WO2005083115A2 - Verfahren zur erkennung von sepsis - Google Patents

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WO2005083115A2
WO2005083115A2 PCT/EP2004/014310 EP2004014310W WO2005083115A2 WO 2005083115 A2 WO2005083115 A2 WO 2005083115A2 EP 2004014310 W EP2004014310 W EP 2004014310W WO 2005083115 A2 WO2005083115 A2 WO 2005083115A2
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Stefan Russwurm
Hans-Peter Deigner
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Sirs-Lab Gmbh
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    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
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    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a method for in vitro differentiation between generalized, inflammatory, non-infectious states and generalized, inflammatory, infectious states according to claim 1.
  • the present invention relates to the use of gene activity markers for the diagnosis of sepsis.
  • the present invention relates to new diagnostic possibilities which can be derived from experimentally verified findings in connection with the occurrence of changes in gene activities (transcription) in patients with SIRS and sepsis.
  • SIRS and sepsis are diseases that occur very frequently in patients in intensive care units and contribute significantly to mortality [2 -3].
  • the mortality rate is approx. 20% in SIRS, approx. 40% in sepsis and increases to 70-80% when multiple organ dysfunctions develop [4-6].
  • the morbidity and lethality contribution of SIRS and sepsis is of interdisciplinary clinical medical importance, because this increasingly jeopardizes the treatment success of the most advanced therapeutic procedures in numerous medical specialties (e.g.
  • sepsis is a disease that is caused by pathogenic microorganisms.
  • molecular control and infection site On the ground of exhaustion, molecular control and infection site
  • SIRS is the systemic response of the inflammatory system to an infectious or non-infectious stimulus
  • at least two of the following clinical criteria must be met: fever> 38 ° C or hypothermia ⁇ 36 ° C, leukocytosis> 12G / I or leukopenia ⁇ 4G / I or a left shift in the differential blood count, a heart rate of over 90 / min, a tachypnea> 20 breaths / min or a PaCO2 (partial pressure of carbon dioxide in the arterial blood) ⁇ 4.3 kPa.
  • Sep Clinical conditions are defined in which the SIRS criteria are met and an infection is causally proven or at least very likely. Severe sepsis is characterized by the additional occurrence of organ malfunctions.
  • the aim is to establish a system for assessing the severity of sepsis, which enables patients to be classified based on their individual patient response based on their predisposing conditions, the type and extent of the infection, the type and severity of the host response, and the degree of accompanying organ dysfunction .
  • the system described is called PIRO, abbreviated to the English terms for "predisposition”, “insult infection”, “response” and "organ dysfunction”.
  • the individual probability of survival and potential response to therapy can then be derived from this [23].
  • non-infectious conditions that are currently subsumed under [1] under the term SIRS should be classified more precisely according to the individual severity of the SIRS.
  • Biomarkers are also sought for this, which reflect the severity of the SIRS also at the molecular level and enable a clear differentiation from infectious states (currently classified as sepsis according to [1]). Similar stages are already being used successfully by other medical disciplines, for example to classify the various stages of disease in the field of oncology (TNM system, [24]).
  • An essential criterion for the diagnosis of sepsis is the detection of an infection in addition to the generalized inflammatory reaction.
  • the pathogens could only be detected in approx. 10% of all blood cultures.
  • microarray technologies now enable the person skilled in the art to compare 10,000 or more genes and their gene products at the same time.
  • the use of such microarray technologies can now provide information on the status of health, regulatory mechanisms, biochemical interactions and signal transmission networks. Improving understanding of how an organism responds to infections should facilitate the development of enhanced detection, diagnosis and treatment modalities for sepsis disorders.
  • Microarrays are derived from "Southern blotting" [27], which is the first approach to immobilize DNA molecules in a spatially responsive manner on a solid matrix.
  • the first microarrays consisted of DNA fragments, often with an unknown sequence, and were spotted on a porous membrane (usually nylon), cDNA, genomic DNA or plasmid libraries were routinely used and the hybridized material was labeled with a radioactive group [28-30].
  • microarrays can in principle be used for the diagnosis of sepsis and conditions similar to sepsis.
  • RNA gene expression markers
  • the starting point for the invention disclosed in the present patent application is the knowledge that gene activities of different genes in biological samples of an individual, in which sepsis-typical symptoms (as defined in [1]) are determined, differ from the gene activities of the same genes in Differentiate samples from individuals diagnosed with SIRS. These differences in gene activity therefore allow patients with a sepsis, i.e. an additional infectious complication, to be distinguished from patients without this infectious complication (SIRS corresponding [1]). As already stated elsewhere, this distinction has so far been associated with considerable disadvantages, but is very significant for the initiation of specialized medical therapy and thus for improving the individual prognosis for survival.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method which makes it possible to distinguish between generalized, inflammatory, non-infectious states (SIRS according to [1]) and generalized, inflammatory, infectious states (sepsis according to [1]). This object is achieved by a method with the characterizing features of claim 1.
  • the present invention is based on the object of making it possible to use markers in a method according to claims 1-25.
  • the method according to the invention is characterized in that the activity of one or more marker genes is determined in a sample of a biological fluid of an individual and a distinction can be made between SIRS and sepsis (both according to [1]) from the presence and / or amount of the determined gene product.
  • One embodiment of the invention is characterized in that the method for in vitro differentiation between SIRS and sepsis comprises the following steps: a) isolating sample RNA from a biological sample; b) labeling the sample RNA and / or at least one DNA which is a specific gene activity and / or a specific gene or gene fragment for distinguishing between SIRS and sepsis (both according to [1]), with a detectable marker contacting of Control RNA, with at least one DNA, under hybridization conditions, the DNA being a gene or gene fragment specific for differentiating between SIRS and sepsis; c) quantitative detection of the marker signals of the hybridized sample RNA and the control RNA; d) Comparing the quantitative data of the marker signals in order to make a statement as to whether specific genes or gene fragments are expressed more or less in the sample than in the control in order to differentiate between SIRS and sepsis (both according to [1]).
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the control RNA is hybridized with the DNA before the
  • Another embodiment of the invention is characterized in that mRNA is used as the sample RNA.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that the DNA is arranged, in particular immobilized, on a support in the form of a microarray at predetermined areas.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the method is used for early differential diagnosis, for checking the therapeutic course and for risk assessment for patients.
  • sample is selected from: body fluids, in particular blood, liquor, urine, ascites fluid, seminal fluid, saliva, punctate; Cell content or a mixture thereof.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that cell samples are optionally subjected to a lytic treatment in order to release their cell contents.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that the biological sample is that of a human.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the gene or gene fragment specific for distinguishing SIRS and sepsis is selected from the group consisting of SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 91, and gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides.
  • SEQ-ID No. 1 to SEQ-ID No. 91 and gene fragments thereof with at least 5-2000, preferably 20-200, more preferably 20-80 nucleotides.
  • sequences with sequence ID: 1 to sequence ID: 91 are included within the scope of the present invention and are disclosed in detail in the attached 42-page, 91 sequence sequence sequence, which is thus part of the invention.
  • This sequence listing also includes an assignment of the individual sequences with sequence ID: 1 to sequence ID: 91 to their GenBank Accession No. (Internet access via http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
  • Another embodiment of the invention is characterized in that the immobilized or free probes are labeled.
  • Self-complementary oligonucleotides so-called molecular beacons, are used as probes for this embodiment. They carry a fluorophore / quencher pair at their ends, so that they are present in the absence of a complementary sequence in a folded hairpin structure and only deliver a fluorescence signal with a corresponding sample sequence.
  • the hairpin structure of the molecular beacons is stable until the sample hybridizes to the specific catcher sequence sequence, which leads to a change in conformation and thus to the reporter fluorescence being released.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least 2 to 100 different cDNAs are used.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that at least 200 different cDNAs are used.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that at least 200 to 500 different cDNAs are used.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least 500 to 1000 different cDNAs are used.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that at least 1000 to 2000 different cDNAs are used.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the genes listed in claim 10 are replaced as DNA by sequences derived from their RNA, synthetic analogs, aptamers and peptide nucleic acids.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the synthetic analogs of the genes comprise 5-100, in particular approximately 70 base pairs.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that all the markers are used with rraaddiicoactive markers, in particular P, C, 125 l, 155 Ep, 33 P or 3 H.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that a non-radioactive marker, in particular a color or fluorescent marker, an enzyme marker or immune marker, and / or quantum dots or an electrically measurable signal, in particular potential and / or conductivity and / or change in capacity in hybridizations.
  • a non-radioactive marker in particular a color or fluorescent marker, an enzyme marker or immune marker, and / or quantum dots or an electrically measurable signal, in particular potential and / or conductivity and / or change in capacity in hybridizations.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the sample RNA and control RNA and / or enzymatic or chemical derivatives have the same label.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the sample RNA and control RNA and / or enzymatic or chemical derivatives have different labels.
  • Another embodiment of the invention is characterized in that the DNA probes are immobilized on glass or plastic.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the individual DNA molecules are immobilized on the carrier material via a covalent bond.
  • a further embodiment of the invention is characterized in that the individual DNA molecules are immobilized on the carrier material by means of electrostatic and / or dipole, dipole and / or hydrophobic interactions and / or hydrogen bonds.
  • a further embodiment of the invention consists in the use of recombinantly or synthetically produced, to distinguish between SIRS and sepsis (both according to [1]) specific nucleic acid sequences, partial sequences individually or in subsets as calibrators in sepsis assays and / or for evaluating the effect and Toxicity in drug screening and / or for the production of therapeutic agents and substances and mixtures of substances intended as therapeutic agents for the prevention and treatment of SIRS and sepsis.
  • Marker genes in the sense of the invention are understood to be all derived DNA sequences, partial sequences and synthetic analogs (for example peptido nucleic acids, PNA).
  • the description of the invention relating to the determination of gene expression at the RNA level does not constitute a restriction, but only an exemplary application.
  • Biological fluids in the sense of the invention are understood to mean all human body fluids.
  • One application of the method according to the invention is in measuring differential gene expression to differentiate between SIRS and sepsis (both in accordance with [1]).
  • the RNA is isolated from the whole blood of corresponding patients and a control sample from a healthy subject or non-infectious patient.
  • the RNA is then labeled, for example radioactively with 32 P or with dye molecules (fluorescence). All molecules and / or detection signals known in the prior art for this purpose can be used as marking molecules. Corresponding molecules and / or methods are also known to the person skilled in the art.
  • RNA labeled in this way is then hybridized with DNA molecules immobilized on a microarray.
  • the DNA molecules immobilized on the microarray represent a specific selection of the genes according to claim 10 of this invention for distinguishing between SIRS and sepsis.
  • the intensity signals of the hybridized molecules are then measured by suitable measuring devices (phosphor imager, microarray scanner) and analyzed by further software-supported evaluations.
  • the expression ratios between the patient sample and the control are determined from the measured signal intensities.
  • the expression ratios of the under- and / or over-regulated genes, as in the experiments shown below, allow conclusions to be drawn about the distinction between SIRS and sepsis.
  • a further application of the method according to the invention consists in measuring the differential gene expression for the therapy-accompanying determination of the probability that patients will respond to the planned therapy and / or for the determination of the response to a specialized therapy and / or to determine the end of therapy in Meaning of a "drug monitoring" in patients with SIRS and sepsis.
  • the RNA sample RNA
  • the different RNA samples are labeled together with the control sample and hybridized with selected genes according to claim 10 which are immobilized on a microarray.
  • the respective expression ratios can thus be used to assess the likelihood that patients will respond to the planned therapy and / or whether the therapy started is effective and / or how long the patients still need to be treated appropriately and / or whether the maximum therapeutic effect is included the dose and duration used has already been reached.
  • Another application of the method according to the invention is the use of the RNA of the genes according to claim 10 to obtain quantitative information by hybridization-independent methods, in particular enzymatic or chemical hydrolysis, subsequent quantification of the nucleic acids and / or derivatives and / or fragments thereof
  • a further application of the method according to the invention is the use of the gene activities to differentiate between SIRS and sepsis for electronic further processing for the purpose of producing software for diagnostic purposes (for example for patient data management systems), or expert systems for modeling cellular signal transmission paths or for the purpose of computer-aided modeling of inflammatory conditions in model organisms such as C. elegans or Saccharomyces cerevisiae.
  • RNA was isolated using the PAXGene Blood RNA Kit in accordance with the manufacturer's instructions (Qiagen).
  • the double-stranded cDNA was then synthesized from the total RNA by means of reverse transcription using the Agilent Low RNA Input Fluorescent Amplification Kit (Agilent) according to the manufacturer's protocol, a T7 RNA polymerase promoter being appended to the poly-A end of the cDNA ,
  • the cDNA was then synthesized using the T7 RNA polymerase promoter and simultaneous insertion of fluorescence nucleotides Cy3 / Cy5 cytosine triphosphate (Amersham) into cRNA, which served as hybridization molecules.
  • RNA samples were divided into two aliquots, one aliquot labeled with Cy3-CTP and the other aliquot labeled with Cy5-CTP. As a result, each co-hybridization could be carried out twice using the reverse RNA / fluorescent dye combination.
  • each of the prepared combinations of the hybridization molecules was hybridized both with the microarray 1A oligo and 1 B oligo from Agilent in accordance with the manufacturer's protocol. Together, these two microarrays contain 36000 genes and ESTs (Expressed Sequence Tags). The fluorescence signals of the hybridized molecules were measured using a reader (Agilent DNA microarray scanner) and calculated using the Agilent Feature Software.
  • the mean intensity of a spot was determined as the median of the spot pixels.
  • the corresponding p-value was less than 0.05 and the mean change in expression greater than 1.2 in both experiments.
  • the level of the expression ratio of each gene was the criterion for sorting the genes examined. Of interest were the genes which were most overexpressed or underexpressed in the patient samples compared to control samples.
  • Table 3 Significantly reduced gene activities in samples from patients with sepsis according to [1], shown as their relative relationship to the corresponding gene activities of the same patient in the state SIRS according to [1]
  • GenBank Accession Numbers listed in Tables 2 and 3 Internet access via http://www.ncbi.nim.nih.gov/) of the individual sequences are in the 42-page sequence listing attached to this application Part of the invention is assigned in each case to a sequence ID (sequence ID: 1 to sequence ID: 91). This sequence listing is part of the present invention.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Unterscheidung von generalisierten, inflammatorischen, nichtinfektiösen Zuständen und generalisierten, inflammatorischen, infektiösen Zuständen, mit den Schritten: a) Isolieren von Proben-RNA aus einer biologischen Probe, b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis spezifische Genaktivität und/oder ein spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker, c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen, d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein zur Unterscheidung von zwischen SIRS und Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist, e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben-RNA und der Kontroll-RNA; und, f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Erkennung von Sepsis.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro Unterscheidung zwischen generalisierten, inflammatorischen, nichtinfektiösen Zuständen und generalisierten, inflammatorischen, infektiösen Zuständen gemäß Anspruch 1.
Die im folgenden verwendeten Begriffe „generalisierter, inflammatorischer, nichtinfektiöser Zustand" entspricht der Definition SIRS nach [1] und „generalisierter, inflammatorischer, infektiöser Zustand" entspricht der Definition Sepsis nach [1].
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Anwendung von Genaktivitätsmarkem für die Diagnose der Sepsis.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung neue Diagnosemöglichkeiten, die sich aus experimentell abgesicherten Erkenntnissen im Zusammenhang mit dem Auftreten von Änderungen der Genaktivitäten (Transkription) bei Patienten mit SIRS und Sepsis ableiten lassen.
Trotz Fortschritte im pathophysiologischen Verständnis und der supportiven Behandlung von Intensivpatienten sind generalisierte inflammatorische Zustände wie SIRS und Sepsis, definiert entsprechend der ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 [1], bei Patienten auf Intensivstationen sehr häufig auftretende und erheblich zur Sterblichkeit beitragende Erkrankungen [2-3]. Die Sterblichkeit beträgt ca. 20 % bei SIRS, ca. 40 % bei Sepsis und steigt bei Entwicklung von multiplen Organdysfunktionen bis auf 70-80 % an [4-6]. Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von fachübergreifender klinisch- medizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz- /Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/ Onkologie, etc. ) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos für SIRS und Sepsis immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 um 139% von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000 Krankenhauspatienten) [7]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
Auf molekularer Ebene wird als Sepsis ein Krankheitsbild bezeichnet, welches durch pathogene Mikroorganismen verursacht wird. Auf dem Boden der Erschöpfung Infektionsort-naher, molekularer Kontroll- und
Regulationsmöglichkeiten entwickelt sich eine generalisierte, den ganzen
Organismus umfassende Entzündungsreaktion, die für die vom Arzt nachgewiesenen klinischen Symptome/Diagnosekriterien/SIRS-Kriterien nach [1] verantwortlich ist. Dieser generalisierte, inflammatorische Zustand
(als Sepsis nach [1] definiert) geht mit Zeichen der Aktivierung verschiedener
Zellsysteme (endotheliale Zellen, aber auch aller leukozytären Zellsysteme und vor allem des Monozyten/ Makrophagensystems) einher. Schließlich schädigen molekulare Mechanismen, die eigentlich den Wirt gegen invasive Mikroorganismen schützen sollen, dessen eigene Organe/Gewebe und tragen so entscheidend zur Entwicklung der vom Kliniker gefürchteten
Organdysfunktionen bei [8-11].
Der Sepsisbegriff hat im Laufe der Zeit einen erheblichen Bedeutungswandel erfahren. Eine Infektion bzw. der dringliche Verdacht auf eine Infektion sind auch heute noch wesentlicher Bestandteil aktueller Sepsisdefinitionen. Besondere Berücksichtigung findet jedoch dabei die Beschreibung Infektionsort-ferner Organfehlfunktionen im Rahmen der inflammatorischen Wirtsreaktion. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des „American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis- Begriffs durchgesetzt [1]. Entsprechend dieser Kriterien [1] werden die klinisch definierten Schweregrade „systemic inflammatory response syndrom" (SIRS), „Sepsis", „severe Sepsis" und „septic shock" unterschieden. Als SIRS wird dabei die systemische Antwort des inflammatorischen Systems auf einen infektiösen oder nichtinfektiösen Reiz definiert. Dazu müssen mindestens zwei der folgenden klinischen Kriterien erfüllt sein: Fieber >38°C oder Hypothermie <36°C, eine Leukozytose >12G/I oder eine Leukopenie <4G/I bzw. eine Linksverschiebung im Differentialblutbild, eine Herzfrequenz von über 90/min, eine Tachypnoe >20 Atemzüge/min oder ein PaCO2 (Partialdruck des Kohlendioxid im arteriellen Blut) <4,3 kPa. Als Sepsis werden solche klinischen Zustände definiert, bei denen die SIRS-Kriterien erfüllt sind und ursächlich eine Infektion nachgewiesen wird oder zumindest sehr wahrscheinlich ist. Eine schwere Sepsis ist vom zusätzlichen Auftreten von Organfehlfunktionen gekennzeichnet. Häufige Organfehlfunktionen sind Änderungen der Bewusstseinslage, eine Oligurie, eine Laktazidose oder eine Sepsisinduzierte Hypotension mit einem systolischen Blutdruck von weniger als 90 mmHg bzw. ein Druckabfall um mehr als 40 mmHg vom Ausgangswert. Wenn eine solche Hypotension nicht durch die Verabreichung von Kristalloiden und/oder Kolloiden zu beheben ist und es zusätzlich zu einer Katecholaminpflichtigkeit des Patienten kommt, so spricht man von einem septischen Schock. Dieser wird bei etwa 20 % aller Sepsispatienten nachgewiesen. Sepsis ist das klinische Ergebnis von komplexen und stark heterogenen molekularen Vorgängen, die gekennzeichnet sind durch eine Einbeziehung von vielen Komponenten und deren Wechselwirkungen auf jeder organisatorischen Ebene des menschlichen Körpers: Gene, Zellen, Gewebe, Organe. Die Komplexität der zugrunde liegenden biologischen und immunologischen Prozesse haben viele Arten von Forschungsstudien hervorgerufen, die einen weiten Bereich klinischer Aspekte umfassen. Eines der hieraus zu erkennenden Ergebnisse war, dass die Bewertung neuer Sepsis-Therapien durch relativ unspezifische, klinisch-basierte Einschlusskriterien, welche die molekularen Mechanismen in nicht ausreichender Weise wiedergeben, erschwert wird [12]. Gleichfalls bestehen auf Grund der mangelnden Spezifität der heutigen Sepsis- und SIRS- Diagnose beim Kliniker große Unsicherheiten, ab welchem Zeitpunkt ein Patient einer spezialisierten Therapie, beispielsweise mit Antibiotika, die ihrerseits beträchtliche Nebenwirkungen haben können, zugeführt werden soll [12]. So zeigte eine von der European Society of Intensive Care Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71 % der befragten Ärzte Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis, trotz langjähriger klinischer Erfahrungen, hatten [22].
Bahnbrechende Entdeckungen in Molekularbiologie und Immunologie während der letzten zwei Jahrzehnte ließen ein vertieftes, mehr an den grundlegenden Mechanismen orientiertes Verständnis der Sepsis entstehen. Das dadurch entstandene Wissen um relevante Targets bildete wiederum die Basis für die Entwicklung gezielter und adjuvanter Therapiekonzepte, welche hauptsächlich auf der Neutralisierung wesentlicher Sepsismediatoren beruhen [13-16]. Eine Ursache für das Scheitern fast aller immunmodulatorischer Therapieansätze in klinischen Studien - trotz Effektivität im Tierexperiment - wird in der nur schlechten Korrelation zwischen den klinischen, eher symptomatisch orientierten Diagnosekriterien und den grundlegenden Mechanismen einer generalisierten Immunantwort gesehen [12, 17-18].
Rückblickend erstaunt dies nicht, da bereits gesunde Menschen bei alltäglichen Verrichtungen Veränderungen der Herz- bzw. Atemfrequenz aufweisen können, welche per Definition bereits die Diagnose eines SIRS zuließen. Bei Berücksichtigung unserer heutigen biomedizinischen Möglichkeiten muss es als Anachronismus erscheinen, dass jährlich 751.000 Patienten in den USA anhand o.g. ACCP/SCCM Kriterien diagnostiziert, klassifiziert und behandelt werden. Von namhaften Autoren wird deshalb schon lange kritisiert, dass zu Lasten einer verbesserten Sepsisdiagnose in der vergangenen Dekade zuviel Energie und finanzielle Ressourcen für die Suche nach einem „magic bullet" der Sepsistherapie aufgewendet wurden [19]. Auch fordern kürzlich publizierte Expertenmeinungen, dass zu einem besseren pathophysiologischen Verständnis der Sepsis eine Modifizierung der Konsensuskriterien nach [1] erforderlich ist [20-21]. Außerdem besteht unter vielen Medizinern Einigung darüber, dass die Konsensuskriterien nach [1] keiner spezifischen Definition von Sepsis entsprechen. So zeigte eine von der European Society of Intensive Gare Medicine (ESICM) durchgeführte Umfrage, dass 71 % der befragten Ärzte Unsicherheit bei der Diagnosestellung einer Sepsis, trotz langjähriger klinischer Erfahrungen, hatten [22].
Aufgrund der oben genannten Probleme mit der Anwendung der Konsensuskriterien nach [1] werden unter Intensivmedizinern Vorschläge für eine sensitivere und spezifische Definitionen der verschiedenen Schweregrade der Sepsis diskutiert [2,23]. Neu ist dabei vor allem, dass molekulare Veränderungen direkt in die Beurteilung der Schwere einer Sepsis, aber auch den Einschluss in innovative Behandlungsverfahren der Sepsis (wie z.B. die Therapie mit aktiviertem rekombinanten Protein C) einbezogen werden sollen. Dieser Konsensusprozess [23], der gegenwärtig von fünf internationalen Fachgesellschaften getragen wird, ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt noch längst nicht abgeschlossen. Ziel ist die Etablierung eines Systems zur Schweregradbeurteilung der Sepsis, das es ermöglicht, Patienten anhand ihrer individuellen Patientenreaktion auf der Basis ihrer prädisponierenden Bedingungen, der Art und des Ausmaßes der Infektion, der Art und der Schwere der Wirtsantwort sowie des Grads der begleitenden Organdysfunktionen zu klassifizieren. Das beschriebene System wird mit PIRO, abkürzt nach den englischen Begriffen für „Predisposition", „Insult Infection", „Response" und „Organ dysfunction", bezeichnet. Davon kann dann die individuelle Wahrscheinlichkeit des Überlebens sowie des potentiellen Ansprechens auf die Therapie abgeleitet werden [23]. Gleichfalls sollen nichtinfektiöse Zustände, die gegenwärtig nach [1] unter dem Begriff SIRS subsummiert werden, entsprechend der individuellen Schwere des SIRS genauer klassifiziert werden. Auch hierfür werden Biomarker gesucht, die die Schwere des SIRS auch auf molekularer Ebene widerspiegeln und eine klare Abgrenzung von infektiösen Zuständen (gegenwärtig als Sepsis nach [1] klassifiziert) ermöglichen. Ähnliche Stadieneinteilungen werden bereits heute von anderen medizinischen Fachdisziplinen mit Erfolg angewendet, beispielsweise zur Klassifizierung der verschiedenen Krankheitsstadien im Bereich der Onkologie verwendet (TNM System, [24]).
Ein wesentliches Kriterium für die Diagnose einer Sepsis ist neben der generalisierten Entzündungsreaktion der Nachweis einer Infektion. Aus [25] ist jedoch bekannt, das beispielsweise von ca. 8500 Blutkulturen aus einer inneren medizinischen Abteilung nur bei ca. 15% aller Blutkulturen der Erreger bestimmt werden konnte. Von dem im gleichen Zeitraum (1 Jahr) bestimmten Blutkulturen einer Anästhesiologischen Intensivstation konnten sogar nur bei ca. 10% aller Blutkulturen die Krankheitserreger nachgewiesen werden. Diese Untersuchungen belegen die Problematik, einen frühzeitigen Nachweis der Infektion und somit einer frühe Diagnose der Sepsis zu ermöglichen. Als Ursache für den fehlenden Nachweis der Krankheitserreger mittels Blutkulturen können die mangelnde Eignung der Methode des Anzüchtens spezieller Erreger im allgemeinen sowie die meist oft begleitend eingesetzte Antibiotikatherapie, die dazu führt, dass die Erreger nicht mehr metabolisch aktiv und somit nicht anzuzüchten sind, im speziellen angesehen werden.
Verglichen mit den Konsensuskriterien nach [1] sollen in der Zukunft zusätzliche molekulare Parameter in die Diagnosestellung einbezogen werden [23], um so eine verbesserte Korrelation der molekularen inflammatorischen/ immunologischen Wirtsantwort mit dem Schweregrad der Sepsis zu ermöglichen. Nach solchen molekularen Biomarkem wird derzeit von verschiedenen wissenschaftlichen und kommerziellen Gruppen intensiv gesucht, da bisherige Parameter wie z.B. die Bestimmung des C-reaktiven Proteins oder des Procalcitonins nicht allen klinischen Anforderungen gerecht werden [26]. Auch aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensivität der Konsensuskriterien nach [1] und des mangelhaften oder verspäteten Nachweises der Ursache der Infektion besteht daher ein dringender Bedarf für neue diagnostische Verfahren, welche die Fähigkeit des Fachmanns verbessern sollen, eine Sepsis frühzeitig zu diagnostizieren, im klinischem Verlauf vergleichbar zu gestalten und bezüglich der individuellen Prognose und dem Ansprechen auf spezifische Behandlungen Aussagen abzuleiten.
Technologische Fortschritte, insbesondere die Entwicklung der Mikroarray- Technologie, versetzen den Fachmann nun in die Lage, 10000 oder mehr Gene und deren Genprodukte gleichzeitig zu vergleichen. Die Anwendung solcher Mikroarray-Technologien kann nun Hinweise auf den Status von Gesundheit, Regulationsmechanismen, biochemischer Wechselwirkungen und Signalübertragungsnetzwerken geben. Das Verbessern des Verständnisses darüber, wie ein Organismus auf Infektionen reagiert, sollte die Entwicklung von verstärkten Erkennungs-, Diagnose- und Behandlungsmodalitäten für Sepsis- Erkrankungen erleichtern.
Microarrays stammen vom „Southern blotting" [27] ab, was die erste Herangehensweise darstellt, DNA-Moleküle in einer räumlich ansprechbaren Art und Weise auf einer festen Matrix zu immobilisieren. Die ersten Mikroarrays bestanden aus DNA-Fragmenten, oft mit unbekannter Sequenz, und wurden auf eine poröse Membran (normalerweise Nylon) punktweise aufgebracht. Routinegemäß wurden cDNA, genomische DNA oder Plasmid- Bibliotheken verwendet, und das hybridisierte Material wurde mit einer radioaktiven Gruppe markiert [28-30].
Kürzlich hat es die Verwendung von Glas als Substrat und Fluoreszenz zur Detektion zusammen mit der Entwicklung neuer Technologien für die Synthese und für das Aufbringen der Nukleinsäuren in sehr hohen Dichten erlaubt, die Nukleinsäurearrays zu miniaturisierten bei gleichzeitiger Erhöhung des experimentellen Durchsatzes und des Informationsgehaltes [31-33].
Weiterhin ist aus WO 03/002763 bekannt, dass Microarrays grundsätzlich für die Diagnose von Sepsis und Sepsisähnlichen Zuständen verwendet werden können.
Eine Begründung für die Anwendbarkeit der Microarray-Technologie wurde zunächst durch klinische Untersuchungen auf dem Gebiet der Krebsforschung geliefert. Hier haben Expressionsprofile ihre Nützlichkeit bei der Identifizierung von Aktivitäten einzelner Gene oder Gengruppen gezeigt, die mit bestimmten klinischen Phänotypen korrelieren [34]. Durch die Analyse vieler Proben, die von Individuen mit oder ohne akute Leukämie oder diffusen B-Zell Lymphomen stammten, wurden Genexpressionsmarker (RNA) gefunden und anschließend für die klinisch relevante Klassifizierung dieser Krebsarten angewandt [34,35]. Golub et al. haben herausgefunden, daß verlässliche Vorhersagen nicht aufgrund von irgendeinem einzelnen Gen gemacht werden können, aber daß Vorhersagen, die auf der Veränderung der Transkritiption von 53 Genen (ausgewählt aus über 6000 Genen, die auf den Arrays vertreten waren) basieren, sehr genau sind [34].
Alisadeh et al. [35] untersuchten große B-Zell Lymphome (DLBCL). Die Autoren erarbeiteten Expressionsprofile mit einem „Lymphochip", einem Microarray, der 18 000 Klone komplementärer DNA trug und entwickelt worden war, um Gene zu überwachen, die in normale und abnormale Lymphozytenentwicklung involviert sind. Unter Anwendung von Cluster- Analysen waren sie in der Lage, DILBCL in zwei Kategorien einzuteilen, welche starke Unterschiede bezüglich der Überlebenschancen der Patienten aufzeigten. Die Genexpressionsprofile dieser Untergruppen entsprachen zwei bedeutsamen Stadien der B-Zelldifferenzierung.
Auch auf dem Gebiet der Neurobiologie sind eine Vielzahl von Studien zur Identifizierung von Genaktivitätsmarkem mittels Microarray-Technologie durchgeführt worden [36]. Gleiches gilt für die Untersuchung der molekularen Veränderungen, welche durch einzelne Bestandteile von bakteriellen Gram negativen Erregern (z.B. unter Verwendung von Stimulationsexperimenten mit Lipopolysacchariden) ausgelöst werden [37]. Solche Untersuchungen werden in der Regel mittels dem Fachmann bekannten zellulären Modellsystemen, z.B. menschlichen Endothelzellkulturen in [38], oder in menschlichen leukozytären Zellkulturen [41], oder auch mittels Untersuchungen menschlicher Gewebe, nicht aber Blut, z.B. in [39], durchgeführt. Dabei richtet sich das experimentelle Bestreben jeweils auf die Identifizierung bislang unbekannter Teilnehmer der zellulären Signalübertragungswege, um auf diesem Wege die molekulare Natur einer Entzündung besser beschreiben zu können. Alternativ werden regelmäßig für solche Fragestellungen auch Tierexperimente, z.B. in Mäusen siehe auch [40], durchgeführt.
Ein weiteres Beispiel für die Verwendung der differentiellen Genexpression zur vertiefenden Untersuchung der molekularen Vorgänge bei einer generalisierten Entzündungsreaktion konnte in [42] auf der Basis cDNA basierter Mikroarrays gezeigt werden.
Die Messung von Genexpressionsprofilen zur Unterscheidung zwischen SIRS entsprechend [1] und Sepsis entsprechend [1] wurde noch nicht beschrieben.
Ausgangspunkt für die in der vorliegenden Patentanmeldung offenbarten Erfindung ist die Erkenntnis, daß Genaktivitäten verschiedener Gene in biologischen Proben eines Individuums, bei dem Sepsis-typische Krankheitserscheinungen (entsprechend der Definition in [1]) festgestellt werden, sich von den Genaktivitäten der g leichen Gene in Proben von Individuen, bei denen eine SIRS diagnostiziert wurde, unterscheiden. Diese Unterschiede in den Genaktivitäten lassen es somit zu, Patienten mit einer Sepsis, also einer zusätzlichen infektiösen Komplikation, von Patienten ohne diese infektiöse Komplikation (SIRS entsprechend [1]) zu unterscheiden. Wie bereits an anderer Stelle dargelegt, ist diese Unterscheidung bislang mit erheblichen Nachteilen verbunden, aber für die Einleitung einer spezialisierten medizinischen Therapie und damit für das Verbessern der individuellen Prognose für das Überleben sehr bedeutungsvoll.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, das die Unterscheidung zwischen generalisierten, inflammatorischen, nichtinfektiösen Zuständen (SIRS entsprechend [1]) und generalisierten, inflammatorischen, infektiösen Zuständen (Sepsis entsprechend [1]) ermöglicht. Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.
Weiterhin liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Verwendungsmöglichkeit von Markern in einem Verfahren gemäß Anspruch 1-25 zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird durch die Verwendung gemäß Anspruch 26-32 gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit eines Individuums die Aktivität eines oder mehrerer Markergene bestimmt und aus der festgestellten Anwesenheit und/oder Menge des bestimmten Genprodukts zwischen SIRS und Sepsis (beides entsprechend [1]) unterscheiden kann.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur in vitro Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis, wobei es folgende Schritte umfasst: a) Isolieren von Proben-RNA aus einer biologischen Probe; b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis (beides entsprechend [1]) spezifische Genaktivität und/oder ein spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Markerln-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein zur Unterscheidung SIRS und Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist; c) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben- RNA und der Kontroll-RNA; d) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis (beides entsprechend [1]) spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle. n Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfasst und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des therapeutischen Verlaufs und zur Risikoabschätzung für Patienten eingesetzt wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Probe um die eines Menschen handelt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das zur Unterscheidung SIRS und Sepsis spezifische Gen oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 91, sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden. Diese Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 91 sind durch den Umfang der vorliegenden Erfindung mit umfaßt und sind dem angefügten 42-seitigen, 91 Sequenzen umfassenden, Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen offenbart. Dieses Sequenzprotokoll beinhaltet zudem eine Zuordnung der einzelnen Sequenzen mit der Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 91 zu deren GenBank Accession Nr. (Internet- Zugang über http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten oder freien Sonden markiert werden. Für diese Ausführungsform finden selbstkomplementäre Oligonukleotide, so genannte Molecular beacons, als Sonden Verwendung. Sie tragen an ihren Enden ein Fluorophor/Quencher-Paar, so daß sie in Abwesenheit einer komplementären Sequenz in einer gefalteten Haarnadelstruktur vorliegen und erst mit einer entsprechenden Probensequenz ein Fluoreszenzsignal liefern. Die Haarnadelstruktur der Molecular Beacons ist so lange stabil, bis die Probe an der spezifischen Fängersequenzsequenz hybridisiert, was zu einer Konformationsänderung und damit auch Freisetzung der Reporterfluoreszenz führt.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die als DNA von den in Anspruch 10 aufgelisteten Genen ersetzt wird durch von deren RNA abgeleiteten Sequenzen, synthetische Analoga, Aptamere sowie Peptidonukleinsäuren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die synthetische Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, ddaaßß aallss ddeetteekkttiieerrbbaarreerr MMaarrkkeerr eeiinn rraaddiicoaktiver Marker, insbesondere P, C, 125l, 155Ep, 33P oder 3H verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Färb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsändem ng bei Hybridisierungen, verwendet wird.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate dieselbe Markierung tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate unterschiedliche Markierungen tragen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen DNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen DNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol- Dipol- und/oder hydrophobische Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
Eine weiter Ausführungsform der Erfindung besteht in der Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis (beides entsprechend [1]) spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis -Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von SIRS und Sepsis.
Es ist dem Fachmann klar, daß die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Als Markergene im Sinne der Erfindung werden alle abgeleiteten DNA- Sequenzen, Partialsequenzen und synthetischen Analoga (beispielsweise Peptido-Nukleinsäuren, PNA) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA-Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt keine Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Die auf Blut bezogene Beschreibung der Erfindung stellt nur eine beispielhafte Anwendung der Erfindung dar. Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten des Menschen verstanden. Eine Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Messung der differentiellen Genexpression zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis (beides entsprechend [1]). Hierzu wird die RNA aus dem Vollblut von entsprechenden Patienten und eine Kontrollprobe eines gesunden Probanden oder nicht-infektiösen Patienten isoliert. Die RNA wird anschließend markiert, beispielsweise radioaktiv mit 32P oder mit Farbstoffmolekülen (Fluoreszenz). Als Markierungsmoleküle können alle im Stand der Technik zu diesem Zwecke bekannten Moleküle und/oder Detektionssignale eingesetzt werden. Entsprechende Moleküle und/oder Verfahren sind dem Fachmann ebenfalls bekannt.
Die so markierte RNA wird anschließend mit auf einem Microarray immobilisierten DNA-Molekülen hybridisiert. Die auf dem Microarray immobilisierten DNA-Moleküle stellen eine spezifische Auswahl der Gene gemäß Anspruch 10 dieser Erfindung zur Unterscheidung SIRS und Sepsis dar.
Die Intensitätssignale der hybridisierten Moleküle werden im Anschluss durch geeignete Messgeräte (Phosporimager, Microarray-Scanner) gemessen und durch weitere softwaregestützte Auswertungen analysiert. Aus den gemessenen Signalintensitäten werden die Expressionsverhältnisse zwischen der Patientenprobe und der Kontrolle bestimmt. Aus den Expressionsverhältnissen der unter- und/oder überregulierten Gene lassen sich, wie in den nachstehend dargestellten Experimenten, Rückschlüsse auf die Unterscheidung SIRS und Sepsis ziehen.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Messung der differentiellen Genexpression für die therapiebegleitende Bestimmung der Wahrscheinlichkeit, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden, und/oder für die Bestimmung des Ansprechens auf eine spezialisierte Therapie und/oder auf die Festlegung des Therapieendes im Sinne eines „drug monitoring" bei Patienten mit SIRS und Sepsis. Hierzu wird aus den in zeitlichen Abständen gesammelten Blutproben des Patienten die RNA (Proben-RNA) isoliert. Die verschiedenen RNA-Proben werden zusammen mit der Kontrollprobe markiert und mit ausgewählten Genen gemäß dem Anspruch 10, welche auf einem Microarray immobilisiert sind, hybridisiert. Aus den jeweiligen Expressionsverhältnissen lässt sich somit beurteilen, welche Wahrscheinlichkeit besteht, daß Patienten auf die geplante Therapie ansprechen werden und/oder ob die begonnene Therapie wirksam ist und/oder wie lange die Patienten noch entsprechend therapiert werden müssen und/oder ob der maximale Therapieeffekt mit der verwendeten Dosis und Dauer schon erreicht worden ist.
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung der RNA der Gene nach Anspruch 10 zur Gewinnung von quantitativen Informationen durch Hybridisierungs-unabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische oder chemische Hydrolyse, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben
Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der Verwendung der Genaktivitäten zur Unterscheidung SIRS und Sepsis für die elektronischen Weiterverarbeitung zum Zweck der Herstellung von Software für Diagnosezwecke (z.B. für Patientendatenmanagementsystemen), oder Expertensystemen zur Modellierung von zellulärer Signalübertragungswegen oder zum Zweck der Computer-gestützten Modellierung von Entzündungszuständen auch in Modellorganismen wie beispielsweise C. elegans oder Saccharomyces cerevisiae.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung des Ausführungsbeispiels. Ausführungsbeispiel:
Untersuchungen zur differentiellen Genexpression zur Unterscheidung von generalisierten, inflammatorischen, nichtinfektiösen Zuständen (entsprechend SIRS nach [1]) und generalisierten, inflammatorischen, infektiösen Zuständen (ensprechend Sepsis nach [1]).
Für die Messung der differentiellen Genexpression zur Unterscheidung SIRS und Sepsis wurden Untersuchungen von Vollblutproben von Patienten, welche auf einer operativen Intensivstation behandelt wurden, durchgeführt.
Es wurden Vollblutproben von fünf männlichen und einer weiblichen Patienten/in abgenommen (Patientenproben). Jeder dieser Patienten entwickelte im Rahmen seiner intensivmedizinischen Betreuung nach einer Bypass-Operation eine Sepsis. Die Patientenproben wurden sofort (innerhalb von 12 Stunden) nach erstemaliger Diagnose einer Sepsis entsprechend der Klassifikation nach [1] entnommen. Ausgewählte Charakteristika der Patienten mit Sepsis sind in Tabelle 1 dargestellt. Dabei werden Angaben zum Alter, Geschlecht, der Ursache der Sepsis (siehe Diagnose) sowie klinischer Schwere, gemessen anhand der im klinischen Schrifttum gut belegten APACHE-II- und SOFA-Scores (jeweils in Punkte), gemacht. Gleichfalls sind die Plasmaproteinspiegel von Procalcitonin (PCT), einem neuartigen Sepsismarker, das Center of Disease (CDC)-Kriterium (siehe http://www.cdc.gov) und der individuelle Überlebensstatus angegeben.
Als Kontrollproben dienten Vollblutproben der gleichen Patienten. Diese wurden jeweils am 1. Tag postoperativ abgenommen. Zu diesem Zeitpunkt hatte jeder ein operationsbedingtes SIRS definiert entsprechend [1] (aufgrund des Einsatzes der Herz-Lungen-Maschine). Tabellel : Daten der Patientengruppe
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Nach Abnahme des Vollblutes wurde die totale RNA unter Anwendungen des PAXGene Blood RNA Kit gemäß den Vorgaben des Herstellers (Qiagen) isoliert. Im Anschluss wurde aus der totalen RNA die doppelsträngige cDNA mittels reverser Transkription unter Verwendung des Agilent Low RNA Input Fluorescent Amplification Kit (Agilent) nach dem Protokoll des Herstellers synthetisiert, wobei am Poly-A-Ende der cDNA ein T7 RNA Polymerase- Promoter angehängt wurde. Anschließend wurde die cDNA unter Verwendung des T7 RNA Polymerase-Promoters und gleichzeitiger Einfügen von Fluoreszenz-Nukleotiden Cy3/Cy5-Cytosintriphosphat (Amersham) in cRNA synthetisiert, welche als Hybridisierungsmoleküle dienten. Alle RNA-Proben wurden in zwei Aliquote geteilt, wovon ein Aliquot mit Cy3-CTP und das andere Aliquot mit Cy5-CTP markiert wurde. Dadurch konnte jede Kohybridisierung zweifach unter Nutzung der umgekehrten RNA/Fluoreszenzfarbstoff- Kombination durchgeführt werden.
Jede der vorbereiteten Kombination der Hybridisierungsmoleküle wurde sowohl mit dem Microarray 1A Oligo als 1 B Oligo der Fa. Agilent entsprechend dem Protokoll des Herstellers hybridisiert. Zusammen enthalten diese beiden Microarrays 36000 Gene und ESTs (Expressed Sequence Tags). Die Fluoreszenzsignale der hybridisierten Moleküle wurden mittels eines Auslesegerätes (Agilent DNA Microarray Scanner) gemessen und mit der Software Agilent Feature Software berechnet.
Auswertung
Für die Auswertung wurde die mittlere Intensität eines Spots als der Medianwert zugehörigen der Spotpixel bestimmt.
Korrektur systematischer Fehler: Von dem Mediän der Spotpixel wurde der Mediän der Pixel des lokalen Hintergrunds abgezogen. Für alle weiteren Berechnungen wurden die Signale mittels arcus sinus hyperbolicus transformiert. Die Normalisierung erfolgte nach dem Ansatz von Huber et al. [43]. Dabei wurden der additive und der multiplikative Bias innerhalb eines Microarrays aus 70% der vorhandenen Genproben geschätzt. Korrigiert wurden dann die Intensität-Signale aus dem roten Kanal.
Statistischer Vergleich Für den Vergleich wurde der gepaarte Student-Test verwendet. Der Test wurde unabhängig für beide experimentellen Bedingungen durchgeführt. Für die Auswahl der differenziert exprimierten Gene wurden der zugehörige p-Wert und die mittlere Expressionsänderung innerhalb der Gruppe bewertet.
Ergebnisse
Für die Gruppe der ausgewählten Gene gilt, dass in beiden Experimenten der zugehörige p-Wert kleiner als 0.05 und die mittlere Expressionsänderung größer als 1.2 war.
Die Höhe des Expressionsverhältnisses jedes Gens stellte das Kriterium für eine Sortierung der untersuchten Gene dar. Von Interesse waren die Gene, die in den Patientenproben gegenüber Kontrollproben am meisten überexprimiert bzw. unterexprimiert wurden.
Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, dass 51 Gene der Patientenprobe gefunden wurden, die in der Patientenprobe gegenüber der Kontrollprobe signifikant überexprimiert waren. Weiterhin wird aus Tabelle 3 deutlich, dass 17 Gene der Patientenprobe gegenüber der Kontrollprobe signifikant unterexprimiert waren. Aus den Ergebnissen wird deutlich, dass die in Tabelle 2 und Tabelle 3 aufgeführten Genaktivitäten zwischen generalisierten, inflammatorischen, infektiösen Zuständen (entsprechend Sepsis nach [1]) und generalisierten, inflammatorischen, nichtinfektiösen Zuständen (entsprechend SIRS nach [1]) unterscheiden. Somit stellen die aufgeführten Genaktivitäten Marker für eine Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis dar. Tabelle 2: Signifikant gesteigerte Genaktivitäten in Proben von Patienten mit Sepsis nach [1], dargestellt als deren relatives Verhältnis zu den korrespondierenden Genaktivitäten des selben Patienten im Zustand SIRS nach [1]
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Tabelle 2- Fortsetzung
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Tabelle 3: Signifikant reduzierte Genaktivitäten in Proben von Patienten mit Sepsis nach [1], dargestellt als deren relatives Verhältnis zu den korrespondierenden Genaktivitäten des selben Patienten im Zustand SIRS nach [1]
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Diese in Tabelle 2 und 3 charakteristischen Veränderungen sind für das erfindungsgemäße Verfahren gemäß Anspruch 1 ausnutzbar.
Die in den Tabellen 2 und 3 aufgeführten GenBank Accession Nummern (Internet-Zugang über http://www.ncbi.nim.nih.gov/) der einzelnen Sequenzen sind in dem dieser Anmeldung angefügten 42-seitigen Sequenzprotokoll, das somit Teil der Erfindung ist, im Einzelnen jeweils einer Sequenz ID (Sequenz ID: 1 bis zur Sequenz ID: 91) zugeordnet. Dieses Sequenzprotokoll ist Teil der vorliegenden Erfindung.
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Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur in vitro Unterscheidung von generalisierten, inflammatorischen, nichtinfektiösen Zuständen und generalisierten, inflammatorischen, infektiösen Zuständen,
dadurch gekennzeichnet, daß
es folgende Schritte umfasst:
a) Isolieren von Proben-RNA aus einer biologischen Probe;
b) Markieren der Proben-RNA und/oder wenigstens einer DNA, die ein zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis spezifische Genaktivität und/oder ein spezifisches Gen oder Genfragment ist, mit einem detektierbaren Marker;
c) In-Kontakt-Bringen der Proben-RNA mit der DNA unter Hybridisierungsbedingungen;
d) In-Kontakt-Bringen von Kontroll-RNA, mit wenigstens einer DNA, unter Hybridisierungsbedingungen, wobei die DNA ein zur Unterscheidung von zwischen SIRS und Sepsis spezifisches Gen oder Genfragment ist;
e) quantitatives Erfassen der Markierungssignale der hybridisierten Proben- RNA und der Kontroll-RNA;
f) Vergleichen der quantitativen Daten der Markierungssignale, um eine Aussage zu treffen, ob zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis spezifische Gene oder Genfragmente in der Probe stärker oder schwächer exprimiert sind als in der Kontrolle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kontroll-RNA vor dem Messen der Proben-RNA mit der DNA hybridisiert und die Markierungssignale des Kontroll-RNA/DNA-Komplexes erfasst und gegebenenfalls in Form einer Kalibrierkurve oder -tabelle ablegt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß nicht veränderte Gene aus der Proben- und/oder Kontroll-RNA als Bezugsgene für die Quantifizierung genutzt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proben-RNA mRNA verwendet wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA an vorbestimmten Bereichen auf einem Träger in Form eines Microarrays angeordnet, insbesondere immobilisiert, wird.
6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur differentialdiagnostischen Früherkennung, zur Kontrolle des klinischen Verlaufs, zur individuellen Risikoabschätzung für Patienten, zur Abschätzung des wahrscheinlichen Ansprechens auf eine spezifische Behandlung sowie zur post mortem Diagnose zur Unterscheidung von SIRS und Sepsis eingesetzt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe ausgewählt wird aus: Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Liquor, Urin, Ascitesflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Speichel, Punktat; Zellinhalt oder eine Mischung davon.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß Zellproben gegebenenfalls einer lytischen Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der biologischen Probe um die eines Menschen handelt.
10.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 dadurch gekennzeichnet, daß das zur Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis spezifische Gen und/oder Genfragment ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID No. 1 bis SEQ-ID No. 91 , sowie Genfragmenten davon mit wenigstens 5-2000, bevorzugt 20-200, mehr bevorzugt 20-80 Nukleotiden.
11.Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 2 bis 100 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 200 bis 500 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 500 bis 1000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 1000 bis 2000 unterschiedliche cDNAs verwendet werden.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß die in Anspruch 10 aufgelisteten Gene oder Genfragmente und/oder von deren RNA abgeleiteten Sequenzen ersetzt werden durch synthetische Analoga, Aptamere sowie Peptidonukleinsäuren.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet daß die synthetische Analoga der Gene 5-100, insbesondere ca. 70 Basenpaare umfassen.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein radioaktiver Marker, insbesondere 32P, uC) 125,_ i55Ep 33p oder 3H verwendet wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß als detektierbarer Marker ein nicht radioaktiver Marker, insbesondere ein Färb- oder Fluoreszenzmarker, ein Enzymmarker oder Immunmarker, und/oder quantum dots oder ein elektrisch messbares Signal, insbesondere Potential- und/oder Leitfähigkeits- und/oder Kapazitätsänderung bei Hybridisierungen, verwendet wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate dieselbe Markierung tragen.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben-RNA und Kontroll-RNA und/oder enzymatische oder chemische Derivate unterschiedliche Markierungen tragen.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-19, dadurch gekennzeichnet, dass die immobilisierten oder nichtimmobilisierten Sonden eine Markierung tragen.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sonden auf Glas oder Kunststoff, immobilisiert werden.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen DNA Moleküle über eine kovalente Bindung an das Trägermaterial immobilisiert werden.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die einzelnen DNA Moleküle mittels elektrostatischer- und/oder Dipol- Dipol- und/oder hydrophobe Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrücken an das Trägermaterial immobilisiert werden.
26. Verwendung von rekombinant oder synthetisch hergestellten, für die Unterscheidung zwischen SIRS und Sepsis spezifischen Nukleinsäuresequenzen, Partialsequenzen einzeln oder in Teilmengen als Kalibrator in Sepsis-Assays und/oder zur Bewertung der Wirkung und Toxizität beim Wirkstoffscreening und/oder zur Herstellung von Therapeutika und von Stoffen und Stoffgemischen, die als Therapeutikum vorgesehen sind, zur Vorbeugung und Behandlung von zwischen SIRS und Sepsis.
27. Verwendung der RNA der Gene und/oder Genfragmente nach Anspruch 10 zur Gewinnung von quantitativen Informationen über die Genaktivität durch Hybridisierungs-unabhängige Verfahren, insbesondere enzymatische und/oder chemische Hydrolyse und/oder Amplifikationsverfahren, vorzugsweise PCR, anschließende Quantifizierung der Nukleinsäuren und/oder von Derivaten und/oder Fragmenten derselben.
28. Verwendung von Genaktiviäten der Gene und/oder Genfragmente gemäß Anspruch 10, die spezifisch für SIRS oder Sepsis sind zum Wirkstoffscreening in Modellorganismen.
29. Verwendung von Genaktivitäten nach Anspruch 1-25 welche auf zellulärer Ebene durch Genaktivitäten der Gene und/oder Genfragmente nach Anspruch 10 moduliert werden.
30. Verwendung der Gene und/oder Genfragmente nach Anspruch 10 zum Erhalt von Informationen über einen Sepsis- oder SIRS-Zustand, für die elektronische Weiterverarbeitung.
31. Verwendung von Genaktivitätsdaten für die Herstellung von Software für Diagnosezwecke und/oder Patientendatenmangementsytstemen
32. Verwendung von Genaktivitätsdaten für die Herstellung von Expertensystemen zur Modellierung von zelluläreren Signalübertragungswegen.
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