RU2618459C1 - Способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом - Google Patents
Способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2618459C1 RU2618459C1 RU2016127948A RU2016127948A RU2618459C1 RU 2618459 C1 RU2618459 C1 RU 2618459C1 RU 2016127948 A RU2016127948 A RU 2016127948A RU 2016127948 A RU2016127948 A RU 2016127948A RU 2618459 C1 RU2618459 C1 RU 2618459C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- risk
- gene
- nat2
- genetic predisposition
- gstp1
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
- C12Q2565/125—Electrophoretic separation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/32—Cardiovascular disorders
- G01N2800/327—Endocarditis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
- G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
-
- G—PHYSICS
- G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
- G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
- G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
- G16C20/70—Machine learning, data mining or chemometrics
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом (ИЭ) и высокого риска развития ИЭ. У русских пациентов группы риска осуществляют забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение аллель-специфической полимеразной цепной реакции и определение полиморфных локусов Lys268Arg гена NAT2 и Ile105Val гена GSTP1. У носителей сочетания генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ile105Val выявляют генетическую предрасположенность и 11,3-кратный риск развития ИЭ. Изобретение обеспечивает установление генетической предрасположенности к ИЭ у пациентов из группы риска, что способствует эффективному определению комплекса профилактических и лечебных мероприятий. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и хирургии, и может быть использовано для определения генетической предрасположенности и повышенного риска развития инфекционного эндокардита (ИЭ) у пациентов из группы риска.
ИЭ - одно из самых тяжелых заболеваний сердечно-сосудистой системы с летальным исходом в 20-30% случаев. В группу повышенного риска входят лица с ревматическими пороками сердца, дегенеративными изменениями клапанов, ПМК, искусственными клапанами, врожденными и приобретенными пороками сердца, после операций на сердце, а также употребляющие наркотики внутривенно. Однако участились случаи возникновения ИЭ при отсутствии известных факторов риска у детей, ослабленных пожилых пациентов и людей, имеющих хронические очаги инфекции. Рост заболеваемости ИЭ в последние годы, сложность своевременной диагностики и его лечения обусловливает поиск дополнительных факторов, предрасполагающих к его развитию. К таковым можно было бы отнести маркеры, определяющие генетическую предрасположенность к заболеванию и наследственный риск его развития, - однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП; single nucleotide polymorphism, SNP) генов. Исследования ОНП, связанных с патогенезом ИЭ, проводимые в последнее десятилетие, немногочисленны и неоднозначны, посвящены, в основном, выявлению ассоциаций ИЭ с вариантами генов системы врожденного иммунитета. Тем не менее, несомненных ассоциаций с ИЭ некоторых вариантов генов толл-подобных рецепторов и интерлейкинов - TLR4, IL10, IL1β, IL6, TNF, не обнаружено [Weinstock М., Grimm I., Dreier J., Knabbe С., Vollmer Т. Genetic Variants in Genes of the Inflammatory Response in Association with Infective Endocarditis. PLoS One. 2014; 9 (10): e110151. Published online Oct 9, 2014].
Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения высокого риска развития ИЭ у носителей варианта Q полиморфизма R753Q (rs 5743708) в гене толл-подобного рецептора 2 (TLR2) (Bustamante J., Tamayo Е., Florez S., Telleria J.J., Bustamante E., Lopez J., San Roman J.A., Alvarez F.J. Toll-Like Receptor 2 R753Q Polymorphisms Are Associated With an Increased Risk of Infective Endocarditis. Rev. Esp. Cardiol. 2011; 64 (11): 1056-9). Способ заключается в выделении геномной ДНК из образцов крови, взятой в пробирки с антикоагулянтом - этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭД-ТА), определении полиморфизма R753Q в гене TLR2 с помощью полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа полученных ПЦР-продуктов. Авторами было обследовано 65 больных инфекционным эндокардитом в сравнении с 66 практически здоровыми индивидами. При статистическом анализе результатов генотипирования найдена значительная ассоциация с ИЭ полиморфизма R753Q гена TLR2 и установлен повышенный риск (в 3-13 раз) развития ИЭ у носителей аллеля Q.
Однако заявленная Bustamante J. и соавт. связь полиморфизма R753Q в гене TLR2 с ИЭ не была подтверждена в более поздних исследованиях [Понасенко А.В., Кутихин А.Г., Хуторная М.В., Южалин А.Е., Рутковская Н.В., Головкин А.С., Барбараш Л.С. Связь полиморфизмов генов системы TLR с риском развития инфекционного эндокардита. Медицина в Кузбассе. 2015, XIV(4): 4-10].
Задачей настоящего изобретения явилась разработка нового способа определения генетической предрасположенности и повышенного риска развития инфекционного эндокардита (ИЭ) на основании выявления ассоциации ИЭ с однонуклеотидными полиморфизмами других генов.
Поставленная задача была достигнута забором образцов венозной крови, выделением геномной ДНК, проведением аллель-специфической полимеразной цепной реакции, определением однонуклеотидного полиморфизма Lys268Arg гена ариламин N-ацетилтрансферазы NAT2 (rs1208, нуклеотидная замена 803A>G) и однонуклеотидного полиморфизма Ile105Val гена глутатион-S-трансферазы Пи1 GSTP1 (rs1695, нуклеотидная замена 313A>G) при генотипировании русских пациентов группы риска и у носителей сочетания генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ile105Val выявлением генетической предрасположенности и 11,3-кратного риска развития инфекционного эндокардита. В группу риска входят пациенты с врожденными и приобретенными пороками сердца, протезированными клапанами сердца, пролапсом митрального клапана сердца (МК) 2-3 степени с систолическим шумом, атеросклеротической деформацией МК и аортального клапана сердца (АК), а также принимающие наркотики внутривенно.
Новизна изобретения
1. Генотипирование по полиморфным локусам Lys268Arg гена NAT2 и Ile105Val гена GSTP1 русских пациентов группы риска позволяет определить генетическую предрасположенность и прогнозировать 11,3-кратный риск развития ИЭ у носителей сочетания генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 I105V.
2. В группу риска входят пациенты с врожденными и приобретенными пороками сердца, протезированными клапанами сердца, пролапсом МК 2-3 степени с систолическим шумом, атеросклеротической деформацией МК и АК, а также принимающие наркотики внутривенно.
В патентной и научной литературе отсутствуют сведения об аналогичном способе определения генетической предрасположенности к заболеванию ИЭ.
Совокупность существенных признаков изобретения позволила получить новый технический результат, заключающийся в установлении генетической предрасположенности к ИЭ у пациентов из группы риска, что поможет определить тактику ведения пациентов и индивидуализировать комплекс профилактических и лечебных мероприятий.
Ген NAT2 кодирует N-ацетилтрансферазу 2, один из ферментов второй фазы системы детоксикации, осуществляющий N-ацетилирование (дезактивацию) ароматических и О-ацетилирование (активацию) гетероциклических аминов, к которым относятся многие канцерогены и лекарственные препараты. Известно более 65 вариантов (гаплотипов) гена NAT2, отличающихся одним или более ОНП в 870-bp кодирующей области NAT2. Большинство гаплотипов NAT2 представляют собой один или сочетание семи наиболее часто встречающихся ОНП в кодирующей области гена. Гаплотипы NAT2 связаны со слабой («медленной») или сильной («быстрой») ацетилирующей способностью (фенотипом), которая модифицирует чувствительность фермента ариламин N-ацетилтрансферазы к субстратам и может повышать риск развития некоторых видов рака (Hein D.W, Doll М.А, Fretland A.J. et al. Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2000; 9: 29-42; Agundez J.A. Polymorphisms of human N-acetyltransferases and cancer risk. Curr Drug Metab. 2008; 9:520-31). Гаплотипы делят носителей на фенотипы быстрого и медленного ацетилирования. Показано, что частота и/или степень тяжести лекарственного и ксенобитического токсикоза в человеческих популяциях зависит от статуса ацетилирования (Jiang W., Feng Y., Hein D.W. Higher DNA adduct levels in urinary bladder and prostate of slow acetylator inbred rats administered 3,2'-dimethyl-4-aminobiphenyl. Toxicol Appl Pharmacol 1999; 156: 187-94; Feng Y., Fretland A.J., Rustan T.D., Jiang W., Becker W.K., Hein D.W. Higher frequency of abberant crypt foci in rapid than slow acetylator inbred rats administered the colon carcinogen 3,2'-dimethyl-4-aminobiphenyl. Toxicol Appl Pharmacol. 1997; 147: 56-62).
Носительство двух мутантных («медленных») аллелей гена NAT2 приводит к фенотипу медленного ацетилятора, т.е. продуцируется фермент с пониженной активностью, вследствие чего повышается чувствительность организма к воздействию ароматических аминов, усиливается риск развития онкологических заболеваний, вызываемых воздействием ароматических аминов, особенно рака мочевого пузыря [An Y., Li Н., Wang K.J., Liu Х.Н.„ Qiu М.Х., Liao Y., Huang J.L., Wang X.S. Meta-analysis of the relationship between slow acetylation of N-acetyl transferase 2 and the risk of bladder cancer. Genet Mol Res. 2015 Dec 14; 14(4): 16896-904].
Присутствие в генотипе хотя бы одного аллеля дикого («быстрого») типа приводит к фенотипу быстрого ацетилятора при аутосомно-доминантном типе наследования, т.е. продуцируется фермент с повышенной активностью, из-за чего усиливается чувствительность к воздействию гетероциклических аминов, повышается риск колоректального рака, особенно при употреблении в пищу жареного мяса [Lang N.P., Butler М.А., Massengell J., Lawson М., Stotts R.С., Hauer-Jensen M., Kadlubar F. F. Rapid metabolic phenotypes for acetyltransferase and cytochrome P4501A2 and putative exposure to food-borne heterocyclic amines increases the risk for colorectal cancer or polyps. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 1994; 3: 675-82,; Roberts-Thomson I. C., Ryan P., Khoo K.K., Hart W.J., McMichael A.J., Butler R.N. Diet, acetylator phenotype, and risk of colorectal neoplasia. Lancet. 1996; 347: 1372-4].
Мутантный вариант первого тестируемого нами полиморфизма rs1208 (общее название Lys268Arg) приводит к несинонимичной замене аминокислот Lysine (AAA)→Arginine (AGA) в кодоне 268. Rs1208 присутствует во множестве гаплотипов NAT2*, формирующих различные фенотипы в зависимости от ассоциации с другими ОНП в гене NAT2. Rs1208 может приводить к формированию фенотипа «медленного» ацетилятора при его сочетании с другими «медленными» функциональными вариантами. NAT2*12 гаплотипы, в составе которых всегда находится rs1208, ассоциируются со статусом быстрого ацетилятора.
Глутатион-S-трансферазы (GST) - семейство мультифункциональных антиоксидантных ферментов фазы II системы детоксикации ксенобиотиков, одной из наиболее известных функций которых является катализ конъюгации глутатиона с различными субстратами, в том числе мутагенами и канцерогенами и их электрофильными метаболитами, генерируемыми в процессах окисления фазы I детоксикации. GST могут играть важную роль в детоксикации электрофильных α- и β-ненасыщенных карбонильных соединений, продуцируемых в реакциях окисления липидов, при воздействии ионизирующей радиации и при метаболизме лекарств [Berhane K., Widersten М., Engstrom А. et al. Detoxication of base propenals and other α,β-unsaturated aldehydeproducts of radical reactions and lipid peroxidation by human glutathione transferases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994; 91: 1480-4]. Фермент GSTP1 экспрессируется во многих нормальных и малигнизированных тканях. Кодирующий его ген GSTP1 выделен и охарактеризован [Lo H.-W. and Ali-Osman F. Genomic Cloning of hGSTP1*C, an Allelic Human Pi Class Glutathione S-Transferase Gene Variant and Functional Characterization of Its Retinoic Acid Response Elements. J. Biol. Chem. 1997; 272(52): 32743-9]. У человека он локализуется в хромосомном локусе 11q13, состоит из 7 экзонов и 6 интронов, содержащих 3116 п.н., и может иметь несколько нуклеотидных транзиций. Несинонимичный полиморфизм 313A>G (Ile105Val в экзоне 5), а именно транзиция нуклеотидов, изменяющая кодон 105 с Ile на Val, приводит к изменениям в связывающем электрофильные соединения сайте фермента и ослаблению его активности, что определяет повышенную чувствительность индивида к множеству заболеваний, в том числе к астме, различным формам рака.
Способ осуществляется следующим образом.
Геномную ДНК выделяют из клеток периферической крови с помощью коммерческих реагентов «ДНК-экспресс-кровь-плюс» или «ДНК-экспресс-кровь» (НПФ «Литех», Москва). Для генотипирования используют коммерческие комплекты реагентов для выявления мутаций (полиморфизмов) в геноме человека - «SNP-экспресс» (НПФ Литех, Москва). Генотипирование проводят по полиморфным локусам Lys268Arg гена NAT2 (Мутация-3 NAT2) [НПФ Литех, Москва] и Ile105Val гена GSTP1 (мутация 1 Пи-глутатион-S-трансферазы) [НПФ Литех, Москва] с помощью метода аллель-специфической полимеразной реакции. Согласно инструкции к комплектам, с образцом выделенной ДНК осуществляют одновременно две реакции амплификации - с двумя парами аллель-специфичных праймеров, на параллельное выявление аллелей мутантного и нормального типа. Реакционная смесь для ПЦР состоит из 5 мкл исследуемого образца ДНК и 20 мкл рабочей амплификационной смеси, содержащей 0,2 мкл рабочего раствора Taq полимеразы. Амплификацию проводят в автоматическом термоциклере Терцик («ДНК-Технология», Москва). Программа амплификации, соответственно инструкции, включает следующий температурный режим - 1 цикл при 93°C в течение 1 мин, 35 циклов с этапами денатурации ДНК в течение 10 с при 93°C, отжига праймеров в течение 10 с при 64°C и синтеза цепей в течение 20 с при 72°C и 1 цикл при 72°C в течение 1 мин. Анализ ПЦР-продуктов проводят после их электрофоретического разделения в 50 мл 3%-агарозного геля на 50×ТАЕ-буфере, в который до застывания вносят 5 мкл 1% раствора бромистого этидия. В каждом геле вырезают два ряда лунок - для детекции аллеля нормального типа и мутантного аллеля. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся полос. Гели анализируют в УФ-трансиллюминаторе ЕСХ-15М (Vilber Lourmat, Франция) с помощью гельдокументирующей видеосистемы GL-2 (Россия) и/или фотографируют при помощи цифрового фотоаппарата Canon PowerShot А590 IS в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 310 нм.
Изобретение иллюстрируется фотографиями Фиг. 1 и Фиг. 2.
На Фиг. 1 представлены результаты проведения генотипирования 19 человек с диагнозом инфекционного эндокардита по полиморфизму Lys268Arg гена NAT2 в виде электрофореграммы, на которой показаны продукты амплификации исследуемого локуса в виде светящихся полос. K- - отрицательный контроль; дорожки 1,8,9,13 - гомозиготный нормальный генотип Lys268Lys, дорожки 2, 4, 6, 7, 11, 14, 15, 19 - гомозиготный мутантный генотип Arg268Arg, дорожки 3, 5, 10, 12, 16 - гетерозиготный генотип Lys268Arg.
На Фиг. 2 представлены результаты проведения генотипирования 8 пациентов с диагнозом инфекционного эндокардита по полиморфизму Ile105Val гена GSTP1 в виде электрофореграммы, на которой показаны продукты амплификации исследуемого локуса в виде светящихся полос. K- - отрицательный контроль; дорожки 1-4, 6-8 - гетерозиготный генотип Ile105Val, дорожка 5 - гомозиготный генотип Ile105Ile.
Всего обследовано 48 пациентов (16 женщин и 32 мужчины) в возрасте от 19 до 76 лет, находившихся на стационарном лечении в терапевтических клиниках г. Новокузнецка с диагнозом инфекционного эндокардита, выставленным на основании критериев DUKE. Более половины из них принимали наркотики внутривенно (27 человек), 5 человек в этой группе страдали хронической болезнью почек с необходимостью проведения гемодиализа, у большинства из них обнаружено поражение трикуспидального клапана сердца (ТК). У 10 человек обнаружен ревматический порок митрального и аортального клапанов сердца (МК, АК), у пяти из них проведено их протезирование. Врожденные пороки сердца выявлены у 4-х пациентов, пролапс митрального клапана 2-3 степени с систолическим шумом - у 2-х человек, у 3-х пациентов обнаружены атеросклеротические изменения МК и АК, у 2-х больных ИЭ с поражением ТК развился на фоне тяжелой вирусной инфекции. У всех пациентов неоднократно проводилось исследование крови на стерильность. У 18 больных выявлены золотистый стафилококк Staphylococcus aureus и зеленящий стрептококк Streptococcus viridans, у 7 человек - другие возбудители (энтеробактерии, клебсиеллы, кишечная и синегнойная палочки). У остальных пациентов инфекционный агент не был обнаружен.
В группу контроля включены 56 лиц в возрасте от 27 до 74 лет (30 женщин и 26 мужчин), не имеющих признаков очаговой и системной инфекции с умеренно выраженными возрастными изменениями (у лиц старше 60 лет), не страдающих артериальной гипертензией и ишемической болезнью сердца.
Забор крови и молекулярно-генетические исследования осуществляли на основании информированного согласия обследованных лиц. Все обследованные лица проживали на территории Кемеровской области и принадлежали к русскому этносу.
Математическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакетов статистических программ InStatII, Microsoft Excel. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли стандартно при помощи программы Chi-sq Hardy-Weinberg equilibrium test calculator for biallelic markers. Достоверность различий в распределении частот аллелей и генотипов между группами больных и здоровых индивидов оценивали двусторонним точным критерием Фишера. Частота аллеля/генотипа определялась по соотношению количества его носителей к общему количеству носителей тестируемых аллелей/генотипов в исследуемой выборке. Относительный риск заболевания по конкретному признаку вычисляли как соотношение шансов (OR-odds ratio): OR=(а×d)/(b×с), где а и b - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный аллель (генотип) соответственно; с и d - количество человек в группе контроля, имеющих и не имеющих мутантный аллель (генотип) соответственно.
Результаты генотипирования по тестируемым полиморфным локусам генов NAT2 и GSTP1 всех обследуемых лиц представлены в таблице 1. Полиморфизм Lys268Arg гена NAT2 в гомозиготном и гетерозиготном вариантах встречался со сходной частотой как в группе с ИЭ, так и в группе контроля (p>0,05). Однако гомозигот по аллелю 268Arg среди пациентов с ИЭ было в 4 раза больше, чем в контроле (р=0,0081), что, видимо, обусловило небольшое отклонение частот тестируемых генотипов у больных людей от равновесия Харди-Вайнберга (χ2=4,07, р=0,0435), в то время как в группе контроля распределение генотипов не отличалось от равновесия Харди-Вайнберга (χ2=0,15, р=0,6967). Полученные результаты позволили выявить высокий достоверный риск заболевания у носителей генотипа Arg268Arg (OR=5,25, р=0,0049), аллеля 268Arg (OR=2,27, р=0,0078) и положительную корреляционную связь с ИЭ как у носителей данного генотипического варианта (r=0,3009, р=0,0032), так и у носителей аллеля 268Arg (r=0,2466, р=0,0166). Носительство аллеля 268Lys отрицательно связано с заболеванием и поэтому его можно отнести к защитным факторам в отношении ИЭ.
У 75% больных ИЭ обнаружено носительство гетерозиготного варианта полиморфизма Ile105Val гена GSTP1, а в группе контроля данный генотип встретился только у 36% обследованных. Распределение генотипов полиморфизма Ile105Val подчинялось равновесию Харди-Вайнберга в группе контроля (χ2=1,84, р=0,1749), в группе больных ИЭ - значимо отличалось (χ2=13,17, р=0,0003) вследствие существенного превалирования гетерозигот. И расчет показал достоверно высокий риск заболевания (OR=5,4, р<0,0001) и положительную корреляционную связь с ИЭ (r=0,3929, р<0,0001) у гетерозигот по данному полиморфизму. Соответственно, гомозиготный генотип GSTP1 Ile105Ile оказался протективным вариантом (OR=0,23, р=0,001).
Сочетание генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ile105Val встречалось у 23% больных ИЭ, а в группе контроля только у 3% лиц, и у носителей такого сочетания риск заболевания оказался максимальным (OR=11,3, р=0,0099) в данном исследовании.
Таким образом, выявлена ассоциация однонуклеотидных полиморфизмов Lys268Arg гена NAT2 и Ile105Val гена GSTP1 с ИЭ, проявляющаяся в положительной корреляционной связи с заболеванием и 11,3-кратном риске его развития при носительстве сочетания генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ile105Val у русских пациентов с врожденными и приобретенными пороками сердца, протезированными клапанами сердца, пролапсом МК 2-3 степени с систолическим шумом, атеросклеротической деформацией МК и АК, а также принимающих наркотики внутривенно.
Клинический пример №1. Пациент Р., 36 лет, русский, поступил 12.12.2014 г. в отделение терапии МБЛПУ ГКБ №2 с жалобами на слабость, потливость, одышку при обычной физической нагрузке, боль в грудной клетке, усиливающуюся при глубоком вдохе, кашле, трудноотделяемую гнойную мокроту, повышение температуры тела до 39-40°C, ознобы, боли в мышцах, в суставах. Болен в течение 2 недель, лечился самостоятельно безрезультатно жаропонижающими препаратами, цефтриаксоном. Доставлен бригадой скорой помощи. В анамнезе: гепатит, туберкулез, ВИЧ - отрицает. Прием наркотиков в/в в течение 15 лет (ханка, соли, героин). Курит в течение 15 лет по 1 пачке в сутки. Простудные заболевания 3-4 раза в год. Постоянной работы нет. При осмотре состояние средней степени тяжести, температура тела 38°C, кожа сухая, бледная, отеков нет, пониженного питания. В легких дыхание везикулярное, рассеянные сухие хрипы над всей легочной поверхностью, ЧД 22 в мин. Тоны сердца глухие ритмичные, ЧСС 110 в мин, систолический шум во всех точках, АД 120/80 мм рт. ст. Живот мягкий, безболезненный. Стул, диурез в норме. При обследовании: AT к ВИЧ, ВГВ, трепонеме - не выявлены. Обнаружены AT к ВГС. Общий анализ крови - Нв 112 г/л, эр. 3,5, лейк. 8,4, п/я 20, лимф. - 13, СОЭ 50 мм/ч. Общий анализ мочи - уд. вес 1012, белок 0,3 г/л, лейк. в большом количестве, эр. - 1-2 в п/зр, цилиндры гиалиновые 1-2 в п/зр. Анализ мочи по Нечипоренко: лейк.-201500, эр. 2500, цилиндры 3000. Б/х ан. крови: сахар 5,7, креатинин 155 (№40-140) мкмоль/л, мочевина 8,0, АЛТ 132, ACT-66 (повышены), фибриноген 5.25, белок 78,1, билирубин 11,7. Кровь на гемокультуру №3 - отрицательно. УЗИ - спленомегалия, печень + 1,5 см из-под края реберной дуги, размеры в норме. Диффузные изменения в паренхиме почек. ЭХО КГ - умеренно расширены правые полости, на ТК гипоэхогенный очаг вегетаций 13×5 мм, регургитация 2-3 ст, незначительный перикардиальный выпот, признаков легочной гипертензии не выявлено, ФВ 67%. ЭКГ - синусовая тахикардия 117 в мин. Рентгенография органов грудной клетки - двусторонняя септическая пневмония с распадом. Результаты генотипирования по полиморфным локусам Lys268Arg гена NAT2 и Ile105Val гена GSTP1: выявлено сочетание генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ilel05Val, указывающее на 11,3-кратный риск заболевания ИЭ.
Дз: Острый инфекционный эндокардит с поражением трехстворчатого клапана, первичный. Недостаточность ТК. ХСН 1-2а ст. Двусторонняя септическая пневмония, с распадом, тяжелое, затяжное течение. Наркомания. Хр. вирусный гепатит С.
Проведено лечение: цефуроксим, ванкомицин, фраксипарин, гентамицин. Выписан с улучшением на дальнейшее амбулаторное лечение.
Клинический пример №2. Больная М., 26 лет, русская. Госпитализирована в отделение пульмонологии МБЛПУ ГКБ №1 г. Новокузнецка с жалобами на сухой кашель, одышку при незначительной физической нагрузке, озноб, повышение температуры тела до 39°C, потливость по ночам, кашель с небольшим количеством гнойной мокроты. Больна в течение 2-3 недель, накануне перенесла ОРВИ, не обращалась за медицинской помощью, лечение симптоматическое, повышение температуры тела - в дебют заболевания в течение 3-4 дней. На фоне лечения - улучшение состояния, катаральные явления купированы, температура вернулась к норме. Сохранялась выраженная слабость, одышка при умеренной физической нагрузке. В течение последних 2 недель появились ознобы, вновь отмечалось повышение температуры до 39°C без эффекта от жаропонижающих препаратов, нарастала слабость, появился кашель, потливость по ночам. Доставлена бригадой скорой помощи в санпропускник МБЛПУ ГКБ №1. В анамнезе нередкие простудные заболевания до 4-6 раз в год, частое использование антибактериальных препаратов без назначения врача. В 2009 г. выявлен порок сердца, документов с результатами обследования нет, не наблюдалась. Прием наркотиков отрицает. Работа связана с переохлаждением (работала на хладокомбинате фасовщицей). Питание однообразное, мясо, фрукты - редко. Объективно: состояние средней степени тяжести за счет интоксикационного синдрома, температура тела - 38,5°C. Носовое дыхание не затруднено. Кожа бледная, влажная, чистая, отеков нет. В легких дыхание жесткое, ослаблено в подлопаточной области справа, хрипов нет, ЧД 18 в минуту, тоны сердца глухие, ритмичные ЧСС 110 в минуту, аускультативно - грубый систолический шум во всех точках. При обследовании: общий анализ крови - Нв 91 г/л, эр. 3,4, л. 15,0, п/я. 14, лимф. 10,5, юные - 1, тромбоциты - 415, СОЭ 52 мм/ч. Общий анализ мочи - уд. вес 1005, белок 2,5 гр/л, эр. 40-50 в п/зр., л. - 2-6 в п/зр. Б/х ан. крови: АЛТ 2,26, ACT - 3,0, мочевина 10,2, креатинин 106, белок 59,6, сахар 5,0, прокальцитонин 6,1, СРБ 460.3 мг/л. Д-димер 2350, AT к ВГВ, ВГС, ВИЧ не выявлены. ЭКГ - синусовая тахикардия, нарушение процессов реполяризации в задней стенке левого желудочка. Рентгенография органов грудной клетки - полисигментарная пневмония справа с распадом. ЭХО-КГ - признаки ревматического поражения митрального клапана, стеноз створок МК. Smo 1,62 см 2, регургитация 1-2 ст. Аортальный клапан - стеноз не выявлен, кальциноз и фиброз створок, регургитация 2 степени. Уплотнены створки трикуспидального клапана и клапана легочной артерии, регургитация ТК-2 ст. В правом предсердии по в/стенке дополнительное округлое образование, подвижное, средней эхогенности 2,7×1,75 см. Дилятация полостей обоих предсердий, больше левого, ФВ 47,8%. пародоксальное движение МЖП. По УЗИ - гепа-тоспленомегалия. Диффузное изменение паренхимы почек. В динамике - появилась свободная жидкость в брюшной полости. По результатам посева крови на стерильность выявлена Staphylococcus aureus. В последующих посевах появилась Pseudomonas stutseri. Учитывая тяжесть состояния, проводимую инфузионную, антибактериальную терапию, больной был поставлен подключичный катетер. Состояние ухудшилось: присоединился тромбоз подколенной артерии справа, рецидивировали ТЭЛА, нарастала сердечная, дыхательная недостаточность. Проведена ампутация правой нижней конечности до средней трети бедра. Результаты генотипирования по полиморфным локусам Lys268Arg гена NAT2 и Ile105Val гена GSTP1: выявлено сочетание генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ilel05Val, указывающее на 11,3-кратный риск заболевания ИЭ.
Дз: Вторичный инфекционный эндокардит. Хр. ревматическая болезнь сердца: комбинированный митральный порок с преобладанием стеноза. Недостаточность АК, ТК, ХСН 2Б. ФК III. Состояние после ампутации правой нижней конечности до ср/трети бедра по поводу острого артериального тромбоза. Полисегментарная пневмония справа с распадом. Рецидивирующие ТЭЛА.
Claims (2)
1. Способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом и высокого риска развития инфекционного эндокардита, включающий забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение аллель-специфической полимеразной цепной реакции, определение однонуклеотидного полиморфизма гена, отличающийся тем, что проводят генотипирование по полиморфным локусам Lys268Arg гена ариламин N-ацетилтрансферазы NAT2 и Ile105Val гена глутатион-S-трансферазы Пи1 GSTP1 русских пациентов группы риска и у носителей сочетания генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ile105Val выявляют генетическую предрасположенность и 11,3-кратный риск развития инфекционного эндокардита.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в группу риска входят пациенты с врожденными и приобретенными пороками сердца, протезированными клапанами сердца, пролапсом митрального клапана сердца (МК) 2-3 степени с систолическим шумом, атеросклеротической деформацией МК и аортального клапана сердца (АК), а также принимающие наркотики внутривенно.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016127948A RU2618459C1 (ru) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | Способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2016127948A RU2618459C1 (ru) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | Способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2618459C1 true RU2618459C1 (ru) | 2017-05-03 |
Family
ID=58697573
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016127948A RU2618459C1 (ru) | 2016-07-11 | 2016-07-11 | Способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2618459C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2694744C1 (ru) * | 2018-12-18 | 2019-07-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России) | Способ прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090041782A1 (en) * | 2003-12-30 | 2009-02-12 | Takashi Ooshima | Novel serotype streptococcus mutans and utilization of the same |
-
2016
- 2016-07-11 RU RU2016127948A patent/RU2618459C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090041782A1 (en) * | 2003-12-30 | 2009-02-12 | Takashi Ooshima | Novel serotype streptococcus mutans and utilization of the same |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
BUSTAMANTE J. et al. [Toll-like receptor 2 R753Q polymorphisms are associated with an increased risk of infective endocarditis]. [Article in Spanish]. Rev Esp Cardiol. 2011 Nov; 64(11): 1056-1059. Epub 2011 Jul 23 [Найдено 24.10.2016] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21783307. * |
ГНУСАЕВ С.Ф. Врожденные пороки и малые аномалии сердца у детей. Бюллетень Федерального Центра сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова. Тезисы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов" 20-22 мая 2010 г. 2010; N2. Стр.51 [Найдено 25.10.2016] [он-лайн], Найдено из Интернет: URL: http://www.almazovcentre.ru/wp-content/uploads/bulleten_02_2010_.pdf. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2694744C1 (ru) * | 2018-12-18 | 2019-07-17 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования "Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России) | Способ прогнозирования эффективности лечения тимололом первичной открытоугольной глаукомы |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Pontremoli et al. | Genetic polymorphism of the renin-angiotensin system and organ damage in essential hypertension | |
Edvardsson et al. | Clinical features and genotype of adenine phosphoribosyltransferase deficiency in Iceland | |
Mörner et al. | Amyloid heart disease mimicking hypertrophic cardiomyopathy | |
Emingil et al. | Matrix metalloproteinase (MMP)‐8 and tissue inhibitor of MMP‐1 (TIMP‐1) gene polymorphisms in generalized aggressive periodontitis: gingival crevicular fluid MMP‐8 and TIMP‐1 levels and outcome of periodontal therapy | |
Rodríguez-Pérez et al. | rs3918242 MMP9 gene polymorphism is associated with myocardial infarction in Mexican patients | |
Jiang et al. | Hyperhomocysteinemia and related genetic polymorphisms correlate with ulcerative colitis in Southeast China | |
WO2013080227A1 (en) | Genetic variants useful for risk assessment of arterial disease | |
Pan et al. | Linkage analysis with candidate genes: the Taiwan young-onset hypertension genetic study | |
Roncarati et al. | Unexpectedly low mutation rates in beta‐myosin heavy chain and cardiac myosin binding protein genes in italian patients with hypertrophic cardiomyopathy | |
Shekarriz et al. | Cystinuria and other noncalcareous calculi | |
EP2568978A2 (en) | Cancer prevention and treatment methods based on dietary polyamine content | |
Kokot et al. | Hepatic inactivation of renin in man | |
Rantala et al. | Association of IL-6 and IL-6R gene polymorphisms with susceptibility to respiratory tract infections in young Finnish men | |
Korstanje et al. | Locating Ath8, a locus for murine atherosclerosis susceptibility and testing several of its candidate genes in mice and humans | |
RU2618459C1 (ru) | Способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом | |
RU2617060C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития инфекционного эндокардита | |
Ma et al. | Correlations between LP-PLA2 gene polymorphisms and susceptibility and severity of acute pancreatitis in a Chinese population | |
US20240034799A1 (en) | Methods and systems of stratifying inflammatory disease patients | |
RU2587753C1 (ru) | Способ прогнозирования риска развития инфекционного эндокардита | |
US20070299025A1 (en) | Method for Detecting the Risk of Cardiovascular Diseases Such as Acute Myocardial Infarction and Coronary Heart Disease By Analysing Defesin | |
Ishimitsu et al. | Increased cardiovascular risk in long-term hemodialysis patients carrying deletion allele of ACE gene polymorphism | |
KR20210130168A (ko) | Il18r1을 표적화하는 염증성 질환의 치료를 위한 방법, 시스템 및 키트 | |
CN111733235A (zh) | Kdm5a基因和atrx基因的应用 | |
Crandall et al. | Bb2Bb3 regulation of murine Lyme arthritis is distinct from Ncf1 and independent of the phagocyte nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase | |
RU2677469C1 (ru) | Способ прогнозирования исхода инфекционного эндокардита |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20180712 |