WO2005071082A1 - 抗癌作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

抗癌作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド Download PDF

Info

Publication number
WO2005071082A1
WO2005071082A1 PCT/JP2004/015932 JP2004015932W WO2005071082A1 WO 2005071082 A1 WO2005071082 A1 WO 2005071082A1 JP 2004015932 W JP2004015932 W JP 2004015932W WO 2005071082 A1 WO2005071082 A1 WO 2005071082A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antisense oligonucleotide
rna
cancer
cells
present
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/015932
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Katsutomo Hamada
Original Assignee
Good Will Okinawa Co.,Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Good Will Okinawa Co.,Ltd filed Critical Good Will Okinawa Co.,Ltd
Priority to CN2004800187313A priority Critical patent/CN1816626B/zh
Priority to EP04793044A priority patent/EP1707630B1/en
Priority to US10/558,265 priority patent/US7393951B2/en
Priority to JP2005517190A priority patent/JP4226006B2/ja
Priority to AT04793044T priority patent/ATE428786T1/de
Priority to DE602004020677T priority patent/DE602004020677D1/de
Publication of WO2005071082A1 publication Critical patent/WO2005071082A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Definitions

  • the present invention relates to an antisense oligonucleotide having an anticancer action, for example, a cancer cell growth inhibitory action, a cancer therapeutic or preventive action, etc., and a cancer cell growth inhibitor comprising the antisense oligonucleotide. And a therapeutic or preventive agent for cancer.
  • SRP recognition particle
  • SRP has a sedimentation coefficient of 1 IS as a whole, and consists of 7SL RNA and 6 types of proteins.
  • a ribosome is a place for protein synthesis, and it also has rRNA and many ribosomal protein forces.
  • a force with a sedimentation coefficient of 80S as a whole is further split into two particles of 60S and 40S, and the former 5S, 5.8S and 28S rRNA, and the latter ⁇ 18S r Contains 1 molecule each of RNA.
  • SRP recognizes a signal peptide having a hydrophobic amino acid sequence that exists at or near the N-terminus of a secreted protein precursor that has also extended its ribosome force, and binds to a protein-ribosome complex. Thereby, the translation of the protein ahead is stopped. SRP transports the complex to the membrane of the endoplasmic reticulum and binds to the SRP receptor protein on the cytosolic side of the endoplasmic reticulum. When SRP-bound complexes bind to the membrane, translation inhibition is released, SRP dissociates, and ribosomes are immobilized on the membrane. Translation is then continued, and the polypeptide chain passes through the membrane, creating a mature secreted protein.
  • RNAs in the nucleus of eukaryotic cells, in addition to mRNA involved in protein translation as described above, a group of RNAs called small nuclear RNAs of about 100-300 bases in length are synthesized. Is done. They usually exist as ribonucleoproteins in association with proteins.
  • nuclear low molecular weight RNAs for example, RNAs called Ul, U2, U3, U4, U5, and U6 are known.
  • Ul, U2, U4, U5, and U6 are known.
  • the functions of small nuclear RNA are Ul, U2, U4, U5, and U6 before mRNA. It has been shown to be involved in the splicing of the precursor, but other functions are still unknown.
  • transcripts [Transforming RNA (Transforming RNA) added with poly (A) to the base sequence (SEQ ID NO: 2) on the 3 'end of the first stem in the secondary structure of U5 RNA and transcribed in an RNA polymerase II-dependent manner. RNA)] was also shown to have canceration ability (see Non-Patent Document 2). Canceration ability depended on a specific base sequence (SEQ ID NO: 3) in the transforming RNA.
  • Non-Patent Document 2 Mol. Carcinog. 20, 175-188 (1997)
  • Non-Patent Document 3 J. Biol. Chem. 274 (22), 15786-15796 (1999)
  • the present invention relates to an antisense oligonucleotide having an anticancer effect, for example, a cancer cell proliferation inhibitory effect, a cancer treatment or preventive effect, and the like, and a cancer cell proliferation inhibitor comprising the antisense oligonucleotide.
  • Another object is to provide a therapeutic or preventive agent for cancer.
  • the antisense oligonucleotide for the 47-51 base sequence of RNA is the U5
  • RNA can be remarkably effective in suppressing canceration, and the present invention has been completed.
  • the present invention exerts a lethal and growth-inhibiting action on human cancer cells based on the elucidation of the initial function associated with canceration ability of U5 RNA and transforming RNA derived from U5 RNA. It was made by searching and clarifying substances that act antagonistically.
  • the present invention provides:
  • a cancer cell proliferation inhibitor comprising the antisense oligonucleotide according to [1] or [2],
  • a therapeutic or prophylactic agent for cancer comprising the antisense oligonucleotide according to [1] or [2],
  • cancer cell proliferation can be suppressed or killed, cancer symptoms can be alleviated or ameliorated, or cancer can be treated or prevented.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the structure of 7SL RNA of SRP derived from rabbit cells. The numbers in the figure indicate the base positions (except 3 'and 5').
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of oligol-5, which is an antisense oligonucleotide prepared in Examples, on the proliferation of human cancer cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the concentration-dependent effect of oligo3 on the proliferation of human cancer cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of oligol-5 on cellular DNA synthesis in human cancer cells.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of oligo3 on the death of human cancer cells.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of oligo3 on body weight gain of mice when administered intravenously at gZg body weight.
  • nucleotide is used in the meaning including DNA and RNA.
  • antisense oligonucleotide refers to an oligonucleotide having a base sequence complementary to a specific base sequence (hereinafter referred to as a sense sequence) and capable of hybridizing to the sense sequence.
  • the sense sequence corresponding to the antisense oligonucleotide of the present invention is 7SL R of SRP.
  • This is the 47-51 base sequence of NA.
  • Fig. 1 schematically shows the structure of 7SL RNA of SRP derived from rabbit cells.
  • the base sequence of 7SL RNA is known from various animal cells.
  • non-patent literature 3 describes the ones derived from the rabbit cells, and Ullu, E "and Wiener, AM, (1984) EMBO J. 3. 3303-3310.
  • the above-mentioned 7SL RNA 47 The base sequence at position 51 is the same.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention has an anticancer effect such as a cancer cell growth inhibitory effect, a cancer therapeutic or preventive effect, and the like.
  • antisense oligonucleotides comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 are useful.
  • Cancer cell growth inhibitory effects include cancer cell killing effects. It is presumed that the shift effect of the antisense oligonucleotide of the present invention is also based on the suppressive action of the U5 RNA such as canceration ability.
  • the cancer cell proliferation inhibitory action of the antisense oligonucleotide of the present invention can be confirmed according to the method described in the examples described later.
  • the method for synthesizing the antisense oligonucleotide of the present invention is not particularly limited, and includes a phosphoramidite method, a phosphorothioate method, a phosphotriester method and the like using a known oligonucleotide synthesizer. Can be used.
  • the phosphate group or the hydroxyl group of the ribose moiety may be replaced with other stable groups within a range that does not significantly reduce the activity. It is also possible to use it as a derivative substituted.
  • Specific examples of such antisense oligonucleotide derivatives include those in which the phosphate group is substituted with a thiophosphate group or a methylphosphonate group, the hydroxyl group of the ribose moiety is an alkoxy group such as a methoxy group or a aryloxy group, Examples thereof include those substituted with an amino group or a fluorine atom.
  • the sequence of the bases constituting it is important.
  • the oligonucleotide has a non-natural type as described above.
  • it may be a peptide nucleic acid type modifying compound (PNA). Because the permeability of cell membrane and nuclear membrane is good, as the antisense oligonucleotide of the present invention, those having a sugar (preferably bentose) structure in their structure are preferred.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention may be DNA type or RNA type, but it is preferable that the viewpoint of higher stability when administered to a living body is also the DNA type. .
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be used alone. Therefore, the cancer cell growth inhibitor and the therapeutic or preventive agent for cancer (hereinafter sometimes collectively referred to as a preparation) provided by the present invention may have the ability of the antisense oligonucleotide itself, Preferably prepared by mixing with a pharmaceutically acceptable substance and preparing the preparation according to a known method.
  • Cancer cell growth inhibitors and cancer therapeutic agents or preventive agents are not particularly distinguished in terms of their composition and production method, but cancer cell growth inhibitors are used to alleviate or improve cancer symptoms, In addition to being used for the treatment or prevention of cancer, for example, it is different in that it is also intended to be used for suppressing cancer cell growth as a general reagent in a normal experimental process.
  • the preparation can be produced, for example, as follows.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention in water, physiological saline, glucose solution or the like, and if desired, a buffer, preservative or stable. It may contain an agent!
  • the antisense oligonucleotide of the present invention can be prepared by dissolving or dispersing in an oily, emulsion or water-soluble base, and if desired, a stabilizing agent, PH adjusters, plasticizers, emulsifiers, surfactants, solubilizers, wetting agents, preservatives, preservatives, solvents or absorption accelerators may be included.
  • an emulsion, lotion or the like is prepared by dissolving or dispersing the antisense oligonucleotide of the present invention in an aqueous phase and emulsifying it with an oil phase component such as a hydrocarbon or a higher alcohol.
  • an oil phase component such as a hydrocarbon or a higher alcohol.
  • a stabilizer, a pH adjuster, a plasticizer, an emulsifier, a surfactant, a solubilizer, a wetting agent, a preservative, a preservative, a solvent, or an absorption enhancer may be contained.
  • the cell growth inhibitor of the present invention includes, for example, water as a general reagent. It can also be prepared as a dry product that can easily be made into a solution.
  • the preparation is preferably combined with a known pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier include a carrier mainly composed of lipids such as ribosome, fat emulsion and micelle, a peptide carrier such as polylysine and polyorthin, and a synthetic polymer such as polyethyleneimine and polylactic acid Z glycolic acid copolymer.
  • carriers include carriers.
  • preparations combined with ribosomes are preferred.
  • the antisense oligonucleotides of the invention are preferably present embedded in ribosomes. Formulation using these carriers can be performed according to a known method.
  • Preparations combined with ribosomes are phospholipids, glycolipids, neutrals commonly used for ribosome formation.
  • lipids such as lipids
  • substances that give cationic charge to the formed liposomes such as dicetyl phosphate, stearylamine, and substances that prevent oxidation of ribosomes, such as ⁇ -tocopherol
  • compositions may contain other known ingredients that have been shown to have anticancer effects.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention linked to a vector that is, incorporated into an arbitrary vector can be used.
  • the antisense oligonucleotide is preferably operably linked to a suitable promoter.
  • “operably” means that the antisense oligonucleotide (RNA) can be expressed in cells of a living body by the action of a promoter.
  • a vector for example, an adenovirus vector, a vaccinia virus vector, a retrovirus vector etc. are mentioned.
  • Such a vector is useful as a vector for gene therapy.
  • Sambrook, J., et. Al. Molecular cloning: A Laboratory Mannual;.. 2 nd Ed , Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor.
  • the content of the antisense oligonucleotide in the preparation of the present invention is not particularly limited, and may be appropriately adjusted so as to obtain a desired effect according to the use mode corresponding to each preparation. 1 to 10% by weight is appropriate.
  • the cancer cell growth inhibitor and the cancer therapeutic or prophylactic agent of the present invention are obtained.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention for producing the cancer cell proliferation inhibitor of the present invention, or a therapeutic or preventive agent for cancer.
  • Examples of the method of administering the therapeutic or prophylactic agent for cancer of the present invention to a living body include, for example, oral administration, intravenous administration, transdermal administration, topical administration, depending on the form of the therapeutic agent or prophylactic agent. Administration, intraperitoneal administration, and the like can be mentioned, but are not particularly limited.
  • a method for administering the therapeutic or prophylactic agent for cancer of the present invention a more effective method may be selected according to each individual, the state of each disease, etc., but intravenous administration is usually preferable.
  • the dose of the therapeutic or preventive agent for cancer is not particularly limited as long as it is appropriately determined according to symptoms, etc.
  • the present invention for In terms of the amount of the antisense oligonucleotide, 0.1-1 mgZkg body weight, more preferably 0.1-0.5 mgZkg body weight is appropriate.
  • the administration may be performed once or divided into multiple times within a day. Also, the administration period is not particularly limited.
  • the living body to which the therapeutic or preventive agent for cancer of the present invention is administered is not limited to the above-mentioned humans, and includes, for example, mammals other than humans.
  • the cancer cell proliferation inhibitor of the present invention can be used in the same manner as the therapeutic or preventive agent for cancer of the present invention.
  • the location of cancer cells that are targets of anticancer activity by the cancer cell proliferation inhibitor and the therapeutic or preventive agent for cancer according to the present invention is not particularly limited. It is preferably derived from the digestive tract such as the surface, esophagus, stomach and large intestine, liver that can be administered intraarterially, and the like.
  • the antisense oligonucleotide of the present invention includes, for example, the reference example 1 described later. In particular, no toxicity is observed.
  • antisense ODN SEQ ID NO: 6
  • the antisense ODN acts in a direction to reduce the inhibition of secretory protein synthesis, the antisense ODN is expected to work in canceration.
  • an antisense oligonucleotide for a base sequence consisting of several residues centered on the 48-51 base sequence (SEQ ID NO: 8) of the 7SL RNA of the Rabbit cell-derived SRP was used.
  • SEQ ID NO: 8 the base sequence of 7SL RNA derived from human cells.
  • An antisense oligonucleotide (DNA) having the base sequence shown in Table 1 below was prepared by requesting Takara Bio Inc.
  • oligol-5 indicates the name of the antisense oligonucleotide, and the number in parentheses indicates the corresponding position of the base sequence of 7SL RNA.
  • Oligo5 is a mixture of antisense oligonucleotides randomly generated without being based on the base sequence of 7SL RNA, and N represents A, C, G or T.
  • oligo 5 NNNNN [0043] The influence of each oligo on cell proliferation was examined. That is, HeLa cells, which are human cancer cells in DMEM medium containing 10% heat-inactivated fetal calf serum (FCS), were seeded in a 96-well plate at a density of 1500 cells. After culturing for 24 hours, the culture solution was replaced with a culture solution containing each oligo and 1% FCS at a concentration of 10 M. Culturing was performed at 37 ° C in the presence of CO. That
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of each oligo on the proliferation of human cancer cells. The experiment was performed in triplicate. In the graph, each data is shown as average person SD (hereinafter the same). It can be seen that oligo3 has a strong growth inhibitory effect on human cancer cells with the lowest cell viability. Incidentally, 1, 2, 3, and 4 each Itoda cells viability ⁇ or control ⁇ to 49.6 0/0, 62.7%, 71.6%, and 71. was 1%.
  • Fig. 3 is a graph showing the concentration-dependent effect of oligo3 on the proliferation of human cancer cells. It can be seen that oligo3 growth inhibition of human cancer cells increases in proportion to the concentration. The cell viability on days 1, 2, 3, and 4 was 44.4%, 45.1%, 55.5%, and 63.8% of the control.
  • each oligo on cellular DNA synthesis was examined by observing [3 ⁇ 4] methylthymidine uptake by cells. That is, after culturing the cells for 24 hours in the same manner as described above, the culture solution was replaced with a culture solution containing each oligo at a concentration of 5, 10 or 20 M and 0.1% FCS. After 18 hours: CiZmL of [] methylthymidine was added to the culture and further incubated for 6 hours. After the culture, the specific radioactivity of the cells was determined by a liquid scintillation counter after a predetermined treatment.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of each oligo on cellular DNA synthesis in human cancer cells.
  • oligo3 has the lowest uptake of [] methylthymidine into cells and has a strong effect of suppressing the growth of human cancer cells.
  • oligo3 the induction of cell death in human cancer cells by oligo3 was examined. That is, 3000 HeLa cells were seeded in the slide chamber. After culturing for 24 hours, the culture solution was replaced with a culture solution containing oligo3 at a concentration of 20 M. About 18 hours after the addition of oligo3, the cultured cells were observed with a stereomicroscope (magnification 100 times; manufactured by Olympus), and the process of cell rounding and cell death was observed. Furthermore, 24 hours after the addition of oligo3, Giemsa staining was performed after washing the cells with phosphate buffered saline (PBS). The number of viable and dead cells was measured. The rate (%) was determined. As a control, Sako oligo5 was used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of oligo3 on the death of human cancer cells.
  • Cell viability with oligo3 is 30.8%, whereas control and oligo5 are 98.5% and 98.7%, respectively, and cell viability with oligo3 is significantly lower than other controls. Therefore, oligo3 has a high cell death-inducing effect on human cancer cells.
  • oligo3 (SEQ ID NO: 1), an antisense oligonucleotide to the 47-51 base sequence of SRP 7SL RNA, suppresses the growth of cancer cells and induces their death. It turns out that it has an effect
  • oligo3 The toxicity of oligo3 was examined. That is, 20 g per lg body weight was intravenously administered to female mice (5 weeks old) using oligo3 dissolved in physiological saline so as to be 1 mgZmL. The body weight of mice was measured on the day of administration (day 0) and 2, 5, 10, 12 and 14 days after administration.
  • Fig. 6 is a graph showing the effect of oligo3 on body weight gain of mice when intravenously administered at 20 ⁇ g Zg body weight. In the graph, each data is indicated by average person SE. Each data was obtained using 7 mice for oligo3 and 6 mice for control.
  • an antisense oligonucleotide having an anticancer effect for example, a cancer cell growth inhibitory effect, a cancer treatment or preventive effect, and the like, and a cancer cell growth inhibitor comprising the antisense oligonucleotide and A therapeutic or prophylactic agent for cancer is provided.
  • an anticancer effect for example, a cancer cell growth inhibitory effect, a cancer treatment or preventive effect, and the like
  • a cancer cell growth inhibitor comprising the antisense oligonucleotide and A therapeutic or prophylactic agent for cancer
  • SEQ ID NO: 1 is the base sequence of an antisense oligonucleotide corresponding to the base sequence at positions 47 to 51 of 7SL RNA.
  • SEQ ID NO: 3 is a partial base sequence of transforming RNA.
  • SEQ ID NO: 4 is the base sequence of an oligodeoxynucleotide prepared based on the partial base sequence of transforming RNA.
  • SEQ ID NO: 5 is a partial base sequence of an oligonucleotide.
  • SEQ ID NO: 6 is the base sequence of antisense oligodeoxynucleotide relative to the base sequence of oligodeoxynucleotide.
  • SEQ ID NO: 7 is a partial base sequence of an antisense oligonucleotide.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用等を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤を提供する。 　シグナル認識粒子（ＳＲＰ）の７ＳＬ　ＲＮＡの４７～５１位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖抑制剤、並びに前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌の治療剤又は予防剤。                                                                                 

Description

明 細 書
抗癌作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
技術分野
[0001] 本発明は、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用等を 有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含 有してなる癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤に関する。
背景技術
[0002] 動物細胞における分泌タンパク質の合成にはシグナル認識粒子 (signal
recognition particle; SRP)が関与する。 SRPは全体で 1 ISの沈降係数を持っており 、 7SL RNAと 6種のタンパク質よりなる。
[0003] 分泌タンパク質の合成は、その mRNAが遊離リボソームと結合することにより開始さ れる。リボソームとはタンパク質の合成場であり、 rRNAと多数のリボソームタンパク質 力もなる。真核生物の場合、全体で 80Sの沈降係数を持つ力 さらに 60Sと 40S力 なる 2つの粒子に分力、れ、前者 ίま 5S、 5. 8S及び 28Sの各 rRNAを、後者 ίま 18Sの r RNAを、各 1分子ずつ含む。
[0004] SRPは、リボソーム力も伸長してきた分泌タンパク質前駆体の N末端或はその近傍 に存在する疎水性アミノ酸配列力もなるシグナルペプチドを認識し、タンパク質ーリボ ソーム複合体に結合する。それにより、その先のタンパク質の翻訳は停止する。 SRP は該複合体を小胞体の膜へ輸送し、小胞体の細胞質ゾル側にある SRPレセプター タンパク質に結合する。 SRPの結合した複合体が該膜に結合すると翻訳阻害が解か れ、 SRPは解離し、リボソームは該膜に固定される。次いで翻訳が継続され、ポリべ プチド鎖が該膜を通過し、成熟型の分泌タンパク質が作られる。
[0005] 一方、真核細胞の核内では、前記のようにタンパク質の翻訳に関与する mRNA等 の他、長さが 100— 300塩基程度の核内低分子 RNAと呼ばれる一群の RNAが合 成される。それらは、通常、タンパク質と結合してリボ核タンパク質として存在する。核 内低分子 RNAとしては、例えば、 Ul、 U2、 U3、 U4、 U5、 U6と呼ばれる RNAが知 られている。核内低分子 RNAの機能としては、 Ul、 U2、 U4、 U5、 U6が mRNA前 駆体のスプライシングに関与することが示されているが、他の機能に関しては未だよ く分かっていない。
[0006] このように、核内低分子 RNAの機能には不明な点が多いが、 U5 RNAについて 、トランスフエクシヨンにより培養細胞を癌化させることが報告された (非特許文献 1参 照)。また、 U5 RNAの二次構造における first stemの 3'末端側の塩基配列（配列 番号： 2)にポリ（A)付加し、 RNAポリメラーゼ II依存的に転写させた転写物〔トランス フォーミング RNA (Transforming RNA)〕も同様に癌化能を有することが示された（非 特許文献 2参照)。なお、癌化能はトランスフォーミング RNA内の特定の塩基配列（ 配列番号: 3)に依存した。
[0007] ゥサギ網赤血球抽出液を用いたタンパク質合成実験においては、トランスフォーミ ング RNAは分泌タンパク質の合成を抑制した (非特許文献 3参照)。配列番号： 4記 載の塩基配列を有するオリゴデォキシヌクレオチド (ODN)も同様にゥサギ網赤血球 抽出液内で分泌タンパク質の合成を抑制した。さらに、 ODN内の特定の塩基配列（ 配列番号： 5)部分でリボソームの 28S RNAと結合することが明らかにされた。一方
)は SRP内の 7SL RNAと結合し、分泌タンパク質の合成抑制を減ずる方向（結果と して分泌タンパク質合成は促進される）に働くこと力 さら〖こ、アンチセンス ODN内の 特定の塩基配列（配列番号： 7)部分で 7SL RNAの 48— 51位の塩基配列（配列番 号： 8)と結合することが報告された (図 1参照)。
[0008] これらの報告は、 U5 RNAに内在する塩基配列が癌化能及び分泌タンパク質合 成抑制能という新たな機能を発揮すると共に、 U5 RNAの癌化能等の発現に関与 すると推定される塩基配列部分に対するアンチセンス ODNには U5 RNAの癌化能 等を抑制する作用があることを示唆するものである力 U5 RNAの癌化能等の抑制 にはどのような要素が必要十分であるかについては未だ不明である。
非特許文献 l :Mol. Cell Biol. 9, 4345-4356 (1989)
非特許文献 2 :Mol. Carcinog. 20, 175-188 (1997)
非特許文献 3 : J. Biol. Chem. 274(22), 15786-15796 (1999)
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0009] 本発明は、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用等を 有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該アンチセンスオリゴヌクレオチドを含 有してなる癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤を提供することを目的とす る。
課題を解決するための手段
[0010] 前記した通り、 U5 RNAの癌化能等の発現に関与すると推定される塩基配列部 分に対するアンチセンス ODNには U5 RNAの癌化能等を抑制する作用があること が示唆された力 U5 RNAの癌化能等の抑制にはどのような要素が必要十分であ るかについては未だ不明であった。
[0011] そこで、本発明者は鋭意検討した結果、意外にも、シグナル認識粒子 (SRP)の 7SL
RNAの 47— 51位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドこそが U5
RNAの癌化能等の抑制に著効を発揮し得ることを初めて明らかにし、本発明を完成 させるに至った。
[0012] すなわち、本発明は、 U5 RNA及び U5 RNAに由来するトランスフォーミング R NAの癌化能に連関する初期機能の解明を基礎に、ヒト癌細胞に対し致死並びに増 殖抑制作用等を発揮して拮抗的に働く物質を探索し明らかにしたことによりなされた ものである。
[0013] 本発明は、
〔1〕 シグナル認識粒子（SRP)の 7SL RNAの 47— 51位の塩基配列に対するアン チセンスオリゴヌクレオチド、
〔2〕 配列番号： 1記載の塩基配列からなる前記〔1〕記載のアンチセンスオリゴヌタレ ォチド、
〔3〕 前記〔1〕又は〔2〕に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細 胞増殖抑制剤、
〔4〕 前記〔1〕又は〔2〕に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌の 治療剤又は予防剤、
〔5〕 アンチセンスオリゴヌクレオチドがリボソーム中に存在してなる前記〔4〕記載の 治療剤又は予防剤、
〔6〕 アンチセンスオリゴヌクレオチドがベクターと連結されたものである前記〔4〕又は 〔5〕記載の治療剤又は予防剤、並びに
〔7〕 前記〔3〕に記載の癌細胞増殖抑制剤、又は前記〔4〕一〔6〕いずれかに記載の 治療剤若しくは予防剤の製造のための前記〔1〕又は〔2〕に記載のアンチセンスオリゴ ヌクレオチドの使用方法、
を提供するものである。
発明の効果
[0014] 本発明のアンチセンスヌクレオチドによれば、癌細胞の増殖抑制や死滅、癌の症状 の緩和又は改善、癌の治療又は予防等を行うことができる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1は、ゥサギ細胞由来 SRPの 7SL RNAの構造の模式図である。図中の数 字は塩基の位置を示す (3'、 5'を除く)。
[図 2]図 2は、実施例において作製したアンチセンスオリゴヌクレオチドである oligol— 5のヒト癌細胞の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。
[図 3]図 3は、 oligo3のヒト癌細胞の増殖に及ぼす濃度依存的な影響を示すグラフで ある。
[図 4]図 4は、 oligol— 5のヒト癌細胞の細胞 DNA合成に及ぼす影響を示すグラフで ある。
[図 5]図 5は、 oligo3のヒト癌細胞の死滅に及ぼす影響を示すグラフである。
[図 6]図 6は、 gZg体重で静脈内投与した場合の oligo3のマウスの体重増加に 及ぼす影響を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
[0016] 本明細書において、「ヌクレオチド」とは DNA及び RNAを含む意味で用いられる。
また、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、特定の塩基配列（以下、センス配列とい う）に対し相補的な塩基配列を有し、かつセンス配列にハイブリダィズし得るオリゴヌ クレオチドをいう。
[0017] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対応するセンス配列は、 SRPの 7SL R NAの 47— 51位の塩基配列である。図 1は、ゥサギ細胞由来 SRPの 7SL RNAの 構造を模式的に示す。 7SL RNAの塩基配列は種々動物細胞由来のものが知られ ている。例えば、前記ゥサギ細胞由来のものは非特許文献 3に、ヒト細胞由来のもの は Ullu, E" and Wiener, A. M., (1984) EMBO J. 3. 3303- 3310.に記載されている。ま た、その他の動物由来のもの力 例えば、 Larzen, N., and Zwieb, C, (1991) Nucleic Acids Res., 19, 209-215.に記載されている。少なくとも哺乳動物細胞では上記 7SL RNAの 47— 51位の塩基配列は同一である。
[0018] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制 作用、癌の治療又は予防作用等を有する。中でも、配列番号： 1記載の塩基配列か らなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが有用である。癌細胞増殖抑制作用には癌細 胞死滅作用も含まれる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの 、ずれの作用も 、その U5 RNAの癌化能等の抑制作用に基づくものと推定される。なお、本発明の アンチセンスオリゴヌクレオチドの癌細胞増殖抑制作用は後述の実施例に記載の方 法に従って確認することができる。
[0019] 本発明のアンチセンスオリゴヌクオレチドの合成方法としては、特に限定されず、公 知のオリゴヌクレオチド合成機を用いたホスホロアミダイト法、ホスホロチォエート法、 ホスホトリエステル法等を用いることができる。
[0020] また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性や細胞に対する親和性を 高めるために、その活性を著しく低下させない範囲で、リン酸エステル基又はリボー ス部分の水酸基を他の安定な基に置換した誘導体として用いることも可能である。こ のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドの誘導体の具体例としては、リン酸エステル 基をチォリン酸エステル基やメチルホスホネート基等で置換したもの、リボース部分の 水酸基をメトキシ基ゃァリロキシ基等のアルコキシ基、アミノ基、又はフッ素原子等で 置換したもの等が挙げられる。
[0021] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの分子設計においては、それを構成する 塩基の配列が重要であり、該オリゴヌクレオチドには天然型の核酸分子の他、前記し たような非天然型の修飾オリゴヌクレオチドが含まれる力 さらにペプチド核酸型の修 飾化合物 (PNA)であってもよ ヽ。細胞膜や核膜等の透過性が良好であることから、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、その構造中に糖 (好ましくはベント ース)構造を有するものが好まし 、。
[0022] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 DNA型であっても RNA型であっても よいが、生体に投与した際の安定性がより高いという観点力も DNA型であるのが好 ましい。
[0023] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単独で用いることもできる。従って、本発 明により提供される癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤（以下、まとめて 製剤という場合がある）は、該アンチセンスオリゴヌクレオチドそのもの力もなつてもよ いが、薬学的に許容され得る物質と混合し、公知の方法に従って製剤の形態に調製 したものが好ましい。なお、癌細胞増殖抑制剤と癌の治療剤又は予防剤とは、その組 成、製造方法等において特に区別されるものではないが、癌細胞増殖抑制剤は、癌 の症状の緩和若しくは改善、又は癌の治療若しくは予防に使用される以外に、例え ば、通常の実験過程において一般の試薬として癌細胞増殖抑制のために使用され ることをも意図したものである点で異なる。該製剤は、例えば、以下のようにして製造 することができる。
[0024] 例えば、注射剤とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを水、生 理食塩水又はブドウ糖溶液等に溶解させて調製することができ、所望により緩衝剤、 保存剤又は安定化剤等を含有させてもよ!ヽ。
[0025] 軟膏剤とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、油脂性、乳剤 性又は水溶性の基剤に溶解又は分散させて調製することができ、所望により安定ィ匕 剤、 PH調整剤、可塑剤、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤 、溶剤又は吸収促進剤等を含有させてもよい。
[0026] 乳剤、ローション剤等とする場合には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、 水相中に溶解又は分散させ、炭化水素や高級アルコール等の油相成分と乳化する ことにより調製することができ、所望により安定化剤、 pH調整剤、可塑剤、乳化剤、界 面活性剤、可溶化剤、湿潤剤、保存剤、防腐剤、溶剤又は吸収促進剤等を含有させ てもよい。
[0027] また、本発明の細胞増殖抑制剤は、一般の試薬として、例えば、水を添加すること で容易に溶液とすることができる乾燥品として調製してもよ 、。
[0028] 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの生体におけるより効率的な取り込みや効 果の持続性を所望する場合、薬学的に許容される公知の担体と組み合わせて製剤と するのが好ましい。担体としては、例えば、リボソーム、脂肪乳剤、ミセル等の脂質を 主成分とする担体、ポリリジンやポリオル-チン等のペプチド性担体、ポリエチレンィ ミン、ポリ乳酸 Zグリコール酸共重合体等の合成高分子担体等が挙げられる。中でも 、リボソームと組み合わせてなる製剤が好ましい。力かる製剤においては、本発明の アンチセンスオリゴヌクレオチドはリボソーム中に包埋されて存在するのが好ましい。 これらの担体を用いた製剤化は公知の方法に従って行うことができる。
[0029] 例えば、リボソームを用いる製剤化の方法は、 Gregory, G. (ed), Liposome
Technology: Liposome Preparation and Related Techniques. 2" Ed., CRC Pr., 1992.等に記載されている。リボソームと組み合わせてなる製剤は、リボソームの形成 に通常使用されるリン脂質、糖脂質、中性脂質等の脂質に加え、形成されたリポソ一 ムにカチオン性の電荷を与えるような物質、例えば、ジセチルリン酸、ステアリルァミン や、リボソームの酸化を防止するような物質、例えば、 α—トコフエロール等を含んで いてもよい。また、細胞への取り込みの促進や標的細胞への指向性を高める目的で 上記担体を任意に修飾したものも使用可能である。
[0030] なお、これらの製剤は、抗癌作用が認められている公知の他の成分を含有するもの であってもよい。
[0031] また、前記製剤においては、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをベクターと 連結して、すなわち、任意のベクターに組み込んでなるものを用いることができる。そ の場合、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは適当なプロモーターに作動可能に連結 されているのが好ましい。ここで「作動可能に」とは、プロモーターの作用により該アン チセンスオリゴヌクレオチド (RNA)が生体の細胞内で発現されうることを意味する。 ベクターとしては、特に限定されるものではないが、例えば、アデノウイルスベクター、 ワクシニアウィルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。このようなベクタ 一は遺伝子治療用のベクターとして有用である。力かるベクターの構築方法、具体的 な用法等については、例えば、 Sambrook, J., et. al.， Molecular cloning: A Laboratory Mannual; 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor.
NY., 1989.等の成書を参照すればよい。
[0032] 本発明の製剤中のアンチセンスオリゴヌクレオチドの含有量としては特に限定はな ぐ各製剤に応じた使用態様に合わせて所望の効果が得られるように適宜調節すれ ばよいが、通常、 1一 10重量％程度が適当である。
[0033] 以上により、本発明の癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤が得られる。
よって、本発明の別の一態様として、本発明の癌細胞増殖抑制剤、又は癌の治療剤 若しくは予防剤の製造のための本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用方法 が提供される。
[0034] 本発明の癌の治療剤又は予防剤の生体への投与方法としては、該治療剤又は予 防剤の形態に応じて、例えば、経口投与、静脈内投与、経皮的投与、局所投与、腹 腔内投与等が挙げられるが、特に限定されるものではない。本発明の癌の治療剤又 は予防剤の投与方法は、各個体、各疾患の状況等に応じてより有効性の高い方法 を選択すればよいが、通常、静脈内による投与が好ましい。また、癌の治療剤又は予 防剤の投与量も症状等に応じて適宜決定すればよぐ特に限定されるものではない 力 静脈内による投与の場合、例えば、 1日当たりヒトに対し、本発明のアンチセンス オリゴヌクレオチドの量に換算して、好ましくは 0. 1— lmgZkg体重、より好ましくは 0 . 1-0. 5mgZkg体重が適当である。投与は 1日内で単回で行なっても複数回に分 けて行ってもよい。また、投与期間も特に限定されるものではない。
[0035] なお、本発明の癌の治療剤又は予防剤の投与対象である生体としては、前記ヒトに 限定されるものではなぐ例えば、ヒト以外の哺乳動物等も包含される。また、本発明 の癌細胞増殖抑制剤を本発明の癌の治療剤又は予防剤と同様にして用いることもで きる。
[0036] 本発明の癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤による抗癌作用の標的と なる癌細胞の所在は特に限定されるものではな 、が、中でも癌細胞が皮膚等の体表 面、食道、胃及び大腸など消化管、動脈内投与可能な肝臓等に由来するものである のが好適である。
[0037] なお、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドには、例えば、後述の参考例 1に示 すように特に毒性は認められな ヽ。
実施例
[0038] 以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はかかる実施例のみ に限定されるものではない。
[0039] 実施例 1
前記トランスフォーミング RNAは細胞の癌化と分泌タンパク質の合成抑制に関与し ていることから、細胞の癌化には分泌タンパク質の合成抑制がかかわっているものと 推定される。一方、アンチセンス ODN (配列番号: 6)は分泌タンパク質の合成抑制を 減ずる方向に作用することから、当該アンチセンス ODNは癌化に杭して働くことが期 待される。
[0040] そこで、ゥサギ細胞由来 SRPの 7SL RNAの 48— 51位の塩基配列（配列番号： 8 )を中心とした数残基力 なる塩基配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド (ホス ホロチォエートオリゴ)を合成し、細胞外からの取り込みによるヒト癌細胞への影響を 検討した。なお、ヒト細胞由来の 7SL RNAの塩基配列はゥサギ細胞由来のものと 同じ塩基配列を有することが知られて 、る。
[0041] 以下の表 1に示す塩基配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド (DNA)をタカ ラバイオ株式会社に依頼して作製した。なお、表中、 oligol— 5はアンチセンスオリゴ ヌクレオチドの名称を、括弧内の番号は 7SL RNAの塩基配列の対応位置を示す。 また、 oligo5は 7SL RNAの塩基配列に基づくことなくランダムに作製されたアンチ センスオリゴヌクレオチドの混合物であり、 Nは A、 C、 G又は Tを示す。
[0042] [表 1] oligo 1 CCTC (48-51)
oligo厶 GCCTC (48-52)
oligo 3 CCTCA (47-51)
oligo 4 GCCTCA (47-52)
oligo 5 NNNNN [0043] 各 oligoの細胞増殖に対する影響を検討した。すなわち、 10%の熱不活性ィ匕ゥシ胎 児血清（FCS)を含む DMEM培地中のヒト癌細胞である HeLa細胞を 96穴プレート に 1500個の密度で播種した。 24時間培養後、培養液を、 10 Mの濃度で各 oligo 及び 1% FCSを含む培養液に交換した。培養は CO存在下に 37°Cで行った。その
2
後、 24時間間隔で 4日間に渡り、細胞計数キット (株式会社同仁堂製)を用い、 MTT 変法 (WST— 1 + 1ーメトキシ PMS)により生細胞の割合〔細胞生存率（％)〕を調べた ( 吸光度: 450— 650nm)。なお、培養液を、いずれの oligoも含まない培養液に交換 したものを対照とした (以下、同様)。
[0044] 図 2は、各 oligoのヒト癌細胞の増殖に及ぼす影響を示すグラフである。実験は三連 で行った。グラフ中、各データを平均士 SDで示す（以下、同様)。 oligo3において細 胞生存率が最も低ぐヒト癌細胞の増殖抑制効果が強いことが分かる。なお、 1、 2、 3 、そして 4曰目の各糸田胞生存率 ίま対照に対し 49. 60/0、 62. 7%, 71. 6%,そして 71 . 1%であった。
[0045] 次に、 oligo3に関し、培養液中の濃度を 2. 5、 5、 10及び 20 Mに設定して同様 の実験を行い、ヒト癌細胞の増殖抑制と濃度との関係を調べた。
[0046] 図 3は、 oligo3のヒト癌細胞の増殖に及ぼす濃度依存的な影響を示すグラフである 。 oligo3のヒト癌細胞の増殖抑制は濃度に比例して増大することが分かる。なお、 1、 2、 3、そして 4日目の各細胞生存率は対照に対し 44. 4%、 45. 1%、 55. 5%、そし て 63. 8%であった。
[0047] また、各 oligoの細胞 DNA合成に与える影響について細胞による〔¾〕メチルチミジ ンの取り込みを観察して検討した。すなわち、前記と同様にして細胞を 24時間培養 後、培養液を、 5、 10又は 20 Mの濃度の各 oligo及び 0. 1% FCSを含む培養液 に交換した。 18時間後、： CiZmLの〔 〕メチルチミジンを培養液に添加し、さら に 6時間培養した。培養後、所定の処理の後に細胞の比放射活性を液体シンチレ一 シヨンカウンタ一により根 lj定した。
[0048] 図 4は、各 oligoのヒト癌細胞の細胞 DNA合成に及ぼす影響を示すグラフである。
oligo3において〔 〕メチルチミジンの細胞への取り込みが最も低く抑えられ、ヒト癌細 胞の増殖抑制効果が強いことが分かる。なお、 oligo3存在下でのヒト癌細胞の〔 〕メ チノレチミジン取り込み率 ίま対照に対し、 5、 10、そして 20 Μの濃度で、 57. 50/0、 3 2. 0%、そして 16. 6%であった。
[0049] さらに、 oligo3によるヒト癌細胞における細胞死の誘発について検討した。すなわち 、スライドチャンバ一に 3000個の HeLa細胞を播種した。 24時間培養後、培養液を、 oligo3を 20 Mの濃度で含む培養液に交換した。 oligo3の添加から約 18時間後、 実体顕微鏡 (倍率 100倍；ォリンパス社製)で培養細胞を観察したところ、細胞の小 円化力も細胞死に至る過程が観察された。さらに、 oligo3の添加から 24時間後、リン 酸緩衝生理食塩水（PBS)で細胞洗浄後にギムザ染色を行!ヽ、生細胞と死細胞の数 を測定し、得られた各細胞数力も細胞生存率 (％)を求めた。なお、対照として、さら 【こ oligo5を用 ヽた。
[0050] 図 5は、 oligo3のヒト癌細胞の死滅に及ぼす影響を示すグラフである。 oligo3での細 胞生存率は 30. 8%である一方、対照及び oligo5ではそれぞれ 98. 5%及び 98. 7 %であり、 oligo3での細胞生存率が他の対照に比し有意に低いことから、 oligo3はヒト 癌細胞に対する高い細胞死誘発作用を有することが分力る。
[0051] 以上より、 SRPの 7SL RNAの 47— 51位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴ ヌクレオチドである oligo3 (配列番号： 1)は、癌細胞の増殖を抑制し、また、その細胞 死を誘発する作用を有することが分かる。よって、 oligo3は抗癌剤としての効用が期 待される。
[0052] 参考例 1
前記 oligo3の毒性について検討した。すなわち、 oligo3を lmgZmLとなるように生 理的食塩水に溶解させたものを用いて、雌のマウス（5週齢）に対し、体重 lg当たり 2 0 gを静脈内投与した。投与当日（0日）及び投与から 2、 5、 10、 12及び 14日後の マウスの体重を測定した。
[0053] 図 6は、 20 μ gZg体重で静脈内投与した場合の oligo3のマウスの体重増加に及ぼ す影響を示すグラフである。グラフ中、各データを平均士 SEで示す。なお、各データ は、 oligo3については 7匹、対照については 6匹のマウスを用いて得た。
[0054] 図 6に示すように、 oligo3と対照とで体重増加に与える影響に差はな力つた。また、 両者で特に異なった症状の発生も確認されな力つた。これらの結果より、 oligo3は特 に毒性を示さな 、ものと考えられる。
産業上の利用可能性
[0055] 本発明により、抗癌作用、例えば、癌細胞増殖抑制作用、癌の治療又は予防作用 等を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、並びに該アンチセンスオリゴヌクレオチド を含有してなる癌細胞増殖抑制剤及び癌の治療剤又は予防剤が提供される。これら は、癌の治療分野において大きく寄与し得る。
配列表フリーテキスト
[0056] 配列番号： 1は、 7SL RNAの 47— 51位の塩基配列に対するアンチセンスオリゴ ヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号： 3は、トランスフォーミング RNAの部分塩基配列である。
配列番号: 4は、トランスフォーミング RNAの部分塩基配列に基づいて作製された オリゴデォキシヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号： 5は、オリゴデォキシヌクレオチドの部分塩基配列である。
配列番号: 6は、オリゴデォキシヌクレオチドの塩基配列に対するアンチセンスオリ ゴデォキシヌクレオチドの塩基配列である。
配列番号： 7は、アンチセンスオリゴデォキシヌクレオチドの部分塩基配列である。

Claims

請求の範囲
[1] シグナル認識粒子（SRP)の 7SL RNAの 47— 51位の塩基配列に対するアンチ センスオリゴヌクレオチド。
[2] 配列番号： 1記載の塩基配列力 なる請求項 1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチ ド、。
[3] 請求項 1又は 2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌細胞増殖 抑制剤。
[4] 請求項 1又は 2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有してなる癌の治療剤 又は予防剤。
[5] アンチセンスオリゴヌクレオチドがリボソーム中に存在してなる請求項 4記載の治療 剤又は予防剤。
[6] アンチセンスオリゴヌクレオチドがベクターと連結されたものである請求項 4又は 5記 載の治療剤又は予防剤。
[7] 請求項 3に記載の癌細胞増殖抑制剤、又は請求項 4一 6いずれかに記載の治療剤 若しくは予防剤の製造のための請求項 1又は 2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオ チドの使用方法。
PCT/JP2004/015932 2004-01-22 2004-10-27 抗癌作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド WO2005071082A1 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2004800187313A CN1816626B (zh) 2004-01-22 2004-10-27 具有抗癌作用的反义寡核苷酸
EP04793044A EP1707630B1 (en) 2004-01-22 2004-10-27 Antisense oligonucleotide having anticancerous activity
US10/558,265 US7393951B2 (en) 2004-01-22 2004-10-27 Antisense oligonucleotide having anticancerous activity
JP2005517190A JP4226006B2 (ja) 2004-01-22 2004-10-27 抗癌作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
AT04793044T ATE428786T1 (de) 2004-01-22 2004-10-27 Antisense-oligonukleotid mit antikrebsaktivität
DE602004020677T DE602004020677D1 (de) 2004-01-22 2004-10-27 Antisense-oligonukleotid mit antikrebsaktivität

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-014883 2004-01-22
JP2004014883 2004-01-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005071082A1 true WO2005071082A1 (ja) 2005-08-04

Family

ID=34805433

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/015932 WO2005071082A1 (ja) 2004-01-22 2004-10-27 抗癌作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7393951B2 (ja)
EP (1) EP1707630B1 (ja)
JP (1) JP4226006B2 (ja)
CN (1) CN1816626B (ja)
AT (1) ATE428786T1 (ja)
DE (1) DE602004020677D1 (ja)
WO (1) WO2005071082A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007035962A2 (en) * 2005-09-23 2007-03-29 California Institute Of Technology Gene blocking method
CN109517894B (zh) * 2018-08-31 2020-01-21 清华大学 一种与肝癌相关的非编码rna生物标志物及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994008003A1 (en) 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
US5985558A (en) * 1997-04-14 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos
US5827705A (en) * 1996-03-22 1998-10-27 South Alabama Medical Science Foundation Molecule and method for importing DNA into a nucleus
US6130207A (en) * 1997-11-05 2000-10-10 South Alabama Medical Science Foundation Cell-specific molecule and method for importing DNA into a nucleus
EP1049772A1 (en) * 1998-01-30 2000-11-08 Genesense Technologies, Inc. Oligonucleotide sequences complementary to thioredoxin or thioredoxin reductase genes and methods of using same to modulate cell growth
AU2002217932A1 (en) * 2000-12-01 2002-06-11 Origene Technologies Inc Prostate polynucleotides and uses
US20030232443A1 (en) * 2002-06-18 2003-12-18 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of centromere protein B expression

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAMADA K. ET AL.: "Effect of transforming RNA on the synthesis of a protein with a secretory signal sequence in vitro", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 22, 1999, pages 15786 - 15796, XP002984437 *
LIU L. ET AL.: "The trypanosomatid signal recognition particle consists of two RNA moleculaes, a 7SL RNA homologue and a novel tRNA-like molecule", J. BIOL. CHEM., vol. 278, no. 20, 2003, pages 18271 - 18280, XP002984439 *
ULLU E. ET AL.: "Alu sequences are processed 7SL RNA genes", NATURE, vol. 312, no. 5990, 1984, pages 171 - 172, XP002984438 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1707630A4 (en) 2007-01-24
US7393951B2 (en) 2008-07-01
JPWO2005071082A1 (ja) 2007-12-27
US20070129318A1 (en) 2007-06-07
EP1707630B1 (en) 2009-04-15
CN1816626A (zh) 2006-08-09
CN1816626B (zh) 2010-05-26
ATE428786T1 (de) 2009-05-15
EP1707630A1 (en) 2006-10-04
DE602004020677D1 (de) 2009-05-28
JP4226006B2 (ja) 2009-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2281041B1 (en) Silencing of csn5 gene expression using interfering rna
AU2002255285B2 (en) Circular dumbbell decoy oligodeoxynucleotides (CDODN) containing DNA bindings sites of transcription
IL195181A (en) Compositions for inhibiting the expression of the pcsk9 gene
CA2163234A1 (en) Inhibition of proliferation of vascular smooth muscle cell
KR20180018405A (ko) 세포투과성이 향상된 펩티드 핵산 복합체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
CA2677176A1 (en) Inhibition of bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
KR20150006743A (ko) 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR20150006742A (ko) 간암 연관 유전자 특이적 siRNA, 그러한 siRNA를 포함하는 이중나선 올리고 RNA 구조체 및 이를 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
WO2018084168A1 (ja) 皮膚線維症処置剤
WO2011010691A1 (ja) Ｐｈｄ２発現抑制物質搭載ポリイオンコンプレックス
AU2019375245B2 (en) Composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising skin-penetrating nucleic acid complex as effective component
WO2005071082A1 (ja) 抗癌作用を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
WO2011065677A2 (ko) 암 치료용 약학 조성물
JPH10506003A (ja) プレイオトロフィンのアンチセンスオリゴヌクレオチド
KR20190132220A (ko) 매트릭스메탈로프로티나제-1 안티센스 올리고뉴클레오티드
KR20220070206A (ko) 혈소판 감소증 치료용 핵산 분자 및 그의 이용
JPWO2004027061A1 (ja) 抗増殖性疾患治療薬のスクリーニング法
WO2022197607A2 (en) Methods of cancer treatment by delivery of sirnas against bclxl and mcl1 using a polypeptide nanoparticle.
EP4093870A1 (en) Compositions for the treatment of nash and associated disorders and methods of using same
EP4110921A1 (en) Chemically modified transfer rna-derived small rnas (tsrnas) to target pathogenic bacteria
KR101722948B1 (ko) 리간드가 결합된 이중나선 올리고 ｒｎａ 구조체 및 그 제조방법
GB2574845A (en) Therapeutically active complexes
JP2003192692A (ja) Ｖｅｇｆアンチセンス化合物
JP2006111540A (ja) リポソーム

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005517190

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004793044

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2007129318

Country of ref document: US

Ref document number: 10558265

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20048187313

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004793044

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10558265

Country of ref document: US