WO2005063992A1

WO2005063992A1 - 新規血清型のストレプトコッカスミュータンスおよびその利用

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Publication number: WO2005063992A1
Application number: PCT/JP2004/019631
Authority: WO
Inventors: Takashi Ooshima; Kazuhiko Nakano
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Priority date: 2003-12-30
Filing date: 2004-12-28
Publication date: 2005-07-14
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Abstract

　本発明は、ストレプトコッカス　ミュータンス血清型特異的多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、当該ポリヌクレオチドを有する新規ストレプトコッカス　ミュータンス株、および当該ストレプトコッカス　ミュータンス株に特異的な抗体、ならびに被験体中に存在する当該ストレプトコッカス　ミュータンス株を検出する方法に関する。本方法に従うと、血清型が不定であるストレプトコッカス　ミュータンスが被験体中に存在か否かが確認され得、その結果、感染性心内膜炎発症の可能性の高い対象を特定し得る。

Description

明細書

新規血清型のストレプトコッカスミュータンスおよびその利用

技術分野

[0001] 本発明は、ストレプトコッカスミュータンス（Streptococcus mutans (S. mutans) )の新規血清型株、当該新規血清型株に特異的な抗体、当該抗体を作製する方法、当該抗体を用いる当該新規株を検出するための方法およびキット、ならびに、 S.

mutansの新規血清型株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを用いる当該新規株を検出するための方法およびキットに関する。具体的には、上記抗体と被験体サンプル力抽出した表層多糖抗原とを免疫反応させることによって、または被験体サンプルより抽出したゲノム DN Aに対して上記ポリヌクレオチドを用いてハイブリダィゼーシヨンを行うかもしくは上記ポリヌクレオチドを用いて PCR反応を行うことによって、被験体における S. mutansの新規血清型株の存在を検出する方法および当該検出方法を行うためのキットに関するものである。

背景技術

[0002] ストレプトコッカスミュータンス（S. mutans)力う蝕（むし歯）の原因菌として有名である。う蝕は、 S. mutansが発生する酸によって歯が溶出する疾患である。 S. mutansは、口腔内で増殖して酵素ダルコシルトランスフェラーゼを分泌する。この酵素は、食物中の糖分を分解して不溶性の多糖類グルカンを生成する。生成したグルカンは、 S. mutans菌体とともに歯の表面に付着してプラーク（歯垢）を形成する。 S. mutansは、プラーク内で糖を代謝して乳酸などの酸を生成する。この酸が歯表面のエナメル質力カルシウムを溶出し、その結果、う蝕が進行する。以上のように、う蝕は、歯科領域において重要な疾患の 1つであるので、う蝕の治療および予防に関する研究が進められている。

[0003] 細菌を分類する公知の方法としては、生理生化学的性状に基づく方法、キノン組成、菌体脂肪酸組成または細胞壁成分等に基づく方法、 DNAの G + C含量に基づく方法、 DNA相同性に基づく方法、 DNAプローブを用いる方法、および 16Sリボソーム RNA (rRNA)遺伝子の塩基配列の解析を行う方法等が挙げられる。特に、近年では、 16Sリボソーム RNA遺伝子の塩基配列に基づ!/、て系統分類したグループ（クラスター）を指標とする細菌の分類および識別が行なわれてヽる。

[0004] ミュータンス連鎖球菌（mutans streptococci)は、その細胞壁多糖類の組成およびその連鎖における相違に基づいて、 Streptococcus mutans (S. mutans) (血清型 c、 e 、 f)、 Streptococcus sobrinus (皿清型 d、 g)、 Streptococcus cncetus血清型 aノ、 Streptococcus rattus (血清型 b)、 Streptococcus ferus (血清型 c)、 Streptococcus macacae (血清型 c)、及び Streptococcus downei (血清型 h)の計 8つの血清型に分類される。

[0005] さらに、 S. mutansは、感染性心内膜炎（Infective Endocarditis； IE)患者の血液より分離されることがある。感染性心内膜炎は、歯科領域において最も良く知られている全身性疾患の一つである。感染性心内膜炎は致死的な感染症であり、心臓弁置換術を受けた患者または心臓に先天性奇形を有する患者が罹患しやすヽとされる。感染性心内膜炎は、歯科治療によって患者の血液中に原因菌が侵入し、心内膜に細菌塊を形成して炎症を引き起こす。この原因菌は、口腔に存在する連鎖球菌 (特に、 Streptococcus sanguinis)であることが多いが、 S. mutansもまた原因菌として挙げられ得る。

[0006] 通常、感染性心内膜炎を発症する患者を歯科治療する場合は、治療の前に抗生物質の投与が行なわれ、そして抗生物質の血中濃度が上昇してから下降するまでの間に治療が行なわれる (非特許文献 1および 2参照)。

[0007] 〔非特許文献 1〕

Dajani A. S. et al.， Prevention of Bacterial Endocarditis； Recommendations by the American Heart Association. Circulation 1997 96: 358—366.

〔非特許文献 2〕

Nakatani S et al" Current characteristics of infective endocarditis in Japan ; an analysis of 848 cases in 2000 and 2001. Circ. J. 2003 67: 901-905.

[0008] 感染性心内膜炎を予防するために、多量の抗生物質が使用される。例えば、ベニシリン系抗生物質であるサヮシリンは、体重 25kgの子供に 1回につき lOOOmgが力プセルまたは粉末にて術前投与される。

[0009] このような多量の抗生物質は、医学的に必要である。しかし、抗生物質の乱用に起因する薬剤耐性菌の出現は、近年大きな問題となっている。従って、抗生物質の使用量を減らすこと、および抗生物質の使用による耐性菌出現を抑制することは、有用である。

[0010] 本発明者らの以前の研究において、抜歯処置の後の菌血症患者または感染性心内膜炎患者力も分離した 4つの連鎖球菌株は、その生物学的な性質および 16Sリボソーム RNAの塩基配列に基づヽて S. mutans株と特定された (非特許文献 3参照)。通常、 S. mutans株は、その約 80%以上が血清型 cに分類される力上記患者の血液力も分離した 4株の S. mutansはいずれも血清型 cではなかった。これらの株のうち、 1 株が血清型 e、 1株が血清型 fであり、残りの 2つの株 (TW295及び TW871)は、公知の血清型 (c型、 e型または f型）のいずれにも属さず、血清学的に不定であった。

[0011] S. mutans株の血清型を決定する血清型特異的な多糖抗原は、ラムノース基本骨格と α—又は β 結合のダルコシド基側鎖とを有するラムノースグルコースポリマー力なる。上記 TW295株及び TW871株の血清学的に不定であるという性質は、血清型特異的な多糖抗原におけるグルコース側鎖の量の低下に起因することが示された。さらに、血清学的に不定な株 (便宜上、 S. mutansの血清型不定株と称する) TW 295及び TW871における血清型特異多糖抗原は、 gluA遺伝子 (グルコース側鎖ドナ一における直前の前駆体の生産を触媒する酵素をコードする）を不活性ィ匕した変異株における血清型特異多糖抗原と類似しており、 gluA遺伝子不活ィヒ変異株および S. mutansの血清型不定株のいずれにおいても、血清型特異多糖抗原のダルコ一スの量は低い。

[0012] また、 S. mutansの血清型不定株は、口腔力分離した株と同じくらい高い疎水性とショ糖依存的付着能とを有することが示され、また、食作用を受けにくいことが明らかになった。

[0013] 〔非特許文献 3〕

Pujiwara, Τ·， K. Nakano, M. Kawaguchi, T. oshima, S. Sobue, S. Kawabata, I. Nakagawa, and S. Hamada. 2001. Biochemical and genetic characterization of serologically untypable Streptococcus mutans strains isolated from patients with bacteremia. Eur. J. Oral Sci. 109: 330-334.

[0014] 上記の知見は、高い疎水性とショ糖依存的な付着レベルとに起因して、 S. mutans の血清型不定株がヒトの口腔に存在し得ることを意味する。さらに、 S. mutansの血清型不定株は、食作用を受けにくいために、血液中においてより長く生存することが可能になり、その結果、血液より分離されたと考えられる。

[0015] 感染性心内膜炎を予防するために、患者が感染性心内膜炎の原因菌 (例えば、 S. mutansの血清型不定株)を保有するか否かを簡便に同定することが、非常に望まれている。さらに、感染性心内膜炎の原因菌を特定することは、治療に用いる抗生物質を選択する際に有用である。しかし、患者が感染性心内膜炎の原因菌を保有するか否かを簡便に同定する方法や、感染性心内膜炎の原因菌を特定する方法は、未だ開発途上である。

[0016] 上述したように、 S. mutansの血清型不定株は血液中でも安定であり、その結果、 S. mutansの血清型不定株が感染した患者は感染性心内膜炎を発症する可能性が高いと考えられる。 S. mutansの血清型不定株は、死に至る可能性がある感染性心内膜炎の発症を予防する観点から重要であると考えられているので、 S. mutansの血清型不定株の分離および同定が、特に望まれる。

[0017] 本発明の目的は、当該 S. mutansの血清型不定株を分離および同定して、被験体中に存在するか否かを有効かつ効率的に判定する方法を提供することにある。発明の開示

[0018] 本発明者等は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、免疫方法に改良を加えることによって、 S. mutansの血清型不定株に対する抗血清を取得し、 S. mutansの血清型不定株を新規血清型 (k型)と定義した。

[0019] この新規血清型 k型を規定する多糖抗原を解析するために、 S. mutans多糖抗原の生合成に関与する酵素（rgpA、 rgpB、 rgpC、 rgpD、 rgpE、 rgpF、 ORF7、 rgpH、 rgplおよび ORF10)をコードする遺伝子の全配列を、当該 k型株において特定した。これらの遺伝子配列について k型株と既知の血清型 S. mutans株との間で比較して、 rgpFにおいて複数の k型株に共通した特異配列が存在することを見出した。さらに本発明者らは、 rgpFにおいて見出された S. mutansの k型株に特異的な塩基配列に基づ、て設計したプライマーを用いて、被験体より得られた組織サンプルを PCR増幅することによって、当該被験体における S. mutansの血清型不定株の存在を有効かつ効率的に検出することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

[0020] 即ち、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミユータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むことを特徴としている。

[0021] 好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴として、る。

[0022] 上記ポリヌクレオチドは、

配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列；または

配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列において 1もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列、

力もなることを特徴とするポリヌクレオチドであることが好ましい。

[0023] 上記ポリヌクレオチドはまた、

配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列力なるポリヌクレオチド;または

配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列力なるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列力もなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズするポリヌクレオチド、

であることが好ましい。

[0024] さらに好ましくは、上記ポリヌクレオチドは、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列からなることを特徴として、る。

[0025] 上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株に特異的に存在するポリヌクレオチドを提供することができる。

[0026] 即ち、本発明のオリゴヌクレオチドは、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むことを特徴として!ヽる。

[0027] 好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列またはその相補配列を含むことを特徴としている。

[0028] 上記オリゴヌクレオチドは、配列番号 8ないし 10に示される塩基配列またはその相補配列を含むことが好まし、。

[0029] 上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株を特異的に検出することに優れたオリゴヌクレオチドを提供することができる。

[0030] 即ち、本発明のポリペプチドは、ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させることを特徴としている。

[0031] 好ましくは、本発明のポリペプチドは、上記ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントによってコードされることを特徴として、る。

[0032] さらに好ましくは、本発明のポリペプチドは、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされることを特徴としている。

[0033] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型 c、 eまたは fの株以外の新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株に特異的に存在するポリべプチドを提供することができる。

[0034] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンス株は、ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量が低下していることを特徴とする。

[0035] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンス株は、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した新規血清型であることを特徴としている。

[0036] 1つの局面において、本発明のストレプトコッカスミュータンス株は、上記ポリヌクレォチドを有することが好まし、

他の局面において、本発明のストレプトコッカスミュータンス株は、上記ポリべプチドを発現することが好ましい。

[0037] 上記構成によれば、既知の血清型を有するストレプトコッカスミュータンスに関する新たな知見をカ卩えるとともに、既知の血清型を有するストレプトコッカスミュータンスだけでは解明できな力つた疾患の治療および zまたは予防に有用であるストレブトコッカスミュータンス株を提供することができる。

[0038] 即ち、本発明の抗体は、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカスミュータンスの血清型 c、eまたは fの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株の多糖抗原に特異的に結合することを特徴としている。

[0039] 即ち、本発明の抗体は、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株に特異的な多糖抗原に結合することを特徴として、る。

[0040] 好ましくは、本発明の抗体は、上記ストレプトコッカスミュータンス株の血清型特異多糖抗原と特異的に結合することを特徴とする。

[0041] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株を検出するために有用な抗体を提供することがでさる。

[0042] 即ち、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法は、上記オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR反応を行なう工程を包含することを特徴とする。

[0043] 好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法は、被験体サンプルより細菌を分離する工程、および、上記分離した細菌のゲノム DNAまたは総 RNAを抽出する工程をさらに包含することを特徴とする。

[0044] 本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法において、上記組織サンプルは血液、唾液または歯垢より得られることが好ましい。

[0045] 本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法において、上記プライマーは、配列番号 8に示される塩基配列力なるオリゴヌクレオチドおよび配列番号 9または 10に示される塩基配列力もなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。 [0046] 即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株の血清型特異多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードする遺伝子の存在を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。

[0047] 即ち、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法は、上記の課題を解決するために、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダィゼーシヨン反応を行なう工程を包含することを特徴とする。

[0048] 好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法は、被験体サンプルより細菌を分離する工程、および、上記分離した細菌のゲノム DNAまたは総 RNAを抽出する工程をさらに包含することを特徴とする。

[0049] 本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法において、上記組織サンプルは、血液、唾液または歯垢より得られることが好ましい。

[0050] 本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法において、上記オリゴヌクレオチドは、配列番号 8ないし 10の何れかに示される塩基配列からなることが好ましい。

[0051] 本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法にぉ、て、上記細菌を分離する工程が上記抗体を用いることが好ま、。

[0052] 即ち、本発明のハイブリダィゼーシヨン反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、上記ハイブリダィゼーシヨン反応に使用されるプローブとして、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列であることを特徴として、る。

[0053] 好ましくは、本発明のハイブリダィゼーシヨン反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記ハイブリダィゼーシヨン反応に使用されるプローブとして、ストレプトコッカスミュータンスの血清型 c、 eまたは fの株に特異的な塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列ある、は当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴として、る。 [0054] 好ましくは、本発明のハイブリダィゼーシヨン反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さら〖こ、被験体の組織サンプルから染色体 DNA または総 RNAを得ることを特徴として、る。

[0055] 好ましくは、本発明のハイブリダィゼーシヨン反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴として、る。

[0056] 好ましくは、本発明の本発明のハイブリダィゼーシヨン反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さら〖こ、唾液または歯垢より菌を分離する工程を包含することを特徴として、る。

[0057] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型 c、 eまたは fの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。

[0058] 即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株の血清型特異多糖抗原の生合成に重要な酵素を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。

[0059] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコ一ス側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法は、上記の課題を解決するために、上記の抗体を用いて免疫反応を行う工程を包含することを特徴としている。

[0060] 好ましくは、本発明の被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法は、

被験体サンプルより細菌を分離する工程；

上記分離した細菌と請求の範囲第 9項に記載の抗体をインキュベートする工程；および

上記抗体と結合した細菌を検出する工程、

を包含することを特徴とする。

[0061] 上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンスの有用な検出方法を提供することができる。

[0062] 即ち、本発明の被験体中のストレプトコッカスミュータンス株の血清型を判定する方法は、上記ストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする。

[0063] 即ち、本発明の PCR反応によって S. mutansの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、上記 PCR反応に使用されるプライマーとして、 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した S. mutans株に特異的な塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用いられるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列であることを特徴として、る。

[0064] 好ましくは、本発明の PCR反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記 PCR反応に使用されるプライマーとして、ストレブトコッカスミュータンスの血清型 c、 eまたは fの株に特異的な塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列あるいは当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドが用 V、られることを特徴として、る。

[0065] 好ましくは、本発明の PCR反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、被験体の組織サンプルカゝら染色体 DNAまたは総 RNAを得ることを特徴としている。

[0066] 好ましくは、本発明の PCR反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さらに、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。

[0067] 好ましくは、本発明の PCR反応によってストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さら〖こ、唾液または歯垢より菌を分離する工程を包含することを特徴としている。

[0068] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース佃 j鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。 [0069] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株に特異的に結合する抗体を用いることを特徴として、る。

[0070] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法は、さら〖こ、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株に特異的に結合する抗体を用いることを特徴としている。

[0071] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース佃 j鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定する方法を提供することができる。

[0072] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンス株のスクリーニング方法は、上記のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする。

[0073] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコ一ス側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いることを特徴として！/、る。

[0074] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントが PCR反応に用いられることを特徴としている。

[0075] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントがハイブリダィゼーシヨン反応に用いられることを特徴として、る。

[0076] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株をスクリーニングする方法は、上記の抗体を用いることを特徴としている。 [0077] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株のスクリーニングに優れた方法を提供することができる。

[0078] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンス株は、上記のスクリーニング方法によつて取得されることを特徴とする。

[0079] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコ一ス側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株は、上記のスクリーニング方法によって分離されることを特徴として、る。

[0080] 上記構成によれば、新たにスクリーニングされたストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株を提供することができる。

[0081] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコ一ス側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株は、上記の課題を解決するために、上記のスクリーニング方法によってスクリーニングされることを特徴としている

[0082] 上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株をさらに提供することができる。

[0083] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキットは、上記のオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする。

[0084] 本発明のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキットにおいて、上記オリゴヌクレオチドは配列番号 9に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。

[0085] 本発明のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキットにおいて、配列番号 8に示される塩基配列力なるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましい。

[0086] 本発明のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキットにおいて、配列番号 10に示される塩基配列力もなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましい

[0087] 本発明のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキットは、 PCR反応またはハイブリダィゼーシヨン反応に用いることが好ま、。

[0088] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株に特異的である塩基配列ある、は当該塩基配列の相補配列を含むオリゴヌクレオチドを備えるとともに、上記特異的な塩基配列が、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列であることを特徴として、る。

[0089] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ストレプトコッカスミュータンスの血清型 c、 eまたは fの株に特異的な塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドを備えることを特徴として、る。

[0090] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、被験体の組織サンプル力染色体 DNAまたは総 RNAを得るための試薬を含むことを特徴として、る。

[0091] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さら〖こ、上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴としている。

[0092] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、唾液または歯垢より菌を分離するための試薬を含むことを特徴としている。

[0093] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、 PCR反応に用いるための試薬を含むことを特徴としている。

[0094] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ハイブリダィゼーシヨン反応に用いるための試薬を含むことを特徴としている。

[0095] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、上記オリゴヌクレオチドが標識されていることを特徴としている。

[0096] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース佃 j鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットを提供することができる。

[0097] 即ち、上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株に特異的な多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードする遺伝子の存在を検出して当該新規血清型株の存在を知ることができる。

[0098] 即ち、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、上記の課題を解決するために、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株に特異的に結合する抗体を備えることを特徴として、る。

[0099] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株に特異的に結合する上記抗体を備えることを特徴とする。

[0100] 上記構成によれば、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株の検出に有用なキットを提供することができる。

[0101] 好ましくは、本発明のストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットは、さらに、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株の多糖抗原に特異的に結合する抗体を備えることを特徴として、る。

[0102] 上記構成によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株を特異的に検出することに優れたストレプトコッカスミュータンスの血清型を判定するためのキットを提供することができる。

[0103] 即ち、本発明の抗体の製造方法は、上記の課題を解決するために、従来の免疫方法を改良して、ることを特徴として、る。

[0104] 1つの局面において、本発明の抗体の製造方法は、リン酸緩衝化生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカスミュータンス株を 5日間連続でゥサギ耳介静脈に注射する工程を包含することが好ま、。 [0105] 本発明の抗体の製造方法は、 1週間間隔をあけた後、さらなる 2週間において 1週間に 5日間ずつリン酸緩衝ィ匕生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカスミュータンス株を反復注射する工程をさらに包含することが好ましい。

[0106] 上記方法によれば、ストレプトコッカスミュータンスの血清型特異多糖抗原のダルコース側鎖の量が低下したストレプトコッカスミュータンス株、すなわち、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株に特異的に結合する抗体の製造方法を提供することができる。

[0107] 上記構成によれば、従来の免疫方法では取得し得なかった新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス表層抗原に対する抗体を提供することができる。

[0108] 即ち、本発明の細菌検出器具は、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株に特異的な塩基配列またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドが基板上に固定ィ匕されてヽることを特徴として、る。

[0109] 好ましくは、本発明の細菌検出器具において、上記塩基配列は、新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株に特異的な多糖抗原の生合成に重要な酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列であることを特徴としている。

[0110] 上記構成によれば、サンプル中に含まれる新規血清型を有するストレプトコッカスミュータンス株を検出 ·同定することがでさる。

[0111] さらに上記構成によれば、サンプル中に含まれるストレプトコッカスミュータンス株の網羅的な検査を行なうことができる。

[0112] 本発明のさらに他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分わ力るであろう。また、本発明の利益は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

図面の簡単な説明

[0113] [図 1]A— Eは、 S. mutansの TW295株に特異的な抗血清および TW871株に特異的な抗血清と、 TW295株、 TW871株、 c型株、 e型株および f型株から調製したランツーランドール (RR)抗原との反応を示す図である。

[図 2]A— Cは、 S. mutansにおける PA、 CA— GTFおよび CF— GTFの発現のウェスタンプロットの結果を示す図である。

[図 3]Α·Βは、 S. mutansの口腔分離株および血液分離株の食作用率を示す図である。

[図 4]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較することにより、変異の存在を示す図である。

[図 5]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 4の続きを示す。

[図 6]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 5の続きを示す。

[図 7]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 6の続きを示す。

[図 8]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 7の続きを示す。

[図 9]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 8の続きを示す。

[図 10]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 9の続きを示す。

[図 11]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 10の続きを示す。

[図 12]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 11の続きを示す。

[図 13]S. mutansの血清型 c型と k型とにおける rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較する図であり、図 12の続きを示す。

[図 14]S. mutansの血清型 c型と k型との塩基配列を整列させて、 rgpF遺伝子前半部の塩基配列を比較した図である。

[図 15]至適な PCR条件を示す図である。

[図 16]MT8148株（c型）、 TW295株 (k型）および FT1株 (k型）力も抽出したゲノム DNAを希釈しそれをテンプレートにして血清型に特異的なプライマーを用いて PCR 増幅して検出感度を求めた結果を示す図である。

[図 17]Α·Βは、種々の血清型の S. mutans株および種々の連鎖球菌力抽出したゲノム DNAをテンプレートにして血清型特異的プライマーを用いて PCR増幅した結果を示す図である。

[図 18]Α·Βは、唾液サンプル力も抽出したゲノム DNAをテンプレートにして血清型特異的プライマーを用いて PCR増幅した結果を示す図である。

[図 19]Α·Βは、 S. mutansにおける CA— GTF発現および CF— GTF発現のウェスタンィムノブロット検出を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0114] 本発明の実施の一形態について以下に詳細に説明する力本発明は以下の記載に限定されるものではない。

[0115] (1)血清型 kの S. mutans株

S. mutansは、感染性心内膜炎を発症する患者の血液より時折単離されるが、その侵入機構および生存機構は、解明の余地を残す。菌血症または感染性心内膜炎を発症する患者より得た 4つの血液分離株のうち 2つ (TW295株および TW871株）は、免疫沈降試験によると血清学的に不定であった。

[0116] これらの血清型不定株に対する抗血清を用いる免疫拡散分析は、 100人の被験体より得た 100株の口腔分離株のうち 2つが陽性反応を示した。 50人の被験体より得た 2500株の口腔分離株に対するさらなる免疫拡散分析において、単一の患者より得た 50個の分離株全てが抗 c型抗血清、抗 e型抗血清、および抗 f型抗血清と反応しないが、抗 TW295抗血清および抗 TW871抗血清と反応した。これらの株は、対照株である S. mutans株 MT8148と同様の生物学的特性（例えば、高レベルのショ糖依存的吸着および菌体疎水性、ならびにダルコシルトランスフェラーゼおよびタンパク質抗原 (PA)の発現)を示した。本発明者らは、この生物を血清型 kと名付けた。

[0117] 本発明者らは、ヒト血液サンプルおよび口腔サンプルより血清型 kの新たな S. mutans株を分離し、そして特徴付けた。血清型 k株の血清学的特徴は、 MT8148の gluA不活ィ匕変異株 (MT8148GD)の特徴と同様であることを見出した。

[0118] 血清型 kの口腔分離株は、血液分離株および MT8148GDと同様に食作用に抵抗性を示した。これらの結果は、 S. mutans血清型 k株がヒト口腔内に存在するだけでなぐ食作用に対する低い感受性に起因して血液中で生存し得るということを示す。

[0119] MT8148GDは、ガラス表面に対するショ糖依存的付着、唾液で被覆したヒドロキシアパタイトに対するショ糖非依存的付着、デキストラン結合活性、および菌体結合型（ceU-associated)ダルコシルトランスフェラーゼ（GTF)活性などの生物学的特性に関して、その親株である MT8148株よりも有意に低、。

[0120] さらに、ウェスタンブロット分析は、血清型 kにおける GTFBZGTFCの発現率比が MT8148より減少したことを示した力ラットに対するう蝕誘発能は、 MT8148、 MT 8148GDおよび血清型 kの口腔分離株の間で同程度であった。

[0121] これらの結果は、 S. mutansの血清型特異的多糖におけるグルコース側鎖の欠失がう蝕誘発能と関連し得るが、その他の主要な表層タンパク質 (例えば、 GTF、 PAc等 )よりもその程度が低、と、うことを示す。

[0122] 本発明において、従来の免疫方法に改良をカ卩えることによって、血清型 kの S. mutans株に対する抗血清が取得された。 S. mutans株の血清型特異多糖抗原の生合成に関わる遺伝子群の配列を特定して血清型 kと既知株とを比較した結果、血清型 k の S. mutans株に共通して存在する rgpF遺伝子の配列において変異が同定された。

[0123] (A)ポリヌクレオチド

本発明は、ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中において使用される場合、「ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のダルコ一ス側鎖量を低下させるポリペプチド」は、「血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチド」または「血清型 kの S. mutans株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチド」と置換可能に使用される。一実施形態において、本発明は、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列を有するポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デォキシリボヌクレオチド (A、 G、 Cおよび Tと省略される）の配列として示される。また、「配列番号 1ないし 4 の何れか 1つに示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号 1ないし 4の各デォキシヌクレオチド A、 G、 Cおよび Zまたは Tによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。

[0124] 本発明に係るポリヌクレオチドは、 RNA (例えば、 mRNA)の形態、または DNAの形態（例えば、 cDNAまたはゲノム DNA)で存在し得る。 DNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖 DNAまたは RNAは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得る力またはそれは、非コード鎖 (アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。

[0125] 本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。ォリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド (三量体）と V、われ、長、ものは 30マーまたは 100マーと!/、うように重合して!/、るヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。

[0126] 本発明のポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも 12nt (ヌクレオチド）、好ましくは約 15nt、そしてより好ましくは少なくとも約 20nt、なおより好ましくは少なくとも約 30 nt、そしてさらにより好ましくは少なくとも約 40ntの長さのフラグメントが意図される。例えば、「配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示されるヌクレオチド配列の少なくとも 2 Ontの長さのフラグメント」によって、配列番号 1ないし 4の何れ力 1つに示されるヌクレォチド配列力の 20以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示されるヌクレオチド配列が提供されるので、当業者は，このような DNAフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント (オリゴヌクレオチド）力 Applied

Biosystems Incorporated (ABI, 850 Lincoln Center Dr., Foster City, CA 94404) 392 型シンセサイザーなどによって合成される。

[0127] 本発明は、血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリべプチドをコードする力否かに関係なぐ配列番号 1ないし 4の何れ力 1つに示される塩基配列の少なくとも 12個連続する配列またはその相補配列力もなるポリヌクレオチドに関する。特定のポリヌクレオチドが血清型 kの血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、上記ポリヌクレオチド力例えば、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)のプライマー、またはノ、ィブリダィゼーシヨンプローブとして使用され得ることを容易に理解する。本発明のポリヌクレオチドは、血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に PCR増幅できるので、本発明のポリヌクレオチドは、血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的にノ、イブリダィズするハイブリダィゼーシヨンプローブとしてもまた利用可能である。血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードしない本発明のポリヌクレオチドの他の用途としては、 Vermaり、 Human Chromosomes: a Manual of Basic

Techniques, Pergamon Press, New York (1988)に記載の、正確な染色体位置を提供するための分裂中期染色体展開物に対するインサイチュハイブリダィゼーシヨン（例えば、 FISH)；および、特定の組織における血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドに関する mRNA発現を検出するためのノ一ザンブロット分析が挙げられる。

[0128] 例えば、「長さが少なくとも 20nt」のポリヌクレオチドの部分によって、参照のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からの 20以上の隣接したヌクレオチドが意図される。好ましい実施形態において、本発明のこのような部分は、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)による標的配列の増幅のためのプライマーとして、または従来の DNAノヽイブリダィゼーシヨン技術に従ったプローブとしてのいずれかで診断的に有用である。

[0129] 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダィゼーシヨン条件下で、上記の本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される塩基配列力もなるポリヌクレオチド）またはその一部にハイブリダィズするポリヌクレォチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。用語「ストリンジェントなノ、イブリダイゼーシヨン条件」は、ハイブリダィゼーシヨン溶液（50%ホルムアミド、 5 X SSC (1 50mMの NaCl、 15mMのクェン酸三ナトリウム）、 50mMのリン酸ナトリウム（pH7. 6)、 5 Xデンノヽート液、 10%硫酸デキストラン、および 20 gZmlの変性剪断サケ精子 DNAを含む）中にて 42°Cでー晚インキュベーションした後、約 65°Cにて 0. 1 X S SC中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にノ、イブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約 15ヌクレォチド (nt)、そしてより好ましくは少なくとも約 20nt、さらにより好ましくは少なくとも約 30nt、そしてさらにより好ましくは約 30— 70ntにハイブリダィズするポリヌクレオチド（ DNAまたは RNAのいずれ力）が意図される。これらは、本明細書中においてより詳細に考察されるような診断用プライマーおよび診断用プローブとして有用である。血清型 kの S. mutans株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されな、：それ自体によって、成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド;成熟したポリペプチドのコード配列およびさらなる配列（例えば、リーダー配列をコードする配列）（例えば、プレタンパク質配列またはプロタンパク質配列またはプレブ口タンパク質配列）；イントロン、非コード 5'配列および非コード 3'配列（例えば、転写、 mRNAプロセシング (スプライシングおよびポリアデュル化シグナルを含む）において役割を担う転写非翻訳配列）；さらなる機能性を提供するようなさらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列。従って、例えば、ポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列）に融合され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、マ一力一アミノ酸配列は、へキサーヒスチジンペプチド（例えば、 pQEベクター（Qiagen , Inc. )において提供されるタグ)であり、他の中では、それらの多くは公的および Zまたは商業的に入手可能である。例えば、 Gentzら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)において記載されるように、へキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素 (HA)タンパク質由来のェピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、 Wilsonら、 Cell 37: 767 (1984)によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、 N末端または C末端にて Fcに融合される血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。

[0131] 血清型 kの S. mutans株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする本発明に係るポリヌクレオチドは、宿主細胞における増殖のための選択マーカーを含有するベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物中力、または荷電された脂質との複合体中で導入される。また、下記で詳述するように、 DEAEデキストラン法ゃェレクト口ポレーシヨン法を用いてもよい。ベクターがウィルスである場合、ベクターは、適切なノッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングされ得、次、で宿主細胞に形質導入され得る。

[0132] 本発明はさらに、血清型 kの S. mutans株の血清型特異多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードする本発明のポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によつて、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の 1つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で公知の変異誘発技術を用いて生成され得る。

[0133] そのような変異体は、本発明のポリヌクレオチドにおいて 1または数個のヌクレオチド置換、欠失、または付加によって生成される変異体を含む。置換、欠失、または付カロは、 1つ以上のヌクレオチドを含み得る。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変化され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、または付加を生成し得る。

[0134] このように、本発明に係るポリヌクレオチドは、少なくとも、配列番号 1ないし 4の何れ力 1つに示される塩基配列を含む力またはその変異体であればよいといえる。また、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列は、適切なリンカ一ペプチドをコードするポリヌクレオチドで連結されて、てもよ!/、。

[0135] つまり、本発明の目的は、血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを検出するために使用するポリヌクレオチド (オリゴヌクレオチド)を提供することにあるのであつて、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび当該ポリヌクレオチドを検出するために使用するポリヌクレオチド (オリゴヌクレオチド)も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0136] (B)ポリペプチド

本発明者らは、新規血清型 (k型)の S. mutans株を見出し、この血清型を規定する多糖抗原の生合成に関与する酵素の 1つである rgpFにおいて変異が存在することを見出した。

[0137] 本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリべプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。

[0138] 用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。

[0139] 本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主 (例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む)力組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリべプチドは、グリコシルイ匕され得るカゝ、または非グリコシルイ匕され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチォニン残基を含み得る。

[0140] 1つの局面において、本発明は、 k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドを提供する。

本明細書中で使用される場合、「k型 S. mutans株の rgpFポリペプチド」は、新規血清型 kの S. mutans株の多糖抗原の生合成に関与する酵素である rgpFポリペプチドが意図される。 [0141] 1つの実施形態において、本発明は、配列番号 1ないし 4の何れ力 1つに示される塩基配列によってコードされるポリペプチドを提供する。本発明の好まし、ポリべプチドとしては、成熟ポリペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメイン、または膜貫通ドメインの全てまたは一部を欠失した細胞外および細胞内ドメインを含むポリペプチドが挙げられる。

[0142] 本発明は、さら〖こ、実質的な k型 S. mutans株の rgpFポリペプチド活性を示す k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドの変異体を提供する。 1つの実施形態において、本発明は、配列番号 1ないし 4の何れ力 1つに示される塩基配列によってコードされるポリペプチドにおいて 1または数個のアミノ酸が置換、付加または欠失した、 k型 S.

mutans株の rgpFポリペプチド活性を示すポリペプチド変異体を提供する。

[0143] 本明細書中で使用される場合、用語「k型 S. mutans株の rgpFポリペプチド活性」は、公知の血清型の S. mutans株には存在しない多糖抗原、すなわち、 k型 S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する rgpFポリペプチドの特徴が意図される。

[0144] このような変異体は、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換 (例えば、親水性の残基の別の残基への置換 (通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない)）を含む。「中性」アミノ酸置換は、一般的にほとんど活性に影響しない。

[0145] ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸力このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではぐ天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。

[0146] 当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において 1または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。 [0147] 好ましい変異体は、保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。好ましくは、サイレント置換、付加、および欠失であり、特に好ましくは、保存的置換である。これらは、 k型 S. mutans株の rgpFポリペプチド活性を変化しない。

[0148] 代表的に保存的置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸 Ala、 Val、 Leu,および lieの中での 1つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基 Serおよび Thrの置換、酸性残基 Aspおよび Gluの置換、アミド残基 Asnおよび Ginの間の置換、塩基性残基 Lysおよび Argの置換、ならびに芳香族残基 Phe、 Tyrの間の置換である。

[0149] 上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそう力 (すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、 Bowie, J. U.り「Deciphering the Message in Protein Se quences： Tolerance to Amino Acid SubstitutionsJ , Science 247 : 13 06-1310 (1990) (本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。

[0150] 別の局面において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または精製に続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドの N末端に付加され得る。

[0151] 特定の局面において、本発明に係る k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識 (タグ配列またはマーカー配列）を N末端または C末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去されてもよい。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、へキサーヒスチジンペプチド (例えば、 pQEベクター（Qiagen, Inc. )において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および Zまたは商業的に入手可能である。例えば、 Gentzら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 821—824 (1989) (本明糸田書中に参考として援用される）において記載されるように、へキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「HA」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素 (HA)タンパク質由来のェピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、 Wils onら、 Cell 37 : 767 (1984) (本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、 Nまたは C末端にて Fcに融合される本実施形態に係る k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。

[0152] 本発明に係る k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。

[0153] 組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。

[0154] 合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、 Houg htenは、 4週間未満で調製されそして特徴付けられた HA1ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す 10— 20mgの 248の異なる 13残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。 Houghten, R. A. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 5131—5135 (1985)。この「 Simultaneous Multi pie Peptide Synthesis (SMPS)」プロセスは、さらに Houghtenら（1986)の米国特許第 4, 631, 211号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の榭脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、 50 0— 1000以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Houghtenら、前出、 513 4)。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。

[0155] 1つの局面において、本発明は、本明細書中に記載の k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドのェピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。本発明の k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドのェピトープ保有部分のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、少なくとも 6個、 7個、 8個、 9個、 10個のアミノ酸を有するポリべプチドの部分を含む力配列番号 1ないし 4の何れ力 1つに示される塩基配列によつてコードされる本発明の k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドの全アミノ酸配列の長さまでの任意の長さ（全体を含む）のェピトープ保有部分ポリペプチドもまた含まれる。

[0156] 本発明の k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドのェピトープ部分は、当該分野で公知の方法により同定される。例えば、 Geysenら (1984)は、酵素結合免疫吸着アツセィにおける反応に十分に純粋な何百というペプチドを同時に固体支持体上に迅速に合成する手順を開示する。合成ペプチドの抗体との相互作用は、次いで、それらを支持体から除去することなく容易に検出される。この様式において、所望のタンパク質の免疫原性ェピトープを保有するペプチドは、当業者により容易に同定され得る。例えば、ロ蹄疫ウィルスのコートタンパク質における免疫学的に重要なェピトープは

、タンパク質の 213のアミノ酸配列全体を覆う全ての 208の可能なへキサペプチドの重複セットの合成による 7アミノ酸の解明により Geysenらによって位置付けされた。次 V、で、全ての 20アミノ酸が順にェピトープ内の各位置で置換されたペプチドの完全な置換セットが合成され、そして抗体との反応のための特異性を与える特定のァミノ酸が決定された。従って、本発明のェピトープ保有ペプチドのペプチドアナログは、この方法により日常的に作製され得る。 Geysen (1987)の米国特許第 4,708,781号は、所望のタンパク質の免疫原性ェピトープを保有するペプチドを同定するこの方法をさらに記載している。

[0157] 「免疫原性ェピトープ」は、タンパク質全体が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質の一部として定義される。これらの免疫原性ェピトープは、分子上の 2 、 3の焦点に制限されると考えられている。一方では、抗体が結合し得るタンパク質分子の領域は、「抗原性ェピトープ」と定義され得る。タンパク質の免疫原性ェピトープの数は、一般には、抗原性ェピトープの数よりも少ない。例えば、 Geysen, H. M.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984)を参照のこと。

[0158] 本発明の抗原性ェピトープ保有ペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するのに有用である。従って、抗原ェピトープ保有ペプチドで免疫化されたドナーからの脾臓細胞の融合により得られるハイプリドーマの大部分は、一般に天然のタンパク質と反応性がある抗体を分泌する。抗原性ェピトープ保有ペプチドにより惹起された抗体は、模倣タンパク質を検出するのに有用であり、そして異なるペプチドに対する抗体力翻訳後プロセシングを受けるタンパク質前駆体の種々の領域の末路を追跡するために使用され得る。免疫沈降ァッセィにおいて、短いペプチド (例えば、約 9アミノ酸)でさえ、より長いペプチドに結合しそして置換し得ることが示されているので、ペプチドおよび抗ペプチド抗体は、模倣タンパク質についての種々の定性的または定量的アツセィ、例えば、競合的アツセィにおいて使用され得る。例えば、 Wilson, I. A.ら、 Cell 37: 767-778 (1984) 777を参照のこと。本発明の抗ペプチド抗体もまた、模倣タンパク質の精製 (例えば、当該分野で周知の方法を使用して、吸着クロマトグラフィーにより）に有用である。

[0159] 上記のガイドラインに従って設計された本発明の抗原性ェピトープ保有ペプチドは、好ましくは本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内に含まれる少なくとも 7、より好ましくは少なくとも 9、そして最も好ましくは約 15—約 30アミノ酸の間の配列を含む。しかし、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の約 30—約 50アミノ酸または全体までの任意の長さおよび全体を含む、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のより大部分を含むペプチドまたはポリペプチドもまた、本発明のェピトープ保有ペプチドであると考えられ、そしてまた模倣タンパク質と反応する抗体を誘導するのに有用である。好ましくは、ェピトープ保有ペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中で実質的な溶解性を提供するように選択され (すなわち、その配列は、比較的親水性残基を含み、そして高度な疎水性配列は好ましくは回避される）；そしてプロリン残基を含む配列が特に好ましい。

[0160] 本発明のェピトープ保有ペプチドは、本発明のポリヌクレオチドを使用する組換え手段を含むペプチドを作製するための任意の従来の手段によって産生され得る。例えば、短いェピトープ保有アミノ酸配列は、組換え体産生および精製の間、ならびに抗ペプチド抗体を産生するための免疫化の間、キャリアとして作用するより大きなポリペプチドに融合され得る。ェピトープ保有ペプチドはまた、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。

[0161] 本発明のェピトープ保有ペプチドは、当該分野に周知の方法によって抗体を誘導するために使用される。例えば、 Chow, M.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:

910-914;および Bittle, F. J.ら、 J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はぺプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットへモシァニン (KLH)または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システィンを含有するペプチドは、 m—マレイミドベンゾィルー N—ヒドロキシスクシンイミドエステル（ MBS)のようなリンカ一を使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、ダルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ゥサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリアーカツプリングペプチドのいずれかで、例えば、約 100 gのペプチドまたはキャリアタンパク質および Freundのアジュバントを含むェマルジヨンの腹腔内および Zまたは皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用して ELIS Aアツセィにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約 2週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。

[0162] (C)ベクターおよび細胞

本発明は、 k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドを生成するために使用されるべクタ一に関する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよ、。

[0163] 本発明はまた、本発明に係る k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドを組換え的に生成するための本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換え構築物で形質転換された宿主細胞、および組換え技術による k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドまたはそのフラグメントの産生方法に関する。

[0164] 組換え構築物は、感染、形質導入、トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、および形質転換のような周知の技術を用いて宿主細胞に導入され得る。組換え構築物としてのベクターは、例えば、ファージベクター、プラスミドベクター、ウイノレスベタター、またはレトロウイルスベクターであり得る。レトロウイルスベクターは、複製可能かまたは複製欠損であり得る。後者の場合、ウィルスの増殖は、一般的に、相補宿主細胞においてのみ生じる。

[0165] 発現させる目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野において周知の方法を用いて取得することができる。公知のタンパク質の部分配列は、所望の部位に対してプライマーを設計して PCR増幅することによって対応するポリヌクレオチドを取得した後、発現ベクターに挿入して細胞内で容易に得られる。

[0166] 目的の挿入ポリヌクレオチドに対するシス作用性制御領域を含有するベクターが好ましい。適切なトランス作用性因子は、宿主によって供給され得るか、相補ベクターによって供給され得る力、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給され得る。

[0167] 特定の実施態様にお!、て、ベクターは、誘導性および Zまたは細胞型特異的であり得る特異的な発現を提供するベクターが好ましい。このようなベクターの中で特に好ましいベクターは、温度および栄養添加物のような操作することが容易である環境因子によって誘導性のベクターである。

[0168] 本発明において有用な発現ベクターとしては、染色体ベクター、ェピソ一ムベクタ一、およびウィルス由来ベクター（例えば、細菌プラスミド、ノクテリオファージ、酵母ェピソ一ム、酵母染色体エレメント、ウィルス（例えば、バキュロウィルス、パポバウイルス、ワクシニアウィルス、アデノウイルス、トリボックスウィルス、仮性狂犬病ウィルス、およびレトロウイルス）、ならびにそれらの糸且合せに由来するベクター（例えば、コスミドおよびファージミド）が挙げられる。

[0169] DNA揷入物は、適切なプロモーター（例えば、ファージ λ PLプロモーター、 E. col i lacプロモーター、 trpプロモーター、および tacプロモーター、 SV40初期プロモーターおよび後期プロモーター、ならびにレトロウイノレス LTRのプロモーター）に作動可能に連結されるべきである。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。発現構築物は、さらに、転写開始、転写終結のための部位、および、転写領域中に翻訳のためのリボゾーム結合部位を含む。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるべきポリペプチドの始めに転写開始コドンを含み、そして終わりに適切に位置される終止コドンを含む。

[0170] 発現ベクターは、好ましくは少なくとも 1つの選択マーカーを含む。このようなマーカ一としては、真核生物細胞培養につ、てはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性遺伝子、 E. coliおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、細菌（例えば、 E. coli細胞、 Streptomyces細胞、および Salmonella typ himurium細胞）；真菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、 Drosophila S 2細胞および Spodoptera Sf9細胞）；動物細胞（例えば、 CHO細胞、 COS細胞、および Bowes黒色腫細胞）；ならびに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。

[0171] 好ましい実施形態において、本発明に係るベクターは、細菌（特に、 E. coli)において本発明に係る k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドを発現し得る。細菌における使用に好ましいベクターの中には、 pQE70、 pQE60、および pQE— 9 (Qiagenから入手可會）； pBSベクター、 Phagescriptベクター、 Bluescriptベクター、 pNH8A、 pNH16a、 pNH18A、 pNH46A (Stratageneから入手可能）；ならびに ptrc99a、 PKK223— 3、 pKK233— 3、 pDR540、 pRIT5 (Pharmaciaから入手可能）が含まれる。

[0172] 本発明における使用に適した公知の細菌プロモーターの中には、 E. coli laclおよび lacZプロモーター、 T3プロモーターおよび T7プロモーター、 gptプロモーター、 λ PRプロモーターおよび λ PLプロモーター、ならびに trpプロモーターが含まれる。適切な真核生物プロモーターとしては、 CMV前初期プロモーター、 HSVチミジンキナーゼプロモーター、初期 SV40プロモーターおよび後期 SV40プロモーター、レトロウィルス LTRのプロモーター（例えば、ラウス肉腫ウィルス (RSV)のプロモーター）、ならびにメタ口チォネインプロモーター（例えば、マウスメタ口チォネイン Iプロモータ一）が挙げられる。

[0173] 別の実施形態において、本発明に係るベクターは、高等真核生物細胞において本発明に係る k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドを発現し得る。高等真核生物細胞による DNAの転写は、ベクター中にェンノヽンサ一配列を挿入することによって増大させ得る。ェンハンサ一は、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働ぐ通常約 10— 300bpの DNAのシス作用性エレメントである。ェンハンサ一の例としては、 SV40ェンハンサー（これは、複製起点の後期側上の 100— 27 Obpに位置される）、サイトメガロウィルスの初期プロモーターェンハンサー、複製起点の後期側上のポリオ一マエンハンサー、およびアデノウイルスェンハンサ一が挙げられる。

[0174] 好ましい真核生物ベクターとしては、 pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44、 ρΧΤ1、および pSG (Stratageneから入手可能）；ならびに pSVK3、 pBPV、 pMSG、および pSVL (Phrmaciaから入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者に周知である。

[0175] 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAEデキストラン媒介トランスフエクシヨン、カチオン性脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、形質導入、感染または他の方法によってもたらされ得る。このような方法は、 Davisら、 Basic Methods In Molecular Biology(1986) (本明細書中に参考として援用される）のような多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。

[0176] 高等真核生物による DNAの転写は、ベクター中にェンノヽンサ一配列を挿入することによって増大させ得る。ェンノヽンサ一は、所定の宿主細胞型におけるプロモーターの転写活性を増大するように働ぐ通常約 10— 300bpの DNAのシス作用性エレメントである。ェンハンサ一の例としては、 SV40ェンハンサー（これは、複製起点の後期側上の 100— 270bpに位置される）、サイトメガロウィルスの初期プロモーターェンハンサ一、複製起点の後期側上のポリオ一マエンハンサー、およびアデノウイルスェンハンサ一が挙げられる。

[0177] 翻訳されたタンパク質の小胞体の管腔内へ力周辺質空間内へか、または細胞外環境内への分泌のために、適切な分泌シグナル力発現されるポリペプチド中に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内因性であり得る力、またはそれらは異種シグナルであり得る。

[0178] 従って、ポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、そして分泌シグナルだけでなぐ付加的な異種の機能的領域も含み得る。例えば、付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間の、または続く操作および保存の間の、安定性および持続性を改善するために、ポリべプチドの N末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするためにポリべプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへの付カ卩は、当分野でよく知られており、そして日常的な技術である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質の可溶化に有用な免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、 EP A 0 464 533 (また、カナダ対応出願 2045869)は、別のヒトタンパク質またはその一部とともに免疫グロブリン分子における定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質中の Fc部分は、治療および診断における使用に十分に有利であり、従つて、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（EP A 0232 262)。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質力記載される有利な様式で、発現され、検出され、および精製された後に Fc部分が欠失され得ることが望ましい。これは、 Fc部分が、治療および診断における使用の妨害であると判明する場合 (例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原として使用されるべき場合)である。薬物探索において、例えば hIL— 5のようなヒトタンパク質は、 hIL— 5のアンタゴ-ストを同定するための高処理能力スクリーニングアツセィの目的で Fc部分と融合されている。 D. Bennettら、 Journal of Molecular Recognition Vol. 8: 52-58 (1995)、および K. Johansonら、 The Journal of Biological Chemistry Vol. 270,No. 16, 9459- 9471頁 (1995)を参照のこと。

[0179] k型 S. mutans株の rgpFポリペプチドは、周知の方法 (例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ァフィユティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって組換え細胞培養物力も回収され、そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」 )が精製のために用いられる。

[0180] このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

[0181] また、本発明に係る細胞は、少なくとも、本発明に係るベクターを含めばよいといえる。すなわち、市販の細胞以外の初代培養細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。

[0182] つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリヌクレオチドを含有するベクターおよび当該ベクターを含有する細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得したベクターおよび細胞も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。

[0183] (D)細菌

本発明は、分離された血清型 kの S. mutans株を提供する。好ましくは、本発明の血清型 kの S. mutans株は、以下で詳述されるような血清型 kの S. mutans株に特異的に結合する抗体を用いて、生物学的サンプルより分離される。好ましい血清型 kの S. mutans株としては、血液分離株 2株 (TW295および TW871)、口腔分離株 154株（ FT1— FT51、 SU1— SU51、および YK1— YK50、ならびに ATIおよび YT1)が挙げられるがこれらに限定されない。用語「生物学的サンプル」は、個体、体液、細胞株、組織培養物、または血清型 kの S. mutans株タンパク質もしくはその DNAもしくは mRNAを含む他の供給源カゝら得られる、任意の生物学的サンプルが意図される。生物学的サンプルとしては、血清型 kの S. mutans株タンパク質を含む体液（例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液および髄液)あるいは血清型 kの S. mutans株タンパク質を発現する可能性のある組織供給源が挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語「組織サンプル」は、組織供給源より得られた生物学的サンプルが意図される。哺乳動物力組織生検および体液を得るための方法は当該分野で周知である。生物学的サンプルが mRNAを含む場合、組織生検が好ましい供給源である。本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」としては、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプル以外に、上記生物学的サンプルおよび上記組織サンプルより抽出したゲノム DNAサンプルおよび Zまたは総 RNAサンプルも挙げられる。

[0184] 1つの局面において、本発明は、 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した S. mutans株を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「S. mutansの血清型 c、eまたは fの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下した」は、 S. mutansの血清型 c、 eまたは fの株に特異的な既知の抗体を用いて検出することができないことが意図される。従って、本明細書を参照して、この用語は、 S. mutansの血清型 c、 eまたは fの株に特異的な多糖抗原のグルコース側鎖が全くなヽことを意味するのではなぐ S. mutansの血清型 c、 eまたは fの株に特異的な既知の抗体に対する抗原性が著しく低下して、る状態であると、うことを意図して、ることを、当業者は容易に理解する。

[0185] (E)抗体

本発明は、 S. mutansの血清型 c、 e、もしくは fの株に特異的な多糖抗原のダルコ一ス側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明は、血清型 kの S. mutans株に特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン (IgA、 IgD、 IgE、 IgG、 IgMおよびこれらの Fabフラグメント、 F (ab' )フラグメント、 Fcフラグメント）を意味し、例とし

2

ては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディォタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の抗体は、従来の免疫方法では取得し得な力つた力免疫方法に創意工夫を重ねることによって取得された。さらに、本発明の抗体は、 k型以外の血清型を有する既知の S. mutans株を公知のグルコース側鎖欠失方法を用いて作製した変異株を用いて作製される。さらに、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを抗原に用いて作製される。本発明の抗体は、血清型 kの S. mutans株の検出および Zまたは診断に有用であり得る。

[0186] 本明細書中で使用される場合、用語「血清型 kの S. mutans株に対する抗体」は、血清型 kの S. mutans株抗原に特異的に結合し得る完全な分子および抗体フラグメント（例えば、 Fabおよび F (ab，）フラグメント）を含むことを意味する。 Fabおよび F (ab，）

2 2 フラグメントは完全な抗体の Fc部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Wahlら、 J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983》。従って、これらのフラグメントもまた好ましい。

[0187] あるいは、血清型 kの S. mutans株抗原に結合し得るさらなる抗体力抗イディォタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、血清型 kの S. mutans株特異的抗体は、動物 (好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイプリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイプリドーマ細胞は、血清型 kの S. mutans株特異的抗体に結合する能力が血清型 kの S. mutans株抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、血清型 kの S. mutans株特異的抗体に対する抗ィディォタイプ抗体を含み、そしてさらなる血清型 kの S. mutans株特異的抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。

[0188] Fabおよび F (ab' ) ならびに本発明の抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開

2

示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン (Fabフラグメントを生じる）またはペプシン (F (ab' ) フラグメン

2 トを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、血清型 kの S. mutans株結合フラグメントは、組換え DNA技術の適用または合成化学によって産生され得る。

[0189] ヒトにおける診断のために、インビボでのイメージングを用いて、上昇レベルの血清型 kの S. mutans株を検出する場合、「ヒト化」キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましくあり得る。このような抗体は、上記のモノクローナル抗体を生成するハイプリドーマ細胞由来の遺伝構築物を用いて生成され得る。キメラ抗体を生成するための方法は、当該分野で公知である。総説については、 Morrison, Science 229: 1202 (1985)； Oiら、 BioTechniques 4: 214 (1986)； Cabillyら、米国特許第 4,816,567号； Taniguchiら、 EP 171496 ; Morrisonら、 EP 173494; Neubergerら、 WO 8601533 ; Robinsonら、 WO 8702671 ; Boulianneら、 Nature 312: 643 (1984)； Neubergerら、 Nature 314: 268 (1985)を参照のこと。

[0190] このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係る k型 S. mutans株を認識する抗体フラグメント (例えば、 Fabおよび F (ab，）フラグメント）を備えていればよいと

2

いえる。すなわち、本発明に係る k型 S. mutans株を認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子の Fcフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。

[0191] つまり、本発明の目的は、本発明に係る k型 S. mutans株を認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類 (IgA、 IgD、 IgE、 IgGまたは IgM)、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。 [0192] (2)血清型 kの S. mutans株の検出法および診断法

本発明にカゝかる S. mutansの血清型検出法および診断法は、被験体に存在し得る血清型 kの S. mutans株を検出および診断するものである。

[0193] 感染因子、または、代謝産物、核酸、およびタンパク質を含む病気の指標となる分子の検出は、医学的疾患の診断および治療、ならびに研究における基本的な要素である。多くの方法論が現在検出に使用されている。これらの方法論は、一般に、病気を引き起こす因子の成分をコードする遺伝物質のような、核酸に対する診断アツセィ、および病気を引き起こす因子または病気の副産物の、ずれかの成分であるタンノク質に対する抗体をベースにした診断アツセィに分けられる。

[0194] 本発明は、生物学的サンプルにお、て、特に被験体から得られた組織または他の細胞または体液において、血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドを検出することによって、血清型 kの S. mutans株関連障害を診断する方法を提供する。

[0195] (A)核酸に対する検出法および診断法

核酸に対するアツセィは、ポリヌクレオチド (核酸分子）の存在を検出するための放射性標識プローブを用いるノーザンブロットハイブリダィゼーシヨンのような単純な方法から、ハイブリダィゼーシヨン技術による配列の検出に使用され得るところまで非常に少量の特定の核酸配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)の使用までの範囲にわたる。ヌクレオチドプローブは、市販の染料、または酵素、蛍光、化学発光、あるいは放射性の標識を用いて標識され得る。これらのプローブは、ハイプリダイゼーシヨンにより細胞中または組織試料中の遺伝子または関連配列（そこではその遺伝子は通常の成分である）の発現を検出するために、および生物の感染から生じる疾患を有すると疑われるヒトからの血清または組織試料をスクリーニングするために使用され得る。プライマーがまた、逆転写酵素、または DNAポリメラーゼおよびポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製され得、組織または液体中に非常に少量で存在するポリヌクレオチドの検出のために使用され得る。

[0196] ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)は、特に、クロー-ング、遺伝子発現の分析、 DNA配列決定、遺伝的マッピング、薬物の発見などにおいて適用される、非常に重要な手段で teる。 f列えば、 Innisら、 PCR Protocols A guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego (1990)；および米国特許第 4,683, 195,4,683号を参照のこと。

[0197] 本発明は、配列番号 1ないし 4に示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列またはその相補配列力もなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR 反応を行う工程を包含する、血清型 kの S. mutans株を検出する方法を提供する。 PC R試薬および方法論は、 p_erkin Elmer, 761 Main Ave. , Norwalk, Conn. 06850 ;または Roche Molecular Systems, 1145 Atlantic Ave. , Suite 100, Alameda, CA 94501力ら入手可能である。好ましい PCR反応は、 20mlの PCR反応液（20ngZ 1のゲノム DNAを 5 μ 1、 dNTP混合物 2 1、 10 X PCR緩衝液 2 1、順方向プライマー（20 !!101/ 1) 1 1、逆方向プラィマー（20 11101/ 1) 1 1、八111 1^& Gold 0. 1 μ 1、 MilliQ水 8. 9 1を含む）を、 94°Cで 5分間処理した後、 94°Cで 30秒間、 60 °Cで 30秒間、 72°Cで 30秒間を 30サイクル行!、、次!、で 72°Cで 7分間処理して行う力これに限られない。本明細書中で使用される場合、用語「少なくとも 12個」は、 12 、 13、 14、 15、またはそれ以上の整数をいう。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に血清型 kの S. mutans株が存在するか否かを、有効かつ効率的に判定し得る。

[0198] 伝統的には、 PCRおよびノヽイブリダィゼーシヨンプロセスは、別の作業として行われている。し力し、 PCRおよびハイブリダィゼーシヨンプロセスを組み合わせることによつて得られる利点がいくつかある：（i)単一の試薬添カ卩工程が必要とされるのみであり、これにより、反応チューブを開ける必要なぐこの組み合わされた反応を進行させることが可能であり、これにより、サンプルの混同およびサンプルの汚染の機会を減少させる；（ii)必要とされる試薬がより少量である；（iii)必要とされる試薬添加工程がより少なぐ自動化をより容易にする；そして (iv) in situの方法の場合、熱循環の間に細胞サンプルの完全性を保護するのに使用されるサンプル封じ込め（containment)ァセンブリを分解する必要がない。単一の反応において、 PCRをハイブリダィゼーションプロセスと組み合わせた、 1つの存在する方法は、「Taqman」として知られる技術である。例えば、 Hollandら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280 (1991)を参照のこと。

[0199] インサイチュでの PCRは、特定の増幅された核酸が、標的核酸配列を元々含んでいた細胞または下位の細胞構造内に実質的に含まれるように、固定された細胞において実行される PCR増幅をいう。細胞は、水性懸濁液中にあっても、または組織サンプルの部分 (例えば、組織ィ匕学的切片または細胞化学的スメァ）であってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「組織ィ匕学的切片」は、凍結または化学的に固定され、ワックスまたはプラスチック中に包埋されることにより固められ、薄板 (代表的には、数ミクロンの厚さ）にスライスされ、そして固体支持体 (例えば、顕微鏡スライド）に付着された生物学的組織の固体サンプルをいい、そして用語「細胞化学的スメァ」は、化学的に固定されそして顕微鏡スライドに付着された細胞 (例えば、血球)の懸濁物をいう。好ましくは、細胞は、プロティナーゼ消化、界面活性剤または有機溶媒を用いる液体抽出、または透過ィ匕（permeabilization)法のような他のものによって、 PC R試薬に対して透過性にされて、る。

[0200] 本明細書中で使用する場合、用語「固定された細胞」は、溶媒変化、温度変化、機械的ストレス、または乾燥による破裂に対して細胞構造 (特に、膜)を強化するために化学的に処理された生物学的細胞のサンプルをいう。細胞は、懸濁物中に固定されても、または組織サンプルの部分として固定されても、いずれでもよい。細胞固定液は、一般に、細胞構造のタンパク質構成要素を、最も一般的には、タンパク質ァミノ基と反応することによって架橋する化学薬品である。好ましい固定液には、緩衝化ホルマリン、 95%エタノール、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドが含まれる。固定された細胞の透過性は、プロティナーゼ、または界面活性剤、または膜脂質を溶解する有機溶媒での処理により増加され得る。

[0201] 本発明は、配列番号 1ないし 4に示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列またはその相補配列力もなるオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイプリダイゼーシヨン反応を行う工程をさらに包含する血清型 kの S. mutans株を検出する方法を提供する。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に存在する S. mutans株を、有効かつ効率的に判定し得る。

[0202] 本発明のオリゴヌクレオチドは、染色体とのインサイチュハイブリダィゼーシヨンによつて遺伝子マッピングするため、および例えばノーザンブロット分析によってヒト糸且織中の血清型 kの S. mutans株の発現を検出するためのプローブとして有用である。以下に詳細に記載されるように、特定の組織における血清型 kの S. mutans株遺伝子発現の変化を検出することは、特定の疾患および Zまたは障害を提示し得る。

[0203] 好ま、実施形態にぉ、て、本発明のオリゴヌクレオチドは、標識される。適切な標識としては、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するォキシダーゼ群由来の酵素が挙げられる。グルコースォキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質 (グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。ォキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体 z基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアツセィされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素 (例えば、ヨウ素 (¹²⁵ι、 ¹²¹ι)、炭素 (¹⁴c)、ィォゥ (³⁵s)、トリチウム

(³H)、インジウム (¹¹²In)、およびテクネチウム (^99mTc) )、ならびに蛍光標識 (例えば、フルォレセインおよびローダミン）ならびにピオチンが挙げられる。

[0204] (B)タンパク質に対する検出法および診断法

タンパク質に対するアツセィは、さらに、分子 (通常抗体)と、検出されるタンパク質との結合反応、または、酵素の活性ィ匕をもたらし、検出可能な色の変化を生じる基質を開裂し得る、酵素と酵素に結合する標的された分子間の反応を含む方法に分けられる。多くの結合アツセィは、染料、酵素または放射性または蛍光標識を含み、検出を増強する。タンパク質に対する抗体は、患者、免疫化動物、または抗原特異的モノクローナル細胞株から得られ得る。これらの抗体アツセィは、サンドイッチ ELISAアツセィ、ウェスタンブロット、放射性ィムノアツセィ、および免疫拡散アツセィのようなアツセィを包含する。その他のアツセィは、分子の固定ィ匕および検出のためにアビジンおよびピオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。

[0205] 本発明は、ストレプトコッカスミュータンスの血清型 c、e、もしくは fの株に特異的な多糖類のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を用 Vヽて免疫反応を行う工程を包含する血清型 kの S. mutans株を検出する方法を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「免疫反応」としては、サンドイッチ ELISA アツセィ、ウェスタンブロット、放射性ィムノアツセィ、および免疫拡散アツセィのようなアツセィが挙げられるがこれらに限定されない。本発明に従うと、被験体から得られたサンプル中に血清型 kの S. mutans株が存在するか否かを、有効かつ効率的に判定し得る。

[0206] 上記のように、本発明に従うと、血中に侵入した際に、多型核白血球による食作用を受けにくい S. mutans株を保有するか否かを判定し得る。さらに、他の主要な原因菌の同定法と組み合わせることによって、感染性心内膜炎予防の対象者を減少させ、抗生物質の使用量を低下させ、抗生物質の使用による耐性菌出現を抑制することが可能である。

[0207] 本発明はさらに、本明細書中に記載される血清型 kの S. mutans株に特異的に結合する抗体を用いる血清型 kの S. mutans株の診断方法を提供する。抗体を使用するァッセィ方法としては、サンドイッチ ELISAアツセィ、ウェスタンィムノブロット、放射性ィムノアツセィ、および免疫拡散アツセィのようなアツセィが挙げられる。その他のアツセィは、分子の固定ィ匕および検出のためにアビジンおよびピオチンのような分子を用いる。これらの試薬を調製する技術およびそれを使用する方法は、当業者に公知である。

[0208] 生物学的サンプル中の血清型 kの S. mutans株タンパク質レベルのアツセィは、任意の当該分野で公知の方法を使用して行われ得る。抗体に基づく技術が、生物学的サンプル中の血清型 kの S. mutans株タンパク質レベルをアツセィするために好ましい。例えば、組織中での血清型 kの S. mutans株タンパク質の発現は、ウェスタンブロットアツセィまたはドットプロットアツセィを含む、伝統的な免疫組織学的方法で研究され得る。これらの場合、特異的認識は一次抗体 (ポリクローナルまたはモノクローナル )によって提供されるが、二次検出系は、蛍光、酵素、または他の結合された二次抗体を利用し得る。結果として、病理学試験のための組織切片の免疫組織学的染色が得られる。

[0209] 血清型 kの S. mutans株タンパク質レベルを検出するために有用な他の抗体に基づく方法は、ィムノアッセィ (例えば、酵素結合免疫吸着アツセィ (ELISA)およびラジオイムノアッセィ (RIA) )を含む。例えば、血清型 kの S. mutans株特異的モノクローナル抗体は、血清型 kの S. mutans株タンパク質を検出および定量するための、免疫吸着剤としておよび酵素標識プローブとしての両方に使用され得る。サンプル中に存在する血清型 kの S. mutans株タンパク質の量は、直線回帰コンピューターァルゴリズムを使用して、標準的な調製物中に存在する量との比較によって算出され得る。抗原を検出するためのこのような ELISAは、 Iacobelliら、 Breast Cancer Research and Treatment 11: 19-30 (1988)に記載されている。別の ELISAアツセィにおいては、 2 つの異なる特異的なモノクローナル抗体力体液中の血清型 kの S. mutans株タンパク質を検出するために使用され得る。このアツセィにおいて、一方の抗体が免疫吸着剤として使用され、そして他方が酵素標識プローブとして使用される。

[0210] 適切な酵素標識は、例えば、基質との反応による過酸化水素の生成を触媒するォキシダーゼ群由来のものを含む。グルコースォキシダーゼは、それが良好な安定性を有し、そしてその基質 (グルコース）が容易に入手できるために、特に好ましい。ォキシダーゼ標識の活性は、酵素標識抗体 Z基質反応によって形成される過酸化水素の濃度を測定することによってアツセィされ得る。酵素に加えて、他の適切な標識として、放射性同位元素 (例えば、ヨウ素 (¹²⁵ι、 ¹²¹ι)、炭素 (¹⁴c)、ィォゥ (³⁵s)、トリチゥム (³H)、インジウム (¹¹²In)、およびテクネチウム (^99mTc) )、ならびに蛍光標識 (例えば、フルォレセインおよびローダミン）ならびにピオチンが挙げられる。

[0211] 個体から得られる生物学的サンプル中の血清型 kの S. mutans株レベルをアツセィすることに加えて、血清型 kの S. mutans株はまた、画像解析によってインビボで検出され得る。血清型 kの S. mutans株のインビボでの画像解析のための抗体標識またはマーカーとして、 X線撮影法、 NMR、または ESRによって検出可能なものが挙げられる。 X線撮影法については、適切な標識として、検出可能な放射線を放射するが、被検体に対して明らかには有害ではない、バリウムまたはセシウムのような放射性同位元素が挙げられる。 NMRおよび ESRのための適切なマーカーとして、関連のハイプリドーマの栄養分の標識によって抗体中に取り込まれ得る、重水素のような検出可能な特徴的な回転を有するものが挙げられる。

[0212] 放射性同位元素 (例えば、 ¹³¹I、 ⁱ In, ^99mTc)、放射性不透過体 (radio- opaque)基質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像解析部分で標識されている、血清型 kの S. mutans株特異的抗体または抗体フラグメントが、障害について試験される哺乳動物中に (例えば、非経口的、皮下、または静脈内）導入される。被検体の大きさおよび使用される画像解析システムによって、診断用の画像を生じるために必要とされる画像解析部分の量が決定されることが、当該分野で理解される。放射性同位元素部分の場合、ヒト被検体については、注射される放射活性の量は、通常約 5— 20ミリキュリーの範囲の^{99 m}Tcである。次いで、標識抗体または抗体フラグメントは、血清型 kの S. mutans株を含む細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボでの腫瘍画像解析は、 S. W. Burchielら、「Immunopharmacokinetics of Radiolaoeiea Antibodies and Their FragmentsJ (Turner Imaging第 13皁： The Radiochemical Detection of Cancer, Burchiel, S. W.および Rhodes, B. A.編、 Masson Publishing Inc. (1982》に記載されている。

[0213] 本発明の血清型 kの S. mutans株特異的抗体にさらに適切な標識は、以下に提供される。適切な酵素標識の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフイロコッカスヌクレアーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、 α—グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ァスパラギナーゼ、グルコースォキシダーゼ、 j8—ガラタトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレァーゼ、カタラーゼ、グルコース 6—リン酸デヒドロゲナーゼ、ダルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。

[0214] 適切な放射性同位体標識の例としては、 ³H、 ⁱ In, ¹²⁵I、 ¹³¹I、 ³²P、 ³⁵S、 ¹⁴C、 ⁵¹Cr 、 ⁵⁷To、 ⁵⁸Co、 ⁵⁹Feゝ ⁷⁵Seゝ ¹⁵¾u、 ⁹°Y、 ⁶⁷Cu、 ²¹⁷Ciゝ ²¹¹At、 ²¹²Pb、 ^4?Scゝ ¹⁰⁹Pdなどが挙げられる。 ^lnは、インビボでのイメージングが用いられる場合に好ましい同位体である。なぜなら、これは、 ¹²⁵ιまたは¹³¹1で標識したモノクローナル抗体の肝臓による脱ハロゲンィ匕の問題を回避するからである。さら〖こ、この放射性核種は、イメージングのためにより好ましい γ放出エネルギーを有する（Perkinsら、 Eur. J. Nucl. Med. 10: 296-301 (1985)； Carasquilloら、 J. Nucl. Med. 28: 281-287 (1987))。例えば、 1 一（P イソチオシァネートベンジル） DPTAを用いてモノクローナル抗体にカツプリングした l l llnは、非腫瘍性組織 (特に肝臓）における取り込みをほとんど示さなかつた。それゆえ、腫瘍局在化の特異性を増強する（Estebanら、 J. Nucl. Med. 28: 861-870 (1987))。

[0215] 適切な非放射性同位体標識の例としては、 ¹⁵⁷Gd、 ⁵⁵Mn、 ¹⁶²Dy、 ⁵²Tr、および⁵⁶ F eが挙げられる。

[0216] 適切な蛍光標識の例としては、 ¹⁵¾u標識、フルォレセイン標識、イソチオシァネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシァニン標識、ァロフィコシァニン標識、 o—フタルアルデヒド標識、およびフルォレサミン標識が挙げられる。

[0217] 適切な毒素標識の例としては、ジフテリア毒素、リシン、およびコレラ毒素が挙げられる。

[0218] 化学発光標識の例としては、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アタリジ -ゥムエステル標識、イミダゾール標識、アタリジ-ゥム塩標識、シユウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、およびェクオリン標識が挙げられる。

[0219] 核磁気共鳴コントラスト剤の例としては、 Gd、 Mn、および Feのような重金属原子核が挙げられる。

[0220] 上記の標識を抗体に結合するための代表的な技術は、 Kennedyら（Clin. Chim.

Acta 70: 1-31 (1976))および Schursら (Clin. Chim. Acta 81: 1-40 (1977))により提供される。後者において言及されるカップリング技術は、ダルタルアルデヒド方法、過ヨウ素酸方法、ジマレイミド方法、 m—マレイミドベンジルー N—ヒドロキシースクシンイミドエステル方法であり、これらの方法は全て本明細書中に参考として援用される。

[0221] (C)血清型 kの S. mutans株のスクリーニング

本発明は、生物学的サンプル力血清型 kの S. mutans株をスクリーニングする方法を提供する。 1つの局面において、本発明は、配列番号 1ないし 4に示される塩基配列を含みかつ S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的な塩基配列またはその相補配列力なるポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いて、 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株をスクリーニングする方法を提供する。好ま、実施形態にお!ヽて、上記 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型 kの S. mutans株である。さらに好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、本発明の抗体を用いて S. mutans株の血清型を確認する工程をさらに包含する。

[0222] 別の局面において、本発明は、 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株に特異的に結合する抗体を用いて、 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株をスクリーニングする方法を提供する。好ましい実施形態において、上記 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型 kの S. mutans株である。さらに好ましい実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、本発明のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを用いて S. mutans株の血清型を確認する工程をさらに包含する。

[0223] 本発明はさらに、上記のスクリーニング方法を用いて同定された、 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株を提供する。好ましヽ実施形態において、上記 S. mutansの血清型特異多糖抗原のグルコース側鎖の量が低下した血清型の株は、血清型 kの S. mutans株である。さらに好ましい実施形態において、上記血清型 kの S. mutans株は、 TW295、 TW871、 FT1— FT51、 SU1— SU51、 YK1— YK50、 FT1GD、 YK1R、 ATIおよび YT1が挙げられるが、これらに限定されない。

[0224] (3)血清型 kの S. mutans株の検出キットおよび診断キット

本発明に力かる S. mutansの血清型判定キットは、判定対象となる S. mutans株が上記 k型である力否かを判定するものである。

[0225] 本発明は、配列番号 1ないし 4に示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列またはその相補配列力もなるオリゴヌクレオチドを備える、血清型 kの S. mutans 株を検出するためのキットを提供する。好ましくは、本発明のキットは、 c型、 e型または f型の S. mutans株に特異的に結合するオリゴヌクレオチドをさらに備える。さらに好ましくは、上記オリゴヌクレオチドは標識されている。本発明に従えば、患者が血清型 kの S. mutans株を保有するカゝ否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例にお!、て血清型 kの S. mutans株を検出し得る。

[0226] 1つの局面において、本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドが PCRプライマーである。好ましい実施形態において、本発明のキットは、 PCR反応に用いるための試薬をさらに含む。

[0227] 別の局面において、本発明のキットは、上記オリゴヌクレオチドがハイブリダィゼーシヨンプローブである。好ましい実施形態において、本発明のキットは、ハイブリダィゼーション反応に用いるための試薬をさらに含む。

[0228] 一実施形態において、本発明のキットは、配列番号 9に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とする。本実施形態に係るキットは、配列番号 8 に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることが好ましぐ配列番号 10に示される塩基配列力もなるオリゴヌクレオチドをさらに備えることがなお好ましい。

[0229] 本発明はさらに、血清型 kの S. mutans株の多糖抗原に特異的に結合する抗体を備える、血清型 kの S. mutans株を検出するためのキットを提供する。好ましくは、上記ォリゴヌクレオチドは標識されている。本発明に従えば、患者が血清型 kの S. mutans株を保有するカゝ否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において血清型 kの S. mutans株を検出し得る。

[0230] (4)血清型 kの S. mutans株の検出器具および診断器具

本発明に係る細菌検出器具は、サンプル中の細菌を検出 ·同定するための器具であって、対象となる細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドが基板表面に固定化されており、当該オリゴヌクレオチドとサンプルに由来する核酸とのハイブリダィゼーシヨンによりサンプル中の細菌を検出'同定するものである。血清型 kの S. mutans株の検出に用いる場合、上記オリゴヌクレオチドは、血清型 kの S. mutans株に特異的な多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードするポリヌクレオチドの塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列またはその相補配列を含む。さらに他種の細菌を網羅的に検査する場合は、当該他種の細菌 (複数であってもよい）に特異的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチドも基板上に固定ィ匕することが好ましい。このように、複数種の細菌を含むサンプルを使用するアツセィに供することによって、血清型 kの S. mutans株がどのような細菌種と共存する傾向があるかを知ることができる。

[0231] (A)基板本発明に係る細菌検出器具に用いる基板の材質としては、オリゴヌクレオチドを安定して固定ィ匕することができるものであればよい。例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。基板の形態も特に限定されるものではないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。

[0232] 〔基板表面に固定化されるオリゴヌクレオチド〕

本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定ィ匕されるオリゴヌクレオチドは、検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドであればよい。当該オリゴヌクレオチドとサンプル由来の核酸との間にハイブリダィゼーシヨンが成立することにより、サンプル中に含まれている目的の種または属に属する細菌を検出することが可能となる。なお、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドを、以下適宜「キヤプチヤーオリゴ」と称する。

[0233] 上記特異的な塩基配列は、検出対象細菌のゲノムの塩基配列力属または種特異的な塩基配列を見出せばよいが、検出対象細菌のリボソーム RNA遺伝子に対応する塩基配列から見出すことが好ましい。なかでも細菌の 16Sリボソーム RNA遺伝子は属または種特異的な塩基配列を多く有していることが知られており、 16Sリボソーム RNA遺伝子に対応する DNA配列中力属または種特異的な塩基配列を見出すことが特に好ましい。リボソーム RN A遺伝子の塩基配列は、 GenBank、 EMBL、 DDBJ等のデータベース等力も入手することができる。

[0234] キヤプチヤーオリゴは上記属または種特異的な塩基配列に基づ!/、て設計すればよい。したがって、上記属または種特異的な塩基配列そのものであってもよいし、検出対象細菌から調製した核酸と特異的なハイブリダィゼーシヨンが成立する限りにおいて、変異が含まれていてもよい。変異の位置は特に限定されるものではない。

[0235] キヤプチヤーオリゴの長さ (塩基数）は特に限定されるものではないが、短すぎるとハイブリダィゼーシヨンの検出が困難になり、長すぎると非特異的ハイブリダィゼーシヨンを許容してしまう。発明者らは、キヤプチヤーオリゴの長さの最適化について検討を重ね、標準的な長さを 12— 50塩基長とした。好ましくは、 12— 40塩基長、より好ましくは 12— 30塩基長、さらにより好ましくは、 13— 22塩基長である力これらに限定されない。塩基長は主として配列特性 (特定の塩基の含有率，同一塩基のリピート）に依存するものであり、結合性の良!、ものは短鎖でも特異的ハイブリダィゼーシヨンが可能であることが、発明者らにより確認されている。

[0236] キヤプチヤーオリゴ力サンプル由来の核酸とのハイブリダィゼーシヨンを妨害するヘアピン構造、ループ構造、またはそれ以外の立体構造を持つ場合、キヤプチヤーオリゴを構成する 1またはそれ以上のヌクレオチドをイノシンまたは、ずれのヌクレオチドとも対合しない核酸に置換することにより、その立体構造を解除することができる

[0237] キヤプチヤーオリゴの合成法は特に限定されるものではなぐ公知の方法 (例えば、 Maniatis, T. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cola Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載の方法等）により合成すればよい。一般的には、市販の DNA合成機を用いて化学合成することができる。

[0238] 本発明に係る細菌検出器具において、上記検出対象細菌が属する種または属に特異的な塩基配列に基づくオリゴヌクレオチドのみではなぐそれらにカ卩えて、いわゆるコントロール.キヤプチヤーオリゴを基板表面に固定ィ匕することが好ましい。コント口ール.キヤプチヤーオリゴには、陽性コントロール 'キヤプチヤーオリゴおよび陰性コントロール.キヤプチヤーオリゴが含まれる。陽性コントロール.キヤプチヤーオリゴは、後述するプローブ調製工程にぉ、て増幅反応がうまく、つて、るかどうかを判定するために用いるものである。陰性コントロール 'キヤプチヤーオリゴは、非特異的ハイブリダィゼーシヨンが生じてヽな、こと、すなわち擬陽性のハイブリダィゼーシヨンシグナルが生じて!/、な!/、ことを確認するために用いるものである。これらの陽性コントロール ·キャプチヤーオリゴおよび陰性コントロール.キヤプチヤーオリゴが基板表面に固定ィ匕された細菌検出器具も本発明に含まれる。

[0239] 陽性コントロール 'キヤプチヤーオリゴは検出対象細菌力調製するプローブに含まれる塩基配列に基づいて設計されるものであればよい。また、複数の検出対象細菌を同時に同一の細菌検出器具を用いて検出する場合には、各検出対象細菌について陽性コントロール 'キヤプチヤーオリゴを設計してもよいが、複数の検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列に基づ、て設計してもよ!、。すべての検出対象細菌から調製するプローブに共通する塩基配列がない場合は、いくつかのダループごとに陽性コントロール 'キヤプチヤーオリゴを設計してもよい。あるいは、プライマー配列部分が同じで、対象となる細菌の配列とは異なる人工的な配列を設計し、この配列の一部を陽性コントロール 'キヤプチヤーオリゴとすることもできる。上記人工的な配列を铸型としてプローブを調製し (本明細書では、このようなプローブをコント口ールプローブと称する。）、サンプル力も調製したプローブに添加することにより、ハイブリダィゼーシヨンの特異性を検証することが可能となる。なお、上記プローブについては後述する。

[0240] 陰性コントロール 'キヤプチヤーオリゴは、陽性コントロール 'キヤプチヤーオリゴの塩基配列において、 1塩基以上であり、かつ、当該配列の有する塩基数の 20%未満の範囲内で人為的な塩基の置換を含む塩基配列を有するように設計することが好ましい。塩基置換を行う塩基数は、ハイブリダィゼーシヨンの条件との関係で決定され、検出対象細菌由来のプローブがハイブリダィゼーシヨンを生じないような塩基数を選択すればよい。

[0241] 検出対象細菌は特に限定されるものではなぐ目的とするサンプル中から検出しようとする細菌を適宜選択すればよい。例えば、食品中に混入し当該食品を汚染する可能性のある細菌を挙げることができる。食品中に有害な細菌が混入することは、公衆衛生上非常に大きな問題となる。上記の食品汚染細菌の存在および Zまたはその量と比較することによって、本発明の血清型 kの S. mutans株の存在および Zまたはその量を測定することができる。

[0242] 食品を汚染する細菌としては、ラクトバチルス属（Lactobacillus)、ぺディォコッカス属 (Pediocuccus)、ストレフ。トコッカス属 (Streptococcus)、メ！スフエフ属 (Megasphaera )およびべクチネータス属（Pectinatus)に属する細菌を挙げることができる。また、ラタトバチルス属（Lactobacillus)に属する細菌種としては、ラクトバチルス.ブレビス（ Lactobacillus brevisノ、フクトノくナノレス'コリニフォノレミス (Lactobacillus coryniformis)、ラクトバチルス ·力ルバトス（Lactobacillus curvatus)、ラクトバチルス ·デルプリュッキイ（ Lactobacillus delbruecKiリ、フクトノ、チノレス'ファ ~~メンタム (Lactobacillus fermentum) 、ラクトバチルス 'リンドネリ（Lactobacillus lindneri)、ラタトバチルス 'マレフアーメンタンス (Lactobacillus malefermentans)、フクトノくテノレス 'カセィ (Lactobacillus casei)、フタトバチルス 'ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス'ブヒネリ（ Lactobacillus buchneri)、ロイコノストック属 (Leuconostoc)およびザィモモナス属 ( Zymomonas)に属する細菌、並びにェンテロコッカス'デュランス (Enterococcus durans)およびラタトコッカス 'ラクチス（Lactococcus lactis)を挙げることができる。ただし、検出対象細菌はこれらに限定されるものではない。

[0243] 上記例示した細菌を検出'同定するためのキヤプチヤーオリゴとしては、上記に列挙した細菌の 16Sリボソーム RNA遺伝子に対応する塩基配列のうち、各属に特異的な配列に基づくオリゴヌクレオチドを挙げることが、これらに限定されるものではない。

[0244] 本発明に係る細菌検出器具の基板表面に固定ィ匕されるキヤプチヤーオリゴは、対象とする細菌から調製されたプローブとハイブリダィゼーシヨンが成立するものであれば特に限定されるものではな、。

[0245] 1つの基板上に固定ィ匕するキヤプチヤーオリゴは、少なくとも 1種類以上であればよぐ特に上限はない。一般に、試料中に混入した細菌を検出する場合は、サンプル中から検出可能な細菌を 1つの基板で網羅的に検出できることが、操作の簡便性および検査の迅速性の観点力も好ましいといえる。したがって、本発明に係る細菌検出器具も、 1つの基板上に目的の細菌種または属に対応するキヤプチヤーオリゴを複数固定ィ匕した、、わゆるマイクロアレイ型の器具とすることが最も好まし、。

[0246] (B)オリゴヌクレオチド (キヤプチヤーオリゴ)の固定ィ匕

オリゴヌクレオチドの基板表面への固定ィ匕法は特に限定されるものではなぐ公知の方法を適宜選択して用いればよい。例えば、物理的吸着、電気的結合または分子共有結合などの一般的なハイブリダィゼーシヨン法に用いられる手法が利用可能である。本発明に係る細菌検出器具においては、表面にカルポジイミド基またはイソシァネート基を有する基材を使用し (米国特許: US5, 908, 746、特開平 8— 23975号 )、固定ィ匕することが好ましい。

[0247] オリゴヌクレオチドをスポッティングする際に、オリゴヌクレオチドのスポット量が少なすぎると、オリゴヌクレオチドとプローブとの間の反応性を十分に確保することができず、判定が困難になることがある。また、高集積度のスポッティングは技術的な問題と同時にコストがかかり、さらにプローブの蛍光標識やィ匕学発色などを用いたハイプリダイゼーシヨンシグナルの検出にもより精密で高額な検出装置 (例えば、スキャナー）が必要となる。したがって、オリゴヌクレオチドは、基板の表面に径 10— 1, 000 m のサイズに固定することが好まし、。オリゴヌクレオチドの基板上へのスポッティング方法は特に限定されるものではない。例えば、スポッティングマシンを使用して基板上にオリゴヌクレオチド溶液をスポッティングすることにより行うことができる。これによりオリゴヌクレオチド溶液は、通常ほぼ円形にスポッティングされる。

[0248] (5)本発明の用途

本発明を用いることによって、患者が感染性心内膜炎の原因菌の 1つである S. mutansのうち病原性の高い可能性のある菌株を保有する力否かを簡便に同定し得る。特に、これまで検出限界以下であった症例において原因菌を検出し得る。感染性心内膜炎発症のリスクの高い菌株を保有する個体の限定が可能となり、それにより感染性心内膜炎を予防するために使用される多量の抗生物質を抑制し得、抗生物質の乱用に起因する薬剤耐性菌の出現を抑制し得る。また、原因菌となる S. mutans株と症状との間の相関関係を知ることができるとともに、他の原因菌との関係についてさらなる†青報を与えることができる。

[0249] 以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する力本発明はこれに限定されるものではない。

[0250] [実施例 1]

(A) S. mutans臨床口腔分離株の収集および S. mutans血清型の同定

1982年力ら 1990年の間に 571人の幼児力ら分離した 1326個の S. mutans株（分離株の MT4000シリーズまたは MT10000シリーズ）を、本発明者らの研究室ストツクより選択した。

[0251] さらに、 2002年 8月に大阪大学歯学部病院小児歯科（日本国大阪府吹田巿)へ訪れた 100人の被験体 (3— 17歳；平均 8. 9歳)より得た株を、無作為に選択した (NN 2000シリーズ)。これらの被験体は、 88人の健常な幼児とともに、口唇裂および口蓋裂を有する患者 5人、心室中隔欠損を有する患者 3人、エナメル質形成不全症を有する患者 2人、二分脊椎を有する患者 1人、ならびに自閉症の患者 1人を含んだ。

[0252] 臨床標本の収集を、ヒト被験体に関与する研究のための大阪大学倫理委員会規定に従って行った。プラークサンプルを、滅菌した PBS中に懸濁し、希釈し、そしてバシトラシン（0. 2単位 Zml; Sigma Chemical Co. , St. Louis, Mo. )および 15% (wZv) のスクロースを含有する MS寒天培地（Difco)上に広げた。コロニーの形態に基づいて、各被験体力コロニーを 1つ選択して実験に供した。

[0253] Masuda, N. et al. , 1985. i ransmission of Streptococcus mutans in some selected families. Microbios. 44: 223- 232に記載の方法に従って、 S. mutans株の c型、 e型および f型に対する抗血清を取得し、この抗血清を使用する免疫拡散法によって、上記臨床標本の血清型を決定した。

[0254] MTシリーズ 1326株の全てが血清学的に c、 eまたは fとして分類され、血清型が不定である分離株は見出されなかった。一方、 NN2000シリーズ 100株のうちの 78株、 17株および 3株は、それぞれ血清型 c、 eおよび fとして分類され、残りの 2株 (FT1 ( NN2011)および SU1 (NN2029) )は、 c型、 e型または f型に特異的な抗血清と反応しな力つた (表 1)。また、血清学的に不定な株 (FT1株または SU1株）を保有する被験体の各々から、 50コロニーを分離した。

[0255] [表 1]

9631

(B) S. mutans株

上述した S. mutans株の c型、 e型および f型に対する抗血清を用いて、 S. mutans血液分離株 TW295 TW871 TW964および TW1378が、それぞれ、血清型不定株、血清型不定株、 f型株および e型株であることを同定した。これらの S. mutans株ならびに上述した口腔分離株である MT8148 (c型株）、 MT4245株（e型株）、および MT4251 (f型株）の特徴を、表 2に示す。

[表 2]

( 本実施例において使用した細菌株）株血清型特徴

T W 2 9 5 k 抜歯処置後に菌血症を呈した

5 9歳の男性よリ得た血液分離株

T W 8 7 1 k クモ膜下出血を合併する感染性心内膜炎

を発症した 4 5歳の女性より得た血液分離株

T W 9 6 4 f 感染性心内膜炎を発症した 7 2歳の女性

よリ得た血液分離株

丁 W 1 3 7 8 e 感染性心内膜炎を発症した 5 9歳の男性

よリ得た血液分離株

M T 8 1 4 8 c 健常な幼児よリ得た口腔分離株

M T 4 2 4 5 e 健常な幼児より得た口腔分離株

M T 4 2 5 1 f 健常な幼児よリ得た口腔分離株

N N 2 0 0 1 c 6歳の健常な少女よリ得た口腔分離株

N N 2 0 0 2 e 9歳の健常な少年よリ得た口腔分離株

N N 2 0 0 3 f 7歳の健常な少年よリ得た口腔分離株

M T 8 1 4 8 G D

k M T 8 1 4 8のグルコース側鎖欠失変異株

F T 1 ( N 2 0 1 1 )

k 3歳の健常な少女より得た口腔分離株

S U 1 ( N N 2 0 2 9 )

k 1 0歳の健常な少女より得た口腔分離株

Y 1 k ダウン症の 6歳の少女より得た口腔分離株 [0258] (C) S. mutansに対する抗血清の作製

S. mutans血清型不定株に対する抗血清を取得した。新規血清型の S. mutansに対する抗血清は、その抗原性が著しく低下して、るために従来の方法では抗血清が得られな力つたが、本発明者らは、免疫法を工夫することによってその高血清を得ることに成功した。

[0259] 具体的には、 S. mutansの TW295株および TW871株の全菌体を、リン酸緩衝ィ匕生理食塩水（PBS)に懸濁し、各々の菌体にっ、て一日あたり乾燥重量 5mgを、 5日間連続でゥサギ耳介静脈に注射した。 1週間間隔をあけた後、さらなる 2週間において 1週間に 5日間ずつ反復注射し、ゥサギ耳介静脈より採血し、 S. mutansの TW295 株に対する抗血清および TW871株に対する抗血清を得た。

[0260] (D)グルコース側鎖欠失変異株の構築、およびその細菌学的特徴づけおよび血清学的特徴づけ

MT8148のグルコース側鎖欠失 (GD)変異株を、 gluA遺伝子に抗生物質耐性遺伝子の挿入不活化によって構築した。 S. mutans株 Xc (GenBank accession no.AB001562)および Oklahoma大学より公開されている S. mutansゲノムデータベース (GenBank accession no.AE014133)から得た gluA配列に基づ、て構築したプライマ一とともに AmpliTaq Goldポリメラーゼ（Applied Biosystems, Foster City, Calif)を用いるポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)によって、 gluA遺伝子およびその隣接領域を増幅した。この増幅したフラグメントを、次いで、 pST Blue— 1ベクター（Promega, Madison, Wis)にクローユングして、プラスミド pRNlOlを作製した。 pRNlOlの gluAのオーブンリーディングフレームの中央部を、 Stulによって消化し、次いで、 pVA838より得た 830bpのエリスロマイシン耐性遺伝子（erm)フラグメントを挿入してプラスミド pRN 102を構築した。制限酵素 Not Iでの消化によって線状ィ匕した後、このプラスミドを、 Tobianおよび Macrinaの方法によって S. mutans MT8148株に導入した。この形質転換体を、エリスロマイシン（ΙΟ /z gZml)を含有する Mitis- salivarius (MS)寒天培地（Difco Laboratories, Detroit, Mich. )プレート上でスクリーニングした。 gluA遺伝子の PCR増幅および免疫拡散法によって、変異株 MT8148GDの適切な挿入不活化を確認した。 [0261] MT8148GDは、 S. mutansの典型的な生物学的特徴を示した。この特徴としては、 MS寒天培地上での粗いコロニー、糖発酵能陽性、 PAおよび GTFの発現、ならびに高レベルのショ糖依存的付着および菌体疎水性が挙げられる。

[0262] (E)種々の S. mutans株に対する抗血清の反応性

上記の抗体を用いて免疫拡散法 (ゲル内沈降反応）を行なうために、 TW295株および TW871株、ならびに c型、 e型および f型の S. mutans株をー晚培養し、 121°Cで 15分加熱した後に遠心分離して、上清として抗原 (ランツランドール (RR)抗原)を得た。

[0263] S. mutansの TW295株に対する抗血清および TW871株に対する抗血清は、 S. mutansの c型株、 e型株および f型株力も調製した抗原と反応しなかった力 S. mutans の TW295株および TW871株から調製した抗原と反応した（図 1A— E)。これら S. mutansの TW295株および TW871株の血清型を k型と名付けた。

[0264] なお、図 1Aの中央のゥエルは、 TW295株から得た RR抽出物を含み（ゥエル 1)、外側のゥエルは、 TW295株に対する抗血清（ゥエル 2)および TW871株に対する抗血清（ゥエル 3)、ならびに血清型 cに特異的な抗血清（ゥエル 4)、血清型 eに特異的な抗血清（ゥエル 5)および血清型 fに特異的な抗血清（ゥエル 6)を含む。また、図 1B の中央のゥヱルは、 TW871株に対する抗血清を含み（ゥエル 7)、の外側のゥヱルは、 TW295株から得た RR抽出物（ゥエル 8)、 TW871株から得た RR抽出物（ゥエル 9 )、 MT4251株 (f)力ら得た RR抽出物（ゥエル 10)、 MT4245株（e)力ら得た RR抽出物（ゥエル 11)および MT8148株（c)力も得た RR抽出物（ゥエル 12)を含む。また、図 1Cの中央のゥルは、 FT1株力も得た RR抽出物を含み（ゥエル 13)、外側のゥルは、 TW871株に特異的な抗血清（ゥエル 14)、血清型 cに特異的な抗血清（ゥル 15)、血清型 eに特異的な抗血清（ゥエル 16)および血清型 fに特異的な抗血清（ゥエル 17)を含む。図 1Dの中央のゥエルは、血清型 cに特異的な抗血清を含み（ゥエル 18)、外側のゥエルは、 MT8148株から得た RR抽出物（ゥエル 19)および MT8148 GD株（c)から得た RR抽出物（ゥエル 20)を含む。図 1Eの中央のゥヱルは、 TW871 株に対する抗血清を含み（ゥエル 21)、図 1Eの外側のゥヱルは、 TW295株から得た RR抽出物（ゥエル 22)、 TW871株力も得た RR抽出物（ゥエル 23)、 FT1株から得た RR抽出物（ゥヱル 24)、 SU1株力得た RR抽出物（ゥヱル 25)、 YK1株力得た RR 抽出物（ゥエル 26)および MT8148GD株から得た RR抽出物（ゥエル 27)を含む。

[0265] MM8148GDの RR抽出物は、 TW871に対する抗血清と沈降バンドを形成し（しかし、血清型 c特異的抗血清とは沈降バンドを形成しない）、このバンドは、 TW295、 TW871、 FT1、 SU1および YK1の沈降バンドと融合した。

[0266] さらに、この抗血清を用いて、 100人の被験体から分離した 100株（NN2000シリーズ）の S. mutans中に k型株が存在する頻度を調べた。 2株の RR抗原は、 c型、 e型または f型の S. mutans株に対する抗血清とは反応しなかった力 k型の S. mutans株に対する抗血清と反応した。残りの 98株の RR抗原は、 c型株、 e型株または f型株に特異的な抗血清のいずれ力と反応した。よって、 NN2000シリーズの S. mutans臨床口腔分離株における血清型不定株 (FT1株および SU1株）は k型株であると同定した。

[0267] (F)血清型不定株 S. mutansの特徴づけ

血清型が不定な臨床分離株のショ糖依存的付着および菌体疎水性を、それぞれ、 Hamadaら（1981)、および Rosenbergら（1980)、によって記載されるように評価した。菌体結合型 (cell-associated)ダルコシルトランスフラーゼ（CA—GTF)または菌体遊離型（ceU-free)ダルコシルトランスフェラーゼ（CF— GTF)および表層タンパク質抗原 (PA)の発現を、 GTFおよび PAに特異的な抗体を用いるウェスタンプロット分析を使用して分析した（図 2A— C)。ゲノム DNAを試験菌体より抽出し、 16S rRN A配列を決定し、そして対照株 NCTC10449 (GenBank accession no. X58303、 S70358)の配列と比較した。

[0268] なお、図 2Aおよび Bでは、全細胞を、 7%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて分離し、 S. mutansの PA (図 2A)または CA— GTF (図 2B)に対するゥサギ抗体と反応させた。一方、図 2Cでは、硫酸アンモ-ゥム沈殿によって濃縮した細胞上清 (C ) PVDF膜上に転写したタンパク質を、 7%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて分離し、 CF-GTF (C)に対するゥサギ抗体と反応させた。各レーンについて説明すると、レーン 1が MT8148株であり、レーン 2が FT1株であり、レーン 3が SU1株であり、レーン 4が YK1株である。 FT1株および SU1株は、 PAおよび 3つの型の GT Fを発現した。

[0269] FT1株および SU1株は、高レベルのショ糖依存的付着および菌体疎水性を示し（データ示さず）、そしてこれらの 16S rRNA遺伝子配列は、 NCTC10449株（ GenBank accession no. X58303および S70538)の 16S rRNA遺伝子配列と同一であった。さらに、 FT1株の RR抽出物は、 TW871株および TW295株に対する抗血清とともに沈降バンドを形成し、このバンドはまた、 TW871の RR抽出物と TW871に対する抗血清との沈降バンドと融合した。さらに、 FT1株および SU1株を有する被験体の各々より得た 50株は、 c型、 e型または f型に特異的な抗血清と反応性ではなかつた o

[0270] また、これら両方の株は、 S. mutansの特徴である MS寒天培地上での粗いコロニー、バシトラシン耐性、血液寒天上での γ溶血性、マン-トール、ソルビトール、ラフイノースおよびメリビオースにおける糖発酵能陽性、ならびにデキストラン凝集陰性を示した。

[0271] (G)さらなる臨床分離株の解析

S. mutansのさらなる臨床的分離株 2500個を、 2003年初頭に大阪大学歯学部病院の小児歯科へ訪れた別の群の被験体 50人（3— 19歳；平均 7. 8歳)より得た。これらの被験体は、 45人の健常な幼児および一般的健康問題または口腔の健康問題 (例えば、ダウン症、先天性心障害、口唇裂および口蓋裂、エナメル質形成不全症、ならびに部分的無歯症)を有する患者 5人を含んだ。

[0272] 表 3は、 S. mutansの上記分離株 2500個（そのうち 2450個は c型、 e型または f型に分類された)の血清型分布を示す。

[0273] [表 3] ¾ (ノ舰k犟S s s/ ^鼈紫T 04092 Y sue s )m 0.2リ

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[0274] 一方で、単一の被験体（ダウン症の少女）より得た他の 50株（YK1— YK50)の RR 抽出物が、 TW871に対する抗血清と沈降バンドを形成した。このバンドはまた、 TW 295、 TW871, FT1および SU1の RR抽出物の沈降バンドと融合した。表 4は、個々の被験体における血清型分布パターンを示し、これらの被験体のほとんどが、 S. mutansの血清型 cのみを保有し、次いで血清型 eのみを保有する力 50人の被験体のうち 5人は複数の血清型を保有するということが、見出された。

[0275] [表 4] ( 5 0人の被験体個々の血清型分布）血清型被験体の数

(単一の血清型）

C 3 4

e 8

f 2

k 1

(複数の血清型）

cおよび e 3

eおよび f 1

c、 eあよび f 1

[0276] (H)食作用アツセィ

生物を、 Brain Heart Inlusion broth (Difco)中にて 37°Cで 18時間培養した。この菌体を洗浄した後、細胞濃度を、 PBSで 1. 0 X 10⁸CFU/mlに調整した。ヒト末梢血（ 500 μ 1)を、健常なボランティアより収集し、そして細菌 500 μ \ (5. O X 10^?CFU)とともに 37°Cで 10分間インキュベートした。ギムザ染色（Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)を用いて染色し、光学顕微鏡（倍率、 X 100 ; Olympus Industries, Tokyo, Japan)を用いて、食作用を呈している多型核白血球 (PMN)の割合を求めた。 100個の PMN当たり食菌した PMNの平均値（500個の PMNを試験した）によつて、比率を表した。

[0277] さらに、 MT8148株、 MT8148GD株、 FT1株、および TW295株における経時的な食作用の比率の変化を、 15分後、 30分後、 60分後、 90分後および 120分後に観察した。種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析 (ANOVA)によって評価した（図 3)。 [0278] 図 3Α·Βは、 S. mutansの口腔分離株および血液分離株の食作用率を示す。なお、図 3Α·Βに示す結果は、 5回の実験の平均士標準偏差を示す。図 3Αでは、 12株の食作用率を、 10分間のインキュベーション後に試験した。図 3Βでは、 15分間、 30分間、 60分間、 90分間および 120分間のインキュベーションにおける ΜΤ8148 (參）、 MT8148GD(〇）、 FT1 (▲)および TW295 (口）の食作用率の変化を示す。

[0279] MT8148GD株の食作用率は 22. 0± 2. 4%であり、これは、親株 MT8148の食作用率（68. 4±4. 1%)より有意に低力つた（P< 0. 001)。さらに、 NN2001 (c)、 NN2002 (e)および NN2003 (f)の口腔分離株は、 MT8148と同等の食作用率を示したが、血清型 kの口腔分離株である FT1、 SU1および YK1はまた、 MT8148よりも有意に低い食作用率を示した (P< 0. 001)。さらに、血液分離株の 4つ全ての食作用率は、口腔分離株の食作用の割合よりも有意に低力つた (Pく 0. 001)。また、 MT8148GD、 FT1および TW295の食作用率は、不活化 60分間まで MT8148よりも有意に低ぐ TW295の食作用率はまた、不活ィ匕の 90分間後 MT8148よりも有意に低かった（P< 0. 001)。

[0280] 感染性心内膜炎は、病原性細菌の血流中への侵入によって開始されることが知られているが、侵入機構および血液中での S. mutansの生存機構は、未だ明らかになつていない。本実施例において、本発明者らは、血清型特異多糖抗原においてダルコース側鎖を欠失した同系の変異株の食作用率が、親株の食作用率より低いことを見出した。フィッシャー PLSD分析によって決定した場合、 MT8148 (血清型 c)と他の株との間に統計学的に有意な差異があった（*P< 0. 001)。

[0281] さらに、血清型 kの口腔分離株および血液分離株は、 PMNによる食作用率が低下した。総じて、これらの知見は、血清型 k株 (これは、血清型特異多糖抗原においてグルコース側鎖を欠くと考えられている）がおそらく菌血症病原性株であり得ることを示唆する。一方で、血液分離株である TW964 (e)および TW1378 (f)は、口腔分離株である NN2002 (e)および NN2003 (f)より食作用に対して感受性ではな、。しかし、本発明者らは、 TW964がグルカン結合タンパク質 Aを欠く力 TW1378ではこのような変異は何ら見られな力たということを示した。従って、食作用能に対する効果を有する血清型特異的多糖抗原以外に、菌体表層構造物の変異が存在し得る。 [0282] (I)考察

血液分離株 2株（TW295および TW871)、口腔分離株 152株（FT1— FT51、 S U1— SU51、および YK1— YK50)、および、 gluA不活化株（MT8148GD)の RR 抽出物は、 TW295または TW871に対する抗血清と沈降バンドを形成した。一方で、これらの分離株は、 S. mutansに典型的な生物学的特徴 (高レベルのショ糖依存的付着および疎水性、ならびにダルコシルトランスフェラーゼが挙げられる）を有することが示された。

[0283] 本研究において S. mutans血清型 c、 eおよび fが分離される頻度は、デンマークでの研究において報告されたものと非常に類似した。この報告において、ヒト歯垢サンプルより得られた 76個の mutans streptococciのうち 1つおよびヒトぅ蝕性病変より得られた 70個の mutans streptococciのうち 7つは、血清型 a— gとして血清学的に分類することができな力つた。生化学的分析は、これらの血清型不定株が S. mutansに属することを示した力血清型特異的多糖の構造は分布していな力つた。別の研究において、ヒトの歯垢サンプル、う蝕性象牙質サンプル、または糞サンプルより採取された 10 47個の S. mutans分離株または S. sobrinus分離株の全ては、血清型 c、 e、 f、 dまたは gとして分類され得た。さらに、日本の別の地域において実施された最近の研究において、歯垢より得られた 144個の S. mutansまたは S. sorbinusの全て力血清型 c、 e、 dまたは gとして分類され、そして f型株または血清型不定株は検出されな力つた。一方で、最近日本において、 103人の被験体のうち 9人力血清学的に不定な S. mutansを保有することが報告されたが、血清型特異的多糖の特徴に関する正確な記載はな力つた。以上のことは、本発明者らは、最近日本において血清型 k型が出現したことを示している。

[0284] 本研究において、この新たな血清型を有する S. mutansが 3人の幼児由来のプラークサンプル中に見出され、 152株全てが血清型 kとして分類された。これらの臨床分離株の起源は、未だ同定されていないが、血清型 k株は、これら 3人の被験体より得られた歯垢サンプル中に見出された S. mutans株の大部分を占めた。そしてこれらの全てが、高レベルの菌体疎水性およびショ糖依存的付着、ならびに食作用に対する高い抵抗性を示した。これらの知見は、 S. mutansの血清型 k株力 GTFおよび PAの発現ならびに高い疎水性およびショ糖依存的付着に起因してヒトの口腔中に存在すること、ならびにより低い食作用能に起因して血液中で生存し得ることが明ら力となつた。従って、心障害を有する幼児に対して特別な注意が払われなければならない。特に、口腔中に S. mutans血清型 k株を保有するダウン症患者については、心室中隔欠損とともに多型核白血球 (PMN)の機能障害を合併することもあるため、より危険であり得る。これらの患者において新たな血清型 kが検出されるということは危険性の増加を示し得るので、歯科処置の前に抗生物質処方のような臨床的アプローチが必要とされ得、そしてこのことは留意されるべきである。

[0285] [実施例 2. S. mutansの k型株に特異的な遺伝子配列の検索]

S. mutansの k型株（TW295株、 TW871株、 FT1株、 YT1株）からゲノム DNAを抽出し、それぞれの株において、血清型特異的多糖抗原の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子配列を特定し、血清型 cの MT8148株にぉヽて対応する配列と比較した。さらに、 S. mutansの k型株の DNA配列をデータベース上の株（Xc株： uenBank accession no. AB010970、 UAl59¾: GenBank accession no. AE014丄 J3) の DNA配列と比較して、 k型株に特異的な遺伝子配列を特定した。 k型株において r gp遺伝子群中で様々な変異が認められた力全ての k型株に共通して、 rgpF遺伝子の前半部にお、て変異が認められた (図 4一図 13)。

[0286] [実施例 3. S. mutansの k型株の簡易同定法の確立]

S. mutansの c型株と比較した場合、 S. mutansの k型株において、 rgpF遺伝子の前半部分 3分の 1に特異的な遺伝子配列が存在した。その領域を利用して、 rgpF遺伝子の開始コドンの上流部において各血清型（c型、 e型、 f型および k型）の株の間で共通する配列に基づ、て順方向プライマーを設計し (ATTCCCGCCGTTGGAC CATTCC (配列番号 8)： CEFK— F)、 k型に特異的な配列に基づく逆方向プライマ一（CCAATGTGATTCATCCCATCAC (配列番号 9)： K—R)、ならびに c型、 e 型および f型に特異的な配列に基づく逆方向プライマー（CCGACAAAGACCAT TCCATCTC (配列番号 10)： CEF-R)を設計した（表 5および図 14)。

[0287] [表 5] ( プライマーの設計およびその位置）プライマー配列（ 5 ' -→ 3 ' )

CEFK-F ATTCCCGCCGTTGGACCATTCC 6236-6257

K-R CCAATGTGATTCATCGCATCAC 6508-6529

CEF-R CCGACAAAGACCATTCCATCTC 6508-6529 位置は、 Xc (c)株 ( GenBank acces s i on no. AB01 0970) の位置に対応する。

[0288] 上記のプライマー対を用いて k型株のみが特異的に PCR増幅する系を確立した。

具体的には、 S. mutansの k型株 (TW295株、 TW871株、 FT1株、 YT1株）および唾液サンプル力もゲノム DNAを抽出し、 CEFK— Fと CEF— Rとのプライマー対、および CEFK— Fと K Rとのプライマー対を用いて、図 15に従って PCR反応溶液を、 94 。C5分を 1サイクル、 94。C30秒、 60。C30秒、 72。C30秒を 30サイクル、 72°C7分 1サィクルの条件で PCR反応を行った。得られた反応溶液を 1. 5%ァガロースゲルで電気泳動した。その結果を図 16に示す。

[0289] [実施例 4： S. mutansの血清型 k以外の株または血清型 k株にっ、ての PCRアツセィの感度]

S. mutans菌体の滴定培養を用いて、プライマー対 CEFK— Fおよび CEF— Rならびにプライマー対 CEFK— Fおよび K Rを用いる PCR反応の感度を調べた。具体的には、 1ml当たり 10⁸個の MT8148株（c型）、 TW295株（k型）および FT1株（k型）について、プライマー対 CEFK— Fおよび K Rを用いて PCRを行った。テンプレートとして、上記菌体より抽出したゲノム DNAを用いた。滅菌水中に希釈した既知の数（5 X 10⁴個、 5 X 10³個、 5 X 10²個、 5 X 10¹個、および 5個）の菌体を使用することによつて、 PCRの検出限界を決定した（図 16)。 [0290] なお、図 16では、 1ml当たり 10⁸個の MT8148株（c型）、 TW295株（k型）および F T1株 (k型）の細胞の滴定培養を用いて、 PCR反応の感度を調べた。以下の数の細胞を添カ卩した： 5 X 10⁴ (レーン 1)、 5 X 10³ (レーン 2)、 5 X 10² (レーン 3)、 δ Χ ΙΟ^ レーン 4)、および 5 (レーン 5)。 Μは、分子サイズマーカー（lOObp DNAラダー）を示す。

[0291] S. mutansの k型株（TW295株および FT1株）にお!/、て、 k型に特異的なプライマーによる PCR増幅が生じ、 c型（MT8148株）において、 k型に特異的なプライマーによる PCR増幅が起こらなかった。

[0292] 検出限界は、血清型 cZeZf株に特異的なプライマー対において 50— 500細胞、血清型 k株に特異的なプライマー対において 5— 50細胞であり、非常に良好な感度であることがわかった。

[0293] [実施例 5 : S. mutans血清型 k株の検出のための PCRアツセィ]

種々の血清型の S. mutans株および S. mutans以外の連鎖球菌より抽出した DNAをテンプレートに用いて、プライマー対 CEFK— Fおよび CEF— R、プライマー対 CEFK Fおよび K Rを使用する PCRの確からしさを確認した（図 17Α· B)。

[0294] なお、図 17Aでは、血清型 cZeZf株に特異的なプライマー対 (CEFK— Fおよび C EF-R)を用いて、血清型 cZeZf株の細菌より抽出したゲノム DNA (レーン 1一 4)、血清型 k株の細菌より抽出したゲノム DNA (レーン 5— 8)、唾液サンプルより抽出したゲノム DNA (レーン 9一 14)をテンプレートとして、 PCR反応を行った。また、図 17 Bでは、血清型 k株に特異的なプライマー対 (CEFK— Fおよび K R) (B)を用いて、血清型 cZeZf株の細菌より抽出したゲノム DNA (レーン 1一 4)、血清型 k株の細菌より抽出したゲノム DNA (レーン 5— 8)、唾液サンプルより抽出したゲノム DNA (レーン 9一 14)をテンプレートとして、 PCR反応を行った。

[0295] 各レーンについて説明すると、レーン 1が MT8148 (c型）であり、レーン 2が NN20 01 (c型）であり、レーン 3が NN2002 (e型）であり、レーン 4が NN2003 (f型）であり、レーン 5が TW295 (k型）であり、レーン 6が TW871 (k型）であり、レーン 7が FT1 (k 型）であり、レーン 8が YTl (k型）であり、レーン 9が Steptococcus sanguinis ATCC1 0556であり、レーン 10力 ^Streptococcus oralis ATCC10557であり、レーン 11が Streptococcus gordonii ATCC10558であり、レーン 12が Streptococcus mitis AT CC903であり、レーン 13が Streptococcus milleri NCTC10703であり、レーン 14が Streptococcus salivarius HHTで teる。

[0296] プライマー対 CEFK— Fおよび CEF— Rは、血清型 cZeZf株を特異的に検出し、プライマー対 CEFK— Fおよび K Rは、血清型 k株を特異的に検出した力いずれのプライマー対も、 S. mutans以外の連鎖球菌を検出しなかった。このように、プライマー対 CEFK— Fおよび CEFK— R、ならびにプライマー対 CEFK— Fおよび K Rを使用すると、それぞれ血清型 cZeZf株および血清型 k株を特異的に検出し得るだけでなぐ S. mutansのみを特異的に検出し得ることがわ力つた。

[0297] [実施例 6：唾液サンプルを用いる PCR反応による S. mutans血清型 k株を有する被験体の同定]

吐出した全唾液 (約 lml)を、 2004年 1一 2月に大阪大学歯学部小児歯科を訪れた 200人の小児あるいは思春期の患者 (2— 18歳（平均年齢 7. 9± 3. 6歳)）より収集した。これらの唾液サンプルを、 Hoshinoら（2004)によって報告された方法をいくらか改変した PCRアツセィに用いた.簡単には、無刺激の全唾液を滅菌チューブ中に収集して氷上に置いた。菌体を、 500 1の唾液から 16, OOO X g〖こて 5分間で微量遠心管中に回収し、電子オーブン中にて 500Wで 5分間処理し、 N—ァセチルムラミリダーゼ SG (Seikagaku Corp., Tokyo, Japan)中にて 50°Cで 1時間消化した.次いで、 80 _iu lの核溶解（nucleilysis)液（Promega)を添カ卩して、 80°Cで 5分間インキュべートし、その後 60 1のタンパク質沈降溶液（Promega)を添カ卩した。 16, OOO X gにて 3分間の遠心分離によってタンパク質を除去し、フエノールークロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって、 DNAを生成した。抽出した DNAを、 50 1の TE緩衝液（1 OmM Tris— HC1、 ImM EDTA(pH8. 0) )中に溶解した。この DNA抽出方法は、歯垢力菌体ゲノムを抽出する際にも用いることができる。

[0298] 上記のように得た DNAをテンプレートに用いる PCRによって、プライマー対 CEFK -Fおよび CEF-Rを使用して血清型 cZeZf株を (A)、プライマー対 CEFK—Fおよび K Rを使用して血清型 k株 (B)を検出した（図 18Α·Β)。その結果、被験体 200人から得た臨床標本のうち 190個が、血清型 k株に非特異的 (血清型 cZeZf株に特異的)なプライマー対に対して陽性を示したが (A)、血清型 k株に特異的なプライマ一対）に対して陰性であった。また、残りの 10個の標本は、血清型 k株に特異的なプライマー対 (B)および血清型 k株に非特異的 (血清型 cZeZf株に特異的)なブライマ一対 (A)に対して陽性を示した。

[0299] なお、図 18Aでは、プライマー対 CEFK— Fおよび CEF— Rを使用して、血清型 k株に非特異的 (血清型 cZeZf株に特異的)なプライマー対 (A)に対して陽性を示したが血清型 k株に特異的なプライマー対 (B)に対して陰性であった上記 190個の標本のうちで代表的な 5例を示す。また、図 18Bでは、血清型 k株の検出のために、プライマー対 CEFK— Fおよび K Rを使用した。各レーンについて説明すると、レーン 1一 5が血清型 k株に特異的なプライマー対に対して陰性であった上記 190株の標本のうち代表的な 5例を示す。レーン 6— 8は、血清型 k株に特異的なプライマー対に対して陽性であった株を示す。

[0300] 以上のように、 S. mutansの k型株（TW295株、 TW871株、 FT1株、 SU1株、 YK1 株、 YT1株および ATI株）、ならびに S. mutans臨床分離株（NN2000シリーズ： c型 78株、 e型 17株、 f型 3株）において、 k型に特異的なプライマーによる PCR増幅が生じ、 c型、 e型または f型に特異的なプライマーによる PCR増幅は起こらなかった。また、 98個の c型、 e型または f型の S. mutans株において、 c型、 e型または f型に特異的なプライマーによる PCR増幅が起こり、 k型に特異的なプライマーによる PCR増幅が起こらなかった。

[0301] [実施例 7]

S. mutansは、その細胞表面多糖の化学組成に基づいて c型、 e型および f型の血清型に分類される（Linzerら、 1987)。 S. mutansの血清型特異的多糖は、ラムノース骨格および OC連結ダルコシド残基または β連結ダルコシド残基の側鎖を有するラムノースーグルコースポリマー力もなることが知られている。本発明者らの以前の研究において、菌血症を発症する患者の血液より得た血清型不定株 (TW295)および感染性心内膜炎を発症する患者の血液より得た血清型不定株 (TW871)は、血清型特異的多糖にぉ、てグルコース側鎖の量が低下することが示された（Fujiwaraら、 2001)。

[0302] 実施例 1に示すように、 k型の血清型を示す MT8148GDは、高レベルのショ糖依存的付着を示したが、その付着率は、親株 MT8148 (c型)の付着率よりも有意に低かった。

[0303] 最近、血清型特異的多糖が、ヒト単核球および線維芽細胞に対する連鎖球菌の付着において重要な役割を担うことが実証され、そして最も有効なサイト力イン刺激成分であることが予測された (Engels- Deutsche 2003)。しかし、血清型特異的多糖とう蝕との間の関係は、解明の余地を残す。

[0304] そこで本発明者らは、新たに解明された S. mutansの血清型 k株のう蝕原性における血清型特異的多糖のグルコース側鎖の役割を分析した。

[0305] (A) S. mutans株

本実施例において使用した S. mutans株を、表 6に示す。 MT8148 (c)の口腔分離株を、本発明者らの研究室の培養物ストックコレクションより選択した。 FT1株 (k)、 S U1株 (k)および YK1株 (k)をまた、日本人の幼児の口腔より分離した。さらに、 YT1 株を、 6歳の健常な少年の口腔より分離し、実施例 1に記載する方法に従って S. mutans血清型 kであることを確認した。 MT8148R株および YK1R株を、漸増濃度のストレプトマイシン (寒天培地 lml当たり最終濃度 1500 gまで）中での継代培養を繰り返すことによってストレプトマイシンに対して耐性にした（Ooshimaら、 2000)。 M T8148GD株 (MT8148の gluA不活ィ匕同系変異株）を、実施例 1と同様に構築した

[0306] [表 6]

( 本実施例において使用した細菌株）

^ 血清型 M

M T 8 1 4 8 c 健常な幼児より得た口腔分離株

M T 8 1 4 8 G D k E m ' ； M T 8 1 4 8株の g I u Aに e r m を挿入不活化した株

M T 8 1 4 8 R c S m ' ；漸増濃度のストレプトマイシン

中で M T 8 1 4 8の継代培養を繰り返し作製した株

M T 8 1 4 8 R G D

c S m ^r , E m「； M T 8 1 4 8 R株の g l u A に e m r を挿入不活化した株

T W 2 9 5 k 抜歯処置後に菌血症を呈した

5 9歳の男性より得た血液分離株

T W 8 7 1 k クモ膜下出血に関連する感染性心内膜炎を発症した 4 5歳の女性より得た血液分離株

F T 1 ( N N 2 0 1 1 )

k 3歳の健常な少女よリ得た口腔分離株

S U 1 ( N N 2 0 2 9 )

k 1 0歳の健常な少女より得た口腔分離株

Y K 1 k ダウン症を発症した 6歳の少女より得た口腔分離株

Y K 1 R k S m ' ；漸增濃度のストレプトマイシン

中で Y K 1 の継代培養を繰り返し作製した株

Y T 1 k 6歳の健常な少年よリ得た口腔分離株

E m「；エリスロマイシン耐性、 S m ^r ；ストレプトマイシン耐性

(B)う蝕原性特性のインビトロ分析 S. mutansのガラスチューブに対するショ糖依存的付着性および唾液被覆ヒドロキシアパタイト（SHA)に対するショ糖非依存的付着性を、以前に記載した（Ooshimaら、 2001 ;Nakanoら、 2002)ように分析した。菌体疎水性およびデキストラン結合活性をまた、以前に記載した（Fujiwaraら、 2001 ;Nakanoら、 2002)ように分析した。

[0308] 種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析 (ANOVA)によって評価した（表 7)。

[0309] 表 7は、う蝕原性のインビトロ分析より得た生物学的特性を示す。 MT8148GDは、ガラス表面に対するショ糖依存的付着性、 SHAに対するショ糖非依存的吸着率、デキストラン結合能、 CA— CTF活性および CF— CTF活性にっ、て有意に低、値を示した（Pく 0. 001)。し力し、 FT1と FT1GDとの間ではこれらの特性に関して有意差はなかった。

[0310] [表 7]

( 血清型 k株の生物学的特性）ショ糖依存的ショ糖非依存的デキストラン C A - G T F C F — G T F 株付着 [平均土付着 [平均土結合能活性 [平均土 S D 活性 [平均 ± S D s D ( % ) ] S D ( % ) ] [平均 ± S D ] n U / m L ) ] (- U / 'm L )]

MT8148 (c) 91 ■ 5±0. 5 100. 0±2. 1 0 .15±0. 03 73. 0±3. 9 95. 0±2. 8

MT8148GD (k) 70 ■ 5±3. 8^a 88. 6±1. 7" 0 ■ 02±0. 01⁸ 29. 4±0. 8^a 59. 8±0. 9^a

T 295 (k) 70 .4±3. 1 ^a 77. 9±2. 0° 0 • 03±O. 01 » 34. 9±1. 6" 25. 1 ±0. 3^a

TW871 (k) 75 ■ 1 ±0. 9^B 56. 0±3. 8^a 0 .09±0. 04³ 61. 2±1. 5^a 56. 0±2. 3^a

FT1 (k) 83 ■ 1 ±2. 1 ^a 89. 6±0. 3^a 0 .05±0. 00·- 38. 6±0. 3° 35. 7±0- 7^a

FT1GD (k) 81 ■ 8±0. 4^e 89. 8±0. 2 = 0 .05±0. 01 " 41. 2±1. 2^a 38. 0±1. 1 ^a

SU1 (k) 85 • 4±0. 9^a 105. 9±4. 1 0 .07±0. 02° 48. 3±3. 7^a 33. 0±0. 2^a

YK1 (k) 82 .7±1- 2^a 95. 0±3. 4 0 .03±0. 00 = 47. 4±2. 5 = 38. 4±0. 6^a

YT1 (k) 80, .8±1. 4^a 87. 7±9. 7^a 0 .02±0. 01 ^a 28. 9土に 1" 30. 4±0. 4 = フィッシャーの P L S D分析によると、 M T 8 1 4 8 と他の株との間に有意差がある（ ^a P < 0 . 0 0 1 )。

[0311] (C) GTFの発現

発現したタンパク質の量を評価するために、本発明者らの以前の研究において作製した抗菌体結合型 (CA) GTF抗血清および抗菌体遊離型 (CF) GTF抗血清を用いて、 GTFのィムノブロットを行った。試験生物を、 37°Cにて Brain Heart Infosion (BHI)フ'、ロス（Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)中で、 550nmでの吸光度 1. 0 まで増殖させた。この菌体および上清 (硫酸アンモニゥム沈殿によって濃縮した）を、 SDSゲルローデイング緩衝液中に溶解した。等量の各タンパク質を、 7%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、次いで、ポリビ-リデンジフルオリド膜（ Immobilon; Millipore, Bedford, MA, USA)上に転写した。この転写したタンパク質バンドを、 CA— GTFまたは CF— GTFに対するゥサギ抗体と反応させ、次いで、アル力リホスファターゼ複合体化抗ゥサギ免疫グロブリン G抗体（New England Biolabs, Beverly, MA, USA)および 5—ブロモー 4 クロロー 3—インドリルホスフェート -トロブルーテトラゾリゥム基質（Moss Inc. , Pasadena, MD, USA)を使用して可視化した。さらに、各株における GTFBに対する発現強度 ZGTFCに対する発現強度の比を、 NI H imageソフトウェ (National Technical Information Service, bpringfield, VA, UbA )を使用する反応バンドの相対的デンシトメトリー分析によって評価した。

[0312] GTFB、 GTFC、および GTFDが試験した株の全てにおいて発現することを見出した。し力し、 GTFBの強度は、 MT8148において他のいずれの株においてよりも有意に強力つた。 GTFB発現強度 ZGTFC発現強度の比は、 1. 80±0. 15であった。この値は、 MT8148GDの値（0. 80±0. 11)および血清型 kのほかの血液分離株および口腔分離株の値（0. 17-0. 81の範囲の値）より有意に高かった（P< 0. 00 D o対照的に、試験した全ての株の中で GTFD発現強度において有意差はなかつた。

[0313] (D) CA— GTF活性および CF— CTF活性の測定

CA— GTF活性および CF— CTF活性を、以前に記載された方法（Matsumotoら、 2003)を用いて [¹⁴C]ショ糖からの [¹⁴C]グルカン合成によって評価した。 GTF活性 1単位を、 1 molのグルコース残基が 1分間にショ糖力ダルカンへ組み込まれるために必要な酵素量として規定した。 [0314] 血清型 kの血液分離株 TW295および TW871、ならびに 3つの口腔分離株 SU1、 YKlおよび YTlの各々は、 MT8148より有意に低いショ糖依存的付着率、デキストラン結合能、 CA— CTF活性、および CF— CTF活性を示した（P< 0. 001)。 SHAに対するショ糖非依存的吸着率と同様に、試験した血清型 k株 (SU1株および YK1株を除く）の値は、 MT8148の値よりも有意に低かった（P< 0. 001)。さらに、 MT814 8と試験した他の株との間では菌体疎水性において有意差はな力つた。

[0315] (E)ラットにおけるう蝕誘発実験

以前に記載された方法 (Nakanoら、 2002)に従って、 36匹の特異的病原体のない（ SPF) Sprague—Dawleyラット（Charles River Inc. , Osaka, Japan) (1群あたり 12匹）において、う蝕誘発活性を試験した。試験した 3株（MT8148R、 MT8148RGDおよび YK1R)を、 1 X 10⁹CFUずつ 5日間毎日 18— 22日齢のラットに経口的に感染させた後、各ラットについてプラークおよびう蝕のスコアを、 72日齢の時点で評価した

[0316] 種々の因子について群の間での差異を、要因モデルについての統計学的分散分析 (ANOVA)によって評価した。

[0317] ラットにおいて、血清型 kは、明らかなう蝕を誘発した。しかし、 MT8148R株とその変異株 MT8148RGDと口腔分離株 YK1Rとの間でう蝕スコアまたはプラーク指数にお、て有意差はな力つた（表 8)。

[0318] [表 8]

T/JP2004/019631

(F)考察

本実施例にお!、て、 gluA遺伝子 (グルコース側鎖ドナーにおける直前の前駆体である UDP— D—グルコースの生産を触媒する酵素をコードする）の挿入不活ィ匕によつて構築した MT8148GDの生物学的特性を、親株である MT8148の生物学的特性と比較した。 UDP— D—グルコースは、低 pH環境条件における S. mutansの生存度に重要であることが報告されているので、本発明者らは、 gluA遺伝子自体がう蝕原性に関連する特性の変更を引き起こし得るということを予想した。従って、本発明者らは、 gluA遺伝子を挿入不活ィ匕した、血清型 k株 FT1のさらなる変異株 (FT1GD)を構築した。本発明者らの結果は、 FT1と FT1GDとの間で生物学的特性に有意差がな力つたことを示した（表 7)。このことは、 gluA遺伝子自体の不活化が、このインビトロアツセィで測定した特性に関連しないことを示す。従って、本発明者らは、血清型特異的多糖のグルコース側鎖の存在が、より高いショ糖依存的付着、ショ糖非依存的付着、デキストラン結合能、ならびに CA— CTF活性および CF— CTF活性に重要であると結論付けた。

[0320] CA— CTF活性および CF— CTF活性の低減は、血清型 kの臨床分離株において突出していた (表 7)。さらに、血清型 kの臨床分離株における CA— CTF活性および CF— CTF活性は、 30個の S. mutans分離株（16株の血清型 c、 8株の血清型 e、および 6株の血清型 f)における CA— CTF活性および CF— CTF活性より有意に低かった。インビト口での付着能に必要とされる最適な GTFBZGTFCZGTFDの比率を、本発明者らの以前の研究において決定した（Ooshimaら、 2001)。この比率からの隔たりは、菌体の付着能やプラークバイオフィルムの構造に影響を与える（Idoneら、 2003)。本研究におけるウェスタンブロット分析は、 GTFBの発現力 MY8148より血清型 k 株にぉ、てより低、傾向があることを示した（図 19Α· B)。

[0321] なお、図 19Aでは、全菌体 (A)を、 7% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によつて分離し、 PVDF膜上に転写したタンパク質バンドを、 S. mutansの CA— GTFに対するゥサギ抗体と反応させた。図 19Bでは、硫酸アンモニゥム沈殿によって濃縮された培養上清を、 7% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、 PVDF膜上に転写したタンパク質バンドを、 CF— GTFに対するゥサギ抗体と反応させた。各レーンについて説明すると、レーン 1が MT8148株であり、レーン 2が MT8148GD株であり、レーン 3が TW295株であり、レーン 4が TW871株であり、レーン 5が FT1株であり、レーン 6が FT1GD株であり、レーン 7が SU1株であり、レーン 8が YK1株であり、レーン 9が YT1株である。 [0322] GTFBは、不溶性グルカン合成の大部分を担うと考えられ、ミュータンス連鎖球菌の歯面への付着および歯垢の蓄積にぉ、て、重要な毒性因子であると考えられてヽる（Mattos-Granerら、 2000)。従って、血清型 k株のより低い CA— CTF活性は、 GTF Bのより低い発現に起因し得る。一方で、菌体表層でのその発現は、血清型特異的多糖のグルコース側鎖の存在と相関し得る。総じて、これらの結果は、 S. mutansの他の主要な表面構造（例えば、 GTF、 PAおよび Gbp)より程度が低いが、 S. mutansの血清型特異的多糖におけるグルコース側鎖の欠失が S. mutansのう蝕原性と関連し得ることと結論付けられる。

[0323] 尚、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する特許請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。産業上の利用の可能性

[0324] これまで、感染性心内膜炎の発症に関与する S. mutans株については、他の S. mutans株と判別することは容易ではな力つた。し力しながら、本発明では、感染性心内膜炎の感染に関与する可能性の高い S. mutans株を、新規な血清型 k型として容易に確認することができるので、本発明は、歯科医療分野等の医療現場だけでなぐ医薬品産業や検査産業等に広く利用することができる。

[0325] 本発明によって、死に至る可能性がある感染性心内膜炎の発症を予防する観点から重要であると考えられている S. mutansの血清型不定株が被験体中に存在するか否かを有効かつ効率的に判定する方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲

[1] ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、

力もなることを特徴とするポリヌクレオチド。

[2] ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量を低下させるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、

であることを特徴とするポリヌクレオチド。

[3] 配列番号 1ないし 4の何れか 1つに示される少なくとも 12個連続する塩基配列または当該塩基配列の相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。

[4] 配列番号 8ないし 10の何れか 1つに示される塩基配列からなることを特徴とする請求の範囲第 3項に記載のオリゴヌクレオチド。

[5] 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とするポリペプチド。

[6] ストレプトコッカスミュータンス特異的な多糖抗原のグルコース側鎖量が低下していることを特徴とするストレプトコッカスミュータンス株。

[7] 請求の範囲第 1項または第 2項に記載のポリヌクレオチドを有することを特徴とする請求の範囲第 6項に記載のストレプトコッカスミュータンス株。

[8] 請求の範囲第 5項に記載のポリペプチドを発現することを特徴とする請求の範囲第

6項に記載のストレプトコッカスミュータンス株。

[9] 請求の範囲第 6項ないし第 8項の何れ力 1項に記載のストレプトコッカスミュータンス株と特異的に結合することを特徴とする抗体。

[10] 被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法であって、被験体サンプルより細菌を分離する工程；

上記分離した細菌のゲノム DNAまたは総 RNAを抽出する工程；および上記ゲノム DNAまたは総 RNAをテンプレートにして、請求の範囲第 3項または第 4項に記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて PCR反応を行なう工程、を包含することを特徴とするストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法。

[11] 上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴とする請求の範囲第 10項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法。

[12] 上記プライマーが、配列番号 8に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号 9または 10に示される塩基配列力なるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第 10項または第 11項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法。

[13] 被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法であって、被験体サンプルより細菌を分離する工程；

上記分離した細菌のゲノム DNAまたは総 RNAを抽出する工程；および上記ゲノム DNAまたは総 RNAに対して、請求の範囲第 3項または第 4項に記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダィゼーシヨン反応を行なう工程

を包含することを特徴とするストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法。

[14] 上記組織サンプルが血液、唾液または歯垢より得られることを特徴とする請求の範囲第 13項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法。

[15] 上記オリゴヌクレオチドが配列番号 8な、し 10の何れかに示される塩基配列からなることを特徴とする請求の範囲第 13項または第 14項に記載のストレプトコッカスミュ一タンス株を検出する方法。

[16] 上記細菌を分離する工程が請求の範囲第 9項に記載の抗体を用いることを特徴とする請求の範囲第 10項ないし第 15項の何れか 1項に記載のストレプトコッカスミュ一タンス株を検出する方法。

[17] 被験体サンプル中のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法であって、被験体サンプルより細菌を分離する工程；

上記抗体と結合した細菌を検出する工程、

[18] 請求の範囲第 10項ないし第 17項の何れ力 1項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とする被験体中のストレプトコッカスミュ一タンス株の血清型を判定する方法。

[19] 請求の範囲第 10項ないし第 17項の何れ力 1項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出する方法を用いることを特徴とするストレプトコッカスミュータンス株のスクリーニング方法。

[20] 請求の範囲第 19項に記載のスクリーニング方法によって取得されることを特徴とするストレプトコッカスミュータンス株。

[21] 請求の範囲第 3項または第 4項に記載のオリゴヌクレオチドを備えることを特徴とするストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキット。

[22] 上記オリゴヌクレオチドが配列番号 9に示される塩基配列力なるオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第 21項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキット。

[23] 配列番号 8に示される塩基配列力なるオリゴヌクレオチドをさらに備えることを特徴とする請求の範囲第 22項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキット。

[24] 配列番号 10に示される塩基配列力なるオリゴヌクレオチドをさらに備えることを特徴とする請求の範囲第 23項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキット。

[25] PCR反応またはハイブリダィゼーシヨン反応に用いることを特徴とする請求の範囲第 21項ないし第 24項の何れか 1項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキット。

[26] 請求の範囲第 9項に記載の抗体を備えることを特徴とするストレプトコッカスミュータンス株を検出するためのキット。

[27] 請求の範囲第 9項に記載の抗体を製造する方法であって、緩衝液に懸濁した請求の範囲第 6項ないし第 8項の何れか 1項に記載のストレプトコッカスミュータンス株を

5日間連続でゥサギ耳介静脈に注射する工程を包含することを特徴とする抗体を製造する方法。

[28] 上記工程の後に 1週間間隔をあけ、さらなる 2週間において 1週間に 5日間ずつリン酸緩衝ィ匕生理食塩水に懸濁した上記ストレプトコッカスミュータンス株を反復注射する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲第 27項に記載の抗体を製造する方法。

[29] 配列番号 1ないし 4に示される塩基配列の少なくとも 12個連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする細菌検出器具。

[30] 上記オリゴヌクレオチドが、請求の範囲第 3項または第 4項に記載のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求の範囲第 29項に記載の細菌検出器具。

1/18

図 1

差替え用紙（規則 26) [図 2]

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[図 6]

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[図 7]

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[図 12]

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