンダリオシド GM3 結合 性べプチドを有効成分として含むインフルエンザウイルス感染の予防お よび治療に用い得る感染抑制剤である。
シアル酸とガラク トースが結合した構造を有するシァリルガラク トー ス基は、 インフルエンザウイルスが細胞内に侵入するときにへマグルチ ニンの受容体となっており、 シァリルガラク トース基結合性ペプチドは インフルエンザウイルスがシァリルガラク ト一ス基を介して細胞に結合 することを防ぐことにより、 ィンフルェンザが細胞に感染するのを抑制 し得る。 シァリルガラクトース基を有する化合物として、 例えばガング リオシド GM3 が挙げられ、 本発明のシァリルガラク トース基結合性ぺプ チドは、 ガンダリオシド GM3結合性べプチドを含む。
伹し、 本発明のペプチドは、 シァリルガラク トース基に結合する限り 限定されないので、 シァリルガラク ト一ス基が表面に発現されている細 胞ならば、 例えその表面にガングリォシド GM3 が発現していなくても、 該細胞にィンフルェンザウィルスが感染するのを抑制することができる。 本発明の感染抑制剤で感染を抑制するィンフルェンザウィルスはオル ソミクスウィルス科に属する直径約 l OOnmの球状 RNAウィルスであり、 その型は限定されない。 本発明のインフルエンザウイルス抑制剤は、 細 胞のィンフルェンザが認識する受容体をブロックするため、 インフルェ ンザウィルスの型を問わず、 感染を抑制することができる。 インフルェ P T/JP2004/003031 ンザウィルスの型として、 A型 （H2N2、 H3N2、 H1N1等）、 B型、 C型、 ヒ ト分離型、 トリ分離型 （トリインフルェンザウィルス （H5N1、 H7N2、 H7N7 等））、 ブタ分離型 （ブ夕インフルエンザウイルス）、 その他ゥマ等の哺乳 類の分離型等のインフルエンザウイルスの感染を広く抑制し得る。 イン フルェンザウィルスによっては、 へマグルチニンとシァリダーゼ （ノィ ラミニダーゼ） の抗原型の違いにより、 多数の亜型が存在するが、 本発 明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、 型、 亜型を問わず、 インフ ルェンザウィルスの感染を抑制することができる。
さらに、 本発明のインフルエンザウイルス抑制剤は、 インフルエンザ ウィルスが感染しうる動物ならばいかなる動物に対しても用いることが でき、 ヒト、 トリ、 ブ夕等がインフルエンザウイルスに感染するのを抑 制することができる。
本発明のシァリルガラク トース基結合性べプチドは、 以下のように公 知のファージディスプレイライブラリ一を用いたファ一ジディスプレイ ライブラリ一法により選別することができる。 ファージディスプレイラ イブラリー法は、 例えばスコッ トおよびスミスの方法により行うことが できる （Scott, J. M. and Smith, G. P. , Science, 249. 386-390 (1990) ; Smith, G. P. and Scott, J. K. , Method s in Enzymology, 217, 228-257 (1993))。 また、 特開 2000- 253900号公報および特開 2002- 284798号公報 の記載に従って行うこともできる。
ファージディスプレイライブラリ一としては、 市販のものを用いるこ とができる。
まず、 公知のファ一ジディスプレイライブラリ一にランダムな D N A 配列を挿入して、 ファージの外殻表面にランダムなアミノ酸配列を有す るペプチドを発現し得るように構築する。 この際、 例えば、 実施例に示 すようにファージのコ一トタンパク質 pi II遺伝子にランダムな DNAが揷 入された、ファージ外殻表面にランダムな 15個のアミノ酸を有するぺプ チドが発現するように構築されたディスプレイファージを用いることが 2004/003031 できる。 ディスプレイファージを用いることにより、 約 108種類のぺプ チドをそれぞれ発現したファージが得られる。
次いで、ぺプチドをランダムに発現したファージをガンダリオシド GM3 を用いてパニングする。 この際、 ガンダリオシド GM3 の単分子膜を適当 な基板上に作製し （ガンダリオシド GM3単分子膜累積基板）、 該単分子膜 へ結合するファージを選択すればよい。 選別されたファージを大腸菌に 感染させて大量に培養し、 分離、 精製し、 ガンダリオシド GM3 に結合す るペプチド発現ファージを得る。 パニング操作を数回繰り返すことによ り、 ガンダリオシド GM3 と特異的に結合し得るペプチドを発現し得るフ ァージを選別し、 濃縮することができる。
次いで、 選択されたファージから DNA を抽出しその配列を決定するこ とにより、 ファ一ジが発現するシァリルガラク トース基に特異的に結合 するぺプチドを得ることができる。 DNAの配列決定は、 公知のマキサム · ギルバート法等により行えばよく、 市販のシーケンサ一を用いることも できる。
このように、 単分子膜を用いる場合、 表面に糖鎖のみ突き出ているの で、 効率的にシァリルガラク トース基結合性ペプチドを選別することが できる。 なお、 単分子膜を作製し、 ガンダリオシド GM3 と結合するぺプ チドを発現するファージを選択するときに、 マイクロバランスとして知 られる水晶発振子を用いることができる。 該水晶発振子を用いることに より、 ファージの結合に応じて生じる水晶発振子金電極表面の重量変化 を周波数の変化として検出することができる。 水晶発振子を用いた方法 は例えば、 B i och im. B i ophys. Ac t a, 1 138, 82-92 ( 1998)または B i och im. B i ophys. Ac t a, 1285, 14-20 ( 1996)に記載の方法に従って行うことがで きる。 具体的には、 T B S (トリス緩衝化生理食塩水） を下層水として トラフに作製した単分子膜の表面に発振子電極表面を水平付着させ、 発 振させて、 安定したところでファージライブラリー溶液を加え、 ファー ジの結合に応じた発振子の振動数を計測し、結合の有無を調べればよい。 03031 シァリルガラク トース基結合性べプチドの例として、 配列番号 1およ び 2に示す 15アミノ酸からなるガンダリオシド GM3結合性べプチドが挙 げられる。 本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤の有効成分とし てこれらのペプチドを用いることができる。 また、 配列番号 1 または 2 に表されるアミノ酸配列において、 1 もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加したァミノ酸配列からなるペプチドであって、 ガンダリ オシド GM3 に結合し得るぺプチドも本発明のィンフルェンザウィルス抑 制剤の有効成分として用いることができる。 上記 「 1 もしくは数個」 と は好ましくは 1 もしくは 10個、 さらに好ましくは、 1 もしくは 5個、 1 もしくは 4個、 1 もしくは 3個、 1 もしくは 2個または 1個である。 ま た、 配列番号 1 または 2に表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコ 一ドする DNAの相補的な DNAにス トリンジェントな条件でハイブリダイ ズする DNAがコードするアミノ酸配列からなるぺプチドであってガング リオシド GM3 と結合するぺプチドも本発明のィンフルェンザウィルス抑 制剤の有効成分として用いることができる。 ここでス トリンジェントな 条件とは、例えば DNAを固定したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの NaC l 存在下、 68°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍濃度の SSC 溶液 （1倍濃度の SSC とは 150mM NaC l、 15mM クェン酸ナトリウムからな る） を用い、 68°Cで洗浄することにより同定することができる条件をい う。 さらに、 配列番号 1または 2に表されるアミノ酸配列からなるぺプ チドをコードする DNAの縮重変異体がコ一ドするアミノ酸配列からなる ぺプチドであってガンダリオシド GM3 に結合するぺプチドも本発明のィ ンフルェンザウィルス抑制剤の有効成分として用いることができる。 ぺ プチドがガンダリオシド GM3 に結合するか否かは、 例えば上述のガング リオシド単分子膜を付着させた水晶発振子を用いて調べることができる。 上記べプチドは、 公知の液相法及び固相法べプチド合成法により合成. することができる。 また、 選択されたファージと大腸菌を用いて作製す ることもできる。 このようにして得られたペプチドは、 公知のペプチド の精製方法を用いて精製することができる。
また、 ガンダリオシド GM3結合性ペプチドを修飾したペプチドを用い ることもできる。 ペプチドの修飾により親水性が増し、 血中半減期が増 犬し、 また細胞親和性や組織親和性が増大し得るので、 よりインフルェ ンザ感染抑制剤としての効果を期待することができる。 さらにべプチド を修飾により高分子化することにより、 インフルエンザウイルスのガン ダリオシド GM3への結合を立体的に障害しより抑制剤としての効果を期 待することができる。
ペプチドの修飾として、 例えばアルキル化、 脂質化、 PEG 化などの水 溶性ポリマーの結合等が挙げられる。
アルキル基の結合は、 公知の方法で行うことができ、 例えばガンダリ オシド GM3結合性べプチドの C末端カルボキシル基にアルキルアミンを 結合させるか、 または N末端アミノ基に脂肪酸を結合させればよい。 末 端力ルポキシル基へのアルキルァミンの結合または末端アミノ基への脂 肪酸の結合は、 アミ ド結合形成反応により行うことができる。 結合する アルキル基は、 限定されないが、 炭素数 2から 2 0、 例えば 1 8のアル キル基が挙げられる。 脂肪酸を結合させるときに用いる脂肪酸も限定さ れないが、 生体内に存在する脂肪酸が好適に採用でき、 具体的にはラウ リン酸、 ミリスチン酸、 パルミチン酸、 ステアリン酸、 ァラキン酸等の 飽和脂肪酸 ； ォレイン酸、 エライジン酸、 リ ノール酸、 リノレン酸、 ァ ラキドン酸等の不飽和脂肪酸など、 炭素数が 1 2〜 2 0程度の脂肪酸を 用いればよい。
ガンダリオシド GM3結合性べプチドの脂質化も公知の方法により行う ことができる。 例えば New Current, 11 (3), 15-20 (2000)； Biochemica et Biophysica Acta. , 1128, 44-49 (1992)； FEBSLetters, 413, 177-180 (1997)； J. Biol. Chem. , 257, 286-288 (1982)等の記載に従って行えばよ い。 具体的には、 各種リン脂質の 2位の水酸基或いは 3位のリン酸基を 介してガンダリオシド GM3結合性ペプチドを結合することができる。 こ 4 003031 の際、 適当なスぺーサーを介して結合させてもよい。 反応には各種の縮 合法が採用できる。 例えば、 ガンダリオシド GM3 結合性ペプチドの N末 端または C末端に、 数個程度の適当な長さのシスティンを含むアミノ酸 配列を結合させ、 反応性 S H基を利用して行う方法がある。 用いるリン 脂質も限定されず、 ホスファチジン酸、 ホスファチジルコリン （レシチ ン）、 ホスファチジルエタノールァミン、 ホスファチジルセリン、 ホスフ ァチジルイノシトール、 ホスファチジルグリセロール等が挙げられる。 このように、 脂質化したペプチドをリポペプチドと呼ぶ。
ペプチドを水溶性ポリマーの結合により修飾する際に用い得る水溶性 ポリマーとして、 例えば、 ポリエチレングリコール、 モノメ トキシ一ポ リエチレンダリコール、 デキス トラン、 ポリ （N—ビニルピロリ ドン） ポ リエチレングリコール、 プロピレングリコールホモポリマー、 ポリプロ ピレンォキシド /エチレンォキシドコポリマー、ポリ ビニルアルコール等 が挙げられる。 これらのポリマーは、 蛋白質の N末端の α —アミノ基ゃ リシンの ε —ァミノ基とアルデヒドのような反応性基を介して共有結合 することができる。 この中でも、 PEGが好ましく、 PEGの分子量は 6 k Da 〜 50 k Daのものが好ましい。
さらに、 ガンダリオシド GM3 結合性ぺプチドを高分子化する方法とし て、 デンドリマ一化が挙げられる。
また、 ガンダリオシド GM3結合性べプチドを含有するリボソーム製剤 も本発明のィンフルェンザ感染抑制剤として用いることができる。「リポ ゾーム」 とは膜状に集合した脂質層および内部の水層から構成される膜 状の閉鎖小胞を意味する。 本発明のリボソーム製剤は、 リボソームに、 ガンダリオシド GM3結合性べプチドを含有させることにより調製するこ とができる。 リボソームとしては、 酸性リン脂質を膜構成成分とするリ ポゾームまたは中性リン脂質と酸性リン脂質を膜構成成分とするリポソ ームがある。
膜構成成分としての酸性リン脂質としては、 例えばジラウロイルホス P2004/003031 ファチジルグリセロール （ D L P G )、 ジミ リス ドイルホスファチジルグ リセロール（DM P G)、ジパルミ トイルホスファチジルグリセロール（D P P G )、 ジステアロイルホスファチジルグリセロール （ D S P G )、 ジ ォレオイルホスファチジルグリセロール （D O P G)、 卵黄ホスファチジ ルグリセロール （卵黄 P G), 水添卵黄ホスファチジルグリセロール等の 天然または合成ホスファチジルグリセロール類 （P G) およびジラウ口 ィルホスファチジルイノシトール （D L P I ) ; ジミ リス トイルホスファ チジルイノシ卜一ル （ D M P I )、 ジパルミ トイルホスファチジルイ ノシ トール （D P P 1 )、 ジステアロイルホスファチジルイノシトール （D S P I )、 ジォレオイルホスファチジルイノシトール （D O P I )、 大豆ホ スファチジルイノシトール （大豆 P I )、 水添大豆ホスファチジルイノシ トール等の天然または合成ホスファチジルイノシ トール類 （P I ) が挙 げられる。 これらの構成成分は一種のみを単独で用いてもよいし、 二種 以上混合して用いてもよい。
中性リン脂質としては、 大豆ホスファチジルコリ ン、 卵黄ホスファチ ジルコリン、 水添大豆ホスファチジルコリ ン、 水添卵黄ホスファチジル コリ ン、 ジミ リス トイルホスファチジルコリン （DMP C)、 ジパルミ ト ィルホスファチジルコ リ ン （D P P C)、 ジラウロイルホスファチジルコ リ ン （D L P C)、 ジステアロイルホスファチジルコリ ン （D S P C)、 ミ リス 卜ィルパルミ 卜ィルホスファチジルコリ ン （ M P P C )、 パルミ ト ィルステアロイルホスファチジルコリン （P S P C)、 ジォレオイルホス ファチジルコリ ン （D O P C) 等の天然または合成ホスファチジルコリ ン類 （P C)、 大豆ホスファチジルエタノールァミン、 卵黄ホスファチジ ルエタノールァミン、 水添大豆ホスファチジルェタノ一ルァミン、 水添 卵黄ホスファチジルエタノールァミン、 ジミ リス トイルホスファチジル エタノールァミン （DMP E)、 ジパルミ トイルホスファチジルエタノー ルァミン（D P P E)、ジラウロイルホスファチジルエタノールァミン（D L P E)、ジステアロイルホスファチジルエタノールァミン（D S P E)、 ミリストイルパルミ トイルホスファチジルエタノールァミン（MP P E)、 パルミ トイルステアロイルホスファチジルエタノールァミン（P S P E)、 ジォレオイルホスファチジルエタノールァミン (D O P E) 等の天然ま たは合成ホスファチジルエタノールアミン類 （P E) 等が挙げられる。 これらの構成成分は一種のみを単独で用いてもよいし、 二種以上混合し て用いてもよい。
ガンダリオシド GM3結合性ペプチドを含むリボソームは、 上記のリ ン 脂質を用いて公知の方法に従い調製することができる。 この場合、 酸性 リン脂質の割合は、 リボソーム膜構成成分中に約 0. 1〜 1 0 0モル％ 程度、好ましくは約 1〜 9 0モル％、より好ましくは約 1 0〜 5 0モル％ 程度とするのがよい。
上記リボソームの調製に当たっては、 更にコレステロールなどを添加 してもよい。 コレステロールを添加することにより リン脂質の流動性を 調整して、 リボソームの調製をより簡便なものとすることができる。 コ レステロールは通常リン脂質に対して等量まで、 好ましくは 0. 5〜 1 倍等量の量で添加配合されるのが好ましい。
リポソ一ム分散液中のガンダリオシド GM3結合性べプチドと酸性リン 脂質との配合割合は、 ペプチドに対して酸性リン脂質が約 0. 5〜 1 0 0当量程度、 好ましくは約 1〜 6 0当量程度、 より好ましくは約 1. 5 〜 2 0当量程度が好ましい。
また、 リボソームに含まれるガンダリオシド GM3結合性ペプチドの割 合は、 全脂質中、 数モル％から数十モル％程度、 好ましくは 5〜 3 0モ ル％、 さらに好ましくは 5〜 1 0モル％程度である。
本発明のガンダリオシド GM3 結合性べプチドを含有するリボソーム製 剤は、 公知の方法を用いて製造することができる。
例えば多重層リボソーム （ML V) は次のようにして調製される。 ま ず、 脂質を有機溶媒 （クロ口ホルム、 エーテル等） に溶解した後、 丸底 フラスコに入れ、 窒素気流下または減圧下で有機溶媒を除去し、 フラス コ底部に脂質の薄膜をつくる。 この場合、 さらに減圧下でデシケ一夕一 中に放置することによって有機溶媒を完全に除去することもできる。 次 いで、 薬物溶液を脂質薄膜上に加えて脂質を水和させることによって乳 濁色のリボソーム懸濁液が得られる。
また大きな一枚膜リボソーム （L UV) は、 ホスファチジルセリンの 小さな一枚膜リボソームに Ca "を添加し、 融合させてシリンダー状のシ ートとした後、 キレ一ト剤である E D TAを添加し Ca2+を除去する方法 (Biochim. Biophys. Ac t a 394, 483-491, 1975) ゃェ一テルに溶解した 脂質を約 60°Cの水溶液中に注入し、エーテルを蒸発させる方法（Biochim. Biophys. Acta 443, 629 - 634， 1976) により作ることができる。
また、 Szoka らの考案した逆相法によるリボソームの調製法 （Pro Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 4194-4198, 1978) を用いることもできる。 この方法によると、 リン脂質のエーテル溶液に薬物溶液を加え、 超音波 処理すると WZO型エマルシヨンが作成される。 この WZO型エマルシ ヨンを減圧下、 エバポレー夕一によりエーテルを除去し、 次いで緩衝液 を加えポルテックスミキサ一で撹拌すると、 WZO型エマルシヨ ンから ozw型エマルションに転相し、 更に残留する有機溶媒を除く ことによ つてリボソームが作成できる。
これらの調製法のほかに、 フレンチプレス法により粒子径の小さなリ ポソ一ムを調製することもできる （FEBS lett. 99. 210-214, 1979)。 ま た大沢らによって報告されているリポゾームへの保持効率の高い凍結乾 燥法 （Chem. Pharm. Bull. 31, 2442-2445, 1984) と凍結融解法 （Chem. Pharm. Bull. 33, 2916-2923, 1985) を使用することもできる。
このように調製されたリボソームは、 透析法 U. Pharm. Sci. Π, 806-812, 1982)やポリカーボネート膜を用いたろ過法（Biochim. Biophys. Acta 557, 9 - 23, 1979； Biochim. Biophys. Acta L 559-571, 1980) により、 粒子径を一定にすることができる。 また調製されたリボソーム 溶液から、 リボソーム内に保持されなかった薬物を除くためには、 透析 法、 ゲルろ過法、 遠心分離法を利用することができる （リボソーム. " 脂質の化学" [日本生化学会編、生化学実験講座 3 ]、東京化学同人、 1974)。 更にまた透析膜を用いてリボソームを濃縮することも可能である。
このようにして調製されるリボソーム分散液には、 製剤設計上必要な 添加剤として、 防腐剤、 等張化剤、 緩衝剤、 安定化剤、 可溶化剤、 吸収 促進剤等の各種の公知物質を適宜配合することができ、 また必要に応じ てこれらの添加物を含む液または水で希釈することもできる。 上記添加 剤の具体例としては、 防腐剤としては塩化ベンザルコニゥム、 塩化ベン ゼトニゥム、 クロ口へキシジン、 パラベン類 （メチルパラベン、 ェチル パラベン等）、 チメロサール等の真菌および細菌に有効な防腐剤を、 等張 化剤としては D—マンニトール、 D—ソルビトール、 D - キシリ トール、 グリセリン、 ブドウ糖、 マルトース、 庶糖、 プロピレングリコール等の 多価アルコール類や塩化ナトリゥム等の電解質類を、 また安定化剤とし てはトコフエロール、 プチルヒドロキシァニソール、 プチルヒ ドロキシ トルエン、 エチレンジァミン四酢酸塩 （ED TA)、 システィン等をそれ ぞれ例示できる。
また、 本発明の H A結合性べプチドからなる上記リボソームの内部に は、 例えば抗ウィルス剤等の他の薬剤を更に封入させることができ、 同 様にリボソーム製剤とすることができる。
リ ボソーム製剤の製造は、 具体的には例えばウ ッ ド レら （ Long Circulat ing Liposomes： old drugs, New therapeutics. , M. Woodle, G. Storm, Eds: Springer- Verl ag Berlin (1998) ) ま た は ナ ン パ ら ( Liposomal applications to cancer therapy, Y. Naniba, N. Oku, J. Bioact. Compat. Polymers, 8, 158-177 (1993) ) に記載の方法に従って 調製することができる。
リポソ一ム製剤を調製する際には、 上述のアルキル化べプチドゃ脂質 化ペプチドを、 脂質成分として用いることができる。
上記リボソーム製剤を含む本発明の薬学的組成物中のガンダリオシド GM3 結合性ペプチドの量は、 限定されず、 投与する被験体に応じて適宜 選択されるが、 通常組成物中 0 . 0 0 0 2〜 0 . 2 ( w / V % ) 程度、 好ましくは 0 . 0 0 1〜 0 . 1 ( w Z v % ) 程度である。
本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、 インフルエンザウイ ルスに感染していない被験体に投与することによりインフルエンザウイ ルスの感染を予防することができ、 また既に感染した被験体に投与する ことにより、 体内でインフルエンザウイルスが他の細胞に感染するのを 抑制し、 インフルエンザウイルスの治療剤として用いることもできる。 本発明のィンフルェンザ感染抑制剤はガンダリオシド GM3結合性べプチ ドを有効成分として含むとともに、 さらに薬学的に許容される担体、 希 釈剤、 賦形剤を含んでいてもよい。 水溶液製剤の場合、 担体としては、 精製水 （滅菌水） または生理学的緩衝液、 等張液等を利用することがで きる。 また、 グリコール、 グリセロール、 オリ一プ油のような注射投与 可能な有機エステルなどを使用することもできる。 錠剤用の担体、 賦形 剤としては、 ゲル化剤、 乳糖、 ステアリン酸マグネシウムなどが使用さ れる。
本発明のィンフルェンザウィルス感染抑制剤は、 医薬組成物として、 種々の形態で投与することができる。 このような投与形態としては、 錠 剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤等による経口投与、 あるい は注射剤、 点滴剤、 座薬などによる非経口投与を挙げることができる。 また、 噴霧剤としても投与できる。 噴霧剤として用いる場合、 本発明の ィンフルェンザウィルス抑制剤を含む溶液を経口的または経鼻的に被検 体に噴霧すればよく、 トリ、 ブ夕等の家畜にも効率的に投与することが 可能である。 かかる組成物は、 公知の方法によって製造され、 製剤分野 において通常用いられる。
本発明のィンフルェンザウィルス感染抑制剤の投与経路は、 限定され ず、 経口投与、 静脈注射、 筋肉注射、 皮内注射、 皮下注射、 腹腔内注射、 噴霧等がある。さらに、本発明のィンフルェンザウィルス抑制剤をトリ、 ブタ等の家畜が摂取する水、 飼料等に混合して投与することもできる。 投与量は、 疾患の重篤度等により適宜決定できるが、 本発明の組成物の 医薬的に有効量を患者に投与する。 ここで、 「医薬的に有効量を投与す る」 とは、 各種疾患を治療するのに適切なレベルの薬剤を患者に投与す ることをいう。 本発明の医薬組成物の投与回数は適宜患者の症状に応じ て選択される。 例えば、 ガンダリオシド GM3結合性ペプチドの量に換算 して通常成人 1 日当り約 0 . 0 0 1〜 1 0 O m g程度の範囲から選ぶこ とができる。 当該製剤は 1 日 1回投与に限らず、 数回に分けて投与する ことができる。 トリ、 ブ夕等の家畜に投与する場合も、 その体重等を考 慮して適宜投与量を決定することができる。
また、 さらに本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤は、 有効成 分として他のインフルエンザウイルスの感染を抑制し得る化合物を含ん でいてもよい。 他の化合物としては、 例えば、 特開 2002- 284798号公報 に記載のインフルエンザウイルス · へマグルチニン結合性べプチドが挙 げられ、 具体的には、 例えば特開 2002- 284798号公報および 00/59932 に記載されたペプチドがある。 インフルエンザウイルス抑制剤に、 ガン ダリオシド GM3結合性ぺプチドとィンフルェンザウィルス · へマグルチ ニン結合性ペプチドを含ませることにより、 インフルエンザウイルス自 体が有する細胞と結合する部分および細胞の有するィンフルェンザウイ ルスと結合する部分の両方がプロックされ、 より大きなインフルエンザ ウィルス抑制効果が期待できる。 該インフルエンザウイルス · へマダル チニン結合性べプチドも上述のガンダリオシド GM3 結合性べプチドのよ うに、 アミノ酸の一部が変異したものを用いることができ、 また修飾し たものを用いることもできる。 さらに、 リボソームに含有されていても よい。 本発明のインフルエンザウイルス感染抑制剤がリボソーム製剤の 場合、 リボソーム中にガンダリオシド GM3結合性べプチドとィンフルェ ンザウィルス · へマグルチニン結合性べプチドの両方が含まれていても よい。 次に、 本発明を実施例により具体的に説明する。
材料の入手
ガンダリオシド GM3 (NeuAca 2→3Gal β l→4Glc)31→Γ Cer)は雪印乳業 (日本）から入手した。 合成の GM3アナログである 6' GM3 (NeuAc 2→6Gal j8 1→4G1C J31→Γ Cer)は文献（42)に記載の方法で調製した。 ラク トシル セラミ ド （LacCer)、 ガラク 卜シルセラミ ド （GalCer)およびダルコセレブ ロシド （GlcCer)は Sigma(St Louis, MO, USA)から購入した。 卵黄ホスフ ァチジルコ リ ン （卵 PC)およびコ レステロールは N0F 株式会社および nacalai tesQiie社（日本）からそれぞれ入手した。
ファージディスプレイ 15量体ランダムべプチドライブラリー（108の多 様性）は、 文献（43)に記載のようにして得た。 15量体ペプチドアミ ド （ベ プチド - NH2)および N-ステアロイル（ォクタデカノィル）ペプチドアミ ド (C17H35C0-ぺプチド- NH2)は、標準の Fmoc法を使用して、 Advanced Chemtech からの自動べプチドシンセサイザ一 ACT357により合成した。 ぺプチドァ ミ ドおよび N -ステアロイルぺプチドアミ ドは逆相高速液体クロマトグラ フ ィ 一によつ て精製した。 次に、 純度および期待された構造は MALDI-TOF/MSによって確認した。
マウス B16 メラノーマ細胞は RIKEN セルバンク （日本）から得た。 Madin-Darbyィヌ腎臓（MDCK)細胞およびィンフルェンザ A/プエルトリコ /8/34ウィルス株（H1N1)は、 K. Nagata (つくば大学（日本） ）から提供を受 けた。
〔実施例 1〕 ガンダリオシド GM3結合性べプチドの選択
( 1 ) シァリルガラク トース結合性べプチドのァフィニティー選択 ガンダリオシド GM3 (ca. 0.5mg/mL)を含む脂質溶液（クロ口ホルム/メ 夕ノール =2: 1， v/v)を、テフロンコーティングを施したラングミュアの水 槽（USI社（日本））の中で、 トリス緩衝塩溶液（TBS) (50mMTris-HCK 150mM NaCK H 7.5)上に展開した。 下層水の温度は 20°Cに保持した。 表面の 圧力（p- A)の等温線は、 Wilhelmyプレート法によってモニタ一した。 GM3 単分子膜は一定の割合（10 cm2 min— で圧縮され、 30mN m—1の表面圧力で 水晶発振子マイクロバランス（QCM ; 9MHz, AT-cu t, 直径 4. 5匪、 面積 15. 9 匪2)の金表面へ水平に移した（文献（21) )。 QCMは、 1ml の TBSで満たされ た手製のプラスチックチューブに写し、 バッファー温度は攪拌しながら 20 に維持した。 ファージ（各選択ラウンド 6. 1- 87 X 10 形質導入ュニッ ト）は、 キュべッ トに注入した。 インキュベーション時間を決定するため に、 単分子膜へのファージの結合（A F、 Hz)を経時的に追跡した（文献 (35) ) 15 分後、 ファージの結合はほとんど平衡（デ一夕は示さない）に なった。 QCM をピックアップし、 3回 TBS で洗浄し、 単分子膜に結合し たファージを 15分間 0. 1Nの Gly HC 1 バッファー（pH 2. 2)で溶出した。 溶出液は、 1M の t r i s- HC 1 バッファ一（pH 9. 1)で中和し、 次に、 大腸菌 K91Kan宿主細菌細胞にそれらを感染させることにより増幅した。 このプ 口セスを 4 回繰り返し、 GM3 特異的ファージを増やした。 個々のファー ジクローンを単離し、 増幅し、 ポリエチレンダリコール/ NaC l (PEG#6000) で沈殿させた（文献（26) )。各ファージクローンの DNAは Q IAprep Sp in M13 キッ ト （QIAGEN)により精製し、 アミノ酸ァラインメントを推定するため の配列決定の铸型として使用した。
( 2 ) ELI SAによるファージクローンの結合性の分析
ポリスチレン製マルチウエルプレートは、 1%の BSA/TBSであらかじめ ブロッキングし 3回洗浄しておいた。プラスチックプレート （直径 13. 5mm, 住友べ一クライ ト社、 日本）は、 上述のようにして調製したガンダリオシ ド GM3または 6' GM3単分子膜に水平に結合させた。ファージクローン（200 1 の TBS中に 0. 01- 10 nM)は、 4でで 30分間単分子膜とィンキュベート した。 プラスチックプレートの反対側は、 0. 5%の BSA/TBS を加えること によりブロッキングし、 その後 0. 5%の BSA/TBS を用いて 2 回洗浄した。 結合したファージは 4 で 1 時間で l : 2000 (v/v)希釈抗 idパクテリオフ ァ一ジ（S i gma)とともにインキュベートし、 その後、 l : 2000 (v/v)希釈抗 ゥサギ免疫グロプリン Gペルォキシダ一ゼコンジユゲートを用いて 4 1時間標識した。 o -フエ二レンジァミンで発色させ、 492nmで検出した。 各実験は 3回行った。 吸光度の増加（492nmでの Δ A)は、 ファージ濃度に 対する単純飽和カーブを示し、 これは、 [ファージ] /ΔΑと [ファージ]の 間のプロッ トとして以下の方程式のように直線的な関係を示した。
[phage] /AA=[ - ] /Δ Amax+Kd/A Amax (I)
最大の吸光度（Δ Amax)および解離定数（Kd)は、 それぞれ方程式の傾き および切片から計算した。 Kdは 0.018から 0.09 InM の範囲にあった。 コ ントロ一ルファージの AAmax も毎回アツセィし、 相対的結合親和性（△ Amax/Δ A ax, control)を評価した（表 1 )。 ファージの野生型はコントロ —ルとして用いた。 '
( 3 ) 細胞
マウス B16メラノーマは 10%ゥシ胎児血清（Life Technologies, Inc. ), 100ユニッ ト/ ml のペニシリン G、 100 ユニッ ト/ ml のス トレプトマイシ ンを補足した Dulbecco' s modified Eagle' s 培地（ICN Biomedicals) 中で 37°C、 5¾C02> 95%空気の条件下で増殖させた。 Madin- Darby ィヌ腎 臓（MDCK)細胞は 10%ゥシ胎児血清、 0. l%NaHC03、 10 g/ml グルタミン、 100ュニッ ト /mlペニシリン Gおよび 100ュニッ ト /mlス トレプトマイシ ンを添加した MEM (minimum essential medium eagle) (GIBCO BRL) 中で 37°C、 5¾C02、 95%空気の条件下で増殖させた。
( 4) フローサイ トメ トリー
トリプシン処理 B16細胞（2X105)を、 BSA/リン酸緩衝化食塩水（PBS) 中で系列希釈したファ一ジクローン（ [phage] =0. 1-500 nM) 200 1 ととも に、 氷上で 1時間インキュベートした。 の BSA/PBSを用いて 3回洗浄 し、 細胞を 400 倍希釈 （v/v)のゥサギ抗 id バクテリオファージ抗体 (Sigma) 200 1とともに氷上で 0.5時間インキュベートした。 2回洗浄し、 細胞を 400倍希釈 （v/v)の抗ゥサギ IgGフルォレセインイソチオシァネ 一ト （FITC)コンジユゲート （Sigma) 200 1 とともに氷上で 0.5時間ィン キュペートした。 FITC標識細胞を、 1%の BSA/PBSで 2回洗浄し、 フロ一 サイ トメーター（EPICS XL、 コールター）によって分析した。
( 5 ) 単糖の添加による阻害
ト リ プ シ ン処理 B16 細胞 （2 X 10 ) を 、 フ ァ ー ジ ク ロ ー ン ( [phage] =10nM) 200 1 とともに、 単糖（1 または 5mMの N-ァセチルノィ ラミン酸（NeuAc)、 グルコース（Glc)もしくはダルク口ン酸（GIcU))の存在 下または不存在下で氷上で 1時間インキュベートした。 細胞を洗浄し、 FITCで標識し、 フローサイ トメーターにより分析した。
( 6 ) 細胞上の糖タンパク質のシアル酸の除去
ト リ プ シ ン 処 理 B16 細 胞 （2 X 105) を 、 Arthrobacter ureafaciens (Sigma)由来の 0.05 ユニッ トのノィラミニダーゼとともに 37°Cで 1.5時間（pH6.5 または 7.4)インキュベートした。 1%の BSA/PBSを 用いて 3 回洗浄後、 細胞をファージクローン（ [phage] =10nM)とともにィ ンキュペートし、 FITCで標識し、フローサイ トメ一夕一により分析した。
( 7 ) 合成べプチドおよび糖脂質単分子膜の間の相互作用の水晶発振 子マイクロバランス（QCM)分析
糖脂質（GM3、 6'GM3、 LacCer、 GalCerまたは GlcCer)の単分子膜は、 ラ ングミュアタイプ水槽上で調製し、 QCM(27MHz、 AT- cut、 直径 2.5腿、 面 積 4.9讓 2)の上に水平に写した。 27MHzの QCMは 9MHz よりも感度が高か つた（約 10倍） （文献（44) - (46) )。 TBS中 0, 1 mM、 lmMおよび lOmMのぺプ チド溶液を、 QCM 装置のセルキュベッ トへ添加し、 ペプチドの添加に応 答する QCMの周波数減少（AF、 Hz)を経時的に追跡した。 各実験は、 2〜6 回実行した。 結合量（Δπκ ng cm2〉）および AFの関係は、 Sauerbreyの方 程式に基づいて得られた（文献（47) )。 この場合、 1Hzの は、 L lng cm"2 のペプチドの質量増加に相当した。 Δπιを、 ペプチド濃度（最終濃度 =1〜 70 M)に対してプロッ トした。 次に、 最大結合量（ΔπιΠ3Χ)および解離定数 (Kd)を （44-45、 48)に記載の次の方程式から計算した。
[peptide]
Figure imgf000023_0001
mnax (II)
( 8 ) ペプチドを含むリボソームの調製 クロ口ホルム/メタノール（2: 1， v/v)に溶解された、 卵黄ホスファチジ ルコリン (PC)およびコレステロール（2:1，モル比）の混合脂質を、 円形底 フラスコへ加え蒸発させて薄い脂質膜を作製した。 脂質フィルムは、 真 空中でオーバ一ナイ トで乾燥させた。 膜をポルテックスにより PBS(pH 7.4)で膨潤させ、 30 分間超音波処理した。 PC/コレステロールリポソ一 ムは、 N-ステアロイルぺプチドアミ ドの水性溶液と混合した。 PC:コレス テロール：ペプチドの最終のモル比は 20:10:3であった。 実施例 1において以下の結果が得られた。
(a) GM3単分子膜に対するファージディスプレイ選択
GM3 の糖鎖に結合するペプチド配列は、 文献（35)に記載のような脂質 単分子膜と結合したファージライブラリ一法で選択した。 空気と水の界 面において GM3単層を調製し、 ァフィ二ティー選択のために使用した。 GM3特異的ファージは、 4回のァフィ二ティー選択のプロセスを通じて増 加した。 回収したファージの相対的な収量は、 4 ラウンドのバイオパニ ング（データは示さない）を通して 0.2〜15X 106に増加した。 GM3単分子 膜に対する選択されたファージの結合親和性は、 9MHzの水晶発振子マイ クロバランス（QCM)によって確認した （文献（21) - (22))o トリス緩衝化生 理食塩水（·50ιηΜ tris-HCK 150mMNaCK pH 7.5)中でのファージ（10lflTU/mL) の添加に応答した QCMの周波数減少（質量増加）を経時的に追跡した （図 1 )。
図 1において、 ファージライブラリー（白丸）または GM3 単分子層を用 いたァフィ二ティー選択の第 4 ラウンドのファ一ジクローン （黒丸） の 結果を示す。 GM3単分子層は 9MHzの QCM金表面へ結合させ、 QCMは pH 7.5 でトリス緩衝化生理食塩水 1mlへ浸潰した。 6X 101βの変換ュニッ トを含 むファージ溶液を、 緩衝液に注入し、 ファージ結合に応答する周波数減 少を時間に対してプロッ トした。 この結果より、 最終ファージ濃度は、 2ηΜであることがわかった。 周波数変化は、 選択されたファージ（26Hz)の結合量が最初のライブラ リー（4Hz)の 6.5倍であることを示した。 これらの結果は、 ァフィ二ティ 一選択がランダムファージライブラリーからの GM3 結合ファージを与え たこと示す。
27クローンの GM3特異的ファージが単離され、ファージクローンの DNA 配列が決定された。 ランダム化された領域を示す推定アミノ酸配列は、 表 1 に示すように 7種類の 15- mer配列が見出されたことを示す（配列 1 から 7 )。 配列は 2つのグループに分類され、 各グループは推定コンセン サスモチーフ、 W-xxxA-Rおよび WRx- VxFxSをそれぞれ有していた。 各々 のコンセンサスモチーフは、 Arg(R)、 Trp (W)および Phe (F)から構成され ていた。 興味深いことに、 GM1 結合性ペプチドのコンセンサスモチーフ も、 これらの 3 つのアミノ酸（アルギニンおよび芳香性のアミノ酸）を含 んでいた （文献（35))。 更に、 この研究で選択された cOl配列は、 GM1結 合性ペプチド（GM1/ペプチド 2)のうちの 1 つと同じ配列であった。 これ は、 用いたファージライブラリ一が同一だったので、 ライブラリーの多 様性の限界による。 これらの結果は、 cOl 配列がシアル酸含有糖脂質に 対する広いァフィ二ティ一を有していることを示唆する。 表 1
4 ラウンドのァフィ二ティー選択後に分離されたファ—ジクローンの推 定ぺプチド配列および結合ァフィ二ティー
相対的結合
クローン No. ペプチド配列 a 頻度15 ァフィ二ティー c
cOl GW YKGRARPVSAVA 15/27 2.1
c07 LSWPLHAGRGFRWVS 1/27 1.2
c21 GWYSSRHYVRSLNGL 1/27 1.1
cll QQLVYN AVSS ARR 1/27 1.1 c03 RAVWRHSVATPSHSV 7/27 1.8
cl5 LWRPVLFHSAVRALG 1/27 1.7
c30 WRGVYFGDRWLGSQP 1/27 1.4 a 推定アミノ酸配列 推定コンセンサスモチーフは太字で示してある。 b 分離されたファージクローンの数。
C △ Amax/Δ Amax，コント D—ルの比 GM3へのファージクローンの結合 を ELISA により評価した。 コントロールファージクローン (野生型）の N 末端配列は AETVESCLAKPHTENである。
(b) ELISAによるァフィ二ティースクリーニング
GM3に対する単離されたファージクローンの結合親和性は、 ELISAによ つて評価した。 空気-水界面において GM3単分子膜を調製し、 プラスチッ クプレ一トに移した。プラスチックプレートを 24ウェルマルチプレート に移し、 ファージクローンとともに 30分間インキュベートした。 酵素に よる発色の吸収 vs.ファージ濃度のプロッ トにより飽和カーブが得られ、 最大吸光度（AAmax)は上記の方程式 I から計算した。 ELISA の結果は、 単離された Ίつのファ一ジクローンが次の順で GM3 に強く結合すること を示した。 C01>c03〉cl5〉c30〉c07〉c21=cll。 相対的結合ァフィ二ティ一、 すなわち （選択されたファージの Δ ΑΙΜΧ) Z (AETVESCLAKPHTENを提示す るコントロールファージの Δ Amax)は、 1. 1 と 2. 1 の間であった（表 1 )。 最も頻繁に出現した（15/27)ファージクローン cOlは、 GM3への最も高い ァフィ二ティーを示した。
(c) ファージクローンの結合ァフィ二ティー
2つのファ一ジクローン cOlおよび c03の結合ァフィ二ティーを、 ELISA によってさらに調べた。これらのクローンの結合ァフィ二ティ一は NeuAc a 2→3Gal 結合を含む GM3および NeuAcひ 2→6Gal結合を含む合成 6' GM3 を用いてアツセィした。 cOl クローンは、 GM3および 6' GM3の両方に、 コ ントロールクローンと比較して、 それぞれ 2. 1 と 1.6 の倍率で結合した (図 2 )。
単離された cOl および c03 フ ァージク ローンは、 系列希釈し (0.05-10nM) 、 GM3 (NeuAc 2→ 3Gal β 1→ 4Glc β l→ V Cer) ある いは 6' GM3 (NeuAc 2→6Gal j3 l→4Glc β 1→ Γ Cer)単層と相互作用して、 結合 ファージクローンの量を ELISA法によって評価した。 相対的結合ァフィ 二ティー（△ Amax/ Δ Amaxcontrol)はファージクローンの最大吸光度 （△ Amax) をコントロールファージ（△
Figure imgf000027_0001
の最大吸光度で割ることに より得た。
cOl ファージクローンはいずれの NeuAc - Gal 結合にも結合することが 示された。 他方では、 c03 クローンは、 コントロールクローンと比較し て、 1.8の倍率で GM3に特異的に結合した。 c03ファージクローンは、 シ アル酸のガラク トースへのひ 2→ 3 およびひ 2→6 結合の間で異なる結合 ァフィ二ティーを示した。
(d) B16細胞上の糖タンパク質中のシァリルオリゴサッ力ライ ドへの特 異的な結合
動物細胞用に選択されたファージクローンの結合ァフィ二ティーを調 ベた。 マウス B16 メラノーマ細胞の表面上に Iつのタイプのシァロシル ガラク ト一ス結合（ 2→3 および α 2→6)がある。 B16細胞株は主として GM3を発現し、他のガンダリオシドをほとんど発現しない（文献（13)、 （15)、 (49) _ (51) )。 細胞をファージクローンおよび結合クローンとともにイン キュペートしフルォレセイン結合抗体で標識した。 細胞の蛍光は、 フロ 一サイ トメ一夕一を用いて測定し、 観察された蛍光強度は、 ファージ濃 度の関数としてプロッ 卜した（図 3)。
B16 細胞は、 cOl ファ一ジクロ一ン（黒円）、 c03 ファージクローン（白 円）またはコントロールファージクローン（野生型、 黒三角形） とともに 0°Cで 1 時間 の BSA/PBS 中でインキュベートした。 結合したファ一ジ クローンは、抗ファ一ジ一次抗体および FITC結合二次抗体によって標識 した。 細胞へのファージクローンの結合量はフローサイ トメ一夕一によ つて決定した。
cOl ファージクローンは、 1〜10ηΜの範囲のファージ濃度で B 16細胞へ 結合した。 しかし、 c03 およびコントロールファージクローンでは有意 の結合は観察されなかった。
ファージの結合が細胞表面のシアル酸によって仲介されているかどう かを確認するために、 阻害アツセィおよび細胞のノィラミニダーゼ処理 を行った。 B16細胞への cOl ファージクローン（ΙΟηΜ)の結合は、 ImM NeuAc の転化により阻害された（図 4A)。
図 4 Aは、 単糖による、 cOl ファージクローンと B16細胞間の結合の阻 害を示す。 B16細胞（2X 105細胞）を、 NeuAc、 Glcまたは GlcU(lmM)の非存 在下（-）または存在下でファージクローン（ΙΟηΜ) とともにインキュベー 卜した。
グルクロン酸（GlcU)の存在下で、 わずかな阻害が観察された。 GlcUは NeuAc と同様に酸性糖であるので、 カルボン酸が、 ファージと糖鎖の間 の相互作用に部分的に関係していたと思われる。 他方、 グルコースの添 カロによっては阻害は Ϊ忍められな力 つた。 Arthrobacter ureaf aciens力 ら のノイラミニダーゼ（シァリダ一ゼ）は糖コンジユゲートの末端 α 2→3お よび α 2→6結合シアル酸を優先的に加水分解する （相対的な活性は、 α 2 →6〉ο; 2→3>α 2→8である） （文献（52) )。 Β 16細胞をバッファー（ρΗ 6· 5) 中においてノィラミニダ一ゼで 37° (：、 1.5時間処理した。この条件では、 細胞から除去されたシアル酸の量は 106個の細胞について 0.3^ gである と推測され、 それはほとんどある糖タンパク質の NeuAc の総量と等しい (文献（49)- (50))。 他方では、 GM3からの NeuAcの分解は薄層クロマトグ ラフィ一分析によっては確認されなかった （デ一夕は示さない）。 精製さ れた GM3 のシアル酸はノィラミニダ一ゼによって消化された。 しかし、 細胞全体の処理は、 GM3 からのシアル酸の分裂を示さなかった。 したが つて、 細胞がノィラミニダーゼで処理されたとき、 細胞上のシァリル糖 コンジュゲートは GM3 のみであると考えられた。 ELISAは cOl ファージ クローンが GM3 に結合することを示したが、 ノイラミニダーゼ処理 B16 細胞への cO 1 ファージの結合は、 コントロールファージと同じレベルに 減少した（図 4B)。
図 4Bは、 B16細胞のファージ結合に対するノイラミニダーゼ処理の影 響を示す。 B16細胞（2X105細胞）を、 ノィラミニダ一ゼ（pH6.5) 0.05単位 とともに 37° (：、 90分間、 1%の BSA/PBS中でインキュベートし、 さらにフ ァージクローンとともにインキュベートした。 図 4B においてァスタリ スクは p〈0.05を意味する。
細胞が酵素活性のない条件である PH7.4 でノイラミニダーゼ処理され たとき、 cOl ファージは細胞に結合した （デ一夕は示さない）。 これらの 結果は、 cOl ファージクローンは GM3 にではなく糖タンパク質のシァリ ルオリゴサッ力ライ ドに結合することを示している。 ファージが柔軟な フィラメント （長さ約 1 ΠΙ、 厚さ 6_10nm)であるので、 このァフィ二ティ 一はファージの立体障害による可能性がある （文献（26) )。 ELISAの結果 (図 2 )に基づく と、 cOl ファージクローンが糖夕ンパク質中のひ 2— 6 結 合したシァリルガラク ト一スと相互作用すると思われる。
(e) 合成 15- merペプチドの糖認識
選 択 さ れ た べ プ チ ド の 糖 認 識 を 知 る た め に 、 H-GWWYKGRARPVSAVA-NH2 (cOlぺプチド、配列番号 1 )の 15- merぺプチドぉ よび H- RAVWRHSVATPSHSV-匪 2 (c03ペプチド、 配列番号 2 )を合成した。 糖 脂質に対するこれらのぺプチドの結合アツセィは、 27MHzの QCM法（27MHz の QCM は、 9MHz より約 10 倍高感度である）によって分析された（文献 (44) -（46))。 糖脂質（GM3、 6'GM3、 LacCer、 GalCerまたは GlcCer)の単分 子膜は、 空気-水界面で調製し、 QCM金表面へ移した。 その後、 ペプチド 溶液を QCMキュベッ トに注入し、 時間でペプチド結合量を経時的に追跡 した（デ一夕は示さない）。 ぺプチドの単分子膜への結合（Am)は、 図 5に 示すようにぺプチド濃度の関数としてプロッ 卜した。
平衡で結合する cOl (黒円）および c03ペプチド （白円）に応答する質量 増加の値は（Δπι, ng cm— 2)、 QCM分析で最終ペプチド濃度 1. (！〜 10 zM の 範囲であった。 最大結合量（Amnax)および解離定数（Kd)を、方程式 II (表 2 )を用いて相 互のプロッ 卜から計算された（文献（44)- (45)、 （47))。 Kd値は、 最大の結 合の 50%を要するぺプチド濃度に相当する。 cOl および c03ぺプチドは、 それぞれ 1.8および 0.34μΜの Kd値で GM3への最も高いァフィ二ティー を有していた。 cOl ペプチドの最大結合量（46ng cm—2)は、 c03 ペプチド (ling cm—2)より大きかった。 しかしながら、 これらのペプチドはさらに 6' GM3 と LacCerへのァフィニティーを有していたが、 Kd値は GM3より高 かった。 これらの 2つのぺプチドは GalCer と GlcCerへの結合が低いか または結合しなかった。 したがつて、 これらのぺプチドが末端 NeuAc - Gal 構造と相互作用したように見えた。 他方では、 コントロールペプチド (H-AETVESCLAKPHTEN-NH2)は、 この研究で使用されたすベてのグリコスフ ィンゴ脂質に結合しなかった（デ一夕は示さない）。 表 2 ガンダリオシドとグリコスフィンゴリピドに結合した合成べプチド
cOlペプチド c03ペプチド
Am
糖脂質 構造 a max
(ng cm ) (μΜ) (ng cm"2) (MM)
GM3 NeuAd- 2-31GalGlcCer 46 ± 2.4 1.8 ± 0.4 11 ±0.1 0.34 ± 0.005
6ΌΜ3 NeuAc(a2-6)Ga] GlcCer 93士 4.6 4.0 ± 1.1 56 ±3.1 7.0 ±2.2
LacCer GalGIcCer 74 ±5.2 4.8 ± 1.6 37 ± 1.8 5.9 ± 1.2
GalCer Ga!Cer 64 ± 4.5 13 ±3.3 <3 -
GlcCer GlcCer n.d.c - n.d. - a ぺプチドにより認識された部分には下線を付してある。
b Διη Χと Kdの値は、 QCM分析（1Ηζ = 0.91 ng cm—2)により得た。
c Not detected 実施例 1 に示すように、 ファージライプラリー選択の方法は、 空気 - 水界面の脂質単分子膜と組合わせて糖脂質結合べプチド配列の決定に用 いられた （文献（35) )。 この方法では、 糖脂質分子が表面圧 30mN m—1で高 度に配向する（0. 4nm2mo l ecu l e—リので、 糖鎖だけが水相に露出する。 した がって、 ファージ粒子は糖鎖おけと相互作用することができる。 この研 究では、 GM3 が細胞表面に存在する主なオリゴ糖であるシァリルガラク トース残基を有するので、 GM3 はァフィ二ティ一選択の標的分子として 使用された。 GM3 結合ファージのプ一ルは 4ラウンドのァフィ二ティー 選択によって豊富化された。 豊富化は、 それぞれのラウンドで水晶発振 子マイクロバランスにより検出され （データは示さない）、 最終的に 6. 5 倍の質量増加が検出された（図 1 )。 第 4ラウンドで観察された QCMの周 波数減少（26Hz)は、 QCM の電極上のファージの飽和結合量に対応してい ると考えられる。
単離された 27のファージクローンの DNA配列から、 Ί種類のぺプチド 配列を推定した。 7つのペプチド配列は、 2 つのコンセンサスモチーフ、 W - xxxA- R および WRx- VxFxS に分類された （表 1 )。 コンセンサスモチ一 フ中のアルギニンおよび芳香性のアミノ酸は、 GM 1 結合性ペプチドにも 認められた （文献（35) )。 更に、 cO l ペプチドの配列は、 GM 1 結合べプチ ド （GWWYKGRARPVSAVA)と同じであった。 選択された配列の c O lおよび c 03 15me r ペプチドを化学合成し、 いくつかの糖脂質への結合ァフィ二ティ —を調べ、ぺプチドとの相互作用に関係する糖部分を決定した（図 5およ び表 2 )。2つのべプチドは、 GM3に対して最低の Kd値を有しているので、 末端 NeuAc-Ga l 構造はべプチドによる炭水化物認識に必要であると考え られた。 したがって、 ペプチドモチーフ中の Arg (I 、 Trp (W) , Al a (A) , Va l (V)、 Phe (F)および Se r (S)が GM3の NeuAc- Ga lギャルとの相互作用に 関与したと考えられた。 糖の水酸基は、 同時に水素結合ドナーおよびァ クセプターとして働く （文献（53)、 （54) )。 多くの場合、 ペプチドのアミ ド基が、 さらに水素結合ドナーとして働き、 ペプチドのカルボ二ル基ま たはカルボン酸基と NeuAcは水素結合ァクセプ夕一として働く。 さらに、 ガラク トピラノース環の B面および NeuAc のメチル基は、 Trp と Phe の 芳香族環と相互作用し得る。 GM3 結合ペプチドのコンセンサスモチーフ は糖結合アミノ酸から構成されていた。 したがってこれらのぺプチドは、 水素結合およびヴァンデルヮ一ルス相互作用によって NeuAc- Gal 部分を δ忍喊し ί守る。
シァリルガラク トース （NeuAc- Gal)構造は、糖タンパク質と糖脂質中の 末端糖配列である。マウス B16マラノーマ細胞は主として GM3を発現し、 他のガンダリオシドをほとんど発現しないので、 B16 細胞は、 選択され たファ一ジの細胞表面上の GM3 とのァフィ二ティ一を決定するのに用い られた（文献（13)、 （15)、 （49)- (50))。 B16細胞が選択されたファージク ローンとインキュベートされたとき、 cOl ファージクローンのみが細胞 へ結合した（図 3)。 細胞のシアル酸の脱離および遊離の N-ァセチルノィ ラミン酸の添加は、 細胞へのファージの結合阻害をもたらした。 これら の結果は、 cOl ファージクローンの結合が糖タンパク質中のシアル酸残 基によって仲介されていることを示した。 cOl ファージクローンは Neu 2→3Galおよび Neu 2→6Gal結合の両方に対するァフィ二ティーを有 し、 c03 ファージクローンは、 Neu a 2→3Gal 結合に対するァフィ二ティ 一を有していた（図 2 )。 したがって、 ファージクローン cOl のみが B 16 細胞の細胞表面の Neua 2→6Gal と相互作用することがわかった。 GM3は B16 細胞の細胞表面上で発現されるが、 細胞に対するファージの結合は 認められなかった。 また、 ノィラミニダ一ゼは、 GM3 の NeuAc を消化す ることはできなかった。 これらの結果は、 大きな分子（ファージクローン および酵素のような）が B16細胞上の GM3に接近することができないこと を示した。
〔実施例 2〕 ィンフルェンザウィルスの感染の抑制実験
プラークアツセィ
インフルエンザウイルスの感染の阻害を MDCK 細胞上のプラークアツ セィにより決定した。 6ゥエルプレート中の MDCK細胞は、 リボソームあ るいはペプチド含有リボソームを含むインフルエンザ A/PR/8/34 ウィル ス溶液（100 - 200pfu、 pfu とはプラーク形成ュニッ ト） 0.2 mL とィンキュ ベ一卜した。 5%の C02の下での 37°C、30分間のィンキュベーションの後、 上清を除去し、 細胞を PBS を用いて洗浄した。 0.6%のァガロース （0.01% の 0-ジェチルアミノエチルセルロースデキス トラン、 0. l%NaHC03、 0.01 H g/mL ァセチルトリプシンを含む 2XMEM+BSA 2 mL (1 つのゥエル当た り）を添加し、 2 日間インキュベートした。 生細胞をクリスタルバイオレ ッ ト溶液（20%のエタノール中 lmg/mL)で染色し、 プラークの数をカウン トした。 最高感染活性（100%)はリボソームのない場合のプラークの数と して定義した。 ペプチド含有リボソームの IC5。値（50%抑制濃度）は、 log[i/(l-f)]と log [ペプチド含有リボソーム] 、 ここで f は感染活性割 合である、 の間のプロッ トから得られた。
MDCK細胞へのィンフルェンザウィルスの感染のぺプチド含有リポソ一 ムによる阻害の検討の結果は以下の通りであった。
MDCK細胞へのィンフルェンザウィルスの感染のぺプチド含有リポソ一 ムによる阻害をプラークアツセィにより決定した。 ペプチドはステア口 ィル基を用いて、 N-末端でァシル化し、 PC/コレステロールリボソーム（ぺ プチド含有リポソ一ム）に組み込んだ。合成 cOlおよび c03ぺプチドの両 方が NeuAc 2→3Gal および NeuAc 2→6Gal構造へのァフィニティーを 有していたので、 ペプチド含有リボソームは、 MDCK細胞上のシァリルォ リゴサッカライ ドと結合し得る。 ペプチド含有リポソームの存在下で、 MDCK細胞へのィンフルェンザ A/PR/8/34ウィルス（H1N1)の感染は阻害さ れた（図 6 )。
MDCK細胞を、 cOl ペプチド含有リボソーム（黒円）、 c03 ペプチド含有 リボソーム（白円）またはリボソームのみ（黒三角形）の存在下で、 インフ ルェンザ A/PR/8/34ウィルスとともに 30分間インキュベートした。細胞 を洗浄し、 2 日間インキュベートした。 次いで、 生細胞を染色し、 ブラ 一クの数をカウントした。 cOlおよび c03のペプチド含有リボソームの IC5Q値は、 それぞれ 0.36 および 0.37mMであった（表 3 )。 コントロールべプチド配列は阻害を示さ なかった。 cO 1 および c03 ファ一ジクローンは、 インフルエンザウィル スへのァフィ二ティ一を有していなかった（データは示さない）。従って、 MDCK細胞表面へのこれらのリボソームの結合がインフルエンザウイルス の感染を阻害することが示された。 . 表 3 リポソ一ム中の N-ステアロイルペプチドによるインフルエンザ A型ウイ ルス感染の阻害 リボソーム P^Z:コレステ σ―ノレ/
、ノ ド Nステアロイルペプチド IC50
(mol:mo]:md) (HIM) cOlペプチドノリポソーム 20:10:3 Ci7H35CO-GWWYKGRARPVSAVA- ■NH2 0.36
c03ペプチドノリポソーム 20:10:3 Ci7H35CO-RAVW HSVA PSHSV- -NH2 0.37
pillペプチド リポソーム 20:10:3 C17H3sCO-AETVESCI,AKPHTEN- ■NH2 > 10
リボソーム 20:10:0 - > 10 また、 同様の実験をガンダリオシド GM3結合性ペプチドである cOlぺ プチドおよび c03ぺプチドならびにィンフルェンザへマグルチニン結合 性ペプチド A- 1 (ARLSPTMVHPNGAQP (配列番号 8)) を含有するリポソ一 ムを用いて行った。 図 7に結果を示す。 図 7中、 横軸はリボソーム中の eggPC の濃度 （mM) を示し、 縦軸は感染阻害率 （％) を示す。 感染阻害 率は、 ペプチドを含有しないリボソームを添加した場合のプラークの数 に対して、 ぺプチド含有リボソームを添加した場合のプラークの数の減 少率で示した。 図 7に示すように、 いずれのペプチドもインフルエンザ ウィルスの感染を阻害し、 ガンダリオシド GM3結合性ペプチドの阻害率 がより高かった。 eggPC濃度が ΙιηΜ (ペプチド濃度 0.15mM) のときの感 染阻害率は、 cOlペプチドが 83%、 c03ペプチドが 94%、 A1ペプチドが 76%であった。
多くの種類の毒素およびウィルスは、 初期の感染ステツプで細胞表面 の糖鎖を認識する （文献（6) )。 アミロイ ド /3タンパク質もガンダリオシ ド GM 1 と相互作用し、 アミロイ ド- GM 1複合体が線維形成をもたらすと考 えられる（文献（55)、 （56) )。 病原性分子および糖鎖の間の相互作用を阻 害するいくつかの化合物は、 医学応用するために開発されている （文献 (57)、 （58) )。 本発明において、 インフルエンザウイルスの抑制剤として の機能を評価するために、 合成ペプチドをリボソームに導入した。 ぺプ チドをアミノ末端をステアロイル基でァシル化し、疎水性部分を与えた。 期待通り、 ペプチド含有リボソームは、 MDCK細胞へのインフルエンザゥ ィルス （H 1N 1 タイプ）の感染を阻害した（図 6)。 ィンフルェンザ A型ウイ ルス A/PR/8/34 (HIN 1)の赤血球凝集素のセロタイプ H Iは、 NeuAc a→3Ga l 結合に特異的である。 MDCK細胞は、 α 2→3 および α 2→6 結合シアル酸 の両方を細胞表面に有している （文献（59) )。ペプチドリボソームは MDCK 細胞のシァリルガラク ト一ス部分に結合し、 MDCK細胞上のシァリルガラ ク トース受容体へのインフルエンザウイルスの結合を阻害した。 最近、 滝川らは、 糖模倣ペプチドを含むリボソームが癌細胞へ結合し、 癌細胞 の転移を阻害したと報告した （文献（58) )。 機能的ペプチドのリボソーム 中への導入は細胞-細胞および細胞-ウィルス相互作用を阻害する有効な 方法になり得る。
ファージライブラリ一選択によってシァリルガラク トース部分を認識 する 15me rペプチド配列を得た。 得られたペプチドは、 糖脂質単分子膜 の糖鎖へのァフィ二ティーだけでなく、 細胞表面の糖タンパク質へのァ フィニティーも有していた。 細胞表面へのペプチドの結合は、 インフル ェンザウィルス感染を有意に阻害した。 本発明で選択されたべプチドは ィンフルェンザウィルス抑制剤として用い得る。 以下、 本発明において参照した文献リス トを掲げる。 本明細書中で下 記文献を参照する場合は、 文献番号を示した。
文献リスト 1. Varki, A. (1993) Glycobiology 3, 97-130
2. Dwek, R. A. (1996) Chem. Rev. 96, 683-720
3. Weis, W. I. , and Drickamer, K. (1996) Annu. Rev. Biochem. 65, 441-473
4. Lis, H. , and Sharon, N. (1998) Chem. Rev. 98， 637-674
5. Phillips, M. L. , Nudelman, E. , Gaeta, F. C. A. , Perez, M.， Singnhal A. K. , Hakomori, S. -I. , and Paulson, J. C. (1990) Science, 250, 1130-1132
6. Karlsson, K. -A. (1989) Annu. Rev. Biochem. 58, 309-350
7. Kolter, T. , and Sandhof f, K. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38， 1532-1568
8. Hakomori, S. , Yamamura, S. , and Handa, A. K. (1998) Ann. N. Y. Acad. Sci. 845, 1-10
9. Thompson, T. E. , and Tillack, T. W. (1985) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 361-386
10. Anderson, R. G. W. (1998) Annu. Rev. Biochem. 67, 199-225
11. Hakomori, S. -I. (2000) Glycoconj. J. 17, 143-151
12. Galbiati, F. , Razani, B. , and Lisanti, M. P. (2001) Cell 106, 403-411
13. Iwabuchi, K. Zhang, Y. , Handa, K. , Withers, D. A.， Sinay, P. , and Hakomori, S (2000) J. Biol. Chem. 275, 15174-17181
14. Prinetti, A. Iwabuchi, K.， and Hakomori, S. (1999) J. Biol. Chem. 274, 20916-20924
15. Iwabuchi, K. , Yamamura, S. , Prinetti, A. , Handa, K. , and Hakomori S. (1998) J. Biol. Chem. 273, 9130-9138
16. Yuan, C. , and Johnston, L. J. (2000) Biophys. J. 79, 2768-2781
17. Mou, J. , Yang, J. , and Shao, Z. (1995) J. Mol. Biol. 248, 507-512
18. Vie, V. , Mau, N. V. , Lesniewska, E. , Goudonnet, J. P. , He i tz, F. , and Le Grimellec, C. (1998) Langmuir 14, 4574-4583
19. Sato, T. (2001) Trends Glycosci. Glycotechnol. 13, 231-238
20. Hashizume, M.， Sato, T, , and Okahata, Y. (1998) Chein. Lett. , 399-400
21. Sato, T. , Ser i zawa, T. , O take, F. , Nakamura, M. , Terabayashi, T. , Kawanishi, Y. , and Okahata, Y. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1380, 82-92
22. Sato, T. , Serizawa, T.， and Okahata, Y. (1996) Biochim. Biophys. Acta 1285, 14-20
23. Sears, P. , and Wong, C. -H. (1999) Angew. Chem. Int. Ed. 38, 2300-2324
24. Feizi, T. (1985) Science 314, 53-57
25. Scott, J. K. , and Smith, G. P. (1990) Science 249, 386-390
26. Smith, G. P. , and Scott, J. K. (1993) Methods Enzymol. 217, 228-257
27. Yamamoto, K. , Maruyama, I. N. , and Osaka, T. (2000) J. Biochem. (Tokyo) 127, 137-142
28. Wang, L. , Radic, M. Z. , Siegel, D. , Chang, T.， Bracy, J. , and Galili, U. (1997) Mol. Immunol. 34, 609-618
29. Peletskaya, E. N.， Glinsky, V. V. , Glinsky, G. V. , Deutscher, S. L.， and Quinn, T. P. (1997) J. Mol. Biol. 270, 374-384
30. Peletskaya, E. N.， Glinsky, G.， Deutscher, S. L. , and Quinn, T. P. (1996) Mol. Divers. 2, 13-18
31. Gui, J.， Moyana, T. , and Xiang, J. (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun. 218, 414-419
32. Gui, J. , Moyana, T. , Malcolm, B. , and Xiang, J. (1996) Proteins 24, 352-358
33. Mao, S. , Gao, C. , Lo, C. H. , Wirsching, P. , Wong, C. -H. , and Janda K. D. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 96, 6953-6958
34. Dinh, Q. , Weng, N. P.， Kiso, M. , Is ida, H.， Hasegawa, A.， and Marcus, D. M. (1996) J. Immunol. 157, 732-738
35. Matsubara, T. , Ishikawa, D. , Taki, T.， Okahata, Y. , and Sato, T. (1999) FEBS Lett. 456, 253-256
36. Qiu, J. X. , Kai, M.， Eduardo, A. P. , and Marcus, D. M. (1999) J. Neuroi画 nology 97, 172-181
37. van Kuppevel t, T. H.， Denni ssen, M. A. , van Venrooi j, W. J. , Hoet, R. M. , and Veerkamp, J. H. (1998) J. Biol. Chem. 273, 12960-12966
38. Burg, M. A. , PasQual ini, R.， Arap, W. , Ruosla ti, E.， and Stallcup, W. B. (1999) Cancer Res. 59, 2869-2874
39. Reason, D. ， Wagner, T. C.， and Lucas, A. H. (1997) Infect. Im議. 65, 261-266
40. Deng, S. , MacKenzie, C. R. , Sadowska, J. , Michniewicz, J. , Young, N. M.， Bundle, D. R. , and Narang, S. A. (1994) J. Biol. Chem. 269, 9533-9538
41. Williams, M. N. V. , Freshour, G.， Darvill, A. G. , Albersheim, P. , and Hahn, M. G. (1996) Plant Cell 8, 673-685
42. Hashizume, M.， Sato, T. , and Okahata, Y. , in preparat ion.
43. Nis i, T. , Budde, . J. A. , McMurry, J. S. , Obeyesekere, N. U. , Safdar, N. , Levin, V. A. , and Saya, H. (1996) FEBS Lett. 399, 237-240
44. Okahata, Y.， Ni ikura, K. , Sugiura, Y. , Sawada, M. , and Morii, T. (1998) Biochemistry 37, 5666-5672
45. Niikura, K. , Matsuno, H.， and Okahata, Y. (1999) Chem. Eur. J. 5, 1609-1616
46. Niikura, K. , Matsuno, H. , and Okahata, Y. (1998) J. Am. Chem.
120, 8537-8538
Sauerbrey, G. (1959) Z. P ys. 48. Ebara, Y.， and Okahata, Y. (1994) J. Am. Chem. Soc. 116, 11209-11212
49. Moretti, S. , Montorfano, G. , Rapelli, δ. , and Berra, B. (1997) ITAL. J. Bio 46, 187-195
50. Schroeder, F. , and Gardiner, J. M. (1984) Cancer Res. 44， 3262-326
51. Corf ield, A. P. , Higa, H. , Paulson, J. ， and Schauer, . (1983) Biochim. Biophys. Acta 744, 121-126
52. Suzuki, Y.， Nagano, Y.， Kato, H, , Matsumoto, M. , Nerome, K.， Nakaj ima, K. , and Nobusawa, E. (1986) J. Biol. Chem. 261, 17057-17061
53. Weis, H. , and Sharon, N. (1998) Chem. Rev. 98, 637-6
54. Quiocho, F. A. (1989) Pure & Appl. Chem. 61, 1293-1306
55. Yanagisawa, K. , Odaka, A. , Suzuki, N. , and Ihara, Y. (1995) Nature Med. 1, 1062-1066
56. Kakio, A. , Nishimoto, S. , Yanagisawa, K. , Kozutsumi, Y.， Matsuzaki, K. (2001) J. Biol. Chem. 276, 24985-24990
57. Totani, K. , Kubota, T,， Kuroda, T. , Murata, T. , Hidari, K. I. -P. J. , Suzuki, T. , Suzuki, Y. , Kobayashi, K.， Ashida, H. , Yamamoto, K. , and Usui, T. (2003) Glycobiology 13， 315-326
58. Takikawa, M. , Kikkawa, H. , Asai, T.， Yamaguchi, N. , Ishika a, D. , Tanaka, M.， Ogino, K. , Taki, T. , and Oku, N. (2000) FEBS Lett. 466, 381-384
59. Stray, S. J. , Cummings, R. D. , and Air, G. M. (2000) Glycobiology 10, 649-658 産業上の利用可能性
本発明により、 ィンフルェンザウィルスが宿主細胞に結合するのを宿 主細胞の受容体をプロックすることにより阻害するィンフルェンザウイ ルス感染抑制剤が提供される。
本発明のィンフルェンザウィルス感染抑制剤は、 宿主細胞の受容体を ブロックするため、 インフルエンザウイルス感染前の被験体に投与して も、 その後のインフルエンザウイルスの感染を抑制することができるの で、 効果的な感染予防剤として用いることができる。 また、 本発明のィ ンフルェンザウィルス感染抑制剤は、 細胞のィンフルェンザウィルスが 認識する受容体をプロックするため、 ィンフルェンザウィルスの型を問 わず、 感染を抑制することができ、 A型や B 型のヒ 卜から分離されたィ ンフルェンザウィルスだけでなく、 トリから分離されたインフルエンザ ウィルス等の感染抑制にも用いることができる。 さらに、 インフルェン ザウィルスが感染した後も、 出芽により増殖したィンフルェンザウィル スが再び細胞に感染するのを抑制することができるので、 インフルェン ザ治療薬としても効果的に用いることができる。 本発明のインフルェン ザウィルス抑制剤の有効成分はアミノ酸十数個からなるペプチドである ため、 合成も製剤も容易であり、 種々の形態の医薬組成物として利用す ることが可能である。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書 に取り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想 およぴ発明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更 が可能であることは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこ のような変形および変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1 . シァリルガラク 卜ース基結合性ペプチドを有効成分として含有す るインフルエンザウイルス感染抑制剤。
2 . シァリルガラク トース基結合性べプチドがガンダリオシド GM3 結 合性ペプチドである、 請求項 1記載のインフルエンザウイルス感染抑制 剤。
3 . 以下の（a)又は（b)のシァリルガラク ト一ス基結合性べプチドを有 効成分として含有する請求項 1記載のィンフルェンザウィルス感染抑制 剤。
(a) 配列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列からなるぺプチド
(b) 配列番号 1または 2で表わされるアミノ酸配列において 1 若しく は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、 かつシァリルガラク トース基結合活性を有するぺプチド
4 . シァリルガラク 卜ース基結合性べプチドがアルキル化または脂質 化されている請求項 1から 3のいずれか 1項に記載のインフルエンザゥ ィルス感染抑制剤。
5 . シァリルガラク トース基結合性べプチドがリボソームに含有され ている請求項 1から 3のいずれか 1項に記載のィンフルェンザウイルス 感染抑制剤。
6 . インフルエンザウイルスが、 A型インフルエンザ、 B型インフルェ ンザおよび C型ィンフルェンザからなる群から選択される請求項 1から 5のいずれか 1項に記載のィンフルェンザウィルス感染抑制剤。
7 . インフルエンザウイルスが、 トリインフルエンザまたはプ夕イン フルェンザである請求項 1から 5のいずれか 1項に記載のィンフルェン ザウィルス感染抑制剤。
8 . さらに医薬的に許容できる担体を含む、 請求項 1から 7のいずれ か 1項に記載のィンフルェンザウィルス感染抑制剤。
9 . 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載のィンフルェンザウィルス 抑制剤を非ヒ ト動物に投与することを含む、 インフルエンザを予防また は治療する方法。
1 0 . 非ヒ ト動物が、 トリまたはブ夕である請求項 9記載のインフル ェンザを予防または治療する方法。
PCT/JP2004/003031 2004-03-09 2004-03-09 インフルエンザウイルス感染抑制剤 WO2005084694A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2004/003031 WO2005084694A1 (ja) 2004-03-09 2004-03-09 インフルエンザウイルス感染抑制剤
JP2006510604A JPWO2005084694A1 (ja) 2004-03-09 2004-03-09 インフルエンザウイルス感染抑制剤
US10/592,253 US20090098195A1 (en) 2004-03-09 2004-03-09 Influenza virus infection suppressor
CA002559067A CA2559067A1 (en) 2004-03-09 2004-03-09 Influenza virus infection suppressor
EP04718765A EP1728515A4 (en) 2004-03-09 2004-03-09 INHIBITOR OF INFLUENZA VIRUS INFECTION
CNA2004800427656A CN1938041A (zh) 2004-03-09 2004-03-09 流感病毒感染抑制剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2004/003031 WO2005084694A1 (ja) 2004-03-09 2004-03-09 インフルエンザウイルス感染抑制剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005084694A1 true WO2005084694A1 (ja) 2005-09-15

Family

ID=34917859

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/003031 WO2005084694A1 (ja) 2004-03-09 2004-03-09 インフルエンザウイルス感染抑制剤

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20090098195A1 (ja)
EP (1) EP1728515A4 (ja)
JP (1) JPWO2005084694A1 (ja)
CN (1) CN1938041A (ja)
CA (1) CA2559067A1 (ja)
WO (1) WO2005084694A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010024108A1 (ja) * 2008-08-29 2010-03-04 学校法人慶應義塾 インフルエンザウイルス感染症の予防ないし治療剤

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2411526A4 (en) * 2009-03-27 2012-09-19 Zacharon Pharmaceuticals Inc MODULATORS OF GANGLIOSID BIOSYNTHESIS
US10087226B2 (en) * 2014-03-11 2018-10-02 Universite D'aix-Marseille Chimeric peptide that interacts with cell membrane gangliosides
CN111393512B (zh) * 2020-03-24 2021-03-02 北京中科微盾生物科技有限责任公司 一种抑制流感病毒的多肽及其在制备预防和治疗流感病毒感染药物中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05279379A (ja) * 1992-03-31 1993-10-26 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ガングリオシドｇｍ３組成物及びその製造法
WO1997022615A1 (fr) * 1995-12-18 1997-06-26 Daikin Industries, Ltd. Analogues de gangliosides fluores gm3 et leurs intermediaires
JPH1072355A (ja) * 1996-08-29 1998-03-17 Snow Brand Milk Prod Co Ltd インフルエンザウイルス吸着阻止剤
JP2000253900A (ja) * 1999-01-05 2000-09-19 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 糖脂質に結合するペプチドの選別方法
WO2000059932A1 (fr) * 1999-03-31 2000-10-12 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides se liant a l'hemagglutinine du virus de la grippe
JP2001233773A (ja) * 2000-02-22 2001-08-28 Toko Yakuhin Kogyo Kk 抗ウイルス剤
JP2002284798A (ja) * 2001-03-27 2002-10-03 Keio Gijuku インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05279379A (ja) * 1992-03-31 1993-10-26 Snow Brand Milk Prod Co Ltd ガングリオシドｇｍ３組成物及びその製造法
WO1997022615A1 (fr) * 1995-12-18 1997-06-26 Daikin Industries, Ltd. Analogues de gangliosides fluores gm3 et leurs intermediaires
JPH1072355A (ja) * 1996-08-29 1998-03-17 Snow Brand Milk Prod Co Ltd インフルエンザウイルス吸着阻止剤
JP2000253900A (ja) * 1999-01-05 2000-09-19 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 糖脂質に結合するペプチドの選別方法
WO2000059932A1 (fr) * 1999-03-31 2000-10-12 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Peptides se liant a l'hemagglutinine du virus de la grippe
JP2001233773A (ja) * 2000-02-22 2001-08-28 Toko Yakuhin Kogyo Kk 抗ウイルス剤
JP2002284798A (ja) * 2001-03-27 2002-10-03 Keio Gijuku インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATSUBARA T.: "Ganglioside-binding peptides selected from a combinatorial library and their carbohydrate recognition", TRENDS IN GLYCOSCIENCE AND GLYCOTECHNOLOGY, vol. 13, no. 73, 2001, pages 557 - 560, XP002980251 *
See also references of EP1728515A4 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010024108A1 (ja) * 2008-08-29 2010-03-04 学校法人慶應義塾 インフルエンザウイルス感染症の予防ないし治療剤
JPWO2010024108A1 (ja) * 2008-08-29 2012-01-26 学校法人慶應義塾 インフルエンザウイルス感染症の予防ないし治療剤
JP5583017B2 (ja) * 2008-08-29 2014-09-03 学校法人慶應義塾 インフルエンザウイルス感染症の予防ないし治療剤

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2005084694A1 (ja) 2008-01-17
CA2559067A1 (en) 2005-09-15
US20090098195A1 (en) 2009-04-16
EP1728515A1 (en) 2006-12-06
EP1728515A4 (en) 2009-03-18
CN1938041A (zh) 2007-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6676589B2 (ja) 薬物動態特性の改善されたコンプスタチンアナログ
Hendricks et al. Sialylneolacto-N-tetraose c (LSTc)-bearing liposomal decoys capture influenza A virus
JP4528989B2 (ja) インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド
CA2674269C (en) Three component glycolipopeptides
CN111375055B (zh) 一种2019-nCoV亚单位疫苗组合物及其免疫方法
US8828929B2 (en) Cytotoxic T cell epitope peptide for SARS coronavirus, and use thereof
FI109969B (fi) Menetelmä fosfolipidikaksikerrosrakkuloiden valmistamiseksi
JP2002514892A (ja) 遺伝子治療における合成ウイルス様粒子の使用
CN101262881A (zh) 通过交叉β结构的佐剂化
US11267853B2 (en) Carbohydrate tethering at cell surfaces to induce immune response
KR101415864B1 (ko) 면역학적 활성 조성물
JP4651213B2 (ja) インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン結合性ペプチド
JP2022502392A (ja) 経口剤形の製造方法
US20230256082A1 (en) Vaccine against human-pathogenic coronaviruses
Sedaghat et al. Synthesis of mannosylated lipopeptides with receptor targeting properties
JP5778692B2 (ja) 疾病抑制剤
WO2005084694A1 (ja) インフルエンザウイルス感染抑制剤
US20140147476A1 (en) Organic nanotube having hydrophobized inner surface, and encapsulated medicinal agent prepared using the nanotube
KR102017973B1 (ko) 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제
JP2007145777A (ja) インフルエンザウイルス感染阻害方法
JP2006101709A (ja) ヘマグルチニン結合ペプチド、インフルエンザウイルス感染阻害剤、リポソーム、インフルエンザ治療薬、インフルエンザ予防薬
JP5818319B2 (ja) 脂質膜構造体に細胞透過能を付与および／または脂質膜構造体の細胞透過能を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドと結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体
CN113813375A (zh) 一种新型抗新冠病毒复合物的组成及其在防治冠状病毒感染疾病药物中的应用
EP4108251A1 (en) Griffithsin for use in a method of preventing or treating infections with respiratory viruses

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200480042765.6

Country of ref document: CN

AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006510604

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2559067

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004718765

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004718765

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10592253

Country of ref document: US