Kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen enthaltend Superstrukturbildende Nukleinsaure-Sequenzen
Die vorliegende Erfindung betrifft kosmetische oder pharmazeutische Zubereitungen zur Prophylaxe und/oder Behandlung epithehalen Deckgewebes, die Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen enthalten, die Verwendung solcher Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen zur Prophylaxe und/oder Behandlung epithelialen Deckgewebes sowie Wäscheweichspüler, Handwaschmittel, Körper- und Haarpflegemittel, Haarfärbemittel oder Handgeschirrspülmittel, enthaltend solche Superstruktur-bildende Nukleinsaure- Sequenzen.
Hinweise für immunstimulatorische Wirkungen von „Fremd"-DNA gibt es bereits seit den 60er Jahren (Jensen, K. E., Neal, A. L, Owens, R. E. und Warren, J. Interferon Responses of Chick Embryo Fibroblasts to Nucleic Acids and Related Compounds Nature 200 (1963) 433 - 434). Beschrieben wurde sowohl die Induktion der Produktion von Interferon Gamma, als auch die Aktivierung von natürlichen Killerzellen sowie Induktion einer antitumoralen Aktivität durch Fraktionen des Bacillus Calmette-Guerin (BCG) (Tokunaga, T., Yamamoto, H., Shimada, S., Abe, H., Fukuda, T., Fujisawa, Y., Furutani, Y., Yano, O., Kataoka, T., Sudo, T., Makiguchi, N. und Suganuma, T. Antitumor Activity of Deoxyribonucleic Acid Fraction From Mycobacterium Bovis BCG. I. Isolation, Physicochemical Characterization and Antitumor Activity J. Natl. Cancer Res. 72 (1984) 955 - 962). Die immunstimulierende Aktivität dieser Fraktion konnte durch Vorinkubation mit DNAsen, nicht aber mit RNAsen zerstört werden. Dies legte den Schluß nahe, dass die bakterielle DNA den immunstimulierenden Anteil der BCG-Fraktion ausmacht.
Weitere Untersuchungen gaben Anlass zu der Hypothese, dass sich das für die immunstimulatorische Wirkung wichtige Motiv aus einer zentralen CpG-Gruppe zusammensetzt, die am 5'-Ende von zwei Purinen und am 3'-Ende von zwei Pyrimidinen flankiert wird (Krieg, A. M., Yi, A., Matson, S., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A., Teasdale, R., Koretzky, G. A. und Klinman, D. M. CpG Motifs in
Bacterial DNA Trigger direct B-Cell Activation Nature 374 (1995) 546 - 549). DNA- Sequenzen mit der Konsensus-Sequenz 5'-A GA GCGC/TC/T-3' werden als CpGs bezeichnet. CpG-Dinukleotide werden in eukaryontischer DNA supprimiert.
Einerseits kommen diese Motive in eukaryontischer DNA nur mit einem Fünftel der erwarteten Frequenz vor, andererseits sind sie zu 60 - 90 % methyliert (Bird, A. P. CpG-rich Islands and the Function of DNA Methylation Nature 321 (1986) 209 - 213). Im Gegensatz dazu findet man das CpG-Motiv in bakterieller DNA unmethyliert und mit der erwarteten Frequenz (1 :16). Es konnte gezeigt werden, dass die Methylierung das stimulatorische Potential des CpG-Motivs zerstört (Krieg, siehe oben). Diese Unterschiede zwischen bakterieller und eukaryontischer DNA ermöglichen es, die biologischen Beobachtungen bezüglich der immunstimulatorischen Wirkung von bakterieller DNA und synthetischen CpG-Oligodeoxynukleotiden (ODN) sinnvoll zu interpretieren.
Die Erkennung von „Fremd"-DNA und die darauf folgende immunologische Reaktion ist für das angeborene Immunsystem eine Möglichkeit zwischen „Selbst" und „Fremd" zu unterscheiden, ohne auf Vermittlung und Intervention des adaptiven Immunsystems angewiesen zu sein.
Die Effekte und der Wirkungsmechanismus der CpG-ODN wurden vor allem im murinen System untersucht. ODN wirken sowohl auf das angeborene als auch auf das adaptive Immunsystem der Maus stimulatorisch, wobei sich die Wirkungen im Bezug auf die Signalübertragung und die Sequenzspezifität unterscheiden. Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass CpG-ODN auf die unterschiedlichen Typen von Antigen präsentierenden Zellen (APZ) immunstimulatorisch wirken. Die Stimulation von gereinigten B-Lymphozyten mit unmethylierten CpG-ODN führt zur Proliferation und Sekretion von Immunglobulinen (Krieg, siehe oben). CpG-ODN induzieren in Makrophagen die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor kB (NF-kB), die Transkription von Zytokin-mRNA und die Sekretion von Zytokinen wie TNFa, IL-1 , IL-6 und IL-12 (Sparwasser, T., Miethke, T. und Lipford, G. B. Makrophages Sense Pathogens
via DNA Motifs: Induction of Tumor Necrosis Factor-Alpha- Mediated Shock Eur. J. Immunol. 27 (1997) 1671-1679).
CpG-ODN wirken sowohl auf reife als auch auf unreife dendritische Zellen aktivierend. Sie verstärken auf beiden Zellpopulationen die MHC Il-Expression und die Expression von kostimulatorischen Molekülen (CD40, CD86) und induzieren die Produktion von Zytokinen wie IL-6, IL-12 und TNFa. Um den Wirkmechanismus der CpG-ODN näher zu untersuchen, wurden Versuche mit immobilisierten CpG-ODN durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Versuche weisen daraufhin, dass eine Aufnahme der CpG-ODN in die Zelle für die immunstimulatorische Wirkung notwendig ist (Krieg, siehe oben).
Andere Versuche zeigen, dass die Aufnahme der DNA an der Zelloberfläche von Makrophagen durch jedes beliebige kompetitiv zugegebene ODN blockiert werden kann (Hacker, H., Mischak, H., Miethke, T., Liptary, S., Schmid, R., Sparwasser, T., Heeg, K., Lipford, G. B. und Wagner, H. CpG-DNA-Specific Activation of Antigen-Presenting Cells Requires Stress Kinase Activity and Is Preceded by Non-Specific Endocytosis and Endosomal Maturation EMBO Journal 17 (1998) 6230-6240), was vermuten läßt, dass die Aufnahme der ODN in die Zelle nicht sequenzspezifisch erfolgt. Dagegen könnte die CpG-Spezifität durch einen intrazellulären Rezeptor, der z.B. im Endosom lokalisiert ist, vermittelt werden.
Die Hypothese der endosomalen Lokalisation eines intrazelluären CpG-Rezeptors wird durch Ergebnisse untermauert, die zeigen, dass die endosomale Ansäuerung für den Signalweg der CpG-ODN notwendig ist, da die CpG-ODN-Wirkung durch Inhibitoren der endosomalen Ansäuerung wie z.B. Chloroquin blockiert wird (Hacker, siehe oben).
Der vollständige Wirkmechanismus und Signalweg der CpG-ODN ist jedoch größtenteils noch ungeklärt. CpG-ODN entfalten ihre Wirkung auf Makrophagen und dendritische Zellen direkt, während die CpG-ODN-Wirkung auf die B-Zellen sowohl direkt als auch im Sinne einer Kostimulation möglich ist (Krieg, siehe oben). Dagegen konnten direkte Wirkungen von CpG-ODN auf T-Zellen nicht
gezeigt werden. Jedoch werden T-Zellen, die über eine T-Zellrezeptor-Ligation ihr Signal 1 erhalten, durch CpG-ODN kostimuliert (Bendigs, S., Salzer, U., Lipford, G. B., Wagner, H. und Heeg, K. CpG-Oligodeoxynucleotides Co-Stimulate Primary T Cells in the Absence of Antigen-Presenting Cells Eur. J. Immunol. 29 (1999) 1209-1218).
Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der Mechanismus der T-Zellkostimulation ein anderer ist als der einer direkten CpG-ODN-Wirkung auf APZ. Die Untersuchungen der direkten Wirkung von ODN auf T-Zellen wurden in vitro durchgeführt. Es liegen allerdings viele in vivo-Ergebnisse vor, in denen CpG-ODN als Adjuvans verwendet wurden, und durch die Injektion von CpG-ODN in vivo eine T-Zellaktivierung induziert wurde. Die CpG-ODN unterstützen die Ausbildung einer TH1 -Immunantwort und induzieren eine starke peptidspezifische zytotoxische T-Lymphozytenaktivität (ZTL).
Im Gegensatz zum murinen System liegen für die Wirkung von ODN im humanen System nur wenige Befunde vor. Es ist bekannt, dass ODN mit CpG-Motiven in Lymphozyten aus dem peripheren Blut die Produktion von IFNa induzieren. Ferner ist gezeigt, dass durch CpG-ODN - ähnlich wie im murinen System - natürliche Killerzellen durch die Vermittlung von IL-12, das von aktivierten Makrophagen produziert wird, aktiviert werden (Ballas, Z. K., Rasmussen, W. L. und Krieg, A. M. Induction of NK Activity in Murine and Human Cells by CpG Motifs in Oligodeoxynucleotides and Bacterial DNA J. Immunol. 157 (1996) 1840 -1845). Humane periphere mononukleäre Zellen (Peripherblut monocytische Zellen = PBMZ) werden durch CpG-ODN sequenzspezifisch aktiviert.
Diese Aktivierung führt zu einer erhöhten Expression von CD86, CD40, MHC I- und MHC Il-Molekülen und zu einer Produktion der Zytokine IL-12, IL-6 und TNFa. Wie im murinen System induzieren CpG-ODN die Proliferation humaner B-Zellen (Bauer, M., Heeg, K., Wagner, H. und Lipford G. B. DNA Activates Human Immune Cells through a CpG Sequence-Dependent Manner Immunology, 97 (1999) 699 - 705). Die bisher gewonnenen Ergebnisse im humanen System weisen viele Gemeinsamkeiten mit den Ergebnissen im murinen System auf.
CpGs wird daher im Stand der Technik eine immunoprotektive und immunstimulierende Wirkung zugeschrieben und in diesem Sinne werden sie auch - momentan noch experimentell - eingesetzt.
Neben Oligonukleotiden (ODN), die CpG-Motive enthalten, konnte in jüngerer Zeit gezeigt werden, dass auch ODN, die kein CpG enthalten, eine immunstimulierende Wirkung entfalten können. Diese ODN werden in der Literatur als non-CpG bezeichnet. Die Qualität der Immunstimulation kann sich aber unterscheiden zwischen CpG und non-CpG. So konnte gezeigt werden, dass CpG eine Th1 -Antwort in Immunzellen bewirken, während non-CpG einen Th2- Phänotyp induzieren (Sano K, Shirota H, Terui T, Hattori T, Tamura G: Oligodeoxynucleotides without CpG Motifs work as adjuvant for the induction of Th2 differentiation in a sequence-independent manner. J Immunol; 170:2367- 2373, 2003). In diesem Zusammenhang konnte eine Verstärkung der Antigen- induzierten Aktivierung von T-Helfer-Zellen und eine Th2-Differenzierung naiver T- Zellen beobachtet werden. Diese Ergebnisse stimmen mit Arbeiten von McCIuskie und Davis (McCIuskie MJ, Davis HL: Oral, intrarectal and intranasal immunizations using CpG and non-CpG oligodeoxynucleotides as adjuvants. Vaccine 19(4-5): 413-422, 2000) überein, die im Mausmodell einen Th2-gerichteten immunstimulatorischen Effekt von non-CpG gefunden haben, der durch CpG wieder in Richtung einer Th1 -Antwort geshiftet werden kann.
Während bei der Wirkung der CpG TLR-9 eine wichtige Rolle zu spielen scheint und mit den CpG co-lokalisiert, ist dies bei den non-CpGs wahrscheinlich nicht der Fall (Bauer S, Kirschning CJ, Hacker H, Redecke V, Hausmann S, Akira S, Wagner H, Lipford GB: Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sei USA; 98(16): 9237- 9242, 2001 ).
Den non-CpG wurde bisher vorwiegend eine immunstimulatorische Rolle zugeschrieben. Jedoch wurden auch immunsuppressive Effekte von non-CpG gefunden. So konnte beispielsweise ein inhibitorisches Motiv (CCT-Block nahe 5'-
Ende, GGG(G)-BIock nahe 3'-Ende, Linker 3-5 Nukleotide) identifiziert werden, das die Stimulation muriner Milzzellen durch bestimmte CpG-Motive beeinträchtigt (Lenert P, Rasmussen W, Ashman RF, Ballas ZK: Structural characterization of the inhibitory DNA motif for type A (D)-CpG-induced cytokine secretion and NK- cell lytic activity in mouse spieen cells. DNA and Cell Biol, 22(10): 621-631 , 2003).
Im Mausmodell konnte gezeigt werden, dass inhibitorische PTO-ODN die Manifestation und Schwere CpG-induzierter Arthritis um bis zu 80% reduzieren (Zeuner RA, Ishii KJ, Lizak MJ, Gursel I, Yamada H, Klinman DM, Verthelyi D: Reduction of CpG-induced arthritis by suppressive oligodeoxynucleotides. Arthritis Rheumatism, 46(8): 2219-2224, 2002).
Ein suppressiver Effekt von non-CpGs auf das Immunsystem der Haut ist bisher allerdings nicht bekannt.
Bei der Suche nach besonders wirkungsvollen immunsuppressiven Nukleotidsequenzen hat die Anmelderin zunächst nach sequenzspezifischen Gemeinsamkeiten und Motiven gesucht, die immunsuppressive non-CpGs charakterisieren könnten. Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, dass nicht Sequenz- sondern strukturspezifische Funktionsprinzipien immunsuppressive non-CpGs charakterisieren, die bei topischer Anwendung auf der Haut einen immunsuppressiven Effekt ausüben.
Entzündungen des Hautorgans sind weit verbreitete Krankheiten, die sowohl endogen als auch exogen getriggert sein können. Zur Behandlung werden meist Therapeutika auf Steroidbasis topisch oder systemisch verabreicht. Diese Substanzklasse zeigt neben ihrer Wirksamkeit auch eine Reihe von unerwünschten Nebenwirkungen (z.B. Hautatrophie, Cushing Syndrom). Ein alternatives Prinzip zur Behandlung von Entzündungen der Haut ist daher wünschenswert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung zur Prophylaxe und/oder Behandlung epithelialen
Deckgewebes, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Behandlung entzündlich veränderten epithelialen Deckgewebes, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen, insbesondere G-Quadruplex-, Frayed Wire- oder i-Motiv-bildende DNA-Sequenzen enthält.
Unter Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen sind Nukleinsäuren zu verstehen, die befähigt sind, bei nicht kovalenter Bindung an andere Nukleinsäuren SuperStrukturen, insbesondere G-Quadruplexe, sogenannte „Frayed Wires" oder „i-Motive" auszubilden. Vorzugsweise umfassen erfindungsgemäß einsetzbare Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen C- , G- oder l-reiche Sequenzen mit einem Gehalt von von C, G oder I im Bereich von 25 % bis 100 %, bevorzugt 50 % bis 100 %, besonders bevorzugt 75 % bis 100 % und ganz besonders bevorzugt 100 % In ganz besonderem Maße bevorzugt sind Poly-I-Homopolymere, Poly-C-Homopolymere oder Poly-G-Homopolymere. Hierbei steht C für Cytosin, G für Guanin und I für Inosin.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kein CpG-Motiv. Somit handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Sequenzen um sogenannte non-CpG. Insbesondere ist von den erfindungsgemäßen Sequenzen kein nicht-methylierte CG-Dinukleotid, welches am 5 -Ende von zwei Purinen (Pu), 3 -seitig von zwei Pyrimidinen (Pyr) flankiert ist, umfasst. Besonders bevorzugt enthalten die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kein CG-Dinukleotid, insbesondere kein nicht-methyliert CG-Dinukleotid.
Diese erfindungsgemäß besonders geeigneten Superstruktur-bildenden non-CpG- Nukleinsäuren haben einen positiven Effekt z.B. bei der Verbesserung von Kontakthypersensibilisierungsreaktionen. Vorteilhafterweise weisen die erfindungsgemäß geeigneten non-CpG-Nukleinsäuren zusätzlich keine Stimulation der Immunzellen auf, die im Falle einer Penetration von CpG-Motiv- enthaltenden Nukleinsäuren in tiefere Hautschichten (z.B. bei vorgeschädigter Haut), zu einer Verschlechterung der Hauterkrankung führen kann.
Die in den unten aufgeführten Beispielen dargestellten Ergebnisse deuten daraufhin, dass die Wirkung von non-CpG vom Guanin-, Cytosin- bzw. Hypoxanthin-Gehalt abhängig ist. Da Random-Polymere bzw. deren Gemische ebenfalls wirksam sind, scheint die Wirkung, nicht von einer definierten Sequenz abhängig zu sein. Besonders wirksam sind C-, G- und l-reiche ODN (l-reich bedeutet Inosin-reich. Inosin ist das Hypoxanthin-haltige Nukleosid). Diese ODN sind insbesondere dazu geeignet, DNA-Superstrukturen auszubilden. Die Bildung solcher ODN-Superstrukturen ist in erster Linie abhängig von der Basenzusammensetzung der ODN. Weiter von Bedeutung bei der Entstehung von ODN-Superstrukturen sind der pH-Wert, die lonenstärke, die Temperatur und das Vorhandensein bestimmter Kationen.
Guanosin-reiche und auch Inosin-reiche ODN können über Hoogsteen- Basenpaarungen G-Quartette ausbilden, die „aufeinandergestapelt" zur Bildung von G-Quadruplexen führen. Diese stellen ein Multimer aus vier DNA- Einzelsträngen dar. Die Bildung kann inter- und intramolekular erfolgen und die Quadruplexe somit ein, zwei oder vier Moleküle umfassen. Wichtig hierbei ist, dass die ODN mehrere aufeinanderfolgende Guanine enthalten (Stefl R, Spackova N, Berger I, Koca J, Sponer J: Molecular dynamics of DNA quadruplex molecules containing inosine, 6-thioguanine and 6-thiopurine. Biophys J, 80: 455- 468, 2001). G-Quadruplexe können sowohl von Phosphodiestem als auch von Phosphorothioaten gebildet werden (Dapic V, Bates PJ, Trent JO, Rodger A, Thomas SD, Miller DM: Antiproliferative activity of G-quartet-forming oligonucleotides with backbone and sugar modifications. Biochemistry, 41 : 3676- 3685, 2002).
Es ist wahrscheinlich, dass G-Quadruplexe natürlicherweise in der Zelle vorkommen und von biologischer Bedeutung sind.
So wird z.B. vermutet, dass die Telomere der Chromosomen solche Strukturen ausbilden können (Phan AT & Mergny JL: Human telomeric DNA: G-quadruplex, i- motif and Watson-Crick double helix. Nucleic Acid Res, 30(21 ): 4618-4625, 2002).
Zudem wurden anti-proliferative Effekte G-Quadruplex-bildender ODN beschrieben (Bates PJ, Kahlon JB, Thomas SD, Trent JO, Miller DM: Antiproliferative activity of G-rich oligonucleotides correlates with protein binding. J Biol Chem, 274(37): 26369-26377, 1999), ebenso wie einige Aptamere, die solche Strukturen bilden und antiviral (Suzuki J, Miyano-Kurosaki N, Kuwasaki T, Takeuchi H, Kawai G, Takaku H: Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 activity in vitro by a new self-stabilized oligonucleotide with guanosine-thymidine quadruplex motifs. J Virol, 76(6): 3015-3022, 2002) oder Thrombin-bindend wirken (Bock LC, Griffin LC, Latham JA, Vermaas EH, Toole JJ: Selection of single- stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature, 355: 564- 566, 1992). Außerdem sind viele Proteine beschrieben worden, die G- Quadruplexe binden können. Über deren Funktion im Hinblick auf diese Strukturen herrscht noch weitgehend Unklarheit. Eine anti-inflammatorische Wirkung wurde noch nicht beschrieben.
Neben G-Quadruplexen können manche G-reichen Oligos auch sogenannte „Frayed Wires" ausbilden. Hierzu sind u.a. längere G-Folgen im ODN notwendig. Bei diesen Strukturen kommt es über diese G-Folgen zur Aggregation der ODN, an der sehr viele Einzelstränge beteiligt sein können (Poon K & MacGregor RB Jr: Formation and structural determinants of multi-stranded guanine-rich DNA complexes. Biophys Chem, 84: 205-216, 2000).
C-reiche Oligonukleotide können im neutralen und vor allem im leicht sauren pH- Bereich relativ stabile sogenannte „i-Motive" bilden. Über die Protonierung eines Cytosins können dann drei Wasserstoffbrücken zu einem weiteren nicht- protonierten Cytosin ausgebildet werden (Abb. 11 ).
Ebenso wie bei G-Quadruplexen gibt es auch bei i-Motiven Proteine, die diese Strukturen binden können. Auch wird Poly-C-ODN mit einer Länge von mehr als 20 Basen eine antivirale Aktivität zugeschrieben (Majumdar C, Stein CA, Cohen JS, Broder S, Wilson SH: Stepwise mechanism of HIV reverse transcriptase: primer function of phosphorothioate oligodeoxynucleotide. Biochemistry, 28: 1340- 1346, 1989).
I-Motive können sowohl von Phosphodiestern als auch von Phosphorothioaten gebildet werden. Generell ist über i-Motive weniger bekannt als über G- Quadruplexe. Eine anti-inflammatorische Wirkung wurde auch für i-Motive noch nicht beschrieben.
Das Vorliegen solcher SuperStrukturen kann in einfacher, dem Fachmann bekannter Weise durch molekularbiologische, biochemische und/oder bioinformatische Methoden bestimmt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthalten erfindungsgemäß geeigneten Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen mehrere C-, G- oder I-Nukleotide in Folge. Als Folge in einer Nukleinsäuresequenz ist im erfindungsgemäßen Zusammenhang bevorzugt zu verstehen, dass die erfindungsgemäß geeignete Nukleinsäuresequenz mehrere, mindestens 2 (≥2), bevorzugt mindestens 3 (>3), insbesondere mindestens 4 (>4), ganz besonders bevorzugt mindestens 5 oder mehr (≥5) gleiche Nukleotide hintereinander enthält.
Erfindungsgemäß geeignete Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen weisen eine Länge von 8 bis 100, insbesondere 8 bis 40, vorzugsweise 14 bis 40, bevorzugt 20 bis 40 und ganz besonders bevorzugt von 30 bis 40 Nukleotiden auf.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Superstruktur-bildende Nukleinsaure- Sequenzen können eukaryontischen oder prokaryontischen Ursprungs (auch hydrolysiert oder teilhydrolysiert) sein. Erfindungsgemäß bevorzugt ist jedoch synthetische DNA.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Superstruktur-bildende Nukleinsaure- Sequenzen können in dem Fachmann bekannter Weise vollständig (alle Nukleotide) oder teilweise (nur einige Nukleotide) chemisch modifiziert sein. Bevorzugte Modifikationen sind beispielsweise:
a) Veränderung der Internucleosidbrücken: Austausch von Phosphodiestern gegen Methylphosphonate, Phosphoramidate, Phosphorothioate oder Hydroxylamine;
b) Veränderung der Zuckerkomponenten: Austausch der Ribose gegen diverse Hexo- bzw. Pentopyranosen oder 3'-5'-carbocyclisch verbrückte Derivate der 2'- Deoxyribose (Steffens R & Leumann CJ (1997) Tricyclo-DNA: A phosphodiester- backbone based DNA analog exhibiting strong comlementary base-pairing properties. J. Am. Chem. Soc. 119, 11548-11549);
c) Austausch des Strangrückgrats: Austausch der Polyesterketten auf Basis von Zucker-Phosphat-Einheiten gegen Carboxamidketten auf Basis von Aminosäurederivaten wie N-(2-Aminoethyl)-glycin-Einheiten
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt sind Phosphorothioate (PTO).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter epithelialem Deckgewebe zum einen die die äußere Körperoberfläche bedeckende Haut (bestehend aus Subkutis, Korium und Epidermis) verstanden, zum anderen das die Hohlorgane und Körperhöhlen auskleidende Gewebe, einschließlich der Epithelien der Gebärmutter und des Mundes.
„Entzündlich verändert" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung „von einer akuten oder chronischen Entzündung betroffen". Die Entzündung kann durch biologische (z. B. Krankheitserreger, Autoimmunreaktionen, TNF), chemische (z. B. Gifte, Reizstoffe) oder physikalische (z. B. UV-Strahlung, osmotische Veränderungen, mechanische Beanspruchung, Hitzestress) Noxen oder Stressoren bedingt sein.
Eine akute Entzündung ist durch plötzliches Auftreten mit raschem, oft heftigem Verlauf über Stunden oder Tage gekennzeichnet.
Die Kardinalsymptome einer akuten Entzündung sind Rubor (Rötung durch Vasodilatation), Tumor (Gewebsschwellung durch entzündliches Exsudat), Calor (Erwärmung aufgrund der vermehrten Gewebsdurchblutung), Dolor (Schmerz durch Nervenreizung) sowie Functio leasa (gestörte Funktion).
Die verschiedenen Phasen einer akuten Entzündung werden durch folgende Mediatoren gesteuert:
a) Zelluläre Mediatoren: biogene vasoaktive Amine (Histamin und Serotonin), Arachidonsäurederivate (Leukotriene, Prostaglandine, Prostazyklin, Thromboxan A2), plättchenaktivierender Faktor (PAF), Zytokine (Interleukine, TNF-a, Interferone), NO.
b) Plasmamediatoren: Komplementsystem, Gerinnungs- und fibrinolytisches System, Kallikrein-Kinin-System
Die bekanntesten Formen der akuten Entzündung sind die exsudative Entzündung, seröse Entzündung, fibrinöse Entzündung, eitrige Entzündung, hämorrhagische Entzündung, nekrotisierende und ulzerierende Entzündung, gangränöse Entzündung sowie die akute lymphozytäre Entzündung.
Typisch für eine chronische Entzündung ist hingegen ein langer Verlauf (Wochen, Monate oder Jahre) mit häufig schleichendem Beginn und entwickelnder Symptomatik, insbesondere eine Persistenz der Schädigung.
Eine mithilfe einer erfindungsgemäßen Zubereitung bevorzugt zu behandelnde entzündliche Erkrankung ist die Paradontose. Paradontose ist eine Infektionskrankheit, die in den meisten Fällen hervorgerufen wird durch die Bakterien Porphyramonas gingivalis, Bacteroides forsythus und Actinobacillus actinomycetemcomitans. Das Vorhandensein der Bakterien ist eine notwendige, aber nicht ausreichende Vorbedingung für das Auftreten der Krankheit. Die kontinuierliche Ausschüttung von schädlichen Substanzen, vor allem Lipopolysacchariden, durch die Bakterien aktiviert das Immunsystem des Wirtes
und löst die Entlassung von inflammatorischen Mediatoren und MMPs (Matrix- Metallo-Proteasen) durch die Monocyten aus. Proinflammatorische Cytokine wie IL-1 ß und TNF-α aktivieren wiederum die Fibroblasten des umgebenden Gewebes, die ihrerseits die Ausschüttung von MMPs verstärken. Aktivierte Makrophagen und Fibroblasten verringern zudem die Expression von TIMPs. Die Folge ist eine Zunahme der Nettoaktivität von MMPs und die Zerstörung des umgebenden Gewebes.
Im Anfangsstadium der Paradontose entsteht durch die MMP-vermittelte Auflösung kleiner Mengen des verbindenden Epithelgewebes zwischen Zahnfleisch und der Zahnwurzeloberfläche eine Tasche, die den Bakterien Zugang zu dem tieferliegenden Schichten verschafft und somit das Fortschreiten der Krankheit erlaubt. Die Verringerung der Zerstörung der extrazellulären Matrix ist daher ein vielversprechender Ansatz zur Behandlung und Prophylaxe von Paradontose.
Die dem epithelialen Deckgewebe mit Hilfe der erfindungsgemäßen Zubereitung zugeführten Nukleinsäuren sorgen in dem epithelialen Deckgewebe für eine Suppression der überschießenden Immunantwort und dadurch für ein geregeltes Gleichgewicht zwischen Auf- und Abbau von Kollagen.
Die erfindungsgemäße Zubereitung ist außerdem zur Prophylaxe und Behandlung verschiedener anderer Erkrankungen oder unerwünschter Zustände geeignet, insbesondere entzündlich bedingter Alterungsprozesse, Psoriasis, atopisches Ekzem, „trockene Haut", Alopecia arreata, Vitiligo, bullöse Erkrankungen, Abstoßungsreaktionen (graft-versus-host Reaktionen), UV-bedingte
Hautentzündungen sowie Funktionsstörungen der epidermalen Barriere, die auf S. 2 der WO 98/32444 aufgezählt sind, auf die hiermit in vollem Umfag Bezug genommen wird.
Im Gegensatz zur Steroidtherapie ist beim Einsatz der erfindungsgemäßen Zubereitung nicht mit unerwünschten Wirkungen zu rechnen, da non-CpGs natürlich vorkommende DNA-Motive darstellen.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Superstruktur-bildende Nukleinsaure- Sequenzen können in dem Fachmann bekannter Weise chemisch synthetisiert oder aus biologischen Quellen, insbesondere aus Bakterien, gewonnen werden.
Die Wirksamkeit von Nukleinsäuren in Formulierungen zur Anwendung insbesondere auf der Haut hängt von der Verfügbarkeit der Nukleinsäuren in den lebenden Zellen der Haut ab. Das Eindringen eines Makromoleküls durch das Stratum Corneum (natürliche Barriere der Haut) in die Haut ist nicht immer gewährleistet. In Liposomen verpackte Nukleinsäuren können jedoch das Stratum Corneum von Hautmodellen penetrieren. Erfindungsgemäß bevorzugte Zubereitungen sind daher solche, die die erfindungsgemäß einsetzbaren Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen in Liposomen verpackt enthalten.
Besonders bevorzugt erfolgt die Herstellung geeigneter Liposomen wie in der DE- A-197 40 092 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen zur Prophylaxe und/oder Behandlung epithelialen Deckgewebes, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Behandlung entzündlich veränderten epithelialen Deckgewebes.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer kosmetischen oder pharmazeutischen Zubereitung, insbesondere zur Prophylaxe und/oder Behandlung entzündlich veränderten epithelialen Deckgewebes, dadurch gekennzeichnet, dass man Superstruktur- bildende Nukleinsaure-Sequenzen, wie für die erfindungsgemäßen Zubereitungen beschrieben, mit kosmetisch und pharmakologisch geeigneten und verträglichen Trägern vermischt.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind Wäscheweichspüler (Fabric Softener), Handwaschmittel, Körper- und Haarpflegemittel, Haarfärbemittel
oder Handgeschirrspülmittel, die Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen, wie für die erfindungsgemäßen Zubereitungen beschrieben, umfassen.
Die Superstruktur-bildende Nukleinsaure-Sequenzen werden im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise als Komponente in eine kosmetische oder pharmazeutische Zubereitung oder in Wäscheweichspüler, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel oder Körperpflegemittel eingebracht bzw. eingearbeitet.
Je nach Art der Formulierung können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zubereitungen mindestens einen weiteren Hilfs- oder Zusatzstoff, wie z. B. Öle, Schutzkolloide, Weichmacher, Antioxidantien und/oder Emulgatoren enthalten. Im Falle einer Dispersion, insbesondere im Falle einer Suspension oder Emulsion, ist es vorteilhaft, zusätzlich ein physiologisch verträgliches Öl wie beispielsweise Sesamöl, Maiskeimöl, Baumwollsaatöl, Sojabohnenöl oder Erdnußöl, Ester mittelkettiger pflanzlicher Fettsäuren oder Fischöle wie beispielsweise Makrelen-, Sprotten- oder Lachsöl zu verwenden.
Zur Erhöhung der Stabilität des Wirkstoffes gegen oxidativen Abbau ist es vorteilhaft, Stabilisatoren wie σ-Tocopherol, t-Butylhydroxy-toluol, t- Butylhydroxyanisol, Ascorbinsäure oder Ethoxyquine zuzusetzen.
Die Dosierung und Anwendungsdauer der erfindungsgemäß einsetzbaren peptidbasierten Inhibitoren kann durch den Fachmann in geeigneter Weise angepaßt und variiert werden.
Die erfindungsgemäßen Wäscheweichspüler, Handwaschmittel und Handgeschirrspülmittel sowie die kosmetischen Zubereitungen, Körper- und Haarpflegemittel sowie Haarfärbemittel, wie beispielsweise Haarshampoos, Haarlotionen, Schaumbäder, Duschbäder, Cremes, Gele, Lotionen, alkoholische und wäßrig/alkoholische Lösungen, Emulsionen, Wachs/ Fett-Massen, Stiftpräparate, Puder oder Salben können - je nach Art der Formulierung - als Hilfs- und Zusatzstoffe milde Tenside, Ölkörper, Emulgatoren, Überfettungsmittel, Perlglanzwachse, Konsistenzgeber, Verdickungsmittel, Polymere, Siliconverbindungen, Fette, Wachse, Stabilisatoren, biogene Wirkstoffe, Deodorantien,
Antitranspirantien, Antischuppenmittel, Filmbildner, Quellmittel, UV- Lichtschutzfaktoren, Antioxidantien, Hydrotrope, Konservierungsmittel, Insek- tenrepellentien, Selbstbräuner, Solubilisatoren, Parfümöle, Farbstoffe und dergleichen enthalten.
Typische Beispiele für geeignete milde, d.h. besonders hautverträgliche Tenside sind Fettalkoholpolyglycolethersulfate, Monoglyceridsulfate, Mono- und/oder Dialkylsulfosuccinate, Fettsäureisethionate, Fettsäuresarcosinate,
Fettsäuretauride, Fettsäureglutamate, α-Olefinsulfonate, Ethercarbonsäuren, Alkyloligoglucoside, Fettsäureglucamide, Alkylamidobetaine und/oder Proteinfettsäurekondensate, letztere vorzugsweise auf Basis von Weizenproteinen.
Als Ölkörper kommen beispielsweise Guerbetalkohole auf Basis von Fettalkoholen mit 6 bis 18, vorzugsweise 8 bis 10 Kohlenstoffatomen, Ester von linearen C6-C22- Fettsäuren mit linearen C6-C22-Fettalkoholen, Ester von verzweigten C6-Cι3- Carbonsäuren mit linearen C6-C22-Fettalkoholen, wie z.B. Myristylmyristat, Myristylpalmitat, Myristylstearat, Myristylisostearat, Myristyloleat, Myristylbehenat, Myristylerucat, Cetylmyristat, Cetylpalmitat, Cetylstearat, Cetylisostearat, Cetyloleat, Cetylbehenat, Cetylerucat, Stearylmyristat, Stearylpalmitat, Stearylstearat, Stearylisostearat, Stearyloleat, Stearylbehenat, Stearylerucat, Isostearylmyristat, Isostearylpalmitat, Isostearylstearat, Isostearylisostearat, Isostearyloleat, Isostearylbehenat, Isostearylerucat, Oleylmyristat, Oleylpalmitat, Oleylstearat, Oleylisostearat, Oleyloleat, Oleylbehenat, Oleylerucat, Behenylmyristat, Behenylpalmitat, Behenylstearat, Behenylisostearat, Behenyloleat, Behenylbehenat, Behenylerucat, Erucylmyristat, Erucylpalmitat, Erucylstearat, Erucylisostearat, Erucyloleat, Erucylbehenat und Erucylerucat in Betracht.
Daneben eignen sich Ester von linearen C6-C22-Fettsäuren mit verzweigten Alkoholen, insbesondere 2-Ethylhexanol, Ester von Hydroxycarbonsäuren mit linearen oder verzweigten C6-C22-Fettalkoholen, insbesondere Dioctyl Malate, Ester von linearen und/oder verzweigten Fettsäuren mit mehrwertigen Alkoholen (wie z.B. Propylenglycol, Dimerdiol oder Trimertriol) und/oder Guerbetalkoholen,
Triglyceride auf Basis C6-Cιo-Fettsäuren, flüssige Mono-/Di- /Triglyceridmischungen auf Basis von Cβ-Cis-Fettsäuren, Ester von Cβ-C22- Fettalkoholen und/oder Guerbetalkoholen mit aromatischen Carbonsäuren, insbesondere Benzoesäure, Ester von C2-C-ι2-Dicarbonsäuren mit linearen oder verzweigten Alkoholen mit 1 bis 22 Kohlenstoffatomen oder Polyolen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 2 bis 6 Hydroxylgruppen, pflanzliche Öle, verzweigte primäre Alkohole, substituierte Cyclohexane, lineare und verzweigte C6-C22- Fettalkoholcarbonate, Guerbetcarbonate, Ester der Benzoesäure mit linearen und/oder verzweigten C6-C22-Alkoholen (z.B. Finsolv® TN), lineare oder verzweigte, symmetrische oder unsymmetrische Dialkylether mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen pro Alkylgruppe, Ringöffnungsprodukte von epoxidierten Fettsäureestern mit Polyolen, Siliconöle und/oder aliphatische bzw. naphthenische Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Squalan, Squalen oder Dialkylcyclohexane.
Als Emulgatoren kommen beispielsweise nichtionogene Tenside aus mindestens einer der folgenden Gruppen in Frage:
(1) Anlagerungsprodukte von 2 bis 30 Mol Ethylenoxid und/ oder 0 bis 5 Mol Propylenoxid an lineare Fettalkohole mit 8 bis 22 C-Atomen, an Fettsäuren mit 12 bis 22 C-Atomen, an Alkylphenole mit 8 bis 15 C-Atomen in der Alkylgruppe sowie Alkylamine mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alkylrest;
(2) Cι2/ι8-Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von 1 bis 30 Mol Ethylenoxid an Glycerin;
(3) Glycerinmono- und -diester und Sorbitanmono- und -diester von gesättigten und ungesättigten Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen und deren Ethylenoxidanlagerungsprodukte;
(4) Alkyl- und/oder Alkenylmono- und -oligoglycoside mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen im Alk(en)ylrest und deren ethoxylierte Analoga;
(5) Anlagerungsprodukte von 15 bis 60 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
(6) Polyol- und insbesondere Polyglycerinester;
(7) Anlagerungsprodukte von 2 bis 15 Mol Ethylenoxid an Ricinusöl und/oder gehärtetes Ricinusöl;
(8) Partialester auf Basis linearer, verzweigter, ungesättigter bzw. gesättigter C6/22-Fettsäuren, Ricinolsäure sowie 12-Hydroxystearinsäure und Glycerin, Polyglycerin, Pentaerythrit, Dipentaerythrit, Zuckeralkohole (z.B. Sorbit), Alkylglucoside (z.B. Methylglucosid, Butylglucosid, Laurylglucosid) sowie Polyglucoside (z.B. Cellulose);
(9) Mono-, Di- und Trialkylphosphate sowie Mono-, Di- und/oder Tri-PEG- alkylphosphate und deren Salze;
(10) Wollwachsalkohole;
(11 ) Polysiloxan-Polyalkyl-Polyether-Copolymere bzw. entsprechende Derivate;
(12) Mischester aus Pentaerythrit, Fettsäuren, Citronensäure und Fettalkohol gemäß DE 1165574 PS und/oder Mischester von Fettsäuren mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, Methylglucose und Polyolen, vorzugsweise Glycerin oder Polyglycerin,
(13) Polyalkylenglycole sowie
(14) Glycerincarbonat.
Die Anlagerungsprodukte von Ethylenoxid und/oder von Propylenoxid an Fettalkohole, Fettsäuren, Alkylphenole, Glycerinmono- und -diester sowie Sorbitanmono- und -diester von Fettsäuren oder an Ricinusöl stellen bekannte, im Handel erhältliche Produkte dar.
Es handelt sich dabei um Homologengemische, deren mittlerer Alkoxylierungsgrad dem Verhältnis der Stoffmengen von Ethylenoxid und/ oder Propylenoxid und Substrat, mit denen die Anlagerungsreaktion durchgeführt wird, entspricht. C12/18- Fettsäuremono- und -diester von Anlagerungsprodukten von Ethylenoxid an Glycerin sind aus DE 2024051 PS als Rückfettungsmittel für kosmetische Zubereitungen bekannt.
Alkyl- und/oder Alkenylmono- und -oligoglycoside, ihre Herstellung und ihre Verwendung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Ihre Herstellung erfolgt insbesondere durch Umsetzung von Glucose oder Oligosacchariden mit primären Alkoholen mit 8 bis 18 C-Atomen. Bezüglich des Glycosidrestes gilt, dass sowohl Monoglycoside, bei denen ein cyclischer Zuckerrest glycosidisch an den
Fettalkohol gebunden ist, als auch oligomere Glycoside mit einem Oligomerisationsgrad bis vorzugsweise etwa 8 geeignet sind. Der Oligomerisierungsgrad ist dabei ein statistischer Mittelwert, dem eine für solche technischen Produkte übliche Homologenverteilung zugrunde liegt.
Typische Beispiele für geeignete Polyglycerinester sind Polyglyceryl-2 Dipolyhydroxystearate (Dehymuls® PGPH), Polyglycerin-3-Diisostearate (Lameform® TGI), Polyglyceryl-4 Isostearate (Isolan® Gl 34), Polyglyceryl-3 Oleate, Diisostearoyl Polyglyceryl-3 Diisostearate (Isolan® PDI), Polyglyceryl-3 Methylglucose Distearate (Tego Care® 450), Polyglyceryl-3 Beeswax (Cera Bellina®), Polyglyceryl-4 Caprate (Polyglycerol Caprate T2010/90), Polyglyceryl-3 Cetyl Ether (Chimexane® NL), Polyglyceryl-3 Distearate (Cremophor® GS 32) und Polyglyceryl Polyricinoleate (Admul® WOL 1403), Polyglyceryl Dimerate Isostearate sowie deren Gemische.
Weiterhin können als Emulgatoren zwitterionische Tenside verwendet werden. Als zwitterionische Tenside werden solche oberflächenaktiven Verbindungen bezeichnet, die im Molekül mindestens eine quartäre Ammoniumgruppe und mindestens eine Carboxylat- und eine Sulfonatgruppe tragen. Besonders geeignete zwitterionische Tenside sind die sogenannten Betaine wie die N-Alkyl- N.N-dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das
Kokosalkyldimethylammoniumgiycinat, N-Acylaminopropyl-N,N- dimethylammoniumglycinate, beispielsweise das Kokosacyl- aminopropyldimethylammoniumglycinat, und 2-Alkyl-3-carboxylmethyl-3- hydroxyethylimidazoline mit jeweils 8 bis 18 C-Atomen in der Alkyl- oder Acylgruppe sowie das Kokosacylaminoethylhydroxyethylcarboxymethylglycinat. Besonders bevorzugt ist das unter der CTFA-Bezeichnung Cocamidopropyl Betaine bekannte Fettsäureamid-Derivat. Ebenfalls geeignete Emulgatoren sind ampholytische Tenside. Unter ampholytischen Tensiden werden solche oberflächenaktiven Verbindungen verstanden, die außer einer C8/18-Alkyl- oder - Acylgruppe im Molekül mindestens eine freie Aminogruppe und mindestens eine - COOH- oder -SO3H-Gruppe enthalten und zur Ausbildung innerer Salze befähigt sind. Beispiele für geeignete ampholytische Tenside sind N-Alkylglycine, N-Al-
kylpropionsäuren, N-Alkylaminobuttersäuren, N-Alkyliminodipropionsäuren, N-Hy- droxyethyl-N-alkylamidopropylglycine, N-Alkyltaurine, N-Alkylsarcosine, 2-Alkyl- aminopropionsäuren und Alkylaminoessigsäuren mit jeweils etwa 8 bis 18 C-Atomen in der Alkylgruppe. Besonders bevorzugte ampholytische Tenside sind das N-Kokosalkylaminopropionat, das Kokosacylaminoethylaminopropionat und das Ci2/i8-AcyIsarcosin. Neben den ampholytischen kommen auch quartäre Emulgatoren in Betracht, wobei solche vom Typ der Esterquats, vorzugsweise methylquaternierte Difettsäuretriethanolaminester-Salze, besonders bevorzugt sind.
Als Überfettungsmittel können Substanzen wie beispielsweise Lanolin und Lecithin sowie polyethoxylierte oder acylierte Lanolin- und Lecithinderivate, Polyol- fettsäureester, Monoglyceride und Fettsäurealkanolamide verwendet werden, wobei die letzteren gleichzeitig als Schaumstabilisatoren dienen.
Als Perlglanzwachse kommen beispielsweise in Frage: Alkylenglycolester, speziell Ethylenglycoldistearat; Fettsäurealkanolamide, speziell
Kokosfettsäurediethanolamid; Partialglyceride, speziell Stearinsäuremonoglycerid; Ester von mehrwertigen, gegebenenfalls hydroxysubstituierte Carbonsäuren mit Fettalkoholen mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, speziell langkettige Ester der Weinsäure; Fettstoffe, wie beispielsweise Fettaikohole, Fettketone, Fettaldehyde, Fettether und Fettcarbonate, die in Summe mindestens 24 Kohlenstoffatome aufweisen, speziell Lauron und Distearylether; Fettsäuren wie Stearinsäure, Hydroxystearinsäure oder Behensäure, Ringöffnungsprodukte von Olefinepoxiden mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen mit Fettalkoholen mit 12 bis 22 Kohlenstoffatomen und/oder Polyolen mit 2 bis 15 Kohlenstoffatomen und 2 bis 10 Hydroxylgruppen sowie deren Mischungen.
Als Konsistenzgeber kommen in erster Linie Fettalkohole oder Hydroxyfettalkohole mit 12 bis 22 und vorzugsweise 16 bis 18 Kohlenstoffatomen und daneben Partialglyceride, Fettsäuren oder Hydroxyfettsäuren in Betracht. Bevorzugt ist eine Kombination dieser Stoffe mit Alkyloligoglucosiden und/oder Fettsäure-N-
methylglucamiden gleicher Kettenlänge und/oder Polyglycerinpoly-12- hydroxystea raten.
Geeignete Verdickungsmittel sind beispielsweise Aerosil-Typen (hydrophile Kieselsäuren), Polysaccharide, insbesondere Xanthan-Gum, Guar-Guar, Agar- Agar, Alginate und Tylosen, Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose, ferner höhermolekulare Polyethylenglycolmono- und -diester von Fettsäuren, Polyacrylate, (z.B. Carbopole® von Goodrich oder Synthalene® von Sigma), Polyacrylamide, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon, Tenside wie beispielsweise ethoxylierte Fettsäureglyceride, Ester von Fettsäuren mit Polyolen wie beispielsweise Pentaerythrit oder Trimethylolpropan, Fettalkoholethoxylate mit eingeengter Homologenverteilung oder Alkyloligoglucoside sowie Elektrolyte wie Kochsalz und Ammoniumchlorid.
Geeignete kationische Polymere sind beispielsweise kationische Cellulosederivate, wie z.B. eine quaternierte Hydroxyethylcellulose, die unter der Bezeichnung Polymer JR 400® von Amerchol erhältlich ist, kationische Stärke, Copolymere von Diallylammoniumsalzen und Acrylamiden, quaternierte Vinylpyrrolidon/Vinylimidazol-Polymere, wie z.B. Luviquat® (BASF), Kondensationsprodukte von Polyglycolen und Aminen, quaternierte Kollagenpolypeptide, wie beispielsweise Lauryldimonium hydroxypropyl hydrolyzed collagen (Lamequat®L/Grünau), quaternierte Weizenpolypeptide, Polyethylenimin, kationische Siliconpolymere, wie z.B. Amidomethicone, Copolymere der Adipinsäure und Dimethylaminohydroxypropyldiethylentriamin (Cartaretine®/Sandoz), Copolymere der Acrylsäure mit Dimethyldiallylammonium- chlorid (Merquat® 550/Chemviron), Polyaminopolyamide, wie z.B. beschrieben in der FR 2252840 A sowie deren vernetzte wasserlöslichen Polymere, kationische Chitinderivate wie beispielsweise quatemiertes Chitosan, gegebenenfalls mikrokristallin verteilt, Kondensationsprodukte aus Dihalogenalkylen, wie z.B. Dibrombutan mit Bisdialkylaminen, wie z.B. Bis-Dimethylamino-1,3-propan, kationischer Guar-Gum, wie z.B. Jaguar® CBS, Jaguar® C-17, Jaguar® C-16 der Firma Celanese, quaternierte Ammoniumsalz-Polymere, wie z.B. Mirapol® A-15, Mirapol® AD-1 , Mirapol® AZ-1 der Firma Miranol.
Als anionische, zwitterionische, amphotere und nichtionische Polymere kommen beispielsweise Vinylacetat/Crotonsäure-Copolymere, Vinylpyrrolidon/Vinylacrylat- Copolymere, Vinylacetat/Butylmaleat/ Isobomylacrylat-Copolymere,
Methylvinylether/Maleinsäureanhydrid-Copolymere und deren Ester, unvernetzte und mit Polyolen vernetzte Polyacrylsäuren, Acrylamidopro- pyltrimethylammoniumchlorid/Acrylat-Copolymere, Octylacrylamid/Methylmeth- acrylat/tert.Butylaminoethylmethacrylat/2-Hydroxyproyl-methacrylat-Copolymere, Polyvinylpyrrolidon, Vinylpyrrolidon/Vinylacetat-Copolymere, Vinylpyrrolidon/ Dimethylaminoethylmethacrylat/Vinylcaprolactam-Terpolymere sowie gegebenenfalls derivatisierte Celluloseether und Silicone in Frage.
Geeignete Siliconverbindungen sind beispielsweise Dimethylpolysiloxane, Methylphenylpolysiloxane, cyclische Silicone sowie amino-, fettsäure-, alkohol-, polyether-, epoxy-, fluor-, glykosid- und/oder alkylmodifizierte Siliconverbindungen, die bei Raumtemperatur sowohl flüssig als auch harzförmig vorliegen können. Weiterhin geeignet sind Simethicone, bei denen es sich um Mischungen aus Dimethiconen mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 200 bis 300 Dimethylsiloxan-Einheiten und hydrierten Silicaten handelt. Eine detaillierte Übersicht über geeignete flüchtige Silicone findet sich zudem von Todd et al. in Cosm.Toil. 91, 27 (1976).
Typische Beispiele für Fette sind Glyceride, als Wachse kommen u.a. natürliche Wachse, wie z.B. Candelillawachs, Carnaubawachs, Japanwachs, Espartograswachs, Korkwachs, Guarumawachs, Reis-keimölwachs, Zuckerrohrwachs, Ouricurywachs, Montanwachs, Bienenwachs, Schellackwachs, Walrat, Lanolin (Wollwachs), Bürzelfett, Ceresin, Ozokerit (Erdwachs), Petrolatum, Paraffinwachse, Mikrowachse; chemisch modifizierte Wachse (Hartwachse), wie z.B. Montanesterwachse, Sasolwachse, hydrierte Jojobawach.se sowie synthetische Wachse, wie z.B. Polyalkylenwachse und Polyethylenglycolwachse in Frage.
Als Stabilisatoren können Metallsalze von Fettsäuren, wie z.B. Magnesium-, Aluminium- und/oder Zinkstearat bzw. -ricinoleat eingesetzt werden.
Unter biogenen Wirkstoffen sind beispielsweise Tocopherol, Tocopherolacetat, Tocopherolpalmitat, Ascorbinsäure, Desoxyribonucleinsäure, Retinol, Bisabolol, Allantoin, Phytantriol, Panthenol, AHA-Säuren, Aminosäuren, Ceramide, Pseudoceramide, essentielle Öle, Pflanzenextrakte und Vitaminkomplexe zu verstehen.
Kosmetische Deodorantien (Desodorantien) wirken Körpergerüchen entgegen, überdecken oder beseitigen sie. Körpergerüche entstehen durch die Einwirkung von Hautbakterien auf apokrinen Schweiß, wobei unangenehm riechende Abbauprodukte gebildet werden. Dementsprechend enthalten Deodorantien Wirkstoffe, die als keimhemmende Mittel, Enzyminhibitoren, Geruchsabsorber oder Geruchsüberdecker fungieren.
Als keimhemmende Mittel, die gegebenenfalls den erfindungsgemäßen Kosmetika zugesetzt werden, sind grundsätzlich alle gegen grampositive Bakterien wirksamen Stoffe geeignet, wie z. B. 4-Hydroxybenzoesäure und ihre Salze und Ester, N-(4-Chlorphenyl)-N'-(3,4 dichlorphenyl)harnstoff, 2,4,4'-Trichlor-2'- hydroxydiphenylether (Triclosan), 4-Chlor-3,5-dimethylphenol, 2,2'-Methylen- bis(6-brom-4-chlorphenol), 3-Methyl-4-(1 -methylethyl)phenol, 2-Benzyl-4- chlorphenol, 3-(4-Chlorphenoxy)-1 ,2-propandiol, 3-lod-2-propinylbutylcarbamat, Chlorhexidin, 3,4,4 '-Trichlorcarbanilid (TTC), antibakterielle Riechstoffe, Thymol, Thymianöl, Eugenol, Nelkenöl, Menthol, Minzöl, Farnesol, Phenoxyethanol, Glycerinmonolaurat (GML), Diglycerinmonocaprinat (DMC), Salicylsäure-N- alkylamide wie z. B. Sa!icylsäure-n-octylamid oder Salicylsäure-n-decylamid.
Auch Enzyminhibitoren können den erfindungsgemäßen Kosmetika zugesetzt werden. Geeignete Enzyminhibitoren sind beispielsweise Esteraseinhibitoren. Hierbei handelt es sich vorzugsweise um Trialkylcitrate wie Trimethylcitrat, Tripropylcitrat, Triisopropylcitrat, Tributylcitrat und insbesondere Triethylcitrat (Hydagen® CAT, Henkel KGaA, Düsseldorf/FRG). Die Stoffe inhibieren die
Enzymaktivität und reduzieren dadurch die Geruchsbildung. Weitere Stoffe, die als Esteraseinhibitoren in Betracht kommen, sind Sterolsulfate oder -phosphate, wie beispielsweise Lanosterin-, Cholesterin-, Campesterin-, Stigmasterin- und Sitosterinsulfat bzw -phosphat, Dicarbonsäuren und deren Ester, wie beispielsweise Glutarsäure, Glutarsäuremonoethylester, Glutarsäurediethylester, Adipinsäure, Adipinsäuremonoethylester, Adipinsäurediethylester, Malonsäure und Malonsäurediethylester, Hydroxycarbnonsäuren und deren Ester wie beispielsweise Citronensäure, Äpfelsäure, Weinsäure oder Weinsäurediethylester, sowie Zinkglycinat.
Als Geruchsabsorber eignen sich Stoffe, die geruchsbildende Verbindungen aufnehmen und weitgehend festhalten können. Sie senken den Partialdruck der einzelnen Komponenten und verringern so auch ihre
Ausbreitungsgeschwindigkeit. Wichtig ist, dass dabei Parfüms unbeeinträchtigt bleiben müssen. Geruchsabsorber haben keine Wirksamkeit gegen Bakterien. Sie enthalten beispielsweise als Hauptbestandteil ein komplexes Zinksalz der Ricinolsäure oder spezielle, weitgehend geruchsneutrale Duftstoffe, die dem Fachmann als "Fixateure" bekannt sind, wie z. B. Extrakte von Labdanum bzw. Styrax oder bestimmte Abietinsäurederivate. Als Geruchsüberdecker fungieren Riechstoffe oder Parfümöle, die zusätzlich zu ihrer Funktion als Geruchsüberdecker den Deodorantien ihre jeweilige Duftnote verleihen. Als Parfümöle seien beispielsweise genannt Gemische aus natürlichen und synthetischen Riechstoffen. Natürliche Riechstoffe sind Extrakte von Blüten, Stengeln und Blättern, Früchten, Fruchtschalen, Wurzeln, Hölzern, Kräutern und Gräsern, Nadeln und Zweigen sowie Harzen und Balsamen. Weiterhin kommen tierische Rohstoffe in Frage, wie beispielsweise Zibet und Castoreum. Typische synthetische Riechstoffverbindungen sind Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind z.B. Benzylacetat, p-tert.-Butylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden z.B. die linearen Alkanale mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd,
Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen z.B. die Jonone und Methylcedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Isoeugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene und Balsame. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Auch ätherische Öle geringerer Flüchtigkeit, die meist als Aromakomponenten verwendet werden, eignen sich als Parfümöle, z.B. Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzenöl, Zimtblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeerenöl, Vetiveröl, Olibanöl, Galbanumöl, Labdanumöl und Lavandinöl. Vorzugsweise werden Bergamotteöl, Dihydromyrcenol, Lilial, Lyral, Citronellol, Phenylethylalkohol, α-Hexylzimtaldehyd, Geraniol, Benzylaceton, Cyclamenaldehyd, Linalool, Boisambrene Forte, Ambroxan, Indol, Hedione, Sandelice, Citronenöl, Mandarinenöl, Orangenöl, Allylamylglycolat, Cyclovertal, Lavandinöl, Muskateller Salbeiöl, ß-Damascone, Geraniumöl Bourbon, Cyclohexylsalicylat, Vertofix Coeur, Iso-E-Super, Fixolide NP, Evernyl, Iraldein gamma, Phenylessigsäure, Geranylacetat, Benzylacetat, Rosenoxid, Romilat, Irotyl und Floramat allein oder in Mischungen, eingesetzt.
Antitranspirantien (Antiperspirantien) reduzieren durch Beeinflussung der Aktivität der ekkrinen Schweißdrüsen die Schweißbildung, und wirken somit Achselnässe und Körpergeruch entgegen. Wässrige oder wasserfreie Formulierungen von Antitranspirantien enthalten typischerweise folgende Inhaltsstoffe:
(a) adstringierende Wirkstoffe,
(b) Ölkomponenten,
(c) nichtionische Emulgatoren,
(d) Coemulgatoren,
(e) Konsistenzgeber,
(f) Hilfsstoffe wie z. B. Verdicker oder Komplexierungsmittel und/oder
(g) nichtwässrige Lösungsmittel wie z. B. Ethanol, Propylenglykol und/oder Glycerin.
Als adstringierende Antitranspirant-Wirkstoffe eignen sich vor allem Salze des Aluminiums, Zirkoniums oder des Zinks. Solche geeigneten antihydrotisch wirksamen Wirkstoffe sind z.B. Aluminiumchlorid, Aluminiumchlorhydrat, Aluminiumdichlorhydrat, Aluminiumsesquichlorhydrat und deren Komplexverbindungen z. B. mit Propylenglycol-1 ,2. Aluminiumhydroxyallantoinat, Aluminiumchloridtartrat, Aluminium-Zirkonium-Trichlorohydrat, Aluminium- Zirkonium-tetrachlorohydrat, Aluminium-Zirkonium-pentachlorohydrat und deren Komplexverbindungen z. B. mit Aminosäuren wie Glycin.
Daneben können in Antitranspirantien übliche öllösliche und wasserlösliche Hilfsmittel in geringeren Mengen enthalten sein. Solche öllöslichen Hilfsmittel können z.B. sein:
• entzündungshemmende, hautschützende oder wohlriechende ätherische Öle,
• synthetische hautschützende Wirkstoffe und/oder
• öllösliche Parfümöle.
Übliche wasserlösliche Zusätze sind z.B. Konservierungsmittel, wasserlösliche Duftstoffe, pH-Wert-Stellmittel, z.B. Puffergemische, wasserlösliche Verdickungsmittel, z.B. wasserlösliche natürliche oder synthetische Polymere wie z.B. Xanthan-Gum, Hydroxyethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder hochmolekulare Polyethylenoxide.
Als Antischuppenmittel können Climbazol, Octopirox und Zinkpyrithion eingesetzt werden.
Gebräuchliche Filmbildner sind beispielsweise Chitosan, mikrokristallines Chitosan, quatemiertes Chitosan, Polyvinylpyrrolidon, Vinylpyrrolidon-Vinylacetat- Copolymerisate, Polymere der Acrylsäurereihe, quaternäre Cellulose-Derivate, Kollagen, Hyaluronsäure bzw. deren Salze und ähnliche Verbindungen.
Als Quellmittel für wäßrige Phasen können Montmorillonite, Clay Mineralstoffe, Pemulen sowie alkylmodifizierte Carbopoltypen (Goodrich) dienen. Weitere
geeignete Polymere bzw. Quellmittel können der Übersicht von R.Lochhead in Cosm.Toil.108, 95 (1993) entnommen werden.
Unter UV-Lichtschutzfaktoren sind beispielsweise bei Raumtemperatur flüssig oder kristallin vorliegende organische Substanzen (Lichtschutzfilter) zu verstehen, die in der Lage sind, ultraviolette Strahlen zu absorbieren und die aufgenommene Energie in Form längerwelliger Strahlung, z.B. Wärme wieder abzugeben. UVB- Filter können öllöslich oder wasserlöslich sein. Als öllösliche Substanzen sind z.B. zu nennen:
• 3-Benzylidencampher bzw. 3-Benzylidennorcampher und dessen Derivate, z.B. 3-(4-Methylbenzyliden)campher wie in der EP 0693471 B1 beschrieben;
• 4-Aminobenzoesäurederivate, vorzugsweise 4-Dimethylamino)benzoesäure-2- ethylhexylester, 4-(Dimethylamino)benzoesäure-2-octylester und 4-(Dimethyl- amino)benzoesäureamylester;
• Ester der Zimtsäure, vorzugsweise 4-Methoxyzimtsäure-2-ethylhexylester, 4- Methoxyzimtsäurepropylester, 4-Methoxyzimtsäureisoamylester 2-Cyano-3,3- phenylzimtsäure-2-ethylhexylester (Octocrylene);
• Ester der Salicylsäure, vorzugsweise Salicylsäure-2-ethylhexylester, Salicylsäure-4-isopropylbenzyIester, Salicylsäurehomomenthylester;
• Derivate des Benzophenons, vorzugsweise 2-Hydroxy-4-methoxybenzo- phenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon, 2,2'-Dihydroxy-4- methoxybenzophenon;
• Ester der Benzalmalonsäure, vorzugsweise 4-Methoxybenzmalonsäuredi-2- ethylhexylester;
• Triazinderivate, wie z.B. 2,4,6-Trianilino-(p-carbo-2'-ethyl-1 '-hexyloxy)-1 ,3,5- triazin und Octyl Triazon, wie in der EP 0818450 A1 beschrieben oder Dioctyl Butamido Triazone (Uvasorb® HEB);
• Propan-1 ,3-dione, wie z.B. 1-(4-tert.Butylphenyl)-3-4'methoxyphenyl)propan- 1 ,3-dion;
• Ketotricyclo(5.2.1.0)decan-Derivate, wie in der EP 0694521 B1 beschrieben.
Als wasserlösliche Substanzen kommen in Frage:
• 2-Phenyibenzimidazol-5-sulfonsäure und deren Alkali-, Erdalkali-, Ammonium-, Alkylammonium-, Alkanolammonium- und Glucammoniumsalze;
• Sulfonsäurederivate von Benzophenonen, vorzugsweise 2-Hydroxy-4- methoxybenzophenon-5-sulfonsäure und ihre Salze;
• Sulfonsäurederivate des 3-Benzylidencamphers, wie z.B. 4-(2-Oxo-3- bornylidenmethyl)benzoIsulfonsäure und 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornyliden)- sulfonsäure und deren Salze.
Als typische UV-A-Filter kommen insbesondere Derivate des Benzoylmethans in Frage, wie beispielsweise 1-(4'-tert.Butylphenyl)-3-(4'-methoxyphenyl)propan-1 ,3- dion, 4-tert.-Butyl-4'~methoxydibenzoylmethan (Parsol 1789), 1-Phenyl-3-(4'- isopropylphenyl)-propan-1 ,3-dion sowie Enaminverbindungen, wie beschrieben in der DE 19712033 A1 (BASF). Die UV-A und UV-B-Filter können selbstverständlich auch in Mischungen eingesetzt werden. Neben den genannten löslichen Stoffen kommen für diesen Zweck auch unlösliche Lichtschutzpigmente, nämlich feindisperse Metalloxide bzw. Salze in Frage. Beispiele für geeignete Metalloxide sind insbesondere Zinkoxid und Titandioxid und daneben Oxide des Eisens, Zirkoniums, Siliciums, Mangans, Aluminiums und Cers sowie deren Gemische. Als Salze können Silicate (Talk), Bariumsulfat oder Zinkstearat eingesetzt werden. Die Oxide und Salze werden in Form der Pigmente für hautpflegende und hautschützende Emulsionen und dekorative Kosmetik verwendet. Die Partikel sollten dabei einen mittleren Durchmesser von weniger als 100 nm, vorzugsweise zwischen 5 und 50 nm und insbesondere zwischen 15 und 30 nm aufweisen. Sie können eine sphärische Form aufweisen, es können jedoch auch solche Partikel zum Einsatz kommen, die eine ellipsoide oder in sonstiger Weise von der sphärischen Gestalt abweichende Form besitzen. Die Pigmente können auch oberflächenbehandelt, d.h. hydrophilisiert oder hydrophobiert vorliegen. Typische Beispiele sind gecoatete Titandioxide, wie z.B. Titandioxid T 805 (Degussa) oder Eusolex® T2000 (Merck). Als hydrophobe Coatingmittel kommen dabei vor allem Silicone und dabei speziell Trialkoxyoctylsilane oder Simethicone in Frage. In Sonnenschutzmitteln werden bevorzugt sogenannte Mikro- oder Nanopigmente eingesetzt. Vorzugsweise wird mikronisiertes Zinkoxid verwendet. Weitere
geeignete UV-Lichtschutzfilter sind der Übersicht von P.Finkel in SÖFW-Journal 122, 543 (1996) zu entnehmen.
Neben den beiden vorgenannten Gruppen primärer Lichtschutzstoffe können auch sekundäre Lichtschutzmittel vom Typ der Antioxidantien eingesetzt werden, die die photochemische Reaktionskette unterbrechen, welche ausgelöst wird, wenn UV-Strahlung in die Haut eindringt. Typische Beispiele hierfür sind Aminosäuren (z.B. Glycin, Histidin, Tyrosin, Tryptophan) und deren Derivate, Imidazole (z.B. Urocaninsäure) und deren Derivate, Peptide wie D,L-Carnosin, D-Camosin, L- Carnosin und deren Derivate (z.B. Anserin), Chlorogensäure und deren Derivate, Liponsäure und deren Derivate (z.B. Dihydroliponsäure), Aurothioglucose, Propylthiouracil und andere Thiole (z.B. Thioredoxin, Glutathion, Cystein, Cystin, Cystamin und deren Glycosyl-, N-Acetyl-, Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Amyl-, Butyl- und Lauryl-, Palmitoyl-, Oleyl-, γ-Linoleyl-, Cholesteryl- und Glycerylester) sowie deren Salze, Dilaurylthiodipropionat, Distearylthiodipropionat, Thiodipropionsäure und deren Derivate (Ester, Ether, Peptide, Lipide, Nukleotide, Nukleoside und Salze) sowie Sulfoximinverbindungen (z.B. Buthioninsulfoximine, Homocysteinsulfoximin, Butioninsulfone, Penta-, Hexa-, Heptathioninsulfoximin) in sehr geringen verträglichen Dosierungen (z.B. pmol bis μmol/kg), ferner (Metall)- Chelatoren (z.B. α-Hydroxyfettsäuren, Palmitinsäure, Phytinsäure, Lactoferrin), α- Hydroxysäuren (z.B. Citronensäure, Milchsäure, Äpfelsäure), Huminsäure, Gallensäure, Gallenextrakte, Bilirubin, Biliverdin, EDTA, EGTA und deren Derivate, ungesättigte Fettsäuren und deren Derivate (z.B. γ-Linolensäure, Linolsäure, Ölsäure), Folsäure und deren Derivate, Ubichinon und Ubichinol und deren Derivate, Vitamin C und Derivate (z.B. Ascorbylpalmitat, Mg-Ascorbylphosphat, Ascorbylacetat), Tocopherole und Derivate (z.B. Vitamin-E-acetat), Vitamin A und Derivate (Vitamin-A-palmitat) sowie Koniferylbenzoat des Benzoeharzes, Rutinsäure und deren Derivate, α-Glycosylrutin, Ferulasäure, Furfurylidenglucitol, Carnosin, Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, Nordihydroguajakharzsäure, Nordihydroguajaretsäure, Trihydroxybutyrophenon, Harnsäure und deren Derivate, Mannose und deren Derivate, Superoxid-Dismutase, Zink und dessen Derivate (z.B. ZnO, ZnSO4) Selen und dessen Derivate (z.B. Selen-Methionin), Stilbene und deren Derivate (z.B. Stilbenoxid, trans-Stilbenoxid) und die
erfindungsgemäß geeigneten Derivate (Salze, Ester, Ether, Zucker, Nukleotide, Nukleoside, Peptide und Lipide) dieser genannten Wirkstoffe.
Außerdem können erfindungsgemäß Verbindungen zur Unterdrückung oder Minderung von Hautstörungen zugesetzt werden, die durch UV-Strahlung induziert werden, insbesondere Aktivatoren von Peroxisom-Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPAR-Aktivatoren), wie in der WO 02/38150 beschrieben, auf die hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Zur Verbesserung des Fließverhaltens können femer Hydrotrope, wie beispielsweise Ethanol, Isopropylalkohol, oder Polyole eingesetzt werden. Polyole, die hier in Betracht kommen, besitzen vorzugsweise 2 bis 15 Kohlenstoffatome und mindestens zwei Hydroxylgruppen. Die Polyole können noch weitere funktioneile Gruppen, insbesondere Aminogruppen, enthalten bzw. mit Stickstoff modifiziert sein. Typische Beispiele sind
• Glycerin;
• Alkylenglycole, wie beispielsweise Ethylenglycol, Diethylenglycol, Propylenglycol, Butylenglycol, Hexylenglycol sowie Polyethylenglycole mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 100 bis 1.000 Dalton;
• technische Oligoglyceringemische mit einem Eigenkondensationsgrad von 1 ,5 bis 10 wie etwa technische Diglyceringemische mit einem Diglyceringehalt von 40 bis 50 Gew.-%;
• Methyolverbindungen, wie insbesondere Trimethylolethan, Trimethylolpropan, Trimethylolbutan, Pentaerythrit und Dipentaerythrit;
• Niedrigalkylglucoside, insbesondere solche mit 1 bis 8 Kohlenstoffen im Alkylrest, wie beispielsweise Methyl- und Butylglucosid;
• Zuckeralkohole mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Sorbit oder Mannit,
• Zucker mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Glucose oder Saccharose;
• Aminozucker, wie beispielsweise Glucamin;
• Dialkoholamine, wie Diethanolamin oder 2-Amino-1 ,3-propandiol.
Als Konservierungsmittel eignen sich beispielsweise Phenoxyethanol, Formal- dehydlösung, Parabene, Pentandiol oder Sorbinsäure sowie die in Anlage 6, Teil A und B der Kosmetikverordnung aufgeführten weiteren Stoffklassen. Als Insekten-Repellentien kommen N,N-Diethyl-m-toluamid, 1 ,2-Pentandiol oder Ethyl Butylacetylaminopropionate in Frage, als Selbstbräuner eignet sich Dihydroxyaceton.
Als Parfümöle seien genannt Gemische aus natürlichen und synthetischen Riechstoffen. Natürliche Riechstoffe sind Extrakte von Blüten (Lilie, Lavendel, Rosen, Jasmin, Neroli, Ylang-Ylang), Stengeln und Blättern (Geranium, Patchouli, Petitgrain), Früchten (Anis, Koriander, Kümmel, Wacholder), Fruchtschalen (Bergamotte, Zitrone, Orangen), Wurzeln (Macis, Angelica, Sellerie, Kardamon, Costus, Iris, Calmus), Hölzern (Pinien-, Sandel-, Guajak-, Zedern-, Rosenholz), Kräutern und Gräsern (Estragon, Lemongras, Salbei, Thymian), Nadeln und Zweigen (Fichte, Tanne, Kiefer, Latschen), Harzen und Balsamen (Galbanum, Elemi, Benzoe, Myrrhe, Olibanum, Opoponax). Weiterhin kommen tierische Rohstoffe in Frage, wie beispielsweise Zibet und Castoreum. Typische synthetische Riechstoffverbindungen sind Produkte vom Typ der Ester, Ether, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Kohlenwasserstoffe. Riechstoffverbindungen vom Typ der Ester sind z.B. Benzylacetat, Phenoxyethylisobutyrat, p-tert.-Bu- tylcyclohexylacetat, Linalylacetat, Dimethylbenzylcarbinylacetat,
Phenylethylacetat, Linalylbenzoat, Benzylformiat, Ethylmethylphenylglycinat, Allylcyclohexylpropionat, Styrallylpropionat und Benzylsalicylat. Zu den Ethern zählen beispielsweise Benzylethylether, zu den Aldehyden z.B. die linearen Alkanale mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, Citral, Citronellal, Citronellyloxyacetaldehyd, Cyclamenaldehyd, Hydroxycitronellal, Lilial und Bourgeonal, zu den Ketonen z.B. die Jonone, oc-lsomethylionon und Methylcedrylketon, zu den Alkoholen Anethol, Citronellol, Eugenol, Isoeugenol, Geraniol, Linalool, Phenylethylalkohol und Terpineol, zu den Kohlenwasserstoffen gehören hauptsächlich die Terpene und Balsame. Bevorzugt werden jedoch Mischungen verschiedener Riechstoffe verwendet, die gemeinsam eine ansprechende Duftnote erzeugen. Auch ätherische Öle geringerer Flüchtigkeit, die meist als Aromakomponenten
verwendet werden, eignen sich als Parfümöle, z.B. Salbeiöl, Kamillenöl, Nelkenöl, Melissenöl, Minzenöl, Zi tblätteröl, Lindenblütenöl, Wacholderbeerenöl, Vetiveröl, Olibanöl, Galbanumöl, Labolanumöl und Lavandinöl. Vorzugsweise werden Bergamotteöl, Dihydromyrcenol, Lilial, Lyral, Citronellol, Phenylethylalkohol, α- Hexylzimtaldehyd, Geraniol, Benzylaceton, Cyclamenaldehyd, Linalool, Boisambrene Forte, Ambroxan, Indol, Hedione, Sandelice, Citronenöl, Mandarinenöl, Orangenöl, Allylamylglycolat, Cyclovertal, Lavandinöl, Muskateller Salbeiöl, ß-Damascone, Geraniumöl Bourbon, Cyclohexylsalicylat, Vertofix Coeur, Iso-E-Super, Fixolide NP, Evernyl, Iraldein gamma, Phenylessigsäure, Geranylacetat, Benzylacetat, Rosenoxid, Romilllat, Irotyl und Floramat allein oder in Mischungen, eingesetzt.
Als Farbstoffe können die für kosmetische Zwecke geeigneten und zugelassenen Substanzen verwendet werden, wie sie beispielsweise in der Publikation "Kosmetische Färbemittel" der Farbstoffkommission der Deutschen Forschungsgemeinschaft, Verlag Chemie, Weinheim, 1984, S.81-106 zusammengestellt sind. Diese Farbstoffe werden üblicherweise in Konzentrationen von 0,001 bis 0,1 Gew.-%, bezogen auf die gesamte Mischung, eingesetzt.
Zu den erfindungsgemäßen Körperpflegemitteln zählen auch Zahnpflegemittel und allgemein Mittel zur Pflege der Mundhygiene (Oral Gare Produkte).
Zahnpasten enthalten z. B. typischerweise:
- Putz- und Polierkörper wie z.B. Kreide, Kieselsäuren, Aluminiumhydroxid, Aluminiumsilikate, Calciumpyrophosphat, Dicalciumphosphat, unlösliches Natriummetaphosphat oder Kunstharzpulver; - Feuchthaltemittel wie z.B. Glycerin, 1 ,2-Propylenglycol, Sorbit, Xylit und Polyethylenglycole - Bindemittel und Konsistenzregler, z.B. natürliche und synthetische wasserlösliche Polymere und wasserlösliche Derivate von Naturstoffen, z.B. Celluloseether, Schichtsilikate, feinteilige Kieselsäuren (Aerogel- Kieselsäuren, pyrogene Kieselsäuren)
- Aromen, z.B. Pfefferminzöl, Krauseminzöl, Eukalyptusöl, Anisöl, Fenchelöl, Kümmelöl, Menthylacetat, Zimtaldehyd, Anethol, Vanillin, Thymol sowie Mischungen dieser und anderer natürlicher und synthetischer Aromen - Süßstoffe wie z.B. Saccharin-Natrium, Natrium-cyclamat, Aspartame, Acesulfan K, Steviosid, Monellin, Glycyrrhicin, Dulcin, Lactose, Maltose oder Fructose - Konservierungsmittel und antimikrobielle Stoffe wie z.B. p- Hydroxybenzoesäureester, Natriumsorbat, Triclosan, Hexachlorphen, Phenylsalicylsäureeter, Thymol usw. - Pigmente wie z.B. Titandioxid oder Pigmentfarbstoffe zur Erzeugung farbiger Streifen - Puffersubstanzen z.B. primäre, sekundäre oder tertiäre Alkaliphosphate, Citronen-säure/Na-Citrat - wundheilende und entzündungshemmende Wirkstoffe, z.B. Allantoin, Harnstoff, Azulen, Panthenol, Acetylsalicylsäure-Derivate, Pflanzenextrakte, Vitamine, z.B. Retinol oder Tocopherol.
Der Gesamtanteil der Hilfs- und Zusatzstoffe kann 1 bis 50, vorzugsweise 5 bis 40 Gew.-% - bezogen auf die Mittel - betragen. Die Herstellung der Kosmetika und Körperpflegemittel kann durch übliche Kalt - oder Heißprozesse erfolgen; vorzugsweise arbeitet man nach der Phaseninversionstemperatur-Methode.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken:
In vitro Messungen der IL 8-Sekretion:
In in vitro Modeilen mit einer Keratinozytenlinie (HaCaT) kann sowohl die basale als auch die induzierte Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen gemessen werden. In den angeführten in vitro Beispielen wurde der Einfluss der ODN (Oligonukleotide) auf die basale IL8-Sekretion von HaCaT-Zellen untersucht. Das Interleukin 1L-8 dient vor allem als chemotaktischer Faktor für neutrophile Granulozyten, wirkt also entzündungsfördernd. Außerdem ist IL-8 ein pro- Angiogenesefaktor - fördert also die Aussprossung von neuen Gefäßen. Es wird von HaCaT-Zellen vermehrt nach Stimulation mit TNFα oder IL-1 gebildet, jedoch weisen diese Zellen auch gut messbare Basallevel auf.
Die Zellen wurden dazu 18 Stunden in Kulturmedium (Hanks'-Basalmedium mit 5% fötalem Kälberserum, 2mM Glutamax I von Gibco™ und 100U/ml Penicillin/Streptomycin) mit den angegebenen ODN (Endkonzentration 4μM) oder ohne (Kontrolle) inkubiert. Die Zellüberstände wurden kurz abzentrifugiert und die IL8-Konzentration mittels ELISA ermittelt. Anschließend wurde die relative IL8- Sekretion (Verhältnis zur Kontrolle) berechnet. Für jedes Experiment wurden die IL8-Werte von mindestens drei Proben bestimmt und jedes Experiment mindestens dreimal durchgeführt. Angegeben sind jeweils die Mittelwerte aus den unabhängigen Experimenten und die entsprechenden Standardabweichungen. Statistische Signifikanz von Unterschieden (wenn nicht anders angegeben von Probe zur Kontrolle) wurde mit Hilfe des Student's t-Tests ermittelt, die entsprechenden p-Werte sind angegeben.
Beispiel 1
Die in diesem Beispiel beschriebenen anti-inflammatorischen Wirkungen beziehen sich auf in ϊro-Testungen an HaCaT-Zellkulturen. Die anti-inflammatorische Wirkung von non-CpG wurde zudem durch Messungen des TNFα-induzierten IL-
8- und IL-6-Niveaus bestätigt, auf diese Daten wird aber im folgenden nicht näher eingegangen. Es kann somit von einer prophylaktischen (Suppression des Basallevels) und einer therapeutischen (Suppression nach Induktion) Wirkung ausgegangen werden.
Untersuchungen mit non-CpG zeigen, dass nicht alle ODN gleichermaßen anti- inflammatorisch wirken. Betrachtet man Homo-Phosophorothioate (Homo-PTO) mit einer Länge von jeweils 20 Basen, so ergibt sich hinsichtlich der Wirkung folgende Reihenfolge mit Poly-G als wirksamstem ODN: Poly-G > Poly-I > Poly-C > Poly-T > Poly-A (s. Abb. 1A). Betrachtet man die entsprechenden Homo- Phosphodiester (Homo-PDE), so zeigen nur noch Poly-G und Poly-C eine anti- inflammatorische Wirkung, die jedoch deutlich schlechter ist als die der entsprechenden PTO (s. Abb. 1B).
Beispiel 2:
Untersuchungen mit Poly-AG- und Poly-AC-Random-Heteropolymeren als PTO deuten darauf hin, dass viele der Sequenzen (non-CpG) eine anti- inflammatorische Wirkungen aufweisen, insbesondere solche, die einen hohen Gehalt an Guanin bzw. Cytosin (oder auch Hypoxanthin) besitzen (s. Abb. 2 A u. B):
Bezüglich der Länge der Oligonukleotide scheint bei einer Konzentration von 4μM, eine Mindestlänge von 14 bis 16 Basen für eine effiziente anti-inflammatorische Wirkung erforderlich zu sein. Ein kurzes Poly-C-ODN (8mer, PTO) zeigte bei höheren Konzentrationen ebenfalls eine - wenn auch schwache - Wirkung, während bei längeren Poly-C-ODN (30- und 40mere) eine Verbesserung der Wirkung zu erzielen ist (Abb.15).
DNA-Rückgrat-Derivate (Desoxyribo-Phosphorothioat-Derivat, Propandiol- Phosphorothioat-Derivat; 20mere) zeigten keine bzw. nur eine sehr schwache Reduktion des IL-8-Basallevels von HaCaT-Zellen.
Beispiel 3: Anti-inflammatorische Wirkung von non-CpG in vivo (Prophylaxe)
Komplementär zu den in vitro Befunden konnten in vivo Experimente ebenfalls eine anti-inflammatorische Wirkung von non-CpG bestätigen.
Hierzu wurde die Beeinflussung einer Kontaktallergie durch eine 100C-PTO - haltige (20mer, PolyC-PTO) Salbe im Mausmodell gezeigt.
Um eine experimentelle Kontaktallergie auszulösen, werden am Tag 0 jeweils 100μl 0,5% DNFB (Dinitrofluorbenzol) in Aceton/Olivenöl (1/4) auf die Rückenhaut von BALB/c Nacktmäusen aufgetragen. Dies bewirkt eine Sensibilisierung der Versuchstiere gegenüber DNFB, welches ein obligates Kontaktallergen ist.
An Tag 5 erfolgt die Reexposition: 30μl 0,3% DNFB in Aceton/Olivenöl werden auf jede Seite eines Ohrs aufgetragen. Bereits nach 24 Stunden kommt es zu einer Entzündungsreaktion am Ohr. Diese äußert sich vor allem in einer Ohrschwellung. Histologisch findet sich eine Spongiose und eine Einwanderung von Leukozyten. Ohrschwellung und histologische Aufarbeitung sind die Zielgrößen, um eine Wirksamkeit der Testsubstanzen zu untersuchen.
Die nachfolgenden Testsubstanzen wurden hinsichtlich einer Prophylaxe von sensibilisierten Tieren untersucht:
1.) DAC-Basiscreme (Negativkontrolle ohne Wirkstoff) 2.) 1 ,4% 100C-PTO in DAC 3.) Dermatop® (= Positivkontrolle), Dermatop® ist eine von der Firma Aventis erhältliche Klasse-2-steroidhaltige Salbe (Prednicarbat).
Der Versuchsaufbau ist schematisch in der Abb. 3 gezeigt.
Ergebnisse:
1.) Abb. 4 zeigt die Ohrdickendifferenz zwischen behandelten Ohren (Testsubstanz in Kombination mit DNFB) und unbehandelten Ohren der
Versuchstiere. Eine minimale Differenz ist also gleichbedeutend mit einer hohen Wirksamkeit der Testsubstanz.
Die Graphik zeigt, dass die Ohrdickendifferenzen durch die Verwendung von Dermatop® und 100C-PTO (Poly-C-PTO) deutlich geringer sind gegenüber wirkstofffreier DAC-Basiscreme. Die gemessenen Werte legen nahe, dass 1 ,4% Poly-C-PTO in DAC und Dermatop® eine vergleichbare Wirkung haben.
2.) Die Ergebnisse der HE-gefärbten Gewebsschnitte sind in Abb. 5 dargestellt. Es konnte gezeigt werden, dass es bei der Verwendung von DAC-Basiscreme zu einer starken Auflockerung des Gewebes kommt (Spongiose), was auch die Dickenzunahme der Ohren erklärt.
Außerdem ist ein massives entzündliches Infiltrat („dunkle Zellen") in den äußeren Schichten des Gewebes erkennbar. Nach Verwendung der steroidhaltigen Salbe Dermatop® ist das entzündliche Infiltrat deutlich reduziert. Eine ähnliche Reduktion ist auch nach Behandlung mit 1 ,4% 100C-PTO erkennbar.
Beispiel 3b : Anti-inflammatorische Wirkung von non-CpG in vivo (Behandlung)
Komplementär zu den in vivo Befunden hinsichtlich der Prophylaxe einer Kontaktallergie im Mausmodell (siehe oben) wurde 100C-PTO auch im Hinblick auf die Behandlung einer bereits bestehenden Kontaktallergie in diesem Tiermodell untersucht:
Um eine experimentelle Kontaktallergie auszulösen, werden am Tag 0 jeweils 100μl 0,5% DNFB (Dinitrofluorbenzol) in Aceton/Olivenöl (1/4) auf die Rückenhaut von BALB/c Nacktmäusen aufgetragen. Dies bewirkt eine Sensibilisierung der Versuchstiere gegenüber DNFB, welches ein obligates Kontaktallergen ist.
An Tag 5 erfolgt die Reexposition: 30μl 0,3% DNFB in Aceton/Olivenöl werden auf jede Seite eines Ohrs aufgetragen. Bereits nach 24 Stunden kommt es zu einer Entzündungsreaktion am Ohr. Diese äußert sich vor allem in einer Ohrschwellung. Histologisch findet sich eine Spongiose und eine Einwanderung von Leukozyten.
Die Ohrschwellung ist in diesem Versuch die Zielgröße, um eine Wirksamkeit der Testsubstanzen zu untersuchen.
Die nachfolgenden Testsubstanzen wurden hinsichtlich einer Behandlung von reexponierten Tieren untersucht:
2.) DAC-Basiscreme (Negativkontrolle ohne Wirkstoff) 2.) 1 ,4% 100C-PTO in DAC 3.) Dermatop® (= Positivkontrolle), Dermatop® ist eine von der Firma Aventis erhältliche Klasse-2-steroidhaltige Salbe (Prednicarbat).
Der Versuchsaufbau ist schematisch in der Abb. 6 gezeigt.
Ergebnisse:
Abb. 7 zeigt die Ohrdickendifferenz zwischen behandelten Ohren (Testsubstanz in Kombination mit DNFB) und unbehandelten Ohren der Versuchstiere. Eine minimale Differenz ist also gleichbedeutend mit einer hohen Wirksamkeit der Testsubstanz.
Die Graphik zeigt, dass die Ohrdickendifferenzen sowohl nach 24h als auch nach 48h durch die Verwendung von Dermatop® und 100C-PTO deutlich geringer sind gegenüber wirkstofffreier DAC-Basiscreme. Die gemessenen Werte legen nahe, dass 1 ,4% 100C-PTO in DAC und Dermatop® eine vergleichbare Wirkung bezüglich der Behandlung der Kontaktallergie haben.
Beispiel 4:
Die dargestellten Ergebnisse geben einen starken Hinweis darauf, dass die oben beschriebenen ODN-Superstrukturen das Wirkmotiv für non-CpG darstellen.
Es wurde experimentell der Einfluss von Random-Heteropolymeren mit 50% Adenin- und 50% Cytosin- oder Guanin-Gehalt auf den IL-8-Basallevel von HaCaT-Keratinozyten untersucht.
Verglichen wurde die Wirkung mit ODN der gleichen Länge und Basenzusammensetzung, allerdings in alternierender Folge (AGAGAGA...). Bei alternierender Anordnung beinhalten die ODN keine aufeinanderfolgenden Guanine und sollten deshalb nicht in der Lage sein, G-Quadruplexe oder „Frayed Wires" auszubilden!
Wie in Abb. 12 zu sehen ist, führt die alternierende Anordnung der Basen im Falle von Poly-AG-Hetero-PTO zu einer deutlich schwächeren IL-8-Reduktion, die nicht mehr signifikant unterschiedlich von der Kontrolle ist. Dies ist ein deutlicher Hinweis für die Beteiligung von G-Quadruplexen oder „Frayed Wires" an der Wirkung der non-CpG.
Beispiel 5:
Zur Testung des Einflusses des Abstands zweier Cytosin-Folgen auf die Senkung des basalen IL8-Levels von HaCaT-Keratinozyten wurden die ODN SS-19, SS-23 und SS-24 auf ihre biologische Wirksamkeit hin untersucht. Diese ODN weisen jeweils einen Cytosin-Gehalt von 50% auf und besitzen zwei Cytosin-Folgen aus je fünf Cytosinen. Die beiden Folgen sind jedoch durch fünf oder ein Thymin getrennt oder liegen ohne Trennung als Folge von 10 Cytosinen vor. Die unterschiedliche Anordnung hat keinen Einfluss auf die Reduktion des IL8-Levels. Erst eine Erhöhung des Cytosin-Gehalts auf 70, 85 bzw. 100% hat eine tendenziell stärkere Erniedrigung des IL8-Levels zur Folge (Abb. 13).
Beispiel 6:
Zur Testung des Einflusses der Lage einer Guanin-Folge innerhalb eines ODN auf die Senkung des basalen IL8-Levels von HaCaT-Keratinozyten wurden die ODN 25G75A-5G, 25G75A-5G-1 , 25G75A-5G-2 und 25G75A-5G-3 auf ihre biologische Wirksamkeit hin untersucht. Diese PolyAG-Heteropolymere weisen jeweils einen Guanin-Gehalt von 25% auf und besitzen eine Guanin-Folge aus je fünf Guaninen.
Die Folge liegt dabei entweder in der Nähe des 5'-Endes, am 5'-Ende, in der Mitte oder am 3'-Ende des ODN. Die unterschiedliche Anordnung hat keinen Einfluss auf die Reduktion des IL8-Levels. Die Lage der Guanin-Folge ist für die biologische Wirksamkeit daher nicht von Bedeutung. Wichtig ist aber die Anordnung der Guanine in einer Folge. ODN mit gleichem Guanin-Gehalt, die eine Zufallsanordnung (25G75A-PTO, Gemisch) oder eine alternierende Anordnung der Guanine (25G75A-alt) aufweisen, haben keine Wirkung auf den basalen IL8- Level der HaCaT-Keratinozyten (Abb. 14).
Verzeichnis der Abbildungen:
Abb1.: Die Basen bestimmen die suppressive Wirkung von Homopolymeren mit einer Länge von 20 Nukleotiden auf die IL-8 Freisetzung in Hautkeratinozyten (HaCaT). Bei der Kontrolle (-) wurden die Zellen 18 Stunden mit Kulturmedium ohne Oligonukleotide inkubiert, in den anderen Ansätzen die ODN in einer Konzentration von 4μM zugegeben. (A) PTO mit einem Anteil von 100% Adenin (100A-PTO), Thymin (100T-PTO), Cytosin (100C-PTO), Guanin (100G-PTO) oder Hypoxanthin (1001-PTO). (B) PDE mit einem Anteil von 100% Adenin (100A- PDE), Thymin (100T-PDE), Cytosin (100C-PDE) oder Guanin (100G-PDE).
Abb. 2: Der Gehalt an Guanin und Cytosin in einer Nukleotidsequenz bestimmt die suppressive Wirkung auf die IL-8 Freisetzung in Hautkeratinozyten (HaCaT). Bei der Kontrolle (-) wurden die Zellen 18 Stunden mit Kulturmedium ohne ODN (20mere) inkubiert, in den anderen Ansätzen die ODN-PTO in einer Konzentration von 4μM zugegeben. (A) Statistische Verringerung des Guaninanteils in Poly-AG-Random- Heteropolymer-Gemischen von 100% auf 0% führt zur Aufhebung des anti-inflammatorischen Effekts. 100G-PTO = 100% Guanin (20mer), 75G25A-PTO = 75% Guanin und 25% Adenin, 50G50A-PTO = 50% Guanin und 50% Adenin, 25G75A-PTO = 25% Guanin und 75% Adenin, 100A-PTO = 100% Adenin, jeweils statistische Verteilung der Basen. (B) Statistische Verringerung des Cytosinanteils in Poly-AC-Random- Heteropolymer-Gemischen von 100% auf 0% führt zur Aufhebung des anti-inflammatorischen Effekts. 100C-PTO = 100% Cytosin (20mer), 75C25A-PTO = 75% Cytosin und 25% Adenin, 50C50A-PTO = 50% Cytosin und 50% Adenin, 25C75A-PTO = 25% Cytosin und 75% Adenin, 100A-PTO = 100% Adenin, jeweils statistische Verteilung der Basen.
Abb. 3: Schematischer Versuchsaufbau zur Testung von Substanzen auf Prophylaxe bei sensibilisierten Tieren. Am Tag 0 werden die Tiere mit DNFB sensibilisiert. Die Sensibilisierungsphase beträgt 5 Tage. Am 5. Tag wird jeweils ein Ohr der Tiere mit den Testsubstanzen behandelt. Nach 2h wird erneut DNFB
appliziert ('challenge ). Am 6. Tag werden die Ohrdicken gemessen und das Ohrgewebe histologisch untersucht.
Abb. 4: Ohrdickendifferenzen nach Behandlung mit Testsubstanzen und DNFB (siehe Schema oben, Abb. 3). n, Anzahl der Versuchstiere.
Abb. 5: Längsschnitte durch Mausohren nach Behandlung mit Testsubstanzen und DNFB (siehe Schema oben, Abb. 3) in der HE-Färbung.
Abb. 6: Schematischer Versuchsaufbau zur Testung von Substanzen auf Behandlung bei reexponierten Tieren. Am Tag 0 werden die Tiere mit DNFB sensibilisiert. Die Sensibilisierungsphase beträgt 5 Tage. Am 5. Tag wird erneut DNFB appliziert ('challenge"). Nach 2h wird jeweils ein Ohr der Tiere mit den Testsubstanzen behandelt. Am 6. Tag werden die Ohrdicken gemessen und die Tiere erneut mit den Testsubstanzen behandelt. Am 7. Tag werden erneut die Ohrdicken gemessen.
Abb. 7: Ohrdickendifferenzen nach Behandlung mit Testsubstanzen und DNFB nach 24 bzw. 48h (siehe Schema oben, Abb. 6). n, Anzahl der Versuchstiere. Statistisch signifikante Unterschiede zur DAC-Kontrolle sind mit * bezeichnet. p<0,05 ANONA (one way) Tukey Test vs. DAC.
Abb. 8: Bildung eines G-Quartetts über Hoogsteen-Basenpaarungen (Abbildung modifiziert nach Shafer & Smirnov, 2001). Links schematische Darstellung eines Guanin-Quartetts, rechts Struktur eines Guanin-Quartetts aus der Kristallstruktur der linearen Quadruplex [d(TGGGGT)]4.
Abb. 9: Bildung von inter- und intra-molekularen G-Quadruplexen (modifiziert nach Shafer & Smirnov, 2001). Schematische Darstellung von G-Quadruplexen aus vier (A), zwei (B) oder einem (C) Strang.
Abb. 10: Bildung von „Frayed Wires" von d(Tι5Gn)-Oligonukleotiden (Abbildung modifiziert nach Poon & MacGregor, 2000.
Abb. 11: Die Bildung von i-Motiven Cytosin-reicher Nukleotidsequenzen. (A) C C+- Basenpaarung, Bildung von drei Wsserstoffbrücken nach Protonierung eines Cytosins. (B) Schematische Darstellung eines intramolekularen i-Motivs. (A) und (B) modifiziert nach Phan & Mergny, 2002. (C) Schematische Darstellung eines intermolekularen i-Motivs (modifiziert nach Fedoroff et al., 2000).
Abb. 12: Die alternierende Anordnung von Guaninen und Adeninen in Poly-AG- PTO führt im Gegensatz zu einer Zufallsanordnung der Basen zum Verlust der Reduktion des IL8-Basallevels in Hautkeratinozyten (HaCaT). Bei der Kontrolle (-) wurden die Zellen 18 Stunden mit Kulturmedium ohne ODN (20mere) inkubiert, in den anderen Ansätzen die ODN-PTO in einer Konzentration von 4μM zugegeben. PTO: 100G-PTO = 100% Guanin; 50G50A-PTO = 50% Guanin und 50% Adenin, statistische Verteilung; 50G50A-alt-PTO = 50% Guanin und 50% Adenin, alternierende Anordnung; 100C-PTO = 100% Cytosin; 50C50A-PTO = 50% Cytosin und 50% Adenin, statistische Verteilung; 50C50A-alt-PTO = 50% Cytosin und 50% Adenin, alternierende Anordnung;
Abb.13: Die Lage zweier Cytosin-Folgen mit je fünf Cytosinen in PolyTC- Heteropolymeren mit 50% Cytosin-Gehalt hat keinen signifikanten Einfluss auf die biologische Wirksamkeit.
Abb. 14: Der Einfluss der Anordnung von Guaninen und der Lage von Guanin- Folgen in PolyAG-Heteropolymeren auf den basalen IL8-Level von HaCaT- Keratinozyten wurde untersucht. Die Lage einer Guanin-Folge mit fünf Guaninen in PolyAG-Heteropolymeren mit 25% Guanin-Gehalt hat keinen signifikanten Einfluss auf die biologische Wirksamkeit. Die Anordnung der Guanine als Folge ist dagegen essentiell.
Abb. 15: Der Einfluss der Länge von PolyC-Homopolymeren auf den basalen IL8- Level von HaCaT-Keratinozyten wird anhand der relativen IL8-Sekretion, die gegen die entsprechende Konzentration des ODN aufgetragen ist, gezeigt. An den Kurvenverläufen ist deutlich zu sehen, dass die anti-inflammatorische Wirkung mit zunehmender Länge der PolyC-ODN zunimmt.
Tabelle 1 : Die Tabellen 1 und 2 enthalten die genannten Oligonukleotide. Alle genannten Oligonukleotide in Tabelle 1 sind Phosphorothioate (PTO), alle in Tabelle 2 Phosphodiester (PDE). Die Wirkung wird nach der Reduktion des basalen IL8-Levels von HaCaT- Keratinozyten in fünf Kategorien eingeteilt (ODN-Endkonzentration: 4μM): keine Reduktion oder Reduktion auf >90% des Ausgangsniveaus: -; Reduktion auf Werte zwischen 75% und 90%: +; Reduktion auf Werte zwischen 50% und 74%: ++; Reduktion auf Werte zwischen 25% und 49%: +++; Reduktion auf Werte < 25%: ++++; Der Guanin-Anteil im ODN ist in % angegeben.
Tabelle 1 : Verwendete Sequenzen -Phosphorothioate:
Tabelle 2: Verwendete Sequenzen - Phosphodiester